DE2836507C2

DE2836507C2 -

Info

Publication number: DE2836507C2
Application number: DE2836507A
Authority: DE
Inventors: Israel Hertman; Amnon Michael; Jacob Markenson
Original assignee: Israel Institute for Biological Research
Current assignee: Israel Institute for Biological Research
Priority date: 1977-08-24
Filing date: 1978-08-21
Publication date: 1990-03-15
Also published as: IE781639L; GB2003029A; IL52815A; NL7808717A; IL52815A0; IE47175B1; CA1117416A; FR2408352B1; AT364080B; AU520017B2; AU3918678A; GB2003029B; ATA614478A; DE2836507A1; FR2408352A1; US4169886A

Description

Die Erfindung betrifft ein lebendes Vaccin gegen Pasteurella multocida zur Verabreichung an Geflügel durch Injektion, per os oder als Aerosol sowie ein Verfahren zur Herstellung des in dem Vaccin enthaltenen Stamms.

Eine der üblichen Geflügelkrankheiten ist die Geflügelcholera, die durch Pasteurella multocida hervorgerufen wird. Diese Krankheit ist auch als Pasteurellosis bekannt. Die Krankheit herrscht unter Truthähnen und Hühnchen vor. Die Sterblichkeit ist ziemlich hoch und die wirtschaftlichen Verluste sind somit beträchtlich. Die Krankheit ist ansteckend und die Örtlichkeiten bleiben über verlängerte Zeitspannen infiziert. Truthähne und männliche junge Hühner bzw. Hähnchen, die für Zuchtzwecke verwendet werden, sind besonders anfällig.

Das erste geschwächte Vaccin dieses Typs wurde von Pasteur entwickelt (vgl. Compt. Rend. Acad. Sci. 91, 673 (1880)). Dieses Vorgehen hat jedoch den Nachteil, daß die Bakterien wieder zu ihrer Virulenz zuückkehrten.

In Poultry Science 47 1162 (1968) wurde von einem natürlich vorkommenden Stamm mit niedriger Virulenz, nämlich dem Clemson-Universität-(CU)-Stamm, berichtet. Dieser Stamm wird in der Natur gefunden, hat eine verhältnismäßig niedrige Virulenz, ist stabil und ist zur Immunisierung von Truthähnen wirksam. Bei der Verwendung bei jungen Hühnern ist er, insbesondere wenn er oral verabreicht wird, von geringerer Effektivität. Einzelne Injektionen sind zwar wirksam, doch stellt dies einen schwerwiegenden Nachteil dar. Weiterhin wird eine Sterblichkeitsrate von bis zu 2% und sogar mehr beobachtet, wenn das Geflügel andere Mikroorganismen, wie z. B. Mycoplasma gallisepticum, beherbergt (vgl. Poultry International, April 1975, Seite 12).

In den letzten Jahren wurden handelsübliche inaktivierte (abgetötete) Vaccine oder Bakterien zur Immunisierung von Geflügel gegen Geflügelcholera verwendet. Die Nachteile dieses Vorgehens sind, daß solche Vaccine eine Immunität nur gegenüber dem speziellen Stamm des Vaccins verleihen. Es gibt aber viele Stämme und gelegentlich treten auch neue Stämme auf. Die Imunisierung ist gegen solche Stämme nicht wirksam. Weiterhin müssen solche Vaccine durch einzelne Injektion verabreicht werden. Hilfsmittel müssen herangezogen werden, welche oftmals an der Injektionsstelle Knoten verursachen. Durch 2 oder 3 Injektionen wird nur eine Immunitätsdauer von etwa 8 bis 10 Wochen erhalten. Viele Nachteile der herkömmlichen Vaccine können nun durch das neue erfindungsgemäße Vaccin beseitigt werden.

Gegenstand der Erfindung ist ein lebendes Vaccin der oben angegebenen Art, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es als abgeschwächten, nichtvirulenten, genetisch stabilen Stamm von Pasteurella multocida den Stamm M-3-G. ATCC Nr. 31416 enthält.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des abgeschwächten, genetisch stabilen, nichtvirulenten Stamms von Pasteurella multocida (ATCC Nr. 31416), das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den virulenten Feldstamm X-73 (ATCC 11039) züchtet, nach 18 h bei 37°C Kolonien mit gleichförmiger Größe und einem Durchmesser von etwa 4 bis 5 mm auswählt, diese in einem Puffer mit einem pH-Wert von 5,5 suspendiert, diese einem Mutagen mit einer Konzentration, daß eine Sterblichkeit von 90 bis 99% nach 30 min bei 37°C bewirkt wird, aussetzt, die Mikroorganismen zentrifugiert, sie wäscht, auf ein Nährmedium aufbringt und Kolonien mit einem Durchmesser von nicht mehr als 2,5 bis 3 mm nach 18 h bei 37°C auswählt, eine Reinigung durch Reisolierung der einzelnen Kolonien vornimmt, auf die antigene Spezifizität und Virulenz testet und daß man die avirulente, genetisch stabile, immunologisch wirksame Mutante zur Verwendung für das Vaccin auswählt.

