DE2057544A1 - Verfahren zur Herstellung einer Virusvakzine gegen das Kaelberdiarrhoevirus - Google Patents
Verfahren zur Herstellung einer Virusvakzine gegen das KaelberdiarrhoevirusInfo
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Description
" Verfahren zur Herstellung einer Virusvakzine gegen das
Kälberdiarrhoevirus "
Priorität: 28. November 1969, V.St.A., Nr. 880 956
Neonatale Kälberdiarrhoe, auch Kälberruhr oder Kälberenteritis
genannt, ist eine schwere, ansteckende Krankheit neugeborener Kälber. In zahlreichen Veröffentlichungen wird behauptet, dass
Escherichia coli die Ursache der neonatalen Kälberdiarrhoe sei. Diese Krankheit kann aber mit E. coli, das aus Kälbern mit
neonataler Kälberdiarrhoe isoliert wurde, nicht exakt reproduziert werden. Weiterhin kommen Smith und Halls, J. Path, and
Bact, 93 (1967), Seite 499 bis 529, zu dem Schluss, dass E.
coli in 120 von 127 epidemiologisch beziehungslosen Fällen von Kälberdiarrhüo in verschiedenen Teilen der Welt, bei denen die
Kälber mit Kolostrum goflibterb wurden, keine ursächliche Rolle
gespielt habe,
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Vor kurzem haben Mebus et al., University of Nebraska Research
Bulletin 233, März 1969, gezeigt, dass die neonatale Kälberdiarrhoe
durch ein spezifisches Virus verursacht wird. Die exakte experimentelle Reproduktion der Krankheit, die diesen Befund
bestätigte, gelang zuerst dadurch, dass Faeces von auf der Weide lebenden Kälbern mit neonataler Kälberdiarrhoe gesammelt
und mittels einer Duodenalsonde in ein neugeborenes Kalb, das nach der Geburt sofort abgesondert wurde und kein Kolostrum er-
Ψ halten hatte, inokuliert wurden. Bei diesem Kalb trat 15 Stunden
nach der Inokulation die neonatale Kälberdiarrhoe auf. Seine Faeces wurden gesammelt und mittels einer Duodenalsonde in ein
durch Ilysterectomie geborenes Kalb, das kein Kolostrum erhalten hatte, inokuliert. Die Faeces dieses ebenfalls erkrankten Kalbs
wurden in ähnlicher Weise in ein weiteres durch Hysterectomie geborenes Kalb, das kein Kolostrum erhalten hatte, inokuliert.
Die dritten, vierten und fünften Viruspassagen wurden unter Verwendung bakterienfreier Päkalfiltrate durchgeführt, die mittels
ψ Duodenalsonden in Kälber inokuliert wurden. Drei E. coli-freie
Kälber in einer Isolierstation wurden oral mit bakterienfreien Fäkalfiltraten der sechsten Viruspassage inokuliert. Diese Kälber,
bei denen ebenfalls die neonatale Kälberdiarrhoe auftrat, blieben während der ganzen Krankheitszeit frei von E. coli.
Eine siebte Viruspassage in einem Kalb unter Verwendung von Faeces eines der genannten E. coli-freien Kälber verursachte
Stunden nach der Inokulation die -neonatale Kälberdiarrhoe. Teile des Dünndarms des letztgenannten Kalbs wurden nach der Viruspassage
der Immunofluorofizenzfärbung (s, Hobus et al., loc. cit,)
unborv/orfen» Die lipi thelzellen der Vllli zeigten starke
1 ο 9 η ? u 12 ο 3 y
■ - 3 - ■
Fluoreszenz. Das Erregervirus wurde durch Immunofluoreszenzfärbung
getrockneter· Faeces von auf der Weide lebenden Kälbern mit
neonataler Kalberdiarrhoe nachgewiesen. Damit ist zweifelsfrei ■
sichergestellt, dass die neonatale Kälberdiarrhoe durch ein Virus verursacht v/ird.
