FR2464300A1 - Preparation de souches salmonella abortus ovis et compositions de vaccins les contenant - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE LA PREPARATION DE NOUVEAUX AGENTS IMMUNOGENES ET DES COMPOSITIONS DE VACCINS POUR LUTTER CONTRE LA SALMONELLOSE CAUSEE PAR LES SALMONELLA ABORTUS OVIS. LA PREPARATION EST CELLE DE SOUCHES MUTANTES DE SALMONELLA ABORTUS OVIS ET COMPREND: A.L'ENSEMENCEMENT ET LA CULTURE DE BACTERIES D'UNE SOUCHE SAUVAGE VIRULENTE, SUR UN MILIEU CONTENANT UN ANTIBIOTIQUE PERMETTANT LE DEVELOPPEMENT DE MUTANTS "RESISTANTS"; B.LA CULTURE PAR REPLIQUE DES BACTERIES RESISTANTES SUR UN MILIEU EXEMPT D'ANTIBIOTIQUE POUR DETERMINER CELLES QUI SONT "DEPENDANTES"; C.EVENTUELLEMENT L'ENSEMENCEMENT ET LA CULTURE DE BACTERIES DEPENDANTES PROVENANT DE B. SUR UN MILIEU EXEMPT D'ANTIBIOTIQUE JUSQU'A APPARITION DE COLONIES REVERSES. LES AGENTS IMMUNOGENES OBTENUS SONT UTILES POUR LA PREPARATION DE VACCINS.

Description

L'invention concerne la préparation de nouveaux agents

immunogènes et des compositions de vaccins pour lutter con-

tre la salmonellose causée par les Salmonella abortus ovis.

L'infection à Salmonella abortus ovis atteint les pe-

tits ruminants et notamment les ovins. Cette infection sévit à l'état endémique dans les grandes régions d'élevage du mouton en France, et dans la plupart des pays producteurs de

moutons, o elle cause des pertes significatives.

La lutte préventive contre cette maladie repose essen-

tiellement sur l'utilisation de vaccins constitués de Salmo-

nella abortus ovis tuées. L'innocuité de ce genre de vaccins est totale mais leur efficacité n'est pas certaine et, en général, est au moins considérée comme insuffisante pour

répondre aux exigences de la pratique.

Les recherches qui ont abouti à l'invention avaient

pour but de fournir un agent immunogène non virulent, capa-

ble d'engendrer chez les animaux auxquels il est administré

une réponse immunitaire suffisante pour les protéger effica-

cement contre les infections à Salmonella abortus ovis. -

Un autre but de ces recherches était d'obtenir un agent présentant les propriétés qui viennent d'être indiquées et

qui, en outre, soit stable génétiquement et puisse être pré-

paré en quantité suffisante, c'est-à-dire avec un rendement

et dans des conditions compatibles-avec une exploitation dé-

passant le cadre expérimental du laboratoire.

Ces recherches ont montré que ces résultats pouvaient

être atteints grâce aux agents immunogènes selon l'inven-

tion. Ces agents immunogènes sont constitués par des Salmo-

nella abortus ovis vivantes, non virulentes, obtenues à par-

tir de souches virulentes "sauvages" par sélection de mu-

tants en fonction de leurs aptitudes à la croissance sur des milieux contenant un antibiotique, ou de souches dérivées de ces premiers mutants par une deuxième sélection toujours en fonction des critères de croissance sur un milieu exempt,

cette fois, d'antibiotique.

9464t0i La sélection de souches de micro-organismes en fonction

de critères de croissance sur des milieux contenant un anti-

biotique, et notamment la streptomycine, est une opération

qui a été utilisée pour diverses espèces dans le but, notam-

ment, de faire apparaître des souches présentant une viru- lence atténuée. Les résultats obtenus selon cette technique sont très variables et totalement imprévisibles, aussi bien

en ce qui concerne l'atténuation elle-même que pour la modi-

fication d'autres caractères. Ce mode de préparation de sou-

ches modifiées n'est donc pas d'application générale lorsque l'on souhaite obtenir des souches vaccinantes. Seuls des

essais prolongés des souches modifiées obtenues peuvent per-

mettre de déterminer leurs caractéristiques, et notamment leur innocuité et leur efficacité à protéger les animaux

traités contre les infections causées par les souches "sau-

vages" naturelles.

De même, la stabilité génétique ou encore les caracté-

ristiques de croissance sont totalement imprévisibles. Elles ne peuvent être connues que par l'expérimentation. De façon générale, il est connu de la littérature antérieure que les mutations sélectionnées suivant ces caractéristiques de croissance en milieu à forte concentration en antibiotique

s'accompagnent d'une modification de la vitesse de dévelop-

pement des souches mutantes par rapport à celles des souches d'origine dont elles sont issues. Les souches mutantes ont, dans l'ensemble, une croissance beaucoup plus lente. Cette

constatation, faite pour la première mutation, vaut égale-

ment pour les mutations suivantes réalisées à partir de la souche de première mutation. Ces constatations antérieures

n'incitent évidemment pas à rechercher la mutation des sou-

ches et plus encore les mutations multiples lorsque l'on souhaite obtenir des cultures abondantes, a priori seules

capables d'une exploitation satisfaisante.

Les souches mutantes selon l'invention sont en premier lieu les souches non virulentes sélectionnées, à partir de souches virulentes naturelles, pour leur capacité de croître sur un milieu à teneur élevée en streptomycine, et, de plus, qui ne peuvent se développer de façon satisfaisante qu'en présence de streptomycine. Pour cette raison, ces souches 3. sont dites dépendantes de la streptomycine ou encore "streptodépendantes" (D). En second lieu, les souches selon l'invention sont également les mutants sélectionnés à partir

des souches "strepto-dépendantes" et qui présentent la par-

ticularité de pouvoir se développer en l'absence de strepto-

mycine. Ces souches sont dites reverses (Rv).

Les souches naturelles utilisées pour préparer les sou-

ches mutantes selon l'invention doivent être virulentes; On

connait en effet des souches naturellement non virulentes.

Des essais ont même été réalisés pour tester la capacité

immunogène de ces souches. Dans tous les essais de ces sou-

ches naturelles non virulentes, il a été constaté que la protection conférée contre l'infection est nulle ou très nettement insuffisante, et aucun vaccin n'a pu être préparé

à partir de telles souches.

Les souches virulentes utilisées selon l'invention pour

préparer les mutants sont des souches "sauvages", c'est-à-

dire des souches provenant de prélèvements effectués sur des

animaux atteints par l'infection dans des conditions natu-

relles. Les souches sauvages virulentes sont en principe

utilisables pour la préparation des mutants selon l'inven-

tion; néanmoins, ces souches ne sont pas toutes équivalen-

tes et peuvent se différencier par des caractères secondai-

res importants pour l'usage qu'on se propose d'en faire.

