PT1638598E

PT1638598E - Mutantes acapsulares de deleção de hyae de p. multocida

Info

Publication number: PT1638598E
Application number: PT04777430T
Authority: PT
Inventors: Robert E Briggs; Fred M Tatum
Original assignee: Biotechnology Res & Dev; Us Secretary United States Dep
Priority date: 2003-07-02
Filing date: 2004-07-02
Publication date: 2007-03-30
Also published as: ZA200509533B; US20050106185A1; CA2530779C; AU2004254619A1; ES2278344T3; KR101119216B1; NZ543771A; PL1638598T3; EP1638598A2; JP2011024587A; WO2005003330A2; KR20060020657A; JP5001647B2; JP5649881B2; HK1088561A1; JP2007524398A; CA2530779A1; DE602004003582D1; DK1638598T3; EP1638598B1

Description

DESCRIÇÃO "MUTANTES ACAPSULARES DE DELEÇÃO DE HYAE DE P. MULTOCIDA"

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a mutantes acapsulares de Pasteurella multocida e vacinas compreendendo os mutantes.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Pasteurella multocida (P. multocida) está associada a uma variedade de doenças, incluindo meningoencefalite em vitelos e animais com um ano de idade, linfadenite em cordeiros, septicemia em cavalos e burros, pasteurelose septicémica bovina (septicemia hemorrágica, barbone), pasteurelose suina, pasteurelose septicémica suina, pneumonia e cólera aviária.

Existe uma necessidade, na técnica, de vacinas eficazes que possam ser utilizadas para proporcionar imunidade protectora contra doenças provocadas por P. multocida.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Uma forma de realização da invenção é uma bactéria Pasteurella multocida (P. multocida) isolada do serogrupo A que 1 compreende uma deleção de todo ou de uma parte de um gene hyaE. A deleção atenua a bactéria.

Outra forma de realização da invenção é uma vacina para induzir imunidade protectora contra o tipo selvagem de P. multocida. A vacina compreende a bactéria P. multocida do serogrupo A que compreende uma deleção de todo ou de uma parte de um gene hyaE e um veiculo farmaceuticamente aceitável. A mutação de deleção atenua a bactéria.

Ainda outra forma de realização da invenção é rações adequadas para mamíferos (incluindo gado, ungulados e animais de companhia ou aves (de modo preferido aves domésticas) compreendendo uma bactéria P. multocida do serogrupo A que compreende uma deleção de todo ou de uma parte de um gene hyaE. A mutação atenua a bactéria.

Ainda outra forma de realização da invenção é a utilização de uma bactéria P. multocida do serogrupo A que compreende uma deleção de todo ou de uma parte de um gene hyaE, o que atenua a bactéria, no fabrico de uma medicamento para indução de imunidade protectora contra P. multocida do tipo selvagem. A bactéria é para administração num sujeito animal, tal como um mamífero (incluindo gado, ungulados e animais de companhia) ou uma ave (incluindo aves domésticas). A bactéria confere por isso imunidade protectora ao sujeito animal contra P. multocida do tipo selvagem. A invenção proporciona assim ferramentas e métodos para indução de imunidade protectora contra doenças provocadas por P. multocida. 2

BREVE DESCRIÇÃO DA FIGURA FIG. 1. Ilustração da construção de mutantes de deleção hyaE. FIG. IA, esquema apresentando a deleção planeada. FIG. 1B, plasmídeo contendo a inserção hyaE com deleção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Podem ser administrados mutantes acapsulares de deleção de hyaE de P. multocida do serogrupo A a mamíferos (incluindo gado, ungulados e animais de companhia) e aves (incluindo aves domésticas) respectivamente para proporcionar imunidade protectora contra P. multocida do tipo selvagem, e. g., para evitar ou reduzir a gravidade de doenças, tais como septicemia hemorrágica ou pneumonia em gado, ungulados e animais de companhia e para evitar ou reduzir a gravidade de cólera aviária em aves, especialmente aves domésticas. Os termos "mutante(s) acapsular (es)", "bactéria (s) acapsular (es)", e "bactéria (s) mutante(s)" são utilizados indistintamente nesta descrição.

Mutantes acapsulares de deleção de hyaE de P. multocida do serogrupo A

Podem ser produzidos mutantes acapsulares de deleção de hyaE de P. multocida do serogrupo A (e. g., serotipos A:l, A:3, A:4) por mutação do gene hyaE no locus biossintético da cápsula. Os genes do locus biossintético da cápsula no serogrupo A são bem conhecidos e foram completamente sequenciados. Chung et ai., FEMS Microbiol. Lett. 166 (2), 289-96, 1998. 0 locus do serotipo A:1 contém quatro grelhas de leitura aberta (ORFs) na região 1 3 (hexA, hexB, hexC e hexD) , cinco ORFs na região 2 (hyaA, hyaB, hyaC, hyaD e hyaE), e duas ORFs na região 3 (phyA e phyB) .

Em determinadas formas de realização, as bactérias mutantes não compreendem quaisquer genes de resistência a antibióticos ou ADN estranho, o que aumenta a sua atracção ambiental e ecológica. É descrito, no Exemplo 1, um método para produção de mutantes de deleção, mas podem ser utilizados quaisquer outros métodos conhecidos na técnica para a produção de mutações de deleção. São também divulgados no Exemplo 1 testes simples para confirmar que os mutantes possuem um fenotipo acapsular.