Aufgabe der Erfindung war es daher, ein neues Verfahren zur Herstellung
einer Virusvakzine gegen das Kälberdiarrhoevirus zur
Verfügung zu stellen, mit dem die neonatale Kälberdiarrhoe wirk-
sam bekämpft werden kann. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung
gelöst. ■
.Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung
"einer Virusvakzine gegen das Kälberdiarrhoevirus, "das dadurch gekennzeichnet
ist, dass man das in den Faeces infizierter Kälber enthaltene Kälberdiarrhoevirus abtrennt, gegebenenfalls den Virustiter
durch Passagen durch ein oder mehrere Kälber erhöht, die Virulenz des Virus durch Passagen in Gewebekulturen so weit abschwächt,
dass das Virus Immunität induziert, aber keine Krank- * heit verursacht, das abgeschwächte Virus in Gewebekulturen vermehrt,
die Gewebekulturen in an sich bekannter V/eise erntet und aufarbeitet, das in der Vakzine enthaltene Virus gegebenenfalls
inaktiviert, die Vakzine gegebenenfalls mit einem Adguvans vernetzt
und gegebenenfalls lyophilisiert.
Mit Hilfe der nach dem Verfahren der Erfindung hergestellten Vakzine gelingt es, die Anzahl der Fälle von neonataler Kälberdiarrhoe
und die damit verbundene Ilortalität der Kälber beträchtlich zu verringern.
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In der Praxis wird das Verfahren der Erfindung im allgemeinen folgendermassen durchgeführt:
Zur Herstellung der Virusvakzine werden Faeces infizierter Kälber gesammelt. Vorzugsweise benutzt man Faeces von Kälbern, die
vorher mit einem bakterienfreien Filtrat von Faeces inokuliert wurden, in denen das Virus mit Hilfe der Immunofluoreszenzfärbung
oder elektronenmikroskopisch nachgewiesen wurde. Der Virustiter der gesammelten Faeces kann durch Passagen durch ein oder
ρ mehrere Kälber erhöht werden. Dadurch v/ird das anschliessende
Anwachsen des Virus in Gewebekulturen erleichtert. Falls das ursprünglich aus den Faeces erhaltene Virus auf Gewebekulturen
ohne weitere Passagen durch ein oder mehrere Kälber wächst, kann - dieses -vimshaltige Material direkt verwendet werden.
Die gesammelten Faeces werden mit phosphatgepufferter physiologischer
Kochsalzlösung verdünnt, das Gemisch wird etwa 30 Minuten bei 1000 g zentrifugiert, und der Überstand wird durch ein
Bakterienfilter filtriert. Das so erhaltene virushaltige Filtrat " wird zur nachfolgenden Abschwächung der Virulenz des Virus durch
Passagen in Gewebekulturen verwendet.
Der in einem Nährmedium gewachsene Zellrasen der Gewebekultur
wird mit einer serumfreien Salzlösung gewaschen. Man gibt das virushaltige Filtrat entweder direkt auf den Zellrasen der Gewebekultur,
der man nach einer gewissen Adsorptionszeit ein Nährmedium zusetzt, oder man vermischt das virushaltige Filtrat zu-
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erst mit dem Nährmedium und gibt diese Mischung anschliessend
zur Gewebekultur. Die Gewebekultur wird bei einer Temperatur von 25 bis 40 0C, vorzugsweise von 30 bis 37 0C, inkubiert. Die Viruspassagen
können in stationären oder in Drehrohrkulturen durchgeführt
werden. Man lässt das Virus in der Gewebekultur so lange wachsen, bis ein durch das "Ermatten" der Zellen kenntlicher cytopathologischer
Effekt eintritt, der durch die Infektion der Zellen hervorgerufen wird. Der Grad der Infektion wird zusätzlich
mit Hilfe der Immunofluoreszenzfärbung verfolgt. Dieses "Ermatten"
der Zellen tritt innerhalb von 2 bis 10 Tagen ein, und das virushaltige
Inkubationsgemisch wird dann zur weiteren Passage in ein anderes Gefäss mit Gewebekultur gegeben.
