DE2315912A1

DE2315912A1 - Verfahren zur herstellung von oralimpfstoffen gegen enterobacteriaceae-erkrankungen

Info

Publication number: DE2315912A1
Application number: DE19732315912
Authority: DE
Inventors: Marie Dr Kittlick; Hans Dr Koch; Baerbel Dr Kramer; Klaus Prof Dr Linde; Sieglinde Dr Schmidt; Axel Dr Stelzner
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Current assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Priority date: 1973-03-30
Filing date: 1973-03-30
Publication date: 1974-10-10

Description

Verfahren zur Herstellung von Oralimpfstoffen gegen Enterobacteriaceae-Erkrankungen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Merstellung von Oralimpfstoffen zur gktiven Immunisierung genen Unterobacteriaceae-Erkrankungen, insbesondere Enteritiscoli, Shigellosen, Salmonellosen.
bisher bekannte Verfahren betreffen Tmpfstoffe aus abgetöteten Keimen oder Bakterienextrakten, nie Coli-Enterotoxämie bei Schweinen nird mit einen abgetöteten monovalenten Oralimpfstoff aus Bakterien des Serotyps OK 139 bekämpft. Saugferkeln wird ein ITischimpfstoff der Serotypen ol' 9/21 verfiittert, und bei der Kälbersepsis kommt eine stallspezifische Oralvaccine zur Anwendung, In ddr Pädiatrie verfügt man bisher über zwei verschiedene Arten von Oralvaccinen gegen Enteritiscoli (nachfolgend EC). während ein Impfstoff aus Keimen besteht, die mit Formaldehyd inaktiviert Wurden, handelt es sich bei den anderen um Extratimpfstoffe.
Impfungen gegen E-Ruhr-Erkrankungen Werden bekannterweise ebenfalls mit einem Totimpfstoff durchgeführt.
Sonst arbeitet man bereits vorwiegend mit Extraktimpfstoffen oder Lebendimpfstoffen, nämlich mit streptomycinabhängigen Stammen, mit kybridstämmen und mit spontan avirulenten Shigellen.
Impfungen beim Menschen gegen Salmonellosen Werden bisher nur mit Totimpfstoffen durchgeführt. Versuche mit Lebendimpfstoffen beschränken sich auf Tiere. Bei den lebendimpfstoffen handelt es sich um streptomycinabhängige Salmonellen oder um spontan avirulente Formen.
bisher bekannte Oralimpfstoffe gegen Enterobacteriaceae bestehen vorwiegend aus abgetöteten Keimen oder Bakterienextrakten. Nachteiligerweise führt hierbei eine Abtötung und Extraktion der Keime zu Verschiebungen im Antigenmosaik. Bei Enterobacteriaceae-Erkrankungen ist darüber hinaus Jedoch bisher das auslösende pathogenetische Prinzip unbekannt. Daher ist bei einer Impfstoff-Herstellung vonWichtigkeit, daß Impfstämme mit unverändertem Antigenmosaik verwendet werden.
Impfstoffe aus lebenden straptomycinabhängigen Bakterien war den erprobt.
Es ist bekannt, daß ein Totimpfstoff einem tebendimpfstoff unterlegen ist. In Tierversuchen konnte dafür der Be'is zu wiederholten Malen erbracht werden. Besonders ist auf die Tatsache hinzuweisen, daß bei Mäusen eine Ansiedlung des homologen Impfstammes im Darm nur dann zu unterbinden war, Wenn eine Immunisierung mit lebenden Keimen vorausging. Nur durch Iiebendimpf stoffe ist eine echte zelluläre Immunität zu erzielen.
Zweck der Erfindung ist es, einen virulenzabgeschwächten oralen Lebendimpfstoff mit begrenzter Vermehrungsfähigkeit herzustellen, der durch aktive künstliche Immunisierung eine deutliche Morbiditäts- und Mortalitätssenkung an durchfallerkrankungen auslöst und der durch Unterbrechung von Infektketten auch prophylaktische Wirkung besitzt.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch Züchtung antibiotikaabhängiger mutanten der Enterobacteriaceae und Auswahl geeigneter Mutanten einen lebenden, virulenzabgeschwächten, begrenzt vermehrungsfähigen Oralimpfstoff herzustellen, der eine Fombination von nicht pathogener, aber guter immunogener Wirkung und Stabilität besitzt. Der Impfstoff muß qualitativ und quantitativ gut reproduzierbar sein.
