BRPI0410911B1 - Mutantes acapsulares de p. multocida por deleção de hyae - Google Patents

Description

"MUTANTES ACAPSULARES DE P. multocida POR DELEÇÃO DE HYAE" Este pedido reivindica o benefício do pedido co- pendente provisório N. de série No. 60/ ------- depositado em 2 de julho de 2003 sob o número de identificação do agente 000295.00015, e incorpora o mesmo a título de referência.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção se refere a mutantes acapsula- res de Pasteurella multocida e a vacinas que compreendem os mutantes.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Pasteurella multocida (P. multocida) é associada com uma variedade de doenças, incluindo meningo-encefalite do bezerro e do yearling, linfadenite do cordeiro, septice- mía do cavalo e muar, pasteurelose septicêmica (septicemia hemorrágica, barbone) bovina, pasteurelose suína, pasteure- lose septicêmica porcina, pneumonia e cólera aviário. Há a necessidade na técnica de vacinas efetivas que possam ser usadas para proporcionar uma imunidade prote- tora contra doenças causadas por P. multocida.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Uma modalidade da invenção consiste em uma bacté- ria Pasteurella multocida isolada (P. multocida) do grupo sérico A que compreende uma deleção de todo um gene hyaE ou de uma parte dele. A deleção atenua a bactéria.

Uma outra modalidade da invenção consiste em uma vacina para induzir imunidade protetora contra P. multocida do tipo selvagem. A vacina compreende bactéria P. multocida do grupo sérico A que compreende uma deleção de todo um gene hyaE ou de uma parte dele e um veículo farmaceuticamente a- ceitável. A mutação por deleção atenua a bactéria.

Uma outra modalidade da invenção consiste em ra- ções adequadas para mamíferos (inclusive gado, ungulados e animais de estimação) ou aves (de preferência aves domésti- cas) que compreendem uma bactéria P. multocida do grupo sé- rico A que compreende uma deleção de todo um gene hyaE ou de uma parte dele. A mutação atenua a bactéria.

Uma outra modalidade da presente invenção consiste em um método de indução de imunidade protetora contra P. multocida do tipo selvagem. Uma bactéria P. multocida do grupo sérico A é administrada a um animal paciente tal como um mamífero (incluindo gado, ungulados, e animais de estima- ção) ou a uma ave (incluindo aves domésticas) . A bactéria compreende uma deleção de todo um gene hyaE ou de uma parte dele, que atenua a bactéria. A bactéria confere assim ao a- nimal paciente uma imunidade protetora contra P. multocida do tipo selvagem. A invenção assim proporciona ferramentas e métodos para induzir uma imunidade protetora contra doenças causadas por P. multocida.

DESCRIÇÃO SUCINTA DA FIGURA A Figura 1 Ilustração da construção de mutantes por deleção de hyaE. A Figura IA mostra esquematicamente a deleção planejada. A Figura 1B mostra o plasmídeo contendo a parte inserida com hyaE deletado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO os mutantes acapsulares por deleção de hyaE de P. multocida do grupo sérico A podem ser administrados a mamí- feros (incluindo gado, ungulados e animais de estimação) e aves (incluindo aves domésticas) para proporcionar uma imu- nidade protetora com P. multocida do tipo selvagem, para prevenir ou reduzira gravidade de doenças tais como septice- mia hemorrágica ou pneumonia em gado, em ungulados e em ani- mais de estimação e para prevenir ou reduzir a gravidade de cólera aviário em aves, especialmente de aves domésticas, respectivamente. Os termo "mutante(s) acapsular(es)", "bac- téria (s) acapsular(es)" e "bactéria(s) mutante(s)" são usa- dos e modo intercambiãvel nesta descrição.

Mutantes acapsulares de P. multocida do grupo sé- rico A por deleção de hyaE.

Os mutantes acapsulares de P. multocida do grupo sérico A por deleção de hyaE (sorotipos A:l, A: 3, A: 4, por exemplo) podem ser gerados por mutagênese do gene hyaE no lócus biossintético da cápsula. Os genes do lócus biossinté- tíco da cápsula no grupo sérico A são conhecido e já foram completamente seqüenciados. Chung et al., FEMS Microbiol.

