DE1692043A1 - Rhinopneumonitis-Vaccine und Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents

Description

zur Patentanmeldung FV 5658 A « Ma I03

Rhinopneumonitis-Vaccine und Verfahren zu deren Herstellung

Gegenstand der Erfindung ist eine Vaccine gegen die Rhinopneumonit is -Infekt ion des Pferdes (Virusabort der Stuten) und ein Verfahren mu deren Herstellung.

Das Hhinopneumonitlsvirus (Virusabort-Virus der Stuten) führt vorwiegend bei Fohlen zu einer respiratorischen Erkrankung und bei tragenden Stuten häufig sum Abort. Der Erreger gehört in die Gruppe der Herperviren und 1st weltweit verbreitet. Das Virus kann in einem Gestüt grossen wirtschaftlichen Schaden anrichten. Bisher war· -*s durch Impfung nicht möglich, das virusbedingte, seuchenhafte Verfehlen in der Pferdezucht au verhindern· Alle Versuche, einen wirksamen Impfstoff aus inaktivierten oder attenuierten Viren gegen den Studenabort herzustellen, sind unbefriedigend verlaufen, da entweder keine Immunität «u erzielen war oder das ImpfVirus immer noch ttber eine zu starke Virulenz verfügte.

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So führt eine über Goldhamster entwickelt· Lebendvacoine noch BU sogenannten Impfaborten.

Es wurde nun eine Vaccine gegen die Rhinopneuaonitisvirus-Infektion der Pferde (Virusabort der Stuten) und ein Verfahren »u deren Herstellung gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man Rhinopneumonitisvirus, nach An-BÜchtung, durch kontinuierliche Passagen in primären Zellkulturen aus Geweben, die nicht von Squiden stammen, bis rum Verlust der krankmach«» ύ%η Elf ««^schäften für den Pferdeorganismus attenuiert, d* virrs?· ·.< tigen Aberntungen gegebenen· falls mit einem Adjuver;, versetzt und gegebenenfalls lyophil trocknet.

Als Erreger der Rhlnopneuwonitis (Virusabort der Stuten) gemäss der Erfindung kommt das equine Herpesviru* I« das Rhinopneumonitisvirus, in Betracht. Beispielsweise selen als Rhlnopneumonitisvirusstämme die Si «raw e RAC-H, Hannover 1835· Army 183 und Ky-D genannt. Das Rhinopneumonltisvlrus wird beispielsweise durch Abstrich aus Nasenschleim von Fohlen oder aus homogenisierten Organen eine* abortieren Pferdefötus gewonnen.

Die AnxUchtung der Viren kann in bekannter Welse in Zellkulturen (vergleiche DULBECCO und VOGT, J.exp.Med. 99, (195^)» Seite I67, und TOUNGHER, Proc.Socexp Biol.Med. 8£, (1934), Seit*? ?02) «der in Tieren erfolgen, Sie dient dem Zweck, das Virtus sbu Isolieren und asir ,'»rmehren, um auereichend Materiel t*hr weitere Untersuchungen, wie Passagen, Titrationen <.ui4 Keuf-yaliSÄtioneteete xu gewinnen, Im allgemeinen a*wili«#st 'Λΐη sn die Isolierung 3-10 Vermehrung«» passaf-nn an»

Al« Aussaat »material für die Herstell^ing der ZeI ikul türen 8ur V irusanailchtung und Vlrusv«rmehrus« kommen Organe wie Nieren, Milss, Hoden, Haut von Pf??d«n_; Rindern, Scliweinen, Schafen, Ziegen, Affen und kleinen Versuchstieren wie GoIdhför^tsor und Kaninehen sowie permanente Ze 11 -LInIen, wie

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beispielsweise BHK 21-Zellen, AND-Zellen, HeLa-Zellen, PK 15-Ζβ11·η und ΙΙΚ-13-Ζ·11·η in Prag·. Die AnzUchtung der Viren kann auch in Versuchstieren, beispielsweise Goldhamstern, vorgenommen werden. Vorzugsweise können in Betracht Nieren von Pferden oder Ferkeln sowie GoIdhamster.

