BR112019018882A2 - obtenção de uma salmonela enteritidis de tipo rugosa e suas modificações genéticas para uso como vacina aviária - Google Patents
obtenção de uma salmonela enteritidis de tipo rugosa e suas modificações genéticas para uso como vacina aviária Download PDFInfo
- Publication number
- BR112019018882A2 BR112019018882A2 BR112019018882A BR112019018882A BR112019018882A2 BR 112019018882 A2 BR112019018882 A2 BR 112019018882A2 BR 112019018882 A BR112019018882 A BR 112019018882A BR 112019018882 A BR112019018882 A BR 112019018882A BR 112019018882 A2 BR112019018882 A2 BR 112019018882A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- seq
- salmonella enteritidis
- waal
- gene
- 3934vac
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/34—Sugars
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10211—Aviadenovirus, e.g. fowl adenovirus A
- C12N2710/10234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
a presente invenção refere-se a uma cepa de salmonella enteritidis 3934vac ao qual foi deletado o gene waal para obter um fenótipo rugoso (3934vac dwaal), o procedimento para a obtenção e oligos utilizados; com o objetivo de reduzir a toxicidade e manter a imunogenicidade para sua aplicação como vacina. um outro aspecto da presente invenção refere-se a uma cepa de salmonella enteritidis 3934vac tipo dwaal, ou seja de tipo rugosa, o qual foi modificada para expressar o gene da fibra do adenovírus aviário de tipo i, também o processo para a obtenção de um salmonella enteritidis cepa 3034 vac dwaal que expressa um gene de fibra ava-i, a invenção também compreende o desenvolvimento de uma nova vacina aviária, viva, recombinante, vírus eficaz e segura contra o vírus ava-i desenvolvida através de um processo de inserção e a integração dos genes de fibra ava i, no cromossoma de uma cepa atenuada e não patogénica da bactéria salmonella enteritidis.
Description
OBTENÇÃO DE UMA SALMONELA ENTERITIDIS DE TIPO RUGOSA E SUAS MODIFICAÇÕES GENÉTICAS PARA USO COMO VACINA AVIÁRIA
SETOR DA TÉCNICA [0001]. A presente invenção enquadra-se no setor da Saúde Animal. Mais especificamente, o invento refere-se ao desenvolvimento de uma cepa de Salmonella entérica sorovar Enteritidis (Salmonella Enteritidis ou SE) atenuado e de fenótipo rugoso, obtido por deleção de um gene envolvido na síntese de lipopolissacarídeo. Neste contexto, o uso desta cepa como vetor vacinai contra o vírus Ava-I também está incluído, através de um processo de inserção e integração em seu cromossomo dos genes que codificam o antígeno fibra Ava-I. O vetor de SE utilizado foi geneticamente modificado para funcionar como um veículo para a expressão dos genes imunodominantes da fibra do vírus AvA-l, com o objetivo final de estimular uma resposta imune efetiva e duradoura contra o HCI (hepatite viral por corpos de inclusão) em aves. A cepa gerada é completamente segura porque está livre dos doze genes que codificam as proteínas da via de sinalização do mensageiro GMP-di-cíclico secundário, o fator sigma RpoS e a proteína WaaL. Portanto, esta cepa é proposta como uma nova vacina viva recombinante eficaz e segura contra o vírus Ava-I, adequada para vacinar populações aviárias.
[0002]. Todos os componentes desta vacina foram especificamente projetados e desenvolvidos com os três fatores prioritários de eficácia, segurança e custos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0003]. Espera-se um crescimento de 30% no setor avícola nos próximos 8 a 10 anos (APA, 2008), este crescimento caminha lado a lado com programas de saúde bem-sucedidos, que por sua vez dependem de
Petição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 10/157
2/24 vacinas eficazes e seguras. A HCI/SHP é uma doença que causa até 50% de mortalidade em aves afetadas e é um problema latente no Peru porque, apesar da vacinação, ainda há surtos, um problema que não é solucionado porque a tecnologia utilizada para a elaboração de vacinas é a mesma durante 20 anos.
[0004]. Recentemente, as técnicas de manipulação genética, somadas à disponibilidade de genomas bacterianos, o melhor conhecimento dos mecanismos de patogênese e da resposta imune permitiram novas abordagens para o desenvolvimento de cepas bacterianas atenuadas como vetores de genes heterólogos. Assim, bactérias enteropatogênicas como Monocytogenes, Salmonella spp, Shigella spp, Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica ou Bordetella pertussis tem sido usada como vetores eficazes como vacinas. De todos eles, o que deu os resultados mais promissores é Salmonella spp; assim, vetores vacinais baseados em cepas atenuadas de Salmonella typhimurium têm sido utilizados para gerar uma resposta imune protetora contra patógenos virais, bacterianos e protozoários e para realizar tratamentos anti-carcinogênicos. No caso específico das aves, este tipo de vacina foi avaliado como um vetor de genes para o vírus da bronquite infecciosa, o vírus da gripe aviária, o reovírus aviário e o Clostridium perfringens. Todos esses trabalhos concordam com o fato de que essas vacinas foram capazes de provocar uma resposta imune protetora duradoura, além de serem seguras ao evitar o risco de causar a doença. Considerando os aspectos mencionados acima, existe um grande sustento no sucesso que oferecería à indústria avícola o desenvolvimento de uma vacina viva recombinante contra AvA-l usando uma cepa de SE atenuada como vetor. Estas vantagens podem ser resumidas da seguinte forma: (1) atenuação severa através de vários processos de mutagênese dirigida mediante um mecanismo de troca alélica que impede a reversão, não introduz DNA exógeno e converte a cepa resultante em um vetor
Petição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 11/157
3/24 vacinai totalmente seguro; (2) a quantidade de expressão do antígeno AvA-l pode ser regulada por manipulação genética; (3) pode ser administrado por inoculação oral; (4) estimula fortemente o sistema imune inato e adaptativo; e (5), por sua vez, fornecería proteção contra a SE. Embora o desenvolvimento de vacinas utilizando vetores bacterianos tenha sido e seja atualmente objeto de numerosas investigações, até o momento não existem vacinas comerciais licenciadas baseadas na SE. Portanto, o desenvolvimento dessa vacina estabelecería um bom precedente nessa área de pesquisa e desenvolvimento e não teria concorrência nos mercados nacional e internacional.
