ES2324084B1 - Procedimiento que permite producir modificaciones multiples en el cromosoma de bacterias gram negativas y cepas de salmonella deficientes en sintesis de c-di-gmp obtenidas por el mismo. - Google Patents
Procedimiento que permite producir modificaciones multiples en el cromosoma de bacterias gram negativas y cepas de salmonella deficientes en sintesis de c-di-gmp obtenidas por el mismo. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento que permite producir
modificaciones múltiples en el cromosoma de bacterias Gram
negativas y cepas de Salmonella deficientes en síntesis de
c-di-GMP obtenidas por el mismo.
El procedimiento permite realizar múltiples
modificaciones en el genoma de bacterias Gram negativas de forma
sencilla y eficaz, utilizando los plásmidos de la invención, que
contienen un gen indicador bajo el control de un promotor
constitutivo, un origen de replicación específico para bacterias
Gram negativas, un gen que codifica una proteína termosensible
esencial para la iniciación de la replicación del plásmido,
convirtiendo el origen de replicación en termosensible, y un gen de
contra-selección. La invención se refiere también a
cepas mutantes de Salmonella enterica obtenidas mediante el
procedimiento de la invención en las que parte o los doce genes que
codifican proteínas con dominio GGDEF han sido delecionados y al uso
de las mismas como vectores de expresión, agentes
inmunoterapéuticos y en estudios metabólicos.
Description
Procedimiento que permite producir
modificaciones múltiples en el cromosoma de bacterias Gram negativas
y cepas de Salmonella deficientes en síntesis de
c-di-GMP obtenidas por el mismo.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para realizar modificaciones en el genoma de una
bacteria Gram negativa que permite realizar múltiples
modificaciones sucesivas sobre una misma cepa bacteriana de forma
sencilla y eficaz, así como a los plásmidos que permiten llevar a
cabo dicho procedimiento. La invención se refiere también a dos
cepas mutantes de Salmonella enterica obtenidas mediante el
procedimiento de la invención en las que los doce genes que
codifican proteínas con dominio GGDEF han sido delecionados
(mutante \DeltaXII::Km y mutante \DeltaXII::Clo) y a cepas
derivadas de las anteriores, o de las cepas intermedias utilizadas
para su obtención, que son capaces de expresar una única proteína
GGDEF funcional, así como a los posibles usos de las mencionadas
cepas mutantes de Salmonella.
La primera asociación entre el
c-di-GMP y las proteínas GGDEF se
realizó durante el estudio de la síntesis de celulosa en
Gluconacetobacter xylinus (anteriormente denominada
Acetobacter xylinum). Un artículo pionero publicado por el
grupo de Moshed Benziman (Christensen, 1987) demostró que la
actividad de la subunidad reguladora de la celulosa sintetasa se
activaba tras la unión del dinucleótido cíclico
di-guanidin-monofosfato cíclico,
c-di-GMP (Fig. 1). Este trabajo
pasó desapercibido hasta que 11 años más tarde, este mismo grupo
proporcionó la primera conexión entre la síntesis/degradación del
c-di-GMP y las proteínas con
dominios GGDEF (dominio relacionado con la actividad diguanilato
ciclasa, es decir, con la síntesis de
c-di-GMP) y/o EAL (dominio
relacionado con la actividad fosfodiesterasa, es decir, con la
degradación del c-di-GMP y que puede
encontrarse aislado en un polipéptido o combinado con el dominio
GGDEF sobre la misma proteína). Mediante genética reversa y
utilizando la secuencia de aminoácidos de las proteínas con
actividad diguanilato ciclasa y fosfodiesterasa purificadas, Tal
et al. (Tal et al., 1998) clonaron y caracterizaron
tres operones implicados en el control de los niveles de
c-di-GMP en G. xylinus. Cada
uno de estos operones incluía dos genes, un gen que codificaba una
proteína con actividad diguanilato ciclasa, responsable de la
síntesis de c-di-GMP a partir de dos
moléculas de GTP y un gen que codificaba una fosfodiesterasa,
responsable de la degradación del
c-di-GMP a GMP. El análisis de las
secuencias de estas enzimas reveló que las seis proteínas parálogas
codificadas por estos tres operones tenían en común la presencia de
dos dominios, a los que se denominó GGDEF (anteriormente DUF1,
Domain of Unknown Function 1) y EAL (anteriormente DUF2),
debido a la presencia muy conservada de estas secuencias de
aminoácidos en cada uno de ellos. En base a estos resultados, el
grupo de M. Benziman propuso un modelo de regulación de la síntesis
de celulosa en el que proteínas con dominio GGDEF serían
responsables de la síntesis de
c-di-GMP mientras que las proteínas
con dominio EAL serían responsables de la degradación del
c-di-GMP. El
c-di-GMP se uniría a la subunidad
catalítica de la celulosa sintetasa activando de forma alostérica
la síntesis de la celulosa.
La reciente secuenciación de los genomas
bacterianos ha puesto de manifiesto que el dominio GGDEF es
extremadamente abundante, pudiendo contabilizarse hasta 4200
proteínas con dominio GGDEF en las bases de datos. A pesar de su
abundancia, la presencia de las proteínas con dominio GGDEF está
restringida a las bacterias y no se ha encontrado ninguna proteína
con este dominio en Arqueas o Eucariotas (Galperin, 2004). Dentro de
las bacterias, existen proteínas GGDEF en la mayoría de los genomas
secuenciados desde Aquifex y Thermotoga hasta las \alpha y
\gamma Proteobacterias. El dominio GGDEF está ausente de los
genomas de Bacteroidetes, Chiamidiales y
Fusobacteria. La abundancia de proteínas conteniendo este
dominio es muy variable entre las distintas especies bacterianas.
Así, el genoma de Escherichia coli contiene 19 proteínas con
dominio GGDEF, el genoma de Pseudomonas aeruginosa contiene
39 proteínas con dominio GGDEF, Bacillus subtilis tiene 4, y
el pequeño genoma de Rickettsia prowazekii contiene una única
proteína GGDEF. La bacteria con mayor número de proteínas GGDEF es
Vibrio vulnificus cuyo genoma contiene 66 proteínas con
dominio GGDEF.
Uno de los aspectos más llamativos de las
proteínas GGDEF es que, a pesar de su abundancia, la inmensa
mayoría de estas proteínas no ha sido relacionada con ninguna
función biológica. Así, hasta muy recientemente, ninguna de las 19
proteínas con dominio GGDEF de E. coli se había relacionado
con alguna función biológica. Una situación similar ocurre con las
39 proteínas del genoma de Pseudomonas aeruginosa o con las
41 proteínas del genoma de Vibrio cholerae. Tras este
letargo, en los últimos tres años y coincidiendo con el estudio
exhaustivo del proceso de formación de biofilms, se han descrito
numerosas proteínas con dominio GGDEF implicadas en distintos
procesos bacterianos, incluyendo la síntesis de exopolisacáridos y
formación del biofilm, procesos de diferenciación en Caulobacter
crescentus, virulencia de patógenos animales y de plantas y
regulación de genes implicados en fotosíntesis en Synechococcus
elongatus (para revisión consultar (Romling et al.,
2005, Ryan et al., 2006, Jenal & Malone, 2006, Tamayo
et al., 2007)). De forma general, se ha observado que
niveles elevados de c-di-GMP están
asociados con una mayor capacidad de la bacteria para adherirse a un
sustrato (sesilidad), la formación de biofilm y la expresión de
componentes adhesivos de la matriz extracelular, mientras que
niveles bajos de c-di-GMP se han
relacionado con una mayor motilidad y virulencia.
De forma general, y apoyados en el hecho de que
el dominio GGDEF suele estar con frecuencia acompañado de otros
dominios sensores (PAS, PAC, MASE2, HAMP), se ha sugerido que las
proteínas GGDEF podrían ser miembros de una red de transducción de
señal que permitiría adecuar la respuesta a estímulos externos
mediante la producción del transmisor secundario de señal, el
c-di-GMP. La pregunta que surge
inmediatamente es cómo diferentes estímulos pueden dar lugar a
respuestas particulares, si todos ellos convergen en la producción
de una misma molécula difusible, el
c-di-GMP, para transmitir la
señal.
La abundancia de proteínas implicadas en la
síntesis de c-di-GMP en los genomas
bacterianos, y el hecho de que su presencia esté exclusivamente
restringida al dominio Bacteria, no habiéndose descrito la
presencia de proteínas GGDEF en ningún genoma eucariota, ni en
ningún genoma de Arqueas hasta ahora secuenciados, convierten a
este mensajero de señal y a su ruta de señalización en una diana
interesante para el desarrollo de sustancias que bloqueen su
síntesis y, en consecuencia, la capacidad de formar biofilms,
adherirse a superficies o la virulencia de las bacterias.