Die Attenuierung erfolgt in nicht von Equiden stanwenden Zellkulturen. Als primäre Zellkulturen seien beispielsweise solche genannt, die vorzugsweise eus Organen von Huf- und Klausntieren, mit Ausnahme von Equiden, insbesondere «tu * Schaf- und Schweinenieren, vorzugsweise Psrkelnieren stammen. Auch Zellkulturen aus stabilen Zell-Linien können für die Attenuierung herangesogen werden«

Die Zahl der Passagen, die bis zum Verlust der krankmachenden Eigenschaften des Rhinopneumonitisvirus tür den WirtβOrganismus , d.h. für das Pferd, durchgeführt werden »use, ist weitgehend von der Art der verwendeten Zellkulturen abhängig. So führen 20 - 4θ, vorzugsweise 25 bis 30 Schafsnierenkulturpassagen oder auch 24θ bis 3OG _: vorzugsweise 250 bis 28θ Ferkeini er enkulturpassagen zur A >,'■ -^m^rvng= Für die abgeschlossene Attenuierung sind folgende Kri^!:;*ri«i messgebend:

a) Der Infektiositätstiter für Goldhamster nach intraperitonealer Infektion muss gegenüber dem Ausgangswert mindestens um drei Zehnerpotenzen zurückgegangen sein. Für die Titrierungen werden Verdünnungsreihen in Zehnerpotenzen hergestellt, pro Verdünnung k Goldhamster mit je 0,2 ml intraperitoneal geimpft und nach der Methode BEHRENS,B., Arch.exp.Path.Pharmak. l40, 237 (1929) undKÄRBER, G., Arch.exp.Path.Pharmak. 162. A8o (1931) errechnet.

b) Die Beibehaltung der immunisierenden Eigenschaften (Antigenltät) beim Goldhamster im Vergleich zum Auegangsvirus muss gewährleistet sein. Hierzu werden Goldhamster mit

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dent attenuierten Virus (0,5 ml, parenteral) geimpft und 3 Wochen später mit dem virulenten Auegangsvirus (10,000 LD-₀/ml) Infiziert (intraperitoneal). Es müssen über 70 % der geprüften Tiere die Belastungsinfektion überleben.

c) Hochträchtige Stuten zwischen dem 7. und 9. Trächtig- *keitsmonat, die gegenüber dem Virueabort-Virue empfäne;-lich sind, dürfen nach intramuskulärer oder subcutaner Injektion des attenulerten Virus (5 ml, Virustiter zwischen 10 *" und 10''" KID-q/oiI) nicht erkranken und nicht abortleren. Lokale Impf reaktionen dürfen nicht auftreten. Ein kursdauernder biphasischer Fieberanstieg zwischen 18 und 48 Stunden und dem 8. und 9· Tag ist für die Erstimpfung unbedenklich. Bei der 2. Vaccination darf eine Fieberreaktion nicht mehr beobachtet werden.

d) Fohlen im Alter von 2-3 Monaten, die keine spezifischen -Jfcxrtikörper gegen Rhinopneumonit is virus enthalten

nach parenteraler Injektion mit dem attenuierten Virus (5 ml, Virustiter zwischen 1O⁶'⁵ und 1O⁷'⁵ KID-₀/ml) nicht erkranken. Ein kursdauernder Temperaturanstieg ist unbedenklich (vgl. unter c).

Wird ein Adjuvans zugesetzt, so können hierfür beispielsweise mineralische Adjuvantien (vorzugsweise Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat) benutzt werden. Es können hier auch andere, bei der Vaccineproduktion übliche Zusätze und Hilfestoffe, beispielsweise Stabilisatoren, zugegeben werden.

Die Vaccine soll einen Titer von 10⁶'⁰⁰ bis 10^7l5° KID-_o/ml,

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vorzugsweise 10''^p KID_₀/ml, besitzen»

Falls es erwünscht ist, kann die Vaccine auch lyophil getrocknet werden«

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Di· Wirksamkeit der erfindungsgemässen Vaccine wurde an trächtigen Stuten gemessen. Dazu werden drei trächtige Stuten, die im 2. bis 3* Trächtigkeitsmonat und/oder im 7« bis 8. Trächtigkeitsmonat sind, mit 5 ml der erfindungβ-gemüseen Vaccine geimpft und eine Kontrolle wird ungeimpft gelassen. Im 9. bis 11. Trächtigkeitsmonat (im letzten Drittel der Trächtigkeit tritt der Virusabort der Stuten auf) wurden die Versuchstiere mit 10 ml des infektiösen RhinopneumonitTisvirue (Stamm Hannover I835) durch subcutane Injektion infiziert. Die drei immunisierten Tiere brachten am Ende der normalen Trächtigkeitsdauer gesunde Fohlen zur Welt, während das Kontrolltier infolge der VirusInfektion verfohlte.

