ES2323839B2 - Cepa viva atenuada de salmonella enterica serovar choleraesuis como vacuna y vehiculo vacunal para el ganado porcino. - Google Patents
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Abstract
Cepa viva atenuada de Salmonella enterica
serovar Choleraesuis como vacuna y vehículo vacunal para el ganado
porcino. La presente invención proporciona una nueva cepa vacunal
viva y atenuada, incapaz de producir el factor alternativo sigma
(RpoS) y que, además, funciona como vehículo vacunal de antigenos
heterólogos. La construcción de la cepa se ha realizado mediante la
deleción en fase de la totalidad del gen que codifica el factor
alternativo sigma, rpoS, mediante doble recombinación
homóloga. La cepa es avirulenta, genéticamente estable, sin
marcadores de resistencia antibiótica y se diferencia fácilmente de
las cepas silvestres.
Description
Cepa viva atenuada de Salmonella enterica
serovar Choleraesuis como vacuna y vehículo vacunal para el ganado
porcino.
La presente invención se encuadra dentro del
campo de la Sanidad Animal. De forma más concreta, la invención se
refiere a la producción de una cepa viva de Salmonella
enterica serovar Choleraesuis (S. choleraesuis) atenuada
mediante la deleción de un gen, genéticamente estable y sin
marcadores de resistencia a antibióticos. Constituye una nueva cepa
vacunal frente a salmonelosis en porcino y un nuevo vehículo vacunal
frente a enfermedades del
cerdo.
cerdo.
Salmonella es un patógeno intracelular
que puede ocasionar gastroenteritis, fiebre entérica o bacteriemia
tanto en animales como en el hombre. Las bacterias del género
Salmonella son bacilos móviles, Gram negativos,
pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae y se
encuentran filogenéticamente próximas a los géneros Escherichia,
Shigella y Citrobacter.
En cuanto a su taxonomía, es importante destacar
la falta de unanimidad a la hora de denominar a las especies de
Salmonella y la notable confusión existente con los nombres
S. choleraesuis y S. enterica.
En 1980 se aprobó el nombre de S.
choleraesuis como único nombre de especie y con varias
subespecies; por otro lado, en 1987, se propuso que la única especie
del género se llamara S. enterica por ser S.
choleraesuis un término confuso al pertenecer también a uno de
los numerosos serovares que integran el género Salmonella; al
mismo tiempo, otros autores reconocían varias especies, y entre
ellas S. choleraesuis, mientras que, en 2000, la única
especie de Salmonella reconocida por el Código
Bacteriológico era S. choleraesuis. En resumen, ha habido
durante mucho tiempo una propuesta acorde al Código Bacteriológico
que iba cayendo en desuso (S. choleraesuis); y una propuesta
ilegítima que se iba utilizando cada vez más (S.
enterica).
Por fin, en 2005, la Comisión Judicial del
Comité Internacional de Sistemática de Procariotas decidió que el
género Salmonella está formado por tres especies: S.
enterica, S. bongori y S. subterranea, y entre los
numerosos serovares de la especie S. enterica, se encuentra
S. enterica serovar Choleraesuis (Tindall, et al.,
2005, Int J Syst Evol Microbiol, 55:
521-4; Shelobolina, et al., 2004, Appl
Environ Microbiol, 70: 2959-65; Euzéby,
2005, Int J Syst Evol Microbiol, 55:
547-9).
Debido a esta confusión, muchos de los
documentos anteriores a 2005 en los que se cita a S.
choleraesuis no se refieren a este serovar en concreto sino a la
especie tipo tal y como se denominaba anteriormente y que ahora es
S. enterica.
El tipo de enfermedad causada por
Salmonella depende del serovar y del hospedador implicados,
por lo que una clasificación práctica de serovares se basa en su
espectro de hospedador. Siguiendo este criterio, los serovares de
Salmonella se dividen en tres grupos: de hospedador
restringido, se asocian casi exclusivamente con un hospedador
concreto (como Typhi -humanos-, Abortusequi -caballos-, o
Abortusovis -ovejas-); adaptados a un hospedador, se asocian
principalmente con una especie aunque también pueden causar
enfermedades en otras (como Dublin -ganado vacuno- y Choleraesuis
-cerdos-); de hospedador no restringido, son ubicuos (como
Typhimurium y Enteritidis) y pueden causar enfermedades en una
amplia gama de hospedadores no relacionados.
La salmonelosis es una de las enfermedades
entéricas y septicémicas con mayor importancia económica para la
industria porcina y el serovar más frecuentemente aislado a partir
de los animales afectados es Choleraesuis. La preocupación
generalizada de las diversas administraciones por la elevada
prevalencia de Salmonella en el sector porcino ha originado
el establecimiento de una directiva europea (2003/99/CE) que obliga
a este sector a aplicar medidas de vigilancia epidemiológica para
controlar las infecciones por Salmonella a partir de enero de
2007.