Lett. 166(2) 189-96, 1998. 0 lócus do sorotipo A:1 contém quatro quadros de leitura aberta (ORFs) na região 1 (hexA, hexB, hexC e hexD) , cinco ORFs na região 2 (hyaA, hyaE, hyaC, hyaD e hyaE) e dois ORFs na região 3 (phyA e phyB) .

Em determinadas modalidades, as bactérias mutantes não compreendem nenhum gene de resistência a antibiótico nem DNA exógeno, o que aumenta o seu atrativo do ponto de vista ambiental e ecológico. Um método de se gerar mutantes por deleção é descrito no Exemplo 1, mas qualquer outro método conhecido na técnica pode ser usado para gerar mutações por deleção. Testes simples para a confirmação de que os mutan- tes têm um fenótipo acapsular são também descritos no Exem- plo 1.

As bactérias P. multocída com qualquer deleção de todo gene hyaE ou parte dele incidem no âmbito da invenção, desde que a deleção atenue a bactéria, em uma modalidade, a mutação por deleção resulta na deleção dos aminoãcidos 239- 359 da proteína hyaE (isto é, nenhum dos aminoãcidos 239-259 se encontra presente na proteína hyaE codificada). Em outras modalidades, o quadro de leitura aberta do hyaE que sofreu mutação compreende a SEQ ID NO: 7 ou a SEQ ID NO: 8.

Uma bactéria mutante é atenuada, se, depois de ex- posição à bactéria mutante, for necessária uma aumento na dosagem do P. multocída do tipo selvagem para destruir a me- tade do espécie alvo suscetível (isto é, o LDS0 aumento) e/ou hã uma redução nas lesões patológicas (pneumonia, por exemplo) depois de exposição da espécie alvo a bactéria mu- tante, em comparação com a exposição a uma bactéria do tipo selvagem e/ou há uma redução na colonização comensal de su- perfícies mucosas onde P. multocída reside depois da exposi- ção da espécie alvo à bactéria mutante em comparação com ex- posição a uma bactéria do tipo selvagem. A atenuação pode ser avaliada por diversos meios conforme é conhecido na técnica. Para a doença septicêmica, (tal como cólera aviário), por exemplo, espécies suscetíveis podem ser expostas a organismos do tipo selvagem por vias intranasal, intravenosa, intramuscular ou intraperitoneal e a dosagem necessária para causar doença entre os organismos do tipo selvagem e mutante podem ser comparadas. Para a do- ença pneumônica, pode -se expor animais suscetíveis a orga- nismos do tipo selvagem por vias intranasal, intrataqueal, ou intrapulmonar e compara a extensão e gravidade dos sinto- mas clínicos e lesões patológicas entre animais expostos ao mutante e ao tipo selvagem. Para a colonização mucosa, os animais podem ser expostos aos organismos do tipo selvagem por vias oral, intranasal ou intratonsilar e pode-se compa- rar os números de organismos recuperados de amostras de la- vagem de mucosa nasal ou tonsilar a intervalos depois da ex- posição.

Preparados de vacina As vacinas compreendendo bactérias mutantes podem ser administradas sozinhas ou como um componente de uma va- cina polivalente, isto é, em combinação com outras vacinas.

As bactérias mutantes em um preparado de vacina podem estar vivas ou mortas; tanto as bactérias vivas como as mortas po- dem ser liofilizadas, e, opcionalmente, reconstituídas con- forme é conhecido na técnica. As vacinas podem ser conveni- entemente providas em kits, que também podem compreender ro- tulações e instruções adequadas para a administração de uma vacina a um paciente animal (gado, um ungulado, um animal de estimação, por exemplo) ou a uma ave (ave doméstica, por e- xemplo).

