DE602004003582T2 - Akapsuläre i p. multocida hyae deletionsmutanten - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung bezieht sich auf akapsuläre Mutanten von P. multocida und die Mutanten enthaltende Impfstoffe.
  • Technischer Hintergrund der Erfindung
  • Pasteurella multocida (P. multocida) ist mit einer Vielfalt von Krankheiten verbunden, darunter Meningoenzephalitis von Kälbern und Färsen, Lymphadenitis der Schafe, Septikämie der Pferde und Esel, septikämische Rinderpasteurellose (hämorrhagische Septikämie, Barbone), Schweinepasteurellose, septikämische Pasteurellose der Schweine, Pneumonie und Geflügelcholera.
  • Es besteht das Bedürfnis nach wirksamen Impfstoffen, die zur Bereitstellung einer protektiven Immunität gegen die von P. multocida verursachten Krankheiten verwendet werden können.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Eine erfindungsgemäße Ausführungsform ist ein isoliertes Pasteurelle multocida (P. multocida)-Bakterium der Serogruppe A, das eine teilweise oder vollständige Deletion des hyaE-Gens umfasst. Die Deletion schwächt das Bakterium.
  • Eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform ist ein Impfstoff zur Erzeugung einer protektiven Immunität gegen Wildtyp-P. multocida. Der Impfstoff umfasst ein P. multocida-Bakterium der Serogruppe A, das eine teilweise oder vollständige Deleti on des hyaE-Gens umfasst, und ein pharmazeutisch zulässiges Konstituens. Die Deletionsmutation schwächt das Bakterium.
  • Noch eine andere erfindungsgemäß Ausführungsform sind für Säugetiere (einschließlich Vieh, Huftiere und Haustiere (companion animals) oder Vögel (bevorzugt Geflügel)) geeignete Futtermittel, die ein P. multocida-Bakterium der Serogruppe A, das eine teilweise oder vollständige Deletion des hyaE-Gens umfasst, enthalten. Die Deletion schwächt das Bakterium.
  • Noch eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Verwendung eines P. multocida-Bakteriums der Serogruppe A, das eine teilweise oder vollständige Deletion des hyaE-Gens umfasst, die das Bakterium schwächt, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Erzeugung protektiver Immunität gegen Wildtyp-P. multocida. Das Bakterium ist zur Verabreichung an ein Tier wie ein Säugetier (einschließlich Vieh, Huftiere und Haustiere) oder einen Vogel (einschließlich Geflügel) bestimmt.
  • Die Erfindung stellt daher Mittel und Verfahren zur Erzeugung protektiver Immunität gegen die von P. multocida verursachten Krankheiten bereit.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnung
  • 1: Darstellung des Aufbaus der hyaE-Deletionsmutanten.
  • 1A: Schema, das die geplante Deletion zeigt.
  • 1B: Plasmid, das den deletierten hyaE-Insert enthält.
  • Eingehende Beschreibung der Erfindung
  • Akapsuläre hyaE-Deletionsmutanten von P. multocida Serogruppe A können Säugetieren (einschließlich Vieh, Huftiere und Haustiere) und Vögeln (einschließlich Geflügel) verabreicht wer den, um diesen protektive Immunität gegen Wildtyp-P. multocida zu verleihen, z. B. um Krankheiten wie hämorrhagische Septikämie oder Pneumonie bei Vieh, Huftieren und Haustieren zu verhindern oder deren Schwere zu vermindern bzw, um Geflügelcholera bei Vögeln, insbesondere bei Geflügel, zu verhindern oder ihre Schwere zu vermindern. Die Begriffe "akapsuläre Mutante(n)", "akapsuläres Bakterium" und "mutantes Bakterium" werden in dieser Beschreibung austauschbar verwendet.
  • Akapsuläre hyaE-Deletionsmutanten von P. multocida Serogruppe A.