Actualmente, existe una cepa vacunal frente a
esta enfermedad, carente del plásmido de virulencia, (Enterisol
SC-54) comercializada por Boehringer Ingelheim
(patente US5436001) cuya utilización ha sido aprobada en EEUU y
Alemania, pero no en otros países, como Taiwán, donde la incidencia
de S. choleraesuis es enorme y no se ha aprobado el uso de
la vacuna por problemas de seguridad (Ku, et al., 2005,
Infect Immun, 73: 8194-203).
Debido, fundamentalmente, a la posibilidad de
trabajar con el ratón como modelo experimental sencillo y
económico, gran parte de los trabajos realizados en cuanto a la
atenuación de las cepas de Salmonella se han basado en el
serovar Typhimurium. Sin embargo, los expertos están de acuerdo en
que los factores de virulencia no se pueden extrapolar de un
serovar a otro y, mucho menos, de un hospedador a otro. Por eso,
recientemente, se han abierto líneas de investigación que han dado
lugar a cepas vacunales contra Salmonella para cerdos
basadas en genes metabólicos (Kelly, et al., 1992, Infect
Immun, 60: 4881-90) o a mutantes
atenuados afectados en genes esenciales para la persistencia de
Choleraesuis en cerdo (Ku, et al., 2005, Infect
Immun, 73: 8194-203).
Por otro lado, se han utilizado bacterias
invasivas vivas como vehículos vacunales de expresión de antígenos
heterólogos (es decir, de antígenos procedentes de otros
organismos) y entre las bacterias utilizadas se encuentran algunos
casos del género Salmonella (Daudel, et al., 2007,
Expert Rev Vaccines, 6: 97-110). Así,
en la solicitud de patente US20030170211-A1, entre
otras bacterias, se utiliza una cepa de S. typhi como
sistema de liberación de ADN de alphavirus en células animales; la
patente US5877159-A1 presenta bacterias invasivas
vivas para expresar genes heterólogos en células animales mediante
un casete de expresión eucariota y, entre las posibles bacterias
invasivas, nombra a Salmonella; la patente
US6764687-B1 se refiere a bacterias vivas atenuadas
como vacunas que también pueden ser portadoras de genes
heterólogos, construidas mediante la mutación del gen cra y,
por lo tanto, por interferencia en el metabolismo de los
carbohidratos, tanto de Escherichia como de
Salmonella; en CN1730650 se describe una vacuna viva
recombinante contra el virus de la fiebre aftosa construida en
S. choleraesuis; US6905691-B1 hace referencia
a bacterias atenuadas mediante la mutación del gen surA,
acompañada o no de la mutación en otro gen, utilizadas como vacunas
o como vehículos de expresión de antígenos heterólogos y,
especialmente, de un fragmento de la toxina tetánica; WO9011687 se
refiere a mutantes de Salmonella en el gen phoP o en
el gen phoP y, simultáneamente, en los genes cya y
crp que se emplean como vacunas o bien como portadores de
antígenos de otros microorganismos patógenos.
Tanto la vacuna como el vehículo vacunal ideal
deberían ser seguros, fuertemente inmunogénicos, bien
caracterizados genéticamente y estables. Existe una necesidad
urgente de desarrollar cepas que funcionen como vehículos vacunales,
que ofrezcan un excelente perfil de seguridad y que sean capaces de
estimular una respuesta celular efectiva.
Un aspecto de esta invención se refiere a una
cepa viva atenuada de Salmonella enterica serovar
Choleraesuis construida mediante la mutación del regulador RpoS. Se
considera cepa viva atenuada aquella estirpe que mantiene su
capacidad de invadir y multiplicarse en el interior de su
hospedador, pero sin desarrollar el cuadro patogénico. La nueva
cepa ha sido depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo
(CECT), Universidad de Valencia, Campus de Burjassot, Edificio de
Investigación, 46100 Burjassot (Valencia) donde le ha sido asignado
el número de depósito 7268. Se ha utilizado Salmonella
enterica serovar Choleraesuis (según la nomenclatura vigente
desde 2005) por ser un serovar que está especialmente adaptado al
ganado porcino. Por comodidad, a partir de aquí la nombraremos como
S. choleraesuis.
Si bien los mutantes en rpoS de S.
typhimurium y de S. typhi son menos virulentos para el
ratón y el hombre, respectivamente (Rychlik and Barrow, 2005,
FEMS Microbiol Rev, 29: 1021-40;
Robbe-Saule, et al., 1995, FEMS Microbiol
Lett, 126: 171-6), también se ha
descrito, en ensayos de inhibición competitiva, cómo la deleción
del gen rpoS en S. typhimurium y S. enteritidis
no modifica la virulencia de las cepas en pollos (Rychlik and
Barrow, 2005, FEMS Microbiol Rev, 29:
1021-40). Por otro lado, se ha demostrado que cepas
atenuadas de Salmonella enterica serovar Typhi por
modificación de uno o más genes, con fenotipo RpoS+ son prometedoras
como vacunas y vehículos vacunales porque el fenotipo RpoS+
incrementa su poder inmunogénico (US7083794-B2).