Wenn die Virulenz des Virus durch weitere Passagen in Gewebekulturen
genügend abgeschwächt ist, wird das Virus in Gewebe- -kultüren vermehrt. Man gibt das virushal.tige Inkubationsgemisch
entweder direkt auf den Zellrasen der Gewebekultur, der man nach einer gewissen Adsorptionszeit ein vorzugsweise serumfreies Nähr- ^J
medium zusetzt, oder man vermischt das virushaltige Inkubationsgemisch
zuerst mit dem vorzugsweise serumfreien Nährmedium und gibt diese Mischung anschliessend zur Gewebekultur. Die Zellen
der Gewebekultur werden bei Temperaturen von 25 bis 40 0C, vorzugsweise von 30 bis 37 0C, so lange inkubiert, bis ein ausreichender
Virustiter, zum Beispiel eine gewebekulturinfektiöse
Dosis von mindestens 10 /ml, erhalten wird. Das Inder Vakzine enthaltene Virus kann gegebenenfalls inaktiviert, die Vakzine
gegebenenfalls zur Erhöhung der Antigen!tat mit einem Adjuvans
versetzt und gegebenenfalls lyophilisiert werden.
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Zur Durchführung der Viruspassagen in Gewebekulturen kann eine Vielzahl von Primärzellkulturen und Permanentzellkulturen verwendet
werden, z.B. primäre fötale Rindernieren-, -lungen- oder
-Schilddrüsenzellen, primäre Schweinenierenzellen, primäre fötale Rinderzellen aus dem Plexus chorioidei,' primäre Laminnierenzellen,
Rindernieren-Permanentzellkulturen BK IA, Rinderembryotrachea-Permanentzellkulturen
EBTr (ATCC Nr. CCL 44), Permanentzellkulturen BHK91 (ATCC Nr. CCL 10) aus Nierenzellen sehr jun-
ψ ger Hamster, Madin-Darby Hundenieren-Permanentzellkulturen
(ATCC Nr. CCL 22), Grünaffennieren-Permanentzellkulturen VSRO (ATCC Nr. CCL 81), Scliweinenieren-Permanentzellkulturen PK-15
(ATCC Nr. CCL 33), Schweinetestikel-Permanentzellkulturen ST (erhältlich vom" National Animal Disease Laboratory, Ames, Iowa)
und Henles Eingeweide-Permanentzellkulturen HI, Heia und LLC-MK9
(ATCC Nr. CCL 6, 2 und 7) aus menschlichen Embryonen. Vorzugsweise v/erden zur Durchführung der Viruspassagen Rinder- und
Schweinezellen verwendet. Die genannten Substrate erhalten alle das Wachstum des Virus bis zu einem gewissen Grad aufrecht.
Die Primärzellkulturen v/erden aus Organen gesunder Tiere nach 'Standardmethoden hergestellt. Die Permanentzellkulturen sind entweder
aus öffentlichen Hinterlegungsstellen erhältlich oder können nach bekannten Methoden hergestellt werden.
Das Nährmedium darf keine Verbindungen enthalten, die das Wachstum
des Virus hemmen; ansonsten ist die Auswahl des Nährmediums
_nicht kritisch für das Verfahren der Erfindung. Vorzugsweise wird ein serumfreies Nährmedium verwendet. Sa können a. B. Earles oder
Hanks'Salzlösungen, die 0,5 Prozent Laetoglobuliri,
0,1 Prozent Hefeextrakt, Penicillin und Streptomycin enthalten oder EarIes oder Hanks' Base 199, die Q,5 Prozent Lactoglobulin
hydrolysat, Penicillin und Streptomycin enthält, verwendet werden.