[0005]. A cepa utilizada na presente invenção foi isolada e descrita por (Solano et al, 2002). Este estudo relata um novo método de seleção baseado na fluorescência de colônias em placas de agar calcofluor para identificar mutantes de Salmonella enteritidis que são defeituosos na formação de biofilme. Estes resultados não só confirmaram a exigência de genes já descritos para a modulação do comportamento multicelular em Salmonella typhimurium e outras espécies, mas também revelaram novos aspectos do processo de formação de biofilme, tais como novos elementos genéticos nomeados como operons bcsABZC e bcsEFG, necessários para a síntese de um exopolissacarídeo hidrolisável por celulase. As mutações não-polares dos genes BcsC e bcsE, bem como experimentos de complementação, demonstraram que ambos os operons são essenciais para a biossíntese de celulose nos meios LB e ATM, tanto em S. enteritidis como em S. typhimurium. Este estudo também mostrou que o biofilme produzido por S. enteritidis é composto por diferentes componentes, sugerindo que a composição e regulação do biofilme depende das condições ambientais. Além disso, os resultados sugerem que a celulose não está implicada na virulência de S. enteritidis, embora os mutantes deficientes na produção deste polissacarídeo sejam mais sensíveis aos tratamentos com cloro, sugerindo que a produção de
Petição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 12/157
4/24 celulose e a formação de biofilme seria um fator importante na sobrevivência de S. enteritidis nas superfícies. Em um estudo posterior, Solano et al (2009, incluindo referência) realizaram uma abordagem genética ambiciosa na qual, na mesma cepa descrita acima, os 12 genes que codificam proteínas com atividade enzimática diguanilatociclase (DGC, proteínas com domínio GGDEF) foram deletados. Essas enzimas sintetizam o mensageiro secundário C-di-GMP, uma molécula cujo envolvimento em importantes processos biológicos bacterianos como a formação de biofilmes ou virulência, tem sido amplamente estudado em numerosas espécies. No caso específico desta cepa de SE, a depleção total de c-di-GMP correlaciona-se com a perda da capacidade de formar biofilmes, uma ligeira atenuação em um modelo murino e uma maior sensibilidade a condições ambientais extremas.
[0006]. Como resultado da abordagem genética descrita acima, o documento de patente ES 2324084B1 descreve a invenção de um método que permite produzir múltiplas modificações no cromossoma de bactérias Gram-negativas e cepas de Salmonella deficientes na síntese de C-diGMP obtido por este. A referida invenção refere-se também a duas estirpes mutantes de Salmonella entérica obtidas pelo referido método em que os doze genes que codificam proteínas com o domínio GGDEF foram deletados (mutante ΔΧΙI:: Km e mutante ΔΧΙI:: Cio) e à sua utilização como vetores de expressão, agentes imunoterapêuticos e em estudos metabólicos.
[0007]. García Ona (2011), na Tese Análise de uma cepa avirulenta de Salmonella enteritidis para uso como vacina viva atenuada; estudou o potencial de várias cepas derivadas incluídas no documento ES 2324084B1 para o desenvolvimento de uma vacina capaz de induzir uma resposta imune, diminuir a colonização de órgãos e a liberação de Salmonella em fezes em fazendas intensivas de suínos. Neste trabalho concluiu-se que a cepa de Salmonella candidata para o desenvolvimento
Petição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 13/157
5/24 de uma vacina seria a cepa conhecida por S. Enteritidis 3934ΔΧΙΙ*, que eliminou os 12 genes que codificam proteínas com o domínio GGDEF e transporta uma deleção adicional em uma região cromossômica que inclui o regulador transcricional RpoS. Esta cepa é avirulenta, tem capacidade diminuída de sobreviver no meio ambiente e, por não conter DNA exógeno, não seria classificada como OGM (organismo geneticamente modificado). Ensaios de imunização oral utilizando um modelo de infecção murina, revelaram que a imunização com uma dose única de 107ufc (Unidades Formadoras de colônia) desta cepa é capaz de induzir uma resposta imune protetora contra a infecção por Salmonella, indicando que a referida cepa pode ser um candidato adequado para utilização como vacina viva atenuada.
[0008]. Latasa et. al, 2016 realizou o seguinte estudo com o objetivo de construir uma nova vacina viva e atenuada de Salmonella: primeiro, analisou-se o impacto da ausência de di-GMP cíclico (c-di-GMP) na virulência de Salmonella. Como mencionado anteriormente, C-di-GMP é um mensageiro intracelular secundário que controla uma ampla gama de processos bacterianos, incluindo a formação de biofilme e a síntese de fatores de virulência, bem como a modulação da resposta imune inata do hospedeiro a através dos receptores STING. Os resultados descritos neste artigo mostraram que um mutante múltiplo de Salmonella, de cujo genoma os doze genes que codificam as proteínas diguanilatociclase foram deletados e, como consequência, não podem sintetizar c-di-GMP, apresenta atenuação moderada em um modelo de infecção murina sistêmica. Uma mutação adicional controlada (diferentemente da cepa S. Enteritidis 3934ΔΧΙΙ* na qual a perda desse fator sigma resultou de uma contra seleção natural) do gene rpoS resultou em um efeito atenuante sinérgico, o que levou a uma cepa altamente atenuada, denominada ΔΧΙΙΙ. Esta cepa é suficientemente imunogênica para proteger camundongos contra um ataque letal oral de uma cepa
Petição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 14/157
6/24 virulenta de S. typhimurium. A imunogenicidade de ΔΧΙΙΙ depende tanto da ativação da resposta humoral quanto celular e é caracterizada pela produção de anticorpos opsonizantes e pela indução de níveis significativos de IFN-γ, TNF-A, IL-2, IL-17 e IL-10. ΔΧΙΙΙ é capaz deformar biofilmes e não sobrevive sob condições de dessecação, o que indica que pode ser facilmente removido do meio ambiente. Além disso, ΔΧΙΙΙ possui propriedades DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated Animals), que permitem a diferenciação de animais infectados e vacinados. Para facilitar a terminologia, a cepa DXII também é conhecida como 3934vac.
[0009]. Além disso, o documento de Kong et. al, 2011, descreve o efeito da eliminação do antígeno O e dos açúcares do núcleo na virulência e imunogenicidade de Salmonella e/?te/7ca sorotipo typhimurium. Neste estudo, foram realizadas mutações por deleção não polar nos genes waaG (rfaG), waaL (rfal), rfaH, waaJ (rfaJ), wbaP (rfbP), waaL (rfaL) ou wzy (rfc) em uma cepa S. typhimurium selvagem. Após confirmar a estrutura do LPS, várias propriedades in vitro e in vivo de cada mutante foram analisadas e descobriu-se que todos os mutantes apresentaram uma atenuação significativa e menor capacidade de invasão em comparação com as cepas parentais do fenótipo selvagem quando foram administradas a camundongos BALB/c por via oral. Além disso, as cepas portadoras de uma mutação no waaG e no waaL foram deficientes na colonização das placas de Peyer e fígado, sendo essa deficiência parcialmente compensada após a administração intranasal do mutante DwaaL. No contexto de uma cepa vacinai atenuada que fornece o antígeno pneumocócico PspA, todas as mutações testadas resultaram em respostas imunes reduzidas contra os antígenos PspA e Salmonella. Estes resultados indicam que o truncamento não reversível do núcleo externo não é uma opção viável para desenvolver uma vacina oral viva de Salmonella, enquanto que um mutante wzy, que retém uma unidade de antígeno O, seria adequado para estimular a imunidade
Petição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 15/157
7/24 protetora ótima aos antígenos homólogos ou heterólogos por via oral, intranasal ou intraperitoneal.
DESCRIÇÃO GERAL DA INVENÇÃO [0010]. O presente invento refere-se a uma cepa de Salmonella Enteritidis atenuada que foi modificada por técnicas de engenharia genética para eliminar o gene waaL e, portanto, presenta um fenótipo rugoso. Um outro aspecto da presente invenção refere-se à mencionada cepa de Salmonella Enteritidis mutante no gene waaL que também transporta no seu cromossomo os genes que codificam o antígeno fibra de AVA-I. Esta cepa, além de ter um fenótipo rugoso e ser avirulenta, confere proteção contra Ava-I. Adicionalmente, a invenção compreende o processo para obter uma cepa atenuada de Salmonella Enteritidis com um fenótipo rugoso e realizar a integração no seu cromossomo dos genes que codificam a fibra AVA-I, incluindo os plasmídeos e métodos utilizados para obter a referida cepa.
