DE2058645C2

DE2058645C2 - Verfahren zur Herstellung eines stark abgeschwächten Newcastle-Disease-Virus-Lebendimpfstoffs

Info

Publication number: DE2058645C2
Application number: DE2058645A
Authority: DE
Inventors: Homu Suita Osaka Ito
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1969-11-29
Filing date: 1970-11-28
Publication date: 1982-02-11
Also published as: ES385968A1; NL7017334A; GB1274820A; NL170595C; NL170595B; CA962593A; DK124340B; FR2073436A1; FR2073436B1; DE2058645A1

Description

a) Newcastle-Disease-Virus entweder in einer Schweinegewebekultur in einer Reihe von wenigstens 20 Passagen oder in stabilen Schweinezellreihen wenigstens 2 Monate bei einer Temperatur zwischen 30 und 38° C züchtet,

b) die erhaltenen Schweinezellen, die den abgeschwächten Newcastle-Disease-Virus enthalten, auf die Chlorioallantoismembran von Hühnerembryonen inoculiert und die Hühnerembryonen bei einer Temperatur zwischen 35 und 40°C kultiviert und

c) den Newcastle-Disease-Virjs, der vom erhaltenen Komplex aus Chorioallantoismembran und Schweinezellen gewonnen worden ist, über eine Reihe von wenigstens 2 Passagen in der Allantoihöhle von Hühnerembryonen bei einer Temperatur zwischen 35 und 40° C kultiviert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung in der Stufe (a) unter Verwendung einer Gewebekultur durchgeführt wird, die primäre Schweinenierenzellen enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung der Stufe (a) durch Dauerinfektion von stabilen Schweinenierenzellreihen mit Newcastle-Disease-Virus durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung in der Stufe (b) 5 bis 10 Tage durchgeführt wird.

5. Lebendimpfstoff, enthaltend den nach den Ansprüchen 1 —4 stark abgeschwächten Newcastle-Disease-Virus mit den üblichen Konfektionsierungsmitteln.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung stark abgeschwächter Newcastle-Disease-Virus-Lebendimpfstoffs, der weiter abgeschwächt ist, d. h. weit weniger Nebenwirkungen hat als die bisher erprobten Impfstoffe.

Die Newcastle-Disease, die eine akute febrile Infektionskrankheit bei Geflügel ist, stellt eine der ernstesten Ursachen von wirtschaftlichen Verlusten in der Geflügelindustrie dar. Zwar steht die virale Natur dieser Infektionskrankheit fest, und viele Stämme des Newcastle-Disease-Virus sind isoliert worden (siehe beispielsweise »Southwestern Veterinarian«, Band 5 [1951], Seite 19 bis 21, und »American Journal of Veterinary Research«, Band 16 [1955], Seite 450 bis 457), jedoch sind weder wirksame chemotherapeutische Mittel noch wirksame chemoprophylaktische Mittel gegen diese Krankheit gefunden worden. Die Prophylaxe gegen diese Krankheit besteht daher nur in der Immunisierung von Geflügel mit einem inaktivierten oder Lebendimpfstoff des Newcastle-Disease-Virus (nachstehend als »NDV« bezeichnet). In den letzten Jahren ist die Verwendung von NDV-Lebendimpfstoffen ytark gesteigert worden, da sich gezeigt hat, daß diese Lebendimpfstoffe einfach und bequem dem Geflügel durch Aufsprühen oder als Gemisch mit dem Trinkwasser verabreicht werden können, und daß sie antigen wirksamer sind.

Die Verwendung von NDV-Lebendimpfstoffen ist jedoch mit Gefahren verbunden. Wenn ein Lebendimpfstoff nicht genügend abgeschwächt ist, pflegt er eine

ι» gemischte Infektion mit NDV und Mycoplasma gallisepticus (PPLO) zu verursachen und auf diese Weise ernste Erkrankungen der Atemwege zu verursachen, während ein zu stark abgeschwächter Impfstoff nicht zu einer genügenden Antikörperbildung führt, um

i) NDV-Infektionen und den Ausbruch der Krankheit zu verhindern. Die wesentlichen Voraussetzungen für einen praktisch brauchbaren NDV-Lebendimpfstoff sind somit, daß er so weit abgeschwächt ist, daß seine Verabreichung nicht die charakteristischen Anzeichen

.'ο der Newcastle Disease bei Geflügel hervorruft, und daß seine Antikörperbildung genügt, um dem Angriff einer großen Menge eines wilden NDV wirksam zu begegnen.

Einige Methoden zur Abschwächung von NDV sind

bereits für die Herstellung von NDV-Lebendimpfstof-

2'j fen vorgeschlagen worden, jedoch gelang es mit keinem dieser Verfahren, einen NDV-Lebendimpfstoff herzustellen, der die beiden vorstehend genannten wesentlichen Voraussetzungen erfüllt.