( ·
Die Bekämpfung der neonatalen Kälberdiarrhoe kann mittels der erfindungsgemäss hergestellten Vakzine entweder durch Vakzination
der trächtigen Kühe oder durch direkte Vakzination der neu geborenen Kälber erfolgen. Der jeweilige Verwendungszweck erfordert
Modifizierungen der Vakzine. Die entsprechenden Vakzine
werden nachstehend mit Kuh- b*zw. mit Kälbervakzine bezeichnet.
Zur Herstellung der Kuhvakzine genügt eine relativ niedrige
Anzahl von Viruspassagen, vorausgesetzt, dass mindestens 85 cß>
der Zellen der Gewebekultur nach der Immunofluoreszenzfärbung
fluoreszieren. Das in der Kuhvakzine enthaltene Virus kann nach bekannten Methoden inaktiviert werden. Die Kuhvakzine kann zur
Erhöhung der Antigenität mit einem der bekannten Adjuvantia,
z.B. Safloröl, Freunds inkomplettes Adjuvans, Alginat-. Adjuvans und Aluminiumhydroxid-Adjuvans versetzt werden. Der
Virustiter der Kuhvakzine soll mindestens eine gewebekulturinfektiöse Dosis von 10 /ml betragen und vorzugsweise einen
noch höheren Wert haben.
Als Kälbervakzine wird eine stark abgeschwächte Lebendvakzine verwendet. Die Herstellung einer solchen Vakzine erfordert bis
zu etwa 200 Viruspassagen. Die Zahl der notwendigen Viruspaissagen
ergibt sich daraus, dass die in das Duodenum eines neugebo-
10982Λ/2039
renen, ohne Kolostrum ernährten Kalbs inokulierte Vakzine aus einer bestimmten Viruspassage keine neonatale Kälberdiarrhoe
■verursacht und diese Krankheit verhindert, wenn das Kalb hinterher mit einem bakterienfreien, virulentes Virus enthaltenden
7 I
\ V
Fäkalfiltrat inokuliert wird.
Die Kälbervak.zine kann in der unmittelbar entstehenden flüssigen ^ Form verwendet werden, sie kann aber auch lyophilisiert und vor
Gebrauch in einem Lösungsmedium, zum Beispiel in sterilem Wasser, aufgelöst werden.
Die Kuhvakzine soll der trächtigen Kuh 60 bis 90 Tage vor dem Kalben parenteral, vorzugsweise subkutan oder intramuskulär,
verabreicht werden. Die Kälbervakzine soll den Kälbern kurz nach der Geburt, das heisst, bevor sie dem virulenten Virus ausgesetzt
sind, verabreicht werden.
W Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Primäre fötale Rinderlungenzellen, die aus 8 bis 9 Monate alten Rinderföten nach bekannten Methoden hergestellt wurden, werden
in einem Nährmedium aus Earles Lactoglobulinhydrolysat und 10 Prozent Kälberserum in Roux-Flaschen gezüchtet. Vor der Inokulation
werden die Zell-Monoschichten zwei- oder dreimal mit Hanks Salzlösung gewaschen. Der Zellrasen wird mit einem bakterienfreien
virushaltigen Fäkalfiltrat, das durch eine oder mehrere Passagen
10982Λ/2039
in Kälbern erhalten wurde, inokuliert. Nach zweistündiger Adsorp-
fi man tion des Virus bei einer Temperatur von 37 C, wobei/das Gefäss
alle 30 Minuten zur erneuten Verteilung des Inokulums schUt-.
telt, . .' wird das Gemisch mit einem Nährmedium versetzt, das
V ·
aus Earlen Salzlösung, 0,5 Prozent lactoglobulin, 0,1 Prozent
Hefeextrakt, Penicillin und Streptomycin besteht. Die Zellen werden
anschliessend bei einer Temperatur von 37 0C inkubiert, bis
der Zellrasen einen cytopa'thogenen Effekt zeigt oder nach erfolgter
Immunofluoreszenzfärbung fluoresziert. |
Wenn 85 bis 100 Prozent der Zellen in der Monoschicht fluoreszieren,
wird das InkubationBgut durch Einfrieren und Auftauen geerntet. Das Volumen wird in einer Ultrazentrifuge um 50 Prozent
vermindert. Dar Sell-Flüssigkeitsgemisch wird bei -60 0C aufbewahrt.