Queda claro, por lo tanto, que el comportamiento de los mutantes en
rpoS de Salmonella depende del serovar y del
hospedador estudiados. En el área que nos ocupa, es fundamental
trabajar con cepas específicas para el cerdo.
La estrategia elegida para la construcción del
mutante se basa en la deleción en fase de la totalidad del gen que
codifica el regulador RpoS, rpoS, mediante doble
recombinación homóloga.
Con el mutante CECT 7268 se aprovechan las
especiales propiedades de adaptación al hospedador natural (cerdo)
de S. choleraesuis para ser utilizada como vehículo de
antígenos heterólogos dirigidos a esta especie animal y como vacuna
frente a la salmonelosis del cerdo. Esta cepa prolifera en
fibroblastos y sobrevive en macrófagos viables, células obtenidas a
partir de la lámina propia del intestino delgado del cerdo y que
constituyen la vía normal de entrada en el hospedador natural de
S. choleraesuis.
La construcción del mutante CECT 7268 nos ha
permitido desarrollar un nuevo concepto de atenuación de la
virulencia de Salmonella. Así, empleando cultivos celulares
primarios de cerdo normalmente no permisivos para el crecimiento de
S. choleraesuis (fibroblastos de la lámina propia intestinal)
la cepa construida presenta un fenotipo de proliferación elevado en
células viables, a diferencia de lo que ocurre con la cepa
silvestre e incluso con una vacuna viva atenuada comercial
(SC-54). Además, sobrevive en cultivos de
macrófagos primarios obtenidos de la lámina propia de la mucosa
intestinal, a diferencia de lo que ocurre con la cepa viva atenuada
comercial que es eliminada. Ambos resultados aseguran una mayor y
más prolongada estimulación de la respuesta inmune.
El método utilizado para realizar esta invención
cumple los requerimientos indispensables de seguridad biológica en
cuanto a vacunas de nueva generación. Por un lado, asegura la
estabilidad de la mutación puesto que la reversión al fenotipo
silvestre está totalmente impedida debido a la ausencia de dianas
requeridas para la recombinación homóloga o ilegítima a partir de
poblaciones naturales de bacterias. Por otro lado, la cepa
construida carece de marcadores de resistencia a antibióticos.
La avirulencia de esta cepa evidencia su empleo
como cepa vacunal. Por lo tanto, un aspecto de esta invención
incluye un kit de vacunación para cerdos contra las enfermedades
infecciosas producidas por S. choleraesuis, que comprende los
elementos y adyuvantes necesarios para contener y vehicular la cepa
vacunal. Además, para el control veterinario de la salmonelosis, es
importante poder diferenciar la cepa vacunal de las cepas
silvestres. Por ello, otro aspecto de esta invención se refiere a
la identificación de la cepa mutante mediante una sencilla reacción
de PCR utilizando como cebadores oligonucleótidos diseñados a partir
de las secuencias adyacentes al gen rpoS, como pueden ser
los cebadores descritos en SEQ ID NO: 3 y 4.
Otra aplicación de esta invención consiste en la
utilización de la cepa atenuada como vector vacunal de expresión o
transporte de antígenos heterólogos favorecido por su mayor
persistencia en células del sistema inmune junto a su mayor
persistencia en el interior de fibroblastos con respecto a las
cepas silvestres de S. choleraesuis. Tal y como ocurre en el
caso del uso de la cepa CECT 7268 como cepa vacunal, en su
aplicación como vehículo vacunal puede diferenciarse de las cepas
silvestres de S. cholerasuis mediante la técnica de la PCR
utilizando como cebadores oligonucleótidos diseñados a partir de
las secuencias adyacentes al gen rpoS; en este caso también
pueden utilizarse los oligonucleótidos descritos en SEQ ID NO: 3 y 4
como cebadores de la reacción.
Para facilitar la comprensión de las principales
características de la invención y formando parte integrante de esta
memoria descriptiva, se acompañan una serie de figuras. Con
carácter ilustrativo y no limitativo se ha representado lo
siguiente:
Figura 1. Muestra el esquema de la construcción
de la cepa mutante CECT 7268 según se describe en el ejemplo 1.
Figura 2. Supervivencia intracelular de S.
choleraesuis CECT 7268 en cultivos primarios de macrófagos
obtenidos a partir de la lámina propia del intestino delgado
porcino, tal y como se describe en el ejemplo 4.