As vacinas que compreendem mutantes acapsulares podem também compreender veículos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico e veterinário. Tais veículos são bem co- nhecídos pelos versados na técnica e incluem, sem limitação, macromoléculas de metabolismo lento, tais como proteínas, polissacarídeos, ácidos polilãticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoãcidos e partí- culas de vírus inativo. Os sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico e veterinário podem também ser usados na vaci- na, sais minerais tais como cloridratos, bromidratos, fosfa- tos ou sulfatos, por exemplo, assim como sais de ácidos or- gânicos tais como acetatos, propionatos, malonatos ou benzo- atos. As vacinas podem também conter líquidos tais como á- gua, solução salina, glicerol e etanol, assim como substân- cias tais como agentes umectantes, agentes emulsificante, ou agente de tamponamento de pH. Podem também ser usados lipos- somas como veículos para bactérias mutantes. Veja as paten- tes U.S. No. 5.422.120, WO 95/13796, WO 91/14445, ou EP 5244.968 BI.

Se for desejado pode se acrescentar um adjuvante a uma vacina. Os adjuvantes úteis incluem, sem limitação, ten- soativos (hexadecilamina, octadecilamina, lisolecitina, bro- meto de dimetil dioctadecil amonio, N,N-dioctadecil-n'-N- bis (2-hidróxi-etíl-propano diamina), metóxi hexadecil- glicerol e polióis plurônicos, por exemplo); poliânions (pi- rano, sulfato de dextrano, poli IC, ácido poliacrílico, car- bopol, por exemplo), peptídeos (muramil dipeptídeo, dimetil- glicina, tuftsin, por exemplo), emulsões oleosas, alume e suas misturas.

Tratamento de mamíferos, especialmente de gado, ungulados e animais de estimação "Mamíferos" incluem monotremos (ornitorrinco, por exemplo), marsupiais (canguru, por exemplo), e placentários, que incluem gado (animais domésticos criados para alimento, leite ou fibra tais como suínos, ovinos, bovinos e eqüinos) e animais de estimação (cães, gatos, por exemplo). "Ungula- dos" incluem, sem limitação, gado bovino (bovinos), búfalos, bisões, ovelhas, porcos, cervos, elefantes e iaques. Cada um destes inclui tanto formas adultas como em desenvolvimento (bezerros, porquinhos, cordeiros, por exemplo, etc.). As bactérias da presente invenção podem ser administradas tanto a mamíferos adultos como em desenvolvimento, de preferência, gado, ungulados ou animais de estimação.

Um método conveniente de se administrar uma bacté- ria da invenção a mamíferos (tais como gado, ungulados ou animais de estimação) é por administração oral (na ração ou na água de beber ou em isca, por exemplo) . É especialmente conveniente se cobrir ou misturar a ração com a bactéria.

Tipicamente animais de porte (gado/ungulados, tais como bo- vinos, por exemplo) recebem doses de IO6, 5 x 10S, 107, 5 x 10 , 108, 5 x ίο8, 109, 5 x 1Q9, ou IO10 cfu; aproximadamente 108, 5 x ίο8, 109 ou 5 x 109 cfu se a ração recebe uma cober- tura. Podem ser dadas doses de aproximadamente 1Q5 a aproxi- madamente 10a, de aproximadamente 2 x 106 a aproximadamente 3 x 108, aproximadamente 2,4 x 106 a aproximadamente 2,6 x 10a, de aproximadamente 104 a aproximadamente 106 cfu ou de aproximadamente 104 a aproximadamente 109 cfu. As doses po- dem ser ajustadas para gado/ungulados de menor porte tal co- mo ovino (de aproximadamente 104, 5 x ΙΟ4, 105, 5 x 10S, 106, 5 χ ΙΟ5, ΙΟ7, 5 χ ΙΟ7, ΙΟ8, 5 χ 10® cfu, por exemplo) . Regi- mes de dosagem análogos podem ser facilmente deduzidos para animais de estimação.

Embora a via oral seja a preferida para facilidade de fornecimento, outras vias para a vacinação podem também ser usadas. Estas incluem, sem limitação, via subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intranasal, intra- bronquial etc. As bactérias da invenção podem ser implanta- das no ouvido. As bactérias podem também ser administradas por pulverização, por inoculação ocular, ou por escarifica- ção.