Zur Wertbemessung der Vakzine wird das Zell-Plüssigkeitsgemisch
aufgetaut und sowohl allein als auch mit einer gleichen Menge SaflorcHL-Adjuvans vermischt getestet. Die Vakzine wird trächti- (j
gen Kühen 60 Tage vor dem Kalben intramuskulär injiziert. Acht Kühen wird die beschriebene Gewebekulturflüssigkeit,
sieben Kühen wird dieselbe Menge Gewebekulturflüssigkeit vermischt
mit einer ebenso grossen Menge Adjuvans und sechs Kühen werden 5 ml Adjuvans vermischt mit 5 ml einer Virussuspension
aus Faeces von Veroucho-Knlbern mit neonataler Kälberdiarrhoe
(o. Mebus et al., loc cit.) injiziert. Neununddreisoig Kühe erhalten
keine Vakzine und dienen als Kontrolle. Die Kühe werden'
zum KaIt)Cm auf eine Viehfarm tfobrncht, auf der dio rinorintnlo
103Q24/2039
20575AA
Kälberäiarrboe während mehrerer Jahre immer wieder auftrat und
zum beschriebenen Zeitpunkt ebenfalls vorlag. Die Vfirkaamkeit
der Vakzine wird dadurch bestimmt, dass das Nichtauftreten bzw.
das Auftreten der neonatalen Diarrhöe bei den geborenen Kälbern
registriert wird und im letzteren Fall .die Faeces dieeer Kälber
mit Hilfe der Immunofluoreszenzfärbung auf die Anwesenheit des Virus untersucht werden. Die Ergebnisse sind in der Tabelle zu-..!.
ß.ammengestelit,
V/irksamkeit verschiedener Kälberdiarrhoe-Vakzinen
| • -Vakzine · - — | Anzahl träch tiger Kühe |
Anzahl ge borener· Kälber |
Anzahl diarrhoe- tißcher Kälber |
| Gewebekultur- flüSBigkeit |
8 | 8 | .7 (87,5 #) |
| Gewebekultur- flüesigkeit + Adjuvans |
7 | 7 | 3 (42,8 ?t) |
| Päkalvirus- Suspension + Ad;) uv ans |
6 | 6 | 4 (66,6 $) |
| keine Vakzine (Kontrolle) |
39 | 39 | 39 (100 9t) |
Alle Kontroll-Kälber erkrankten an neonataler Kälberdiarrhoe;
sieben von acht Kälbern, die von den mit GewebckulturflüSBigkeit ßoirapftcn Kühen abotamraen, erkrankten an neonataler Kälberdiarrhoo;
vier von occha Kälbern, die von· den mit dem Gnmioch aus der Piikalviruo-Sunponn
lon und dem Adjuvano geimpften Kühoti abBtammon, er-
10üü?A/?039 '
krankten an neonataler Kälberdiarrhoe und drei von sieben Kälbern,
die von den mit dem Gemisch aus der Gewebekulturflüssigkeit und dem Adjuvans geimpften Kühen abstammen, erkrankten an
neonataler Kälberdiarrhoe. Die Tabelle zeigt,dass alle Vakzinen
selbst angesichts einer schweren, möglicherweise unvermeidbaren Infektionsgefahr eine gewisse Wirksamkeit besitzen. Die besten
Ergebnisse werden bei Verwendung der Vakzinen aus dem äell-Flüssigkeitsgeniisch und einem Adjuvans erzielt. ^
Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wird die Wertbemessung der Vakzine aus dem Gemisch der Gewebekulturflüssigkeit und einem
Adjuvans in einer Milchviehherde durchgeführt, in der schwere
neonatale Kälberdiarrhoe während zwei Jahren aufgetreten war und in der das Virus mit Hilfe der Immunofluoresζenζfärbung nachgewiesen
wurde. Pur den Versuch werden trächtige Kühe so ausgewählt,
