DD232822A5

DD232822A5 - Verfahren zur herstellung eines viruspraeparates gegen die mareksche gefluegelkrankheit

Info

Publication number: DD232822A5
Application number: DD85274954A
Authority: DD
Inventors: Gerbe F De Boer
Original assignee: Centraal Diergeneeskundig Inst
Priority date: 1984-04-09
Filing date: 1985-04-08
Publication date: 1986-02-12
Also published as: IN163229B; NL8401120A; ES541930A0; EP0159743B1; AU574164B2; IL74809A0; WO1985004588A1; HU194496B; HUT38542A; CA1251397A; ZA852564B; YU44687B; US4673572A; MX7718E; YU59985A; DE3579617D1; AU4156185A; ES8605680A1; IL74809A; ATE56364T1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer hoch immunogenen Viruszubereitung, abgeleitet von einem Virusstamm der Marekschen Krankheit zum Vogelherpesvirus Serotyp-1 gehoerend, durch Attenuierung, wobei aufeinanderfolgende Passagen in Vogelzellkulturen und Plaque-Reinigungsstufen durchgefuehrt werden. Der bevorzugte Elternvirus ist der Stamm MDV CVI-988, der von einem gesunden Junghuhn gewonnen wurde (Avian Diseases 16:108-125, 1972). Die so erhaltene lebende, gereinigte Vakzine der Marekschen Krankheit ist unschaedlich fuer spezielle pathogenfreie Rhode Island Red-Junghuehner, die fuer die Entwicklung von Tumoren der Marekschen Krankheit hoch empfindlich sind. Die monovalente Viruszubereitung nach der Erfindung zeigt im Vergleich mit kuerzlich entwickelten Vakzinen der Marekschen Krankheit desselben Stammes, bei geringeren Zellpassagen eine verbesserte Schutzwirksamkeit gegen Challenge-Infektion gegenueber zwei Repraesentanten virulenter Viren der Marekschen Krankheit. Die erfindungsgemaesse monovalente Vakzine erbringt einen soliden Schutz gegen Challenge-Infektion mit zwei Repraesentanten der Gruppe kuerzlich aufgetretener biovarianter, sehr virulenter Virusstaemme der Marekschen Krankheit.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Viruszubereitung, insbesondere einer Vakzine, gegen die Marek'sche Krankheit.

Die erfindungsgemäß hergestellte Zubereitung wird angewandt als Impfstoff in der Geflügelzucht.

Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung einer hoch-immunogen und nichtpathogenen Viruszubereitung, insbesondere einer Vakzine gegen die Marek'sche Krankheit. Dieses Verfahren ist gekennzeichnet durch die Verwendung eines lebenden viralen Klons der Marek'schen Krankheit (MDV), der zum Vogel-Herpesvirus Serotyp-1 gehört, wobei dieser Klon in der Lage ist, mit diesem Klon geimpfte Junghühner/Kücken (Begriff wird synonym verwendet, d.U.) gegen die nachfolgende Challenge-Infektion durch virulente oder sehr virulente biovariante Viren der Marek'schen Krankheit (MD) zu schützen. Einen solchen Klon erhält man durch mehrfache Passagen und Plaque-Reinigung eines Marek'schen Virus vom Vogelherpesvirus Serotyp-1.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Marek'sche Krankheit ist eine bösartige, lymphgewebebildende Geflügelkrankheit, die durch eine Infektion mit einem Herpesvirus, dem Marek'schen Virus hervorgerufen wird. 1907 entdeckt, ist er einer der gefährlichsten Geflügelviren.

Ein Virus mit identischen Merkmalen des Stammes MDV CVI-988, wurde von einem medizinischen Geflügellaboratorium als ein Isolat niedriger Virulenz entdeckt. Es konnte durch mehrfache Passagen in Zellkulturen [Rispens at al. in Avian Diseases 16, Seite 108-125 und 126-138 (1972)] attenuiert werden. Seit dieser Zeit wurde die Viruszubereitung, die man nach etwa 35 Passagen in Vogel-Zellkülturen erhielt, erfolgreich zur Vakzinierung von Junghühnern gegen die Marek'sche Krankheit (MD) eingesetzt.

Anfänglich wurde die Virusattenuierung in Entenembryofibroblasten (DEF) durchgeführt. Enten sind allerdings nur schwierig unter speziellen phathogenfreien (SPF) Bedingungen zu halten. Dies erfordert aufwendige Tests einer jeden Produktionscharge, um zu garantieren, daß keine für Vögel pathogene Mikroorganismen vorhanden sind. Die Junghühnerhaltung unter SPF-Bedingungen ist weniger problematisch. Darüber hinaus sind Zellen von Junghühnern bevorzugt, da sie in die MD-Vakzine keine für die Tierart fremde Zellen einbringen. Dementsprechend wurde im Zeitraum 1967 bis 1978 der MDV CVI-988-Stamm den Kükenembryo- Fibroblastenzellkulturen (CEF) angepaßt, und die Hersteller von MDV CVI-988-Vakzine gingen zur Produktion in

CEF über.

Obgleich praktisch Vakzine, die auf dem Elternstamm MDV CVI-988 basierten, zu sehr zufriedenstellenden Resultaten führten (Maas et al., World Poultry Sei. 38, (1982) 162-176) kann es bei Junghühnern vom Stamm der hoch MD-empfindlichen Rhode Island Red (RIR) MD-Schäden hervorrufen, wenn diese Junghühner mit dem zehnfachen der Normaldosis geimpft werden [Avian Pathology 6,395-403 (1977)]

Andere gegenwärtig eingesetzte Vakzine gegen die Marek'sche Krankheit sind

A. Eine Vakzine, basierend auf einem Truthahn-Herpesvirus (HVT FC 126) [Avian Diseases 14, S. 413-429 (1970) und US-PS 3642574] dem Vogelherpesvirus Serotyp-3 zugehörig. Die Verabreichung dieser Vakzine in zellfreier Form ist in der US-PS 3 783 098 beschrieben.

B. Eine Vakzine, die durch Attenuierung eines virulenten MDV-Stammes (HPRS-16) erhalten wurde [Journal of General Virology 4,557-564 (1969) und US-PS 3674861] dem Vogelherpesvirus Serotyp-1 zugehörig.

. Eine Vakzine, basierend auf einem nichtonkogenen Virusstamm des Virus der Marek'schen Krankheit vom Serotyp-2 (SB-1 5B-1] [Journal National Cancer Institute 60,1075-1082 (1982)]. Diese Vakzine wird effektiv im allgemeinen als Gemisch mit VT-Vakzine angewandt.

arüber hinaus erfolgte eine Hinterlegung bei der Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes, Institut Pasteur, 28, ue du Docteur Roux, 75015, Paris, Frankreich, unter der Nummer I-426.

iel der Erfindung ist die Bereitstellung einer Marek-Viruszubereitung, die für Geflügel allgemein und insbesondere für unghühner und damit auch für die hochempfindlichen Rhode Island Red-Junghühner nichtpathogen ist.

in anderes Ziel der Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Marek-Viruszubereitung, die hoch-immunogen ist.

in anderes Ziel der Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Marek-Viruszubereitung, die geeignet ist, geimpfte Junghühner egen virulente und sehr virulente biovariante Stämme des Marek-Virus zu schützen.

larlegung des Wesens der Erfindung

ler Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Klon des Marek-Virus zur Verfügung zu stellen, der vom Elternstamm MDV VI-988 herrührt, aber wesentlich weniger pathogen ohne Verlust der Immunisierungsstärke ist.

ler Erfindung liegt insbesondere die Aufgabe zugrunde, eine Familie von Klonen des Marek-Virus, Serotyp 1, durch oftmalige assagen in Vogelzellkulturen und Piaquereinigung zur Verfugung zu stellen, wobei ein Stamm mit einer bevorzugten kombination an Nicht-Pathogenität und an Immunisierungsstärke ausgewählt werden kann.