  • Akapsuläre hyaE-Deletionsmutanten von P. multocida Serogruppe A (z. B. die Serotypen A:1, A:3, A:4) können durch Mutagenisierung des hyaE-Gens im biosynthetischen Genlocus für die Kapsel erzeugt werden. Die Gene des biosynthetischen Genlocus für die Kapsel in der Serogruppe A sind gut bekannt und wurden vollständig sequenziert. Chung et al., FEMS Microbiol. Lett. 166(2), 289–96, 1998. Der Serotyp A:1-Genlocus enthält vier offene Leseraster (ORFs) in der Region 1 (hexA, hexB, hexC und hexD), fünf ORFs in Region 2 (hyaA, hyaE, hyaC, hyaD und hyaE) und 2 ORFs in Region 3 (phyA und phyB).
  • In bestimmten Ausführungsformen umfassen die mutanten Bakterien keine antibiotischen Resistenzgene oder fremde DNA, was ihre Attraktivität für Umwelt und Ökologie verbessert. Ein Verfahren zur Erzeugung von Deletionsmutanten ist im Beispiel 1 beschrieben, jedoch können alle anderen bekannten Verfahren zur Erzeugung von Deletionsmutanten angewendet werden. Einfache Tests zur Bestätigung, dass die Mutanten einen akapsulären Phänotyp haben, sind ebenfalls im Beispiel 1 beschrieben.
  • P. multocida-Bakterien mit irgendeiner teilweisen oder vollständigen Deletion des hyaE-Gens gehören zur Erfindung, wenn die Deletion das Bakterium schwächt. In einer Ausführungsform führt die Deletionsmutation zur Deletion der Aminosäuren 239–359 des hyaE-Proteins (d. h. im kodierten hyaE-Protein ist keine der Aminosäuren 239–359 vorhanden). In anderen Ausführungsformen umfasst das offene Leseraster des hyaE-Gens SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8.
  • Ein mutantes Bakterium ist geschwächt, wenn bei Exposition mit dem mutanten Bakterium eine Steigerung der Dosis gegenüber dem Wildtyp-P. multocida erforderlich ist, um die Hälfte der empfindlichen Zielspezies zu töten (d. h. die LD50 steigt) und/oder die pathologischen Läsionen (z. B. Pneumonie) nach Exposition der Zielspezies mit dem mutanten Bakterium im Vergleich zur Exposition mit dem Wildtyp-Bakterium abnehmen und/oder die kommensale Koloniebildung auf Schleimhautoberflächen, auf denen P. multocida nach Exposition der Zielspezies mit dem mutanten Bakterium residiert, im Vergleich zur Exposition mit einem Wildtyp-Bakterium geringer ist.
  • Die Schwächung kann mit verschiedenen bekannten Verfahren beurteilt werden. Für septikämische Erkrankungen (wie Geflügelcholera) können beispielsweise empfindliche Spezies mit Wildtyp-Organismen auf intranasalem, intravenösem, intramuskulärem oder intraperitonealem Weg exponiert werden und die zur Erzeugung der Krankheit erforderliche Dosis von Wildtyp- und Mutantorganismen kann miteinander verglichen werden. Für Lungenkrankheiten kann man empfindliche Tiere mit Wildtyp-Organismen auf intranasalem, intratrachealem oder intrapulmonalem Weg exponieren und Ausmaß und Schwere der klinischen Symptome und pathologischen Läsionen zwischen mutant- und wildtypexponierten Tieren vergleichen. Für die Koloniebildung auf Schleimhäuten können Tiere mit Wildtyp auf oralem, intranasalem oder intratonsillarem Weg exponiert werden und die Zahl der zu verschiedenen Zeiten nach der Exposition aus dem Nasenschleim oder aus Tonsillenwaschproben gewonnenen Organismen kann verglichen werden.