Gemäß der Erfindung Wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß man Enterobacteriaceae auf Nährboden mit hohen Streptomycinkonzentrationen aufspatelt, wobei die nach der Bebrütung als streptomycinresistent erkannten Kolonien parallel auf nährböden ohne und mit Streptomycin ausgestrichen werden und die dabei gefundenen streptomycinabhängigen Stämme anschließend auf ihre Eignung als Impfstämme durch Bestimmung ihrer Reversionsrate, durch Wachstumskurven der Revertanten, durch Nachweis einer antiinfektiösen Immunität und durch Bestimmung der LD50 nach REED und NÜNCH geprüft werden. Zur Unterscheidung von Revertanten und Wildstämmen können den als Impfstämmen ermittelten Bakterien Auxotrophiemarker eingekreuzt werden. Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Bebendimpfstoff hat folgende Vorteile gegenüber einem abgetöteten: Durch Erzielung echter zellulärer Itrnnunität wird eine Ausbreitung der Infektion über die Darmwand hinaus verhindert Es wird eine antiinfektiöse Immunität erreicht.
Durch die Ansiedlungshemmung der Infektion im Darm ist infolge Unterbrechung von Infektketten nach aktiver künstlicher Immunisierung eine echte Prophylaxe zu erwarten.
Unter streptomycinabhängigen (nachfolgend Sm-d) Stämmen mit begrenzter Vermehrungsfähigkeit sind virulenzabgeschwächte Imp£-stämme mit guter immunogener Wirkung zu finden.
Eine Sm-d Vaooine zeigt bei 30 Erwachsenen in einer Dosierung von täglich 1012 Keimen über einen Zeitraum von 10 Tagen gute Verträglichkeit.
An 20 Säuglinge wurden täglich 1011 Sm-d Enteritiscoli-Keime für 10 Tage reaktionsios und ohne Nebenwirkungen verfüttert.
Durch nachstehendes Beispiel wird die Erfindung näher erläutert, wobei nur Verfahrensstufen beschrieben werden, die zur Herstellung eines schließlich zur Impfstoffproduktion auszuwährenden Stammes führen. Es müssen stets eine große Anzahl anderer, nach diesem oder ähnlichen Verfahren hergestellte Formen geprüft werden, die unter Umständen für Impfzweoke ungeeignet sind.
Mit Hilfe des Phagozytosetestes werden von streptomycinsensiblen Ausgangsstämmen (Wildstämmen), deren Idendität zuvor durch Bestimmung der 0-, H- und K-Antigene mit der Widaltechnik nachgewiesen wurde, solche ausgesucht, die für eine Impfstammisolierung geeignet scheinen.
Der Phagozytosetest wird an peripheren Leukozyten, peripheren Monozyten sowie an Peritonealmakrophagen von Meerschweinchen in Gegenwart und Abwesenheit von sogenannten Normal seren derwenigen Spezies, in diesem Palle des Menschen, durchgeführt, an welcher später die Impfung vorgenommen werden soll.
Innerhalb eines hinsichtlich Keimmenge, Zellzahl und Versuchsbedingungen genau abgestimmten Systems darf die Normalphagozytose bestimmte prozentuale Mittelwerte nicht überschreiten.
Zur Isolierung von Sm-d Enterobacteriaceae-Stämmen merden 2 x 109 Keime/0, 1 ml physiologische NaCl-Lösung auf Agarplatten mit 400 /ml Streptomycin gespatelt, 48h bei 370 C bebrütet. Alle gewachsenen streptomycinresistenten kolonien müssen anschließend parallel auf Stretomycin-Agarplatten (400 # /ml) und auf Agarplatten ohne Streptomycin (nachfolgend Sm) isoliert Werden, um Sm-d Kolonien zu erkennen, die nicht -mehr ohne Sm wachsen können.
Die Mutation zur Streptomycin-Abhängigkeit ist stammabhängig.
Prüfung auf Sm-Unabhängigkeit muß erfolgen, da nur solche Sm-d Stämme als eventuelle Impfkeime verwendet werden, deren Reversion zur Sm-Unabhängigkeit nicht größer ist als 20 Sm-unabhängige (Revertanten, Minusmutanten) Kolonien auf 108 Sm-d.
Die Orüfung wird wie folgt vorgenommen: man stellt den fraglichen Impftstamm auf eine Keimzahl von 109/ml physiologischerNaCl-Lösung ein und spatelt davon Je 0,1 ml auf drei Agarplatten. iTach 48h Bebrütung bei 370 C und Weiteren 72h bei Zimmertemperatur dürfen im Durchscnitt nicht mehr als 20 Sm-unabhängige Kolonien des entsprechenden Serotypes/Platte wachsen.
Sm-d Stämme, die in ihrer Reversionsrate den angegebenen richtlinien entsprechen, werden leiter auf die Minusmutantennatur ihrer Revertanten untersucht.