Jach der vorliegenden Erfindung wird eine Viruszubereitung, insbesondere eine Vakzine hergestellt, die hochimmunogen und lichtpathogen bei Geflügel ist, insbesondere bei Junghühnern.

)ie erfindungsgemäße Viruszubereitung wird durch Einsatz eines Klons von MDV zum Vogelherpesvirus Serotyp-1 gehörig iergestellt, wobei dieser Klon in der Lage ist, die mit diesem Klon geimpften Junghühner gegen eine nachfolgende Challengenfektion durch virulente oder sehr virulente biovariante Viren der Marek'schen Krankheit (MD) zu schützen, rfindungsgemäß erhält man einen solchen Klon durch mehrfache Passagen eines Marek'schen Virus vom Vogelherpesvirus >erotyp-1 in Vogelzellkulturen und nach Piaquereinigung, wodurch der Klon auf Immunisierungsstärke und Nicht-Pathogenität lelektiertwird, insbesondere für hoch MD-empfindliche RIR-Junghühner.

Vorzugsweise ist der als Ausgangsmaterial eingesetzte Marek'sche Virus der Stamm MD CVI-988. Ein bevorzugter Klon wurde lurch oftmalige Passagen des Virusisolates MDV CVI-988 in Entenembryofibroblasten (DEF) und sechs Plaquereinigungsstufen wischen den DEF-Passagen Nr. 39 und Nr. 49 erhalten. Dieser Virusklon, der als MDV CVI-988 Klon C bezeichnet wurde, wurde vegen seiner hoch immunogenen und nichtpathogenen Wirkung auf RIR-Junghühner ausgewählt.

η Hinblick auf dessen Verwendung als Ausgangsvirus für die Vakzineherstellung wurde der in Frage kommende Virusklon an ZEF angepaßt mittels abwechselnder Viruspassagen in CEF und DEF zwischen den Zellkulturpassagen Nr. 52 und 63. Dieser Klon aus der 65.CEF-Passage (MDV CVI-988 CEF₆₅ Klon C) wurde am 28. März 1984 unter der Nummer PC PV 1 in der Phabagen Collection, Vakgroep Moleculaire Biologie, Transistorium 3, Padualaan 8,3584 CH Utrecht, Niederlande, hinterlegt. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung einer hoch immunogenen Viuiszubereitung, die einen ebenden Virusklon enthält des Virus der Marek'schen Krankheit, der zum Vogelherpesvirus Seroty-1 gehört, die man durch nehrfache Passagen in Vogelzellkulturen und Piaquereinigung eines Marek'schen Virus erhält, der zum Vogelherpesvirus 3erotyp-1 gehört, vorzugsweise der Virus MDV CVI-988, wobei dieser Klon in der Lage ist, mit diesem Klon geimpfte Junghühner aegen eine nachfolgende Challenge-Infektion durch virulente und sehr virulente biovariante MD-Viren zu schützen, wie z. B. MDV <, MDV GA-5, MDV RB/1B und MDV/Tun, und im wesentlichen nichtpathogen gegen hoch-MD-empfindliche SPF RIR-Junghühner ist.

Herstellung der Versuchsvakzine

Der Virusstamm wurde attenuiert über 51 Passagen in DEF einschließlich sechs Plaquereinigungsstufen zwischen den DEF-Passagen Nr. 39 und Nr.49, in denen die Virusausbeute einer lokalisierten cvtopathologischen Änderung (Virusplaque) als Impfstoff eingesetzt wurde. Klon C wurde beim letzten Plaquereinigungsschritt ausgewählt. Derartige Monoschichten wurden mit Endpunktverdünnungen des Virus geimpft, und der neugebildete Virus wurde in situ durch Zusatz von 0,85% Agar zum Medium lokalisiert. Die Adaption von CEF erhielt man durch abwechselnde Passagen in CEF und DEF zwischen den Passagen Nr. 52 und 63. Anschließend erfolgten Zellkulturpassagen in CEF. Nach einer Kultivierungsperiode von 3 bis 5 Tagen, abhängig von der Virusdosis im Impfstoff waren spezifische cytopathologische Änderungen feststellbar. Entenembryofibroblasten erhielt man durch Trypsinierung von Embryos aus 13 Tage alten angebrüteten Enteneiern. Kulturbehälter(PetrischalenoderRoux-Flaschen wurden mitZellsuspensionenangesetzt,dieO,8 χ 10⁶Zellenpromlenthileten. Die Kulturen wurden bei 37⁰C in einem Medium kultiviert, in dem der CO₂-Anteil bei 5% gehalten wurde. Das Wachstumsmedium hatte die folgende Zusammensetzung:

EntmineralisiertesWasser 818ml

Medium 199(10 x konzentriert) 90 ml

NaHCO₃,1,4% 87 ml

Kalbsserum 60 ml

Natriumbenzylpenicillin(50 000I.E./ml )

Streptomycinsulfat(50000I.E./ml) ) 5 ml

Pimafucin^e(0,25%/ml) )

Vitaminkonzentrat (BME, Gibco) 1ml

Glutamin 2,6% 3,8 ml

Nach einer Kultivierungszeit von 2 Tagen bildeten sich kohärente Monoschichten und die Infektion wurde durch Impfen mit einer Suspension infizierter Zellen aus der vorhergegangenen Viruspassage durchgeführt. Entsprechend dem Grad des cytopathischen Effektes wurden die Zellen von jeder infizierten Kultur dazu eingesetzt, 4 bis 20 frische Kulturen zu infizieren. Von diesem Moment an enthielt das Erhaltungsmedium

Entmineralisiertes Wasser 810 ml

Medium F-10(10 x) 50ml

Medium 199(10 x) 40ml

Tryptose-Phosphatbriihe 40 ml

NaHCO₃,1,4% 75 ml

Kalbsserum 30 ml

Antibiotika usw. wie oben genannt.

Elf Tage alte embryonierte Eier aus einer SPF-Gef lügelzucht wurden für die Herstellung von CEF-Monoschichten verwendet. Das Kulturmedium war das oben genannte. In dem Zeitraum, wo der Virusstamm nicht mittels Virusvervielfachung in DEF oder CEF aufrechterhalten wurde, wurde der Virus in flüssigem Stickstoff bei -196⁰C gelagert. Das Einfrieren der infizierten Zellen erfolgte in Wachstumsmedium, wie oben genannt, mit Kalbsserum, das auf 10% erhöht wurde, und dem gleichen Prozentsatz Dimethylsulfoxid (DMSO). Die Abkühlungsrate im Bereich von +20⁰C bis -4O⁰C wurde automatisch mit einer Rate von 1⁰C pro Minute gesteuert. Eine Einschätzung des Virustiters der Proberöhrchen erfolgte durch eine Plaqueassay in CEF.