  • Impfstoffherstellung
  • Impfstoffe mit mutanten Bakterien können allein oder als Bestandteil von Mehrfachimpfstoffen, d. h. in Kombination mit anderen Impfstoffen, verabreicht werden. Mutante Bakterien in einer Impfstoffrezeptur können lebend oder abgetötet sein; sowohl lebende als auch abgetötete Bakterien können gefriergetrocknet und optional wie dem Fachmann bekannt wieder gelöst werden. Impfstoffe können geeignet in Sätzen (kits) geliefert werden, welche auch geeignete Kennzeichnungen und Informationen für die Verabreichung des Impfstoffs an ein Tier (z. B. Vieh, ein Huftier, ein Haustier) oder einen Vogel (z. B. Geflügel) enthalten können.
  • Impfstoffe mit akapsulären Mutanten können auch pharmazeutisch und veterinärmedizinisch zulässige Träger enthalten. Solche Träger sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen ohne Beschränkung langsam metabolisierende Makromoleküle, wie Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglykolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäurecopolymere und inaktive Virusteilchen. Auch pharmazeutisch und veterinärmedizinisch zulässige Salze können im Impfstoff verwendet werden, beispielsweise Mineralsalze wie Hydrochloride, Hydrobromide, Phosphate oder Sulfate, wie auch Salze organischer Säuren wie Acetate, Propionate, Malonate oder Benzoate. Die Impfstoffe können auch Flüssigkeiten, wie Wasser, Kochsalzlösung, Glyzerin und Ethanol enthalten, wie auch Substanzen wie Netzmittel, Emulgatoren oder pH-Puffermittel. Auch Liposomen können als Träger für mutante Bakterien verwendet werden. Siehe US 5,922,120 ; WO 95/13796; WO 91/14455 oder EP-529 968-B1.
  • Falls gewünscht kann dem Impfstoff ein Adjuvans zugefügt werden. Brauchbare Adjuvantien umfassen ohne Beschränkung oberflächenaktive Mittel (z. B. Hexadecylamin, Octadecylamin, Ly solecithin, Dimethyldioctadecylammoniumbromid, N,N-Dioctadecyl-N'-N-bis(2-hydroxyethylpropandiamin), Methoxyhexadecylglyzerin und Polyalkylenglykolpolyole), Polyanionen (z. B. Pyran, Dextransulfat, Poly-IC, Polyacrylsäure, Carbopol), Peptide (z. B. Muramyldipeptid, Dimethylglyzin, Tuftsin), Ölemulsionen, Alaun und deren Mischungen.
  • Behandlung von Säugetieren, insbesondere Vieh, Huftiere und Haustiere
  • "Säugetiere" umfassen Monotremata (z. B. Schnabeltier), Beuteltiere (z. B. Känguruh) und Plazentalier, umfassend Vieh (einheimische Tiere, die wegen Nahrung, Milch oder Fasern gezüchtet werden, wie Schweine, Schafe, Rinder und Pferde) und Haustiere (z. B. Hunde, Katzen). "Huftiere" umfassen ohne Beschränkung Rinder, Wasserbüffel, Bisons, Schafe, Schweine, Hirsche, Elefanten und Yaks. Beide umfassen sowohl ausgewachsene als auch im Wachstum befindliche Formen (z. B. Kälber, Ferkel, Lämmer usw.). Erfindungsgemäße Bakterien können ausgewachsenen oder im Wachstum befindlichen Säugetieren, bevorzugt Vieh, Huftieren oder Haustieren verabreicht werden.
  • Ein geeignetes Verfahren zur Abgabe eines erfindungsgemäßen Bakteriums an Säugetiere (wie Vieh, Huftiere oder Haustiere) ist die orale Verabreichung (z. B. im Futter oder Trinkwasser oder im Köder). Es ist besonders dienlich, das Futter mit dem Bakterium zu garnieren (das Bakterium aufzulegen) oder zu mischen. Typischerweise wird bei Großtieren (z. B. Vieh/Huftiere wie Rinder) etwa 106, 5 × 106, 107, 5 × 107, 108, 5 × 108, 109, 5 × 109 oder 101 cfu (koloniebildende Einheiten) dosiert, etwa 108, 5 × 108, 109, 5 × 109 cfu, wenn das Futter garniert wird. Es können Dosen von etwa 106 bis etwa 108, etwa 2 × 106 bis etwa 3 × 108, etwa 2,4 × 106 bis etwa 2,6 × 108, etwa 104 bis etwa 106 cfu oder etwa 104 bis etwa 109 gegeben werden. Für kleineres Vieh/Huftiere wie Schafe können die Dosen angepaßt werden (z. B. etwa 104, 5 × 104, 105, 5 × 105, 106, 5 × 106, 107, 5 × 107 oder 108 cfu). Analoge Dosisvorschriften für Haustiere können leicht abgeleitet werden.