Das neue erfindungsgemäße Vaccin hat eine Anzahl von wichtigen Vorteilen, wie z. B.: der abgeschwächte Stamm ist gegenüber Truthähnen und jungen Hühnern vollständig avirulent. Der abgeschwächte Stamm ist genetisch stabil und kehrt nicht zu seiner ursprünglichen Virulenz zurück, so daß bei der Verabreichung an Geflügel, das Mycoplasma spp. beherbergt, keinerlei Sterblichkeit bewirkt wird. Die Immunität hält über einen nennenswert längeren Zeitraum an und sie ist gegenüber allen Stämmen von Pasteurella multocida und sogar gegenüber neuen Stämmen, die von Zeit zu Zeit auftreten, wirksam. Die Tatsache, daß die Immunität sowohl gegenüber homologen als auch heterologen Stämmen wirksam ist, ist von besonderer Wichtigkeit.

Der M-3-G-Stamm des Serotyps 1 (Heddleston) ist das Ergebnis einer kontrollierten und reproduzierbaren Mutation. Der Stamm unterscheidet sich hinsichtlich einer Anzahl von signifikanten Parametern von dem Feldstamm FS-3, Typ X-73, der gleichfalls bei der ATCC niedergelegt worden ist und von der ATCC erhältlich ist. Als Unterschiede können eine unterschiedliche Größe der Kolonien, die Abwesenheit von Hyaluronsäure von der Kapsel und eine verlängerte Generationszeit genannt werden. Ein wiederholter Durchtritt auf intravenösem Weg durch Truthähne hat die Stabilität des neuen Stamms hinsichtlich sämtlicher angegebenen Eigenschaften demonstriert. Der Stamm ist vollständig avirulent und Dosen so hoch wie 10¹¹ Mikroorganismen pro Truthahn, zugeführt auf verschiedenen Verabreichungswegen, haben keine schwerwiegenden Nebenwirkungen bewirkt.

K.L. Heddleston hat 16 Serotypen von P. multocida mit den Nummern 1 bis 16 beschrieben, die aus jungen Hühnern, Truthähnen, Büffeln und wilden Vögeln etc. isoliert worden sind. Das erfindungsgemäße Verfahren, das auf der Anwendung einer mutagenen Substanz aufgebaut ist, ist auf die verschiedenen Serotypen anwendbar. Es ist möglich, abgeschwächte avirulente Stämme und Vaccine, die solche Stämme enthalten, durch das erfindungsgemäße Verfahren zu erhalten. Die neuen Stämme sind avirulent, genetisch stabil und sie verleihen eine langanhaltende Immunität. Die Verabreichung per os oder durch Aerosol ist zweckmäßig und für die Massenimmunisierung geeignet.

Der abgeschwächte M-3-G-Stamm, der mit der Hinterlegungsnummer ATCC 31 416 hinterlegt worden ist, wurde aus einem virulenten Feldstamm entwickelt, der als FS-3 vom Serotyp 1 durch die Heddleston-Klassifizierung identifiziert wurde, welche durch den Test von Little et al., Am. J. Vet. Res. 4, 110 (1943) vorgenommen wurde. Dieser Stamm wird auch als X-73 bezeichnet und er ist von der ATCC unter der Hinterlegungsnummer ATCC Nr. 11039 erhältlich. Im Gegensatz zu herkömmlichen Vaccinen, die zu einer Sterblichkeit von etwa 1 bis 3% führen, wenn eine verborgene Krankheit vorhanden ist, haben die erfindungsgemäßen neuen Vaccine praktisch keine Nebenwirkungen. Die Effektivität des Vaccins ist hoch (80 bis 100%). Die neuen Vaccine werden vorzugsweise oral (vorzugsweise mit dem Trinkwasser) oder durch Aerosol verabreicht. Orale Dosen sind 10⁸ bis 10¹¹ abgeschwächte Mikroorganismen, vorzugsweise 10¹⁰, pro Vogel. Das Vaccin kan lyophilisiert und über verlängerte Zeitspannen gelagert werden. Die lyophilisierte Substanz enthält etwa 2 Dosen pro mg trockenes Material und sie wird vor dem Gebrauch durch eine geeignete Verdünnung rekonstituiert.