Die Herstellung der Zellkulturen und Durchführung der Passagen erfolgt in an sich bekannter Weise. Eine sweckmässige Ausführung«ferm des erfindungsgemässen Verfahrens sei nachstehend näher geschildert.

Nieren von Schafen oder Ferkeln werden mechanisch zerkleinert und mit einer 0,25 &Lgen TrypsinlÖsung in Phosphatpuffer, pH 7,6 die Interzellularsubstanz verdaut. Die Zellen lösen sich hierbei einzeln aus dem Gewebeverband heraus« bleiben jedoch vom Trypsin unbeeinflusst und behalten ihre Teilungsfähigkeit bei. Die in der TrypsinlÖsung suspendierten Zellen werden auszentrifugiert, mehrmals gewaschen, z.B. mit phosphatgepufferter 0,85 ftLger Natriumchloridlösung und anschliessend in einer KulturflUssigkeit resuspendiert.

Als Kulturflüssigkeit eignen sich beispielsweise Hanks'Lösung, Earle'sche Lösung und Eagle's Medium, Tissue Culture Medium (TCM 199) mit Lactalbuminhydrolysat, Kälberserum und Amnionflüssigkeit, vorzugsweise Rinderamnionflüssigkeit sowie Virusmedium VM 2a.

Eine bevorzugte Kulturflüssigkeit stellt Hanks·- oder Barle'sche Lösung dar mit 0,5 % Lactalbuminhydrolysat, 10 % Kälberserum,

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Antibiotika, B.B. 100 IE Penicillin und 50 gamma Streptomycin oder 100 gamma Dihydro*treptomycin/ml sowie 0,01 % Phenolrot ala Indikator. Die KuIturflUssigkeit wird durch Zugabe von Natriumbicarbonat oder Begasen mit 5 % Kohlendioxid auf einen pH-Wert von 7,0 bia 7,5, vorzugsweise 7,3 eingestellt.

Die im Medium suspendierten Zellen werden in Glasgefässe eingefüllt und bei etwa 37°C bebrütet. Die Nierenzellen setzen sich dabei auf dem Glasboden fest, vermehren sich durch Zellteilung und bilden bald einen dichten eng aneinandergefügten Zellrasen. Nach etwa 3-4 Tagen wird das verbrauchte Nährmedium durch neues ersetzt. Wenn der Zellkulturrasen ausgewaschen ist -gewöhnlich nach weiteren zwei bis drei Tagenwird er z.B. bei Roux-Schalen-Kulturen mit 0,5 ml, bei Röhrchen-Kulturen mit 0,1 ml der entsprechenden Virussuspension beimpft.

Die Viruszüchtung und Virusvermehrung wird im allgemeinen bei 37°C durchgeführt. Die Gewebekultursellen vermehren dabei das Virus lind geben die neugebildeten Viruspartikel an das umgebende Nährmedium ab. Das virushaltige Medium einer Zellkultur wird für die Beimpfung der nächsten Zellkultur verwendet und auf diese Weise werden die Attenuierungspassagen durchgeführt.

Entspricht das durch Passierung gewonnene Virus den geschilderten Kriterien für die Attenuierung, so kann die Virus sue p ens ion als Vaccine verwendet werden. Dabei wird als Kulturmedium VM 2a oder ein anderes, nicht serumhaltiges, synthetisches Medium verwendet. Ferner kann es sweckmässig sein, ein Adjuvans, wie z.B. Aluminiumhydroxid, zuzusetzen und durch Gefriertrocknung ein Trockenpräparat herzustellen. Es eignet sich vorzüglich nach Wiederauflösung in einen Lösungsmittel, z.B. gepuffertem Aqua dest., sur Immunisierung der Pferde gegen die Rhinopneumonitis der Pferde (Virusabort der Stuten).