Die GB-PS 10 10 509 beschreibt nur ein Verfahren,

in bei dem NDV, das schon abgeschwächt worden ist, in Gewebekulturen von Affen, Kälbern oder Schweinen und nicht von Vögeln stammend vermehrt und dann die erhaltene, das Virus enthaltende Flüssigkeit gewonnen wird, um einen NDV-Lebendimpfstoff zu erhalten. Wie

i^r> aus S. 1, Zeile 81 bis S. 2, Zeile 7 hervorgeht, ist ein wesentliches Charakteristikum des dort beschriebenen Verfahrens, daß eine weitere Abschwächung des verwendeten abgeschwächten Virus durch Kultivierung des abgeschwächten NDV in einer Kultivierung durchgeführt wird, ohne daß die Kultivierung in Passagen durchgeführt wird. Es sei darauf hingewiesen, daß die Offenbarung der GB-PS 10 10 509 auf S. 3, Zeilen 23—27 nicht bedeutet, daß vier Passagen durchgeführt worden sind, sondern daß die Maßnahmen j zum Frhalten einer großen Menge des Impfstoffs durch Verwendung einer konstanten Menge der Gewebekultur 4mal durchgeführt wird, d. h. daß neues Medium der mit Virus inocculierten Gewebekultur zugegeben wird, die erhaltene Kultur kultiviert wird und dann die

to erhaltene Virusflüssigkeit gewonnen wird.

Hier ist also nicht von mehreren Passagen die Rede, sondern ganz im Gegenteil, es wird dem Fachmann die Lehre gegeben, das Verfahren nicht in mehreren Passagen durchzuführen.

■55 Ganz im Gegenteil dazu unterscheidet sich das Verfahren der vorliegenden Erfindung insbesondere hinsichtlich der Stufe a) des Anspruchs 1, gemäß dem NDV entweder in einer Schweinegewebekultur in einer Reihe von wenigstens 20 Passagen oder in stabilen Schweinezellenreihen wenigstens 2 Monate gezüchtet wird, wobei das NDV schnell abgeschwächt wird.

Die US-PS 27 67 117 betrifft nur eine trockene, stabile Form eines Geflügel-Atemtrakt-Krankheitsvirus-lmpfstoffes einschließlich NDV-Impfstoff und lehrt den

b5 Fachmann nur, daß NDV-Impfstoff-Keime in der Allantoishöhle von Hühnerembryo zur Bildung einer Impfstoff-Flüssigkeit vermehrt werden können.

»Mikrobiologie und allgemeine Seuchenlehre« Stutt-

gart 1966, S. 540 und 541 lehrt den Fachmann nur, daß NDV in verschiedenen Systemen einschließlich Schweinegewebekulturen und Allantoishöhle von Hühnerembryo kultiviert werden kann.

Daraus folgt, daß keine dieser Literaturstellen dem Durchschnittsfachmann die Kombination der Stufen a) bis c) des Verfahrens gemäß der Erfindung lehren oder nahelegen kann und schon gar nicht über die ausgezeichneten Qualitäten des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen NDV-Impfstoffs verfügt

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen dargelegten Gegenstände.

Gemäß der Erfindung wird NDV einer bestimmten Aufeinanderfolge von Stufen unterworfen: NDV wird entweder in einer Schweinegewebekultur über eine Reihe von wenigstens 20 Passagen oder in stabilen Schweinezellreihen (porcine stable cell lines) wenigstens etwa 2 Monate gezüchtet (Stufe 1). Die erhaltenen Schweinezellen, die das abgeschwächte NDV enthalten, werden auf die Chorioallantoismembran von Hühnerembryonen inoculiert, worauf das Hühnerembryo kultiviert wird (Stufe 2). Das aus dem erhaltenen Komplex von Chorioallantoismembran und Schweinezellen gewonnene NDV wird über eine Reihe von wenigstens zwei Passagen in der Allantoishöhle von Hühnerembryonen kultiviert (Stufe 3).

Beim Verfahren gemäß der Erfindung kann jeder Stamm des Newcasile-Disease-Virus als Ausgangs-NDV verwendet werden.