Tratamento de aves "Aves" incluem aves selvagens (aves de caça, por exemplo) e domesticadas (aves domésticas ou de estimação) e inclui tanto formas adultas como em desenvolvimento (pintai- nhos, pintos, peruzinho, por exemplo, etc.) "Aves domésti- cas" incluem todas as aves, mantidas, coletadas ou domesti- cadas para obtenção de carne ou ovos, incluindo galinha, pe- ru, avestruz, galinha de caça, pombo, galinha de angola, faisão, codorna, pato, ganso e ema.

As bactérias da presente invenção podem ser admi- nistradas a uma ave por qualquer técnica conhecida ou pa- drão, incluindo por injeção mucosa ou intramuscular. Em um incubadora, podem ser administradas bactérias que empregam técnicas tais como vacinação in ovo, vacinação por pulveri- zação ou vacinação subcutânea. Na granja, as bactérias podem ser administradas usando-se técnicas tais como escarifica- ção, vacinação por pulverização, vacinação por gota ocular, vacinação em água, vacinação na ração, vacinação na trama da asa, vacinação subcutânea e vacinação intramuscular.

As doses efetivas dependem do tamanho da ave. As doses variam e podem variar, por exemplo, de aproximadamente 102, 5 x ΙΟ2, 103, 5 x 103, 1θ\ 5 x ΙΟ4, 105, 5 x 105, 10s, 5 x ΙΟ6, 107, 5 x 107, 10\ 5 x 10a, 109 a 5 x IO10 cfu.

Todas as patentes e pedidos de patentes citados nesta divulgação são expressamente incorporados ao presente documento a título de referência. A descrição acima descreve em linhas gerais a presente invenção. Uma compreensão mais completa pode ser obtida fazendo-se referência aos exemplos específicos abaixo, que são dados para fins de ilustração somente e não devem ser interpretados como limitando o âmbi- to da presente invenção. EXEMPLO 1 Geração de mutantes acapsulares de P. multocida por deleção de hyaE

Os mutantes de P. multocida da cepa 1059 (sorotipo A:3, aviária) e da 1062 (bovino, sorotipo :3) foram gerados por deleção da região de codificação dos seus genes hyaE, que bloquearam a síntese do bloco de formação capsular N- acetil-D-glicosamina. As regiões de codificação dos genes hyaE de 1059 e 1062 (SEQ ID NOs: 5 e 6, respectivamente) fo- ram obtidas pro amplificação por PCR, usando o iniciador di- anteiro 5'-ATGAAAAAGGTTAATATCATTGG-31 (SEQ ID NO: 1) e o i- niciador reverso 5'-TTAACCTTGCTTGAATCGTTTACC-3' (SEQ ID NO: 2). Todos os iniciadores foram sintetizados com um sinteti- zador de oligonucleotídeo (Applied Biosystems Inc) por Inte- grated DNA Technologies, Inc., Coralvílle, IA. As reações de PCR foram condzidas usando-se o kit de PCR GeneAmp LX PCR

Kit (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) em um termocir- culador Perkin Elmer GeneAmp 9600. As condições de reação foram de 30 ciclos, com 30 segundos a 95°C, 45 segundos a 48°C, e 60 segundos a 72°C por ciclo.

Os dois fragmentos hyaE gerados por PCR iniciaram no seu início os códons Met e terminaram nos seus códons de terminação. Os fragmentos de PCR foram ligados em pCR2.1 (Invitrogen Inc, LaJolla, CA) e foram eletroporados na cepa DH11S de E. coli (Life Technologies, Rockville, MD) que ge- rou os plasmídeos pCR2.lhyaE1059 e pCR2.lhya£1062. As duas construções de plasmídeos foram isoladas pelo método de SDS alcalino, sendo então purificadas por centrifugação com CsCl empregando-se métodos padrão. Os dois filamentos dos dois genes hyaE foram seqüenciados empregando-se o kit Dye Termi- nator Chemistry obtido de PE Applied Biosystems. As amostras foram testadas em um seqüenciador de DNA ABI Prism 377 pela Nucleic Acids Facility, Universidade do Estado de lowa, Ames IA.

