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Verfahren zur Herstellung einer verbesserten
Hund estaupevirusvaccine
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer verbesserten Hundestaupevirusvaccine.
Hundestaupevirusvaccine wird im allgemeinen hergestellt, indem ein avirulenter Stamm entwickelt wird, der an die Fortpflanzung in Kükenembryos adaptiert ist und indem dann lebende Kükenembryos damit geimpft, eine Reihe von Tagen bebrütet werden und dann das infizierte Gewebe geerntet wird. Die Standard-Hundestaupevaccine ist immunologisch wirksam, hat aber noch den Nachteil, mit dem Gewebe der Embryos verunreinigt zu sein, wodurch manchmal beim Wirt unerwünschte Nebenreaktionen hervorgerufen werden. Diese Nebenreaktionen wurden früher notgedrungen geduldet, um die gewünschte Immunität zu erhalten.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Fortpflanzung eines an Kükenembryos adaptierten Hundestaupevirus in Gewebekulturen, die nur ein Minimum an Kükenembryogewebe enthalten. Die Lösung ist jedoch nicht einfach. Versuche zur Fortpflanzung eines modifizierten Hundestaupevirus in Hunde- und Frettchengewebe misslangen und bis zum Zeitpunkt der vorliegenden Erfindung wurde keine gewebsfortgepflanzte Hundestaupevirusvaccine hergestellt.
Erfindungsgemäss wird ein Verfahren zur Herstellung einer verbesserten Hundestaupevirusvaccine ent- wickelt, wobei Hundestaupevirus durch eine ausreichende Zahl von Passagen durch lebende Kükenembryos zur Avirulenz gebracht wird, das avirulente Virus in eine Kultur von Kükenembryogewebe geimpft, bebrütet und die erhaltene Vaccine geerntet wird. Die von so gezüchtetem Hundestaupevirus geerntet Vaccine ist praktisch frei von den Nachteilen der Standard-Hundestaupe-Virusvaccine, die in lebenden Embryos fortgepflanzt wird. Die Kultur des Kükenembryogewebes erzeugt offensichtlich keine unerwünschten Nebenreaktionen im Wirt, wenn diese Vaccinen zur Immunisierung von Hunden verwendet werden.
Es ist nicht bekannt, welche im Ei mit dem Embryo anwesenden Bestandteile für die unerwünschten Nebenreaktionen in erster Linie verantwortlich sind und die nicht in der Gewebekulturvaccine der vorliegenden Erfindung anwesend sind.
Eine Vaccine, oder genauer eine Viruskultur, verliert häufig die Antigenwirktmg bei der serienweisen Züchtung in heterologen Geweben. Es ist ein wichtiger Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass das nicht vorkommt, selbst nicht nach 42 Passagen durch Kükenembryogewebskultur. Die erhaltene Vaccine ist antigen mit einem bemerkenswert niedrigen Virus CED50 von 0, 15 pro 0, 2 ml (der CED-Wert wird logarithmisch ausgedrückt). Das Virus kann in Form einer Vaccine nach der ersten Gewebekulturpassage geerntet werden, wird aber üblicherweise erst nach einer Anzahl von Passagen geerntet, da bei Reihenpassagen ein gewisser Anstieg des Titers eintritt.
Das Virus bleibt nicht nur in seiner Antigenwirkung bei aufeinanderfolgenden Passagen durch Küken-
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bleibtneutralisationsverfahren sichergestellt, wobei das ursprüngliche Hundestaupevirus verwendet wurde, sowie durch die Standard-Frettchenimmunisierung. Die Ergebnisse dieser Versuche werden weiter unten genauer dargestellt.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die geerntet Vaccine nicht besonders labil ist und zur Aufbewahrung ohne bemerkenswerten Verlust der Wirksamkeit gefriergetrocknet werden kann.
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Der Verlust des CED50-Wertes pro ml beträgt nicht mehr als 1, 0-1, 5 und es tritt kein Verlust der immunilogischen Aktivität auf, da der CED-Wert erheblich über dem Minimum für brauchbare Immunisierung bleibt. Mit andern Worten, die verbesserte Eigenschaft der Vaccine, das Nichtauftreten von we- sentlichen Nebenreaktionen, wird erreicht, ohne dass dieser Vorteil durch Nachteile in Frage gestellt wird.