[0011]. Com o objetivo de reduzir a toxicidade e manter a imunogenicidade das cepas baseadas no fundo genético 3934vac (SE DXIII), um aspecto da presente invenção refere-se à deleção do gene waaL. A mutação desse gene resulta em um fenótipo rugoso porque o lipopolissacarídeo é composto apenas do core (núcleo) e lípido A, tendo perdido a capacidade de sintetizar o antígeno O. Esta mutação tem a vantagem adicional de permitir a diferenciação de animais vacinados e naturalmente colonizada por cepas selvagens de Salmonella Enteritidis e typhimurium.
[0012]. Para a geração dos mutantes rugosos foi utilizado um desenho experimental baseado em uma troca alélica, o que dá origem a um plasmideo termossensível portador de duas regiões homólogas aos adjacentes 5' e 3' do gene waaL. De modo a efetuar a troca alélica por recombinação homóloga, clonaram-se primeiro neste plasmideo dois
Petição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 16/157
8/24 fragmentos de aproximadamente 500 pb flanqueando waaL nas regiões 3' e 5' (fragmentos AB e CD). O plasmídeo construído foi introduzido na cepa 3934vac por eletroporação (A cepa de Salmonella portadora deste plasmídeo cresce a 28°C na presencia de 20 pg/ml de cloranfenicol). Após a transformação da cepa, selecionaram-se vários clones para a integração do plasmídeo no cromossomo por cultura a 42°C (temperatura não permissiva para a replicação do plasmídeo). Após a confirmação da integração do vetor no cromossomo por PCR, procedeu-se à excisão ou segunda recombinação. Neste segundo passo o plasmídeo é perdido gerando a deleção desejada ou tendo restaurado a cópia selvagem do gene (a razão aproximada destes eventos genéticos é 50-50%). A segunda recombinação é conseguida por cultivo a 30°C na ausência de antibiótico e na presença de sacarose, já que o plasmídeo carrega o gene letal sacBe a presença deste açúcar no meio de cultura contra seleciona os clones que ainda retêm o plasmídeo. A confirmação dos clones em que ocorreu a troca alélica foi realizada por PCR e sequenciamento posterior. Deve-se notar que os mutantes resultantes deste procedimento não possuem resistência a antibióticos ou vestígios de DNA exógeno. [0013]. A fim de integrar no cromossomo um cassete de expressão que permitisse a produção do antigeno da fibra na cepa SE, foi realizada uma abordagem semelhante à descrita anteriormente. Neste caso, o plasmídeo contém, além das regiões flanqueadoras de recombinação, um cassete de expressão que está integrada no cromossomo. Este cassete de expressão foi clonado num plasmídeo integrativo contendo as regiões AB e CD de aproximadamente 500 pb do gene Sb13 do prófago ST64B. A clonagem foi projetada de modo que a cassete de expressão de fibra AvaI esteja entre os dois fragmentos do gene do prófago defeituoso. (A cepa de Salmonella portadora deste plasmídeo é crescida a 28°C na presença de cloranfenicol 20 pg/ml). Uma vez o plasmídeo foi transformado por eletroporação, vários clones foram sujeitos a várias passagens de
Petição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 17/157
9/24 crescimento a 42°C (temperatura não permissiva de replicação do plasmídeo - a integração do plasmídeo ocorre graças às regiões homólogas de AB e CD adjacentes ao waaL). Após verificação por PCR de que o plasmídeo tinha sido integrado no cromossoma, a excisão ou segunda recombinação foi realizada a 28°C na ausência de antibiótico e a presença de sacarose. Como descrito acima, este sistema de contra seleção permite identificar os clones que perderam no plasmídeo. O último passo consiste novamente em selecionar por PCR os clones em que ocorreu a inserção do cassete de expressão de fibra no gene sb13 do prófago ST64B.
[0014]. A cepa resultante, à qual está invenção se refere, é uma cepa mutante modificada de Salmonella Enteritidis que porta uma deleção do gene waaL e, portanto, tem um fenótipo rugoso, e expressa genes de fibra de Ava-I de seu próprio cromossomo.
[0015]. Para fins da presente invenção, Salmonella Enteritidis é uma abreviatura de Salmonella entérica sorovar Enteritidis.
[0016]. Também, para a presente invenção, deve ser considerado que a PCR é a reação em cadeia da polimerase; e oligo é o iniciador usado na PCR.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO OBTENÇÃO DE SALMONELLA ENTERITIDIS ATENUADA (SEA) Projeto e construção de um sistema que permite a introdução de qualquer xenoantígeno de interesse no cromossomo de Salmonella Enteritidis (SE).
[0017]. Uma vacina viva ou um vetor vacinai deve ser seguro e eficaz, com um genótipo e fenótipo totalmente controlados, que evitem o risco de reversão para virulência. Além disso, a cepa deve manter um equilíbrio entre o grau de atenuação e a imunogenicidade, permanecendo no organismo hospedeiro por tempo suficiente para dar origem a uma
Petição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 18/157
10/24 resposta imune protetora contra antígenos homólogos e/ou heterólogos. Neste caso, a cepa de Salmonella enteritidis aviária (SEA) gerada tem como característica primordial uma drástica atenuação em aves. Além disso, a cepa SEA é incapaz de formar biofilmes e tem uma sobrevida muito reduzida no ambiente, evitando qualquer risco associado ao período em que os animais vacinados poderíam excretar essa cepa. Ao contrário da maioria das vacinas comerciais (como a 9R), seu genótipo e fenótipo são totalmente controlados e não possuem genes de resistência a antibióticos. A segurança de bactérias vivas atenuadas foi verificada em outros modelos, como a vacina 9R, cujos relatos rejeitaram cientificamente uma possível reversão à forma virulenta original (Okamoto., et al 2010 Revista Brasileira de Ciências Avícolas).
[0018]. Por conseguinte, a presente invenção utiliza uma cepa de Salmonella enteritidis 3934 (depositada na Coleção Espanhola de Culturas Tipo (CECT) com o número de acesso CECT 7236, ao qual, através de técnicas de engenharia genética, foram deletados os doze genes que codificam enzimas diguanilatociclase, o gene rpoSe o gene waaL. Esta última mutação foi realizada com o objetivo de obter uma cepa vacinai de fenótipo rugoso (Salmonella enteritidis 3934vac DwaaL) que confere proteção em animais de criação. Da mesma forma, outro aspecto da presente invenção compreende uma cepa vacinai do fenótipo rugoso portadora de um cassete de expressão para genes da fibra de Ava-I (Salmonella enteritidis 3934vac DwaaL-fibra) que confere imunidade contra hepatite de corpos de inclusão em aves.
GERAÇÃO DE MUTANTES RUGOSOS [0019]. A fim de reduzir a toxicidade e manter a imunogenicidade das cepas baseadas no background genético do 3934vac, procedeu-se à exclusão do gene waaL. A mutação deste gene resulta em um fenótipo rugoso porque o lipopolissacarídeo é composto apenas de núcleo e lipídio
Petição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 19/157
11/24
A, tendo perdido a capacidade de sintetizar o antigeno O. Esta mutação tem a vantagem adicional de permitir a diferenciação de animais vacinados e naturalmente colonizado por cepas selvagens de Salmonella Enteritidis e typhimurium.