Das Verfahren zur Herstellung von dem abgeschwächten, genetisch stabilen Stamm, der avirulent ist und der für eine wirksame Impfung gegen Geflügelcholera verwendet werden kann, wird nachstehend im Versuchsteil näher beschrieben. Das Verfahren enthält die folgenden wesentlichen Stufen: Der virulente Feldstamm wird auf einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet und nach 18 h bei 37°C werden gleichförmige Kolonien mit einem Durchmesser von etwa 4 bis 5 mm ausgewählt. Die Mikroorganismen werden in einem Puffer mit einem pH-Wert von 5,5 suspendiert und ein geeignetes Mutagen wird in einer Konzentration zugefügt, die zu einer Überlebensrate von etwa 1 bis 2% nach 30 min bei 37°C führt. Besonders gute Ergebnisse wurden mit N-Methyl-N-nitroso-N-nitroguanidin (NTG) erhalten. Andere mutagene Substanzen, wie z. B. Methylmethansulfonat (MMS), Äthylmethansulfonat (EMS), 5-Bromuracyl, 2-Aminopurin und Hydroxylamin, können ebenfalls verwendet werden. Nach dem Zentrifugieren und Waschen werden die Mikroorganismen in einem Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 suspendiert, verdünnt und mit einer Konzentration von 100 pro Platte aufgelegt. 95 bis 99% der Kolonien haben eine herkömmliche Größe und sie sind vom herkömmlichen Typ. 1 bis 5% sind Mutanten. Kolonien mit einem Durchmesser von weniger als etwa 2,5 bis 3 mm nach 18 h bei 37°C werden ausgewählt, durch Reisolierung der einzelnen Kolonien, die über diese Größe nicht hinausgehen, gereinigt, auf die antigene Spezifizität getestet, auf die Virulenz getestet und die avirulenten Stämme werden gezüchtet und auf die genetische Stabilität durch wiederholten Durchgang durch Vögel getestet. Die Stämme mit den besten immunogenen Eigenschaften werden ausgewählt. Der beste ausgewählte Stamm wird als M-3-G bezeichnet. Seine Hinterlegungsnummer ist ATCC 31 416. Dieser Stamm hat eine Generationszeit, die sich erheblich von derjenigen des Ausgangsstamms X-73 unterscheidet. Die Generationszeit ist 27 min bei 37°C und 24 min bei 41°C für den Ausgangsstamm und 30 min bei 37°C und 39 min bei 41°C bei dem Stamm mit der Hinterlegungsnummer ATCC 31 416. Die Körpertemperatur der Vögel beträgt etwa 41°C. Diese Mutante hat keine Hyaluronsäure in ihrer Kapsel.

Die Virulenz der Mutante ist erheblich vermindert. Während 8,8 Organismen des Ausgangsstamms bei i.p.-Injektion 5 von 5 Mäusen innerhalb von 2 Tagen töten und 88 Mikroorganismen innerhalb von 24 h 5 von 5 Mäusen töten, bewirkte M-3-G bei i.p.- Injektion von 10⁷ Mikroorganismen keinen Tod von einer Maus von 10 Mäusen.

Wie oben zum Ausdruck gebracht wurde, hat das neue Vaccin keine Nebenwirkungen und die Immunität, die durch eine 2- bis 3- malige aufeinanderfolgende orale Zuführung mit dem Trinkwasser resultiert, hält etwa 10 Wochen oder mehr an.

Die Erfindung wird in dem nachfolgenden Beispiel näher erläutert.

Herstellung des Vaccins a. Stämme

5 Feldstämme, die Pasteurella-multocida-Serotypen, Heddleston et al., 1972, Avian Dis. 16, 703, darstellten, wurden zu einer Konzentration von 10⁸ Bakterien pro ml bei 37°C in 5 ml LB-Brühe (10 g Bactotrypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl, 1 g Glucose in 1000 ml destilliertem Wasser) gezüchtet. Die Kulturen wurden mit einem Verdünnungsmittel (10 g Bactotrypton, 5 g NaCl in 1000 ml Wasser) zu einer Konzentration von 1000 Bakterien/ml verdünnt. Proben mit 0,1 ml wurden auf LB- Agar (LB-Brühe, ergänzt mit 10 g/l Agar, Difco und 200 mg/l Hämin) aufgebracht. Die Kolonien wurden nach 18 h bei 37°C beobachtet. Alle Medien wurden bei einem pH-Wert von 7,2 gehalten.