As bactérias P. multocida com qualquer deleção de todo ou de uma parte do gene hyaE estão dentro do âmbito da invenção desde de que a deleção atenue a bactéria. Numa forma de realização, a mutação de deleção resulta na deleção dos aminoácidos 239-359 da proteína hyaE (i. e., nenhum dos aminoácidos 239-359 está presente na proteína hyaE codificada). Noutras formas de realização, a grelha de leitura aberta do hyaE mutado compreende a SEQ ID N°:7 ou SEQ ID N°:8.

Uma bactéria mutante encontra-se atenuada se, após exposição à bactéria mutante, for necessário um aumento na dosagem de P. multocida do tipo selvagem para matar metade das espécies alvo susceptíveis (i. e., a LD50 aumenta) e/ou existir uma redução nas lesões patológicas (e. g., pneumonia) após exposição das espécies alvo à bactéria mutante comparado com a exposição à bactéria do tipo selvagem, e/ou existir uma redução na colonização comensal de superfícies mucosas em que reside P. multocida após exposição das espécies alvo à bactéria mutante quando comparado com a exposição a uma bactéria do tipo selvagem. 4 A atenuação pode ser avaliada de várias maneiras como é conhecido na técnica. Por exemplo, para doença septicémica (tal como, cólera aviária), as espécies susceptiveis podem ser expostas a organismos do tipo selvagem por via intranasal, intravenosa, intramuscular ou intraperitoneal, e a dosagem necessária para provocar doença pode ser comparada entre organismos do tipo selvagem e mutantes. Para doença pneumónica, podem-se expor animais susceptiveis a organismos do tipo selvagem por via intranasal, intratraqueal ou intrapulmonar e comparar a extensão e gravidade dos sintomas clínicos e lesões patológicas entre animais expostos ao mutante e ao tipo selvagem. Para colonização das mucosas, os animais podem ser expostos a organismos do tipo selvagem por via oral, intranasal, ou intra-amigdalar e pode ser comparado o número de organismos encontrados no muco nasal ou nos espécimes de lavagem amígdalar a intervalos de tempo após a exposição.

Preparações de vacina

As vacinas compreendendo bactérias mutantes podem ser administradas por si só ou como um componente de uma vacina polivalente, i. e., em combinação com outras vacinas. As bactérias mutantes numa formulação de vacina podem estar vivas ou mortas; tanto as bactérias vivas como as mortas podem ser liofilizadas e, opcionalmente, reconstituídas como é conhecido na técnica. As vacinas podem ser convenientemente proporcionadas em kits, que também podem compreender etiquetas e instruções apropriadas para a administração de uma vacina a um sujeito animal (e. g., gado, um ungulado, um animal de companhia) ou uma ave (e. g., aves domésticas). 5

As vacinas que compreendem mutantes acapsulares podem conter também transportadores farmaceuticamente e veterinariamente aceitáveis. Tais transportadores são bem conhecidos para os peritos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente, tais como proteínas, polissacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, e partículas virais inactivas. Podem ser também utilizados, numa vacina, sais farmaceuticamente e veterinariamente aceitáveis, por exemplo, sais minerais, tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos, ou sulfatos, assim como os sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, proprionatos, malonatos ou benzoatos. As vacinas também podem conter líquidos, tais como água, soro fisiológico, glicerol e etanol, assim como substâncias, tais como agentes humidificantes, agentes emulsificantes, ou agentes tamponantes de pH. Podem ser também utilizados lipossomas como transportadores para bactérias mutantes. Ver Patente U.S. 5422120, documento WO 95/13796, documento WO 91/14445 ou documento EP 524968 BI.

Se desejado, pode ser adicionado um adjuvante a uma vacina. Os adjuvantes úteis incluem, sem limitação, tensioactivos (e. g., hexadecilamina, octadecilanina, lisolecitina, brometo de di-metildioctadecilamónio, di-amina de N,N-dioctadecil-n'-N-bis(2-hidroxietil-propano) , metoxi-hexadecilglicerol, e polióis plurónicos); polianiões (e. g., pirano, sulfato de dextrano, poli IC, ácido poliacrílico, carbopol), péptidos (e. g., dipéptido muramil, dimetilglicina, tuftsina), emulsões oleosas, alúmen, e suas misturas. 6

Tratamento de mamíferos, particularmente, gado, ungulados e animais de companhia "Mamíferos" inclui monotrématos (e. g., ornitorrinco), marsupiais (e. g., canguru), e placentários, que incluem gado (animais domésticos criados para carne, leite, ou fibra, tais como porcos, ovelhas, vacas, e cavalos) e animais de companhia (e. g., cães, gatos). "Ungulados" inclui, mas não está limitado a, vacas (animais bovinos), búfalo de água, bisonte, ovelhas, porcos, veados, elefantes e iaques. Cada um destes inclui tanto adultos como formas em desenvolvimento (e. g., vitelas, leitões, cordeiros, etc.). As bactérias da invenção podem ser administradas a mamíferos adultos ou em desenvolvimento, de modo preferido gado, ungulados ou animais de companhia.