Die bei der vorliegenden Erfindung verwendete Gewebekultur kann aus Kükenembryos von verschiedenem Alter erhalten werden. Ausgezeichnete Ergebnisse werden durch Verwendung von Geweben von 9 Tage alten Embryos erhalten.
Beispiel l : Kükenembryogewebe von 9 Tage alten Embryos wurde nach dem Standardverfahren vonDulbecco und Vogt, J. Exp. Med., Volume 99, Seite 167, mit Trypsin behandelt. Die Gewebe wurden in Standard-Povitsky-Flaschen verwendet, wobei die Wachstumsflüssigkeit aus Earle'sBasalmedium be- stand, das Lactalbuminhydrolysat und 15 - 200/0 normales Kalbserum enthielt ; unmittelbar vor der Imp- fung bei jeder Passage wurden die Züchtungsflaschen mit 100 ml einer sogenannten synthetischen Mischung Nr. 199 erneuert, die in Proc. Soc. Exp. Blo. and Med., Volume 73, Seite 1, beschrieben ist. Die Beimpfung wurde mit der 48.
Passage von modifiziertem Hundestaupevirus durch lebende Kükenembryos durchgeführt, wobei das Impfmaterial 5, 0 ml einer 40 ig infizierten Chorioallantoismembran war. Die Flaschen wurden bei 370C bebrütet und mikroskopisch 7 Tage untersucht. Es wurde kein wesentlicher cytopathogener Effekt beobachtet und jede Passage wurde so durchgeführt, dass eine Schicht in die Flüssigkeit gebracht, die Flüssigkeit abgekühlt, gemahlen und mit 5, 0 ml Suspension pro Flasche Gewebskultur beimpft wurde. Es wurden Serienpassagen ausgeführt und nach der 15. Passage und bis zu einer Gesamtzahl von 64 Passagen wurden die Ernten nicht nur als unverdünnt Suspension beimpft, sondern auch in Kükenembryos titriert, wobei Titer von Id"bis 10"'erhalten wurden ; die Mehrzahl lag zwischen fund 104, 5.
Diese Titer sind von der gleichen Grössenordnung wie die von Viren, die durch Passagen durch lebende Kükenembryos erhalten wurden.
Virenausbeuten aus der 19. und 20. Reihenpassage wurden zu verschiedenen Tagen des Bebrütens bestimmt und zeigten, dass ein Maximum am 4. Tag erreicht wurde. Nach dem Abernten am 4. Tag und dem Mahlen in einem Waring-Mischer wurden die Suspensionen zur Aufbewahrung gefriergetrocknet.
Beispiel 2 : Die Identität des Virus in den erzeugten Vaccinen wurde nach 10facher Verdünnung der Vaccine bestimmt und durch Neutralisationsuntersuchung unter Verwendung einer 1 : 8 Verdünnung des Hundestaupe-Immunisierungshundeserums und normalen Hundeserums bestätigt, und der CED--Wert berechnet, indem mit 0, 2 ml Dosen von jeder Serie in 10facher Verdünnung in die Choriollantoismembran von Kükenembryos geimpft und anschliessend 7 Tage bei 35 - 360C bebrütet wurde. Die infizierten Membranen wurden dann auf typische Verdickung und undurchsichtige, scharfe Stellen beobachtet und der CED5Q-Wert nach der Reed- und Muench-Formel berechnet (beschrieben in Am. J. Hyg., Volume 27, Seite 493).
Die erhaltenen CED50-Werte sind die im allgemeinen Teil der vorliegenden Beschreibung erwähnten.
Beispiel 3 : Die Wirksamkeit der gemäss Beispiel 1 hergestellten Vaccine wurde durch intraperitoneale Impfung von normalen Frettchen mit 1, 0 ml frischer, unverdünnter Suspension und auch mit 1 ml Dosen von Vaccine geprüft, die durch Wiederherstellung des Standardvolumens mit sterilem, destilliertem Wasser aus den gefriergetrockneten Vaccinen erhalten wurde. Es wurden auch 10fache, 100fache und 1000fache Verdünnungen ausgeführt.
Die Frettchen wurden dann zusammen mit normalen Kontrollfrettehen, die keine Vaccine erhalten hatten, mit einem Standardstamm von virulentem Hundestaupevirus geprüft. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt, wobei die Vaccine aus verschiedenen Passagen erhalten wurden, wie in der Tabelle gezeigt ist.