Figura 3. Proliferación intracelular de la cepa
silvestre parental de S. choleraesuis (en barras negras), y
S. choleraesuis CECT 7268 (en barras blancas) en cultivos
primarios de fibroblastos obtenidos a partir de la lámina propia
del intestino delgado porcino (SIF). Se representa el número de
bacterias intracelulares en el interior de SIFs a las 2 horas
(panel A) y a las 24 horas (panel B) postinfección. Se describe en
el ejemplo 5.
Las cepas de S. choleraesuis empleadas se
cultivaron rutinariamente a 37ºC con agitación en medio LB
(Luria-Bertani). Las cepas transformadas con
plásmidos termosensibles se incubaron a 30ºC para evitar la pérdida
del plásmido. Los medios se complementaron con kanamicina (30
\mug/ml) o ampicilina (50 \mug/ml) cuando fue necesario. Para
obtener medio sólido se añadió agar (15 g/l).
Se utilizó S. choleraesuis CECT 915 (en
adelante, WT) como cepa silvestre para construir la cepa
mutante.
Habiendo descrito la presente invención, se
ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, los cuales
no son limitativos de su alcance, que viene definido exclusivamente
por la nota reivindicatoria adjunta.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Para la construcción de las cepas vacunales, se
optimizó para Salmonella choleraesuis (CECT 915) el método
previamente descrito para Escherichia coli y S.
typhimurium (Datsenko and Wanner, 2000, Proc Natl Acad Sci U
S A, 97: 6640-5). En la figura 1 se
representa el esquema de la construcción de la cepa mutante. Las
secuencias empleadas como moldes en el diseño de los
oligonucleótidos utilizados para delecionar rpoS se
obtuvieron a partir de la secuencia completa del genoma de S.
choleraesuis. En la figura 1, los números 1, 2, 3, y 4 se
corresponden con la nomenclatura de los oligonucleótidos utilizados
en esta invención y descritos en SEQ ID NO: 1, 2, 3 y 4,
respectivamente, que se representan con flechas en la figura 1.
Cada uno de los cebadores de la pareja de
oligonucleótidos descritos en SEQ ID NO: 1 y 2 se encuentra
integrado por un tándem formado por: (i) secuencias (destacadas en
gris) homólogas a la región que flanquea en el extremo 5'
(oligonucleótido 1) y en el extremo 3' (oligonucleótido 2) a
rpoS (flecha gris marcada con rpoS en la figura 1);
(ii) junto a secuencias (destacadas en negro) que hibridan con el
plásmido pKD4 en la región que flanquea el extremo 5'
(oligonucleótido 1) y el extremo 3' (oligonucleótido 3) del gen de
resistencia a kanamicina. Este plásmido codifica un casete de
resistencia a kanamicina (rectángulo negro marcado con km en
la figura 1) flanqueado por secuencias repetidas denominadas FRT
(marcadas en blanco en los extremos del casete de kanamicina en la
figura 1). pKD4 se utilizó como DNA molde de una PCR en la que se
utilizaron los oligonucleótidos 1 y 2 como cebadores y en la que se
amplificó un fragmento de 1,6 kb, en cuyos extremos se encontraban
las secuencias homólogas a las regiones flanqueantes al gen
rpoS que portaban los propios cebadores 1 y 2 en uno de sus
extremos. Este fragmento de PCR fue introducido mediante
electroporación en la cepa WT de S. choleraesuis en la que
previamente se había introducido, también por electroporación, el
plásmido termosensible pKD46, que porta el sistema \lambdaRed que
permite la recombinación homóloga del fragmento de PCR con el DNA
cromosómico. A continuación se seleccionaron las colonias en las que
se había producido el fenómeno de recombinación y que, por lo
tanto, habían incorporado el marcador de resistencia a antibiótico
y habían sido capaces de crecer en un medio con kanamicina 30
\mug/ml. Posteriormente, fueron analizadas con los cebadores
descritos en SEQ ID NO: 3 y 4 para determinar si se había producido
la recombinación en el lugar adecuado. Estos cebadores se diseñaron
basándose en la secuencia de las regiones flanqueantes a
rpoS (el gen nlpD para el diseño de SEQ ID NO: 3 y el
gen SC2853 para el diseño de SEQ ID NO: 4).