Ainsi, toutes les souches sauvages ne présentent pas le même

degré de virulence ni les mêmes aptitudes à se développer.

Diverses souches sauvages ont été essayées parmi les-

quelles la souche dite "115/5"1, déposée le 28 août 1979 à la Collection Nationale des Cultures de Micro-organismes et répertoriée sous le n0 I 096, présente à la fois une virulence marquée et une croissance rapide en colonies bien homogènes. Pour cette raison, cette souche sauvage se

prête avantageusement à l'utilisation selon l'invention.

Mais d'autres souches sauvages, ou des souches répondant aux mêmes critères de virulence et de croissance, peuvent être utilisées.

Les souches mutantes préparées selon l'invention doi-

vent être non virulentes, c'est-à-dire que, globalement, elles ne doivent pas développer chez l'hôte auquel elles t 464300 sont administrées des phénomènes pathologiques analogues à

ceux de l'infection qu'elles sont censées prévenir.

La notion de non-virulence doit être précisée. Elle est

liée, au moins en partie, aux caractéristiques du développe-

ment du micro-organisme chez l'hôte. Par ailleurs, l'effica- cité de la protection conférée est fonction de la réaction immunitaire elle-même liée à l'importance du développement et au maintien des micro-organismes vaccinants chez l'hôte traité. Autrement dit, il existe une certaine corrélation

entre l'efficacité de la protection obtenue et un développe-

ment des bactéries vaccinantes, et une virulence résiduelle

est nécessaire pour assurer ultérieurement une bonne protec-

tion.

-La différence entre les phénomènes liés à la vaccina-

tion et ceux qui correspondent à l'infection tient au fait que le développement des bactéries vaccinantes reste d'ampleur limitée, tant par leur nombre que par celui des organes atteints. Ceci se traduit aussi, pour l'animal

traité, par l'absence de-manifestations pathologiques carac-

téristiques de l'infection. Tout au plus, l'animal vacciné peut présenter un certain nombre de réactions passagères

sans commune mesure avec l'infection proprement dite.

Pour les raisons qui viennent d'être précisées, il apparait bien que la non-virulence ne peut être évaluée que par les essais in vivo soit directement sur les animaux de

l'espèce qui doit finalement être traitée, dans le cas pré-

sent les moutons, soit sur des animaux d'essais de labora-

toires (souris, cobayes), une fois que les protocoles et corrélations entre les résultats, dans les deux cas, ont été établis. Ceci fait l'objet-d'exemples détaillés dans la

suite de la description.

Les souches mutantes selon l'invention, bien entendu,

doivent aussiprésenter un caractère immunogène qui se tra-

duise par une protection significative des animaux traités vis-à-vis de l'infection à Salmonella abortus ovis. Les souches mutantes appropriées selon l'invention sont telles

que leur administration à l'animal s'accompagne d'un déve-

loppement limité, décelable par des examens bactériologiques d'organes et en particulier de la rate, ou encore par 5.

l'apparition d'anticorps spécifiques en quantité très supé-

rieure à celle que l'on constate chez les animaux non trai-

tés. Dans tous les cas, le caractère immunogène doit être

précisé par des essais in vivo de protection contre l'infec-

tion proprement dite, soit sur les moutons, soit à défaut sur les animaux de laboratoires lorsque, comme précédemment pour la non-virulence, une corrélation certaine a pu être

mise en évidence.

Quelle que soit la souche utilisée, il va de soi que ces caractères de virulence, et surtout d'immunogénicité, sont liés aux doses utilisées. Selon l'invention, on utilise donc les agents immunogènes aux doses capables de conférer aux animaux traités une protection significative contre

l'infection qui se propage dans les conditions naturelles.

Le choix de l'antibiotique pour sélectionner les mu-

tants selon l'invention est guidé par des raisons d'ordre pratique. La streptomycine et, de façon plus générale, les

agents antibiotiques du type aminoglycoside (gentamycine, kanamy-

cine...) sont connus pour conduire rapidement au développement de souches résistantes parmi les micro-organismes qu'ils sont supposés combattre, ce qui d'ailleurs constitue un grave inconvénient

pour leur utilisation en thérapeutique. D'autres antibioti-

ques conduisent à des phénomènes analogues, notamment les sulfonamides, les tétracyclines, la; pénicilline, etc.

On sait que la résistance à l'antibiotique peut résul-

ter de différents mécanismes de modification. En particu-

lier, la modification génétique peut affecter un chromosome de la bactérie; elle peut aussi se situer sur un segment d'ADN extrachromosomique (sur un plasmide par exemple). La modification chromosomique est un événement rare mais qui,

une fois réalisée, assure la stabilité des propriétés acqui-

ses. La modification d'un plasmide, au contraire, apparaît

plus fréquemment mais est un phénomène réversible. Le carac-

tère acquis dans ce dernier cas ne présente pas la stabilité

nécessaire selon l'invention. Il est absolument indispensa-

ble que les souches mutantes ne puissent retourner à une

forme virulente.

Il est possible d'orienter la modification de la souche vers l'un ou l'autre de ces deux types. On sait en effet que, pour des concentrations élevées en streptomycine dans le milieu sur lequel s'effectue la sélection (concentrations

auxquelles cet antibiotique est bactéricide et non pas seu-

lement bactériostatique), seuls les mutants chromosomiques peuvent se développer. On choisit donc, pour préparer les souches mutantes selon l'invention, des milieux présentant une concentration élevée en streptomycine. Avantageusement, cette concentration est de l'ordre de 500 pg/ml, mais peut

-être bien supérieure, allant jusqu'à 2000 pg/ml et davanta-

ge. Cette concentration ne doit pas être inférieure à celle pour laquelle les modifications des souches sélectionnées ne seraient pas de nature chromosomique. Avantageusement, le milieu utilisé pour cette sélection ne contiendra pas moins

de 50 pg/ml.

Il est possible de vérifier que les souches obtenues présentent bien une modification chromosomique et non une transformation de type plasmidique. Ainsi, lorsque l'on met

en présence les souches d'origine et les souches résistan-

tes à la streptomycine, si les secondes proviennent d'une

mutation chromosomique, il n'y a pas de phénomène de trans-

fert du caractère résistant des secondes aux premières,

selon le mécanisme bien connu de la conjugaison. Au contrai-

re, si les modifications sont portées par l'ADN extrachromo-

somique, c'est-à-dire celui des plasmides ou des épisomes,

la fréquence de transfert est élevée. Les conditions opéra-

toires indiquées précédemment pour l'obtention des souches

mutantes sont choisies de façon telle que les souches obte-

nues ne se prêtent pas au transfert de cette caractéristique

acquise de résistance à la streptomycine.