  • Obwohl wegen der einfachen Gabe der orale Weg bevorzugt ist, können auch andere Wege zur Impfung angewendet werden. Diese umfassen ohne Beschränkung subkutan, intramuskulär, intravenös, intradermal, intranasal, intrabronchial usw. Erfindungsgemäße Bakterien können in das Ohr implantiert werden. Die Bakterien können auch durch Luftnebel, Augeninokulation oder Skarifikation (Ritzen) verabreicht werden.
  • Behandlung von Vögeln
  • "Vögel" umfassen wilde (z. B. Wildgeflügel) und gezähmte (z. B. Geflügel oder zahme) Vögel und umfassen sowohl ausgewachsene als auch im Wachstum befindliche Formen (z. B. Junge, Küken, Truthahnküken usw.). "Geflügel" oder "Geflügelvögel" umfassen alle Vögel, die wegen Fleisch oder Eiern gehalten, gefangen oder gezähmt werden, darunter Hühner, Truthahn, Strauß, Wildhuhn, Jungtaube, Perlhuhn, Fasan, Wachtel, Ente, Gans und Emu.
  • Erfindungsgemäße Bakterien können einem Vogel durch alle bekannten oder Standardverfahren verabreicht werden, darunter Injektion in Schleimhaut oder Muskeln. In einem Brutbetrieb können Bakterien durch Techniken wie In ovo-Impfung, Sprühimpfung oder subkutane Impfung verabreicht werden. Auf dem Bauernhof können Bakterien durch Techniken wie Skarifikation, Sprühimpfung, Augentropfenimpfung, Trinkwasserimpfung, Futterimpfung, Flügelimpfung (wing web vaccination), subkutane Impfung und intramuskuläre Impfung verabreicht werden.
  • Die wirksame Dosis hängt von der Größe des Vogels ab. Die Dosen reichen von etwa 102, 5 × 102, 103, 5 × 103, 104, 5 × 104, 105, 5 × 105, 106, 5 × 106, 107, 5 × 107, 108, 5 × 108, 109 bis 5 × 109 cfu.
  • Die vorstehende Offenbarung beschreibt die vorliegende Erfindung allgemein. Ein vollständigeres Verständnis kann durch Bezug auf die folgenden speziellen Beispiele erreicht werden, die nur zum Zweck der Veranschaulichung angegeben werden und den Umfang der Erfindung nicht beschränken sollen.
  • Beispiel 1
  • Erzeugung von akapsulären P. multocida-Mutanten mit hyaE-Deletion
  • P. multocida-Mutanten der Stämme 1059 (Vogel, Serotyp A:3) und 1062 (Rind, Serotyp A:3) wurden durch Deletion des kodierenden Bereichs ihres hyaE-Gens erzeugt, was die Synthese des Kapselbausteins N-Acetyl-D-glukosamin blockierte. Die kodierenden Bereiche der hyaE-Gene von 1059 und 1062 wurden durch PCR-Vermehrung erhalten, wobei der Vorwärtsprimer 5'-ATGAAAAAGGTTAATATCATTGG-3' (SEQ ID NO:1) und der Rückwärtsprimer 5'-TTAACCTTGCTTGAATCGTTTACC-3' (SEQ ID NO:2) verwendet wurden. Alle Primer wurden mit einem Oligonukleotidsynthesizer (Applied Biosystems Inc.) von Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, synthetisiert. Die PCRs wurden unter Verwendung des GeneAmp LX PCR-Kits (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) in einem Perkin-Elmer GeneAmp 9600 Thermocycler durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen waren 30 Zyklen mit je 30 s bei 95°C, 45 s bei 48°C und 60 s bei 72°C.