Die Kultivierung in der Stufe 1 des Verfahrens gemäß jo der Erfindung kann vorgenommen werden, indem man das Ausgangs-NDV über eine Reihe von Passagen in einer Schweinegewebekultur züchtet oder stabile Schweinezellreihen der Dauerinfektion mit dem NDV unterwirft. 3>

Die Schweinegewebekultur, die für die Züchtung des Ausgangs-NDV über eine Reihe von Passagen verwendet wird, kann primäre Schweinezellen, z. B. primäre Schweinenierenzellen, primäre Schweinehodenzellen und primäre Zellen von Schweineembryonen oder stabile Schweinezellreihen (porcine stable cell lines) enthalten, die in bekannter Weise von den vorstehend genannten primären Schweinezellen abgeleitet sind. Das Ausgangs-NDV wird in die Gewebekultur geimpft, die die Zellen zusammen mit einem geeigneten Gewebekulturmedium enthält. Hier wird das NDV stationär oder mit Rotation bei einer Temperatur zwischen etwa 30 und 38° C (gewöhnlich etwa 32 bis 36° C) etwa 2 bis 10 Tage gezüchtet. Das proliferierte Virus wird dann in eine frische Gewebekultur inoculiert, die Schweinezellen für die anschließende Passage der Kultivierung enthält. Mit aufeinanderfolgender Wiederholung dieser Passage geht die Abschwächung glatt vonstatten. Die Passagen der Kultivierung werden wenigstens zwanzigmal, vorteilhaft etwa fünfzig- bis hundertmal fortgesetzt, wodurch das NDV genügend abgeschwächt worden ist. Für die neuen Passagen der Kultivierung mit der Schweinegewebekultur wird bis zur 20. Passage das Kulturmedium der vorhergehenden Passage auf ungefähr das 10²- bis Wfache Volumen ω verdünnt, und djeses verdünnte Medium wird als Impfvirus verwendet, das für die anschließende Kultivierungspassage inoculiert wird. Bei einer Reihe von mehr als 20 Kultivierungspassagen ist es vorteilhaft, die aus der vorhergehenden Passage erhaltene Kultur- o5 brühe wiederholt (zweckmäßig dreimal) einzufrieren und als Impfvirus die obenstehende Flüssigkeit der aufgetauten Brühe so, wie sie anfällt, oder nach Verdünnung auf ungefähr das 10- bis lOOfache Volumen zu verwenden.

Es ist auch möglich, stabile Schweinezellreihen einer Dauerinfektion mit dem Ausgangs-NDV zi\ unterwerfen. Als stabile Schweinezellreihen werden vorzugsweise z. B. stabile Schweinenierenzellreihen, stabile Schweinehodenzellreihen u.dgl. verwendet Die in einem geeigneten Gewebekulturmedium gezüchteten stabilen Schweinezellreihen werden mit dem NDV infiziert

In der Praxis ist es vorteilhaft, die stabilen Schweinezellreihen mit dem NDV bei etwa 1 : ΟΛ001 bis 1:10 M.O.I. (Multiplicity of Infection), insbesondere bei etwa 1 :1 M.O.I, zu infizieren. Die so infizierten stabilen Schweinezellreihen werden dann stationär oder mit Rotation bei einer Temperatur zwischen etwa 30 und 38° C (gewöhnlich etwa 32 bis 36° C) kultiviert, wodurch das NDV proliferiert, während die stabilen Schweinezellreihen sich selbst ebenfalls fortpflanzen. Bei dieser Dauerinfektion ist es zweckmäßig, das Kulturmedium in Abständen von etwa 2 bis 7 Tagen, vorzugsweise von etwa 3 Tagen, zu erneuern. Ferner ist es zur Abkürzung der Gesamtdauer der Dauerinfektion zweckmäßig, die durch die Dauerintaktion erhaltene Flüssigkeit in frische stabile Schweinezellreihen oder Primärzellen von Hühnerembryonen zu inoculieren, dann kleine Plaques (kleiner als etwa 1 mm Durchmesser) von NDV aus der erhaltenen Kultur nach dem bekannten Plaque-Bildungstest unter Verwendung stabiler Schweinezelireihen oder primärer Zellen von Hühnerembryonen auszuwählen (beschrieben beispielsweise in »Method in Virology«, Band 3, Seite 289, herausgegeben von Academic Press, New York 1967) auszuwählen und frische stabile Schweinezellreihen einer weiteren Dauerinfektion mit dem so isolierten, kleinen Plaques bildenden NDV zu unterwerfen.

Die Dauerinfektion wird wenigstens 2 Monate, vorteilhaft etwa 15 bis 50 Monate fortgesetzt, wodurch das NDV genügend abgeschwächt worden ist.

Als Gewebekulturmedien für die Stufe 1 des Verfahrens gemäß der Erfindung eignen sich beispielsweise Hanks-Lösung, Earle-Lösung und Gey-Lösung. Diese Medien können nach Bedarf mit geeigneten Bestandteilen, z. B. Lactalbuminhydrolysat und inaktiviertes Kalbsserum, ergänzt werden. Ferner kann dem Medium ein Antibiotikum oder Antibiotikumgemisch, z. B. Penicillin, Streptomycin, Dihydrostreptomycin, Neomycin und Kanamycin, zugesetzt werden, um die Fortpflanzung von Fremdmikroorganismen, die durch zufällige Verunreinigung in das Medium gelangt sind, zu verhindern.