Metodologia Detalhada [0020]. A metodologia utilizada é construir um vetor integrativo pKO: waaL, integrar este vetor pKO: waaL em um primeiro passo de recombinação e então realizar a excisão do vetor integrativo com um segundo passo de recombinação (Figura 1)
1. Construção do vetor integrativo pKO:: waaL [0021]. Para a construção do plasmídeo integrativo pKO::waaL, dois fragmentos flanqueadores ao gene waaL de 520 pb (oligonucleotídeos A e B) e 504 pb (oligonucleotídeos C e D) respectivamente, são amplificados por PCR. Os produtos de PCR são purificados em gel e clonados independentemente em vectores de clonagem convencionais, para depois serem digeridos em Notl Xhol (fragmento AB) e Xhol Bglll (fragmento CD). Ambos os fragmentos digeridos são purificados a partir de gel e subclonados no plasmídeo pKO cuja sequência é SEQ ID NO:1 digerido para Notl Blgll, dando origem ao vetor pKO::waaL. O plasmídeo pKO transporta um cassete de resistência ao cloranfenicol, uma origem termossensível, sistema lacZde seleção e sacB contra- seleção (Figura 2).
[0022]. A construção PKO: waal cuja sequência é a SEQ ID NO: 2 é feito de uma cepa de Escherichia colie verificada por PCR, miniprep e digestão.
[0023]. Os oligonucleotídeos utilizados para a construo do vector pDEST::waaL estão apresentados na Tabela 1. Sequência (5'-3'). Os sites de restrição estão sublinhados.
Petição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 20/157
12/24
TABELA 1: Oliqonucleotídeos utilizados para realizar a deleção do gene waaL em Salmonella enteritidis 3934
Nome do gene | Oligonucleotídeos |
waaL | oligo A (SEQ ID NO: 3) oligo B (SEQ ID NO: 4) oligo C (SEQ ID NO: 5) oligo D (SEQ ID NO: 6) |
2. Integração do vetor suicida pKO:: waaL (primeira recombinação) [0024]. Uma vez construído e verificado o plasmídeo pKO:: waaL (Figura 3), é extraído a partir da cepa de Escherichia colipor miniprep e eletroporado na cepa S. Enteritidis 3934vac onde sua integração é forçada pelo crescimento a 42QC. Esta temperatura não é permissiva para a replicação do plasmídeo e a integração do plasmídeo ocorre graças às regiões AB e CD homólogas adjacentes ao waaL. Vários clones resultantes da incubação a 44°C, resistentes ao cloranfenicol, foram testados por PCR com os pares de oligos E - F e E - G para verificar a integração. No primeiro caso, as PCRs devem ser negativos e no segundo caso, aqueles clones nos quais a recombinação ocorreu no fragmento AB, a PCR resultante será de 1282pb.
TABELA 2: Oliqonucleotídeos utilizados para a verificação da integração do plasmídeo pKO:: waaL
Nome de Oligo | Sequência |
oligo E | SEQ ID NO: 9 |
oligo F | SEQ ID NO: 10 |
oligo G (hibridizado no plasmídeo pKO) | SEQ ID NO: 11 |
Petição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 21/157
13/24
3. Excisão do vetor integrativo pKO:: waaL (segunda recombinação) [0025]. Para que o segundo evento de recombinação ocorra e o plasmídeo pKO seja perdido, vários clones integrados são cultivados em meio líquido a 30°C na ausência de antibiótico. Após 24 horas, 5 diluições em série são colocadas em meio sólido suplementado com 5% de sacarose. Apenas os clones que perderam o plasmídeo através de uma segunda recombinação crescem neste meio, o qual, dependendo do fragmento em que ocorreu, origina a regeneração do genótipo parental ou a deleção total do gene waaL. Ambos os alelos podem ser diferenciados por PCR com oligos E e F (sequência descrita acima).
[0026]. Na cepa parental 3934vac, a PCR com os oligonucleotídeos E e F resulta num fragmento de 2328 pb, a sequência do amplicon vindo do genótipo 3934vac é SEQ ID NO: 7, enquanto nos clones em que a deleção tinha sucedido o fragmento tem um tamanho de 1106 pb cuja sequência de amplificação é SEQ ID NO: 8 [0027]. A estirpe 3934vacDwaal ou 3934vacR pode ser crescida a 37°C na ausência de antibiótico, uma vez que não contém qualquer cassete de seleção.
[0028]. A região de Waa (rfa) de Salmonella enteritidis 3934vac e a região de Waa (rfa) de Salmonella enteritidis 3934vacR podem ser vistas na Figura 4 e na Figura 5, respectivamente.
[0029]. Os oligonucleotídeos utilizados na verificação dos mutantes DwaaL são: SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10.
CONSTRUÇÃO E INSERÇÃO DE CASSETES COM GENES FIBRA AVA-I NA CEPA 3934VacR
Construção e inserção de cassete de expressão com genes de fibra de AvA-l no cromossomo de 3934VacR.
Petição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 22/157
14/24 [0030]. A inserção dos genes dos genes de interesse na cepa 3934vacR é realizada no nível cromossômico. Essa estratégia permite que a expressão de genes heterólogos seja estável, eliminando o problema de segregação plasmidial e a necessidade de utilizar antibióticos como marcadores de seleção. As etapas estão resumidas na Figura 6.
1. Construção do vetor integrativo pKO: sb13-Fibra [0031]. Nesta primeira fase, um plasmídeo integrativo é construído para integrar o cassete de expressão no gene sb13 do prófago defeituoso ST64B (todas as cepas SE o possuem em seu cromossomo) (Figura6). Seguindo uma abordagem semelhante à descrita acima, as regiões AB (427bp) são amplificadas, e CD (597 pb) com pares de oligos HI e JK. Os produtos de PCR são purificados em gel e clonados independentemente em vectores de clonagem convencionais, para depois serem digeridos com Smal sphl (fragmento AB) e spHI Sail (fragmento CD). Ambos os fragmentos digeridos são purificados em gel e subclonados no plasmídeo suicida pKO digerido para Smal Sail cujo, dando origem ao vector pKO:: sb13 (Figura 7) cuja sequência é SEQ ID NO: 12 [0032]. Oligos usado [0033]. Fragmento AB:
oligo H (SEQ ID NO: 13) oligo I (SEQ ID NO: 14) [0034]. CD do fragmento:
oligo J (SEQ ID NO: 15) oligo K (SEQ ID NO: 16) [0035]. Uma vez construído o plasmídeo pKO::sb1 3, o cassete é montado, que dará origem à expressão do antigeno fibra. Esta etapa é realizada em várias fases: (i) Amplificação de <Terminator (43bp) Pr.promotor.RBS (114bp) -clyA (915pb) > a partir de um plasmídeo
Petição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 23/157
15/24 sintético com os oligonucleotídeos L - M, (ii) amplificação da região codificante do antígeno fibra (1597pb) usando como molde o plasmídeo pET28::fibra com o par de oligonucleotídeos N-0 e (iii) PCR sobreposta para fundir dois fragmentos, com os oligos externos L-O.