Las infecciones causadas por las bacterias del
género Salmonella, tanto en animales como en seres humanos,
han sido causa de gran preocupación durante bastantes años. El
desarrollo de cepas atenuadas de Salmonella para generar con
ellas protección frente a las enfermedades causadas por las
bacterias de este género ha suscitado gran interés entre los
investigadores, que han intentado averiguar los factores de
patogenicidad de estas bacterias para intentar combatirlos. Entre
otros, la formación de biofilm es un importante factor de
patogenicidad de Salmonella, ya que le permite sobrevivir en
ambientes fuera del huésped, incluyendo el suelo y el agua, y así
pasar con facilidad del aparato digestivo del huésped al ambiente y
viceversa. La capacidad de formación de biofilms parece estar
ampliamente extendida entre los serotipos de Salmonella
enterica (una de las principales especies que da lugar a
infecciones intestinales) y, particularmente, entre los serotipos
Enteritidis (al que se hará referencia de aquí en adelante como
S. Enteritidis) y Typhimurium (al que se hará referencia de
aquí en adelante como S. Typhimurium).
Debido a su influencia en la patogenicidad y
virulencia, los factores que influyen sobre la capacidad de
formación de biofilms por parte de las especies de
Salmonella y otras especies patógenas tales como
Escherichia coli han sido objeto de gran interés. Así, por
ejemplo, la solicitud de patente estadounidense US2004/017517
reivindica un método para reducir la formación de biofilms en cepas
con capacidad para ello pertenecientes a la especie E. coli o
a los géneros Salmonella, Klebsiella o a los de
gamma-proteobacterias relacionadas, mediante el
incremento de los niveles de la proteína CsrA (abreviatura del
inglés carbon storage system), una proteína inhibidora de la
síntesis de glucógeno, proponiendo para ello varias alternativas:
el uso de un oligonucleótido modulador de su expresión; el aumento
de la expresión y/o traducción de genes implicados en la regulación
de la síntesis de dicha proteína CsrA, tales como CsrB, BarA, SdiA
y UvrY; el aumento de la actividad de la proteína UvrY mediante el
control de su grado de fosforilación o el incremento de la vida
media de dicha proteína o de su RNA mensajero. Las proteínas de la
familia GGDEF, por su parte, también han sido objeto de interés
para dilucidar su papel en la formación de biofilms.
El análisis de los genomas de distintos
serotipos de Salmonella enterica muestra la presencia de
hasta 12 proteínas con dominio GGDEF (Fig. 2A). Tal redundancia de
proteínas parálogas en ésta y otras bacterias supone un reto para
los estudios funcionales que pretenden dilucidar el papel
fisiológico de las rutas de señalización que tienen al
c-di-GMP como segundo mensajero. Dos
proteínas de esta familia (AdrA y el producto del gen inicialmente
identificado como STM1987, indicado en la Fig. 2A como GcpA) han
sido implicadas en procesos de síntesis de exopolisacáridos
(celulosa) y formación de biofilm (Romling et al., 2000,
Garcia et al., 2004). En el caso de STM1987 durante un
estudio dedicado a averiguar por qué la cepa SL1344 de S.
Typhimurium es incapaz de formar biofilms tanto en medios de
crecimiento ricos (LB) como en medios deficientes en nutrientes, se
encontró que el gen stm1987 (que codifica una proteína con
un dominio GGDEF, GcpA) es esencial para la formación de biofilm en
un medio deficiente en nutrientes (Garcia et al., 2004). En
este mismo trabajo, se construyeron cepas mutantes, en cada uno de
los genes que codifica una proteína que tuviese el motivo
GG[DE]EF conservado (donde [DE] indica la presencia
de ácido glutámico o de ácido aspártico en esa posición). El genoma
de Salmonella contiene seis proteinas (STM4551, STM2123,
STM1283, STM1703, STM3388, STM2672), además de AdrA y STM1987 que
presentan conservado este dominio. El análisis del fenotipo de estos
mutantes indicó que ninguno de ellos afectaba a la producción de
celulosa o a la formación de biofilm. Sin embargo, la
complementación de los mutantes en adrA o stm1987 con
cada una de las restantes proteínas GGDEF mostró que la mayoría de
las proteínas GGDEF eran capaces de compensar la deficiencia de
adrA o stm1987 y por tanto estas proteínas son
funcionales y están funcionalmente relacionadas, controlando los
niveles del c-di-GMP. Estos
estudios mostraron que el c-di-GMP
regula, entre otros procesos, la producción de celulosa y la
formación de biofilms. Ninguno de los estudios realizados, sin
embargo, dio lugar a cepas mutantes que carecieran de más de dos
miembros funcionales de la familia de proteínas GGDEF.
La presencia redundante de proteínas GGDEF en el
genoma de las bacterias dificulta enormemente la dilucidación de la
función particular de cada proteína GGDEF porque no es posible
descartar que los restantes miembros de la familia tengan alguna
influencia sobre el fenotipo en estudio cuando se inactiva una sola
de las proteínas de esta familia o un número reducido de ellas. Así
se señala en los estudios del grupo de Ute Römling (Simm et
al., 2004, Kader et al., 2006), en los que se concluye
que los niveles incrementados de
c-di-GMP no sólo afectan a la
biosíntesis de celulosa, sino que la elevación de dichos niveles
provocada por la sobreexpresión de la proteína AdrA conducen a la
activación de la biosíntesis de fimbrias curli, otro
componente de la matriz extracelular que se produce simultáneamente
con la celulosa, debido a que la producción de ambos elementos está
regulada positivamente por CsgD. En estos trabajos también se
observa que concentraciones elevadas de
c-di-GMP permiten superar la
regulación negativa que ejerce la temperatura sobre el morfotipo
multicelular rdar (del inglés red, dty and rough), un
comportamiento multicelular descrito en S. enterica y
Escherichia coli que refleja la expresión de celulosa y
fimbrias de tipo curli en la matriz extracelular. Está regulación
negativa se supera debido a que los niveles elevados de
c-di-GMP consiguen que se induzca la
expresión de CsgD a 37ºC. Como en el caso anterior, los estudios de
este grupo se produjeron mayoritariamente con mutantes en los que
se había inactivado como máximo una única proteína GGDEF y en
ningún caso con cepas en las que se hubieran inactivado más de tres
proteínas GGDEF, por lo que sus conclusiones sobre el impacto de
las proteínas GGDEF en la fisiología celular se redujeron a
confirmar el papel de CsgD como un regulador significativo de la
aparición del morfotipo rdar y a señalar que el impacto de cada
proteína GGDEF en concreto sobre el metabolismo de las bacterias
podría estar determinado parcialmente por el nivel de expresión de
cada proteína en particular.
Sería interesante encontrar un sistema que
permitiera estudiar la función precisa de cada uno de los miembros
de la familia GGDEF sin que la presencia de otros miembros de la
misma familia perturbara el fenotipo en estudio, preferentemente,
la formación de biofilms y su influencia en la patogenicidad. La
concepción y, sobre todo, el desarrollo de la herramienta apropiada
para tal finalidad se ha visto hasta ahora frenada por los
procedimientos utilizados habitualmente para las modificaciones del
genoma bacteriano.
La modificación del genoma de las bacterias se
realiza actualmente mediante un proceso en el que la zona del
genoma que se desea modificar se clona en un plásmido, se somete a
la modificación deseada y se introduce nuevamente en el cromosoma
de la bacteria mediante un proceso de recombinación homóloga. Para
facilitar la selección de las bacterias en las que se ha producido
la modificación, se introduce simultáneamente junto con la
modificación un gen marcador de selección. Tal como se utiliza en la
presente memoria, se denomina gen marcador de selección a un gen
cuya expresión da lugar a una proteína que permite la supervivencia
de las bacterias que lo poseen en unas determinadas condiciones de
crecimiento, que darían lugar a la paralización de la replicación
de las mismas o a la destrucción de su estructura celular en
ausencia del producto de dicho gen marcador de selección. El
ejemplo típico de gen marcador de selección lo constituyen los
genes que confieren resistencia a antibióticos: en presencia del
antibiótico, las bacterias que carecen del gen de resistencia no
pueden sobrevivir; las bacterias que poseen el gen cuyo producto
confiere resistencia a dicho antibiótico, en cambio, son capaces de
sobrevivir y replicarse en presencia del antibiótico, lo cual, en
teoría, permite seleccionar las bacterias que poseen el gen de
resistencia al antibiótico y la eliminación de las bacterias que no
lo poseen. Entre los genes de resistencia a antibióticos, los más
comúnmente utilizados en los métodos de modificación de los genomas
bacterianos son los que confieren resistencia a ampicilina,
kanamicina, tetraciclina o cloranfenicol (como el gen cat,
que codifica una cloranfenicol transacetilasa).