Für die Herstellung einer NDV-Lebendvaccine wird das NDV in der Allantoishöhle des bebrüteten Hühnereies gezüchtet. Das abgeschwächte NDV ist jedoch nicht in der Lage, in der Allantoishöhle des bebrüteten Hühnereies zu proliferieren, so daß bei direkter Inoculierung des abgeschwächten NDV in die Allantoishöhle des Hühnerembryos praktisch keine Proliferation des Virus stattfindet.

Beim Verfahren gernäß der Erfindung kann dem in der Stufe 1 genügend abgeschwächten NDV die Fähigkeit verliehen werden, in der Allantoishöhle des bebrüteten Hühnereies zu proliferieren, indem die Schweinezellen, die das in der Stufe 1 erhaltene abgeschwächte NDV enthalten, auf die Chorioallantoismembran des bebrüteten Hühnereies inoculiert werden und anschließend das Hühnerembryo kultiviert wird (Stufe 2). Als Hühnerembryo können vorteilhaft etwa 10 bis 11 Tage bebrütete Hühnereier verwendet werden.

Vorzugsweise werden pro Ei etwa 10⁵ bis 10⁷ Zellen, die das abgeschwächte NDV enthalten, auf die Chorioallantoismembran der Hühnerembryonen inoculiert Die Kultivierung der Hühnerembryonen, auf deren Chorioallanloismembran das abgeschwächte NDV in dieser Weise geimpft worden ist, wird vorzugsweise stationär bei einer Temperatur zwischen etwa 35 und 40⁰C, vorzugsweise etwa 36 bis 38° C, durchgeführt. Im allgemeinen wird die Züchtung des abgeschwächten NDV auf der Chorioallantoismembran etwa 5 bis 10 Tage fortgesetzt, wodurch das Virus die Fähigkeit erwirbt, in der Allantoishöhle des bebrüteten Hühnereies zu proliferieren.

Das NDV wiid aus dem in den Hühnerembryonen gebildeten Komplex der Chorioallantoismembran und der Schweinezellen gewonnen und dann einer Reihe von Züchtungspassagen in der Allantoishöhle von Hühnerembryonen unterworfen (Stufe 3). Die Gewinnung des NDV aus diesem Komplex und die Inoculation des Virus in die Allantoishöhle der hühnerembryonen kann in der Praxis durchgeführt werden, indem man die Chorioallantoismembran, auf und in der die Schweinezellen proliferiert haben, nach der Kultivierung der Stufe 2 aus den Hühnerembryonen extrahiert, den Komplex aus Chorioallantoismembran und Schweinezellen in einem geeigneten Medium, z. B. Hanks-Lösung, homogenisiert und die obenstehende Flüssigkeit oder das vom erhaltenen Gemisch abgetrennte Filtrat in die Allantoishöhle von Hühnerembryonen mit etwa 1 bis 1000 EID₅₀ (50% Egg Infective Dose) pro Ei inoculiert. Als Hühnerembryonen für die Stufe 3 können vorteilhaft 10 bis 11 Tage bebrütete Hühnereier verwendet werden. Die Züchtung des NDV in der Allantoishöhle des Bruteies erfolgt im allgemeinen stationär etwa 2 bis 4 Tage bei einer Temperatur zwischen etwa 35 und 40⁰C, vorzugsweise etwa 36 bis 38° C. Das proliferierte Virus wird dann für die anschließende Passage der Züchtung in die Allantoishöhle von frischen Bruteiern inoculiert. Durch wenigstens zweimalige, vorzugsweise drei- bis zehnmalige Wiederholung der Serienpassagen der Züchtung auf diese Weise proliferiert das NDV in der Allantoishöhle des Bruteies häufig genug, um eine NDV-Vaccine zu bilden.

Die von den Bruteiern nach der letzten Passage der Züchtung gewonnene Allantoisflüssigkeit kann in Abhängigkeit von ihrem Virustiter als solche oder nach Verdünnung mit einem geeigneten Verdünnungsmittel wie physiologischer Kochsalzlösung oder destilliertem Wasser als NDV-Vaccine gemäß der Erfindung verwendet werden.

Die auf diese Weise hergestellte stark abgeschwächte NDV-Vaccine ist gebrauchsfertig, kann jedoch in eingefrorener Form mit oder ohne Zusatz eines oder mehrerer stabilisierender Mittel wie Saccharose, Lactose, Glutamate und Phosphate konserviert werden. Sie kann auch mit oder ohne Zusatz eines oder mehrerer der vorstehend genannten stabilisierenden Mittel gefriergetrocknet werden. Das gefriergetrocknete Produkt wird bei Gebrauch in einem geeigneten Verdünnungsmittel, z. B. physiologischer Kochsalzlösung oder sterilem destilliertem Wasser, gelöst.