[0036]. Oligo L (SEQ ID NO: 17) [0037], Oligo M (SEQ ID NO: 18) [0038]. Oligo N (SEQ ID NO: 19) [0039]. Oligo O (SEQ ID NO: 20) [0040]. O cassete de expressão de fibra tem a sequência SEQ ID NO: 21 [0041]. O fragmento resultante (2.702 pb) é purificado em gel e clonado por montagem de extremos homólogos no vetor pKO::sb13 previamente digerido para spHI, obtendo o vetor pKO::sb13-Fibra cuja sequência é SEQ ID NO: 22
2. Integração do vetor suicida pKO::sb13-fibra (primeira recombinação) [0042]. Uma vez construído e verificada, o plasmídeo pKO::sb13fibra, que é extraído a partir da cepa de Escherichia coli por miniprep e eletroporado na cepa S. Enteritidis 3934vacR (ou 3934vac DwaaL) onde a sua integração é forçada pelo crescimento a 42QC. Esta temperatura não é permissiva para a replicação do plasmídeo e a integração do plasmídeo ocorre graças às regiões homólogas AB e CD homólogas ao gene sb13. Vários clones resultantes da incubação a 44 ° C, resistentes ao cloranfenicol, são testados por PCR com os pares de oligos P - Q e P - M para verificar a integração. No primeiro caso, as PCRs devem ser negativas e no segundo caso, aqueles clones nos quais a recombinação ocorreu no fragmento AB, a PCR resultante será 1607pb.
[0043]. Os oligos utilizados foram:
Oligo P (SEQ ID NO: 23)
Petição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 24/157
16/24
Oligo Q (SEQ ID NO: 24)
Oligo M (SEQ ID NO: 25)
-Excisão do vetor integrativo pKO::ab13-fibra (segunda recombinação) [0044]. Para que o segundo evento de recombinação ocorra e o plasmídeo pKO seja perdido, deixando o cassete de expressão de antígeno fibra inserida no cromossomo, vários clones integrados são cultivados em meio líquido a 30°C na ausência de antibiótico. Após 24 horas, 5 diluições em série são colocadas em meio sólido suplementado com 5% de sacarose. Apenas os clones que perderam o plasmídeo através de uma segunda recombinação crescem neste meio, que, dependendo do fragmento em que ocorreu, resulta na regeneração do genótipo parental ou inserção no gene sb13 do prófago defeito ST64B do cassete de expressão responsável pela produção do antígeno da fibra. Estes últimos clones podem ser diferenciados por PCR, usando os oligos P e Q (sequência descrita acima) [0045]. Na estirpe parental 3934vacR, a PCR com os oligonucleotídeos P e Q resulta num fragmento de 1314 pb, enquanto nos clones em que foi produzida a estirpe 3934vacR:: FIBRA (AvA), a integração do caso o chá da expressão da fibra tem um tamanho de 3792bp bp.
[0046]. A sequência no fundo genético 3934vacR é SEQ ID NO: 25. [0047]. A sequência sb13 no fundo genético 3934vacR::FIBRA (AvaI) é SEQ ID NO: 26
Detecção da expressão de proteínas de fibra por AAE [0048]. Para a confirmação da expressão heteróloga do antígeno de fibra, são utilizadas as técnicas de SDS-PAGE e Western blot. As proteínas heterólogas são expressas por cultura das bactérias em meio
Petição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 25/157
17/24
LB, depois as proteínas são extraídas do citoplasma, periplasma e segregadas. As amostras obtidas da expressão são separadas por SDSPAGE em geles de poliacrilamida ao 10%. As proteínas são transferidas para membranas de nitrocelulose e as proteínas são detectadas indiretamente usando como conjugado IgG-HRP (anticorpo ligado à peroxidase de rábano), seguido por detecção usando DAB (3,3' Diaminobenzidina tetrahidroclorado) como substrato.
[0049]. Assim, os resultados obtidos por Western blot validam e satisfatoriamente corroboram a expressão do antígeno da fibra na cepa Salmonella Enteritidis 3934Vac sob ambas as condições de crescimento de 37°C e 28°C. Embora nenhuma das bandas (A, B e C) corresponda exatamente ao peso molecular teórico estimado da fusão ClyA-fibraAVAI-His (85,4 kDa), a banda A provavelmente corresponde ao tamanho total da fusão enquanto as bandas B e C são produtos da degradação proteica. Onde ClyA representa a sequência do gene ClyA; fibra AVAI representa a sequência do gene fibra do AVA-I e His representa a sequência de 6 histidinas consecutivas.
Estudo fenotípico de cepas 3934 e derivados da vacina rugosa.
[0050]. De modo a estudar os fenótipos das diferentes cepas, que foram plaqueadas em ágar Vermelho do Congo, o que permitiu diferenciar facilmente a cepa de Salmonella que transporta o gene da fibra. Ao contrário de cepas selvagens que produzem normalmente celulose, fímbrias e outros apêndices, resultando genótipo RDAR- red drough and dry, vermelho secos e rugoso, os mutantes gerados na presente invenção têm um fenótipo conhecido como saw (smooth and white), liso e branco. Este fenótipo é especialmente perceptível quando as cepas produzem um lipopolissacarídeo truncado, devido à mutação no gene waaL. As diferenças também são significativas em ágar de natação semissólida,
Petição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 26/157
18/24 embora este fenótipo possa sofrer variações dependendo da composição e umidade exatas das placas de cultura (Figura 8)
AVALIAÇÃO DE VACINAS RECOMBINANTES
Testes de imunização e desafio Preparação do inóculo da vacina.
[0051]. O inóculo é preparado a partir da estirpe RAvA-SE que expressa adequadamente o gene da fibra AvA-l. A bactéria é semeada em meio XLD e é incubada durante 24 horas a 37°C. As colônias típicas são transferidas para meio LB, a cultura incubada durante 18h a 37°C sob agitação a 250 rpm (agitador mecânico). As células bacterianas são recolhidas por centrifugação a 5000 g durante 10 min e diluídas em série em PBS de acordo com a concentração desejada.
Preparação do inóculo AvA-l para testes de desafio.
[0052]. O isolamento de AvA-l utilizado no estudo foi obtido a partir de um surto de HCI (Hepatite com corpos de inclusão) de uma fazenda em Chincha, lea, Peru, caracterizado como o sorotipo AvA-l 4 por RFLPPCR. O isolado é inoculado em ovos SPF com 10 dias de idade através da membrana corialantóica (CAM) e incubado por 9 dias, após os quais os fígados são coletados para homogeneização e a carga viral é determinada por PCR. A dose média infecciosa do embrião de galinha (DIEP50 / mL) do inóculo é calculada usando a fórmula de Reed e Muench. O material homogeneizado é armazenado a -20Q C até o seu uso no desafio.
Teste de proteção [0053]. Neste ponto, os testes em animais permitirão avaliar a imunogenicidade da vacina candidata RAvA-SE. Para fazer isso, um cronograma semelhante é estabelecido como mostrado abaixo. O número de grupos a trabalhar é estabelecido de acordo com a dose e via de
Petição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 27/157
19/24 administração. Se mais de uma vacina candidata for gerada, o mesmo esquema também será seguido. Cada grupo de tratamento é composto por 30 animais, este número é justificado de acordo com um cronograma que envolve o sacrifício de animais ao longo do experimento para avaliar a colonização das bactérias em órgãos internos. Onde os animais são entendidos como aves de criação.