  • Die beiden mit PCR erzeugten hyaE-Fragmente begannen mit ihren Met-Startcodons und endeten an ihren Stop-Codons. Die PCR-Fragmente wurden in pCR2.1 (Invitrogen Inc., LaJolla, CA) ligiert und in den E. coli-Stamm DH11S (Life Technologies, Rock ville, MD) elektroporiert, welche die Plasmide pCR2.1hyaE1059 und pCR2.1hyaE1062 erzeugten. Beide Plasmidkonstrukte wurden mit dem alkalischen SDS-Verfahren isoliert und dann durch CsCl-Zentrifugieren mit Standardverfahren gereinigt. Beide Stränge beider hyaE-Gene wurden mit dem Dye Terminator Chemistry Kit von PE Applied Biosystems sequenziert. Die Proben wurden auf einem ABI Prism 377 DNA Sequencer durch die Nucleic Acids Facility, Iowa State University, Ames, IA, bearbeitet.
  • Die hyaE-Strukturgene eines jeden Strangs waren 1869 Bp (Basenpaare) lang. Wegen der hauptsächlich am 3'-Ende des kodierenden Bereichs gefundenen Sequenzabweichung wurden für jeden Stamm besondere hyaE-Ersatzplasmide konstruiert, um die beiden mutanten Stämme von P. multocida zu entwickeln. Genaue Deletionen in jedem auf den Plasmiden pCR2.1hyaE1059 und pCR2.1hyaE1062 vorhandenen hyaE-Gen wurden mit PCR unter Verwendung der Deletionsprimer 5'-AARGATATCTTGGTTTACTTCAATAATTTC-3' (SEQ ID NO:3) und 5'-AAAGATATCACTGCATCTGTTCAATCAACGAGC-3' (SEQ ID NO:4) erzielt. Die Deletionsprimer lagern sich an das geklonte Gen im Abstand von etwa 300 Bp an und erstrecken sich nach außen, zum Plasmidvektor hin, anstatt nach innen. Die PCR vermehrt den gesamten Klonvektor und zwei Enden des Geninserts, aber nicht die "Deletion" von etwa 300 Bp. Das vermehrte Produkt ist linear mit zwei hyaE-Genfragmenten an den Enden und dem Plasmidvektor in der Mitte. Die Primer enthalten EcoRV-Erkennungsstellen (GATATC) an den 5'-Termini. Daher enthalten die Enden des linearen Produkts EcoRV-Stellen. Siehe 1A und 1B.
  • Die resultierenden PCR-Fragmente wurden der EcoRV-Restriktionsdigestion unterworfen, um spezifische Sequenzen an den Enden zu entfernen. Dann wurde jedes Fragment ligiert, um rastergemäße (inframe) Deletionen durch Ausschneiden der Nukleotide 715 bis 1082 zu erzeugen. Ein SmaI-Linker mit 8 Bp (5'-CCCCGGGG-3') wurde in die EcoRV-Deletionsstelle des P. multocida 1062 eingefügt, um sicherzustellen, dass die Mutation zu einem akapsulären Phänotyp führt. In die Deletionsstelle des P. multocida 1059 wurde keine solche DNA eingefügt.
  • Die Nukleotidsequenzen der mutierten hyaE-Fragmente von 1059 und 1062 sind in SEQ ID NO:7 bzw. SEQ ID NO:8 gezeigt. Sowohl in 1059 als auch in 1062 wurden die Aminosäuren 239 bis 359 des hyaE-Proteins deletiert. Außerdem wurde in beiden Stämmen die Aminosäure an der früheren Position 360 von Leucin in Isoleucin geändert. Stamm 1062 erhielt zusätzlich 8 Aminosäuren in der Deletionsstelle genau stromaufwärts von der früheren Position 360 (ProArgGlyProGlyAlaProGly; SEQ ID NO:9).