Der Stamm FS-3 (Serotyp 1), der dem Stamm X-73, ATCC 11 039, äquivalent ist, ergab Kolonien mit einer gleichförmigen Größe von einem Durchmesser von 4 bis 5 mm. Der Stamm FS-3 gab die beste Reproduzierbarkeit der Lebensfähigkeitszählungen. Der Stamm FS-3 und die anderen Stämme wurden hinsichtlich der Bildung von Kolonien nach der Lyophilisierung untersucht. Er konnte über 90% hinausgehend ohne Verlust an koloniebildenden Einheiten lyophilisiert werden. Dieser Stamm wurde für die Mutagenese ausgewählt.

b. Mutagenese

FS-3-Bakterien von gefrorenen Vorratskulturen wurden ausgetaut, in LB-Brühe (1 ml Ausgangskultur auf 10 ml LB-Brühe) inokuliert und bei 37°C in 50-ml-Erlenmayer-Kolben unter Hin- und Herschütteln gezüchtet. Die Kulturen wurden nach 18 h 1 : 60 in 5 Kolben verdünnt, welche 10 ml frische LB-Brühe enthielten, und sie wurden zu der Mid-log-Phase (etwa 10⁸ Bakterien pro ml) gezüchtet. Die Kulturen wurden durch Zentrifugieren mit 10 000 Upm/10 min geerntet. Das Sediment wurde gewaschen und in 10 ml Citratpuffer mit einem pH-Wert von 5,5 resuspendiert.

N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) wurde zu den Bakteriensuspensionen zu den folgenden Endkonzentrationen: 25, 50, 100 und 200 µg/ml zugesetzt. Die Bakteriensuspensionen, die verschiedene Konzentrationen von NTG enthielten, wurden in einem Wasserbad 30 min lang bei 37°C (ohne Belüftung) inkubiert. Nach dieser Inkubierungsperiode wurde jede Kultur 10 min lang mit 10 000 Upm zentrifugiert. Das Sediment wurde zweimal mit Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,2 gewaschen. Das gewaschene Sediment, das die behandelten Bakterien enthielt, wurde in 10 ml frischer LB-Brühe wieder suspendiert und 18 h lang in Kolben bei 37°C unter Belüften und Hin- und Herschütteln inkubiert. Die Lebensfähigkeit der Bakterien wurde bestimmt, indem sie unmittelbar nach Inkubierung mit NTG vor dem Zentrifugieren auf LB-Agar aufgebracht wurden. Bei den obigen Konzentrationen von NTG betrug die Sterblichkeit 15, 40, 90 bzw. 99%. Die Eichung von NTG wurde mit jeder Kultur von P. multocida, die mit dem Mutagen behandelt worden war, durchgeführt. Nur Kulturen mit einer Sterblichkeit von 90 bis 99% nach Aussetzen an NTG wurden für die weiteren Auswahlmaßnahmen herangezogen.

c. Isolierung der abgeschwächten Mutanten

500 Bakterien-Klone, die die NTG-Behandlung überlebt hatten, wurden durch sterile Zahnstocher aufgenommen und genetisch gereinigt, indem sie zweimal auf die Oberflächen von Agarplatten aufgestreift wurden und indem die einzelnen Kolonien wieder isoliert wurden. Die gereinigten Klone wurden über Nacht bei 37°C wachsen gelassen. Kolonien mit einem Durchmesser von weniger als 3 mm wurden ausgewählt. Diese wurden in LB-Brühe 1/50 verdünnt, 18 h unter Belüftung bei 37°C gezüchtet und auf die Virulenz getestet, indem sie intraperitoneal mit 10⁶ Bakterien mindestens 4 Mäusen injiziert wurden. Der parenteral injizierte Stamm FS-3 bewirkte bei dieser Konzentration nach 10 bis 18 h ein Absterben von 100%. Durch diese Methode wurden 11 Stämme isoliert, die gegenüber Mäusen avirulent waren. Diese wurden weiterhin bei 5 Wochen alten Truthähnen getestet. Die Stämme wurden als 1T, 5T, 6T, 8T, 9T, M3, M4, ITG, M3G und M4G bezeichnet. Es wurde festgestellt, daß 6 der 11 Stämme in Truthähnen geschwächt (avirulent) waren. Die ausgewählten Stämme wurden auf die immunogenen Eigenschaften getestet. Es wurde festgestellt, daß der Stamm M3G der beste war. Dieser Stamm hat die in der folgenden Tabelle angegebenen Eigenschaften.