[0054]. Um modelo padronizado de cronograma de vacinação foi seguido de acordo com o seguinte cronograma
TABELA 3: Cronograma dos horários de vacinação
Cronograma | Tipo de amostras | Laboratório | (ELISA, PCR, Cultura) | Dia | ||||
0 | 7 | 14 | 21 | 28 | ||||
Data | ||||||||
Idade da ave | 1 dia | 8 dias | 15 dias | 22 dias | 29 dias | |||
Vacuna 1° dose | X | |||||||
Desafio | X | |||||||
Sangue | soro | LMS | ELISA | X | X | X | X | X |
Órgãos | fígado, baço, fezes, Hissopado por | LBMG/LMS | PCR/ Cultura microbiológica | X | X | X | X | X |
Outras |
LMS: Laboratório de microbiologia y sorologia
LBMG: Laboratório de Biologia Molecular y Genômica [0055]. Neste ponto são utilizadas galinhas SPF Hyline com 1 dia de idade, que são vacinados de acordo com o esquema acima mencionado. Após a vacinação, as aves são monitoradas para observação de sinais clínicas. Cada grupo experimental é mantido em gaiolas separadas. No dia 21 as aves são desafiadas por via intramuscular com 1010 cópias/mL de AvA-l sorotipo IV, o que é igual a 105 DIEPso(dose média de infecção
Petição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 28/157
20/24 em embrião de galinha). Um dos grupos é desafiado com AvA-l (intramuscular) e com uma cepa selvagem de Salmonella enteritidis (oralmente, 107 cópias / mL). As amostras são coletadas em intervalos regulares, de acordo com o cronograma estabelecido, que incluirá fezes, hissopados cloacais, fígado e baço para a detecção e quantificação de RAvA-SE, SE selvagem e AvA-l. As amostras de sangue também são consideradas de acordo com o cronograma para a medição de anticorpos protetores. Aos 7 dias após o desafio, a eutanásia é aplicada a todas as aves.
Determinação da excreção e colonização de Salmonella enteritidis atenuada em frangos [0056]. Os testes em animais, neste ponto pode determinar que a estirpe atenuada de Salmonella enteritidis (MAR) fornece as características sob as quais foi concebido: avirulenta, capacidade diminuída para a colonização, persistência e excreção, em comparação com um campo estirpe selvagem.
[0057]. O cronograma de trabalho foi elaborado especificando: grupos de tratamento, via de administração, concentração das bactérias a serem utilizadas, tipo de amostra a ser avaliada e os dias de amostragem. Cada tratamento consiste de 15 animais, este número inclui o sacrifício de animais nos dias indicados no cronograma, para avaliar a colonização das bactérias em órgãos internos. As aves com um dia de idade, separadas por grupo de acordo com o tratamento, são inoculadas com a cepa SEA utilizando uma seringa estéril de 1 mL. As aves são monitoradas diariamente para sinais clínicas, alimentação e água ad libitum. As condições de umidade relativa e os ciclos de luz-escuridão apropriados são mantidos. As aves no final do experimento foram eutanasiadas por choque elétrico.
Petição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 29/157
21/24 [0058]. De acordo com o desenho do experimento, as amostras são enviadas ao laboratório para as respectivas análises microbiológica, sorológica e molecular.
Ensaios microbiológicos para a detecção e quantificação de Salmonella.
[0059]. Permitem determinar a excreção e a colonização tecidual da bactéria SEA durante todo o experimento, de acordo com o cronograma de envio da amostra estabelecida.
[0060]. Amostras de fezes, hissopados retais, baço e fígado das aves dos diferentes grupos avaliados são analisadas ao longo do experimento de acordo com o cronograma de envio de amostras estabelecido. O procedimento para isolamento é realizado conforme indicado pelo fluxograma (Figura 9).
[0061]. A carga bacteriana nas amostras foi determinada.
LISTA DE FIGURAS [0062]. Figura 1: Método de troca alélica para a construção de 3934vacR .
[0063]. Figura 2: Plasmídeo integrative de pKO [0064]. Figura 3: Plasmídeo integrative pKO::waaL [0065]. Figura 4: Região Waa (rfa) de Salmonella enteritidis 3934vac [0066]. Figura 5: Região Waa (rfa) de Salmonella enteritidis 3934vacR [0067]. Figura 6: Plasmídeo pKOB::sb13 [0068]. Figura 7: Plasmídeo pKO B::sb13fibra [0069]. Figura 8: Diferenciação fenotípica de cepas de Salmonella em placas de ágar vermelho congo (esquerda) e ágar semi-sólido (direita).
Petição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 30/157
22/24 [0070]. Figura 9: Fluxograma para a detecção e quantificação microbiológica de Salmonella. Além disso, TSI: Agar ferro três açúcares; LIA: Ágar lisina de ferro.
[0071]. Figura 10: Resultados de transferência de Western blot da proteína de interesse clyA-fibraFAdV-His.
[0072]. Figura 11: Resultados de SDS-PAGE da proteína de interesse clyA-fibraFAdV-His, com controlos positivos A e B.
[0073]. Figura 12: Coloração de Coomassie do SDS-PAGE e Western Blot dos extratos proteicos obtidos após crescimento em meio LB a 37°C ou 28°C. Além disso, MW: marcador de peso molecular, wt: Salmonella Enteritidis 3934, Δ: Salmonella Enteritidis 3934Vac; Δ-fibra: Salmonella enteritidis 3934Vac com fusão ClyAfibraFAdV-His no cromossomo, Δpfibra: Salmonella enteritidis 3934Vac expressando a fusão ClyAfibraFAdV-His a partir do plasmídeo. As bandas específicas obtidas no western blot foram indicadas (A, B e C).
[0074]. Figura 13: A análise eletroforética dos produtos de PCR revela a presença de clones que transportam a deleção waaL. Para a seleção de clones portadores da deleção, o cromossomo bacteriano foi amplificado usando oligos externos à construção. Além disso, M = marcador de peso molecular, wt = cepa selvagem, c = colônia. Tamanhos esperados: peso = 2328 pb, Δ waaL= 1112 pb [0075]. Figura 14: Tabela de resumo dos oligos usados
FORMA DE REALIZAO PREFERIDA DA INVENÇÃO: EXEMPLOS [0076]. Os seguintes exemplos que são fornecidos aqui servem para ilustrar a natureza da presente invenção. Estes exemplos são incluídos apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretados como limitações à invenção reivindicada aqui.
[0077]. Exemplo 1: Expressão do antígeno Fibra na cepa
Salmonella Enteritidis 3934 Vac por Western blot.
Petição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 31/157
23/24 [0078]. Extrato de proteína [0079]. Plantamos 1 colônia em LB 5 ml de meio de cultura para a fibra ClyA que tem a inserção no cromossomo. Incubar a 37°C a 200 rpm por uma noite inteira.
[0080]. Centrifugamos a 11 0000 rpm durante 5 minutos e adicionamos o tampão de lise 1 (Tris-HCI 10 mM, EDTA 5 mM, NaCI 50 mM) + inibidor de protease de 40 μΙ (3 g/ml_) + 50 μΙ de lisozima (10 mg/ml), mais o tampão de carga SDS (50 μΙ tampão simples 2x + 50 μΙ de ureia 8M + 5 μΙ de B-mercaptoetanol em 50 μΙ de amostra) por amostra e tudo foi homogeneizado e aquecido a 100 °C durante 5 minutos e, em seguida no gelo 5 minutos e de lá para carregar 20 μΙ, levou para carregar. 0.1 Amps para cada gel. Por 1:30.