Unmittelbar nach Wiedergewinnung der Vakzine erfolgte die intramuskuläre Impfung der Junghühner. Das oben beschriebene Erhaltungsmedium war ein geeignetes Verdünnungsmittel. Jedes Tier erhielt eine Impfung von 0,5 ml, die die gewünschte

Dosierung an Zell-assoziiertem MD-Virus enthielt.

Großtechnische Herstellung

Vakzine der Marek'schen Krankheit als Handelsprodukt wurde im Prinzip in ähnlicher Weise wie im Forschungslaboratorium hergestellt. Ansteile der stationären Kulturbehälter (Roux-Flaschen) wurden in Hinblick auf den größeren Maßstab Rollbehältersysteme verwendet. Es wurden Stichproben beim Einsatzmaterial, Stichproben während der Produktion, Tests mit dem Endprodukt hinsichtlich des NichtVorhandenseins von Fremdmikroorganismen durchgeführt gemäß den von einer internationalen Expertengruppe gegebenen Vorschriften (Bericht des Avian Products Committee der International Association of Biological Standardization, E. C. Hülse et al. Hersg., S. 29-42, Genf, Schweiz; Biostandards). Im Hinblick auf die Aktivität der Marek'schen Vakzine sollte das Erfordernis eines gewissen Schutzindexes gewährleistet werden. Dieser kann als Verhältnis der Prozentsätze von erkrankten Testtieren in vakzinierten und nichtvakzinierten Gruppen und der nachfolgenden Infektion sowie innerhalb eines vorbestimmten Zeitraumes angegeben werden. Eine genauere Methode für die Einschätzung der immunogenen Eigenschaften der Viruszubereitung ist eine Fünfzigprozent-Schutzdosis-Assay (PD₅₀), die im Journal of Biological Standardization 9,15-22 (1981), beschrieben wurde.

Charakteristika der gereinigten MD-Lebendvakzine Unschädlichkeit für RIR-Junghühner Wie bereits in der Einführung darauf hingewiesen, bringen die seit kurzem erhältlichen MD-Vakzinen, die auf dem Stamm CVI-988 basieren, die in der 35. Kulturpassage verwendet wurden, zufriedenstellenden Schutz auf diesem Gebiet. Die Vakzine ruft allerdings MD-Läsionen bei SPF RIR-Junghühnern hervor, die hoch MD-empfindlich sind. Die pathogenen Eigenschaften einer Anzahl von MDV CVI-988-Klonen wurden an SPF RIR-Junghühnern untersucht.

Diese Studien wurden angeregt, da bereits früher gezeigt wurde, daß MDV CVI-988 DEF₅₁ Klon C und MDV CVI-988 DEF₉₇ Klon E nicht pathogen bei SPF RIR-Junghühnern wirkte. Die mit MDV CVI-988 DEF₅₁ Klon C, MDV CVI-988 CEF₅₉ Klon C und MDV CVI-988 CEF₆₅ Klon C durchgeführten Unschädlichkeitsuntersuchungen sind in den Beispielen I und Il erläutert. Sie zeigen, daß der erfindungsgemäße Virusklon C bei RIR-Junghühnern nicht pathogen ist. Die mit MDV CVI-988 CEF₆₃ Klon A, MDV CVI-988 CEF₆₂ Klon B, MDV CVI-988 CEF₆₇ Klon C und MDV CVI-988 CEF₅₉ Klon C durchgeführten Untersuchungen, wobei die letzteren beiden von Plaque C herrührten, gesammelt von der DEF-Passage Nr. 49, jedoch mit leicht unterschiedlichem Zellpassagenwerdegang, wurden im Beispiel III erläutert. Diese Experimente zeigen, daß bei zwei Junghühnern, eines mit Klon A oder Klon C geimpft, histologische Schäden beobachtet werden konnten, die für die Marek'sche Krankheit typisch sind.

Der Virusklon C der vorliegenden Erfindung ist hochwirksam beim Schutz von Geflügel gegen MD, wenn er durch eine Vielzahl virulenter MD-Stämme erregt wurde, wie MDV K und MDV GA-5, sowiezwei sehr virulente biovariante Stämme, MDV RB/1B und MDV Tun.

Die graduelle Reduktion des „A"-Antigens

Das „A"-Antigen wurde ursprünglich sowohl in Zellextrakten als auch in Kulturflüssigkeiten von MD-Virus-infizierten Zellen durch Immunodiffusionsanalyse bestimmt (J. Gen. Viral. 4,557-564,1969). Das „A"-Antigen besteht vermutlich aus Glykoproteinen mit einem Molekülbereich von 54K bis 7OK (J.Gen. Viral. 64,2597-2610,1983).

Der Zellpassagenwerdegang der verschiedenen MDV CVI-988-Ansätze, die auf Anwesenheit des „A"-Antigens" untersucht wurden, wurde als Akronym wie folgt bezeichnet:

— MDV CVI-988 CEF₃₇ (DEF1.4, CEF/DEF5-14, CEF15.37)

— MDV CVI-988 CEF₆₅ Klon C (DEF₁^₁, CEF/DEFm^, CEF₅₈-S₉, DEF/CEFeo-es, Plaquereinigungsschritte zwischen Passage 39 und 49)

— MDV CVI-988 DEF₉₉ Klon E (DEFv₉₉, Plaquereinigungsschritte zwischen Passage 87 und 94).

— MDV CVI-988 DEF₁₆₆ (DEFl₁₆₆).

Die überstehenden Flüssigkeiten von MDV CVI-988 CEF₃₇, MDV CVI-988 CEF₆₅ Klon C, MDV CVI-988 DEF₉₉ Klon E und MDV CVI-988 DEF₁₆₆ wurden auf das Vorhandensein von „A"-Antigen durch Immunofällungsuntersuchungen getestet unter Einsatz eines Kaninchenserums, das auf MDV-gp 54/70 gerichtet war (freundlicherweise von Dr. L. Velicer, Lansing, Ml, USA, zur Verfügung gestellt.

„A"-Antigen wurde in der überstehenden Flüssigkeit von MDV CVI-988 DEF₁₆₆ nicht gefunden, wurde aber in Zellkulturen produziert, die mit den Passagen Nr. 35,65 und 99 infiziert worden waren. Während zahlreicher Zellkulturpassagen und Piaquereinigungen wurde eine graduelle Reduktion der Menge an produziertem „A"-Antigen beobachtet. Die Menge an „Ä"-Antigen die vom MDV CVI-988 CEF₆₅ Klon C produziert wurde, lag ungefähr um 90% unter der „Ä"-Antigenexpression von MDV CVI-988 CEF₃₇.

Da die erfindungsgemäße Viruszubereitung (MDV CVI-988 CEF₆₅ Klon C) als vollständig attenuiert hinsichtlich der Pathogenität auf die hochempfindlichen RIR-Junghühner zu betrachten ist, ist die Schlußfolgerung berechtigt, daß die MDV-Attenuierung nicht immer mit dem vollständigen Verlust der „A"-Antigenexpression verbunden ist.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen erläutert.