Eigenschaften von Pasteurella multocida M-3-G

1. Heddleston-Serotyp 1, identifiziert durch Agarpräzipitation und Schnellagglutinationstests.
2. Keine Hyaluronsäurekapsel vorhanden. Mit spezifischem Antiserum (Anti-) ohne Vorbehandlung mit Hyaluronidase agglutinierbar.
3. Generationszeit etwa 30 min bei 37°C in LB-Brühe, Ende 39 min bei 41°C.

4. Widerstandsmuster gegen Antibiotika:

Streptomycin (5 µg)
nicht-empfindlich
Tetracyclin (10 µg)	empfindlich
Penicillin (5 µg-Einheiten)	ziemlich empfindlich
Cephalotin (30 µg)	sehr empfindlich
Erythromycin (5 µg)	resistent
Chlormycetin (10 µg)	sehr empfindlich
Novobiocin (10 µg)	sehr empfindlich
Kanamycin (10 µg)	sehr empfindlich
Methicillin (10 µg)	sehr empfindlich

Das Widerstandsmuster wurde durch Scheibentests (Difco) auf LB- Agarplatten und durch Messung der Hemmzonen nach 18 bis 24 h bestimmt.
Der parenterale Stamm FS-3 ist gegenüber Streptomycin und Erythromycin und den anderen Antibiotika empfindlich.

5. Avirulenz gegenüber Mäusen (i.p. 10⁶ Bakterien), Truthähnen bzw. Truthennen (i.p. 10⁸ Bakterien).
6. Kein Wiederkehren zu der Virulenz nach dem Durchlauf durch Truthähne bzw. Truthennen: 10⁸ Bakterien wurden i.v. injiziert. Die Tiere wurden 20 bis 30 h später geschlachtet und die Bakterien wurden aseptisch aus der Leber isoliert. Maximale Bakterienzahl pro Leber: 100 bis 1000.
Dies wurde zehnmal wiederholt. Die Endausbeutemenge an Bakterien nach dem zehnten Vogel-zu-Vogel-Durchlauf wurde reisoliert. Empfindliche Truthähne bzw. Truthennen wurden mit 10¹⁰ Bakterien pro Vogel inokuliert. Den Vögeln wurde kein Schaden zugefügt. Es wird ersichtlich, daß die Bakterien nicht zu ihrer Virulenz zurückkehrten.
Die Bakterien behielten auch ihre anderen Eigenschaften bei, wie z. B. die Abwesenheit von Hyaluronsäure in der Kapsel, die Bildung von Mikrokolonien mit einem Durchmesser von weniger als 3 mm nach 18 h bei 37°C und die verminderte Generationszeit (etwa 39 min bei 41°C).
7. Die Bakterien überlebten ein Einfrieren in 8% Glycerin in der Brühe und auch eine Lyophilisierung.
8. Die Bakterien überlebten mindestens 2 h in Trinkwasser von 25°C, das mit 0,25% Milchpulver ergänzt worden war.

Erzeugung des Vaccins

Der Stamm M-3-G wurde in 500 ml Tryptosebrühe inokuliert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die erhaltene Kultur wurde durch mikroskopische Untersuchung auf gramgefärbte Verschmierungen und auf die Fähigkeit, ohne Vorbehandlung mit Hyaluronidase zu agglutinieren, untersucht. Der Stamm wurde aufgebracht und biochemisch und serologisch untersucht. Die so erhaltene Kultur wurde als Inokulum verwendet und aseptisch in einen 40-l- Fermentator überführt, wo ein vorsterilisiertes Kulturmedium zugesetzt wurde, das Tryptose, Hefeextrakt, Pepton, Dextrose und Puffersalze enthielt. Der pH-Wert wurde während des Züchtungsprozesses kontrolliert. Das Kulturmedium wurde periodisch durch photometrische Dichtemessungen der entnommenen Proben auf das Wachstum von M-3-G untersucht. Als das Wachstum sein Maximum erreicht hatte, wurde die Suspension in vorgekühlte Gefäße übertragen und die Organismen wurden durch Zentrifugieren konzentriert. Das konzentrierte Produkt wurde in einem geeigneten Medium, wie Milchkohlenhydraten oder Kaseinhydrolysat, resuspendiert und in Ampullen und Gläschen eingegeben und eingefroren.