Falls erforderlich, kann das NDV, das aus der Allantoisflüssigkeit nach der letzten Passage der Züchtung in Stufe 3 gewonnen worden ist, in einem geeigneten Gewebekultursystem, z. B. in einer Kultur, die Primärzellen von Hühnerembryonen enthält, zur Herstellung von NDV-Vaccine weiter gezüchtet werden. In diesem Fall werden Feststoffe, z. B. Zellen und Zellfragmente, beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugieren entfernt Das Filtrat oder die obenstehende Flüssigkeit kann in Abhängigkeit von ihrem Virustiter als solche oder niich Verdünnung mit einem der obengenannten geeigneten Verdünnungsmittel als NDV-Vaccine gemäß der Erfindung verwendet werden. Die auf diese Weise hergestellte NDV-Lebendvaccine zeichnet sich dadurch aus, daß sie im wesentlichen

ίο keine Virulenz hat und in hohem Maße die Fähigkeit zur Antikörperbildung besitzt Wenn beispielsweise 10 Tage alte Küken mit etwa 10⁷ EID₅₀ pro Küken geimpft werden, so zeigen diese Tiere keinerlei Symptom der Newcastle Diseas. 10 Tage alte Küken, die mit etwa 10³ EID₅₀ pro Küken geimpft werden, zeigen keinerlei Anzeichen der Newcastle Disease, auch wenn sie 14 Tage nach der Impfung mit NDV in einer Dosis von etwa 10⁴ LDso(50%-Letaldosis) infiziert werden. Ferner werden durch die Impfung mit der NDV-Lebendvaccine gemäß der Erfindung beträchtlich verlängerte Immunisierungseffekte im Vergleich zu den bisher bekannten Vaccinen erreicht

Die NDV-Lebendvaccine gemäß der Erfindung kann allen Arten von Vögeln, die von der Newcastle Disease befallen werden, z. B. Küken, Putern, Tauben und Perlhühnern, zur Prophylaxe verabreicht werden. Zur ausreichenden Impfung ist eine Dosis von etwa 10²—10⁵ EID50 pro Tier vorteilhaft. Auch bei noch höheren Dosen besteht keinerlei Gefahr unerwünschter Neben-

jo Wirkungen auf Grund der hohen Sicherheit der erfindungsgemäßen Vaccine, jedoch ist es unzweckmäßig, diese hohen Dosierungen anzuwenden, da keine besondere Steigerung des gewünschten Vaccinationseffekts zu erwarten ist.

Die NDV-Lebendvaccine gemäß der Erfindung kann

dem Geflügel beispielsweise oral, intranasal, als Augenlotion, durch Aufsprühen oder durch subkutane oder intramuskuläre Injektion verabreicht werden.

Die Sicherheit und Wirksamkeit der stark abge-

schwächten NDV-Vaccine gemäß der Erfindung wird durch die nachstehend beschriebenen Versuche weiter veranschaulicht.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden in den folgenden Beispielen beschrieben.

Die Versuche 1 und 2 veranschaulichen die typische Vorbereitung der primären Schweinenierenzellen und die Herstellung der stabilen Schweinezellreihen. Die Prozentangaben beziehen sich auf Gewicht/Volumen, falls nicht anders angegeben.

Versuch 1

Einem gesunden jungen Schwein wird die Niere aseptisch entnommen und dekapsuliert, um da;; Nierenbecken zu entfernen. Die erhaltene Nierenrinde wird aseptisch zu Fragmenten von 3 bis 5 mm Größe geschnitten. Die Gewebsfragmente werden dreimal jeweils mit etwa dem lOfachen Volumen der von zweiwertigen Calcium- und Magnesiumionen freien basischen Phosphatlösung von Dulbecco der nachstehend genannten Zusammensetzung (pH 7,2) gewaschen und in ungefähr dem lOfachen Volumen dieser Lösung, die durch 0,25% Trypsin (Difco 1 :250) ergänzt ist, suspendiert. Die Suspension wird 1 Stunde gerührt und 5 Minuten bei 1000 UpM zentrifugiert. Die erhaltenen

b5 Zellen werden in einer solchen Menge einer Hanks-Lactalbuminlösung der nachstehend genannten Zusammensetzung, der vorher 5% inaktiviertes Kalbsserum, 200 Einheiten Penicillin pro ml und 200 μg Streptomycin pro

ml zugesetzt worden waren, suspendiert, daß die erhaltene Zellsuspension etwa 2 χ 10^s Zellen/ml enthält. Die Suspension wird stationär in Roux-Flaschen 96 Stunden bei etwa 37⁰C bebrütet, wobei Monoschichtzel-Ien der Schweineniere erhalten werden.