Um método conveniente de distribuição de uma bactéria da invenção a mamíferos (tais como gado, ungulados, ou animais de companhia) é por administração oral (e. g., na alimentação ou água de beber ou num isco). É particularmente conveniente revestir ou misturar ração com as bactérias. Tipicamente, os animais de grande porte (e. g., gado/ungulados, tais como vacas) recebem doses com cerca de 106, 5 X ΙΟ6, 107, 5 x ΙΟ7, 108, 5 x ΙΟ8, 109, 5 x 109, ou IO10 cfu; cerca de 108, 5 x ΙΟ8, 109, 5 x 109 cfu se a ração for revestida. Podem ser administradas doses de cerca de 106 até cerca de 108, cerca de 2 x 10β até cerca de 3 x 108, cerca de 2,4x 106 até cerca de 2,6 x 108, cerca de 104 até cerca de 106 cfu ou de cerca de 104 até cerca de 109 cfu. As doses podem ser ajustadas para gado/ungulados mais pequenos, tais como ovelhas (e. g., cerca de 104, 5 x ΙΟ4, 105, 5 χ 105, 106, 5 χ ΙΟ6, 107, 5 χ ΙΟ7, 108, 5 χ 108 cfu) . Podem ser facilmente deduzidos regimes de dosagem análogos para animais de companhia. 7

Apesar da via oral ser preferida por facilidade de distribuição, também podem ser utilizadas outras vias para vacinação. Estas incluem sem limitação, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intranasal, intrabronquial, etc. As bactérias da invenção podem ser implantadas no ouvido. As bactérias também podem ser administradas por pulverização, por inoculação no olho, ou por escarificação.

Tratamento de aves "Aves" inclui aves selvagens (e. g., aves cinegéticas) e domesticadas (e. g., aves domésticas ou aves de estimação) e inclui quer adultos quer formas em desenvolvimento (e. g., aves acabadas de nascer, pintos, frangos, etc.). "Aves domésticas" ou "galináceos domésticos" inclui todas as aves mantidas, capturadas, ou domesticadas para carne ou ovos, incluindo galinhas, perus, avestruzes, galinhas "Cornish Rock", pombos, galinhas da índia, faisões, codornízes, patos, gansos e émus.

As bactérias da invenção podem ser administradas a uma ave por qualquer técnica conhecida ou convencional, incluindo injecção mucosal ou intramuscular. Numa incubadora, as bactérias podem ser administradas utilizando técnicas, tais como vacinação in ovo, vacinação por pulverização, ou vacinação subcutânea. Na quinta, as bactérias podem ser administradas utilizando técnicas, tais como escarificação, vacinação por pulverização, vacinação por gotas nos olhos, vacinação na água, vacinação na ração, vacinação na membrana alar, vacinação subcutânea e vacinação intramuscular.

As doses eficazes dependem do tamanho da ave. As doses estão no intervalo e podem variar, por exemplo, desde cerca de CM O Λ-1 5 x CM o τ—1 103, 5 x ΙΟ3, 104, 5 x ΙΟ4, 105, 5 x 105, 106, 107, 5 x 107, 108, 5 x ΙΟ8, 109, até 5 x 109 cfu. 0 acima divulgado descreve, de modo geral, a presente invenção. Uma descrição mais completa pode ser obtida por referência aos seguintes exemplos específicos, que são apresentados apenas para fins de ilustração e não se pretende que limitem o âmbito da invenção. EXEMPLO 1

Produção de mutantes acapsulares de deleção de hyaE de P. multocida

Os mutantes de P. multocida das estirpes 1059 (aviária, serotipo A:3) e 1062 (bovina, serotipo A:3) foram produzidos por deleção da região codificante dos seus genes hyaE, o que bloqueou a síntese do bloco de construção capsular N-acetil-D-glucosamina. As regiões codificantes dos genes hyaE 1059 e 1062 (respectivamente, SEQ ID Nos: 5 e 6) foram obtidas por amplificação por PCR, utilizando o iniciador de sentido directo 5'-ATGAAAAAGGTTAATATCATTGG-3' (SEQ ID N°:l) e o iniciador de sentido reverso 5'-TTAACCTTGCTTGAATCGTTTACC-3' (SEQ ID N°:2). Todos os iniciadores foram sintetizados com um sintetizador de oligonucleótidos (Applied Biosystems Inc.) pela Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA. As reacções de PCR foram efectuadas utilizando o Kit de PCR GeneAmp LX (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) num termociclador Perkin Elmer

GeneAmp 9600. As condições de reacção foram 30 ciclos, com 30 9 segundos a 95 °C, 45 segundos a 48 °C, e 60 segundos a 72 °C por ciclo.

Os dois fragmentos hyaE produzidos por PCR tiveram início nos seus codões de início Met e terminaram nos seus codões de terminação. Os fragmentos de PCR foram ligados em pCR2.1 (Invitrogen Inc., La Jolla, CA) e electroporados na estirpe de E. coli DH11S (Life Technologies, Rockville, MD), o que produziu os plasmídeos pCR2.lhya£1059 e pCR2.lhyaE1062. As duas construções plasmídicas foram isoladas pelo método alcalino SDS, seguidamente purificadas por centrifugação em CsCl utilizando métodos convencionais. Ambas as cadeias de ambos os genes hyaE foram sequenciadas utilizando o kit "Dye Terminator Chemistry" da PE Applied Biosystems. As amostras foram introduzidas num Sequenciador de ADN ABI Prism 377 na "Nucleic Acids Facility, Iowa State University, Ames, IA".

Os genes estruturais hyaE de cada estirpe tinham 1869 bp de comprimento. Devido a variações na sequência, encontradas principalmente na extremidade 3' da região codificante, foram construídos plasmídeos hyaE únicos de substituição para cada estirpe de modo a modificar as duas estirpes mutantes de P. multocida. Foram conseguidas deleções exactas em cada gene hyaE contido nos plasmídeos pCR2.lhyaP1059 e pCR2.lhya£1062 por PCR utilizando os iniciadores de deleçâo 5'- AAAGATATCTTGGTTTACTTCAATAATTTC-3' (SEQ ID N°:3) e 5'-AAAGATATCACTGCATCTGTTCAATCAACGAGC-3' (SEQ ID N°:4). Os iniciadores de deleção emparelham com o gene clonado com uma distância de aproximadamente 300 pares de bases mas a extensão faz-se para o exterior, em direcção ao vector plasmídico, em vez de para o interior. A reacção de PCR amplifica o vector de clonagem completo e duas extremidades da inserção génica mas não 10 a "deleção" de aproximadamente 300 pares de bases. O produto de amplificação é linear, com os dois fragmentos do gene hyaE nas extremidades e o vector plasmídico no meio. Os iniciadores possuem sítios EcoRV (GATATC) nas suas extremidades 5'. As extremidades do produto de amplificação linear, por conseguinte, possuem sítios EcoRV. Ver Figuras IA e 1B.