[0081]. Abanda da proteína de interesse clyA-fibraFAdV-His foi observada nos resultados do Western Blot. Marcadores foram utilizados à esquerda o ladder P7709V (175 KDa), a da direita ab 116029 (245 KDa). (Figura 10) [0082]. Além disso, quando são utilizados dois controlos positivos His+, mas as iniciais A e B são pelo peso, A é aproximadamente 60 kDa e B é aproximadamente 30 kDa. Estes resultados permitem concluir que a fusão clyA-fibraFAdV-His é expressada com um peso molecular de aprox. de 85.4 kDa. (Figura 11) [0083]. O Western blot foi realizado para a cepa selvagem: Salmonella Enteritidis 3934, Δ: Salmonella Enteritidis 3934Vac; Δ-fibra: Salmonella enteritidis 3934Vac com fusão ClyAfibraFAdV-His no cromossomo, Δ-pfibra: Salmonella enteritidis 3934Vac expressando a fusão ClyAfibraFAdV-His a partir do plasmídeo.
[0084]. A análise eletroforética dos produtos de PCR revela a presença de clones que transportam a deleção de waaL (Figura 13)
Petição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 32/157
24/24 [0085]. Para os propósitos da presente invenção, o uso da cepa Salmonella enteritidis 3934vac em modelos experimentais sugeriu que ela funcionaria em modelo murino e mesmo aviário, [0086]. Em nossos testes, vimos que, quando inoculados em aves, isso não funciona bem, porque a infecção se desenvolve de qualquer maneira; A fim de alcançar a imunidade, foi feita uma deleção no gene waaL de Salmonella enteritidis 3934vac, com o qual a imunidade foi alcançada. Assim mesmo os testes de desafio com a cepa 3934vac sb13::clyA-fibraFAdV AwaaL mostraram que confere imunidade contra Salmonella e adenovirus aviário tipo-l prevenindo o aparecimento de hepatite de corpo de inclusão.
Depósito de microorganismos [0087]. As cepas SG-9R sb:ClyA-FIBRA 6His, 3934 vac-mutante Rugoso e 3934 vac-Fibra mutante Rugoso foram depositadas na Coleção Espanhola de Culturas Tipo (Paterna, Valencia, Espanha), seguindo as regras do Tratado de Budapeste ' para o depósito de microorganismos para fins de patentes nas seguintes datas e lhes foi atribuído o seguinte número de depósito
Material | Data do depósito | Número de acesso |
SG-9Rsb: ClyA-FIBRA 6His | 5 de abril de 2017 | CET 9331 |
3934 vac-mutante Rugoso | 5 de abril de 2017 | CET 9332 |
3934 vac-Fibra mutante Rugoso | 5 de abril de 2017 | CET 9333 |
[0088]. A presente invenção não está limitada ao âmbito dos microrganismos depositados na patente, uma vez que representam uma ilustração específica de um aspecto da invenção. Qualquer microrganismo ou plasmideo que seja funcionalmente equivalente aos descritos na invenção estão incluídos na invenção.
Claims (9)
- REIVINDICAÇÕES (SE-RUGOSA)1. Uma estirpe mutante de Salmonella enteritidis 3934vac caracterizada porque compreende uma deleção do gene waaL.
- 2. O procedimento para gerar uma cepa mutante de Salmonella enteritidis 3934 vac, caracterizado por compreender:• A construção de um vector integrativo, em que para a construção do vector integrativo são amplificados por PCR dois fragmentos flanqueadores ao gene waaL de 520 pb (oligonucleotídeos A e B) e 504 pb (oligonucleotídeos C e D), respectivamente, em que os oligonucleotídeos A, B, C e D são as sequências SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 4 , SEQ ID NO: 5 , SEQ ID NO: 6 • Purificar e clonar os produtos de PCR são separadamente em vectores pKOB para amplificação, para obter o vector resultante pKOB::DwaaLR1 para a amplificação, logo digestão enzimática, purificar e ligar no vector de pDESTINATIQN • Transformar em Escherichia coli o vector resultante pDEST::Waal e verificar por PCR, miniprep e digestão, em que, uma vez construído, o plasmídeo pDEST::waal_ é eletroporado nas cepas S. enteritidis 3934vac e 3934vac sb13::clyA-fibraFAdV, em que a sua integração é forçada pelo crescimento a 42°C e posterior excisão a 28 °C.• Verificar por PCR com oligos externos à construção (waaL E e F) a deleção do gene waaL por recombinação homóloga dupla, onde os oligos E e F são SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10.
- 3. Vacina aviária recombinante de Salmonella enteritidis caracterizada porque compreende uma cepa mutante modificada de Salmonella enteritidis 3934 vac uma deleção do gene waaL.Petição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 34/1572/3
- 4. Uma cepa mutante de Salmonella enteritidis 3934vac caracterizada por compreender a sequência completa do gene da fibra AVA-I e uma deleção do gene waaL.
- 5. Procedimento para gerar uma cepa mutante de Salmonella enteritidis 3934vac caracterizada por compreender:• Dispor uma cepa de Salmonella enteritidis 3934 vac.• Inserir através de um primeiro passo de recombinação homóloga um cassete de seleção, em que o cassete contém, além do gene para resistência a antibiótico, nas suas regiões flanqueadoras sequências complementares do prófago ST64B; em que no primeiro passo da recombinação homóloga a bactéria é eletroporada na presença do ADN linear portador do cassete de seleção.• Selecionar as colônias transformantes, após o primeiro passo de recombinação homóloga, em meio LB contendo o antibiótico.• Confirmar a presença do cassete no cromossomo de Salmonella enteritidis 3934 por PCR com os oligos de sequências SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO: 25.• Inserir através de um segundo passo de recombinação homóloga um cassete de expressão ClyA-fibraFAdV-His, em que o cassete de expressão substitui o cassete de seleção, em que a cassete de expressão compreende a sequência SEQ ID NO: 21 • Selecionar as cepas de Salmonella enteritidis 3934vac sb13::clyAfibraFAdV verificando o produto da expressão da sequência SEQ ID NO: 21 por Western Blot e SDS-PAGE.
- 6. Procedimento de acordo com a reivindicação, caracterizado por compreender também • Construir um vector integrativo, onde para a construção do vector integrativo são amplificados por PCR dois fragmentos flanqueadores aoPetição 870190090328, de 11/09/2019, pág. 35/1573/3 gene waaL de 520 pb (oligonucleotídeos A e B de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, respectivamente) e 504 pb (oligonucleotídeos C e D das sequências SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente).• Purificar e clonar os produtos de PCR são separadamente em vectores pKOB para sua amplificação, para obter o vector resultante pKOB::DwaaLR1 para sua amplificação, logo digestão enzimática, purificar e ligar no vector de pDESTINATION.• Transformar em Escherichia coli o vector resultante pDEST::waaL e verificar por PCR, miniprep e digestão, em que, uma vez construído, o plasmídeo pDEST::waaL é eletroporado nas cepas S. enteritidis 3934vac e 3934vac sb13::clyA-fibraFAdV, em que a sua integração é forçada pelo crescimento a 42°C e posterior excisão a 28 °C.• Verificar por PCR com os oligos SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, externos à construção da deleção do gene waaL por recombinação homóloga dupla.