Ce que nous venons d'indiquer pour la mutation aboutis-

sant au caractère strepto-résistant s'applique aussi aux mu-

tations suivantes conduisant respectivement aux souches dé-

pendantes et reverses.

La mutation des souches et leur sélection peuvent être réalisées par étapes successives sur des milieux à teneur croissante en streptomycine, mais il est possible d'opérer directement sur un milieu présentant la concentration la plus élevée choisie. Cette dernière façon de procéder est évidemment plus pratique. Elle n'est réalisable que par le 7- fait que les souches mutantes selon l'invention ont d'emblée

une vitesse de croissance suffisante sur ce milieu.

En dehors de l'antibiotique, les milieux sur lesquels

sont effectuées les cultures sélectives n'ont pas de carac-

tère particulier. On utilise donc un milieu connu pour per-

mettre un bon développement des cultures pour l'espèce con-

sidérée. Avantageusement, on peut utiliser un milieu gélosé

tel que la gélose trypticase-soja. On peut également utili-

ser des milieux sélectifs pour l'espèce Salmonella comme

la gélose Salmonella ShiQella. Néanmoins, ces milieux sélec-

tifs ne présentent d'avantage que pour prévenir les contami-

nations accidentelles et sont plus utiles, par exemple, pour

la conservation des souches ou la préparation des compo-

sitions destinées aux essais de vaccination.

Les autres conditions de culture sont également celles

qui permettent une bonne croissance.

La sélection, l'isolement et la culture des souches mu-

tantes sont effectués suivant des techniques usuelles. Ces techniques tiennent compte en particulier de la fréquence d'apparition des mutations et de la plus ou moins grande

capacité des souches en question de se développer.

Le principe des opérations conduisant aux différentes

souches mutantes est le suivant.

La souche sauvage est ensemencée sur le milieu renfer-

mant l'antibiotique aux concentrations indiquées ci-dessus.

Sur ce milieu, après incubation, apparaissent les colonies correspondant aux souches résistantes à la streptomycine (S.R.). La culture par réplique des colonies résistantes sur milieu dépourvu de streptomycine permet de déterminer, parmi ces colonies résistantes, celles qui sont dépendantes (D)

par comparaison de la culture répliquée à celle sur le mi-

lieu contenant la streptomycine.

Les souches dépendantes, une fois identifiées, sont

isolées et cultivées suivant des méthodes usuelles.

A partir des souches dépendantes, on opère de façon ana-

logue pour sélectionner les souches dites reverses. On procè-

de donc à l'ensemencement du milieu exempt de streptomycine

au moyen des souches dépendantes. Les colonies qui se déve-

loppent dans ces conditions sont des mutants des souches dépendantes (et non les souches initiales sauvages). Une très forte proportion des souches reverses obtenues par cette deuxième sélection ne se développe pas sur le milieu

contenant la streptomycine.

Les souches reverses obtenues sont également isolées et conservées. Les souches de mutants obtenues selon l'invention et à

1'intérieur du même groupe, dépendantes ou reverses, -ne pré-

sentent pas des caractères uniformes en dehors de celui qui permet de les sélectionner. On a ainsi indiqué que, parmi les souches reverses, certaines pouvaient se développer sur des milieux contenant de la streptomycine ou sur des milieux

n'en contenant pas.

_ Une autre particularité apparaît sur certaines colonies-

dépendantes. Ordinairement, les cultures des Salmonella, qu'elles soient sauvages, dépendantes ou reverses, sont constituées de cellules bien individualisées et qui peuvent

être isolées les unes des autres. Il peut apparaître néan-

moins dans certains cas des souches dépendantes dans les-

quelles la multiplication des bactéries se fait sans que les cellules se séparent systématiquement. La culture observée au microscope est alors formée de grappes ou chaînettes de

bactéries liées les unes aux autres.

L'apparition de ces souches de bactéries incomplètement

individualisées est désavantageuse. En effet,, pour l'utili-

sation comme souche vaccinale, il est préférable d'utiliser des souches bien homogènes et à des doses déterminées. La présence de ces chaînettes s'oppose à la réalisation de ces

deux conditions.

Contrairement à ce que l'on aurait pu s'attendre à constater, les souches reverses obtenues selon l'invention, résultant de deux mutations successives, ont un taux de croissance comparable (sinon meilleur) à celui des souches dépendantes qui, elles, n'ont subi qu'une seule mutation; Du

point de vue de la culture de ces souches, on peut donc con-

- sidérer qu'il n'y'a pas d'avantages particuliers à utiliser

une catégorie plutôt que l'autre en dehors de ce que la cul-

ture des souches dépendantes nécessite l'emploi de la strep-

tomycine.

è464300

A titre indicatif, sur leur milieu de culture respec-

tif, on peut comparer le taux de croissance d'une souche sauvage et des souches mutantes qui en sont issues par le temps nécessaire, après ensemencement, pour la formation de colonies d'un millimètre de diamètre. On a pu constater ain- si, pour la souche sauvage 15/5 qui se développe rapidement,

un temps avoisinant 24 heures. Les souches dépendantes obte-

nues à partir de la souche 15/5, pour atteindre le même dé-

veloppement, devaient être cultivées pendant environ 72 heu-

res, et les souches reverses pendant environ 48 heures.

Si les souches reverses ou dépendantes peuvent être obtenues dans des conditions de rendement et de facilité analogues, le choix d'un type donné est fonctiond'autres particularités. Ainsi, les souches dépendantes cultivées sur un milieu à forte teneur en antibiotique renferment, au sein

des bactéries, une certaine quantité de ce même antibioti-

que. La préparation de vaccins polyvalents, c'est-à-dire de vaccins contenant plusieurs agents immunogènes, peut par

suite être contrariée. La présence de la streptomycine véhi-

culée par les Salmonella dépendantes s'oppose, en effet, à

la combinaison avec d'autres micro-organismes vivants sensi-

bles à cet antibiotique. Avec les souches reverses, cet incon-

vénient éventuel est évidemment évité.

Les raisons qui guident le choix entre souches dépen-

dantes et reverses sont principalement liées à l'efficacité et à l'innocuité. Sur ce point, comme les exemples donnés ci-après le montrent, il n'apparaît pas de différence très

marquée entre ces deux catégories. Globalement, les diffé-

rences constatées sur l'ensemble des souches d'une catégorie par rapport à l'ensemble des souches de l'autre catégorie

sont moins importantes que celles qui peuvent apparaître en-

tre deux souches d'une même catégorie. Si l'on compare les "meilleures" souches de chaque catégorie, il semble que les souches reverses soient plus immunogènes mais aussi plus virulentes, ce qui, comme nous l'avons dit, est généralement lié. Au plan théorique, cet avantage en faveur de certaines souches reverses peut s'expliquer peut-être par la nature même de ces souches. Les souches dépendantes administrées à l'hôte se trouvent dans un milieu qui n'est pas favorable à

leur développement faute d'antibiotique. Les micro-organis-

mes continuent de croître en raison de la présence de strep-

tomycine contenue à l'intérieur même des cellules adminis-

trées, mais, l'antibiotique s'épuisant, la croissance des bactéries dépendantes est nécessairement limitée. Il n'y a rien de semblable pour ce qui concerne les souches reverses qui peuvent donc mieux se propager et, par suite, provoquer une meilleure réponse immunitaire. Les résultats des essais

semblent confirmer cette hypothèse.