Finalmente, el gen de resistencia antibiótica
fue eliminado del cromosoma mediante la flipasa codificada en el
plásmido termosensible pCP20. Este plásmido recombinante se
introdujo en S. choleraesuis mediante electroporación. Las
bacterias transformadas, seleccionadas en medio con Ampicilina 50
\mug/ml, se incubaron a 30ºC en presencia de ampicilina hasta la
fase estacionaria de crecimiento. A continuación se elevó la
temperatura a 43ºC durante 24 horas para evitar la multiplicación
del plásmido y permitir su curación, es decir, su eliminación de
las bacterias. Por último se confirmó la desaparición del casete de
resistencia a kanamicina y la deleción del gen rpoS mediante
PCR utilizando los cebadores flanqueantes, descritos en SEQ ID NO 3
y 4 (señalados como 3 y 4 en la figura 1), obteniendo así la cepa
CECT 7268 de S. choleraesuis.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Con el fin de evaluar el efecto en la virulencia
del mutante construido y compararlo con la cepa silvestre parental
WT y la cepa atenuada comercial SC-54, se estimó el
denominado índice de competición (CI) tras inocular ratones BALE/c
por vía intraperitoneal (ip) con una mezcla bacteriana de la cepa
cuya virulencia queríamos analizar y de la cepa silvestre o
control. El CI es la relación entre el número de bacterias de cada
una de las dos cepas obtenidos tras la infección (output),
previa normalización con el número de bacterias del inóculo
(input):
(M_{o}/W_{o})/(M_{i}/W_{i}),
donde M es el número de bacterias de la cepa mutante,
W es el número de bacterias de la cepa parental, o es
el recuento del número de bacterias del output e i es
el recuento de las bacterias del input. Un mutante se
considera atenuado empleando este índice si el valor de CI es <
0,4.
CECT 7268, la cepa silvestre y
SC-54 se cultivaron durante 18-20
horas en medio LB a 37ºC sin agitación. Los cultivos se
centrifugaron, se lavaron dos veces con PBS estéril y se
resuspendieron en 5 ml de PBS estéril para obtener las dosis de
inoculación que se ajustaron mediante diluciones seriadas siguiendo
la relación 1 DO_{600} equivale a 10^{9} unidades formadoras de
colonias (ufc)/ml. Las dosis utilizadas oscilaron entre 1x10^{6}
ufc para WT y SC-54 y 1x10^{7} ufc en el caso de
CECT 7268. La cantidad de ufc de los inóculos se confirmó mediante
la siembra de diluciones seriadas en placas de LB y reacciones de
PCR a partir de las colonias obtenidas, utilizando los cebadores
descritos en SEQ ID NO: 3 y 4 de manera que en el caso de las cepas
WT y SC-54 se obtenía una banda de 2610 pares de
bases y en la cepa mutante CECT 7268, que tiene delecionado el gen
rpoS, la banda era de 1618 pares de bases. Para el ensayo se
utilizaron ratones BALB/c hembras de 6-8 semanas de
edad, que se dispusieron en grupos de 3 animales cada uno y a los
que se suministró agua y comida ad libitum bajo condiciones
normales de luz y temperatura. Se comparó el mutante CECT 7268 por
un lado con la cepa silvestre (WT) y por otro con la cepa comercial
SC-54. Los animales se inocularon
intraperitonealmente con 0,2 ml de las suspensiones bacterianas con
las dosis ajustadas según se acaba de describir. Los ratones fueron
sacrificados y necropsiados a las 72 horas o en estado moribundo. Se
extrajeron asépticamente muestras de bazo e hígado para determinar
el contenido exacto de las 2 cepas en cada animal. Para ello se
realizaron PCRs, a partir de las colonias obtenidas, utilizando los
cebadores descritos en SEQ ID NO: 3 y 4 tal y como se acaba de
describir para los inóculos. Se calculó el CI en la colonización de
los órganos siguiendo la fórmula descrita anteriormente. Los datos
obtenidos indicaron que CECT 7268 presentaba un alto grado de
atenuación con respecto a su cepa parental silvestre (véase tabla
1). Además, CECT 7268 presentó una significativa reducción de la
virulencia con respecto a la cepa viva atenuada comercial
SC-54.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Una vez comprobada la drástica atenuación en el
modelo murino, profundizamos en el análisis de la virulencia
realizando ensayos en el modelo porcino mediante infecciones mixtas
por vía oral entre la cepa silvestre, CECT 7268 y la vacuna viva
atenuada comercial (SC-54), calculando los niveles
de competición en la colonización de los nódulos linfáticos
mesentéricos mediante el cálculo del índice de competición (CI) tal
y como se ha detallado en el ejemplo 2 para el ratón. Para ello, se
inocularon oralmente 3 cerdos cruces de Landrace con Large
White de entre 5 y 6 semanas de edad. Los animales se agruparon
aleatoriamente en cuatro lotes de 3 animales cada uno. Los cerdos
se inocularon por vía oral; dos lotes con una mezcla de CECT
7268/WT y otros dos lotes con CECT 7268/SC-54 con
dosis de 10^{8} ufc (WT y SC-54) y 10^{9} ufc
(CECT 7268). Los animales fueron eutanasiados a los 3 días
post-inoculación. Tras la necropsia, se extrajeron
asépticamente muestras de nódulos linfáticos mesentéricos para
hacer recuento de la cantidad de bacterias recuperadas en cada
ensayo para cada cepa utilizando, como en el ejemplo 2, los
cebadores descritos en SEQ ID NO: 3 y 4 en reacciones de PCR. Los
datos de CI obtenidos, mostrados en la Tabla 2, confirman una
extraordinaria atenuación en la virulencia de CECT 7268 con
respecto a su cepa silvestre parental en el hospedador al que S.
choleraesuis está adaptado, el cerdo.
