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Verfahren zur Herstellung von Oralimpfstoffen gegen Enterobacteriaceae-Erkrankungen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Merstellung von Oralimpfstoffen zur gktiven
Immunisierung genen Unterobacteriaceae-Erkrankungen, insbesondere Enteritiscoli,
Shigellosen, Salmonellosen.
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bisher bekannte Verfahren betreffen Tmpfstoffe aus abgetöteten Keimen
oder Bakterienextrakten, nie Coli-Enterotoxämie bei Schweinen nird mit einen abgetöteten
monovalenten Oralimpfstoff aus Bakterien des Serotyps OK 139 bekämpft. Saugferkeln
wird ein ITischimpfstoff der Serotypen ol' 9/21 verfiittert, und bei der Kälbersepsis
kommt eine stallspezifische Oralvaccine zur Anwendung, In ddr Pädiatrie verfügt
man bisher über zwei verschiedene Arten von Oralvaccinen gegen Enteritiscoli (nachfolgend
EC). während ein Impfstoff aus Keimen besteht, die mit Formaldehyd inaktiviert Wurden,
handelt es sich bei den anderen um Extratimpfstoffe.
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Impfungen gegen E-Ruhr-Erkrankungen Werden bekannterweise ebenfalls
mit einem Totimpfstoff durchgeführt.
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Sonst arbeitet man bereits vorwiegend mit Extraktimpfstoffen oder
Lebendimpfstoffen, nämlich mit streptomycinabhängigen Stammen, mit kybridstämmen
und mit spontan avirulenten Shigellen.
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Impfungen beim Menschen gegen Salmonellosen Werden bisher nur mit
Totimpfstoffen durchgeführt. Versuche mit Lebendimpfstoffen beschränken sich auf
Tiere. Bei den lebendimpfstoffen handelt es sich um streptomycinabhängige Salmonellen
oder um spontan avirulente Formen.
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bisher bekannte Oralimpfstoffe gegen Enterobacteriaceae bestehen vorwiegend
aus abgetöteten Keimen oder Bakterienextrakten. Nachteiligerweise führt hierbei
eine Abtötung und Extraktion der Keime zu Verschiebungen im Antigenmosaik. Bei Enterobacteriaceae-Erkrankungen
ist darüber hinaus Jedoch bisher das auslösende pathogenetische Prinzip unbekannt.
Daher ist bei einer Impfstoff-Herstellung
vonWichtigkeit, daß Impfstämme
mit unverändertem Antigenmosaik verwendet werden.
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Impfstoffe aus lebenden straptomycinabhängigen Bakterien war den erprobt.
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Es ist bekannt, daß ein Totimpfstoff einem tebendimpfstoff unterlegen
ist. In Tierversuchen konnte dafür der Be'is zu wiederholten Malen erbracht werden.
Besonders ist auf die Tatsache hinzuweisen, daß bei Mäusen eine Ansiedlung des homologen
Impfstammes im Darm nur dann zu unterbinden war, Wenn eine Immunisierung mit lebenden
Keimen vorausging. Nur durch Iiebendimpf stoffe ist eine echte zelluläre Immunität
zu erzielen.
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Zweck der Erfindung ist es, einen virulenzabgeschwächten oralen Lebendimpfstoff
mit begrenzter Vermehrungsfähigkeit herzustellen, der durch aktive künstliche Immunisierung
eine deutliche Morbiditäts- und Mortalitätssenkung an durchfallerkrankungen auslöst
und der durch Unterbrechung von Infektketten auch prophylaktische Wirkung besitzt.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch Züchtung antibiotikaabhängiger
mutanten der Enterobacteriaceae und Auswahl geeigneter Mutanten einen lebenden,
virulenzabgeschwächten, begrenzt vermehrungsfähigen Oralimpfstoff herzustellen,
der eine Fombination von nicht pathogener, aber guter immunogener Wirkung und Stabilität
besitzt. Der Impfstoff muß qualitativ und quantitativ gut reproduzierbar sein.
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Gemäß der Erfindung Wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß man Enterobacteriaceae
auf Nährboden mit hohen Streptomycinkonzentrationen aufspatelt, wobei die nach der
Bebrütung als streptomycinresistent erkannten Kolonien parallel auf nährböden ohne
und mit Streptomycin ausgestrichen werden und die dabei gefundenen streptomycinabhängigen
Stämme anschließend auf ihre Eignung als Impfstämme durch Bestimmung ihrer Reversionsrate,
durch Wachstumskurven der Revertanten, durch Nachweis einer antiinfektiösen Immunität
und durch Bestimmung der LD50 nach REED und NÜNCH geprüft werden. Zur Unterscheidung
von Revertanten und Wildstämmen können den als Impfstämmen ermittelten Bakterien
Auxotrophiemarker eingekreuzt werden.