Os genes estruturais hyaE de cada cepa tinham 1869 pb de comprimento. Devido à variação de seqüência, encontra- da principalmente n extremidade 3' da região de codificação foram construídos plasmídeos de substituição de hyaE especí- ficos para cada cepa a fim de construir as duas cepas mutan- tes de P. multocída. As deleções precisas no interior de ca- da gene hyaE contidas nos plasmídeos pCR2.lhyaE1059 e p- CR2.lhya£1062 foram efetuadas por PCR empregando-se os ini- ciadores de deleção 5'-AAAGATATCTTGGTTTACTTCAATAATTTC-3' (SEQ ID NO: 3) e 5' -AAAGATATCACTGCATCTGTTCAATCAACGAGC-3' (SEQ ID NO: 4). Os iniciadores de deleção se anelam ao gene clonado a aproximadamente 300 pares de base de distância, mas se estendem para fora, na direção do vetor de plasmídeo, e não para dentro. A reação de PCR amplifica o vetor de clo- nagem integral e as duas extremidades da parte inserida do gene, mas não a deleção de aproximadamente 300 pares de ba- se. O produto amplificado é linear, com os dois fragmentos de gene hyaE nas extremidades e o vetor de plasmídeo no mei- o. Os iniciadores contêm sítios EcoRV (GATATC) nos seus ter- minais 5'. As extremidades do produto linear amplificado, portanto, contêm sítios EcoRV. Veja as Figuras IA e 1B.

Os fragmentos resultantes de PCR foram submetidos a digestão de restrição por EcoRV para remover seqüências específicas das suas extremidades. Cada fragmento foi então ligado para gerar as deleções no quadro que excisaram os nu- cleotídeos 715 a 1082. Um linker Smal de oito pares de bases (5'-CCCCGGGG-3') foi inserido no sítio de deleção EcoRV de P. multocida 1062 para assegurar que a mutação resultaria em um fenótipo acapsular. Nenhum tal DNA foi inserido no sítio de deleção da parte inserida de hyaE 1059 de P. multocida.

As seqüências de nucleotídeos dos fragmentos 1059 e 1062 de hyaE que sofreram mutação são mostradas nas SEQ ID NOs: 7 e 8, respectivamente. Tanto em 1059 como em 1062, fo- ram deletados os aminoacidos de 239 a 359 da proteína hyaE.

Além disso, nas duas cepas, o aminoãcido na posição original 360 foi alterado de leucina para isoleucina. A cepa 1062 re- cebeu um grupo adicional de 8 aminoãcidos no sítio de dele- ção imediatamente a montante a partir da posição original 360 (Pro Arg Gly Pro Gly Ala Pro Gly; SEQ ID NO: 9).

Os fragmentos de hyaE que sofreram mutação foram subclonados em sítios EcoRI no interior do sítio de clonagem múltipla do plasmídeo pBCSK (Stratagene Inc.}, inserindo-se em seguida o elemento Tn903 de resistência a canamicina nos sítios BamHI adjacentes para produzir pBCSKAhyaEkanr1059 e pBCSKAhya£kanr1062, respectivamente. A construção dos plas- mídeos de substituição foi completada ligando-se fragmentos AhyaEkan gerados por BssH2 de 1059 e 1062 com a origem de replicação de pBB192 sensível a temperatura de 1,2 kb exci- sada do sítio BssH2 de pBCSK (Stratagene, Inc.). Veja paten- te U.S. No. 5.840.556. Como a origem de ColEl é inativa em P. multocida, somente os produtos de ligação que geram os plsms pl92orihyaHkanr1059 ou pl92orihyaEkanr1059 foram capa- zes de se replicar no interior de hospedeiras.