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Mit einem sterilen Wattebausch wird von einem infizierten «■ Fohlen Nasenschleim gewonnen. Der Wattebausch wird in 5 ml Hanks«Medium ausgespült. Diese SpUIflüssigkeit wird 15 Minuten niedertourig zentrifugiert (3000 Ό/min). Der Überstand (4,5 ml) wird mit 0,5 »1 Streptorayein-Penicillin-Lösung eine halbe Stunde inkubiert und dann 2 ml auf Pferdenierenkulturen, die in 100 ml Erlenmeyerkolben angesetzt wurden und mit 10 ml KulturflUasigkeit Uberschichtet sind verimpft. Eine derart beimpfte Kultur wird nach einer bis 2^-stUndigen Adsorption ausgewaschen, mit Erhaltungemedium (Hanks'Lösung mit 0,5 # Lactalbuminhydrolysat und 2,0 9» Kälberserum sowie Antibiotika und Phenolrot) Überschichtet und bei 37°C gehalten. Die Virusaberntung wird noch weiteren 5 Pferdenierenkultur-Passagen unterworfen und danach auf Schafsnierenkulturpaasagen übertragen. Als Impfmenge dienen 2 ml der vorhergehenden Passage, von der 20. Passage ab genügt 1 ml. Auch hierbei wird als Erhaltungsmedium Hanks*Lösung mit 0,5 94 Lactalbumlnhydrοlyeat und 2,0 % Kälberserum sowie Antibiotika und Phenolrot verwendet. Die Kulturen werden 6-10 Tage täglich mikroskopisch kontrolliert. Jede 5* Passage wird serumfrei ausgeführt und an Goldhamstern geprüft, ob das Virus attenuiert ist.' Nach 25 Schafsnierenkulturpassagen war dieses Ziel erreicht. Die virushaltige Aberntung der 25. Passage wird gewonnen und mit 0,1 % Alumlniumhydroxid versetzt. Der Virusgehalt dieser Vaccine beträgt 10 * KID₅₀/ml.

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Beispiel 2

Unter sterilen Bedingungen werden Leber, Lunge, HiIs und Niere einea abortierten Pferdefötus entnommen und die einseinen Organe mit Natriumchlorid-Phosphatpuffer pH 7,2, 100 IE/ral Penicillin und 100 g«mmii/ml Dihydrostreptomycin sowie mit Seesand in Mörser «errieben und zentrifugiert (20 Minuten, 3000 U/min). Der Überstand des Zentrifugates wird in Mengen von je 0,5 »1 auf Mindestens vier Reagensglaskultüren aus Ferkelnieren (ohne Erhaltungsmedium) sur Adsorption gegeben. Nach 2-stfindiger Adsorption bei 37°C im Brutschrank wird das Impfmaterial von der Zellkultur abgezogen und die Kulturen mit Jeweils 2,0 ml Erhaltungemedium (sterile Rinderamnionflüssigkeit, Antibiotika und Phenolrot) überschichtet. Die Kulturen werden tüglich mikroskopisch kontrolliert. Wenn ein spesifischer cytopatho· gener Effekt aufgetreten ist, wird der Überstand der Kultur nach der Adsorptionsmethode auf eine neue Kultur übertragen und die Passagen auf diese Weise fortgeführt* Nach etwa 5 Passagen genügt 0,1 ml des Überstandes der vorausgehenden Kultur für die weitere Passagierung. Nach 100 Passagen * werden nur noch 100 ΙΕ/ml übertragen. Jede 20. Passage wird am Goldhamster geprüft. Bei der 255* Passage hatte der Infektiomltätstiter für Goldhamster um drei Zehnerpotenzen abgenommen. Der Abguss dieser Passage wird mit 0,1 % Aluminiumhydroxid versetat. Der Virusgehalt beträgt 10^7f0KID₅₀/ml.

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Claims (5)

Patentanspruch·

1. Vaccine gegen die Rhinopneumonitisvirus-Infektion der Pferde (Virusabort der Stuten), gekennzeichnet durch*in kontinuierlichen Passagen in primären Zellkulturen aus Geweben, die nicht von Equiden stammen, bis sum Verlust der krankmachenden Eigenschaften für den Pferdeorganisnus attenuiertes Rhinopneumonitisvirus.

2ι Vaccine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet« dass sie ein Adjuvans enthält·

3· Vaccine gemäss Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass sie lyophil getrocknet wurde.

4. Verfahren xur Herstellung einer Vaccine gegen die Rhinopneumonitisvirus-Infektion der Pferde (Virusabort der Stuten), dadurch gekennzeichnet, dass man Rhinipneumonitisvirus nach AnsUchtung durch kontinuierliche Passagen in primären Zellkulturen aus Geweben, die nicht von Equiden stammen, bis sum Verlust der krankmachenden Eigenschaften für den Pferdeorganismus attenuiert, die virushaltigen Aberntungen gegebenenfalls mit einem Adjuvans versetzt und gegebenenfalls lyophil trocknet·

5.i Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Attenuierung auf Schaf- oder Ferkelnierenzellkulturen durchgeführt wird·

6* Verfahren gemäss Anspruch k und 5· dadurch gekennzeichnet, ; dass die Attenuierung auf Kulturen von permanenten Zell-Linien durchgeführt wird.

* «inen Gehalt an

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