Seispiel I

Bestimmung der Pathogenität von MDV CVI-988 DEF₅₁ Klon C im Hinblick auf RIR-Junghühner im Vergleich mit denen von HVT ^:C126 und MDV CVI-988 CEF₃₅

Der Test wurde mitspf RIR-Junghühnern der Houghton Geflügelforschungsstation (England) durchgeführt. Die Junghühner /vurden in veränderten Horsfall-Bauer-Käfigen gehalten. Die Vögel wurden ad Libitum mit Roggenmaische-Futtermitteln gefüttert. Sie wurden über 24 Wochen täglich auf das Auftreten klinischer Symptome von MD untersucht. Die Junghühner /vurden als einen Tag alte Küken intramuskulär mit 10000 FFU des infrage kommenden Virus in 0,5ml Gewebekulturmedium geimpft, was dem Zehnfachen der üblichen Felddosis entsprach. Alle Vakzinezubereitungen enthielten den Virus in Zellenassoziierter Form.

Eine Gruppe von 20 RIR-Junghühnern wurde mit MDV CVI-988 CEF₃₅, der kommerziellen Vakzine, geimpft. Eine andere Gruppe /on 20 RIR-Junghühnern erhielt die erfindungsgemäße Viruszubereitung (MDV CVI-988 DEF51 Klon C). Eine Gruppe von 43 RIR-Junghühnern wurde mit HVT FC126 geimpft.

Tote und eingehende Vögel wurden herausgenommen und einer Autopsie unterzogen. Die Gewebe wurden mikroskopisch untersucht. Am Schluß des Beobachtungszeitraumes wurden alle verbliebenen Junghühner getötet und makroskopisch sowie mikroskopisch untersucht. Nervenschädigungen wurden nach Payne und Biggs, Journal of the National Concer Institute 39, 281-302 (1967) als inflammatorische (B-Typ) Schädigungen und lymphomatoide (Α-Typ) Schädigungen klassifiziert. Gesteigerte lymphoide Infiltration und lymphocytische Hyperplasie in visceralen Organen wurde als Anzeichen für die Marek'sche Krankheit betrachtet. Die Gesamtzahl der Junghühner wurde hinsichtlich unspezifischer Mortalität innerhalb von 21 Tagen nach dem Ausbrüten korrigiert.

Die Ergebnisse sind aus Tabelle 1 zu entnehmen. Aus ihr geht das Verhältnis der Anzahl der Junghühner mit makroskopischen pathologischen und/oder mikroskopischen Zeichen von MD im Hinblick auf die Gesamtzahl der im Test befindlichen Junghühner hervor. Die Impfung von RIR-Junghühnern mit der kommerziellen Vakzine (MDV CVI-988 CEF₃₅) rief bei 5 von 8 Junghühnern Paralyse hervor. Die Paralyse wurde von einer endoneuralen Entzündung der peripheren Nerven und Nervenplexi begleitet (B-Typ-Schädigung). Weitere zwei Junghühner wurden entfernt, da sie eingingen. Diese Junghühner zeigten ebenfalls B-Typ-Schädigungen in den peripheren Nerven. Ein Junghuhn, das während des Testes starb, zeigte keine Anzeichen der Marek'schen Krankheit. In den ersten zwei Wochen starben 12 Junghühner aus zufälligen Gründen.

Weder makroskopische Anzeichen noch mikroskopische Schaden wurden an einer Gruppe RIR-Junghühner beobachtet, die mit der erfindungsgemäßen Vakzinezubereitung geimpft worden waren. Bei einem mit HVT FC126 geimpften RIR-Junghuhn wurde Paralyse beobachtet. Die mikroskopische Überprüfung der peripheren Nerven zeigte geringfügige Schädigungsmerkmale eines endoneuralen Lymphadenoms. Gegen Ende der Beobachtungszeit offenbarte die mikroskopische Überprüfung B-Typ-Schädigungen an peripheren Nerven von 3 Junghühnern, die mit HVT FC126 geimpft worden waren. Ein Junghuhn mit klinischer Paralyse zeigte eine unspezifische Neuritis.

Tabelle 1

Vergleich von zwei kommerziellen Vakzinen mit der erfindungsgemäßen Vakzine: pathogene Eigenschaften bei RIR-Junghühnern

	Anzahl d.	Mortalität innerhalb 24 Wochen	Nerven	B-Typ-	A-Typ-	MD-	Autopsie nach	Anzahl d. MDpos./	(88%)
	Junghühner		schwel	Schäd.	Schäd.	negativ	24 Wochen	Ges.anzahld.
			lung					Junghühner²¹	(0%)
Impfstoff	20	unspezif.	5	7	—	1	B-Typ- MD-		(10%)
		Mortalität¹¹					Schäd. negativ		(0%)
	20		—	—	—	—
MDV CVI-988 CEF₃₅	43	12	—	—	1	2	— —	7/8
MDV CVI-988 DEF₅₁	20
Klon C	2				— 18	0/18
HVTFC126	4				3 33	4/39
Kontrolle	3			— 17	0/17

1) Unspezifische Mortalität von 21 Tagen nach dem Ausbrüten

2) Gesamtzahl der Junghühner wurde hinsichtlich unspezifischer Mortalität korrigiert

Beispiel Il

Ähnliche Tests wie im Beispiel I zur Unschädlichkeit bei Einsatz von RIR-Junghühnern wurden mit zwei CEF-angepaßten erfindungsgemäßen Zubereitungen durchgeführt (MDV CVI-988 CEF-ss-Klon C und MDV CVI-988 CEF₅₃ Klon C).

MDVCVI-SSSCEF₆₅KlOnC:

Zwanzig R!R-Küken, die aus SPF RIR-Fiem ausgebrütet worde.i waren (erhalten von Wickham Laboratories) wurden intramuskulär mit 10000 FFU unmittelbar nach dem Ausbrüten geimpft. Die Küken wurden in modifzierten Horsefall-Bauer-Käfigen gehalten.

Zehn Wochen nach der Impfung wurden 6 Junghühner (5 männliche, 1 weibliches) aus dem Käfig genommen und seziert. Es fand eine histologische Überprüfung derThymus, der Fabriciusbursa, der Milz, der Leber, der vagalen und interkostalen Nerven sowie trachialen und Hüftnerven und Nervengeflechte von beiden Seiten statt.

Nach einem Beobachtungszeitraum von 24 Wochen wurde der Test durch Autopsie der verbliebenen 10 weiblichen Junghühner beendet. Die für die histologische Untersuchung ausgewählten Gewebe waren die oben genannten. Es wurden weder klinische noch makroskopische Anzeichen der Marekschen Krankheit noch histologische Schädigungen im Zusammenhang mit MD bei irgendeinem der 16 Testjunghühner beobachtet.

MDV CVI-988 CEF₅₉ Klon C:

Dreizehn RIR-Jungküken, ausgebrütet aus SPF RIR-Eiern, die von Wickham Laboratories erhalten worden waren, wurden mit 10000 FFU unmittelbar nach dem Ausbrüten geimpft. Die Küken wurden in modifizierten Horsefall-Bauer-Käfigen gehalten.

