DE1692043B2 - Rhinopneumonitis-Vaccine und Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents

Rhinopneumonitis-Vaccine und Verfahren zu deren Herstellung

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Description

Gegenstand der Erfindung ist eine Vaccine gegen die Rhinopneumonitis-Infektion des Pferdes (Virusabort der Stuten).
Das Rhinopneumonitisvirus (Virusabort der Stuten) führt vorwiegend bei Fohlen zu einer respiratorischen Erkrankung und bei tragenden Stuten häufig zum Abort. Der Erreger gehört in die Gruppe der Herpesviren und ist weltweit verbreitet. Das Virus kann in einem Gestüt großen wirtschaftlichen Schaden anrichten. Bisher wares durch Impfung nicht möglich, das virusbedingte, seuchenhafte Verfohlen in der Pferdezucht zu verhindern. Alle Versuche, einen wirksamen Impfstoff aus inaktivierten oder attenuierten Viren gegen den Stutenabort herzustellen, sind unbefriedigend verlaufen, da entweder keine Immunität zu erzielen war oder das Impfvirus immer noch über eine zu starke Virulenz vefügte.
So führt eine über Goldhamster entwickelte Lebendvaccine noch zu sogenannten Impfaborten. Dieser Impfstoff weist gegenüber dem erfindungsgemäßen erhebliche Nachteile auf. Das dort verwendete Attenuierungsverfahren führt offenbar nur zu einer Abschwächung, nicht aber zu einem Verlust der krankmachenden Eigenschaften des Virus. Dieses wird in aktiver Form vom geimpften Tier ausgeschieden und kann daher bei nicht geimpften Tieren zu so Infektionen führen. Darum wird empfohlen, eine Impfung mit dieser Vaccine nur in verseuchten Gegenden vorzunehmen. Der bekannte Impfstoff wird zum Schutz der Schleimhäute intranasal verabreicht. Die erzielte Immunitätsdauer ist mit 10 bis 12 Wochen sehr kurz. Das Optimum liegt bei 3 bis 4 Wochen nach der Impfung. Die Impfung muß relativ häufig, d. h. 2- bis 4mal pro Jahr wiederholt werden. Demgegenüber handelt es sich bei dem Impfstoff gemäß der Erfindung um ein auf Zellkonturen attenuiertes Virus, das seine krankmachenden Eigenschaften für den Pferdeorganismus gänzlich verloren hat. Die gegen Rhinopneumonitis zu schützenden Stuten werden mit der erfindungsgemäßen Vaccine parenteral geimpft. Dieser Impfmodus führt im Gegensatz zu einer intra- h-5 nasal verabreichten Vaccine nicht nur zur Ausbildung einer lokalen Schleimhautimmunität, sondern veranlaßt den geimpften Organismus insbesondere zur Bildung von hormonalen Antikörpern. Die erfindungsgemäße Rhinopneumonitis-Vaccine führt zu einer langdauernden Immunität: sowohl im 2. als auch im 8. Trächtigkeitsmonat einmal geimpfte Stuten sind gegen einen im 9. und 11. Trächtigkeitsmonat artifiziell provozierten Impfabort geschützt. Eine Einschränkung bezüglich der Bewegungsfreiheit der geimpften Pferde, wie sie nach dem Stand der Technik unerläßlich ist, ist nach der Impfung der Stuten mit der erfindungsgemäßen Vaccine unnötig; sie ist nachgewiesenermaßen ausgezeichnet verträglich.
Es wurde nur eine Vaccine gegen die Rhinopneumonitisvirus-Infektion der Pferde (Virusabort der Stuten), durch Attenuieren des Virus in kontinuierlichen Passagen in primären Zellkulturen aus Geweben, die nicht von Equiden stammen, gefunden, die gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an Rhinopneumonitisvirus, das auf Schaf- oder Ferkelnierenzellkulturen oder auf permanenten Zell-Linien bis zum Verlust der krankmachenden Eige nschaften für den Pferdeorganismus attenuiert worden ist.
Als Erreger der Rhinopneumonitis (Virusabort der Stuten) gemäß der Erfindung kommt das equine Herpesvirus I, das Rhinopneumonitisvirus, in Betracht. Beispielsweise seien als Rhinopneumonitisvirusstämme die Stämme RAC-H, Hannover 1835, Army 183 und Ky-D genannt. Das Rhinopneumonitisvirus wird beispielsweise durch Abstrich aus Nasenschleim von Fohlen oder aus homogensierten Organen eines abortierten Pferdefötus gewonnen.