Cuando se utilizan los sistemas basados en
selección de bacterias modificadas mediante la presencia de genes
de resistencia a antibióticos u otros genes marcadores de
selección, cada modificación supone la inserción en el cromosoma de
la bacteria de un gen de resistencia a un antibiótico o de otro gen
marcador de selección. Este procedimiento presenta serias
limitaciones porque el número de marcadores de selección disponible
es pequeño, y por tanto el número de modificaciones que se pueden
realizar sobre una misma bacteria es limitado.
Además, en el caso de que se deseen realizar
varias modificaciones sobre la misma bacteria, es necesario
introducir un gen marcador de selección con cada modificación,
generando cepas multirresistentes a antibióticos, con los
importantes inconvenientes medio-ambientales que
esto conlleva para su posible utilización no confinada.
Para solucionar este problema se han
desarrollado distintos procedimientos que permiten eliminar los
marcadores de selección mediante la utilización de recombinasas
sitio-específicas: recombinasa
Cre-lox del fago/plásmido P1 (Ayres et al.,
1993), ParA-res (Kristensen et al., 1995),
TnpR-res (Camilli et al., 1994) o el sistema
Flp-FRT de Saccharomyces cerevisiae
(Cherepanov & Wackernagel, 1995). Las recombinasas reconocen
secuencias de ADN específicas que se sitúan a ambos lados del
marcador de selección, de forma que, tras el proceso de
recombinación, el marcador situado entre las secuencias es
eliminado junto con una de las secuencias de reconocimiento. Sin
embargo, durante la reacción en la que la recombinasa elimina el
marcador de selección, una de las secuencias de reconocimiento
flanqueantes no se elimina y queda como huella en el genoma. Tras
varias rondas de modificación en una misma cepa, el genoma tendrá
esparcidas por distintos puntos del mismo secuencias de
reconocimiento de la recombinasa. En esta situación, el riesgo de
que la recombinasa elimine fragmentos del genoma contenidos entre
dos secuencias de reconocimiento en lugar del marcador de selección
aumenta significativamente. Otra limitación de esta metodología es
que resulta muy difícil realizar pequeñas modificaciones o
sustituciones en el interior de un gen, porque el marcador de
selección que acompaña a la modificación o la secuencia de
reconocimiento de la recombinasa suponen por sí mismas una
alteración importante en la secuencia de ADN de la bacteria que se
está modificando.
Otra estrategia utilizada para realizar
manipulaciones de ADN, en ausencia de genes marcadores de
selección, se ha basado en la utilización de sistemas de
contra-selección. Aquí, el plásmido en el cual se ha
clonado el fragmento de ADN que lleva la modificación que se desea
introducir en el genoma de la bacteria, contiene además un gen que
codifica una enzima cuya presencia resulta tóxica en presencia de
un determinado sustrato en el medio de cultivo: a este gen es al
que se le denomina gen de contra-selección. De
forma que, una vez que el plásmido ha sido integrado por un proceso
de recombinación, la bacteria se crece en presencia del sustrato de
contra- selección y, en teoría, sólo las bacterias que pierden el
plásmido gracias a un segundo evento de recombinación son capaces
de sobrevivir. Varios sistemas de contra-selección
han sido utilizados: inhibición del crecimiento en presencia de
sacarosa mediada por el gen sacB (Ried & Collmer, 1987),
inhibición del crecimiento en presencia de acido fusárico mediada
por genes de resistencia a tetraciclina (Maloy & Nunn, 1981),
inhibición del crecimiento en presencia de análogos de nucleótidos
mediada por fosforibosil transferasas (PRT)
(Bitan-Banin et al., 2003, Fabret et
al., 2002, Peck et al., 2000).
La selección de las bacterias en las que se ha
producido modificación del genoma en dos pasos, es decir, una
primera integración del vector que contiene la secuencia con la
modificación deseada y la pérdida del vector concomitante a la
deleción del gen de interés, se ha intentado optimizar con vectores
en los que se expresa un gen indicador. Tal como se utiliza en la
presente memoria, se denomina gen indicador a un gen que codifica
una proteína cuya presencia da lugar a una característica visible,
fácilmente identificable, cuando dicha proteína está presente, lo
que indica que está presente también el gen que la codifica. A
diferencia de los genes de selección o
contra-selección, la presencia o ausencia de dicha
proteína no es determinante para la supervivencia del organismo
hospedador que la contenga en los medios de selección utilizados
habitualmente para su crecimiento. Los genes indicadores más
habituales son aquellos que codifican una proteína que es capaz de
transformar un compuesto en un segundo compuesto que presenta un
color diferente, fácilmente identificable. Uno de los genes más
utilizados para tal propósito es el gen lacZ, que codifica
una enzima \beta-galactosidasa que es capaz de
transformar el compuesto X-Gal
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranósido)
dando lugar a un compuesto de color azul; así, en presencia del gen
indicador, los organismos que lo posean (bacterias transformadas
con el plásmido de la invención en nuestro caso) aparecerán de
color azul cuando se incuben en presencia de X-Gal,
mientras que los organismos que no posean dicho gen (bacterias que
no hayan sido transformadas por el plásmido) aparecerán de color
blanco aunque se incuben en presencia de X-Gal.
Entre los genes indicadores, el más utilizado ha
sido el gen lacZ de Escherichia coli, insertándolo en
un plásmido bajo el control de un promotor constitutivo, como
sucede con el vector pORI (Leenhouts et al., 1996). En el
caso de dicho vector, sin embargo, aunque la presencia o ausencia
del gen lacZ permite una cribado sencillo de los eventos de
recombinación mediante el desarrollo en las colonias de color azul
o blanco en presencia de X-Gal, estos plásmidos
carecen del gen repA que codifica la proteína de iniciación
de la replicación y son incapaces de replicarse en las bacterias a
menos que se proporcione la proteína RepA en trans, por lo
que se requieren altas frecuencias de transformación para obtener
integraciones, estando limitado el uso de dichos vectores a
bacterias con alta eficiencia de transfor-
mación.
mación.
Otra estrategia utilizada para favorecer la
integración del plásmido y su perdida tras su escisión del
cromosoma es la combinación de marcadores de selección, sistemas de
contra-selección y orígenes de replicación sensibles
a la temperatura, como ocurre en el vector pKO3 (Link et
al., 1997), que contiene un gen de resistencia a cloranfenicol,
un gen sacB de contra-selección y un origen
de replicación termosensible. En estos sistemas, el crecimiento de
las bacterias a una temperatura superior a aquella por encima de la
cual el origen de replicación del plásmido no funciona como tal,
permite la selección de bacterias en las que el plásmido se ha
integrado en el cromosoma; posteriormente, tras crecer las
bacterias de nuevo a la temperatura permisiva para la replicación
del plásmido, las colonias resistentes a sacarosa y sensibles a
cloranfenicol serán las que podrán ser susceptibles de que el
plásmido se haya escindido, habiendo sido reemplazado el gen del
interés por las secuencias previamente alteradas que se deseaba
insertar. La práctica ha demostrado que este sistema da lugar a un
gran número de falsos positivos y no resulta válido para realizar
transformaciones rutinarias que implican varias modificaciones
consecutivas en el genoma de una misma bacteria.
Por todo ello, la introducción de modificaciones
consecutivas en los genomas de bacterias y, en especial, de
bacterias Gram negativas, mediante un método sencillo y que no dé
lugar en el genoma a alteraciones adicionales a las que se desea
introducir, ha representado un cuello de botella para la
modificación genética múltiple del cromosoma de las bacterias. Este
mismo problema dificultaba también el desarrollo de herramientas
útiles para el estudio de procesos biológicos en los que están
implicadas familias de proteínas que, como el caso de la familia de
proteínas GGDEF, parecen estar relacionadas en su función. La
presente invención proporciona solución a estos problemas.
La presente invención proporciona un método
sencillo para la modificación del ADN cromosómico de bacterias Gram
negativas sin necesidad de dejar incorporado, adicionalmente a la
secuencia modificada que se desea introducir en el genoma o que se
desea eliminar del mismo, un marcador de selección o una secuencia
de reconocimiento de una recombinasa. Este procedimiento
alternativo se basa en la combinación de los sistemas de contra-
selección y de presencia de un gen indicador como lacZ.