Os fragmentos de PCR resultantes foram sujeitos a digestão com a enzima de restrição EcoRV para remoção de sequências específicas das suas extremidades. Cada fragmento foi seguidamente ligado para produzir deleções em grelha excisando os nucleótidos 715 até ao 1082. Foi inserido um ligante de oito pares de bases Smal (5'-CCCCGGGG-3') no sítio de deleção EcoRV de P. multocida 1062 para garantir que a mutação resultaria num fenotipo acapsular. Tal ADN não foi inserido no sítio de deleção da inserção P. multocida hyaE 1059.

As sequências nucleotídicas dos fragmentos hyaE 1059 e 1062 mutados são apresentadas, respectivamente, nas SEQ ID Nos: 7 e 8. Tanto no 1059 como no 1062, os aminoácidos 239 até ao aminoácido 359 da proteína hyaE foram excisados. Adicionalmente, o aminoácido em ambas as estirpes na posição anteriormente 360 foi alterado de leucina para isoleucina. A estirpe 1062 recebeu 8 aminoácidos adicionais no sítio de deleção imediatamente a montante da posição anteriormente 360 (Pro Arg Gly Pro Gly Ala Pro Gly; SEQ ID N°:9).

Os fragmentos hyaE mutados foram subclonados em sítios EcoRl no sítio de clonagem múltipla do plasmídeo pBCSK (Strategene Inc.), seguido da inserção do elemento de resistência à canamicina Tn903 nos sítios BamHI adjacentes para produzir, respectivamente, pBCSKAhyaPkanr1059 e 11 pBCSKAhya£kanr1062. A construção dos plasmídeos de substituição foi concluída pela ligação de fragmentos AhyaEkanr produzidos por BssH2 de 1059 e 1062 com as origens de replicação sensíveis à temperatura de 1,2 kb de pBB 192 excisadas do sítio BssE2 de pBCSK (Stratagene, Inc.)· Ver Patente U.S. 5840556. Uma vez que a origem ColEl se encontra inactiva em P. multocida, apenas os produtos de ligação que produzem plasmídeos pl92oriAbya£kanr1059 ou pl92oriAbyaEkanr1062 foram capazes de replicar nos hospedeiros.

Os plasmídeos de substituição foram introduzidos nas estirpes de P. multocida adequadas por electroporação. As células foram cultivadas em meio líquido de Columbia, seguidamente preparadas para electroporação pelos passos seguintes. O produto em cultura foi sedimentado por centrifugação a 5000 x g durante 15 minutos e lavado uma vez em 100 mL de sacarose a 272 mM a 0 °C. O sedimento celular foi ressuspendido (1:3 bactérias compactadas:sacarose a 272 mM) em gelo. As bactérias competentes (100 pL) foram misturadas numa cuvete de electroporação de 0,1 cm (Bio-Rad) com 200 ng de ADN plasmídico que foi não-metilado ou metilado in vitro utilizando Hhal. Imediatamente após a adição de ADN, as células foram electroporadas (Gene pulser, Bio-Rad) a 18.000 V/cm, 800 ohm, e 25 mFd, com as constantes de tempo resultantes variando desde 11 até 15 mseg.

Foi adicionado meio líquido de Columbia (1 mL, 0 °C) às células electroporadas, e as ressuspensões foram incubadas a 25 °C durante aproximadamente 25 minutos. As células foram recuperadas a 30 °C durante 2 horas e foram seguidamente plaqueadas em placas de Columbia agar contendo 50 pg/mL de canamicina. As colónias eram visíveis após 24 horas de incubação 12 a 30 °C. As células transformadas foram cultivadas a 30 °C de um dia para o outro em meio liquido contendo canamicina. As células foram seguidamente plaqueadas em placas de dextrose amido agar com 50 pg/mL de canamicina e cultivadas a 3 °C durante 24 horas.

As células possuindo plasmideos integrados sobreviveram à selecção por antibiótico à temperatura não-permissiva para a replicação plasmidica, e estas podiam ser identificadas porque a integração de plasmideo de substituição resultou num fenotipo acapsular. A distinção entre colónias capsulares e acapsulares de P. multocida das estirpes 1059 e 1062 cultivadas em placas de dextrose amido agar foi facilmente executada. As colónias capsulares do tipo selvagem das duas estirpes possuem ácido hialurónico, o principal componente da cápsula, que dão às colónias uma aparência mucóide; quando visualizadas sob luz transmitida obliquamente, estas colónias apresentam iridescência tipo pérola. Ao contrário, os mutantes acapsulares de "crossover" único são não-mucóides e não-iridescentes.