Die Anzüchtung der Viren kann in bekannter Weise in Zellkulturen (vergleiche Dulbecco und Vοgt, J. exp. Med. 99, [ 1954], Seite 167, und Yοu nger, Proc.Soc. exp. Biol. Med. 85, [1954], Seite 202) oder in Tieren erfolgen. Sie dient dem Zweck, das Virus zu isolieren und zu vermehren, um ausreichend Material für weitere Untersuchungen, wie Passagen, Titrationen und Neutralisationsteste zu gewinnen. Im allgemeinen schließt man an die Isolierung 3-10 Vermehrungspassagen an.
Als Ausgangsmaterial für die Herstellung der Zellkulturen zur Virusanzüchtung und Virusvermehrung kommen Organe wie Nieren, Milz, Hoden, Haut von Pferden, Rindern, Schweinen, Schafen, Ziegen, Affen und kleinen Versuchstieren wie Goldhamster und Kaninchen sowie permanente Zell-Linien, wie beispielsweise BHK 21-ZeIlen, AND-Zellen, HeLa-Zellen, PK 15-Zellen in Frage. Die Anzüchtung der Viren kann auch in Versuchstieren, beispielsweise Goldhamstern, vorgenommen werden. Vorzugsweise kommen in Betracht Nieren von Pferden oder Ferkeln sowie Goldhamster.
Die Attenuierung erfolgt sodann in nicht von Equiden stammenden Zellkulturen. Als primäre Zellkulturen seien beispielsweise solche genannt, die vorzugsweise aus Organen von Huf- und Klauentieren, mit Ausnahme von Equiden, insbesondere aus Schaf- und Schweinenieren, vorzugsweise Ferkelnieren stammen. Auch Zellkulturen aus stabilen Zell-Linien können für die Attenuierung herangezogen werden. Die Zahl der Passagen, die bis zum Verlust der krankmachenden Eigenschaften des Rhinopneumonitisvirus für den Wirtsorganismus, d. h. für das Pferd, durchgeführt werden muß, ist weitgehend von der Art der verwendeten Zellkulturen abhängig. So führen 20 bis 40, vorzugsweise 25 bis 30 Schafsnierenkulturpassagen oder auf 240 bis 300, vorzugsweise 250 bis 280 Ferkelnierenkulturpassagen zur Attenuierung. Für
die abgeschlossene Attenuierung sind folgende Kriterien maßgebend:
a) Der Infcktiositätstiter für Goldhamster nach intraperitonealer Infektion muß gegenüber dem Ausgangswert mindestens um drei Zehnerpotenzen zurückgegangen sein. Für die Titrierungen werden Verdünnungsreihen in Zehnerpotenzen hergestellt, pro Verdünnung 4 Goldhamster mit je 0,2 ml intraperitoneal geimpft und nach der Methode Behrens, B., Arch. exp. Path. Pharmak. 140, 237 (1929) und Kärbert, G., Arch. exp. Path. Pharmak. 162, 480 (1931) errechnet.
b) Die Beibehaltung der immunisierenden Eigenschaften (Antigenität) beim Goldhamster im Vergleich zum Ausgangsvirus muß gewährleistet sein. Hierzu werden Goldhamster mit dem attenuierten Virus (0,5 ml, parenteral) geimpft und 3 Wochen später mit dem virulenten Ausgangsvirus (lOOOO LD50/ml) infiziert (intraperioneal). Es müssen über 70% der geprüften Tiere die Belastungsinl'ektion überleben.
c) Hochträchtige Stuten zwischen dem 7. und 9. Trächtigkeitsmonat, die gegenüber dem Virusabort-Virus empfänglich sind, dürfen nach intramuskulärer oder subcutaner Injektion des attenuierten Virus (5 ml, Virustiter zwischen 106·5 und KID50/ml) nicht erkranken und nicht abortieren. Lokale Impfreaktionen dürften nicht auftreten. Ein kurzdauernder biphasischer Fieberanstieg zwischen 18 und 48 Stunden und dem
8. und 9. Tag ist für die Erstimpfung unbedenklich. Bei der 2. Vaccination darf eine Fieberreaktion nicht mehr beobachtet werden.
d) Fohlen im Alter von 2 bis 3 Monaten, die keine spezifischen Antikörper gegen Rhinopneumonitisvirus enthalten, dürfen nach parenteraler Injektion mit dem attenuierten Virus (5 ml, Virustiter zwischen 106·5 und IO7·5 KID50/ml) nicht erkranken. Ein kurzdauernder Temperaturanstieg ist unbedenklich (vgl. unter a).
Wird ein Adjuvans zugesetzt, so können hierfür beispielsweise mineralische Adjuvantien (vorzugsweise Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat) benutzt werden. Es könen hier auch andere, bei der Vaccineproduktion übliche Zusätze und Hilfsstoffe, beispielsweise Stabilisatoren, zugegeben werden.