Die oben genannte, von zweiwertigen Calcium- und Magnesiumionen freie basische Phosphatlösung nach Dulbecco hat folgende Zusammensetzung:

NaCl	8,0 g
KCI	0,2 g
Na₂HPO₄	1,15g
KH₂PO₄	0,2 g
Wasser	800 ml

Die oben genannte Hanks-Lactalbuminlösung wird hergestellt, indem 5 g Lactaibuminhydroiysat in Hanks-Lösung in einer Menge, die insgesamt 1000 ml ergibt, gelöst werden. Die Hanks-Lösung hat folgende Zusammensetzung:

NaCl	8,0 g
KCl	0,4 g
CaCI₂	0,2 g
MgSO₄ ■ 7	H₂O 0,2 g
Na₂HPO₄ ·	2 H₂O 0,06 g
KH₂PO₄	0,06 g
NaHCO₃	0,25 g
d-Glucose	1,0 g
Phenolrot	0,02 g
Destilliertes Wasser (dreifach destilliert) a. d. 1 I

Versuch 2

Die gemäß Versuch 1 erhaltenen Monoschichtzeilen der Schweineniere werden in an sich bekannter Weise einer Reihe von 50 Züchtungspassagen in der Hanks-Lactalbuminlösung unterworfen, die die gleiche Zusammensetzung wie die im Versuch 1 verwendete Lösung hat, wobei stabile Schweinezellreihen erhalten werden.

Aus Roux-Flaschen, die die stabilen Schweinezellreihen enthalten, wird die Kulturflüssigkeit abgegossen, wobei die stabilen Schweinezellreihen auf der Innenwand der Flaschen zurückbleiben. Die Zellen werden zweimal mit jeweils ungefähr dem lOOfachen Volumen der von zweiwertigen Calcium- und Magnesiumionen freien basischen Phosphatlösung nach Dulbecco gewaschen und 20 Minuten bei etwa 37° C unter ungefähr dem lOOfachen Volumen dieser Lösung gehalten, die 0,005% Trypsin(Difco 1 : 200) und 0,02% Äthylendiamintetraessigsäure enthält, wobei Exfoliation der stabilen

Sch wciiicZcüf einen ei η in it.

Die stabilen Schweinezellreihen werden in der Hanks-Lactalbuminlösung der gleichen Zusammensetzung wie im Versuch 1 suspendiert wobei die Lösung in einer solchen Menge verwendet wird, daß die Zellsuspension etwa 2 χ 10⁵ Zellen/ml enthält.

Die Zellsuspension wird in Roux-Flaschen 72 Stunden bei 37°C stationär bebrütet, wobei die stabilen Schweinezellreihen erhalten werden, die für die Proliferation von NDV verwendet werden können.

Beispiel 1

Schweineniere in Hanks-Lactalbuminlösung (hergestellt gemäß Versuch 1) inoculiert und 7 Tage stationär bei etwa 35°C gezüchtet. Die Kulturflüssigkeit wird 10 Minuten bei 3000 UpM zentrifugiert, um eine obenstehende Flüssigkeit abzutrennen, die nach Verdünnung mit dem lOOfachen Volumen der Hanks-Lösung als Impfvirus in der nächsten Passage verwendet wird. Von der 21. Passage der Züchtung ab wird die Kulturbrühe, die aus der vorhergehenden Passage erhalten worden

κι ist, dreimal eingefroren. Die obenstehende Flüssigkeit der aufgetauten Brühe wird nach Verdünnung mit dem lOfachen Volumen von Hanks-Lösung als Impfvirus in der nächsten Passage verwendet. Auf diese Weise werden die Schweinenierenzellen über 50 Passagen gezüchtet.

Die primären Nierenzellen aus der 50. Passage der Züchtung werden in einer Menge von etwa \0^b Zellen pro Ei auf die Chorioallantoismembran von 11 Tage bebrüteten Hühnereiern inokuliert. Die Hühnerembryonen werden 8 Tage bei etwa 37° C stationär gezüchtet.

Der Komplex aus Chorioallantoismembran und Schweinezellen wird von den Eiern gewonnen, mit Hanks-Lösung in einer Menge von 2 ml pro Ei gemischt und dann homogenisiert. Das homogenisierte Gemisch

2> wird 5 Minuten bei 3000 U/Minute zentrifugiert. Die erhaltene obenstehende Flüssigkeit zeigt etwa 100 EID₅₀ (50% Egg Infective Dose) pro 0,2 ml. Der EIDso-Wert wird unter Anwendung des Systems der lOfachen Verdünnung nach der bekannten Methode

jo bestimmt, die beispielsweise in »Virology«, Band 2, Seite 57 bis 68 (1956) beschrieben wird.

Die obenstehende Flüssigkeit wird in einer Menge von 0,2 ml pro Ei in die Allantoishöhle von etwa 11 Tagen bebrüteten Hühnereiern inoculiert und 5 Tage

J5 stationär bei etwa 36°C bebrütet. Die von den Eiern gewonnene Allantoisflüssigkeit wird nach Verdünnung mit dem lOfachen Volumen von Hanks-Lösung in die Allantoishöhle von frischen Hühnerembryonen inoculiert und in der oben beschriebenen Weise bebrütet. Auf diese Weise wird die Passage von NDV in der Allantoishöhle der Hühnerembryonen dreimal wiederholt. Der obenstehende Teil der Allantoisflüssigkeit, die bei der dritten Passage erhalten wird, zeigt etwa 10⁸ EID₅₀ pro 0,2 ml.