dass pro Woche fünf geimpfte Kühe zum Kalben kommen. Die Impfungen werden 30 bis 90 Tage vor dem Kalben entweder einmal
oder 30 Tage später nochmals durchgeführt. Das Kolostrum der A
\ geimpften Kühe wird bis 5 Tage nach dem Kalben gesammelt und bis
zu 13 Tage alten Kälbern gefüttert. Die Milch der geimpften Kühe wird 6 bis 10 Tage nach dem Kalben gesammelt und 14 bis 28 Tage
alten Kälbern gefüttert. Der.beschriebene Versuch erlaubt sowohl die Abschätzung der zur Erzielung eines Impfschutzes erforderlichen
Zeit zwischen Impfung und dem Kalben als auch die Abschätzung der Wirkung einer zweimaligen Impfung. Folgende Ergebnisse
wurden erhalten: Von 180 Kälbern, die -von einmal geimpften oder
ungeimpften Kühen abstammten und mit dem Kolostrum ungeimpfter und einmal geimpfter Kühe gefüttert wurden, erkrankten 87 Kälber
1098?i/2039
(48,3 Prozent) an neonataler Kälberdiarrhoe; von 253 zwischen
dem 30-8. und dem 24-10· geborenen Kälbern, die von zweimal ge-■
impften Kühen abstammten und mit dem Kolostrum dieser Kühe gefüttert wurden, erkrankten 69 (27,3 Prozent) an neoriatal'er Kälberdiarrhoe.
Wenn sichergestellt wäre, dass alle neugeborenen Kälber so früh wie möglich nach der Geburt mit dem Kolostrum geimpfter Kühe
B gefüttert würden, könnte eine weitere Verbesserung der Ergebnisse
erhalten werden. Im beschriebenen Experiment vergingen aus unvermeidlichen Gründen bis zu 12 Stunden, bevor einige Kälber
gefüttert wurden. Einige Kälber können deshalb schon mit dem Tirus der neonatalen Kälberdiarrhoe infiziert sein, bevor sie
das Kolostrum erhalten.
In den beschriebenen Experimenten wurde keine nachteilige Wirkung der Vakzine auf die geimpften Tiere beobachtet.
™ Beispiel 2
Andere Vakzinen zur Impfung trächtiger Kühe werden durch Viruspassage eines Virus hergestellt, das, gegebenenfalls durch vorhergehende
Passagen in Kälbern, auf die Züchtung in Primärzellkulturen oder Permanentzellkulturen aus Organen von Rindern,
Schweinen oder anderer Herkunft adaptiert wurde. Zur Herstellung der Vakzine sind so viel Viruspassagen notwendig, bis 85 bis
100 Prozent der Zellen der Gewebekultur nach der Immunofluoreszenzfärbung
fluoreszieren.
Eine Vakzine zur direkten Immunisierung von Kälbern wird gemäße
Beispiel 1. durch 37 Viruspassagen in Schweinenieren-Permanentzellkultüren
PK-15 (ATCC Nr. CCL 33) hergestellt. Die Viruspassagen
werden in stationären Gefässen durchgeführt.
Andere Kälbervakzinen können durch Viruspassagen eines Virus hergestellt werden, dar. gegebenenfalls durch vorhergehende Passagen
in Kälbern, auf die Züchtung in Primärzellkulturen oder Permanentzellkulturen aus Organen von Rindern, Schweinen oder
anderer Herkunft adaptiert wurde. Die Anzahl der zur Herstellung
der Vakzine notwendigen Viruspassagen wird bestimmt, indem Proben auf ihre infektiösen Eigenschaften und auf ihre "Antigenität geprüft
werden.