Die Vaccine soll einen Titer von 106·110 bis 107·50 KID50/ml, vorzugsweise 107·50 KID50/ml, besitzen.
Falls es erwünscht ist, kann die Vaccine auch lyophil getrocknet werden.
Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Vaccine wurde an trächtigen Stuten gemessen. Dazu werden drei trächtige Stuten, die im 2. bis 3. Trächtigkeitsmonat und/oder im 7. bis 8. Trächtigkeitsmonat sind, mit ml der erfindungsgemäßen Vaccine geimpft und eine Kontrolle wird ungeimpft gelassen. Im 9. bis 11. Trächtigkeitsmonat (im letzten Drittel der Trächtigkeit tritt der Virusabort der Stuten auf) wurden die Versuchstiere mit 10 ml des infektiösen Rhinopneumonitisvirus (Stamm Hannover 1835) durch subcutane Injektion infiziert. Die drei immunisierten Tiere brachten am Ende der normalen Trächtigkeitsdauer gesunde Fohlen zur Welt, während das Kontrolltier infolge der Virusinfektion verfohlte.
Die Herstellung der Zellkulturen und Durchführung der Passagen erfolgt in an sich bekannter Weise. Eine zweckmäßige Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sei nachstehend näher geschildert.
Nieren von Schafen oder Ferkeln werden mechanisch zerkleinert und mit einer 0,25%igen Trypsinlösung in Phosphatpuffer, pH 7,6 die Interzellularsubstanz verdaut. Die Zellen lösen sich hierbei einzeln aus dem Gewebeverband heraus, bleiben jedoch vom Trypsin unbeeinflußt und behalten ihre Teilungsfähigkeit bei. Die in der Trypsinlösung suspendierten Zellen v/erden auszentrifugiert, mehrmals gewaschen, z.B. mit phosphatgepufferten 0,85%iger Natriumchloridlösung und anschließend in einer Kulturflüssigkeit resuspendiert.
Als Kulturflüssigkeit eignen sich beispielsweise Hanks' Lösung, Earle'sche Lösung und Eagle's Medium, Tissue Culture Medium 199 (TCM 199) mit Lactalbuminhydrolysat, Kälberserum und Amnionflüssigkeit, vorzugsweise Rinderamnionflüssigkeit sowie Virusmedium VM 2 a.
Eine bevorzugte Kulturflüssigkeit stellt Hanks'- oder Earle'sche Lösung dar mit 0,5% Lactalbuminhydrolysat, 10% Kälberserum, Antibiotika, z. B. 100 IE Penicillin und 50 gamma Streptomycin oder 100 gamma Dihydrostreptomycin/ml sowie 0,01% Phenolrot als Indikator. Die Kulturflüssigkeit wird durch Zugabe von Natriumcarbonat oder Begasen mit 5 % Kohlendioxid auf einen pH-Wert von 7,0 bis 7,5, vorzugsweise 7,3, eingestellt.
Die im Medium suspendierten Zellen werden in Glasgefäße eingefüllt und bei etwa 37° C bebrütet. Die Nierenzellen setzen sich dabei auf dem Glasboden fest, vermehren sich durch Zellteilung und bilden bald einen dichten, eng aneinandergefügten Zellrasen. Nach etwa 3 bis 4 Tagen wird das verbrauchte Nährmedium durch neues ersetzt. Wenn der Zellkulturrasen ausgewachsen ist-gewöhnlich nach weiteren 2 bis 3 Tagen - wird er z. B. bei Roux-Schalen-Kulturen mit 0,5 ml, bei Röhrchen-Kulturen mit 0,1ml der entsprechenden Virussuspension beimpft.
Die Viruszüchtung und Virusvermehrung wird im allgemeinen bei 37° C durchgeführt. Die Gewebekulturzellen vermehren dabei das Virus und geben die neu gebildeten Viruspartikel an das umgebende Nährmedium ab. Das virushaltige Medium einer Zellkultur wird für die Beimpfung der nächsten Zellkultur verwendet und auf diese Weise werden die Attenuierungspassagen durchgeführt.
Entspricht das durch Passierung gewonnene Virus den geschilderten Kriterien für die Attenuierung, so kann die Virussuspension als Vaccine verwendet werden. Dabei wird als Kulturmedium VM 2 a oder ein anderes, nicht serumhaltiges, synthetisches Medium verwendet. Ferner kann es zweckmäßig sein, ein Adjuvans, wie z. B. Aluminiumhydroxid, zuzusetzen und durch Gefriertrocknung ein Trockenpräparat herzustellen. Es eignet sich vorzüglich nach Wiederauflösung in einem Lösungsmittel, z. B. gepuffertem Aqua dest., zur Immunisierung der Pferde gegen die Rhinopneumonitis der Pferde (Virusabort der Stuten).