Zwei Junghühner gingen aus unspezifischen Ursachen ein. Nach einem Beobachtungszeitraum von 24 Wochen wurde der Test durch Autopsie beendet, die bei den verbliebenen 11 Junghühnern (5 weibliche und 6 männliche) durchgeführt wurde. Weder

klinische noch makroskopische Anzeichen der Marekschen Krankheit wurden bei irgendeinem der 11 Junghühner beobachtet. Die histologischen Untersuchungen erfolgten am Thymus, der Fabriciusbursa, der Milz, der Leber, vagalen und interkostalen Nerven sowie brachialen und Hüftnerven und Nervengeflechten von beiden Seiten.

Bei einem Junghuhn (männlich) wurde eine lymphoide Hyperplasie an der Leber beobachtet. Es wurden Bursaabhängige follikuläre Strukturen beobachtet, daher wurden die Schädigungen nicht als neoplastisch betrachtet.

Beispiel III

Ähnliche Tests wie in den Beispielen I und Il zur Unschädlichkeit bei Einsatz von RIR-Junghühnern wurden mit den Klonen A, B und C — alle aus der MDV CVI-988 DEF Passage Nr. 48 stammend- (sowohl Klon C als auch Klon C stammten aus derselben Plaque der DEF Passage Nr.49). Zusätzlich wurde Klon D getestet

MDV CVI-988 CEF₆₃ Klon A:

Sechzehn RIR-Küken, ausgebrütet aus SPF RIR-Eiern, die von Wickham Laboratories erhalten worden waren, wurden intramuskulär mit 10000 FFU unmittelbar nach dem Ausbrüten geimpft. Der Testverlauf war ähnlich wie der im Beispiel II. Klinische oder makroskopische Anzeichen der Marekschen Krankheit wurden nicht beobachtet. Es wurden allerdings bei der histologischen Untersuchung inflammatorische Schädigungen, B-Typ-Schädigungen nach Payne und Biggs J. Natl. Cancer Institute 39,281-302 (1967) im Nervengeflecht von einem von 10 Junghühnern beobachtet, die nach 24 Wochen seziert wurden.

MDV CVI-988 CEF₆₂ Klon B:

Achtzehn RIR-Küken, ausgebrütet aus SPF RIR-Eiern, die von Wickham Laboratories erhalten worden waren, wurden intramuskulär mit 10000 FFU des Klons B geimpft. Der Testverlauf war ähnlich wie der im Beispiel II. Weder klinische noch makroskopische Anzeichen der Marekschen Krankheit noch histologische mit MD einhergehende Schädigungen wurden bei irgendeinem der 18 Testjunghühner beobachtet

MDV CVI-988 CEF Klon C:

Vierzehn RIR-Küken, ausgebrütet aus SPF RIR-Eiern, die von Wickham Laboratories erhalten worden waren, wurden intramuskulär geimpft mit 10000 FFU des Klons C, der Zellpassagen in DEF bis zur Passage Nr. 54unterworfen worden war. Der Testverlauf war ähnlich wieder im Beispiel II. Weder klinische noch makroskopische Anzeichen der Marekschen Krankheit noch mit MD einhergehende histologische Schädigungen wurden bei irgendeinem der 14Testjunghühner beobachtet. MDV CVI-988 CEF₅₉ Klon C:

Dreizehn RIR-Küken, ausgebrütet aus SPFRIR-Eiem, die von Wickham Laboratories erhalten worden waren, wurden intramuskulär unmittelbar nach dem Ausbrüten mit 10000 FFU geimpft. Nach einem Beobachtungszeitraum von 24 Wochen wurde der Test durch Autopsie beendet. Drei Junghühner starben aus unspezifischen Ursachen, so daß 10 Junghühner (6 weibliche und 4 männliche) verblieben. Es wurden weder klinische noch makroskopische Anzeichen der Marekschen Krankheit an irgendeinem der 10 Junghühner beobachtet.

Histologische Untersuchungen erfolgten am Thymus, Fabriciusbursa, Leber, vagalen und interkostalen Nerven sowie brachialen und Hüftnerven uns Nervengeflechten von beiden 'Seiten. Bei einem weiblichen Junghuhn wurde im Hüftnerv eine inflammatorische B-Typ-Schädigung beobachtet

MDV CVI-988 DEF₉₇ Klon D:

Zwanzig RIR-Küken, ausgerüstet aus SPF RIR-Eiern, die von der Houghton Geflügelforschungsstation (England) erhalten worden waren, wurden intramuskulär mit 10000 FFU des Klons D geimpft. In gleicher Weise wie Klon E wurde dieser Klon D-nur einer Zellkulturpassage in DEF unterzogen und es wurden Plaquereinigungsstufen zwischen den Passagen 87 und 94 durchgeführt. Zwei Junghühner gingen aus unspezifischen Gründen ein. Das Testverfahren war ähnlich wie das des Beispiels I. Weder klinische noch makroskopische Anzeichen der Marekschen Krankheit noch histologische mit MD einhergehende Schädigungen wurden bei irgendeinem der 18 Testjunghühner beobachtet

Untersuchungen zur Schutzwirksamkeit

Die immunologische Eigenschaften einer Vakzinezubereitung werden am genauesten durch eine 50% Schutzdosis (PD₅₀)-Assay (Journal of Biological Standardization 9:15-22,1981) bestimmt.

Die PD₅₀ ist als die Anzahl von Plaque-oder Infektionsherd-bildenden Einheiten (FFU: plaque orfocus forming units) — bestimmt in einem in vitro Test — definiert, die erforderlich ist, 50% des MD-empfindlichen Teiles einer Gruppe von SPF-Junghühner gegen klinische Symptome und Schädigungen der Marekschen Krankheit zu schützen. Die Challenge-Infektion wird am 9. Lebenstag durch intramuskuläre Injektion mit dem virulenten MDV bei einer Dosis durchgeführt, die dafür bekannt ist, bei unvakzinierten Junghühnern mehr als 70% MD-Schädigungen während eines Beobachtungszeitraumes von 10 Wochen hervorzurufen. Die so erhaltenen Testergebnisse können statistisch über eine Computerprogramm, entwickelt von UCLA Health Sciences Computing Facilities (BMDO3S, Fassung vom I.Juni 1964) ausgewertet werden. Weitere Informationen über den Einsatz dieser statistischen Methode werden im Journal of Biological Standardization 9:15-22,1981 gegeben. Das genannte Computerprogramm gestattet eine exakte Analyse der Testergebnisse und Bestimmung der Neigung der Probit-Regressionslinien. Eine PD₅₀ wird auf der Grundlage der pathologic, en Erscheinungen in dem Teil der Testtiere berechnet, der MD-Empfindlichkeit besitzt. Die natürliche Resistenz wird von der Kontrollgruppe verkörpert.

Die Untersuchungen zur Schutzwirksamkeit mit verschiedenen Virusklonen (nicht Klon C), die man vom Stamm MDV CVI-988 erhalten hatte, zeigten die folgenden Ergebnisse: MDV CVI-988 CEF₅₅ Klon A:

Die Schutzwirksamkeit des Klons A war sehr gering. Der PD₅o-Versuch erbrachte eine flache Linie für die Dosisleistung mit Virusdosen von 100 und 500 FFU, entsprechend wurden 19 und 7 Junghühner von 40 Testtieren gegen MDV-K-Infektion geschützt.