Os plasmídeos de substituição foram introduzidos nas cepas adequadas de P. multocida por eletroporação. As células foram cultivadas em caldo Columbia, sendo então pre- paradas para a eletroporação pelas seguintes etapas. A cul- tura foi reduzida a grânulo por centrifugação a 5000 x g du- rante 15 minutos, sendo então lavada uma vez em 100 mL de sacarose a 272 mM a 0°C. O grânulo de células foi ressuspen- so (bactérias compactadas a l:3:sacarose a 272 mM) sobre ge- lo. As bactérias competentes (100 μΕ) foram misturadas em uma cubeta de eletroporação de 0,1 cm (Bio-Rad) com 200 ng de DNA de plasmídeo que ou era não metilado ou metilado in vitro empregando-se Hhal. Imediatamente depois da adição de DNA, as células foram eletroporadas (Gene pulser, Bio-Rad) a 18.000 V/cm, 800 ohm e 25 mFd, com constantes resultantes de tempo variando de 11 a 15 milissegundos. 0 caldo Columbia (1 mL, 0°C) foi acrescentado âs células eletroporadas, e as ressuspensões foram incubadas a 25°C durante aproximadamente 25 minutos. As células se recu- peraram a 30 °C durante 2 horas e foram então dispostas sobre placas de agar Columbia contendo 50 μ9/πώ de canamicina. As colônias eram visíveis depois de 24 horas de incubação a 30°C. As células transformadas foram cultivadas a 30°C de um dia para o outro em caldo contendo canamicina. As células foram então dispostas em placas de agar de amido de dextrose com 50 μg/mL de canamicina e cultivadas a 3°C durante 24 ho- ras .

As células que possuíam plasmideo integrado sobre- viveram à seleção de antibiótico a temperatura não permissi- va para replicação dos plasmídeos, e estes puderam ser iden- tificados devido à integração de plasmideo de substituição resultou em um fenótipo acapsular. A distinção entre colô- nias capsulares e acapsulares de P. multocída das cepas 1059 e 1052 cultivadas sobre placas de dextrose de agar de amido foi facilmente efetuada. As colônias capsulares do tipo sel- vagem das duas cepas possuem ácido hialurônico, o principal componente da cápsula, o que confere às colônias um aspecto mucóide; quando observadas sob uma luz transmitida obliqua- mente, estas colônias apresentam uma iridescência semelhante a pérola. Por outro lado os mutantes acapsulares de um único crossover tem um aspecto não mucóide e não iridescente.

Os mutantes de um único crossover foram transferi- dos para 5 mL de calco Columbia sem suplementação antibióti- ca e incubados a 30°C de um dia para o outro para resolver o plasmídeo do cromossomo. A cultura foi transferida para pla- cas de dextrose-amido agar sem antibiótico suplementar que foram incubadas a 38°C durante 12 horas. 0 teste inicial pa- ra se identificar os mutantes de crossover duplo abrangia disposições em placas de réplicas de conjuntos de células que pareciam acapsulares sobre placas de dextrose-amido a- gar, ou com ou sem antibiótico, e a cultura das células a 3 8°C. As colônias acapsulares que não se desenvolveram sobre as placas com antibiótico foram submetidas a análise por PCR empregando-se os iniciadores dianteiro e reverso de hyaE. As dimensões dos produtos de PCR foram comparadas aos do proge- nitor do tipo selvagem usando-se eletroforese sobre gel de agarose.

Os mutantes de 1059 e 1062 de P. multocída suspei- tos de deleção hyaE foram também testados para a presença de gene de resistência a canamicina. Os mutantes putativos que possuíam deleções "limpas" de hyaE eram desprovidos de se- qüências de resistência a antibiótico. Um ensaio de disco de enzima de difusão (teste Kirby-Bauer, Bauer et al., Am. J.

Clin. Path, 45, 493-96, 1966} e um teste de tingimento com tinta nanquim (Collins & Lyne, MICROBIOLOGICAL METHODS, But- terworths, Boston, Mass., 1976, p. 110) foram usados para confirmar que os dois mutantes hyaE possuíam um fenótipo a- capsular. EXEMPLO 2 Vacinação de filhotes de peru com a cepa 1059 MiyaE de P. multocida Atenuação da cepa 1059 AhyaE de P. multocida foi avaliada em filhotes de peru branco de peito largo de três semanas de idade. Os grupos consistindo em quatro peruzinhos receberam por injeção intramuscular diluições em série de dez vezes de culturas exponenciais de fase de cultura do ti- po selvagem ou de culturas de mutante acapsular suspensas em caldo de tripticase (0,1 mL). Os peruzinhos foram observados durante 7 dias depois de terem sido desafiados.