Beispiel 1
Mit einem sterilen Wattebausch wird von einem infizierten Fohlen Nasenschleim gewonnen. Der Wattebausch wird in 5 ml Hank's Medium ausgespült. Diese Spülflüssigkeit wird in 15 Minuten niedertourig zentrifugiert (3000 U/min). Der Überstand (4,5 ml) wird mit 0,5 ml Streptomycin-Penicillin-Lösung eine
halbe Stunde inkubiert und dann 2 ml Pferdenierenkulturen, die in 100 ml Erlenmeyerkolben angesetzt wurden und mit lü ml Kulturflüssigkeit übe;rschichtet sind, verimpft. Eine derartig beimpfte Kultur wird nach einer bis 24stündigen Adsorption ausgewaschen, mit Erhaltungsmedium (Hanks' Lösung mit 0,5% Lactalbuminhydrosylat und 2,0% Kälberserum sowie Antibiotika und Phenolrot) überschichtct und bei 37 ° C gehalten. Die Virusaberntung wird noch weiteren 5 Pferdenierenkulturpassagen unterworfen und danach auf Schafsnierenkulturpassagen übertragen. Als Impfmenge dienen 2 ml der vorhergehenden Passage, von der 20. Passage ab genügt 1 ml. Auch hierbei wird als Erhaltungsmedium Hanks' Lösung mit 0,5% Lactalbuminhydrolysat und 2,0% Kälberserum sowie Antibiotika und Phenolrot verwendet. Die Kulturen werden 6 bis 10 Tage täglich mikroskopisch kontrolliert. Jede 5. Passage wird serumfrei ausgeführt und an Goldhamstern geprüft, ob das Virus Pttenuiert ist. Nach 25 Schafsnierenkulturpassagen war dieses Ziel erreicht. Die virushaltige Aberntung der 25. Passage wird gewonnen und mit 0,1% Aluminiumhydroxid versetzt. Der Virusgehalt dieser Vaccine beträgt 106ü KIDJ0/ml.
Beispiel 2
Unter sterilen Bedingungen werden Leber, Lunge, Milz und Niere eines abortierten Pferdefötus entnommen und die einzelnen Organe mit Natriumchlorid-Phosphatpuffer pH 7,2, 100 ΙΕ/ml Penicillin und 100 gamma/ml Dihydrostreptomycin sowie mit Seesand j im Mörser zerrieben und zentrifugiert (20 Minuten 3000 U/min). Der Überstand des Zentrifugates wird in Mengen von je 0,5 ml auf mindestens vier Reagenzglaskulturen aus Ferkelnieren (ohne Erhaltungsmedium) zur Adsorption gegeben. Nach 2stündiger Ad-
lu sorption bei 37° C im Brutschrank wird das Impfmaterial von der Zellkultur abgezogen und die Kulturen mit jeweils 2;0 ml Erhaltungsmedium (sterile Rinderamnionflüssigkeit, Antibiotika und Phenolrot) überschichtet. Die Kulturen werden täglich mikroskopisch kontrolliert. Wenn ein spezifischer cytopathogener Effekt aufgetreten ist, wird der Überstand der Kultur nach der Adsorptionsmethode auf eine neue Kultur übertragen und die Passagen auf diese Weise fortgeführt. Nach etwa 5 Passagen genügt 0,1 ml des Uberstandes der vorausgehenden Kultur für die weitere Passagierung. Nach 100 Passagen werden nur noch 100 ΙΕ/ml übertragen. Jede 20. Passage wird am Goldhamster geprüft. Bei der 255. Passage hatte der Infektiositätstiter für Goldhamster um drei Zehnerpotenzen abgenommen. Der Abguß dieser Passage wird mit 0,1% Aluminiumhydroxid versetzt. Der Virusgehalt beträgt 1070 KID50/ml.

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Parenteral verabreichbare Vaccine gegen die Rhinopneumonitisvirus-Infektion des Pferdes (Virusabort der Stuten) durch Attenuieren des Virus in kontinuierlichen Passagen in primären Zellkulturen aus Geweben, die nicht von Equiden stammen, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Rhinopneumonitisvirus, das auf Schaf- oder Ferkelnierenzellkulturen oder auf permanenten Zell-Linien bis zum Verlust der krankmachenden Eigenschaften für den Pferdeorganismus attenuiert woren ist.
2. Vaccine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein mineralisches Adjuvans, vorzugsweise Al (OH)3 enthält.
3. Vaccine gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie lyophil getrocknet wurde.
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