MDV CVI-988 CEF₅₃ Klon B:

Der PD₅o-Versuch mit einer CEF-angepaßten Zubereitung des Klons B erbrachte eine PD₅₀-Schätzung von 31,9 FFU, die signifikant höher war als die PD₆₀-Schätzung, die man für MDV CVI-988 CEF₅₉ Klon C (p < 0,05) erhielt. MDV CVI-988 CEF₅₉ Klon C:

Der PD₅₀-Versuch mit einer CEF-angepaßten Zubereitung des Klons C erbrachte eine PD₅₀-Schätzung von 41,6 FFU, die Signifikat höher war als die PD₅₀-Schätzung, die man für MDV CVI-988 CEF₅₉ Klon C (p < 0,05) erhielt. MDV CVI-988 DEF₉₇ Klon D:

Dieser Klon D erwies sich als überattenuiert. Eine relativ geringe Anzahl an Junghühnern wurde gegen MDV-K-Challengenfektion geschützt.

\uf Basis der Unschädlichkeits- und Schutzwirksamkeitsuntersuchungen wurden geschlußfolgert, daß MDV CVI-988 Klon C der jeste Kandidat für die Entwicklung einer Vakzine gegen die Marekschen Krankheit ist. Die Schutzwirksamkeit des irfindungsgemäßen Virusklons wurde in den Beispielen IV bis VIII erläutert.

Beispiel IV

Bestimmung der Immunisierungsstärke von MDV CVI-988 DEF₅₁ Klon C im Vergleich mit der von MDV CVI-988 CEF₃₅ und HVT FC126

η diesem Test wurde die immunogene Aktivität einer Viruszubereitung nach der Erfindung, MDV CVI-988 DEF51 Klon C, mit zwei praktisch weitverbreiteten Zubereitungen verglichen: MDV CVI-988 CEF₃₅ und HVT FC126. Dazu wurde die PD₅₀ bestimmt, die als Anzahl der benötigten FFU definiert ist, um 50% des MD-empfindlichen Teiles einer Gruppe von Junghühnefn vor klinischen Symptomen und/oder makroskopischen Schäden von MD zu schützen.

Die Challenge-Infektion erfolgte mit einem virulenten MDV-Klon GA-5 [Journal of the National Cancer Institute 51,929-939

Es wurden SPF-Junghühner, weiße Leghorn, Stamm A (WLA) eingesetzt. Die verschiedenen Gruppen der Testjunghühner wurden in modifizierten Horsefall-Bauer-Käfigen gehalten. Die Junghühner jeder Dosisgruppe wurden auf zwei Käfige aufgeteilt.

Die Tiere wurden ad Libitum mit Roggenmaischefutter gefüttert.

Nach der Impfung wurden die Viruszubereitungen einer Plaquetitration in CEF oder in DEF unterworfen. Die Junghühner wurden auf klinische MD-Symptome hin beobachtet. Während dieses Zeitraumes eingegangene oder krank gewordene Tiere wurden aus den Käfigen entfernt. Am Schluß des Testzeitraumes wurden alle verbliebenen Tiere ebenfalls auf MD-Symptome untersucht.

Tabelle 2 zeigt die Anzahl der Junghühner mit klinischen Symptomen und/oder makroskopischen Schädigungen durch MD und die Gesamtanzahl der Testtiere pro Dosisgruppe. Jede der getesteten Viruszubereitungen gab Schutz gegen intramuskuläre Infektion mit MDV GA-5, wobei die höchste Virusdosierung am effektivsten war. Die Probitanalyse der aus drei Tests erhaltenen Daten erlaubte eine Kalkulierung von PD₅₀-Werten zwischen 14 und 33 FFU. Signifikante Unterschiede zwischen den PD₅₀-Werten der drei getesteten Viruszubereitungen wurden nicht beobachtet.

Tabelle 2

Vergleich von drei PD₅₀-Assays, durchgeführt mit MDV CVI-988 DEF₅₁ Klon C, MDV CVI-988 CEF₃₅ und HVT FC126

Vakzine	MDV CVI-988 DEF₅₁ Klon C	MDV CVi-988 CEF₃₅	HVT FCI26
Challenge-Virus	GA-5	GA-5	GA-5
Höchste Dosis (FFU)	1000 ... ·	500	500
Verschiedene Verdünnungen stufenweise	1:5	1:5	1:5
Anzahl geschützt/gesamt
Höchste Dosis	28/30	24/27	30/31
	29/32	21/24	30/32
	25/31	18/26	21/31
Niedrigste Dosis	12/32	9/23	8/32
	9/32
ohne Vakzine	3/32	5/22	4/28
PD₆₀*	33	14	14,7
95%iger Sicherheitsintervall der PD₅₀	16,5-66	4,4-44,9	6,7-32,1
Neigung der Probitregressionslinie	1,07	0,87	1,50
Standardfehler der Neigung	0,18	0,23	0,27

* Anzahl der benötigten FFU, um 50% der MD-empfindlichen Junghühner zu schützen

Beispiel V

Die gleichen Tests wie im Beispiel IV wurden mit den Viruszubereitungen MDV CVI-988 DEF₅₄ Klon C und -CEF₅₄ Klon C gemäß der Erfindung durchgeführt, im Vergleich mit MDV CVI-988 CEF₃₅ und dem HVT FC126 + MDV SB-1-Gemisch. Die Challenge-Infektion erfolgte mit virulantem MDV-K. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 enthalten.

Tabelle 3

Vergleich von vier PD₅₀-Assays, mit MDV CVI-988 DEF₅₄ Klon C, MDV CVI-988 CEF₅₄ Klon C, MDV CVI-988 CEF₃₅ und dem HVT FC126 + MDVSB-1-Gemisch

Vakzine

Challenge-Virus

MDV CVI-988 DEF₅₄KlOnC K

MDV CVI-988

CEF₅₄KlOnC

MDV CVI-988

CEF₃₅

HVTFC126. K

Höchste Dosis (FFU) 500

Versch. Verdünnungen stufenweise 1:5 Anzahl geschützt/gesamt Höchste Dosis 28/30

17/30 13/28

Niedrigste Dosis 12/30

ohne Vakzine 10/28

PD₅₀* 26,5

95%iger Sicherheitsintervall der PD₅₀10,8-64,8 Neigung der Probitregressionslinie 1,24 Standardfehler der Neigung 0,34

500	500	500
1:5	1:5	1:5
29/29	30/30	mn
26/29	25/29	26/29
25/30	22/29	24/29
18/28	14/30	22/29
15/29	7/30	12/29
12,9	10,3	6,4
3,4-48,5	3,3-32,1	0,48-85,4
1,22	1,20	0,79
0,42	0,29	0,30

* Anzahl der erforderlichen FFU, um 50% der MD-empfindlichen Junghühner zu schützen. Beispiel Vl

Die gleiche PD₅₀-Bestimmung wie in den Beispielen IV und V beschrieben wurde mit drei erfindungsgemäßen Viruszubereitungen vorgenommen, MDV CVI-988 DEF₅₄ Klon C, MDV CVI-988 CEF₅₄ Klon C und MDV CVI-988 CEF₆₅ Klon C im Vergleich mit der handelsüblichen Zubereitung MDV CVI-988 CEF₃₅. Die Challenge-Infektion erfolgte mit MDV RB/1B. Dieser Virus ist ein repräsentativer der sehr virulenten MD-Isolatevon Problem-Hühnerscharen in den USA. Dieses Teilisolat wurde in den USA von einer HVT-vakzinierten Legehühnerschar gewonnen und freundlicherweise von Dr.K.A.Schat, lthaka, N. Y. zur Verfügung gestellt.