  • Die mutierten hyaE-Fragmente wurden in EcoRI-Stellen in den Mehrfachklonstellen des Plasmids pBCSK (Strategene Inc.) subkloniert und danach das Kanamycinresistenzelement Tn903 in die angrenzende BamHI-Stelle eingesetzt, um pBCSKΔhyaEkanr1059 bzw. pBCSKΔhyaEkanr1062 zu erzeugen. Der Aufbau der Austauschplasmide wurde durch Ligieren der von BssH2 erzeugten ΔhyaEkanr-Fragmente von 1059 und 1062 mit dem temperaturempfindlichen 1,2 Bp-Replikationsstartpunkt von pBB192, der aus der BssH2-Stelle des pBCSK herausgeschnitten war (Strategene Inc.), abgeschlossen. Siehe US 5,840,556 . Weil der ColE1-Startpunkt in P. multocida inaktiv ist, waren nur die die Ligationsprodukte erzeugenden Plasmide p192oriΔhyaEkanr1059 oder p192oriΔhyaEkanr1062 in den Wirten replikationsfähig.
  • Die Austauschplasmide wurden in die geeigneten P. multocida-Stämme durch Elektroporation eingeführt. Die Zellen wurden in Columbia-Broth gezüchtet und dann durch folgende Schritte für die Elektroporation vorbereitet. Das Gewachsene wurde durch 15 min Zentrifugieren bei 5000 g als Pellet abgeschieden und einmal mit 100 ml 272 mmol/l Rohrzuckerlösung bei 0°C gewaschen. Das Zellpellet wurde auf Eis resuspendiert (1:3 gepackte Bak terien:272 mmol/l Rohrzucker). Kompetente Bakterien (100 μl) wurden in einer 0,1 cm-Elektroporationsküvette (BioRad) mit 200 ng Plasmid-DNA gemischt und die Zellen wurden bei 18000 V/cm, 800 Ω und 25 mF elektroporiert (Gene pulser, BioRad), wobei die resultierenden Zeitkonstanten von 11 bis 15 ms reichten.
  • Zu den elektroporierten Zellen wurde Columbia-Broth (1 ml, 0°C) zugefügt und die Suspensionen wurden etwa 25 min bei 25°C inkubiert. Die Zellen erholten sich bei 30°C zwei Stunden und wurden dann auf Columbia-Agarplatten mit 50 μg/ml Kanamycin plattiert. Nach 24 h Inkubieren bei 30°C waren Kolonien sichtbar. Die transformierten Zellen wurden über Nacht bei 30°C in Nährlösung mit Kanamycin gezüchtet. Die Zellen wurden dann auf Dextrose-Stärke-Agar-Platten mit 50 μg/ml Kanamycin plattiert und bei 3°C 24 h gezüchtet.
  • Zellen, welche das integrierte Plasmid besaßen, überlebten die antibiotische Selektion bei der für Plasmidreplikation nicht permissiven Temperatur und konnten identifiziert werden, weil die Integration des Austauschplasmids zu einem akapsulären Phänotyp führte. Die Unterscheidung zwischen Kolonien von kapsulärem und akapsulärem P. multocida der Stämme 1059 und 1062, die auf Dextrose-Stärke-Agar-Platten gezüchtet worden waren, konnte leicht vorgenommen werden. Kolonien des kapsulären Wildtyps beider Stämme besitzen Hyaluronsäure als Hauptbestandteil der Kapsel, welche den Kolonien beim Betrachten unter schräg durchfallendem Licht ein schleimiges Aussehen verleiht; diese Kolonien irisieren perlmuttartig. Dagegen sind die akapsulären Einfachkreuzmutanten (single crossover mutants) nicht schleimig und nicht irisierend.