10 ml Faeces von auf der Weide lebenden Kälbern mit neonataler Kälberdiarrhoe werden gesammelt und rasch eingefroren. Die Faeces
werden mit Hilfe der Immunofluoreszenzfärbung oder elektronenmikroskopisch auf Virus untersucht. Die virushaltigen Faeces
werden mit dem dreifachen Volumen phosphatgepufferter physiologischer
Kochsalzlösung verdünnt, das Gemisch wird zentrifugiert und der Überstand nacheinander durch Bakterienfilter
mit Porengrößsori von bM, 1/U und 0,5/U filtriert. 30 ml des
Filtrats werden in dau Duodenum eines Kalbs Inokuliert.
AnsteLLe diesen Filfcrafcn können auch Faeces direkt inokuliert
10 98 24/20 3-9
-H-
werden. Bei beginnender Diarrhöe werden die Faeces dieses Kalbs
gesammelt und in der beschriebenen Weise behandelt. Anschliessend werden zwei oder mehrere Passagen durch Kälber durchgeführt
Nach jeder dieser Passagen wird ein Filtrat hergestellt und auf Rindernieren- oder- - lungen-Primärzellkultüren inokuliert.
In diesen Gewebekulturen werden bis zu vier Viruspassagen in stationärer oder in Drehrohrkultur durchgeführt. Anschliessend
werden die Gewebekulturen auf einen durch das "Ermatten" der Zellen gekennzeichneten cytopathologischen Effekt geprüft und
mit Hilfe der Immunofluoreszenzfärbung untersucht. Verläuft die
Prüfung auf das Virus positiv, so werden weitere Passagen in Gewebekulturen durchgeführt; kann kein ViruR nachgewiesen werden,
so werden die Gewebekulturen verworfen.
Es werden 40 Viruspassagen bei 37 0C in Schweinenierenzellen
PK-15 durchgeführt. Anschliessend werden 135 weitere Viruspassagen
bei 37 0C in primären Rindernierenzellen durchgeführt.
Vor der Inokulation werden die Zellen der Gewebekulturen dreimal mit Hanks* Salzlösung gewaschen. Die ersten Viruspassagen in
Rindernierenzellkultüren werden durchgeführt, indem alle drei
bis vier Tage ein 226,8 g schweres, die Zellkultur enthaltendes Gefäss mit 1 ml virushaltiger Gewebekulturflüssigkeit inokuliert
wird. Vor der Zugabe des Nährmediums wird das Virus bei den
ersten Viruspassagen 2 Stunden, bei den späteren Viruspassagen der
1 Stunde auf/Gewebekultur adsorbiert. Etwa nach der
'70. ' Viruspassage in Kindernierenzellkultüren wird das Virus
109KM/2039
jeden Tag auf eine neue Gewebekultur inokuliert. Von der hundertzwanzigsten
Viruspassage an wird auf die Adsorption des Virus verzichtet. Die Rindernierenzeirkultüren werden gewaschen, mit
Nährmedium versetzt und mit virushaltiger Gewebekulturflüssigkeit
inokuliert. " ■
Von der 40. "bis zur 135· Viruspassage in Rindernierenzellkulturen
wird 5 Tage nach der Inokulation Gewebekulturflüssigkeit entnommen. Diese Gewebekulturflüssigkeit wird mit derselben Men- I
ge Safloröl-Adjuvans versetzt und die erhaltene Vakzine zur
Impfung trächtiger Kühe verwendet. Gegenüber einer Kontrollgruppe war das Auftreten der neonatalen Kälberdiarrhoe bei den von den
' geimpften Kühen abstammenden Kälbern auf etwa 50 Prozent verringert,
und die Mortalität ging auf annähernd Null zurück.