El sistema se basa en la utilización de un
plásmido cuya estructura permite la combinación de ambos sistemas
de selección. Por ello, es un objeto de la presente invención un
plásmido que contiene un gen indicador bajo el control de un
promotor constitutivo, un origen de replicación específico para
bacterias gram negativas, un gen que codifica una proteína
termosensible esencial para la iniciación de la replicación del
plásmido convirtiendo el origen de replicación en termosensible
(ori-ts) y un gen de
contra-selección. Se prefiere que el gen indicador
sea un gen lacZ, el promotor constitutivo sea el promotor
del gen clpB (pclpB) y el gen de
contra-selección es el gen sacB. En
cualquier caso, la presencia adicional de un gen de selección
permite una mayor fiabilidad en la selección de las bacterias que
han sido transformadas con el plásmido, por lo que son
realizaciones preferidas de los plásmidos de la invención aquellos
que además incorporan un gen marcador de selección, entre los
cuales se prefiere especialmente que el gen de selección sea un gen
que confiera resistencia a un antibiótico, por ejemplo, el gen
cat de resistencia a cloranfenicol. El plásmido pKO3blue,
que se utiliza posteriormente en los ejemplos de la presente
memoria, responde a todas las preferencias expresadas y es una
realización especialmente preferida de los plásmidos de la
invención.
Para poder amplificar el plásmido y obtener
copias del mismo, es necesario transformar con dicho plásmido una
bacteria cualquiera en la que el plásmido sea replicable. Por ello,
es también un objeto de la invención una cepa bacteriana
transformada con un plásmido de la invención y, particularmente, la
cepa Escherichia coli XL1Blue pKO3Blue, transformada con el
plásmido pKO3blue y que se ha utilizado para amplificar las copias
del plásmido utilizadas en los Ejemplos que se presentan más
adelante en la presente memoria.
El nuevo plásmido (pKO3blue) se ha construido
sobre la base del plásmido pKO3 en el que se ha clonado un gen
lacZ de Bacillus stearothermophilus que codifica la
\beta-galactosidasa procedente del plásmido pMAD
(Arnaud et al., 2004) (Fig. 3). El gen lacZ se expresa
constitutivamente, al estar bajo el control del promotor pclpB
(promotor del gen clpB de Escherichia coli, que
codifica para una chaperona esencial para la recuperación de las
lesiones provocadas por las elevadas temperaturas) (Parsell et
al., 1994) y se utiliza para seleccionar la inserción/escisión
del plásmido durante un proceso de recombinación homóloga que
permite introducir en el genoma la modificación deseada, tras haber
clonado en dicho plásmido el fragmento de ADN que contiene la
modificación (deleción, sustitución, inserción) que se desea
trasladar al cromosoma de la bacteria.
Este plásmido facilita en gran medida la
modificación del cromosoma de bacterias y la selección de bacterias
en las que se ha introducido la modificación deseada, pues combina
el sistema de contra-selección sacB-sacarosa
presente en el plásmido pKO3 y la presencia de un origen de
replicación termosensible (concretamente, el origen de replicación
derivado del plásmido pSC101 (Link et al., 1997) que actúa
como origen de replicación en el rango de temperaturas de
25-35ºC, pero no es funcional a partir de 43ºC,
comportamiento que muestra cuando está presente y se expresa el gen
repA, gen que codifica una proteína termosensible esencial
para la iniciación de la replicación del plásmido) junto con la
actividad \beta-galactosidasa introducida en dicho
plásmido. Esta combinación facilita enormemente la distinción entre
aquellas bacterias en las que el proceso de recombinación se
resuelve con la pérdida del plásmido de aquellas bacterias en las
que este proceso no se ha producido.
La Fig. 4 ilustra cómo se van produciendo los
sucesivos procesos de selección. En primer lugar, tras la
transformación de las bacterias con el plásmido, se seleccionan
aquellas bacterias que muestran actividad del gen indicador: las
colonias con color azul en el caso de colonias creciendo en placas
con un medio de cultivo que contiene X-Gal cuando el
gen indicador es lacZ. Una vez seleccionadas, las bacterias
transformadas se incuban a la temperatura restrictiva (43ºC en el
caso del pKO3blue) en presencia del antibiótico para el cual el
plásmido tiene un gen de resistencia. Dado que el origen de
replicación del plásmido no es funcional a dicha temperatura, sólo
conservarán el plásmido aquellas bacterias en las que el plásmido se
integre en el genoma de la bacteria mediante un proceso de
recombinación. Para realizar la selección de bacterias en las que se
integra el plásmido de aquellas bacterias en las que no se integra
el plásmido, se plaquea una alícuota del cultivo en una placa que
contenga el sustrato del gen indicador (X-Gal en el
caso del lacZ) y se seleccionan varias colonias en las cuales el
plásmido esté posiblemente integrado (en el caso de lacZ, las
colonias que hayan incorporado el plásmido en el genoma tendrán
color azul debido a la expresión del gen de la
(\beta-galactosidasa, lacZ). A partir de
las colonias seleccionadas en el paso anterior, se comienza el
proceso de selección de aquellas bacterias en las que se produce la
escisión del plásmido mediante un segundo evento de recombinación,
incubando las colonias a una temperatura permisiva (28ºC en el caso
de bacterias que han integrado el pKO3blue recombinante). En esta
etapa, como consecuencia de un segundo proceso de recombinación, en
un porcentaje de la población se producirá la escisión del
plásmido, perdiéndose la actividad
\beta-galactosidasa y, simultáneamente el gen de
contraselección y el gen que confiere resistencia al antibiótico.
Al sembrar diluciones del cultivo en placas que contengan el
compuesto que permita la detección de la ausencia o presencia del
gen indicador (X-gal para lacZ) y en
presencia del compuesto de contra-selección
(sacarosa para el gen sacB), se seleccionan teóricamente sólo
aquellas bacterias que hayan perdido el plásmido. En el caso de los
procedimientos llevados a cabo con pKO3blue (que tiene como gen
indicador lacZ y como gen de contraselección el gen
sacB), las bacterias se incubarán en presencia de
X-gal y sacarosa y las bacterias supervivientes
deberán aparecer de color blanco. Es importante señalar que esta
etapa representa uno de los pasos limitantes en el proceso de doble
recombinación que tiene lugar durante el intercambio alélico y es
una etapa que da lugar a un gran número de falsos positivos en los
procedimientos anteriores a la técnica descrita en esta invención,
desventaja que se ve soslayada gracias al procedimiento de
modificación del genoma de bacterias Gram negativas de la invención,
que utiliza los plásmidos de la invención previamente descritos.
Posteriormente, es conveniente confirmar que la modificación
deseada se ha introducido en el cromosoma de la cepa seleccionada,
lo cual puede hacerse, por ejemplo, llevando a cabo una reacción de
PCR utilizando una pareja de cebadores que permitan la amplificación
de la secuencia que supuestamente deba contener el fragmento
modificado (oligonucleótidos E y F en la Fig. 5).
Por todo ello, es otro objeto de la invención un
procedimiento para la modificación del genoma de una bacteria Gram
negativa que comprende las etapas de:
- a)
- clonar en un plásmido de la invención, dos secuencias de ADN flanqueantes a la región del genoma bacteriano que se desee modificar, de manera que ambas secuencias queden contiguas en dirección 5'-3' o separadas por el fragmento de ADN que se desee sustituir o insertar en el genoma bacteriano;
- b)
- transformar el plásmido obtenido en la etapa a) en la bacteria cuyo genoma se desee modificar;
- c)
- seleccionar la cepa transformada en la etapa b) utilizando un medio de cultivo que comprende el compuesto que da lugar a una reacción que es indicativa de que la bacteria en la que se produce dicha reacción ha sido transformada con el plásmido de la etapa a) y a una temperatura que permita la replicación del plásmido y el crecimiento de las bacterias transformadas;
- d)
- seleccionar la cepa que ha insertado en su genoma el plásmido con el que había sido transformada incubándola a una temperatura restrictiva en la cual el plásmido no es capaz de replicarse debido a su mecanismo de replicación termosensible;
- e)
- incubar cepas obtenidas en la etapa d) en un medio que contiene el sustrato que resulta tóxico al actuar sobre el mismo la enzima de contra-selección codificada por el plásmido y del compuesto que da lugar a una reacción que es indicativa de la ausencia del plásmido en el interior de la bacteria, para seleccionar aquellas cepas en las que se haya producido la escisión y pérdida del plásmido.