  • Einfachkreuzmutanten wurden in 5 ml Columbia-Broth ohne antibiotische Ergänzung überführt und bei 30°C über Nacht inkubiert, um das Plasmid vom Chromosom zu lösen. Das Gewachsene wurde auf Dextrose-Stärke-Agar-Platten ohne Antibiotikum-Ergänzung überführt, die bei 38°C 12 h inkubiert wurden. Der erste Test zur Identifizierung von Doppelkreuzmutanten (double crossover mutants) umfasste das Abklatsch-Plattieren von akapsulär erscheinenden Zellarrays auf Dextrose-Stärke-Agar-Platten mit und ohne Antibiotikum und Züchten der Zellen bei 38°C. Akapsuläre Kolonien, die auf den Antibiotikumplatten nicht wuchsen, wurde der PCR-Analyse mit hyaE-Vorwärts- und Rückwärtsprimern unterworfen. Die Größe der PCR-Produkte wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese mit jenen der Wildtyp-Eltern verglichen.
  • Vermeintliche hyaE-Deletionsmutanten von P. multocida 1059 und 1062 wurden ebenfalls auf das Vorhandensein des Kanamycinresistenzgens geprüft. Mutanten, die mutmaßlich "reine" hyaE-Deletionen besaßen, waren frei von Antibiotikaresistenzsequenzen. Um zu bestätigen, dass die beiden hyaE-Mutanten einen akapsulären Phänotyp besitzen, wurde ein Blättchen-Enzymassay (Kirby-Bauer Test, Bauer et al., Am. J. Clin. Path. 45, 493–496, 1966) und ein Färbeassay mit chinesischer Tinte (Indian ink) (Collins & Lyne, Microbiological Methods, Butterworth, Boston, Mass., 1076, Seite 110) angewendet.
  • Beispiel 2
  • Impfung von Truthahnküken mit dem P. multocida-Stamm 1059 ΔhyaE
  • Die Schwächung des 1059 ΔhyaE-P. multocida-Stamms wurde in drei Wochen alten Küken des breitbrüstigen Weißtruthahns beurteilt. Küken in Vierergruppen wurden Verdünnungsreihen mit Faktor 10 aus Kulturen der exponentiellen Wachstumsphase des Wildtyps und des akapsulären Mutanten, suspendiert in Tryptikase-Nährlösung, intramuskulär injiziert. Die Küken wurden über 7 Tage nach der Belastung beobachtet.
  • Die LD50-Werte (d. h. die zur Tötung der Hälfte der Küken notwendige Menge Bakterien) war < 103 Organismen für die Küken, denen der Wildtypstamm und über 107 für jene, denen die hyaE-Mutante injiziert worden war.
  • Beispiel 3
  • Impfung von Stierkälbern mit dem P. multocida-Stamm 1062 ΔhyaE
  • Sechs Holstein-Stierkälber von etwa 500 pounds (230 kg) wurden der akapsularen Mutante P. multocida 1062 ΔhyaE ausgesetzt. Der Stamm wurde entweder durch subkutane Injektion in den Nacken (108 cfu) oder durch Auflegen auf das Futter (109 cfu) verabreicht.
  • Nach keiner der Expositionen wurden abträglichen Reaktionen beobachtet. Die Schleimhaut von Geimpften zeigte Kolonien auf den Gaumenmandeln während der restlichen 5 Wochen des Versuchs. Intratracheale Belastung mit dem virulenten Elternstamm (1010 cfu Gesamtdosis in 15 ml) rief vorübergehendes (1 bis 2 Tage) Fieber bei den Vergleichskälbern, jedoch nur geringe oder keine Veränderung der Lunge bei Vergleichen und Geimpften 10 d nach Belastung hervor.
  • SEQUENZLISTING
    Figure 00140001
  • Figure 00150001
  • Figure 00160001
  • Figure 00170001

Claims (34)

  1. Isoliertes Pasteurelle multocida (P. multocida)-Bakterium der Serogruppe A, das eine teilweise oder vollständige Deletion des hyaE-Gens umfasst, wobei die Deletion das Bakterium schwächt.