Os mutantes de "crossover" único foram transferidos para 5 mL de meio liquido Columbia sem suplemento antibiótico e incubados a 30 °C durante a noite para separar o plasmideo do cromossoma. O produto em cultura foi transferido para placas de dextrose amido agar sem antibiótico suplementar as quais foram incubadas a 38 °C durante 12 horas. O teste inicial para identificação de mutantes de "crossover" duplo envolveu o plaqueamento de réplicas de conjuntos de células que pareciam acapsulares em placas de dextrose amido agar, com ou sem antibiótico, e cultivar as células a 38 °C. As colónias acapsulares que não cresceram nas placas com antibiótico foram submetidas a análise por PCR utilizando os iniciadores hyaE em sentido directo e reverso. Os tamanhos dos produtos de PCR foram 13 comparados com os do parente de tipo selvagem utilizando electroforese em gel de agarose.

Os mutantes de deleção de hyaE de P. multocida 1059 e 1062 suspeitos foram também analisados quanto à presença do gene de resistência à canamicina. Os mutantes putativos possuindo deleções "limpas" de hyaE foram privados de sequências de resistência ao antibiótico. Foram utilizados um ensaio enzimático por difusão de disco (Kirby-Bauer test, Bauer et al.r Am. J. Clin. Path. 45, 493-96, 1966) e um teste de coloração com tinta da índia (Collins & Line, MICROBIOLOGICAL METHODS, Butterworths, Boston, Mass., 1976, p. 110) para confirmar que os dois mutantes hyaE possuíam um fenotipo acapsular. EXEMPLO 2

Vacinação de perus jovens com a estirpe 1059 AhyaE de P. muitocida A atenuação da estirpe 1059 AhyaE de P. multocida foi avaliada em perus jovens brancos de peito largo com três semanas de idade. Foram injectados, intramuscularmente, grupos constituídos por quatro perus jovens com diluições em série de 10 vezes de culturas em fase exponencial de crescimento do tipo selvagem ou culturas de mutantes acapsulares suspendidas em meio líquido tripticase (0,1 mL) . Os perus jovens foram observados durante 7 dias após o desafio.

Os valores de LD50 (i. e., a quantidade de bactérias necessárias para matar metade dos perus jovens) foram <103 organismos para perus jovens injectados com a estirpe do tipo 14 selvagem e mais do que 107 organismos para perus jovens injectados com o mutante hyaE. EXEMPLO 3

Vacinação de vitelos castrados com a estirpe EhyaE 1062 de P. multocida

Seis vitelos castrados Holstein, aproximadamente de 500 libras, foram expostos ao mutante acapsular EhyaE 1062 de P. multocida. As estirpes foram administradas quer por injecção subcutânea no pescoço (108 cfu) ou por revestimento da ração (109 cfu) . Não se observou reacção adversa a qualquer das exposições. Os animais vacinados na mucosa apresentaram colónias nas amígdalas palatinas durante o tempo restante do teste (5 semanas). O desafio intratraqueal com a estirpe virulenta parente (dose total de IO10 cfu em 15 mL) provocou febres passageiras (1-2) dias em vitelos controlo mas poucas ou nenhumas alterações pneumónicas 10 dias após o desafio em animais controlo ou vacinados. 15

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS 110> Biotecnology Research Development Corporation

Os Estados Unidos da América, representados pelo Departamento de Agricultura <120> Mutantes acapsulares de deleção de hyaE de P. multocida <151> 2003-07-02 < 16 0 > 9 <170> FastSEQ para Windows Version 4.0

<210> 1 <211> 23 <212> ADN <213> P. multocida < 4 0 0 > 1 atgaaaaagg ttaatatcat tgg 23 <210> 2 <211> 24 ,

<212> ADN <213> P. multocida < 4 0 0 > 2 16 24 ttaaccttgc ttgaatcgtt tacc

<210> 3 <211> 30 <212> ADN <213> P. multocida < 4 0 0 > 3 aaagatatct tggtttactt caataatttc 30

<210> 4 <211> 33 <212> ADN <213> P. multocida < 4 0 0 > 4 aaagatatca ctgcatctgt tcaatcaacg age 33