Ejemplo
4
Para determinar si la deleción del gen
rpos afecta a la supervivencia intracelular de S.
choleraesuis, se realizaron estudios de supervivencia
intracelular en cultivos primarios de macrófagos extraídos a partir
de la lámina propia del intestino delgado de lechones. Los
macrófagos constituyen una de las piezas esenciales de la inmunidad
innata, y participan activamente en la presentación de antígenos
para inducir una inmunidad adquirida satisfactoria.
Las líneas celulares de macrófagos estables
resultan más permisivas a la proliferación intracelular de
Salmonella que los cultivos primarios, no obstante, con el
fin de reproducir de una forma más fiable lo que puede ocurrir
in vivo, decidimos obtener cultivos primarios de la lámina
propia del intestino delgado de lechones que se expandieron hasta
conseguir un cultivo primario.
Para examinar el comportamiento de las cepas
atenuadas en cultivos primarios de macrófagos intestinales porcinos
(SIM) de la lámina propia se realizó un ensayo de protección a
gentamicina, en el que los macrófagos se mantuvieron con
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) al que se añadió un
10% de suero fetal bovino, 2% de L-Glutamina, 2,5%
HEPES y 1% de PenicilinalEstreptomicina/Fungizona Mix
(Biowhittaker), realizando las incubaciones a 37ºC con un 5% de
CO_{2}. La cepa silvestre WT, el mutante CECT 7268, así como la
cepa vacunal comercial SC-54, se cultivaron durante
18-20 horas en medio LB a 37ºC sin agitación. Se
determinó la concentración de los inóculos bacterianos sembrando
diluciones seriadas en placas de LB. Los ensayos de invasión,
proliferación y supervivencia intracelular se realizaron en placas
de 24 pocillos. Se inocularon los pocillos con una M.O.I.
(multiplicidad de infección bacterias: células eucariotas) de 10:1.
A continuación, las placas se incubaron durante 30 minutos a 37ºC
con 5% de CO_{2}. Tras esta incubación, se retiró el medio, se
lavaron las células tres veces con PBS estéril y se añadió medio de
cultivo de macrófagos suplementado con 100 \mug/ml de gentamicina
a cada pocillo para destruir las bacterias extracelulares. Después
de la incubación con gentamicina durante 1 hora y media, (2 horas
después de la infección), se retiró el medio y se sustituyó por
medio con 10 \mug de gentamicina/ml y se mantuvieron incubándose
24 horas más. En aquellos tiempos en los que se necesitaba realizar
un recuento del número de bacterias intracelulares (al cabo de las
2 ó 24 horas posinfección), se realizaron tres lavados con PBS
estéril y se lisaron las células añadiendo Tritón
x-100 al 1% en PBS estéril. Se hicieron diluciones
seriadas de los lisados y se sembraron en placas de LB para hacer
el recuento de ufc.
La tasa de crecimiento o supervivencia de la
bacteria en el interior de estas células se expresó como "índice
de proliferación" (Ipro), que se calculó como el cociente del
número de bacterias intracelulares a las 24 y 2 horas postinfección.
En la figura 2 se representa el Ipro de la cepa silvestre (WT), su
mutante en rpoS, CECT 7268, y la cepa vacunal
SC-54 en el interior de cultivos primarios de
macrófagos intestinales de lechón (SIM). En el eje de ordenadas se
representa el valor de Ipro que resulta de calcular el cociente
entre el número de bacterias viables a las 24 y a las 2 horas
postinfección más-menos su error estándar (\pm
ES). Los valores mostrados son la media y el error estándar de un
mínimo de tres experimentos independiente. En el eje de abscisas se
representan los valores de la cepa silvestre WT (2,1 \pm 1,3), el
mutante CECT 7268 (3,8 \pm 1,5) y SC-54 (0,2
\pm 0,4). La comparación de los valores de Ipro de las tres
estirpes, mostró que la tasa de crecimiento intracelular del mutante
CECT 7268 era ligeramente superior a la de la estirpe silvestre WT
(figura 2) y, especialmente destacable, que las dos cepas lograron
sobrevivir e incluso proliferar en macrófagos extraídos de la
lámina propia intestinal mientras que la cepa vacunal comercial
SC-54 es prácticamente eliminada al cabo de las 24
horas postinfección (figura 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Hasta hace poco tiempo, los fibroblastos eran
considerados una población homogénea de células con las únicas
funciones de prestar un soporte estructural a los tejidos y de
reparación de lesiones tisulares. Sin embargo, en la actualidad se
sabe que los fibroblastos constituyen una población heterogénea
formada por distintas subpoblaciones que intervienen en procesos
tan variados como la organogénesis, el control de la motilidad
intestinal o la respuesta inmune. Los fibroblastos participan
activamente en la generación de la respuesta inflamatoria aguda y en
su transición hacia la respuesta inmune adquirida. La abundancia de
fibroblastos en la zona de entrada de Salmonella y su
función moduladora de la respuesta inmune, sumado a la capacidad de
Salmonella para infectar fibroblastos in vitro,
muestran la importancia de estas células en la infección natural
por Salmonella.