- Un autre avantage en faveur de certaines souches reverses tient à la possibilité de les distinguer des autres souches de Salmonella par un simple test d'identification traditionnel. Ce test dit de Voges-Proskauer est utilisé

dans les batteries de test d'identification des entérobacté-

ries. Ce test, pour les souches de Salmonella naturelles,

est négatif. Contrairement à ce caractère général, une majo-

rité des souches reverses essayées se sont révélées positi-

ves. Ceci, de façon accessoire, permet de distinguer les

souches reverses des souches naturelles dont elles provien-

nent, la principale distinction demeurant les vitesses de

croissance très différentes.

Le test de Voges-Proskauer n'est pas applicable aux

souches dépendantes. Ce test, sensible à l'acidité, est po-

sitif pour toutes ces souches en raison de la présence de la streptomycine. De tout ce qui précède, il résulte que, une fois les souches dépendantes ou reverses préparées comme cela a été indiqué, il est nécessaire de soumettre ces souches à un protocole d'essais pour s'assurer de leur efficacité et de leur innocuité. Ce protocole selon l'invention comprend

l'administration à des souris d'une dose d'essai de la sou-

che étudiée. Cette dose d'essai est choisie par rapport à

la dose de souche sauvage virulente létale pour les souris.

La souche étudiée, à la dose considérée, ne doit pas pro-

voquer la mort des animaux, mais, par contre, doit se déve-

lopper de façon limitée, ce qui se caractérise notamment par

la présence des bactéries de cette souche dans certains or-

ganes des animaux d'essais. La souche-étudiée administrée à des animaux d'essais doit, en outre, améliorer la résistance

* des animaux vis-à-vis d'une infection provoquée par l'inocu-

lation directe des bactéries sauvages.

Les résultats des essais effectués sur les souris sont en outre avantageusement confirmés par des essais sur les moutons. Sur ces animaux, différentes mesures de l'activité

immunogénique peuvent être suivies: des mesures sérologi-

ques pour détecter la présence d'anticorps spécifiques (me-

sures qui ont l'avantage de ne pas nécessiter l'abattage des

animaux d'essais), mesures bactériologiques pour la détec-

tion des bactéries vaccinantes dans différents tissus

(rate, ganglions, nodules...).

En suivant ce protocole d'essais, on peut apprécier,

parmi les souches mutantes préparées selon l'invention, cel-

les qui sont les plus aptes à protéger les animaux vaccinés

contre l'infection causée par les Salmonella abortus ovis.

Compte tenu des différents facteurs envisagés ci-dessus, une souche selon l'invention particulièrement avantageuse est celle qui est désignée dans les exemples sous le nom de Rv6, souche déposée le 28 août 1979 à la Collection Nationale des

Cultures de Micro-organismes et répertoriée sous le n0 I - 097.

A partir des souches mutantes dépendantes ou reverses, on prépare les compositions immunogènes selon l'invention pour

le traitement préventif de l'infection à S.abortus ovis.

Les compositions vaccinantes peuvent bien entendu être constituées à l'aide de bactéries fraîchement cultivées,

mais, pour des raisons évidentes de facilité de conserva-

tion, elles sont de préférence préparées au moyen de bacté-

ries lyophilisées après culture.

Pour administrer les bactéries vaccinantes, le milieu

dans lequel elles sont mises en suspension n'est pas criti-

que. Il faut bien entendu que ce milieu ne soit pas contrai-

re à la bonne viabilité des bactéries qu'il renferme. Sa composition exacte, de même que le volume administré sont fonction du mode d'administration. Ce dernier peut prendre

des formes très diverses: administration parentérale (in-

tradermique, intramusculaire), instillation conjonctivale, administration orale, etc. A chacun de ces modes correspond un véhicule et

éventuellement des adjuvants appropriés traditionnels.

Un véhicule préféré pour l'administration parentérale

est constitué par une solution physiologique saline. La sus-

pension est dans ce cas avantageusement préparée de façon extemporanée à partir de bactéries lyophilisées. Les doses utilisées pour vacciner les moutons varient selon le mode d'administration et selon les souches; elles

sont estimées en fonction des résultats du protocole d'es-

sais de la souche considérée. La dose est choisie de telle

sorte que la protection conférée à l'animal traité soit si-

gnificative et ne cause aucune réaction gênante.

Pour une administration par voie parentérale de bacté-

ries des souches dépendantes ou reverses selon l'invention, des doses préférées sont comprises entre environ 1.10 et 5.109 bactéries vivantes, et de préférence d'environ 7.108 bactéries. Pour une administration par voie orale, les doses

administrées doivent être sensiblement plus fortes et peu-

vent atteindre 10 bactéries.

Les compositions vaccinantes peuvent en outre contenir d'autres agents iumnogènes dont l'administration est compatible avec celle des bactéries vaccinantes selon l'invention, de façon à constituer des vaccins polyvalents. Des vaccins polyvalents de ce type peuvent notamment être constitués pour effectuer un traitement préventif simultané de plusieurs infections

causées par des entérobactéries de diverses espèces.

Les exemples suivants de préparation, sélection, cultu-

re des souches vaccinantes selon l'invention, ainsi que les essais d'innocuité et d'efficacité de ces souches illustrent

l'invention de façon plus détaillée.

10) Choix des souches initiales Les Salmonella abortus ovis utilisées pour l'obtention des souches vaccinantes selon l'invention sont des souches naturelles virulentes. Ces souches sont prélevées sur des

animaux infectés, dépistés à l'occasion d'avortements.

Les souches naturelles de départ utilisées doivent pré-

senter un certain degré de virulence. Le choix des souches naturelles comprend donc un essai préalable de

virulence. On a effectué ainsi la détermination des doses létales et doses infectantes pour différentes

souches identifiées par les numéros de laboratoire.

Le tableau ci-dessous regroupe les résultats de ces es-

sais dans lesquels les bactéries sont administrées à des

souris CD1 par injection sous-cutanée plantaire.