Os valores LD50 (isto é, a quantidade de bactérias necessária para matar a metade dos peruzinhos) foram de <103 organismos para os peruzinhos que foram injetados com a cepa do tipo selvagem e acima de 107 organismos para os peruzi- nhos injetados com o mutante hyaE. EXEMPLO 3 Vacinação de bezerros com a cepa 1062 àhyaE de P. mui toei da Seis bezerros Holsteín, pesando aproximadamente 500 libras (227 kg) foram expostos ao mutante acapsular 1062 HhyaE de P. multocida. A cepa foi administrada ou por inje- ção subeutânea no pescoço (108 efu) ou por cobertura da ra- ção (109 efu).

Nenhuma reação adversa a nenhuma das duas exposi- ções foi observada. Os vacinados mucosos foram colonizados nas tonsilas palatinas durante o restante do teste (5 sema- nas) . 0 desafio intrataqueal com a cepa progenitora virulen- ta (IO10 cfu dose total de em 15 mL) produziu febres transi- tórias (1-2) dias em bezerros de controle, mas poucas alte- rações pneumônicas ou mesmo nenhuma alteração 10 dias depois do desafio em controles ou vacinados.

Claims (78)

1. Bactéria Pasteurellaceae multocida (P. mui toei - da) isolada do grupo sérico A, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma deleção de todo um gene hyaE ou de uma parte dele, sendo que a deleção atenua a bactéria.

2. Bactéria, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que não compreende nenhum gene de resistência a antibiótico.

3. Bactéria, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que não compreende nenhum DNA e- xógeno.

4. Bactéria, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que consiste no sorotipo A:3.

5. Bactéria, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que consiste no sorotipo A:l.

6. Bactéria, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que consiste no sorotipo A:4.

7. Bactéria, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que os aminoácidos 239 a 359 da proteína hyaE estão deletados.

8. Bactéria, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a seqüência de nu- cleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 7.

9. Bactéria, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a seqüência de nu- cleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 8.

10. Bactéria, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que é viva.

11. Bactéria, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que é liofilizada

12. Bactéria, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que é morta.

13. Vacina para a indução de imunidade protetora contra P. multocida do tipo selvagem, CARACTERIZADA pelo fa- to de que compreende: a bactéria conforme definida na reivindicação 1; e um veículo farmaceuticamente aceitável.

14. Vacina, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria não compreende ne- nhum gene de resistência a antibiótico.

15. Vacina, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria não compreende ne- nhum DNA exógeno.

16. Vacina, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria consiste no soro- tipo A:3.

17. Vacina, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria consiste no soro- tipo A:1.

18. Vacina, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria consiste no soro- tipo A:4.

19. Vacina, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que os aminoácidos 239 a 359 da proteína hyaE estão deletados.

20. Vacina, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria compreende a se- quência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 7.

21. Vacina, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria compreende a se- qüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 8.

22. Vacina, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria é viva.

23. Vacina, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que 13 a bactéria é liofilizada

24. Vacina, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria é morta.

25. Vacina, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que é embalada com instruções pa- ra a administração da vacina a um ungulado para conferir uma imunidade protetora contra P. multocida do tipo selvagem.

26. Vacina, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que é embalada com instruções pa- ra a administração da vacina a uma ave para conferir uma i- munidade protetora contra P. multocida do tipo selvagem.

27. Ração adequada para ungulados, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a bactéria conforme definida na reivindicação 1.

28. Ração, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria não compreende ne- nhum gene de resistência a antibiótico.