Die Signifikanz der beobachteten Differenzen zwischen Paaren von geschützten PD₅₀, die in den verschiedenen Assays erhalten worden waren, wurde über ein Computerprogramm bestimmt, das von dem Erfassungs-Wahrscheinlichkeits-Test (Kendall und Stuart in The Advanced Theory of Statistics, Bd.2,3.Aufl., Charles Griffin & Co., Ltd., London 24:234-272,1973) abgeleitet wurde. Die PD₅₀-Assays waren vergleichbar, wenn der gleiche Stamm der Versuchshühner eingesetzt wurde, wenn die MD-Symptome und -Schädigungen allein durch makroskopische Inspektion bewertet und wenn die Challenge-Infektion entweder durch einen virulenten MDV oder durch einen sehr virulenten biovarianten MDV erfolgte. Diese statistische Bewertung ist nur durchführbar, wenn die Neigungen der verglichenen Probit-Regressionslinien und die natürliche Resistenz gegen MD-Entwickfung aus beiden Reihen sich nicht wesentlich unterscheiden.

Tabelle 4

Vergleich von vier PD₅₀-Assays, durchgeführt mit MDV CVI-988 DEF₅₄ Klon C, MDV CVI-988 CEF₅₄ Klon C, MDV CVI-988 CEF₆₅ Klon C und MDV CVI-988 CEF₃₅

Vakzine	MDV CVI-988	23/23	1,53	MDV CVI-988	MDV CVI-988	MDV CVI-988
	DEF₆₅ Klon C	23/24	0,34	CEF₅₄ Klon C	CEF₆₅KlOnC	CEF₃₅
Challenge-Virus	RB/IB	19/24	RB/IB	RB/IB	RB/IB
Höchste Dosis (FFU)	2 500	9/24	2 500	560	2 500
Versch. Verdünnungen stufenweise 1:5	0/25	1:5	1:5	1:5
Anzahl geschützt/gesamt	31,6
Höchste Dosis	95%iger Sicherheitsintervall der PD₅₀6,9-14,4	21/21	40/41	20/20
	Neigung der Probit-	17/20	39/40	20/20
	Regressionslinien	20/20	33/41	15/20
Niedrigste Dosis	Standardfehler der Neigung	16/19	17/38	9/20
ohne Vakzine		0,18	4/38	2/20
PD₅₀*	♦*	6,5***	34,3
		2,0-21,5	5,6-211

	1,19	1,73
	0,22	0,48

* Anzahl der erforderlichen FFU, um 50% der MD-empfindlichen Junghühner zu schützen. ** konnte wegen irregulären Verlaufes der Dosisabhängigkeitslinie des PD^-Wertes nicht kalkuliert werden. *** PD₅₀-Schätzung von MDV CVI-988 CEF₆₅ Klon C ist signifikant verschieden von den anderen beiden PD₅₀-Schätzungen (p < 0,01)

Beispiel VII

Es wurde ein PD₅₀-Versuch mit einer CEF-angepaßten Viruszubereitung gemäß der Erfindung, MDV CVI-988 CEF₆₉ Klon C, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt. Auf Grund der genannten Bedingungen im Beispiel Vl waren die Ergebnisse dieser Assay statistisch vergleichbar mit zwei PD₅o-Assays, die mit MDV CVI-988 CEF₃₅ durchgeführt wurden, die bereits in den Tabellen 2 und 3 dargestellt worden waren (diese Ergebnisse werden hier noch einmal dargestellt).

abelle5

itatistischer Vergleich von PD₅₀-Assays, durchgeführt mit MDV CVI-988 CEF₅₉ Klon C und zwei Assays mit MDV CVI-988 CEF₃₅-'akzinierung

'akzine	MDV CVI-988
	CEF₅₉KlOnC
Ihallenge-Virus	K
Ochste Dosis (FFU)	500
fersch. Verdünnungen stufenweise	1:5
Anzahl geschützt/gesamt
löchste Dosis	35/36
	39/39
	27/36
liedrigste Dosis	24/40
jhneVakzine	5/38
^DD₅₀*	3,6
55%iger Sicherheitsintervall der PD₅₀	0,7-19
Neigung der Probitregressionslinie	1,06
Btandardfehler der Neigung	0,23

MDV CVI-988

M DV CVI-988

CEF₃₅

24/27

18/26

500 1:5

30/30

25/29

22/29

14/30

7/30

10,3

3,3-32,1

1,20

0,29

Anzahl der erforderlichen FFU, um 50% der MD-empfindlichen Junghühner zu schützen Signifikant höher als die PD₆₀ von CEF₅₉ Klon C (p < 0,05)

Ein ähnlicher statistischer Vergleich erfolgte ebenso mit der MDV CVI-988 CEF₅₉ Klon C — PD₅₀ Assay und sechs Assays, die mit VIDV CVI-988 CEF₃₅ durchgeführt wurden. Die letzteren PD₅₀-Versuche wurden im J. Biol. Standardization 9:15-22 (1981) Deschrieben.

Tabelle 6	CEF₅₉KlOnC	I	Il	Zellkulturpassage und MDV CVI-988 CEF₅₉ Klon C	IV	V	Vl
	K	K	K	IiI	K	K	GA-5
	500	250	690	K	5120	276	433
				690
Vergleich von sechs PD₅₀-Assays von MDV CVI-988 bei etwa der 35.	1:5	1:5	1:10		1:4	1:4	1:4
Versuch Nr.				1:4
Challenge-Virus	35/36	29/29	36/39		22/22	15/21	19/21
Höchste Dosis (FFU)	39/39	29/26	28/39	10/10	21/21	14/19	14/21
Versch. Verdünnungen	27/36	15/31	13/43	9/10	22/22	7/19	3/20
stufenweise	24/40	9/21	9/32	6/10	20/22	5/20	1/22
Anzahl geschützt/gesamt				2/10	12/20	2/21	1/22
höchste Dosis					9/22	4/22
	5/38	7/26	17/44		4/22	5/41	0/30
	3,6	35⁺	7O⁺	3/20	16**	54**	75⁺
niedrigste Dosis				44+
	0,7-19	3,4-359	16-299		1,8-133	6,0-483	36-159
				17-118
ohne Vakzine	1,06	2,44	1,38		1,72	0,98	1,41
PD₆₀*	0,23	1,64	0,30	2,22	0,47	0,27	0,23
95%iger Sicherheits		0,80
intervall der PD₅o
Neigung der Probit-
Regressionslinie
Standardfehler der Neigung

* Anzahl der erforderlichen FFU, um 50% der MD-empfindlichen Junghühner zu schützen. ** PDso-Einschätzung signifikant höher als PD₅₀VOn CEF₅₉ Klon C (Versuch IVp < 0,05; Versuch V ρ <0,01) ⁺ Statistische Bewertung der Differenzen zwischen PD₅₀-Einschätzungen nicht durchführbar wegen unterschiedlicher Neigung der

Regressionslinien (Versuche I und J]I) oder Differenzen der Prozentsätze des natürlichen Schutzes (Versuche Il und IV) Die folgenden Schlußfolgerungen können aus den Beispielen Vl und VII gezogen werden: .——-—~~— —

— Es wurde ein statistischer Vergleich durchgeführt mit neun Paaren PD₅₀-Assays, bei denen die Vakzinierung entweder mit MDV CVI-988 CEF₃₅ oder mit MDV CVI-988 Klon C durchgeführt wurde.