Der nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren hergestellte Bebendimpfstoff hat folgende Vorteile gegenüber einem abgetöteten:
Durch Erzielung echter zellulärer Itrnnunität wird eine Ausbreitung der Infektion
über die Darmwand hinaus verhindert Es wird eine antiinfektiöse Immunität erreicht.
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Durch die Ansiedlungshemmung der Infektion im Darm ist infolge Unterbrechung
von Infektketten nach aktiver künstlicher Immunisierung eine echte Prophylaxe zu
erwarten.
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Unter streptomycinabhängigen (nachfolgend Sm-d) Stämmen mit begrenzter
Vermehrungsfähigkeit sind virulenzabgeschwächte Imp£-stämme mit guter immunogener
Wirkung zu finden.
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Eine Sm-d Vaooine zeigt bei 30 Erwachsenen in einer Dosierung von
täglich 1012 Keimen über einen Zeitraum von 10 Tagen gute Verträglichkeit.
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An 20 Säuglinge wurden täglich 1011 Sm-d Enteritiscoli-Keime für 10
Tage reaktionsios und ohne Nebenwirkungen verfüttert.
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Durch nachstehendes Beispiel wird die Erfindung näher erläutert, wobei
nur Verfahrensstufen beschrieben werden, die zur Herstellung eines schließlich zur
Impfstoffproduktion auszuwährenden Stammes führen. Es müssen stets eine große Anzahl
anderer, nach diesem oder ähnlichen Verfahren hergestellte Formen geprüft werden,
die unter Umständen für Impfzweoke ungeeignet sind.
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Mit Hilfe des Phagozytosetestes werden von streptomycinsensiblen Ausgangsstämmen
(Wildstämmen), deren Idendität zuvor durch Bestimmung der 0-, H- und K-Antigene
mit der Widaltechnik nachgewiesen wurde, solche ausgesucht, die für eine Impfstammisolierung
geeignet scheinen.
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Der Phagozytosetest wird an peripheren Leukozyten, peripheren Monozyten
sowie an Peritonealmakrophagen von Meerschweinchen in Gegenwart und Abwesenheit
von sogenannten Normal seren derwenigen Spezies, in diesem Palle des Menschen, durchgeführt,
an welcher später die Impfung vorgenommen werden soll.
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Innerhalb eines hinsichtlich Keimmenge, Zellzahl und Versuchsbedingungen
genau abgestimmten Systems darf die Normalphagozytose bestimmte prozentuale Mittelwerte
nicht überschreiten.
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Zur Isolierung von Sm-d Enterobacteriaceae-Stämmen merden 2 x 109
Keime/0, 1 ml physiologische NaCl-Lösung auf Agarplatten mit 400 /ml Streptomycin
gespatelt, 48h bei 370 C bebrütet. Alle gewachsenen streptomycinresistenten kolonien
müssen anschließend parallel auf Stretomycin-Agarplatten (400 # /ml) und auf Agarplatten
ohne Streptomycin (nachfolgend Sm) isoliert Werden, um Sm-d Kolonien zu erkennen,
die nicht -mehr ohne Sm wachsen können.
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Die Mutation zur Streptomycin-Abhängigkeit ist stammabhängig.
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Prüfung auf Sm-Unabhängigkeit muß erfolgen, da nur solche Sm-d Stämme
als eventuelle Impfkeime verwendet werden, deren Reversion zur Sm-Unabhängigkeit
nicht größer ist als 20 Sm-unabhängige (Revertanten, Minusmutanten) Kolonien auf
108 Sm-d.
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Die Orüfung wird wie folgt vorgenommen: man stellt den fraglichen
Impftstamm auf eine Keimzahl von 109/ml physiologischerNaCl-Lösung ein und spatelt
davon Je 0,1 ml auf drei Agarplatten. iTach 48h Bebrütung bei 370 C und Weiteren
72h bei Zimmertemperatur dürfen im Durchscnitt nicht mehr als 20 Sm-unabhängige
Kolonien des entsprechenden Serotypes/Platte wachsen.
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Sm-d Stämme, die in ihrer Reversionsrate den angegebenen richtlinien
entsprechen, werden leiter auf die Minusmutantennatur ihrer Revertanten untersucht.