Es werden 40 Viruspassagen "bei 37 0C in Schweinenierenzellkultu-
o -2
ren PK-15, 85 Viruspassagen "bei 37 C in Rindernieren-Primärzeil- i
kultüren und 17 Viruspassagen bei 31 0C in Rindernieren-Primärzellkulturen durchgeführt. 12 ml der erhaltenen Gewebekulturflüssigkeit
werden in das Duodenum eines durch Kaiserschnitt geborenen, ohne Kolostrum ernährten Kalbs inokuliert. Dieses
Kalb erkrankte nicht an neonataler Kälberdiarrhoe.
Faeces von auf der Weide lebenden Kälbern mit neonataler Kälberdiarrhoe
werden gemäss Beispiel 5 behandelt. Anschliessend wer-
109824/2039
den zwei Viruspassagen in Kälbern durchgeführt, wobei die virushaltigen
Fäkalfiltrate in das Duodenum dieser Kälber inokuliert werden. Anschliessend werden Viruspassagen in Rindernieren-Primär
2 eil en in Drehrohrkulturen durchgeführt. Die 3· b'is 163·
ν ν
Viruspassage wird bei 37 0C in stationärer Kultur durchgeführt.
Mit der aus der erhaltenen virushaltigen Gewebekulturflüssigkeit und einem Adjuvans hergestellten Vakzine werden trächtige Kühe
^ geimpft. Gegenüber einer Kontrollgruppe war das Auftreten der r neonatalen Kälberdiarrhoe bei den von den geimpften Kühen abstammenden
Kälbern wesentlich verringert und darüber hinaus ein wirksamer Schutz gegen die durch die neonatale Kälberdiarrhoe
bedingte Mortalität gegeben.
Es werden 114 Viruspassagen bei 37 0C und anschliessend 16 Viruspassagen
bei 31 0C durchgeführt. Mit der erhaltenen Kulturflüssigkeit
werden 4 Stunden alte Kälber geimpft. Nach weiteren ^ 24 Stunden werden die Kälber mit virulentem Virus infiziert.
Sie erkrankten nicht an neonataler Kälberdiarrhoe.
"Bs werden 1 bis 4 Viruspassagen durchgeführt, indem Faeces von
Kälbern mit neonataler Kälberdiarrhoe in das Duodenum von Kälbern ino^kuliert werden. Anschliessend· werden Viruspassagen in Schweinetestikel-Permanentzellkultüren
durchgeführt. Die virushaltige Gewebekulturflüssigkeit kann als Vakzine verwendet werden, wenn
sie nach Inokulation in das Duodenum von Kälbern keine neonatale
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- 17 Kälberdiarrhoe mehr hervorruft. ■
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Claims (5)
1. Verfahren zur Herstellung einer Virusvakzine gegen das
Kälberdiarrhoevirus, dadurc.h gekennzeichnet
dass man das in den Faeces infizierter Kälber enthaltene Kälberdiarrhoevirus abtrennt, gegebenenfalls den
Virustiter durch Passagen durch ein oder mehrere Kälber erhöht, die Virulenz des Virus durch Passagen in Gewebekulturen
so weit abschwächt, dass das Virus Immunität induziert, aber keine Krankheit verursacht, das abgeschwächte Virus
in Gewebekulturen vermehrt, die Gewebekulturen in an sich bekannter Weise erntet und aufarbeitet, das in der Vakzine
enthaltene Virus gegebenenfalls inaktiviert, die Vakzine gegebenenfalls mit einem Adjuvans versetzt.und gegebenenfalls
lyophilisiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man bis zu etwa 200 Viruspassagen bei einer Inkubationstemperatur
von 25 bis 40 0C durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet,
dass man die Viruspassagen bei einer Inkubationstemperatur von 30 bis 37 0C in Schweinenieren- oder Rindernierenzellkultüren
durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Viruspassagen bei einer Inkubationstemperatur
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_ 19 -
von 30 bis 37 0G in Primärkulturen von Rindernierenzellen
durchführt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet,
dass man die Viruspassagen in Schweinetestikelzellkultüren
durchführt.
1.08824/2039
L «
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| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) |