Dazu sind zehn Revertanten gegen den entsprechenden Wildstamm zu testen: Anzucht der Stämme bei 370 C, danaoh Suspension mit der Öse in physiologischer NaCl-Lösung. Einmal Waschen durch Zentrifugation 3000 U/min ca. 15 Minuten. Die Wieder in NaCl-TJösung aufgenommenen Keime werden auf 2 x 108/ml eingestellt. Von dieser Suspension gibt man 1 ml in geeiohte Reagenzgläser zu 9 ml Rleischbouillon (dreifacher Ansatz). Unter Schütteln wird die beimpfte Bouillon im Wasserbad bei 37° C bebrütet und stündlich über einen Zeitraum von fünf Stunden'die Trübung gemessen. Das Messen erfolgt am Spekol bei einer Wellenlänge von 650 nm unter Verwendung des Meßansatzes ER 1.
wachstumaskurven der Revertanten müssen in der dritten Stunde gt; 10 % unter der des Wildstammes liegen.
das Würde auf die Impfstoffpraxis übertragen bedeutend Revertanten, die durch Nutation aus Sm-d Keimen entstehen, werden auf Grund ihres langsamen Wachstums von der normalen Darmflora überwuchert. Bei vielen quantitativan Stuhluntersuchungen von Persomen, die oral Sn-d Vaccine eingenommon hatten, waren nie Revertanten zu isolieren.
rei Sm-d Stämmen mit geringer Reversion zu Sm-unabhängigen und langsam wachsenden Tinusmutanten empfiehlt es sich außerdem erfindungsgemäß einen Auxotrophiemarker einzukreuzen, um jdeerzeit den Wildstamm von dem Minusmutanten unterscheiden zu können.
Die Einführung eines Auxotrophiemarkers in Sm-d Bnterobacteriadese erfolgt 1. durch N-Hethyl-H'-Nitro-N-Nitrosoguanidin (MHG), indem je eine Öse des betreffenden, etwa 24h alten Stammes in 10 ml Fleischbouillon mit 200# /ml Sm geimpft wird. Die Bebrütung erfolgt über Nacht als Schüttelkultur bei 37° C.
Am nächsten Morgen Werden je 5 ml dieser Übernachtkultur zentrifugiert und einmal in NaCl gewaschen.
Das Sediment wird in 5 ml einer 100 # /ml enthaltenden frischen, wäßrigen MNG-Lösung aufgenommen und 90 Minuten bei 37° C im Wasserbad inkubiert.
Anschließend wird das lEIG abzentrifugiert. Das Sediment nimmt man in 5 ml Pleischbouillon auf 0 1 ml davon kommt in 19 ml frische, angewärmte (370 C) Pleischbouillon und wird 4 Stunden bei 370 a geschüttelt. Dann wird zentrifugiert und einmal in NaCl gewaschen. Das Sediment wird in 5 ml M 9 ohne Stickstoff aufgelöst in einer Endkonzentration von 5 x 106 Keimen/ml und 5 Stunden bei 37° C geschüttelt. Anschließend gibt man 200 IE Penicillin pro ml und 1 % NH, Cl zu und läßt als Übernachtkultur stehen, Am nächsten Morgen zentrifugieren und zweimal in NaCl waschen, anschließend spateln von 0,1 ml der Keimsuspension mit dem Ziel, zwischen 50 und 100 Kolonien/Platte zu erhalten. Nach 18- bis 24-stündiger Bebrütung bei 37° a parallel auf M 9- und Vollmedium stempeln. Nachw Weiteren 18 bis 24 Stunden bei 370C Vergleich der zueinander gehörenden Platten. Kolonien, die auf Vollmedien wachsen, Werden in 0,5 ml NaCl suspendiert. Diese Suspensionen werden auf Vollmdien und Minimalmedium ausgestrichen und über Nacht bei 37° C inkubiert. nach der Prüfung der Platten am nächsten Tag Werden diejenigen Suspensionen aussortiert, die auf beiden Platten Wachsen. Die-Suspensionen' der tatsächlichen Mutanten werden nun auf Vollmediurn und einer Serie von Minimalmediumplatten mit den verschiedensten t7uchsfaktoren, z.B0 Aminosauren, Vitaminen, Purinen und Pyrimidinen, ausgestrichen und 48h bei 37° a bebrütet. Durch Vergleich der verschiedenen Platten Werden dann die spezifischen ITährstoffanforderungen von jeder Mutante bestimmt.
2. durch UV-Bestrahlung, indem je eine Öse des betreffenden, etwa 24 Stunden alten Stammes in 10 ml Pleischbouillon + 200 #/ml Sm zu impfen ist. Die Bebrütung erfolgt über Nacht als schüttelkultur bei 370 G. Am nächsten Morgen Werden 5 ml dieser übernachtkultur in 15 ml Fleischbouillon erneut 3h geschüttelt, anschließend 20 Minuten bei 4000 U/min zentrifugiert. Das Sediment Wird in der gleichen Menge NaCl auf gelöst.