<210> 5 <211> 1870 <212> ADN <213> P. multocida < 4 0 0 > 5 17 tatgaaaaag gttattatca ttggâcatas acagtetaae tateaagatg fctg&aaaggt <50 ttttcaatgt tatgggatga atessçcgct tccatcaaaa cgtgaaaaaa tgtççcéããt 120 çgáaãttggç cãtgtgçttã âKâaagtat£ aeeaa$fc<stt f&gcaeãe&e ctaaaaatgt £$0 atcttfcactt tctaataaga aaagcaaaat aaaaaaaggg aattcagcea aaaataaatc .240 teataageae gctaaaasga acacaataca aacgacttcg agcatcsggg afcaacttatc 300 fcctcgatttg atgctcgcga atãtcgagca aaatttttgg ggatggtctg atcctaatgc 300 aãtteaaata ttagãttatt gggetaacct tgacccaaaç atsastttçg tctttgttta 420 tgatiaagçça g&aaatfcfcafc tnnããtátc» tãgettágáa gaggctctca ããttagataa 480 acacasegta cããgaããaat etgaagagtg fcaaacetac aatgaaaaaa tcctaactfea $40 ctttaataaa tataaagstç gtagtgtafct actgaafcacg caacaacfcce aaaatactaa 400 aaaaacatca ctgtctgaaa tttataaaca fcatttctgca cctgatgcat fcagtcaaaaa €60 âctgãatgsa ecfctctstsa afcaaagagat ggaaattatt gaagt.aaage aagafcttate 720 tcaccaagsa çaafcgtccsc tgtetaactt tafctgtfcagc eaãáttataa aasat-tctcc '780 tacte&t^cg caeatatatg aagaattaca gtcgoafcsrcfc gatctgcctfc atattfecaffa 040 acaaaaatta gtaaafcgatg ecgatttfcgc fcetcettgca tggaaagata tgattcaaaa 800 a«a«.gtcgat gca&steast ateaâcatgâ aaaagaatta gaacttagca gaataaaaga 980 acgtcetafct» graggtcacaçf agaaatatca attgacggaa caaaaactgt cagaaacaca 1020 aaaagaaatc ga&e&a&t&a aagatgaa&s tagaaaagta aaat:<?*:gaaa aagcaaaacfc 1080 cactocatct gfcfeaaatesa egagaaaaat açtttçtgag aasgaaaaag agafctfcefctg .1:140 cataaaaagt gaaaataesa agâttaaaga agaaaaaatt a&aatfcsatg aagcataccsa 1203 cttaaccaag «aaacetfcgt çggstaaaga aaaagccctc aaaaegcate aagatg&aae 1260 fcgaagegcte aagataafcfcfc. ttaatgaaaa tafcfctccgta eaagaasafc» tgcaagááaa 1320 atttaaggaa aacaatããàa gããáácaaga act&gâacãâ gagecaaa&g cc&gmçgggs 1300 fcfc&tt&íjae.a. çagisasaçag ecaaaaaacc caagfcatet.g agfccttfcaga 1440 aaafcgaaaat iaaagtgttat fcagctcaact ecaactcatt caagaagaafc tãgaaa&aet 1500 ttatattgac aafccaagtat taaaagctaa accacgcctt tacggtgeag etgategeai 1560 ssaaaaccaa ttaacttatç gaefcaggfcta caa&atacaá agácáigg&á gaagtctaíífc 1820 tggt;ct;«att tuct&oatfc fceafcettstfc tttcacctat çtgggçttfca saagagagat 1600 gaaataagfcac gaatgsrs-sta ccctcceacc aattcacg&g tatgaagacg cgcataaagç 1140 asacagcatt aaaaseçatfc fcatettataa attgggtgts atatttttaa aagaaateaa 1800 .aaafcecgfctt aagtggstta ctefcccctta caaactgatt ãaaga&ggtã ââegattcãa 1860 gcaa.ggttaa 1010

<210> 6 <211> 1870 <212> ADN <213> P. multocida <400> 6 gttafcfcafcca fct^»C«.fcS& «çagteçaae tafceaagatg ttgaaaaggt 60 tttfceaatgt çstgggatga atoecccgct. fcccafccaaaa. egtgasasaa fcgfccecoe&t 120 egaaattggc catgtgctfca ataaagtatt aeeasgecfcfe gageaescac «taaaaatgt 180 &£et£feâett tefem&fcaaga aa&feaaaat aaaaaaaggg ããttcãgéca áá4ãtâ4ât« 240 tcataagcac gctããaacga ae&caataca sacs^cttgg sgçatçfe^fg afeããçttatç 300 tçtggatttg atgçfcçgoga atatcgagcs Haattttbgg ggaíjggtcí-g âtcctaatgc 360 aattcaasta fetagattatt gggctaacct ceaccoaaac âttcatttcg fcctttgttta 420 tgata.agcca çjaasâfcfcfeafc tccsatatea tagettagaa gaggctctca aattagataa 480 acacaccgta caagaaaaafc ttgaagagtg gcaaaoetac aatgasa&aa tcctaaçtta 548 ettítaataaa ts£.aasgavc gtagt-Qtat* acfegaatâcâ aaaeaacEcc aaaataetaa 600 18 aaaaaçatca çtgtotgaaa tfcfcafcaaaea tatttctgca eetg&t’.gea£ tagfceaaaaa <S$0 actg&atgaa çct.tç£:Cfc.aa atasagagat ggaaafcfcatt gaagtaaacc aagafcfctatc 720 fcCâfiSiàágãá gaâtgt.çcs.e tgfcefc&actt tattgfctagc e&aatfcataa aaaafctctcc 780 tactgtfcacg eagg&atatg aagaattaca gfcçgcatgct gafcctgcctt afcatfcfecagá 840 acaaaaatta gtaaatgatg ecgafcttfcge tctccttgca tggãããgãtâ tgafctcaáaá SOO acaagtcgat gcaafcteaat ateaacafcga aaaagaacfca gaactuagca caataaaaga SCO aeçftcaatta gaggteaoag agaaatatca actgacggaa eaaaaaetgfc cagaaacaca 1020 aaaagaaacc gaacaaatta aagafcgaaaa tagaaaagta «aafccfcgaaa aagcaaaact 1080 eacfcgcatct gttosafccas cgagrcaaaafc actttctgag aa&gaaaaag agatttefctg 1140 eafcaseaagfc gaaaefcabaa agattaaaga «gaaaaaatt aaasttgatg «agcafeaeca 1200 cttaa-ccaag aaaaccttgt cggataaaga aaaag«cctc sasacgçatc aagatgaaafe 1200 tgságcgetc aagataattt ttaatgasaa tafcfctaçgt» caagaagata fcgcaagaaaa 1320 attfceaggaa seeaar..aaaa g&aaacaaga actbgaaoaa gagctaaaag ceafcafccgga 1380 taagsaagca ttafctagaaa cagaaaaoag eeaaaaaaco caagtatctg agtcxstaga 1440 aaafcgaaaafc aaagtgtfcat zagctoaact ccsactcãtt caagaagaab tagaaaaact: 1500 ttafcattgac MfecM&tab taaaagctaa. aecaegcett; tacgg-fcgcag «cgatcgeat x$60 a.a,ftaaa.ceaa ttaafistate gactaggttta eaa&atacaa agaeatggaa gaagtctatt 1620 tggfccteat-t tttctteaçíí ttatettatfc tegeacfc&et ttgcgtttta aaaaag&gat 1680 gaaaaagfcac gaafcggaata ccctcccacc aattcacgâg tatgaagacar Cgô&fcaaágc 1740 aaaopgsatt aaaagceafcfc satctbafcaa attgggtgfcc atctttttac aagaaataaa 1800 aaatccgttt: aagtggctta etctccetta «aaaefcgafct «aagaaggta aacgafctcaa 1880