5 Die oben genannte obenstehende Flüssigkeit wird nach Verdünnung mit dem lOfachen Volumen von Hanks-Lösung aseptisch in die Allantoishöhle von 10 Tagen bebrüteten Hühnereiern inoculiert und 2 Tage aseptisch bei 36° C kultiviert. Nachdem die Eier 12

so Stunden bei etwa 4° C gehalten worden sind, wird die Allantoisflüssigkeit aus den Eiern gewonnen. Sie wird 5 Minuten bei 3000 U/Minute zentrifugiert wobei als obenstehende Flüssigkeit eine stark abgeschwächte NDV-Lebendvaccine abgetrennt wird. Die obenstehende Flüssigkeit zeigt etwa 10⁸ EID50 pro mL

Das Produkt wird für die Lagerung bei —70° C eingefroren. Nach einjähriger Lagerung wird sie aufgetaut und mit dem 10⁵fachen Volumen an physiologischer Kochsalzlösung verdünnt Mit der verdünnten Vaccine werden Küken durch Besprühen geimpft, wodurch die gewünschte Wirkung der Immunisierung der Küken eintritt

Beispiel 2

Ein Impfvirus von NDV, der Stamm »Tokyo« ATCC 65 Stabile Schweinezellreihen in Hanks-Lacalbuminlö-VR-623 (»Virus«, Band 7, Seite 109 — 110, herausgege- sung (hergestellt gemäß Versuch 2) werden mit einem

Impfvirus von NDV, Stamm »Tokyo«, ATTC VR-623, bei etwa 1 :1 M.O.L infiziert und 15 Monate stationär

ben von The Society of Japanese Virologists, 1957), wird bei etwa 1 :1 M.O.L in Monoschichtzeilen einer

bei etwa 36° C kultiviert. Während dieser Zeit wird das Kulturmedium in Abständen von etwa 5 Tagen erneuert.

Die auf diese Weise mit NDV dauerinfizierten stabilen Schweinezellreihen werden in einer Menge von etwa 10⁶ Zellen pro Ei auf die Chorioallantoismembran von 10 Tagen bebrüteten Hühnereiern inoculiert. Die Hühnerembryonen werden 7 Tage stationär bei etwa 37⁰C kultiviert.

Der Komplex aus Chorioallantoismembran und Schweinezellen wird aus den Eiern gewonnen, mit Hanks-Lösung in einer Menge von 2 ml pro Ei gemischt, und dann homogenisiert. Das homogenisierte Gemisch wird 5 Minuten bei 3000 U/Min, zentrifugiert. Die erhaltene obenstehende Flüssigkeit zeigt etwa 100 EI D₅₀ pro 0,2 ml.

Die obenstehende Flüssigkeit wird in die Allantoishöhle von etwa 11 Tage bebrüteten Hühnereiern in einer Menge von 0,2 ml pro Ei inoculiert und 5 Tage stationär bei 36° C kultiviert. Die aus dem Ei gewonnene Allantoisflüssigkeit wird nach Verdünnung mit dem lOfachen Volumen Hanks-Lösung in die Allantoishöhle von frischen Hühnerembryonen inoculiert und in der oben beschriebenen Weise kultiviert. Auf diese Weise wird die Passage von NDV in der Allantoishöhle der bebrüteten Hühnereier zweimal wiederholt. Der aus der zweiten Passage erhaltene obenstehende Teil der Allantoisflüssigkeit 7eigt etwa 10⁷ EID₅₀pro 0,2 ml.

Die obenstehende Flüssigkeit wird nach Verdünnung mit dem 1 Wachen Volumen an Hanks-Lösung aseptisch in die Allantoishöhle von 10 Tage bebrüteten Hühnereiern inoculiert und 2 Tage stationär bei 36° C kultiviert. Nachdem die Eier 12 Stunden bei etwa 4⁰C gehalten worden sind, wird die Atlantoisflüssigkeit aus den Eiern gewonnen. Sie wird 5 Minuten bei 3000 U/Minute zentrifugiert, wobei die obenstehende Flüssigkeit eine stark abgeschwächte N DV-Lebend vaccine abgetrennt wird. Die obenstehende Flüssigkeit zeigt etwa 10⁸ EID₅O pro ml.

10

Testl

Mit je etwa 1 ml der gemäß Beispiel 1 hergestellten NDV-Lebendvaccine mit 10⁸ EID₅O pro ml wurden 15 Tage alte Küken intravenös geimpft. Der klinische Zustand jedes Tiers wurde beobachtet, jedoch zeigten sich keinerlei Symptome der Newcastle Disease. Außerdem hatte eine Untersuchung des Bluts der Küken auf NDV am zweiten Tag nach der Impfung übereinstimmend negative Ergebnisse.