Danaoh wird die UV-Bestrahung von einer Intensität, die eine 0,05 ziege Überlebensrate garantiert, vorgenommen. Diese Arbeiten Während der Bestrahlung und bis zu 5 Stunden danach sind nur im Dunkeln mittels einer Photolampe mit Rotfilter möglich.
0,5 ml der bestrahlten Suspension Werden in 5 ml Fleischbouillon und 200 #/ml Sm aufgenommen, 18 bis 24 Stunden bei 370 C stehengelassen, dann zentrifugiert und zweimal gewaschen. Das Sediment wird in N-freies Minimalmedium mit einer Endkonzentration der Keime von 5 x 106/ml überführt und 5 Stunden geschüttelt. Die weitere Behandlung erfolgt Wie vorher beschrieben.
Die Bestimmung der Tauglichkeit einer Sm-d, auxotrophen Mutante für Impfzwecke, die durch vorbeschriebene zWei Methoden ermittelt wurde, erfolgt 1. durch Bestimmung der Reveræionsratent Reversion zur Sm-Unabhängigkeit. Hierbei ist Bedingung, daß nicht mehr als 20 Revertanten auf 1 x 108 Keine entfallen.
Reversionen zur Prototrophie. TIierbei ist Bedingung, daß nicht mehr als 50 Revertanten auf 1 x 108 Keime entfallen.
Die Keimsuspension wird dabei in einer Konzentration von 1 x 108, 1 x 107 und 1 x 106 in je zwei Verdünnungsreihen auf Minimalmedium aufgespatelt und 48 Stunden bei 370 C bebrütet. Dabei dürfen dann auf den Platten, die mit 1 x 13 Keimen bespatelt wurden, nicht mehr als 50 Kolonien Wachsen.
2. durch Bestimmung der Wuchsstoffabhängigkeit: Dazu Wird eine Minimalmediumplatte zur Kontrolle der Stabilität mitgeführt, die den entsprechenden YJuchsstoff enthält.
Auch sie Wird mit 1 x 108 Keimen bespatelt und muß nach 48h einen Bakterienrasen aufweisen.
Sm-d enterobacteriaceae-Stämme, die genetisch als Impfstämme geeignet erscheinen, müssen im Ansiedlungshemmtest an der darmsterilen Maus ihre immunogenen Fähigkeiten unter Beweis stellen.
Mäuse erhalten 10 Tage lang täglich 1011Sm-d Keime per os. 10 Tage nach der letzten Antigengabe Werden die Mäuse in Einzelkäfige gesetzt und am 3. und 2. Tag vor der Infektion täglich mit 50 mg Streptomycin sondiert. Anschließend erfolgt die Infektion der durch Streptomycin darmsteril gewordenen Mäuse mit 10 bis (Streptomycin-resistenten) Keimen des gleichen Serotyps, der zur Immunisierung verwendet wird. Der Stuhl wird in den folgenden Tagen bakteriologisch untersucht.
T,'t einem geeigneten 103Sm- immunisierte Itläuse scheiden den Sm-r Impfstamm nach 10 Tagen L 20 % us, Zur Abrundung des Bildes kann im aktiven infektionsstamm und im Bakterizidietest eine zusätzliche Überprüfung des Mäuseschutzversuoh erfolgen.
Zur Bestimmung der Verträglichkeit des lmpf stammes wird die N>50 des Wildstammes und des Sm-d Impfstammes an 20 g schweren Albinomäusen nach REED und MÜNCH durch intraperitoneale Injektion bec stimmt. Die Infektionsdosis wird in logarithmisch abgestuften Verdünnungen (bei EC als 33 %ige Dotteremulsion) injiziert. LD50-Werte des Impfstammes verstehen sich in Abhängigkeit vom wildstamm.
Sie sind höher als beim Wildstamm, sollen nicht unter 108 und mindestens eine logarithmische Stufe über dem Wildstamm liegen.

Claims

P a t e n t a n 5 p.r ü o h e

Verfahren zur Herstellung eines Oralimpfstoffes zur aktiven Immunisierung gegen Enterobacteriaceae-Infektionen, insbesondere Enteritiscoli, Shigellosen und Salmonellosen, dadurch gekennzeichnet, daß man Keime auf Nährböden mit hohen Streptomycinkonzentrationen aufspatelt, Wobei die nach der Bebrütung als streptomycinresistent erkannten Kolonien parallel auf Nährböden ohne und mit Streptomycin ausgestrichen werden und die dabei gefundenen streptemycinabhängigen Stämme anschließend auf ihre Eignung als Impfstämme durch Bestimmung ihrer Reversionsrate, durch Wachstumskurven der Revertanten, durch Nachweis einer antiinfektiösen Immunität und durch Bestimmung der I50 nach REED und MÜNCH geprüft werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß den als Impfstämmen ermittelten Bakterien Auxotrophiemarker zur Unterscheidung von Revertanten und Wildstämmen eingekreuzt Werden.