Souches de DL50 DI50 S.abortus ovis S 15/5 5 x 107 2 x 103 S 7 3 x 107 9 x 102 S 8 2 x 108 5 x 103 S 9 9 x 10 1 x 103 S lOa 9 x 107 1 x 103 S 12a 9 x 10 7 x 102 _ Outre les critères de virulence, les souches choisies présentent de préférence des caractères de croissance qui rendent leur utilisation pratique. La souche dite 15/5 offre une croissance relativement rapide et des colonies bien homogènes. Ces deux propriétés facilitent la

mise en évidence et la sélection des souches mutantes dérivées.

2 ) Sélection et isolement des souche mutantes La souche 15/5, retenue pour ses qualités de croissance, a été passée sur un milieu riche en streptomycine. Le milieu est de la gélose

trypticase-soja contenant 500 pg de streptomycine. Sur ce mi-

lieu se développent les souches dites strepto-résistantes.

La fréquence d'apparition des souches strepto-résistantes est d'en-

viron 1 pour 2 x 108 bactéries. Ces souches sont répliquées par des techniques traditionnelles sur des milieux contenant la streptomycine

et simultanément sur des milieux sans streptomycine.

On constate ainsi qu'environ 2 % des souches strepto-résistantes ne se développent pas ou très peu sur les milieux dépourvus de streptomycine. Ces souches sont isolées et cultivées, et

constituent les souches dites "strepto-dépendantes".

Les souches strepto-dépendantes sont à leur tour culti-

vées en un grand nombre de clones dans des milieux dépourvus

de streptomycine pour mettre en évidence l'apparition de co-

lonies qui ne sont plus "dépendantes". Dans l'ensemble, les souches "reverses", qui ne sont plus dépendantes de la

streptomycine, ont perdu l'aptitude à se développer sur mi-

lieu contenant de la streptomycine.

Dans la préparation des cultures, on utilise un milieu de culture non spécifique, la gélose trypticase-soja

(Trypticase-soy-agar, commercialisée par la Société MERIEUX).

Pour les examens bactériologiques dans lesquels il est né-

cessaire de prévenir la présence de bactéries étrangères, on utilise le milieu formé par la gélose Salmonella-Shigella

(commercialisée par l'INSTITUT PASTEUR).

Le tableau ci-dessous récapitule les milieux utilisés

selon les souches et leur destination.

Milieux de culture utilisés pour Souches Souches Préparation Examens des inoculums bactériologiques Sauvage i5/5 TSA3) SS(4) Mutants D(1) TSA(5) et SS(5) et TSA + streptomycyne (6) SS+streptomycine(6) Mutants Rv (2) TSA SS 1 souches streptomycino-dépendantes 2 souches reverses 3 gélose trypticase-soja (Trypticase-soy-agar, B-D MERIEUX) 4 gélose SalmonellaShigella (INSTITUT PASTEUR) utilisé pour vérifier la streptomycinodépendance 6 500 pg par millilitre de milieu

Les caractéristiques de croissance des différentes sou-

ches sont résumées dans le tableau suivant.

Croissance sur milieu

Souches avec strepto. (1) sans strepto.

SR + +

D +

Rv -(2) + (1) 500 pg/ml de milieu (2) exception: la souche Rv5 croit dans ces conditions 3 ) Essais de virulence des souches mutantes sur souris La virulence résiduelle de plusieurs souches

dépendantes et reverses, obtenues selon les méthodes décri-

tes ci-dessus, est comparée à celle de la souche sauvage /5 dont elles sont dérivées. Les essais comparatifs ont

d'abord été conduits sur deux races de souris ayant une sen-

sibilité différente vis-à-vis des souches sauvages de Salmo-

nella abortus ovis.

Expérience sur souris CD

La virulence des souches a été appréciée par leur capa-

cité à provoquer la mort des souris inoculées, ou à coloni-

ser leur rate.

Des souris femelles adultes, de race CD1 (Charles RIVERS, France), groupées par 20, sont inoculées par voie

intrapéritonéale comme indiqué dans le tableau ci-dessous.

Nombre souris Poids moyen des rates Souches Dose mortes en g (+ s_)

(par animal) (20 souris/lot) - -

/5 2,2 x 107 7 D1 2,8 x107 O 0,33 0,03

D27 +

2 D2 2,4 x10 O 0,34 - 0,02 D 1,5 x106 O 0,16 - 0,01

3 6 +

D4 1,5 x106 O 0,16 - 0,01 D 1,5 x107 O 0,40 - 0,02 D 2,4 x107 O 0,34 0,03

6 +

Rv 2,6 x 107 0 0,49 - 0,02 Rv2 2,1 x107 O 0,48 + 0,02 Rv 2,2 x107 O 0,44 0,03 Rv4 2,2 x107 O 0,43 - 0,03

4 6 +

Rv5 9,8 x 106 O 0,38 - 0,03 Rv6 2,2 x 107 O 0,46 - 0,04

6 7 +

Rv7 2,8 x 107 O 0,46 - 0,02 Rv8 1,8 x 107 O 0,46 - 0,03 * Calculé pour les lots dans lesquels toutes les souris survivaient 6 jours après l'inoculation Sept souris sur les 20 inoculées avec la souche sauvage /5 étaient mortes 6 jours après l'inoculation; à cette date, les animaux survivants de ce groupe étaient tous très

affectés cliniquement. Dans les autres lots, toutes les sou-

ris survivaient et manifestaient peu ou pas de signes clini-

ques au moment de l'abattage; les rates des animaux inocu-

lés avec les souches réverses sont le plus souvent plus grosses que celles des animaux inoculés avec les souches dépendantes. L'essai a été renouvelé en effectuant l'inoculation par

voie sous-cutanée plantaire.

Les rates des souris CD1, prélevées 6 jours après l'inoculation, sont moins fréquemment et moins intensément colonisées par les Salmonella mutantes que par la souche

sauvage 15/5. Les résultats figurent dans le tableau sui-

vant. Nombre rates Infection splénique (1) Souches Dose infectées (log X + )

(par animal)(8 souris/lot) -

+f _ /5 8,8 x 105 8 3,16 - 0,2 D1 8,1 x 105 1 1,18 D2 5,4 x 10 1 0,7

D 2,6-x 105 0 -

3 5

D4 3,O x 10 0 -

D 5,2 x 105 3 0,53

5

D6 4,4 x 105 O_ Rv1 5,O x 10 3 0,4 Rv 6,2 x 10 5 O Rv3 4,8 x 10 1 0 Rv 4, 8 x 10 2 0,3

4 5

Rv 6,2 x 10 4 0,7

5

Rv6 4,5 x 10 5 0,64 Rv 4,2 x 105 1 0

7 5

Rv8 6,7 x 10 3 0,10

(1) Moyenne des log1O des nombres de Salmonella; les ra-

tes non infectées ne sont pas prises en compte pour

le calcul de la moyenne.