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Dazu sind zehn Revertanten gegen den entsprechenden Wildstamm zu testen:
Anzucht der Stämme bei 370 C, danaoh Suspension mit der Öse in physiologischer NaCl-Lösung.
Einmal Waschen durch Zentrifugation 3000 U/min ca. 15 Minuten. Die Wieder in NaCl-TJösung
aufgenommenen Keime werden auf 2 x 108/ml eingestellt. Von dieser Suspension gibt
man 1 ml in geeiohte Reagenzgläser zu 9 ml Rleischbouillon (dreifacher Ansatz).
Unter Schütteln wird die beimpfte Bouillon im Wasserbad bei 37° C bebrütet und stündlich
über einen Zeitraum von fünf Stunden'die Trübung gemessen. Das Messen erfolgt am
Spekol bei einer Wellenlänge von 650 nm unter Verwendung des Meßansatzes ER 1.
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wachstumaskurven der Revertanten müssen in der dritten Stunde gt;
10 % unter der des Wildstammes liegen.
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das Würde auf die Impfstoffpraxis übertragen bedeutend Revertanten,
die durch Nutation aus Sm-d Keimen entstehen, werden auf Grund ihres langsamen Wachstums
von der normalen Darmflora überwuchert. Bei vielen quantitativan Stuhluntersuchungen
von Persomen, die oral Sn-d Vaccine eingenommon hatten, waren nie Revertanten zu
isolieren.
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rei Sm-d Stämmen mit geringer Reversion zu Sm-unabhängigen und langsam
wachsenden Tinusmutanten empfiehlt es sich außerdem erfindungsgemäß einen Auxotrophiemarker
einzukreuzen, um jdeerzeit den Wildstamm von dem Minusmutanten unterscheiden zu
können.
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Die Einführung eines Auxotrophiemarkers in Sm-d Bnterobacteriadese
erfolgt 1. durch N-Hethyl-H'-Nitro-N-Nitrosoguanidin (MHG), indem je eine Öse des
betreffenden, etwa 24h alten Stammes in 10 ml Fleischbouillon mit 200# /ml Sm geimpft
wird. Die Bebrütung erfolgt über Nacht als Schüttelkultur bei 37° C.
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Am nächsten Morgen Werden je 5 ml dieser Übernachtkultur zentrifugiert
und einmal in NaCl gewaschen.
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Das Sediment wird in 5 ml einer 100 # /ml enthaltenden frischen,
wäßrigen MNG-Lösung aufgenommen und 90 Minuten bei 37° C im Wasserbad inkubiert.
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Anschließend wird das lEIG abzentrifugiert. Das Sediment nimmt man
in 5 ml Pleischbouillon auf 0 1 ml davon kommt in 19 ml frische, angewärmte (370
C) Pleischbouillon und wird 4 Stunden bei 370 a geschüttelt. Dann wird zentrifugiert
und einmal in NaCl gewaschen. Das Sediment wird in 5 ml M 9 ohne Stickstoff aufgelöst
in einer Endkonzentration von 5 x 106 Keimen/ml und 5 Stunden bei 37° C geschüttelt.
Anschließend gibt man 200 IE Penicillin pro ml und 1 % NH, Cl zu und läßt als Übernachtkultur
stehen, Am nächsten Morgen zentrifugieren und zweimal in NaCl waschen, anschließend
spateln von 0,1 ml der Keimsuspension mit dem Ziel, zwischen 50 und 100 Kolonien/Platte
zu erhalten. Nach 18- bis 24-stündiger Bebrütung bei 37° a parallel auf M 9- und
Vollmedium stempeln. Nachw Weiteren 18 bis 24 Stunden bei 370C Vergleich der zueinander
gehörenden Platten. Kolonien, die auf
Vollmedien wachsen, Werden
in 0,5 ml NaCl suspendiert. Diese Suspensionen werden auf Vollmdien und Minimalmedium
ausgestrichen und über Nacht bei 37° C inkubiert. nach der Prüfung der Platten am
nächsten Tag Werden diejenigen Suspensionen aussortiert, die auf beiden Platten
Wachsen. Die-Suspensionen' der tatsächlichen Mutanten werden nun auf Vollmediurn
und einer Serie von Minimalmediumplatten mit den verschiedensten t7uchsfaktoren,
z.B0 Aminosauren, Vitaminen, Purinen und Pyrimidinen, ausgestrichen und 48h bei
37° a bebrütet. Durch Vergleich der verschiedenen Platten Werden dann die spezifischen
ITährstoffanforderungen von jeder Mutante bestimmt.