En este procedimiento, no es necesaria la
utilización de marcadores de selección y por tanto el número de
modificaciones que se pueden realizar sobre la misma cepa es
ilimitado. Es por ello que una realización preferida del
procedimiento de la invención es un procedimiento en el que las
etapas a) a e) se repiten secuencialmente más de una vez,
introduciendo en cada ronda una modificación diferente en el
genoma.
El procedimiento no necesita la incorporación de
ninguna secuencia de ADN exógeno, por lo que se pueden construir
modificaciones mínimas del genoma que conlleven la alteración de un
nucleótido particular dentro del genoma de la bacteria. Igualmente,
las modificaciones pueden ser de mayor amplitud y consistir en:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento resulta sencillo y barato y
permite construir cepas bacterianas con todas las modificaciones
genéticas que se deseen, teniendo como única limitación el efecto
negativo en la viabilidad de la bacteria que provoquen las
mutaciones generadas.
Cuando la bacteria Gram negativa que se quiere
mutagenizar es sensible a la transducción por fagos, el plásmido
integrado en el genoma (etapa d) podrá ser transferido a otras
cepas mediante el proceso de transferencia horizontal de ADN
denominado transducción generalizada, que consiste en la
transferencia de ADN entre bacterias a través de un fago vector. El
fago transportará del cromosoma de la cepa donadora al cromosoma de
la cepa receptora el fragmento de ADN que contiene integrado el
plásmido evitando las etapas b) y c) necesarias para la integración
del plásmido en la cepa receptora. Posteriormente se realizará la
escisión del plásmido mediante el proceso descrito en la etapa
e).
En el caso de Salmonella, de cada una de
las cepas con el plásmido integrado se pueden preparar lisados con
el fago P22 siguiendo el protocolo de Maloy et al. (Maloy
et al., 1996). En el caso de otras bacterias que se quiera
mutagenizar, habrá que utilizar un protocolo análogo con el fago
pertinente que sea susceptible de producir lisados en ellas.
Cuando la modificación del genoma se produce
utilizando plásmidos que contienen, además del gen indicador y el
gen de contra-selección, un gen marcador de
selección, la fiabilidad de la selección de las bacterias
transformadas con el plásmido es mayor. Por ello, son también
realizaciones preferidas de la invención aquellas en las que el
plásmido de la etapa a) es un plásmido que adicionalmente contiene
un gen de selección, la etapa c) de selección de la cepa
transformada en la etapa b) se lleve a cabo utilizando un medio de
cultivo que comprenda el compuesto de selección que elimine las
bacterias no transformadas con el plásmido de la etapa a) y la etapa
d) de selección de cepas que hayan insertado en su genoma el
plásmido se lleve a cabo utilizando un medio de cultivo que
comprende el mismo compuesto de selección. Se prefiere, como se ha
comentado, que el gen marcador de selección sea un gen que confiera
resistencia a un antibiótico. Cuando el plásmido de partida de la
etapa a) sea el plásmido pKO3blue, que contiene un gen de
resistencia a cloranfenicol, las etapas c) y d) se llevarán a cabo
en presencia de dicho antibiótico, cloranfenicol.
\newpage
Independientemente de que se utilice o no la
selección mediante antibióticos u otro gen de selección, si el
plásmido utilizado es el plásmido pKO3blue u otro plásmido
cualquiera que comprenda lacZ como gen indicador, la etapa
c) se llevará a cabo creciendo las bacterias sobre una placa de
cultivo, en presencia de X-Gal o añadiendo dicho
compuesto una vez que han crecido las colonias, pues es el
compuesto que da lugar a una reacción indicativa de que la bacteria
en la que se produce color azul ha sido transformada con el
plásmido de la etapa a). Esto permitirá seleccionar las bacterias
que hayan sido transformadas con el plásmido, pues serán aquellas
que aparezcan de color azul tras la incubación con
X-Gal. Igualmente, si el plásmido utilizando es
pKO3blue u otro plásmido que contenga el origen de replicación
termosensible derivado del plásmido pSC101 (es decir, su origen de
replicación es el origen de replicación derivado del plásmido
pSC101, que puede considerarse termosensible porque el plásmido
contiene un gen que codifica una proteína termosensible esencial
para la iniciación de la replicación, la proteína RepA
termosensible), la etapa d) se llevará a cabo a 43ºC o a una
temperatura superior a la misma que no cause la muerte de la
bacteria, mientras que la etapa a) se llevará a cabo a entre
25-35ºC, preferiblemente a 28º-30ºC. Por último, en
lo que se refiere al gen de contra-selección, cuando
el plásmido contenga el gen sacB, como es el caso del
plásmido pKO3blue, la etapa e) se llevará a cabo en un medio de
cultivo que contenga sacarosa, de manera que sobrevivan las
bacterias en las que se haya producido la escisión y pérdida del
plásmido, que serán aquellas resistentes a la presencia de
sacarosa.
Adicionalmente, es conveniente incorporar una
etapa en la que se comprueba que el genoma contiene la modificación
deseada. Por ello, se prefieren aquellas realizaciones del método
de la invención que incorporan una etapa adicional f) en la que se
comprueba, mediante amplificación de las secuencias y análisis de
los productos obtenidos mediante un método de análisis de
secuencias (como puede ser la propia secuenciación o, donde sea
aplicable, un método de comprobación del tamaño de los productos de
PCR obtenidos como puede ser una electroforesis) que el genoma
contiene la modificación deseada. En el caso de producirse
deleciones o inserciones de tamaño fácilmente detectable por
electroforesis, como puede ser la que se refiera a fragmentos
mayores de 500 pares de bases, la simple electroforesis de los
productos de PCR en presencia de marcadores de tamaño puede ser
suficientemente indicativa de que se ha producido la deleción o la
inserción deseada; en el caso de sustituciones puntuales o de
intercambio de secuencias de similar tamaño, es preferible recurrir
a métodos como la secuenciación para comprobar que se ha producido
la modificación deseada.
Como se ha comentado, las modificaciones pueden
consistir en deleciones, inserciones o sustituciones. El fragmento
o fragmentos de ADN a insertar en el plásmido de la invención en la
etapa a) se diseñarán y obtendrán teniendo en cuenta la
modificación que se desee realizar en el genoma bacteriano y la
localización del genoma en la que se desee producir dicha
modificación. En cualquier caso, para que pueda producirse el evento
de recombinación, el fragmento de ADN que se desee modificar en el
genoma deberá clonarse en el plásmido acompañado por las secuencias
flanqueantes a la región del genoma donde se va a introducir la
modificación. Si se desea producir una deleción, por ejemplo, lo
más práctico es amplificar las secuencias que flanqueen el
fragmento del genoma que se desee eliminar del cromosoma
bacteriano, diseñando parejas de cebadores adecuadas para ello, y
clonar ambas secuencias flanqueantes, una junto a otra, en el
plásmido. Utilizando un plásmido así diseñado, cuando se produzca
el evento de recombinación y la posterior escisión del plásmido, la
escisión podrá producirse de manera que se recupere la secuencia
salvaje o de manera que se elimine la secuencia comprendida entre
las dos secuencias flanqueantes, siendo necesario un proceso de
selección para identificar la cepa deseada. De manera similar puede
producirse la sustitución de una secuencia por otra, clonando en el
plásmido la secuencia por la que se quiere intercambiar el gen
diana, flanqueada por dos secuencias homólogas a las regiones que
flanquean al gen diana que se va a sustituir. Para la inserción en
el genoma de un fragmento de ADN, dicho fragmento será clonado en
el plásmido flanqueado por dos fragmentos de secuencia que estén
adyacentes al punto de inserción en el genoma bacteriano: La Fig. 5
muestra un ejemplo de amplificación y clonaje de las secuencias
flanqueantes al gen diana en el plásmido pKO3blue, útil para
producir la deleción del gen situado en el genoma entre ambas
secuencias flanqueantes, las comprendidas entre las parejas de
cebadores A/B y C/D. Los sitios de reconocimiento de las enzimas de
restricción dependerán de cada experimento, así como la posición de
los oligonucleótidos con respecto a la modificación que se desea
introducir. En el caso de querer sustituir una secuencia del genoma
por otra secuencia cualquiera, se podría clonar esa secuencia
cualquiera entre las dos secuencias ya clonadas en el plásmido que
son flanqueantes a la region del genoma que se quiere sustituir. En
el caso de querer insertar una secuencia cualquiera de ADN en el
genoma, esa secuencia cualquiera se podría donar entre las dos
secuencias ya clonadas en el plásmido que son flanqueantes a la
región del genoma en la que se quiere insertar esa secuencia.