29. Ração, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria não compreende ne- nhum DNA exógeno.

30. Ração, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria consiste no soro- tipo A:3.

31. Ração, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria consiste no soro- tipo A: 1.

32. Ração, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria consiste no sorotipo A:4.

33. Ração, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de que os aminoácidos 239 a 359 da proteína hyaE estão deletados.

34. Ração, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria compreende a se- quência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 7.

35. Ração, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria compreende a se- quência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 8.

36. Ração, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria é viva.

37. Ração, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria é liofilizada

38. Ração, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria é morta.

39. Ração, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de que é embalada com instruções pa- ra a administração da ração a ungulados para conferir uma imunidade protetora contra P. multocida do tipo selvagem.

40. Ração adequada para uma ave, CARACTERIZADA pe- lo fato de que compreende a bactéria conforme definida na reivindicação 1.

41. Ração, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria não compreende ne- nhum gene de resistência a antibiótico.

42. Ração, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria não compreende ne- nhum DNA exógeno.

43. Ração, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria consiste no soro- tipo A:3.

44. Ração, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria consiste no soro- tipo A:1.

45. Ração, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria consiste no soro- tipo A:4.

46. Ração, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADA pelo fato de que os aminoãcidos 239 a 359 da proteína hyaE estão deletados.

47. Ração, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria compreende a se- qüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 7.

48. Ração, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria compreende a se- quência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 8.

49. Ração, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria é viva.

50. Ração, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria é liofilizada

51. Ração, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADA pelo fato de que a bactéria é morta.

52. Ração, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADA pelo fato de que é embalada com instruções pa- ra a administração da ração a uma ave para conferir uma imu- nidade protetora contra P. multocida do tipo selvagem.

53. Uso, da bactéria conforme definida na reivin- dicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para a indução de imunidade protetora contra P. multocida do tipo selvagem, onde o medicamento adminis- trado a um ungulado ou a uma ave, conferindo deste modo a bactéria ao ungulado ou à ave imunidade protetora contra P. multocida do tipo selvagem.

54. Uso, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que a bactéria não compreende ne- nhum gene de resistência a antibiótico.

55. Uso, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que a bactéria não compreende ne- nhum DNA exógeno.

56. Uso, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que a bactéria consiste no soro- tipo A:3,

57. Uso, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que a bactéria consiste no soro- tipo A:1.

58. Uso, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que a bactéria consiste no soro- típo A:4.

59. Uso, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que os aminoácidos 23 9 a 3 59 da proteína hyaE estão deletados.

60. Uso, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que a bactéria compreende a se- qüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 7.

61. Uso, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que a bactéria compreende a se- quência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 8.

62. Uso, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que a bactéria é viva.

63. Uso, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que a bactéria é liofilizada

64. Uso, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que a bactéria é morta.

65. Uso, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que a bactéria é administrada a um ungulado.

66. Uso, de acordo com a reivindicação 65, CARACTERIZADO pelo fato de que o ungulado é um bovino.

67. Uso, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que a bactéria é administrada a uma ave.

68. Uso, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que a bactéria é administrada a uma ave e a ave é uma ave doméstica.

69. Uso, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que a bactéria é administrada a uma ave e a ave é uma ave doméstica selecionada a partir do grupo que consiste em galinha, peru, avestruz, galinha de caça, pombo, galinha de angola, faisão, codorna, pato, ganso e ema.

70. Uso, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que a bactéria é administrada a uma ave e a ave é uma galinha.

71. Uso, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que a bactéria é administrada a uma ave e a ave é um peru.

72. Uso, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que a bactéria é administrada por via subcutânea.

73. Uso, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que a bactéria é administrada por via intramuscular.

74. Uso, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que a bactéria é administrada o- ralmente.

75. Uso, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que a bactéria é administrada por ração de cobertura.

76. Uso, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que a bactéria é administrada por via intranasal.

77. Uso, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que a bactéria é administrada a uma dose entre aproximadamente 104 e aproximadamente 109 cfu (unidade formadora de colônia).

78. Uso, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que a dose se encontra entre a- proximadamente 104 e aproximadamente 106 cfu.