Das gefrorene Vaccin wurde lyophilisiert und das resultierende trockene Vaccin wurde auf die Reinheit und die Kultureigenschaften sowie die Stabilität beim Gefrieren (+4°C) getestet. Dieses Vaccin wurde für Tests mit Vögeln verwendet. Die Ergebnisse werden nachstehend angegeben. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß das Vaccin dem bislang verwendeten Vaccin vom Typ von abgetöteten Organismen erheblich überlegen ist und daß es erheblich einfacher verabreicht werden kann.

Wirksamkeitstest des Vaccins

Empfindliche Truthähne bzw. Truthennen wurden wiederholt mit dem Stamm M-3-G inokuliert. Dies wurde auf verschiedenen Wegen durchgeführt. Bei einem Versuch erfolgte die Zuführung an die Versuchstiere dreimal intramuskulär mit einer Dosierung von 7,10⁷ bis 4,10⁸. Die inokulierten Truthähne bzw. Truthennen und nicht-inokulierte Kontrolltiere wurden durch Injektion mit virulentem Pasteurella multocida provoziert, wobei der Ausgangsstamm FS-3 und heterologe Stämme, die serologisch unterschiedlich waren, verwendet wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I

Bei einem weiteren Versuch wurde M-3-G durch Zuführung des Vaccins an Truthähne bzw. Truthennen per os getestet. Eine Menge von 10¹⁰ Bakterien in 100 ml Trinkwasser wurde pro Vogel zugeführt. Die Zuführung erfolge dreimal mit wöchentlichen Intervallen. 2 Wochen nach der letzten Dosis wurden die Truthähne bzw. Truthennen im und auf dem Wege über das Atmungssystem provoziert, wobei die Gaumenspalte verwendet wurde, um mit dem Provozierungsstamm zu reiben. Es wurde eine simulierende Infektion im Feld von 10⁸ cfu/ml durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.

Die Immunisierung kann auch durch Inhalation eines Aerosols durchgeführt werden. Eine Menge von 10¹⁰ Bakterien in 50 ml Wasser wurde innerhalb von 10 min aerosolisiert und die Vögel wurden dieser Wolke ausgesetzt.

Tabelle II

Ergebnisse der Provozierung

Die Ergebnisse der Leistungstests wurden bei späteren Versuchen, bei denen die minimale Provozierungsdosis bestimmt wurde, weiter verbessert.

Claims

1. Lebendes Vaccin gegen Pasteurella multocida zur Verabreichung an Geflügel durch Injektion, per os oder als Aerosol, dadurch gekennzeichnet, daß es als abgeschwächten, nichtvirulenten, genetisch stabilen Stamm von Pasteurella multocida den Stamm M-3-G. ATCC Nr. 31 416 enthält.

2. Vaccin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es in Dosiseinheitsform mit etwa 10⁸ bis 10¹¹ Bakterien pro Dosierung für den Vogel vorliegt.

3. Verfahren zur Herstellung des abgeschwächten, genetisch stabilen, nichtvirulenten Stamms von Pasteurella multocida nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den virulenten Feldstamm X-73 (ATCC 11 039) züchtet, nach 18 h bei 37°C Kolonien mit gleichförmiger Größe und einem Durchmesser von etwa 4 bis 5 mm auswählt, diese in einem Puffer mit einem pH-Wert von 5,5 suspendiert, diese einem Mutagen mit einer Konzentration, daß eine Sterblichkeit von 90 bis 99% nach 30 min bei 37°C bewirkt wird, aussetzt, die Mikroorganismen zentrifugiert, sie wäscht, auf ein Nährmedium aufbringt und Kolonien mit einem Durchmesser von nicht mehr als 2,5 bis 3 mm nach 18 h bei 37°C auswählt, eine Reinigung durch Reisolierung der einzelnen Kolonien vornimmt, auf die antigene Spezifizität und Virulenz testet und daß man die avirulente, genetisch stabile, immunologisch wirksame Mutante zur Verwendung für das Vaccin auswählt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mutagen N-Methyl-N-nitro- N-nitrosoguanidin in einer Konzentration von etwa 100 bis 200 Mikrogramm/ml verwendet.