Fünf Küken wurden in der gleichen Weise mit dem Ausgangsstamm von NDV, d.h. dem Stamm »Tokyo« ATCC VR-623, geimpft. Die Untersuchung von Blutproben, die am zweiten und vierten Tag nach der Inoculation genommen und auf ¹Ao ihres ursprünglichen Volumens verdünnt waren, ergab 10² EID» des Virus pro 0,2 ml.

Test 2

Je 1 ml der gemäß Beispiel 1 hergestellten verdünnten NDV-Vaccine mit 10³ EID₅O pro ml wuide intravenös drei Küken, die ein Alter von 10 Tagen hatten, verabreicht. 14 Tage nach der Impfung wurden die Küken mit dem Ursprungsstamm von NDV, d.h. dem Stamm »Tokyo« ATTC VR-623 intravenös in einer Dosis von etwa 10⁴ LD50 pro Tier geimpft

Die mit der Lebendvaccine geimpften Tiere zeigten während einer Zeit von 1 Monat nach der Zufuhr des Ursprungsstamms keine Anzeichen der Newcastle Disease, während Kontrollküken, die nicht geimpft worden waren, bereits am zweiten Tag nach der Zufuhr des Ursprungs-NDV den Ausbruch der typischen Newcastle Disease zeigten, verbunden mit ernsten Symptomen wie Diarrhöe, Dyspnöe, Unfähigkeit aufzustehen u. dgl. Schließlich gingen diese Tiere in 5 bis 7 Tagen ein. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

Gruppe
von Küken

Zahl

der

Küken

Virämie
(NDV in
0,2 ml Blut
2 Tage nach
Infizierung)

Newcastle Disease-Symptome bei den Küken nach der Infizicrung !.Tag 2. Tag 3. Tag 4. Tag S.Tag 6. Tag

7. Tag 30. Tag

Geimpfte
Gruppe

Nicht
Gruppe

10² EID₅,,

IQ²

10²

+ = Anorexie.
++ = Diarrhöe.

+++ = ausgestreckt, mit Dyspnöe.

++++ = Augen geschlossen. Kopf unter den Flügel gesteckt. +++++ = ausgestreckt.

tot

tot
tot

Die LD50 wird nach der bekannten Methode bestimmt, die beispielsweise in »American Journal of Hygiene«, Band 27, (1938), Seite 493—497, beschrieben wird.

Gegenüber einem im Handel befindlichen Präparat wurde der folgende Vergleichsversuch durchgeführt

Jeweils 50 ml von verdünntem NDV-Impfstoff mit 10⁵ EIDso/ml hergestellt gemäß Beispiel 1 der vorliegenden

Erfindung bzw. von verdünntem Hitchner-Bi-NDV-Impfstoff* (Handelsprodukt unter der Handelsbezeichnung »Newcastle Disease life Virus Vaccine S«, Hersteller Nisseiken Co. Ltd, Ome, Tokyo und in den Handel gebracht von Takeda Chemical Industries, Ltd, Osaka, Japan) mit 10⁵ EIDso/ml wurden 10 vier Tage alte Küken durch Besprühen geimpft 7 Tage nach der Impfung wurde die Zahl der Küken,

die an Dyspnea litten gezählt, und 21 Tage nach der Impfung wurde der Titer des NDV Hämagglutinations-Hemmungs(HI)-antikörpers im Serum für jedes Küken

bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt:

Impfstoff

Dyspnea III Anlikörper-Tilcr

<5 5 lü

160

Beispiel 1 der vor- 0/10

liegenden Erfindung

llitchner B, Lebend- 1/10 1 8

impfsloff

Jede Zahl in der 3. Spalte bedeutet die Zahl der Küken von 10 geimpften Küken, deren Sera den in der obersten Zahlenreihe angegebenen NDV HI Antikörpertiter/ 0,25 ml zeigten, der nach der in »Veterinary Bacteriology and Virology« 7. Aufl. (1967) S. 604-605 veröffentlicht von The Iowa State University Press, Arnes, Iowa, USA beschriebenen Methode bestimmt worden war. Aus diesen Daten ist ersichtlich, daß der NDV-l.ebendimpfstoff gemäß vorliegender Erfindung eine höhere Antikörper-Produktion und weniger Nebenreaktionen im Vergleich zu dem Handelsprodukt Hitchner-Bi-Lebendimpfstoff aufweist.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines stark abgeschwächten Newcastle-Disease-Virus-Lebendimpfstoffs unter Züchten des Virus in Schweinegewebekulturen oder Schweinenierenzellen und Hühnerembryonen, dadurch gekennzeichnet, daß man