- 7. Vacina aviária recombinante de Salmonella enteritidis caracterizada por compreender uma cepa mutante modificada de Salmonella enteritidis 3934 vac com uma sequência do gene de fibra AVAI e uma deleção do gene waaL.
- 8. Uma cepa mutante de Salmonella enteritidis 3934 vac, caracterizada por compreender um cassete de expressão SEQ ID NO: 21 e a deleção de waaL que é verificada pela presencia da sequência SEQ ID NO: 8
- 9. Uma estirpe mutante de salmonela enteritidis 3934 vac, caracterizada por compreender uma sequência SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 8.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PE000992-2017/DIN | 2017-06-12 | ||
PE2017000992A PE20171768A1 (es) | 2017-06-12 | 2017-06-12 | Obtencion de una salmonela enteritidis tipo rugosa y sus modificaciones geneticas para uso como vacuna aviar |
PCT/PE2018/000014 WO2018231078A2 (es) | 2017-06-12 | 2018-06-12 | Obtención de una salmonela enteritidis tipo rugosa y sus modificaciones genéticas para uso como vacuna aviar |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
BR112019018882A2 true BR112019018882A2 (pt) | 2020-04-14 |
Family
ID=68069984
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
BR112019018882A BR112019018882A2 (pt) | 2017-06-12 | 2018-06-12 | obtenção de uma salmonela enteritidis de tipo rugosa e suas modificações genéticas para uso como vacina aviária |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11242521B2 (pt) |
EP (1) | EP3640323A4 (pt) |
CN (1) | CN111094546A (pt) |
AR (1) | AR112083A1 (pt) |
BR (1) | BR112019018882A2 (pt) |
CL (1) | CL2021000485A1 (pt) |
CO (1) | CO2019012289A2 (pt) |
MX (1) | MX2019010015A (pt) |
PE (1) | PE20171768A1 (pt) |
WO (1) | WO2018231078A2 (pt) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PE20211141A1 (es) * | 2019-12-19 | 2021-06-25 | Farm Veterinarios S A C | Salmonella enteritidis recombinante y su uso como vacuna porcina |
PE20201405A1 (es) * | 2020-09-09 | 2020-12-02 | Farm Veterinarios S A C | Vacuna viva recombinante para sars-cov-2 basada en salmonella enteritidis recombinante |
CN112941088B (zh) * | 2021-02-04 | 2023-06-16 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心) | 与布氏杆菌毒力相关的基因及其在布氏杆菌毒力评价及制备弱毒布氏杆菌中的应用 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2323839B2 (es) | 2007-07-24 | 2010-07-08 | Universidad Complutense De Madrid | Cepa viva atenuada de salmonella enterica serovar choleraesuis como vacuna y vehiculo vacunal para el ganado porcino. |
ES2324084B1 (es) | 2007-11-21 | 2010-05-31 | Universidad Publica De Navarra | Procedimiento que permite producir modificaciones multiples en el cromosoma de bacterias gram negativas y cepas de salmonella deficientes en sintesis de c-di-gmp obtenidas por el mismo. |
ES2646320T3 (es) * | 2009-03-27 | 2017-12-13 | Eidgenössische Technische Hochschule Zürich | Salmonella enterica que presenta un N-glicano de C. Jejuni o derivados del mismo |
-
2017
- 2017-06-12 PE PE2017000992A patent/PE20171768A1/es unknown
-
2018
- 2018-06-11 AR ARP180101563A patent/AR112083A1/es unknown
- 2018-06-12 EP EP18817362.9A patent/EP3640323A4/en active Pending
- 2018-06-12 WO PCT/PE2018/000014 patent/WO2018231078A2/es unknown
- 2018-06-12 BR BR112019018882A patent/BR112019018882A2/pt unknown
- 2018-06-12 CN CN201880039313.4A patent/CN111094546A/zh active Pending
- 2018-06-12 US US16/491,765 patent/US11242521B2/en active Active
- 2018-06-12 MX MX2019010015A patent/MX2019010015A/es unknown
-
2019
- 2019-10-31 CO CONC2019/0012289A patent/CO2019012289A2/es unknown
-
2021
- 2021-02-26 CL CL2021000485A patent/CL2021000485A1/es unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CO2019012289A2 (es) | 2020-01-17 |
PE20171768A1 (es) | 2017-12-21 |
CL2021000485A1 (es) | 2021-07-02 |
US11242521B2 (en) | 2022-02-08 |
EP3640323A2 (en) | 2020-04-22 |
US20200370034A1 (en) | 2020-11-26 |
EP3640323A4 (en) | 2021-03-17 |
WO2018231078A3 (es) | 2019-03-07 |
WO2018231078A2 (es) | 2018-12-20 |
MX2019010015A (es) | 2019-11-21 |
AR112083A1 (es) | 2019-09-18 |
CN111094546A (zh) | 2020-05-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
TW493987B (en) | Salmonella vaccines | |
Barrow et al. | Contribution of Salmonella gallinarum large plasmid toward virulence in fowl typhoid | |
JP2002521345A (ja) | 鳥類病原体を制御するため生きた弱毒化サルモネラワクチン | |
JP5649881B2 (ja) | 無莢膜パスツレラ・ムルトシダhyaE欠失変異体 | |
ES2724729T3 (es) | Cepas avirulentas modificadas de Salmonella Gallinarum y composición farmacéutica usando las mismas | |
EP1267899B1 (en) | Ssa inactivated salmonella vaccines | |
AU763898B2 (en) | Attenuated microorganisms for the treatment of infection | |
WO2011091291A1 (en) | BACTERIUM COMPRISING A REGULATED rfaH NUCLEIC ACID | |
BR112019018882A2 (pt) | obtenção de uma salmonela enteritidis de tipo rugosa e suas modificações genéticas para uso como vacina aviária | |
JP2020512835A (ja) | 水産養殖動物におけるアエロモナス出血性疾患の予防及び制御のための弱毒生ワクチン | |
JP2009531029A (ja) | 弱毒化サルモネラ生ワクチン | |
AU6737190A (en) | Cross-protective salmonella vaccines | |
JP5745731B2 (ja) | サルモネラワクチン | |
WO2012092226A1 (en) | Veterinary vaccine composition against infections caused by salmonella | |
ES2824402T3 (es) | Vacunas atenuadas contra Pasteurella multocida y procedimientos de fabricación y uso de las mismas | |
CZ20003470A3 (cs) | Zeslabená bakterie nevratnou mutací, vakcina, která ji obsahuje a její použití | |
WO2005001069A1 (en) | Genetic marker for live bacterial vaccines | |
JP2005519872A (ja) | サルモネラ・ワクチン | |
CN111867622A (zh) | 经修饰的用于治疗布鲁氏菌病的布鲁氏菌疫苗株 | |
US20120082698A1 (en) | Mutants of francisella tularensis and uses thereof | |
CN105483051A (zh) | 鸡白痢沙门菌spiC-rfaL双基因敲除减毒株及其DIVA疫苗应用 | |
CN105483052A (zh) | 鸡白痢沙门菌spiC-rfc双基因敲除减毒株及其DIVA疫苗应用 | |
CN110669714B (zh) | 肠炎沙门菌减毒疫苗候选株的制备与应用 | |
US20170049872A1 (en) | Live salmonella vaccine and methods to prevent fowl typhoid | |
CN105524862A (zh) | 鸡白痢沙门菌spiC-rfaJ双基因敲除减毒株及其DIVA疫苗应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
B350 | Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette] |