Expérience sur souris OF1 Les souris de race OF1 (Iffa Credo) sont connues pour 2464tDO

être plus sensibles à l'infection après inoculation parenté-

rale de Salmonella abortus ovis que les souris CD1.

a) Des essais analogues aux précédents ont été effectués sur ces souris pour faire apparaître de façon plus marquée la virulence des différentes souches. Des souris OF1 femelles adultes ont été inoculées par voie souscutanée plantaire pour comparer les souches selon leur pouvoir létal et leur capacité de coloniser la rate et le ganglion poplité drainant le lieu d'injection. Les souris

ont été sacrifiées et autopsiées. 6 jours après l'inocula-

tion. Le tableau suivant récapitule les résultats de ces essais. On constate, comme précédemment, l'absence totale de

mortalité pour les animaux inoculés à l'aide des souches mu-

tantes préparées selon l'invention, et, dans l'ensemble, l'administration des souches reverses semble s'accompagner

d'effets plus marqués.

Ganglions poplités Survivants Infectés total total Infection (1) Infectées total Rates Infection (1) (log X + s) n Poids (2) en g (+ s) n /5 2,6 x 106

D1 7,5

D2 5,5

D3 1,4

D4 5,5

D5 9,0

D6 2,9

Rv1 Rv2 Rv3 Rv4 Rv5 Rv6 Rv7 Rv8 4,0 4,7 ,5 ,5 4,2 6,5 4,8 3,4 x 106 x 106 x 106 x 106 x 106 x 106 x 106 x 106 x 106 x 106 x 106 x 106 x 106 x 106 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 2,29 2,51 2,05 1,41 2,75 2,24 3, 18 2,66 3,i01 2,92 2,69 2,95 2,88 2,56

- 0, 11

+ 0,05

+ 0,10

+O,lO

+ 0', 06'

-+ 0,05

± 0,09

-+ 0,05

+ 0,08

- 0,07

+ o,lo + o0,12

+ 0,15

-+ 0,17

8/8 8/8 7/8 /8 8/8 6/8 8/8 8/8 8/8 8/8 7/8 8/8 8/8 8/8

0,80 ± 0,09

1,55 - 0,14

0,21 0,11

+

0,80 - 0,17

1,52 -+ 0,17

0,46 + 0,13

3,87.- 0,21

1,46 - 0,14

1,14 - 0,14

3,64 + 0,19

1,02 - 0,16

3,88 + 0,20

2,05 - 0,24

1,84 - 0,11

(1) Moyenne des logarithmes décimaux de Salmonella viables par organe, calculée à partir des organes prélevés dans les groupes expérimentaux sans mortalité (2) Poids moyen, en grammes, des rates des souris faisant partie des groupes expérimentaux sans mortalité Souches Doses 4/8 0,01 0, 01 0,01 0,00 0,00 0,01 co 0,07 0,07 0,09 0,09 0,07 0,07 0,16 0,07 0,08 0, 20 0, 10 0,21 0, 10 0,08 + + + + + +_ -+ + + + + + + 0,02 0,01 0,01 0,02 0,01 0,02 o,01 0,01 w o> Toutes les souches mutantes obtenues manifestent sur souris CD1 ou OF1 une virulence sensiblement plus faible que

celle de la souche 15/5 sauvage.

b) On a également déterminé l'effet relatif de l'inocuration dans le temps de la souche sauvage, d'une souche dépendante

et d'une souche reverse, sur le poids de la rate, et sa co-

lonisation par les Salmonella.

Trois lots de 35 souris OF femelles adultes ont été i 6

inoculés par voie intraveineuse avec environ 1 x 10 bacté-

-ries viables des souches 15/5, D ou Rv6. Aux jours indiqués sur les figures annexes, 5 souris de chaque lot ont été abattues et les rates ont été prélevées, pesées et mises en culture. La figure 1 représente l'évolution du poids moyen de la

rate en grammes, en fonction du temps indiqué en jours.

La figure 2 représente l'évolution de la moyenne du

log10 du nombre de Salmonella/rate en fonction du temps.

Les chiffres portés sur les graphiques indiquent le nombre de souris survivantes lorsque celui-ci est inférieur

à 5.

L'évolution de l'infection splénique et celle du poids

de la rate permettent de conclure à la faible virulence ré-

siduelle des souches mutantes D et Rv6. Dans la rate, le nombre de bactéries mutantes diminue progressivement. Les bactéries Rv6 se maintiennent dans cet organe plus longtemps en plus grand nombre que les bactéries D5. Par ailleurs, la splénomégalie développée après inoculation de la souche Rv6 est plus élevée et plus durable que celle observée après

inoculation de la souche D5.

40) Essais d'immunogénicité chez la souris

Pour apprécier le pouvoir immunogène des souches mutan-

tes selon l'invention, la résistance à une inoculation d'épreuve a été mesurée chez des souris femelles adultes de race CD1, soit non vaccinées, soit vaccinées avec l'une des

souches mutantes.

Un délai de 3 semaines sépare la vaccination, d'une

part, et l'épreuve des souris, d'autre part.

Les bactéries d'épreuve sont des Salmonella abortus ovis 15/5 streptorésistantes (SR). Elles sont inoculées par voie sous-cutanée plantaire à la dose de 4,8 x 105 bactéries viables par animal. La virulence de cette souche pour la souris est du même ordre que celle de la souche sauvage 15/5 dont elle est dérivée par sélection sur milieu contenant 500 pg/ml de streptomycine. La vaccination avec les bactéries à virulence atténuée a pour effet de diminuer le nombre de bactéries colonisant la rate 6 jours après l'inoculation d'épreuve. Cet effet global doit être nuancé: des différences apparaissent selon

les souches vaccinales.