<210> 7 <211> 1507 <212> ADN <213> P. multocida <400> 7 ta.tgaã.«aag gfctsttatoa ttggacataa acagtctaae tstcsagatg fctgaaaaggfc gg ttfcfcra&atgs. tatgggatga. atççççeget tecatcaaaa cgtgaaaaaa tgtcccccat xjq cgaaãttggç catgtgctta ataaagtatt accaagtctt gageaeacsc ctaaaastgfc «tctttactt tctaataaga «aagcaaaat aaâãaaag^g aattcagcca. aaaataaatc 240 fceataagcac getsa.ascga açacaataca aacgacttcg agcatctggg ata&cttatc 3,|>q tctcgatttg istgctcgega atstcgagea aaattttegg ggatggfcctg afccetaafcgc açg

aatfcosáata tfcágafcfc&tfc gggcstaaeet tgacecaaac atteattfecg tctttgttta 42 D tgatsagcca gaasatbtat, tecaatatea fcagcfctagaa gaggctcfeca aattagâfcaa 48o acacaccflta caagaaaaat ttgaagagtg geaaaeefcsc aatgaaaaaa tcctaactta $4¾ ctfefca*'fca«R. tataasgatc gtagtgtatt acbgaataca «aecaa-ctcc aaaatactea fiõfí &aaaae&tca ctgtctgaaa tttataaaca tatfctctgca ectgatgcat tagtcaaaaa 460 actgaatgaa ççttcfcctaa ataaagagat ggaaattatt: gaagtaaacc aagatateae 720 tgcatctgtt «aa&caaega gcaaaataeb ttctgagaaa gaaaaagaga tttcttgcat 7βο aa<attagtgaa aatacaaaga ttaasgaágá aaaa&ttaaa attgatgaag cataccacfcfc 84 0 aaccaa.gaaa accttgtcgg ataaagaaaa agcccccsaa acgcatosag atgaaattga 50ô agcgctxíaag ataattbtta atgaaaatat ttçacgtacaa gaagatacgc aagsaaaatt 960 tcsggaaacc aataaaagaa aacaagaact- tgaacaagag ctaaaageca tatcggataa 102(3 gaaagcsatta ttagaaacag aaaacagcca. aaaaacwaa gtafcetgagfe ctttagaaaa ÍM& tgaaaataaa gtgt-tattag «fccaactcca aebcattcaa gaagaattag aaaaacttfca 1140 toattgacaafc csaagtattaa aagctaaacc acgcctfctac ggtgcagctg atcgcataaa 1300 aaaccaatfca aetfcatcgac feaggttacaa aatacaaaga cafeggaagaa gtcbafctbgg 1.260 fccfccabtfcfete cfetccfcttca tottattttt eaectatcfeg ggcfctfeaaaa gagagatgaa 1320 «aagfeacgaa tggaafeaaac fegmsaeaaat t«^<sgagfeat gasgacgcgc ataasgcaas 1380 ccgcattaaa agccatttat ctfcataaattfc gggtgtcatc tfettfcacaag aaafecaaaaa lâ#0 19 tecgfcttaag tggefctacfcc tcccfctacaa acfegafcfcaaa gaeggtaaae gattcaagca 1.S68 aggtfcaa 1507

<210> 8 <211> 1531 <212> ADN <213> P. multocida < 4 0 0 > 8 tatgaaaaag gttattatca fctgg&c&fcaa ac&gfcefcaae fcatcaagatg ttgaaaaggt 60 fc&fcgggatga afcçecfiçgçn tccateaaaa cgfcgsaaáâE tfcrfceccccat 120 cgaaa.fctggc cafcgtgcfcfca sta.s&gfcS-tt accaagççtt gagcacacac ctaasaatgt ISO atetttactt t-cSaataaga aaagçsaaat aa&aaaaggg aattcagcea «âã δ tv&íififcC 240 tcafcaageac gcfcaaaaega ac&ç&afcaaa âacgacfcfceg agcafcctggg staSCt.fcstC 300 tefcegafcfctg atgcfcegega afcatcgagcg aaatttifcgg gg&fcggfccfcg atccfcsatgc 360 aafeteaaata ttagattâtt gggetaaeet csgacccaasc attcafeticg tctttgttua 420 tgataageca ga.aasfc.fct:afc. tcsáátsteã fc&gefcfc&g&a. gaggcfccfcca a&ttagataa 480 acacacccgta csagaaaaisfc ttgaagagtg gcaaaccfe&e aatg-eaisaaa tcctaâcit.fcá 540 ctfctaafcsaa. tatâããgatcí gtsgtgt&tfc acfcgaafcaca. eaaemctae aaaafcaetaa 600 a.-ia&acatca ctgtctga&à fc&tttssigcs ççfcgatgeat fcagtcaaaaa §60 eet.fcçfcçtaa staaagagafc ggaaafc&afct gaagtaas.cc aagatccccg 720 gggçceeg®· gceeegefgga teacfcgcatc fcgtt.c3.atca acg&gcaaaa fcaettfccfcga 780 gaaagaaaaa .gsgatttctt geataaaââg· tga&a&taca aagatta&ag aag&aaaa&t 840 fcaaaat.fc.gafc ga&gcatacc &ct taaceaa eaaaacefefcg tcggataáág ââaáãgcadt 900 sasascgcafc çsagstg&áâ ttga&gegct cssgatastt fcttáãtgsaa atatttccgt 960 acsaga&gat atgcaafjwa aafcfctcagga aaceaafca&a agaaaacaas aacttgaaca 1020 agsgcfcaaaa gccat&tcgg ataagaaagc afctafctagsa acagaasaca gccaaaaaac 1000 ceaagt&tct gagfcctttaç amatg&a&a fcaaagfcgtfca fctagctcaac tecsactcat iiéte tca&ga&gaa ttagaa&aac tfcfc&fcafefcga ea&fccaagta ttaaa*$et& aaeeacgcet; 12# t.y «fafces&togrea taaáaaHcea stt&aeftt&fc egaefcaggfct ÍAG KÍfàti-rj. íÃC â. 12# sagaeafcgga. «.gaagtíJtat ttggtctcat tfettetteec cfcfcatcttat fcttgcacfcta i3^> ttfcgegfct.tfc sa&a&sgaga fcgas&aagfca accçfceecaç c&attcaega 13:8¾ CftS. L{fSa.Cj-rl C gcgcat&aag ca&accgeat ttatcttata a&tfcgggtgfc Miè" ç.ai.ct.t.t:fcLa cãâgaaãtcã â&âi&fc ' £ fcasgtggcfct sctctccctt aeaaactgat 1500 fcaaaga&ggfc as&ogafcfcca· agoaaggtfca a 153.1.