La capacidad de las estirpes para proliferar en
el interior de estos fibroblastos en cultivo primario se examinó
mediante un ensayo de protección a gentamicina tal y como se
describe en el ejemplo 4. La tasa de crecimiento de la bacteria en
el interior de estas células no se pudo expresar como "índice de
proliferación" (Ipro) calculado como se describe anteriormente
en el caso de los macrófagos (recuento bacteriológico en medios de
cultivo) porque comprobamos que existía un porcentaje de células
muertas en las que las bacterias crecían considerablemente y que
enmascaraba el comportamiento de lo que ocurría en las células
vivas que son las que interesan como dianas de los vehículos
vacunales. Con estos precedentes se decidió determinar de forma más
precisa el número de bacterias en el interior de células vivas
individuales a las 2 y 24 horas postinfección (p.i.) mediante
observación microscópica de 100 células infectadas de tres
experimentos independientes. Las bacterias se detectaron mediante
inmunofluorescencia indirecta. Para ello, se realizaron los cultivos
celulares sobre lentillas de 11 mm antes de las infecciones,
posteriormente, las células fueron fijadas con paraformaldehido al
3% y permeabilizadas con saponina al 0,2% según protocolos
estándares. Para detectar Salmonella se utilizaron
anticuerpos primarios policlonares de conejo
anti-LPS (Lipopolisacarido) (Difco) y anticuerpos
secundarios anti-conejo marcados con isotiocianato
de fluoresceina (FITC; Sigma, Chemicon, Alexa 488 - verde- y alexa
594 -rojo-; Molecular Probes). Finalmente se usó DAPI
(4,6-diamidino-2-phenylindole;
1 \mug/ml) para teñir los núcleos celulares. En la figura 3 se
muestra el porcentaje de células infectadas que contenían un número
bajo \leq5, medio 6-20, ó elevado >20, de
bacterias (en negro se representa WT; y en blanco, CECT 7268) a las
2 horas postinfección (p.i.) (panel A) y a las 24 horas p.i (panel
B) en tres experimentos independientes. Las gráficas reflejan en
ordenadas la media \pm el error estándar (ES) del porcentaje de
células que estaban infectadas con diversos intervalos de número de
bacterias (1-5, 6-20, >20).
En la infección con la cepa silvestre WT, casi
la totalidad de las células infectadas (95,1%) contenían
1-5 bacterias a las 2 horas p.i, y un pequeño
porcentaje (4,9%) 6-20 bacterias (figura 3A). A las
24 horas p.i., la proporción de células infectadas con bajo número
de bacterias (1-5) disminuyó hasta el 63,1%,
aumentando el número de células que presentaban un número medio de
bacterias intracelulares (6-20) (24,2%) y
apareciendo un pequeño porcentaje de células con un elevado número
de bacterias (12,7%) (figura 3B). Cuando se analizó la población de
células infectadas con el mutante CECT 7268 a las 2 horas p.i., la
mayoría (71,9%) presentaron 1-5 bacterias en su
interior. Sin embargo, a las 24 horas p.i., un gran número de estas
células (79,9%) presentaban más de 20 bacterias intracelulares
(figura 3B). Estas bacterias se alojaban en grandes vacuolas.
Finalmente, en cuanto a la cepa vacunal
comercial SC-54, no se pudieron encontrar células
vivas infectadas tras 24 horas p.i, incluso a las 2 horas p.i. el
número de células infectadas era muy reducido y todas ellas
presentaban un número entre 1-5 de bacterias.
Claims (15)
1. Cepa viva atenuada de Salmonella
enterica serovar Choleraesuis caracterizada porque
carece de la actividad del regulador RpoS.
2. Cepa viva atenuada de S. enterica
serovar Choleraesuis, según la reivindicación 1,
caracterizada por la deleción del gen rpoS que
codifica el regulador RpoS.
3. Cepa viva atenuada de S. enterica
serovar Choleraesuis, según la reivindicación 2,
caracterizada porque la deleción del gen rpoS es una
deleción en fase.
4. Cepa viva atenuada de S. enterica
serovar Choleraesuis, según la reivindicación 3,
caracterizada porque la deleción en fase del gen rpoS
se realiza mediante una estrategia que evita la reversión de la
cepa mutada al fenotipo silvestre.
5. Cepa viva atenuada de S. enterica
serovar Choleraesuis, según la reivindicación 4,
caracterizada porque la estrategia elegida para evitar la
reversión de la cepa mutada al fenotipo silvestre es la doble
recombinación homóloga.