Por todo ello, se prefieren las realizaciones
del procedimiento de la presente invención que comprenden las
etapas previas a cada ronda de modificación de:
- a)
- amplificar los fragmentos adyacentes a la región del cromosoma que se desea modificar;
- b)
- insertar ambas secuencias flanqueantes en un plásmido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 de forma que queden contiguas en dirección 5'-3' si se desea realizar una deleción o separadas por el fragmento de ADN que se desee sustituir o insertar en el genoma bacteriano.
Se prefiere que el tamaño de cada uno de los
fragmentos adyacentes amplificados sea de al menos 500 nucleótidos,
porque la recombinación homóloga es óptima con fragmentos de este
tamaño o superiores. No es aconsejable utilizar fragmentos de ADN
de un tamaño inferior a 250 nucleótidos, porque disminuye la
eficiencia de la integración del plásmido por recombinación
homóloga.
\newpage
Independientemente del método que se utilice
para su obtención y la modificación que se pretenda realizar, la
transformación de la bacteria con el plásmido podrá realizarse
mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica.
Se prefieren especialmente la electroporación o el choque
térmico.
Aprovechando el procedimiento de la invención,
que permite realizar modificaciones múltiples en el genoma de
bacterias Gram negativas, los inventores han construido dos cepas
de S. Enteritidis en las que se han delecionado los 12 genes
que codifican las proteínas GGDEF que posee esta bacteria. A la
bacteria obtenida se le ha denominado, de forma genérica, mutante
\DeltaXII; los mutantes específicos obtenidos han recibido las
denominaciones \DeltaXII::Km y \DeltaXII::Clo. La cepa mutante
\DeltaXII es incapaz de sintetizar
c-di-GMP (Fig. 7) y, por tanto, toda
la cascada de señalización que depende de este transmisor
secundario de señal está ausente en esta bacteria. El mutante
\DeltaXII es completamente avirulento (Fig. 8A), pero es capaz de
atravesar la barrera epitelial e invadir los órganos (Fig. 8B y 8C)
por lo que es un excelente candidato para el desarrollo de vacunas
atenuadas para la inmunización frente a infecciones por
Salmonella spp o como vector de expresión de antígenos de
cualquier organismo (xenoantígenos, incluidos alergenos y
fármacos), con fines inmunoprofilácticos o inmunoterapéuticos y
terapéuticos. Por todo ello, otro objeto adicional de la invención
lo constituyen las cepas mutantes de Salmonella spp. en la
que se han delecionado todos los genes que codifican las proteínas
GGDEF. En particular, es una realización preferida de dichos
mutantes de la invención aquella en la que la cepa mutante es una
cepa mutante de Salmonella enterica serotipo Enteritidis en
la que se han delecionado los doce genes que codifican proteínas
GGDEF y, particularmente, los casos específicos de mutante
\DeltaXII cuya obtención se describe posteriormente en los
ejemplos de la presente memoria descriptiva, obtenidos a partir del
aislado clínico 3934: los mutantes \DeltaXII::Km y
\DeltaXII::Clo.
A partir de estas cepas \DeltaXII::Km y
\DeltaXII::Clo y de cepas intermedias utilizadas para su
construcción, los inventores han construido dos cepas derivadas,
cada una de las cuales produce una única proteína GGDEF, mediante
reinserción del gen correspondiente. En estas dos cepas, la síntesis
de c-di-GMP depende de una única
proteína GGDEF. Estas cepas tienen un enorme valor para la búsqueda
de moléculas químicas que interfieran o bloqueen el metabolismo del
c-di-GMP, afectando a su viabilidad,
virulencia, capacidad de formación de biofilm, supervivencia en el
medio ambiente. Dado que el
c-di-GMP se encuentra exclusivamente
en bacterias, cualquier gen implicado en su síntesis / degradación
representa una diana potencial para el desarrollo de una nueva
familia de antimicrobianos. Así, constituyen otro objeto de la
invención las cepas de Salmonella spp. en cuyo genoma está
presente únicamente un gen funcional que codifica proteínas GGDEF,
así como las cepas intermedias útiles para su obtención, es decir
las cepas mutantes de Salmonella spp. en las que se ha
delecionado al menos uno de los genes que codifica para proteínas
GGDEF utilizando el procedimiento de la invención. De entre ellas,
se prefieren las cepas derivadas del serotipo Enteritidis de
Salmonella enterica (S. Enteritidis). En el caso de
los mutantes que poseen un único gen funcional que expresa una
proteína GGDEF, pueden obtenerse a partir de una cepa mutante
\DeltaXII (\DeltaXII::Km o \DeltaXII::Clo) reinsertando en
ellas el gen de interés previamente delecionado o a partir de
alguna de las cepas intermedias utilizadas para obtener dichas
cepas mutantes \DeltaXII, como pueden ser las cepas \DeltaI,
\DeltaII, \DeltaIII, \DeltaIV, \DeltaV, \DeltaVI,
\DeltaVII, \DeltaVIII, \DeltaIX, \DeltaX ó \DeltaXI que se
describen más adelante en los Ejemplos de la presente memoria.
(Como gen funcional se entiende el gen que es capaz de expresar la
proteína codificada en su secuencia y que es capaz de ejercer la
función reconocida para dicha proteína en las mismas condiciones en
las que lo haría en una cepa de Salmonella tipo
silvestre).
También es un objeto de la presente invención el
uso de cualquiera de estas cepas para el desarrollo de vacunas o
para la fabricación de medicamentos destinados a ser utilizados
como vacunas. En conexión con el uso anterior, es otro objeto de la
presente invención el uso de dichas cepas como vectores de expresión
de antígenos de cualquier organismo (xenoantígenos), que pueden ser
de otras cepas bacterianas o de otros organismos. También es objeto
de la presente invención el uso de dichas cepas como vectores de
expresión de fármacos.
Por su gran utilidad en este campo, es un objeto
más de la presente invención el uso de dichas cepas mutantes de
Salmonella para el estudio del metabolismo del
c-di-GMP, con particular preferencia
por aquellas cepas que expresan una única proteína GGDEF funcional.
En particular, constituye un uso específico del anterior el uso
para la identificación y desarrollo de sustancias químicas que
bloqueen la síntesis de c-di-GMP.
Finalmente, otros usos de las cepas mutantes de la invención que
constituyen objetos de la invención son el uso para el estudio de
los mecanismos de formación y bloqueo de la formación de biofilms
y/o de la relación de los biofilms con la virulencia.
La presente invención se explicará con mayor
detalle mediante las figuras y ejemplos que aparecen a
continuación. En ellos se describe la construcción de una
realización preferida de los plásmidos de la invención, el plásmido
pKO3blue. El mismo se utilizó para poner en práctica el
procedimiento de modificación de la invención, en primer lugar, para
conseguir dos mutantes deficientes en los 12 genes que codifican
proteínas GGDEF (\DeltaXII::Km y \DeltaXII::Clo) para,
posteriormente, reintroducir en \DeltaXII::Km, de forma
independiente, los genes previamente delecionados.
La Fig. 1 muestra la estructura del
c-di-GMP.
La Fig. 2 muestra, en la parte (A), la lista de
genes que codifican proteínas con dominio GGDEF en el genoma de
S. Enterica. En la tabla se indica, en la primera columna,
el número de la ORF (Open Reading Frame: Marco Abierto de
Lectura) en el genoma de S. Typhimurium LT2, el nombre
asignado a dicho gen (segunda columna), el nombre de la proteína
(tercera columna), el número de hélices transmembrana (cuarta
columna), se representa esquemáticamente la organización de
dominios conocidos en estas proteínas (quinta columna) y se indica
la conservación del motivo GGDEF en cada una de ellas. La parte (B)
muestra la posición en kilobases de los 12 genes que codifican
proteínas con dominio GGDEF en el genoma de S. Typhimurium
LT2.
La Fig. 3 muestra el mapa de los plásmidos pKO3
(plásmido de la parte superior izquierda), pMAD (plásmido de la
parte superior derecha) y pKO3blue (plásmido de la parte inferior).
Las etiquetas subrayadas junto a las líneas indican las posiciones
de las enzimas de restricción utilizadas para introducir el gen de
la \beta-galactosidasa que contiene el plásmido
pMAD en el plásmido pKO3. Las leyendas situadas sobre los plásmidos
corresponden a: repA: un gen que codifica una proteína
termosensible esencial para la iniciación de la replicación del
plásmido convirtiendo el origen de replicación
(pSC101-ts: origen de replicación termosensible
derivado del plásmido pSC101) en termosensible; cat: gen de
resistencia a cloranfenicol; \beta-gal: gen lacZ que
expresa la \beta-galactosidasa; sacB: gen
que confiere sensibilidad a la presencia de sacarosa.