— DiePÜMi-Einschätzungen von CEF₅₉KlOn C — oder CEF₆₅ Klon C-Zubereitungen lagen alle unter denen, dier.it MDV CVI-988 CEF₃₅ erhalten wurden.

— Die Differenzen zwischen PD₅₀-Werten waren in vier Vergleichen signifikant (2 χ p< 0,01,2 χ p< 0,05). In einem Falle war die Differenz nicht signifikant. In vier Fällen war eine statistische Bewertung nicht durchführbar wegen der Differenzen zwischen den verglichenen Neigungen der Regressionslinien oder beobachteter natürlicher Resistenz in nicht-vakzinierten Gruppen.

— Es kann geschlußfolgert werden, daß die Schutzwirkung von MDV CVI-988 Klon C über der von MDV CVI-988 CEF₃₅ liegt, wenn sie bei SPF-Junghühnem eingesetzt wird.

Beispiel VIII

Ein Repräsentant der Gruppe sehr virulenter biovarianter MD-Viren wurde aus einer HVT FC126-vakzinierten Geflügelschar in Tunis isoliert. In der ursprünglichen Schar war ein MD-Befall von 29% beobachtet worden. Das Isolat (MDV Tun) zeigte extrem virulente Eigenschaften, nur 100 weiße Blutzellen eines infizierten SPF-Junghuhns führten während der Standardbeobachtungszeit von 10 Wochen zu über 70% MD-Verlusten in Gruppen unvakzinierter 9 Tage aller Küken. Der oben genannte Repräsentant des biovarianten sehr virulenten MD-Virus wurde als Challenge-Virus in zwei PD₅₀-Versuchen eingesetzt, bei denen die Schutzwirkungen von MDV CVI-988 CEF₆₅ Klon C und HVT FC126 verglichen wurden. Die Ergebnisse dieser

WoronKhü cinH in Tahplle 7 Hamestfillt. Tabelle 7

Vergleich des erreichten Schutzes durch MDV CVI-988 CEF₆₅ Klon C und HVT FC126 gegen MDVTun-Challenge-lnfektion

Vakzine Challenge-Virus

Höchste Dosis (FFU) Versch. Verdünnungen stufenweise Anzahl geschützt/gesamt höchste Dosis

Niedrigste Dosis ohne Vakzine

95%iger Sicherheitsintervall der PD₅₀ Neigung der Probitregressionslinie Standardfehler d. Neigung * Anzahl der benötigten FFU, um 50% der MD-empfindlichen Junghühner zu schützen ** PDüo-Einschätzung von MDV CVI-988 CEF₆S Klon C signifikant verschieden von HVT FC126 PD₅₀-WeIt (p < 0,05).

Die Schlußfolgerung ist berechtigt, daß die erfindungsgemäße Vakzinezubereitung besseren Schutz gegen MDVTun-Challenge Infektion gibt als die verglichenen HVT-Vakzinen.

M DV CVI-988 CEF₆₅ Klon C	HVTFC126
MDVTun	MDVTun
268	500
1:5	1:5
38/38	37/41
38/38	30/41
28/40	18/39
19/40	9/41
8/38	11/39
5,2**	60,8
1,6-16,4	27,3-136
1,75	1,35
0,43	0,27

Claims

Erfindungsanspruch:

1. Verfahren zur Herstellung einer Viruszubereitung, insbesondere einer Vakzine, gegen die Marek'sche Krankheit, gekennzeichnet durch die Verwendung eines lebenden viralen Klons des Virus der Marek'schen Krankheit, der zum Vogelherpesvirus Serotyp-1 gehört, wobei dieser Klon in der Lage ist, mit diesem geimpfte Junghühner gegen eine nachfolgende Challenge-Infektion durch virulente oder sehr virulente biovariante Viren der Marek'schen Krankheit (MD) zu schützen.
2. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnet durch die Verwendung eines viralen Klons, der im wesentlichen nichtpathogen gegen spezielle pathogenfreie (SPF) Rhode Island Red (RIR)-Junghühner(Küken) ist, die hoch-MD-empfindlich sind.
3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß der verwendete virale Klon ein Derivat eines Virus ist, der die Identifizierungsmerkmale von MDV CVI-988 aufweist.
4. Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß der verwendete virale Klon die Identifizierungsmerkmale von MDV CVI-988 Klon C aufweist.
5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der verwendete Klon hoch immunogen ist und ein breites Spektrum an Schutz gibt.
6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der verwendete virale Klon in der Lage ist, 50% der MD-empfindlichen Junghühner, die mit der Zubereitung geimpft sind gegen das Auftreten von makroskopischen MD-Schädigungen nach Challenge-Infektion mit dem Virus MDVTun bei einer statistisch signifikant niedrigeren Dosis als mit HVT FC126 zu schützen.
7. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß der verwendete Virusklon MDV CVI-988 Klon C ist, hinterlegt in seiner 65. CEF-Passage als Phabagan PC PV 1 sowie als CNCM I-426 (Institut Pasteur), oder ein Derivat davon oder ein beliebiger rekombinanter Virus auf Basis dieses viralen Klons oder deren Derivate.
8. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnet dadurch, daß ein Virus der Marek'schen Krankheit, zum Vogelherpesvirus Serotyp-1 gehörend, aufeinanderfolgenden Passagen in Vogelzellkulturen und einer Piaquereinigung unterworfen wird, ein Klon selektiert wird, der immunogen und nichtpathogen ist, insbesondere gegen hoch MD-empfindliche Rhode Island Red (RIR)-Junghühner, und eine Vogelzellkultur des selektierten Klons bereitet wird.
9. Verfahren nach Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß der als Ausgangsmaterial verwendete Virus der Marek'schen Krankheit ein Virus mit den Identifizierungsmerkmalen von MDV CVI-988 ist.
10. Verfahren nach Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß der selektierte Klon die Identifizierungsmerkmale von MDV CVI-988 Klon C aufweist.
11. Verfahren nach Punkt 10, gekennzeichnet dadurch, daß der selektierte Klon MDV CVI-988, Klon C ist, hinterlegt in seiner 65. CEF-Passage als Phabagen PCPV 1 sowie als CNCM I-426 (Institut Pasteur), oder ein Derivat davon oder ein beliebiger rekombinanter Virus auf Basis dieses viralen Klons oder Derivate davon.