<210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial 20 <2 2 Ο > <223> aminoácidos inseridos <400> 9

Fro Arg Gly Gly &Ia Gly 1 5

Lisboa, 26 de Fevereiro de 2007 21

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Isolado da bactéria Pasteurella multocida (P. multocida) do serogrupo A que compreende a deleção de todo ou de uma parte de um gene hyaE, em que a deleção atenua a bactéria. que é do que é do que é do 7. Bactéria da reivindicação 1 em que da proteína hyaE são excisados.
2. Bactéria da reivindicação resistência a antibióticos.
3. Bactéria da reivindicação 1
4. Bactéria da reivindicação 1
5. Bactéria da reivindicação 1
6. Bactéria da reivindicação 1
8. Bactéria da reivindicação nucleotidica apresentada na
9. Bactéria da reivindicação nucleotidica apresentada na
10. Bactéria da reivindicação 1
11. Bactéria da reivindicação 1 1 que não compreende genes de que não compreende ADN exógeno, serotipo A:3. serotipo A:l. serotipo A:4. os aminoácidos 239-359 1 que compreende a sequência SEQ ID N°:7 . 1 que compreende a sequência SEQ ID N°:8. que está viva. que está liofilizada.
12. Bactéria da reivindicaçãol que está morta. 1
13. Vacina para induzir imunidade protectora contra P. multocida do tipo selvagem compreendendo: a bactéria de qualquer uma das reivindicações 1 a 12; e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
14. Vacina da reivindicação 13 que é embalada com instruções para administração da vacina a um ungulado para conferir imunidade protectora contra P. multocida do tipo selvagem.
15. Vacina da reivindicação 13 que é embalada com instruções para administração da vacina a uma ave para conferir imunidade protectora contra P. multocida de tipo selvagem.
16. Ração adequada para ungulados compreendendo a bactéria de qualquer uma das reivindicações 1 a 12.
17. Ração da reivindicação 16 que é embalada com instruções para administração da ração a ungulados para conferir imunidade protectora contra P. multocida do tipo selvagem.
18. Ração adequada para uma ave compreendendo a bactéria de qualquer uma das reivindicações 1 a 12.
19. Ração da reivindicação 18 que é embalada com instruções para administração da ração a uma ave para conferir imunidade protectora contra P. multocida do tipo selvagem.
20. Utilização da bactéria de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 na produção de um medicamento para conferir imunidade protectora a um ungulado ou ave contra P. multocida do tipo selvagem. 2
21. Utilização da reivindicação 20 em que o medicamento é para administração a um ungulado.
22. Utilização da reivindicação 21 em que o ungulado é um animal bovino.
23. Utilização da reivindicação 20 em que o medicamento é para administração a uma ave.
24. Utilização da reivindicação 20 em que o medicamento é para administração a uma ave e a ave é uma ave doméstica.
25. Utilização da reivindicação 20 em que o medicamento é para administração a uma ave e a ave é uma ave doméstica seleccionada do grupo constituído por galinha, peru, avestruz, galinha "Cornish Rock, pombo, galinha da índia, faisão, codorniz, pato, ganso, e ému.
26. Utilização da reivindicação 20 em que o medicamento é para administração a uma ave e a ave é uma galinha.
27. Utilização da reivindicação 20 em que o medicamento é para administração a uma ave e a ave é um peru.
28. Utilização da reivindicação 20 em que o medicamento é para administração subcutânea.
29. Utilização da reivindicação 20 em que o medicamento é para administração intramuscular. 3
30. Utilização da reivindicação 20 em que o medicamento administração oral. 31. Utilização da reivindicação 20 em que o medicamento administração por revestimento da ração. 32. Utilização da reivindicação 20 em que o medicamento administração intranasal. 33. Utilização da reivindicação 20 em que o medicamento administração a uma dose entre cerca de 104 e cerca cfu. 34. Utilização da reivindicação 20 em que o medicamento administração a uma dose entre cerca de 104 e cerca cfu. é para é para é para é para de 109 é para de 10ê Lisboa, 26 de Fevereiro de 2007 4