La Fig. 4 muestra el proceso de intercambio
alélico mediante doble recombinación utilizado para introducir la
modificación del genoma de la bacteria Gram negativa que se desea
modificar. Para ello, en una primera recombinación homóloga, el
plásmido pKO3blue se inserta en el genoma de la bacteria Gram
negativa (1ª recombinación) y, posteriormente se escinde (2ª
recombinación) para generar la cepa salvaje original o la cepa
recombinante que contiene la modificación deseada. El crecimiento
en presencia del compuesto de contra-selección, a
la temperatura permisiva, permite identificar las bacterias que
contienen la modificación deseada: (WT: cepa recombinante idéntica
a la cepa silvestre original; MS: cepa mutante que contiene la
modificación deseada).
La Fig. 5 muestra un ejemplo del diseño
experimental utilizado para preparar la modificación que se desea
introducir en el genoma de la bacteria y su clonaje en el plásmido
pKO3blue. Las regiones flanqueantes al gen que se desea delecionar
se amplifican mediante PCR utilizando los oligonucleótidos A, B, C
y D. Los fragmentos amplificados se digieren con enzimas de
restricción cuya secuencia se ha introducido en la secuencia de los
oligonucleótidos B y C (XhoI) y se clonan en el plásmido pKO3blue
utilizando las enzimas que digieren en los oligonucleótidos A
(NotI) y D (BglII).
La Fig. 6 (A) muestra la capacidad de formación
de biofilm del mutante \DeltaXII::Km (parte derecha de las
fotografías, encabezada por "\DeltaXII") frente a la de la
cepa parental (parte izquierda de las fotografías, encabezada por
"S. Enteritidis 3934"). En el medio rico Luria Bertani
(LB) (foto superior) la cepa parental forma un biofilm a modo de
película en la interfase medio-aire tras 72 horas
de incubación a temperatura ambiente y en condiciones estáticas. La
cepa parental también es capaz de formar un biofilm a modo de anillo
adherido al vidrio en el medio deficiente en nutrientes denominado
ATM (foto inferior de la parte A) en el que la bacteria es incapaz
de multiplicarse y en el que se inocula una densidad optica de 0,4
medida a 590 nm y se incuba durante 4 horas a 37ºC con una fuerte
agitación. Como se puede observar el mutante \DeltaXII::Km fue
incapaz de formar biofilm en ambos medios. La parte (B) muestra la
capacidad del mutante \DeltaXII::Km para sintetizar celulosa
puesta de manifiesto en placas de calcofluor. Tanto la cepa
parental como el \DeltaXII::Km se incubaron durante 48 h a
temperatura ambiente en una placa de LB a la que se añadió
calcofluor (200 \mug ml^{-1}). El calcofluor es un fluorocromo
capaz de unirse a los enlaces \beta-glucosídicos
presentes en la celulosa, uno de los componentes de la matriz
exopolisacarídica que conforma el biofilm de Samonella, de
tal forma que las colonias de las cepas capaces de producir
celulosa se observan fluorescentes al observarlas bajo luz UV de
360 nm. A diferencia de la cepa parental el \DeltaXII::Km fue
incapaz de producir celulosa. La parte (C) muestra la capacidad del
mutante \DeltaXII::Km para sintetizar celulosa y fimbrias de tipo
curli al visualizar la morfología colonial en placas con Rojo
Congo. Tanto la cepa parental como el \DeltaXII::Km se incubaron
durante 48 h a 28ºC en placas de LB sin sal suplementadas con Rojo
Congo (40 \mug ml^{-1}) y Coomassie Brilliant Blue (20 \mug
ml^{-1}) y se analizó la morfología colonial. Se han establecido
varios morfotipos coloniales en este medio en función de la
capacidad de producir celulosa y fimbrias tipo curli, ambos
componentes esenciales del biofilm en Salmonella. Cuando la
cepa es capaz de sintetizar celulosa y fimbrias tipo curli las
colonias se observan rojas y rugosa (morfotipo rdar: red, dry and
rough, roja, seca y rugosa), si la cepa no es capaz de
sintetizar celulosa pero si fimbria tipo curli el morfotipo es bdar
(brown, dry and rough, marron, seca y rugosa), si la cepa es
incapaz de sintetizar fimbrias tipo curli pero si es capaz de
producir celulosa el morfotipo es pdar (pink, dry and rough,
rosa, seca y rugosa) y por último si la cepa es incapaz de
sintetizar tanto celulosa como fimbrias tipo curli el morfotipo es
saw (smooth and white, lisa y blanca). El mutante
\DeltaXII::Km presentó una morfotipo saw frente al morfotipo rdar
de la cepa parental lo que puso de manifiesto la incapacidad del
\DeltaXII::Km para producir celulosa y fimbrias tipo curli. La
parte (D) y (E) muestran el análisis de la movilidad en el mutante
\DeltaXII::Km. Salmonella es capaz de desplazarse sobre la
superficie de un medio sólido (swarming) (parte D). Para estudiar
esta capacidad se inoculó 5 \mul de un cultivo ON a 37ºC de la
cepa parental y del mutante \DeltaXII::Km en una placa de LB con
0,5% de agar y 0,5% de glucosa y se incubó ON a temperatura
ambiente. A diferencia de la cepa parental el mutante
\DeltaXII::Km no fue capaz de desplazarse sobre la superficie.
Salmonella también es capaz de nadar en el interior de un medio
semisólido (swimming) (parte E). Para estudiar esta capacidad se
inoculó 5 \mul de un cultivo ON a 37ºC de la cepa parental y del
mutante \DeltaXII::Km en una placa de LB con 0,3% de agar y se
incubó ON a temperatura ambiente. A diferencia de la cepa parental
el mutante \DeltaXII::Km no fue capaz de desplazarse en el
interior del medio.
La Fig. 7 muestra los niveles de
c-di-GMP mediante HPLC en la cepa
silvestre (S. Enteritidis 3934) (gráficos superiores) y el
mutante \DeltaXII::Km (gráficos inferiores). Los gráficos de la
parte derecha corresponden a muestras en las que se inyectó
c-di-GMP para comprobar la
localización del pico correspondiente a este compuesto. Se observa
que la cepa salvaje acumula una cantidad de
c-di.GMP de 1,46 pmoles/mg después de 24 horas de
incubación en placas de LB sin sal a 28ºC. Nótese que los niveles de
c-di-GMP en el \DeltaXII::Km no
son detectables. Los resultados representan la media de tres
experimentos independientes.
La Fig. 8 muestra el estudio de la virulencia de
la bacteria mutante \DeltaXII::Km. La parte (A) muestra el
estudio de supervivencia. Se indica en ordenadas el porcentaje de
ratones BALB/c, infectados por vía oral con 10^{9} ufc (unidades
formadoras de colonia) de la cepa silvestre 3934 (circulos sin
relleno, o) o de la cepa mutante \DeltaXII::Km (cuadrados
rellenos, \sqbullet) que sobreviven tras el número de días
post-infección que se indica en abcisas. Nótese que
todos los ratones infectados con la cepa salvaje mueren antes del
día 12 post-infección, mientras que ninguno de los
ratones infectados por la cepa \DeltaXII::Km muere. La parte (B)
muestra el ensayo de asa intestinal, en el que se indica el
logaritmo en base 10 del número de unidades formadoras de colonia
que se detectan por asa (log ugcs/asa) tras realizar a tres ratones
un ligamiento de un fragmento de intestino delgado que contenga una
o varias placas de Peyer, inocular una cantidad de 10^{7} ufc,
incubar durante 90 minutos, sacrificar al animal, cortar el trozo
de intestino comprendido entre las dos ligaduras, y analizar la
cantidad de bacterias que han sido capaces de atravesar la barrera
intestinal y colonizar las células del epitelio: la barra sin
relleno corresponde a la cepa silvestre 3934 (WT), mientras que la
barra con relleno oscuro corresponde a la cepa mutante
\DeltaXII::Km (\DeltaXII). La parte (C) muestra un gráfico
correspondiente al ensayo de colonización de órganos, en el que se
muestra en ordenadas el logaritmo en base 10 del número de unidades
formadoras de colonia que se detectan por órgano (log ufcs/órgano)
tras inocular oralmente 5 ratones BALB/c con una dosis subletal de
10^{4} ufc y sacrificar los animales tras 5 días de infección y
cuantificar la cantidad de ufc en bazo (primer par de barras) e
hígado (segundo par de barras). Como en el caso anterior, la barra
sin relleno corresponde a la cepa silvestre 3934 (WT), mientras que
la barra con relleno oscuro corresponde a la cepa mutante
\DeltaXII::Km (\DeltaXII).