Doses Souris Souches vaccinales Rates infectes Infection splénique vaccinales (par animal) Rates cultivées (log X + s_)(2)

(1) ___ -

Témoins - - 6/6 4,05.- 0,44 s + D1 8,3 x 10 6/6 3,56 - 0,43 D2 7,0 x 105 6/6 3,27 - 0,28 D3 3,3 x 103 6/6 3,72 - 0,36

3 5+

D4 4,6 x 10 6/6 3,09 - 0,29 D5 9,5 x 10 6/6 3,38 - 0,25

6+

D6 1,0 x 10 6/6 3,68 - 0,15 Vaccinées Rv1 6,4 x 10 5/6 2,87 - 0,08 Rv 5,0 x 10 6/6 3,36 - 0,09

2 +

-Rv3 5,5 x 10 6/6 2,48 - 0,63

3 5+

Rv4 4,7 x 10 6/6 3,44 - 0,20 Rv5 4,5-x 105 6/6 2,84 - 0,47

5+

Rv6 4,8 x 10 4/5 (3) 2,38 - 0,53 Rv7 6,0 x 105 6/6 3,43 - 0,64 Rv 3,7 x 10 6/6 4,05-0,27 (1) Injection par voie sous-cutanée dans la nuque

(2) Moyenne des logarithmes décimaux des nombre de Salmo-

nella viables par organe; calcul à partir des organes prélevés 6 jours après l'inoculation d'épreuve (SR)

(3) Une souris morte accidentellement en cours d'expérien-

ce ) Essais de virulence sur béliers

Un essai a été pratiqué pour apprécier la virulence ré-

siduelle dès souches mutantes selon l'invention sur des 21- béliers. Les essais sur béliers ont l'avantage, par rapport à ceux effectués sur les brebis, de ne pas être influencés par les périodes gestantes. A cet effet, l'évolution de la température rectale, de l'épaisseur du pli de peau au site de l'injection et de la réponse sérologique a été suivie. La répartition des Salmonella dans l'organisme a également été étudiée. Vingt et un béliers, âgés de 7 à 8 mois, reçoivent, par voie sous-cutanée sur les côtes en arrière du coude droit, des doses variables de la souche sauvage 15/5 ou des souches

mutantes. Les béliers sont abattus 12 jours après l'injec-

tion vaccinale. Les prélèvement d'organes et de ganglions

ont lieu à l'autopsie.

-Les doses de vaccins sont préparées par culture à 37WC pendant 24 heures sur gélose trypticase soja (B-D MERIEUX) inclinée en tubes, contenant ou non de la streptomycine

(500 pg/ml). La culture est récoltée en solution saline iso-

tonique; la suspension obtenue est ajustée par mesure pho-

tométrique à la concentration désirée, puis la concentration de bactéries viables a été vérifiée par ensemencement après dilution. Les ganglions prélevés à l'abattoir sont dégraissés, flambés superficiellement, sectionnés sur tout leur pourtour

et sont écrasés mécaniquement dans un sachet stérile conte-

nant un petit volume de solution saline stérile. Le liquide contenant le suc ganglionnaire ainsi exprimé est ensemencé

à raison de 0,2 ml par boite de milieu.

Les organes ou morceaux d'organes prélevés à, l'abattoir sont flambés superficiellement, puis broyés. Un aliquot de chaque broyat est étalé sur le milieu de culture. L'excès de

broyat est retiré après étalement.

Les nodules réactionnels sont disséqués, flambés super-

ficiellement et écrasés. Le liquide obtenu est ensemencé sur

boite de milieu de culture.

Cinq prélèvements de sang, à intervalles de 2 ou 3 jours, ont été effectués pendant les 12 jours séparant l'injection vaccinale et l'abattage des animaux. Le test de séro-agglutination a été fait par microtechnique en plaques, en utilisant un antigène "0" (antigène de surface) préparé à partir de la souche 15/5 et titré par rapport à un sérum

servant de référence pour le laboratoire. Les titres agglu-

tinants sont exprimés par le numéro d'ordre de la dernière

dilution (au demi) qui est positive, le nombre 1 correspon-

dant à la dilution finale au 1/10 du sérum à tester.

Il apparaît que les souches mutantes provoquent des ré-

actions biologiques sensiblement plus faibles que la souche sauvage 15/5. Parmi les souches mutantes, les souches

reverses semblent plus "actives" que les souches dépendantes.

* SAlmonnm= 1 ner4sntoe rtans Vaccination Pli Poids Titres Acmes d Autres pré- agglutinants Souche Dose de peau PSD Nodule PSD lèvements maxima

(1) (2) (3) (4) (5)

41,5 3,40 10,7 4(6) 4 O 8

/5 6,3 x 10 41,3 2,20 9,7 4 2. O 9

41,7 2,60 18,0 4 4 O 9

,4 0,52 3,7 NR (7) O 0 5

D 1,1 x 10 40,3 0,59 3,5 NR 0.0 5

1 40,7 0,95 4,9 NR 0 O 7

x 9 41,6 0,67 3,1 NR 0 0 5 D5 1 x 10 40,9 1,30 5,0 NR O O 5

,5 1,40 3,7 NR O O 8

,0 0,48 1,8 NR O 0 8

Rv 5,3 x 108 40,1 0,83 3,9 2 2 O 7

1 40,1 1,33 4,3 2 1 O 9

9 40,9 3,24 7,7 2 2 0 8

Rv4 1,1 x 10 41,0 1,73 9,3 4 2 O 9

,7 1,41 9,3 4 2 O 9

9,40,9 2,80 4,3 4 3 0 8

Rv 1 x 10 40,6 1,82 4,4 4 1 O 6

*6 40,9 2,52 6,1 4 3 0 7

(1) Acmes thermiques, en degrés Celsius; température moyenne des animauxavant injection = 39 5 C (2) Epaisseur maximum du pli de peau, en cm; pli de peau moyen avant injection = 0,27 cm (3) Poids du ganglion préscapulaire droit, en g (4) Autres prélèvements: rate, ganglion mésentérique, ganglion hépatique, foie, vésicule

biliaire, reins, testicules, épididymes, vésicules séminales-

(5) Agglutination "0" en microtechnique; les nombres indiquent la plus haute dilution positive avec 1 = 1/10, 2 = 1/20, 3 = 1/30 - Moyenne avant injection = 2,7 (6) Nombre de Salmonella isolées:- = absence de Salmonella; 1 = 1 à 5 bactéries; 2 = 6-25; 3 = 26-125; 4 = 125 (7) NR = non repérable et donc non prélevé w o> o> ) Essais de virulence sur brebis Deux lots de brebis Préalpes-Lacaunes sont vaccinés par injection sous-cutanée sur les côtes en arrière du coude gauche, soit de bactéries D5, soit de bactéries Rv6. Un troisième lot est composé de brebis non vaccinées. Les réactions locales au site d'injection du vaccin

sont appréciées par l'épaisseur du pli de peau aux jours in-

diqués sur le tableau, et par la formation ou non d'abcès ouverts. Vaccination Pli de peau (en cm) Abcès au jour x après la vaccination (1) ouverts Souche Dose 7 14 21 27 Total

Témoins 0,25 - - -

D 7,3 x 10 1,12 0,49 0,30 0,28 0/18 O Rv6 7 x 10 2,30 1,58 0,78 0,61 5/18 (1) Moyenne sur des lots de 18 animaux

Les brebis sont fécondées 36 jours plus tard. Une par-

tie des animaux entrés en gestation sert à tester 1'immuno-

-génicité des souches vaccinales (voir exemple 70)). L'autre partie a permis de vérifier que les brebis vaccinées 1 mois environ avant le début de la gestation avaient ensuite une

gestation normale et n'excrétaient pas de bactéries vacci-

nales à la mise-bas.