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2. durch UV-Bestrahlung, indem je eine Öse des betreffenden, etwa
24 Stunden alten Stammes in 10 ml Pleischbouillon + 200 #/ml Sm zu impfen ist. Die
Bebrütung erfolgt über Nacht als schüttelkultur bei 370 G. Am nächsten Morgen Werden
5 ml dieser übernachtkultur in 15 ml Fleischbouillon erneut 3h geschüttelt, anschließend
20 Minuten bei 4000 U/min zentrifugiert. Das Sediment Wird in der gleichen Menge
NaCl auf gelöst.
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Danaoh wird die UV-Bestrahung von einer Intensität, die eine 0,05
ziege Überlebensrate garantiert, vorgenommen. Diese Arbeiten Während der Bestrahlung
und bis zu 5 Stunden danach sind nur im Dunkeln mittels einer Photolampe mit Rotfilter
möglich.
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0,5 ml der bestrahlten Suspension Werden in 5 ml Fleischbouillon
und 200 #/ml Sm aufgenommen, 18 bis 24 Stunden bei 370 C stehengelassen, dann zentrifugiert
und zweimal gewaschen. Das Sediment wird in N-freies Minimalmedium mit einer Endkonzentration
der Keime von 5 x 106/ml überführt und 5 Stunden geschüttelt. Die weitere Behandlung
erfolgt Wie vorher beschrieben.
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Die Bestimmung der Tauglichkeit einer Sm-d, auxotrophen Mutante für
Impfzwecke, die durch vorbeschriebene zWei Methoden ermittelt wurde, erfolgt 1.
durch Bestimmung der Reveræionsratent Reversion zur Sm-Unabhängigkeit. Hierbei ist
Bedingung, daß nicht mehr als 20 Revertanten auf 1 x 108 Keine entfallen.
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Reversionen zur Prototrophie. TIierbei ist Bedingung, daß nicht mehr
als 50 Revertanten auf 1 x 108 Keime entfallen.
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Die Keimsuspension wird dabei in einer Konzentration von 1 x 108,
1 x 107 und 1 x 106 in je zwei Verdünnungsreihen auf Minimalmedium aufgespatelt
und 48 Stunden bei 370 C bebrütet. Dabei dürfen dann auf den Platten, die mit 1
x 13 Keimen bespatelt wurden, nicht mehr als 50 Kolonien Wachsen.
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2. durch Bestimmung der Wuchsstoffabhängigkeit: Dazu Wird eine Minimalmediumplatte
zur Kontrolle der Stabilität mitgeführt, die den entsprechenden YJuchsstoff enthält.
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Auch sie Wird mit 1 x 108 Keimen bespatelt und muß nach 48h einen
Bakterienrasen aufweisen.
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Sm-d enterobacteriaceae-Stämme, die genetisch als Impfstämme geeignet
erscheinen, müssen im Ansiedlungshemmtest an der darmsterilen Maus ihre immunogenen
Fähigkeiten unter Beweis stellen.
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Mäuse erhalten 10 Tage lang täglich 1011Sm-d Keime per os. 10 Tage
nach der letzten Antigengabe Werden die Mäuse in Einzelkäfige gesetzt und am 3.
und 2. Tag vor der Infektion täglich mit 50 mg Streptomycin sondiert. Anschließend
erfolgt die Infektion der durch Streptomycin darmsteril gewordenen Mäuse mit 10
bis (Streptomycin-resistenten) Keimen des gleichen Serotyps, der zur Immunisierung
verwendet wird. Der Stuhl wird in den folgenden Tagen bakteriologisch untersucht.
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T,'t einem geeigneten 103Sm- immunisierte Itläuse scheiden den Sm-r
Impfstamm nach 10 Tagen L 20 % us, Zur Abrundung des Bildes kann im aktiven infektionsstamm
und im Bakterizidietest eine zusätzliche Überprüfung des Mäuseschutzversuoh erfolgen.
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Zur Bestimmung der Verträglichkeit des lmpf stammes wird die N>50
des Wildstammes und des Sm-d Impfstammes an 20 g schweren Albinomäusen nach REED
und MÜNCH durch intraperitoneale Injektion bec stimmt. Die Infektionsdosis wird
in logarithmisch abgestuften Verdünnungen (bei EC als 33 %ige Dotteremulsion) injiziert.
LD50-Werte des Impfstammes verstehen sich in Abhängigkeit vom wildstamm.
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Sie sind höher als beim Wildstamm, sollen nicht unter 108 und mindestens
eine logarithmische Stufe über dem Wildstamm liegen.