6. Cepa viva atenuada de S. enterica
serovar Choleraesuis, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a
5, caracterizada porque la deleción de rpoS no deja en
la bacteria marcadores de selección por resistencia a
antibióticos.
7. Cepa viva atenuada de S. enterica
serovar Choleraesuis, según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, caracterizada porque presenta mayor supervivencia
en cultivos primarios de macrófagos de cerdo que la cepa
parental.
8. Cepa viva atenuada de S. enterica
serovar Choleraesuis, según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, caracterizada porque presenta mayor capacidad de
proliferación en fibroblastos de lámina propia intestinal de cerdo
que la cepa parental.
9. Aislado biológicamente puro de la cepa de
S. enterica serovar Choleraesuis depositada en la Colección
Española de Cultivos Tipo con número 7268.
10. Uso de una cepa viva atenuada de S.
enterica serovar Choleraesuis como la que se describe en las
reivindicaciones 1 a 9, como vacuna frente a enfermedades
infecciosas producidas por S. enterica serovar Choleraesuis
en el cerdo.
11. Kit de vacunación para cerdos contra las
enfermedades infecciosas producidas por S. enterica serovar
Choleraesuis que comprenda un contenedor que incluya una cepa viva
atenuada como la descrita en las reivindicaciones 1 a 9.
12. Uso de una cepa viva atenuada de S.
enterica serovar Choleraesuis como la que se describe en las
reivindicaciones 1 a 9, como vehículo vacunal de antígenos
heterólogos.
13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
10 y 12, caracterizado porque la diferenciación entre la
cepa viva atenuada y las cepas silvestres de S. enterica
serovar Choleraesuis se realiza mediante cebadores diseñados en las
regiones adyacentes a la secuencia del gen rpoS de S.
enterica serovar Choleraesuis quedando limitadas dichas
regiones adyacentes, respectivamente, por los genes nlpD y
SC2853, ambos inclusive.
14. Uso según la reivindicación 13,
caracterizado porque los cebadores utilizados son los
descritos en SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.
15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
13 y 14, caracterizado porque la técnica utilizada para la
diferenciación entre la cepa viva atenuada y las cepas silvestres
de S. enterica serovar Choleraesuis es la técnica de la
PCR.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200702057A ES2323839B2 (es) | 2007-07-24 | 2007-07-24 | Cepa viva atenuada de salmonella enterica serovar choleraesuis como vacuna y vehiculo vacunal para el ganado porcino. |
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
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| ES2323839A1 ES2323839A1 (es) | 2009-07-24 |
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|---|---|---|---|
| ES200702057A Active ES2323839B2 (es) | 2007-07-24 | 2007-07-24 | Cepa viva atenuada de salmonella enterica serovar choleraesuis como vacuna y vehiculo vacunal para el ganado porcino. |
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|---|---|---|---|---|
| PE20171768A1 (es) | 2017-06-12 | 2017-12-21 | Farm Veterinarios S A C | Obtencion de una salmonela enteritidis tipo rugosa y sus modificaciones geneticas para uso como vacuna aviar |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6024961A (en) * | 1997-11-14 | 2000-02-15 | Washington University | Recombinant avirulent immunogenic S typhi having rpos positive phenotype |
| AU2006308966A1 (en) * | 2005-10-28 | 2007-05-10 | University Of Maryland, Baltimore | Attenuated salmonella enterica Serovar Paratyphi A and uses thereof |
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2007
- 2007-07-24 ES ES200702057A patent/ES2323839B2/es active Active
-
2008
- 2008-07-24 WO PCT/ES2008/000518 patent/WO2009013379A1/es active Application Filing
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| KU Y-W. et al. Novel Attenuated Salmonella enterica Serovar Choleraesuis Strains as Live Vaccine Candidates Generated by Signature-Tagged Mutagenesis. Infection and Immunity. 2005, Vol 73(12), páginas 8194-8203. Especialmente, página 8194, resumen; columna 1, párrafo 1 - columna 2, párrafo 3; página 8195, columna 1, párrafos 1-2; página 8198, columna 2 - página 8199, columna 1; página 8201, columna 1, párrafo 2 - columna 2, párrafo 1. * |
| METHNER et al. Intestinal colonisation-inhibition and virulence of Salmonella phoP, rpoS and ompC deletion mutants in chickens. Veterinary Microbiology. 2004, Vol 98, páginas 37-43. Especialmente, página 37, resumen; página 38, columna 1, párrafos 1-3; página 41, columna 1, párrafo 2. * |
| NICKERSON Ch A. & CURTISS III R. Role of Sigma Factor RpoS in Initial Stages of Salmonella typhimurium Infection. Infection and Immunity. 1997, Vol 65(5), páginas 1814-1823. Especialmente, página 1814, resumen. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2009013379A1 (es) | 2009-01-29 |
| ES2323839A1 (es) | 2009-07-24 |
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