Les caractéristiques pour ces dernières sont résumées

dans le tableau suivant. Ces résultats montrent que la vac-

cination à l'aide des souches mutantes obtenues selon l'in-

vention n'affecte pas le déroulement de la gestation. La présence de mortnés chez les animaux vaccinés n'a pas de

signification particulière étant donné que l'examen bacté-

- riologique des agneaux en question est négatif.

Vaccination Souche Dose Excrétion à la mise-bas (1) Témoins 7,3 x 108 7 x 108

F 2,7

3,3

F 2,8

M 3,6

M 4,5

M 3,7

F 3,5

F 2,7

F 4,5

M 4,2

M 3,9

F 2,9

F 1,7

M 1,6

F 2,6

F 2,5

+ + + + + + + + + + + + + (1) Ecouvillon vaginal et colostrum (2) M = mâle; F = femelle (3) + = survie 2 jours après la naissance; - = mort-né ou survie < 2 jours - (4) L'examen bactériologique n'est fait que sur les

agneaux. non viables; poumon, rate, foie sont préle-

vés; - = pas de Salmonella détectées 7 ) Essais d'immunoqénicité sur brebis

L'essai du pouvoir protecteur a été conduit sur 28 bre-

bis gestantes faisant partie des 3 lots d'animaux décrits à

l'exemple 6 ).

Cent deux jours après la vaccination et 68 jours après le début de leur gestation, ces brebis sont éprouvées par injection sous-cutanée de 8 x 109 Salmonella abortus ovis /5, en arrière du coude droit. Le tableau indique, pour les trois groupes expérimentaux, les résultats cliniques et Sexe (2) Poids (Kg) Agneaux Viabilité (3)

Bacté-

riologie (4)

F 2,5

M 3,5

M 3,5

M 3,2

+ + + +

bactériologiques enregistrés.

Il apparaît dans le tableau ci-après que, des deux sou-

ches vaccinales testées, celle qui confère la meilleure ré-

sistance à l'inoculation d'épreuve est la souche reverse Rv6. 1 r,

Durée Parturi- Bacté-

Vaccination Agneaux riologie moyenne tion viab riologie Souche.Dose de gestation à terme v es négative (jours) total (1) total(2) total(3) Témoins 92 1/9 1/14 1/9 D 7,3 x 10 117 4/9 4/13 4/9 Rv 7,0 x 10 133 8/10 9/13 6/10 (1) Durée de gestation:, 140 jours (2) Agneaux viables: survie.> 2 jours après le part

(3) Bactériologie négative: absence de Salmonella détec-

table dans le mucus vaginal, le colostrum (si possi-

ble); et chez les foetus mort-nés ou non viables:

poumon, rate, liquide gastrique, cerveau.

L'appréciation du niveau de protection ainsi conférée aux brebis doit prendre en considération la sévérité du test

d'immunogénicité utilisé. En effet, les brebis sont éprou-

vées à mi-gestation, périodede sensibilité maximale aux in-

fections abortives; l'épreuve ainsi réalisée fait avorter

8 brebis témoins sur 9, alors que le pourcentage d'avorte-

ment observé in natura dépasse rarement 50 % de l'effectif des brebis gestantes. Les résultats de ces essais devraient donc conduire à un effet protecteur encore beaucoup plus net

contre l'infection in natura.

Claims (10)

REVENDICATIONS

1 - Procédé de préparation de souches mutantes de Sal-

monella abortus ovis comprenant: a) l'ensemencement et la culture de bactéries d'une souche sauvage virulente, sur un milieu contenant une quantité tel- le d'antibiotique que seuls les mutants chromosomiques "résistants" puissent se développer

b) la culture par réplique des colonies de bactéries résis-

tantes mises en évidence en a) sur un milieu exempt d'anti-

biotique pour déterminer, parmi ces colonies de bactéries résistantes, celles qui ont le caractère de "dépendance"

vis-à-vis de 1' antibiotique, puis le développement des sou-

ches dépendantes ainsi sélectionnées; et c) éventuellement l'ensemencement et la culture de bactéries

dépendantes provenant de b) sur un milieu exempt d'antibio-

tique jusqu'à apparition de colonies reverses, et le déve-

loppement des souches reverses ainsi sélectionnées.

2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce

que l'antibiotique utilisé est la streptomycine.

3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce

que la concentration en streptomycine dans le milieu de cul-

ture utilisé en a) est supérieure à 50 pg/ml.

4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la concentration en streptomycine est d'environ 500 pg/ ml.

- 5 - Procédé selon l'une quelconque des revendications

précédentes, caractérisé en ce que la souche virulente uti-

lisée est la souche 15/5 répertoriée sous le no I - 096

dans la Collection Nationale des Cultures de Micro-organis-

mes.

6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications

précédentes, caractérisé en ce que les souches dépendantes

ou reverses préparées sont en outre sélectionnées en fonc-

tion des caractéristiques qu'elles présentent dans les essais du protocole comprenant leur administration à des souris pour déterminer leur innocuité et l'effet protecteur vis-à-vis d'une infection provoquée par injection d'une

souche sauvage virulente.

7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce

que les souches sélectionnées sont en outre testées sur mou-

tons pour leur aptitude à protéger ceux-ci. contre une infec-

tion provoquée par injection de bactéries d'une souche sau-

vage virulente à une dose suffisante pour causer l'infection sur des animaux non vaccinés.

8 - Salmonella abortus ovis dépendantes ou reverses ob-

tenues par le procédé selon l'une quelconque des revendica-

tions précédentes.

9 - Salmonella abortus ovis selon la revendication 8,

répertoriées sous le n0 I - 097 de la Collection Natio-

nale des Cultures de Micro-organismes.

- Salmonella abortus ovis reverses de souches dépen-

dantes de la streptomycine, caractérisées en ce qu'elles

sont positives au test d'identification de.Voges-Proskauer.

11 - Composition de vaccin, caractérisée en ce qu'elle comprend, comme agent immunogène, des Salmonella abortus ovis vivantes dérivées de souches sauvages virulentes par un

procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.

12 - Composition de vaccin selon la revendication 11, caractérisée en ce que la souche utilisée est une souche reverse. 13 --Composition de vaccin selon la revendication 12,

caractérisée en ce que la souche utilisée est celle réper-

toriée à la C.N.C.M. sous le n0 I - 097.

- 14 - Composition de vaccin selon l'une quelconque des

revendications 12 ou 13, caractérisée en ce que, pour le

traitement parentéral des moutons, elle est dosée par unité

de 1.107 à 5.109 bactéries.

- Composition de vaccin selon l'une quelconque des

revendications 12 à'14, dans laquelle les bactéries sont

sous forme lyophilisée.