  2. Bakterium nach Anspruch 1, das keine Antibiotika-Resistenzgene umfasst.
  3. Bakterium nach Anspruch 1, das keine exogene DNA umfasst.
  4. Bakterium nach Anspruch 1 vom Serotyp A:3.
  5. Bakterium nach Anspruch 1 vom Serotyp A:1.
  6. Bakterium nach Anspruch 1 vom Serotyp A:4.
  7. Bakterium nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuren 239–359 des hyaE-Proteins deletiert sind.
  8. Bakterium nach Anspruch 1, das die in SEQ ID NO:7 gezeigte Nukleotidsequenz umfasst.
  9. Bakterium nach Anspruch 1, das die in SEQ ID NO:8 gezeigte Nukleotidsequenz umfasst.
  10. Bakterium nach Anspruch 1, das lebendig ist
  11. Bakterium nach Anspruch 1, das gefriergetrocknet ist.
  12. Bakterium nach Anspruch 1, das getötet wurde.
  13. Impfstoff zur Erzeugung einer protektiven Immunität gegen Wildtyp-P. multocida, umfassend – das Bakterium nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und – ein pharmazeutisch zulässiges Konstituens.
  14. Impfstoff nach Anspruch 13, verpackt mit Anweisungen zur Verabreichung des Impfstoffs an ein Huftier, um diesem protektive Immunität gegen Wildtyp-P. multocida zu verleihen.
  15. Impfstoff nach Anspruch 13, verpackt mit Anweisungen zur Verabreichung des Impfstoffs an einen Vogel, um diesem protektive Immunität gegen Wildtyp-P. multocida zu verleihen.
  16. Für Huftiere geeignetes, das Bakterium nach einem der Ansprüche 1 bis 12 enthaltendes Futter.
  17. Futter nach Anspruch 16, verpackt mit Anweisungen zur Verabreichung des Futters an Huftiere, um diesen protektive Immunität gegen Wildtyp-P. multocida zu verleihen.
  18. Für Vögel geeignetes, das Bakterium nach einem der Ansprüche 1 bis 12 enthaltendes Futter.
  19. Futter nach Anspruch 16, verpackt mit Anweisungen zur Verabreichung des Futters an einen Vogel, um diesem protektive Immunität gegen Wildtyp-P. multocida zu verleihen.
  20. Verwendung des Bakteriums nach einem der Ansprüche 1 bis 12 bei der Herstellung eines Arzneimittels, das einem Huftier oder Vogel protektive Immunität gegen Wildtyp-P. multocida verleiht.
  21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Arzneimittel zur Verabreichung an ein Huftier bestimmt ist.
  22. Verwendung nach Anspruch 21, wobei das Huftier ein Rind ist.
  23. Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Arzneimittel zur Verabreichung an einen Vogel bestimmt ist.
  24. Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Arzneimittel zur Verabreichung an einen Vogel bestimmt und der Vogel ein Geflügeltier ist.
  25. Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Arzneimittel zur Verabreichung an einen Vogel bestimmt und der Vogel ein Geflügeltier, ausgewählt aus der aus Huhn, Truthahn, Strauß, Wildhuhn, Jungtaube, Perlhuhn, Fasan, Wachtel, Ente, Gans und Emu bestehenden Gruppe, ist.
  26. Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Arzneimittel zur Verabreichung an einen Vogel bestimmt und der Vogel ein Huhn ist.
  27. Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Arzneimittel zur Verabreichung an einen Vogel bestimmt und der Vogel ein Truthahn ist.
  28. Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Arzneimittel zur subkutanen Verabreichung bestimmt ist.
  29. Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Arzneimittel zur intramuskulären Verabreichung bestimmt ist.
  30. Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Arzneimittel zur oralen Verabreichung bestimmt ist.
  31. Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Arzneimittel zur Verabreichung durch Auflegen auf das Futter bestimmt ist.
  32. Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Arzneimittel zur intranasalen Verabreichung bestimmt ist.
  33. Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Arzneimittel zur Verabreichung mit einer Dosis von etwa 104 bis etwa 109 koloniebildenden Einheiten (cfu) bestimmt ist.
  34. Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Arzneimittel zur Verabreichung mit einer Dosis von etwa 104 bis etwa 106 koloniebildenden Einheiten (cfu) bestimmt ist.
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