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Tabelle
EMI3.1
<tb>
<tb> Immunisierung <SEP> von <SEP> Frettchen <SEP> mit <SEP> Gewebskultur-Hundestaupevirus
<tb> Passage <SEP> Impfmaterial <SEP> CED50 <SEP> Vergleichsversuche:
<tb> Verdünnung <SEP> injiziert <SEP> Zahl <SEP> der <SEP> toten <SEP> Tiere <SEP> beim <SEP> Versuch
<tb> (1 <SEP> ml) <SEP> zur <SEP> Gesamtzahl <SEP> der <SEP> geprüften <SEP> Tiere
<tb> immunisierte <SEP> Kontroll- <SEP>
<tb> Frettchen <SEP> Frettchen
<tb> 22 <SEP> unverdünnt <SEP> 2, <SEP> 9 <SEP> 0/2 <SEP> 2/2
<tb> 34 <SEP> unverdünnt <SEP> 3, <SEP> 4 <SEP> 0/2
<tb> (1) <SEP> (2)
<tb> 42 <SEP> unverdünnt <SEP> 5, <SEP> 2 <SEP> 1/2
<tb> 10-1 <SEP> 4, <SEP> 2 <SEP> 0/3
<tb> 10-2 <SEP> 3,2 <SEP> 0/2 <SEP> (2) <SEP> 2/2
<tb> 10-3 <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP> 0/3
<tb> 10-4 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 0/2 <SEP> (z)
<tb> 10"''0, <SEP> 2 <SEP> 0/3
<tb>
1.
Ein Frettchen starb an Lungenentzündung 10 Tage nach den Vergleichsver- suchen ohne Staupesymptome.
2. Immunisierte Frettchen, die an Zwischeninjektionen starben, bevor die
Vergleichsversuche durchgeführt wurden und keine Staupesymptome zeigten, wurden nicht in die Tabelle aufgenommen.
In jedem Fall trat also selbst bei so hohen Verdünnungen wie 100000 mit einem so niedrigen CED- Wert wie 0,2, vollständige Immunisierung ein. Die wiederhergestellten, gefrorenen Vaccine wurden auf die gleiche Art wie oben beschrieben wurde, verwendet, wobei die gefrorenen Vaccine aus drei verschiedenen Passagen entnommen und eine von ihnen unverdünnt sowie mit drei Verdünnungen verwendet wurde.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt.
Tabelle
EMI3.2
<tb>
<tb> Immunisierung <SEP> von <SEP> Frettchen <SEP> mit <SEP> experimentellen <SEP> Gewebskultur-Hundestaupevaccinen
<tb> Passage <SEP> Impfmaterial <SEP> CED <SEP> Vergleichsversuche <SEP> : <SEP>
<tb> Verdünnung <SEP> (injiziert) <SEP> Zahl <SEP> der <SEP> toten <SEP> Tiere <SEP> beim <SEP> Versuch
<tb> (1 <SEP> ml) <SEP> zur <SEP> Gesamtzahl <SEP> der <SEP> geprüften <SEP> Tiere
<tb> immunisierte <SEP> KontrollFrettchen <SEP> Frettchen
<tb> 3 <SEP> unverdünnt <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> 0/3 <SEP> 2/2
<tb> 33 <SEP> unverdünnt <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP> 0/3 <SEP> 2/2
<tb> 34 <SEP> unverdünnt <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP> 1/6 <SEP> (1) <SEP> 4/4
<tb> 10-1 <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP> 0/3
<tb> 10-2 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 0/3
<tb> 10-3 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0/3
<tb>
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In jedem Falle wurde mit der frischen Vaccine gleichförmig wirksame Immunisierung erhalten. In keinem Fall wurden irgendwelche Nebenreaktionen beobachtet, wie manchmal bei Hundestaupevaccinen der Fall ist, die mittels Serienpassagen durch lebende Kükenembryos erhalten wurden.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung einer verbesserten Hundestaupevirusvaccine, wobei Hundestaupevirus mittels einer ausreichenden Zahl von Passagen durch lebende Kükenembryos avirulent gemacht wird, dadurch gekennzeichnet, dass das avirulente Virus in eine Kultur von Kükenembryogewebe geimpft und bebrütet und die erhaltene Vaccine nach an sich bekannten Methoden gewonnen und gegebenenfalls gefriergetrocknet wird.