La Fig. 9 muestra una esquematización del genoma
de la cepa mutante S. Enteritidis 3934 \DeltaXII+stm4551
en la que el gen csgA se ha sustituido por un gen indicador
para realizar ensayos de identificación de sustancias que inhiban
la síntesis de c-di-GMP mediante la
medida de la actividad enzimática de dicho gen indicador en
presencia de la sustancia química de ensayo. Los genes tachados son
los genes delecionados en dicha cepa.
La Fig. 10 muestra los Southern Blot realizados
para comprobar la deleción de dos de los genes GGDEF (los genes
stm1987 y stm3388) en el mutante \DeltaXII::Km. En
la primera calle se corrió DNA de la cepa parental en la que se
observar una banda correspondiente a la hibridación de la sonda con
el gen stm1987 (fotografía izquierda) y el gen
stm3388 (fotografía derecha) respectivamente. La segunda
calle se corresponde al mutante \DeltaXII::Km, en el que se ha
delecionado el gen con el que hibrida la sonda utilizada, por lo que
las sondas no son capaces de hibridar y por ultimo la tercera calle
corresponde a las cepas \DeltaXII+stm1987 y \DeltaXII+stm3388
respectivamente, en las que se demuestra que se ha resturado la
presencia de estos genes en el genoma de estas cepas. Los mismos
resultados se observaron en los Southern Blot que se realizaron
para cada uno de los 12 genes GGDEF.
Los presentes ejemplos muestran la construcción
del plásmido pKO3blue y el uso del mismo, en conjunción con el
procedimiento de la invención, para realizar modificaciones en el
genoma de una bacteria Gram negativa, concretamente, para la
obtención de las cepas de S. Enteritidis.
El plásmido se construyó clonando un gen que
codifica la (\beta-galactosidasa en un plásmido
que posee un origen de replicación termosensible (véase la Fig. 3).
En este caso, se ha clonado el gen de la
\beta-galactosidasa de Bacillus
stearothermophilus obtenido desde el plásmido pMAD en el
plásmido pKO3 (Link et al., 1997). Para ello, el plásmido
pMAD (Arnaud et al., 2004), que contiene la secuencia que
codifica la \beta-galactosidasa bajo el promotor
pclpB, se digirió con BamHI/StuI y se clonó el gen de la
\beta-galactosidasa entre los sitios de
restricción BamHI/SmaI del plásmido pKO3.
Para facilitar la amplificación de este
plásmido, se transformó mediante electroporación la cepa de E.
coli XL1 Blue con el plásmido recombinante obtenido,
obteniéndose la cepa Escherichia coli XL1 Blue pKO3blue, que
se depositó en la Colección Española de Cultivo Tipo, otorgándosele
el número de acceso CECT 7241, según se refleja en el apartado de
"Depósito de Microorganismos".
Cualquier otro plásmido conteniendo un origen de
replicación termosensible y otro gen indicador podría servir para
la misma finalidad.
Para obtener el plásmido con el que transformar
las bacterias, se procedió al clonaje en el plásmido resultante,
pKO3blue, de dos fragmentos de ADN de aproximadamente 500
nucleótidos cuya secuencia correspondía, en cada caso, a las zonas
adyacentes a la región del cromosoma que se desea modificar (véase
la Fig. 5). Estos fragmentos se obtuvieron mediante amplificación
por PCR utilizando las parejas de nucleótidos NB y C/D aplicables
en cada caso según el gen que se deseaba delecionar. A y B forman
una pareja de cebadores que permiten la amplificación de una de las
regiones flanqueantes del gen que se desea eliminar, mientras que C
y D forman una segunda pareja de cebadores que permiten la
amplificación de la región flanqueante situada en el extremo
contrario del gen que se desea delecionar. La amplificación se
realizará de forma que al fusionar ambos fragmentos en el plásmido
se producirá la modificación que se desea introducir en el cromosoma
de la bacteria: sustitución, deleción o inserción de una secuencia.
En el caso de la construcción del mutante \DeltaXII::Km y del
mutante \DeltaXII::Clo, todas las modificaciones deseadas
consistieron en deleción de genes, concretamente, los de la familia
GGDEF. Así, la modificación deseada en cada una de las 12 rondas de
modificación efectuadas fue la deleción del fragmento de secuencia
situado en el genoma entre las regiones flanqueantes AB y CD. Cada
uno de los genes GGDEF fue delecionado completamente desde el codon
de inicio de la traducción (ATG o GTG) hasta el codon de parada de
la traducción y 6 nucleótidos de la secuencia por delante del codon
de inicio y por detrás del codon de parada también fueron
delecionados y sustituidos por la secuencia de una diana XhoI
(incorporada en los oligos B y C correspondientes). El gen
yeaJ se delecionó mediante recombinación con un fragmento
lineal de ADN introduciendo un cassette de resistencia a un
antibiótico mediante el método de Datsenko y Wanner (Datsenko &
Wanner, 2000). Por un lado un fragmento del gen yeaJ fue
delecionado por la inserción de un cassette de Kanamicina
obteniéndose el mutante \DeltaXII::Km y por otro lado el gen
yeaJ fue delecionado completamente desde el codon de inicio
hasta el codon de parada introduciendo un cassette de resistencia a
Cloranfenicol obteniéndose el mutante \DeltaXII::Clo.
Los oligonucleótidos utilizados como cebadores
en la amplificación de los fragmentos en cada uno de los genes
delecionados, y los oligonucleótidos empleados para mutar el gen
yeaJ mediante el método de Datsenko & Wanner se muestran
a continuación en la Tabla 1.
Las condiciones de las reacciones de PCR para
amplificar las regiones AB yCD y para comprobar el clonaje de los
fragmentos AB y CD en el plámido pGEMt-easy fueron
las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Los fragmentos de ADN obtenidos mediante
amplificación por PCR utilizando las correspondientes parejas de
oligonucleótidos A/B y C/D se clonaron en el plásmido
pGEMt-easy. El plásmido que contenía el producto de
amplificación obtenido con los oligonucleótidos NB se digirió con
las enzimas de restricción NotI-XhoI y el plásmido
conteniendo el producto de amplificación obtenido con los
oligonucleótidos C/D se digirió con las enzimas de restricción
XhoI-BglII. Los productos de la digestión se
resolvieron en geles de agarosa y los fragmentos AB y CD se
purificaron desde un gel de agarosa utilizando un kit
comercial.
Los fragmentos purificados se ligaron
simultáneamente con el plásmido pKO3blue digerido con las enzimas
NotI-BglII y se transformó mediante
electroporación la cepa de E. coli XL1Blue con el plásmido
recombinante obtenido.
Los transformantes obtenidos se analizan
mediante PCR utilizando como cebadores la pareja formada por A y D
y las siguientes condiciones:
Posteriormente se purificó el plásmido de un
clon positivo.
El plásmido pKO3blue obtenido en el Ejemplo 2
conteniendo los fragmentos AB y CD se introdujo mediante
electroporación en la cepa S. Enteritidis 3934 (depositada en la
Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso
CECT 7236) y las bacterias electroporadas se incubaron durante 4 h
a 28ºC en medio líquido, después se sembraron en placas con un
medio de cultivo conteniendo cloranfenicol (20 \mug/ml), y
X-gal
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranósido)
(40 \mug/ml) y se incubaron a 28ºC durante 72 h. La cepa de S.
Enteritidis transformada se seleccionó como una colonia azul
(véase la Fig. 4).
Una vez seleccionada, la cepa se inoculó en
medio líquido precalentado a 43ºC conteniendo cloranfenicol (20
\mug/ml) y se incubó a 43ºC durante 48 h para permitir la
integración del plásmido en el cromosoma de la bacteria por un
proceso de recombinación homóloga (Recombinación tipo Campbell).
Dado que el plásmido tiene un origen de replicación termosensible,
no es capaz de replicarse a 43ºC y sólo podrán crecer en presencia
de cloranfenicol a 43ºC, aquellas bacterias que integren el
plásmido en el cromosoma. 75 \mul del cultivo se plaquearon
mediante agotamiento por estrías en una placa precalentada a 43ºC
que contenía un medio de cultivo con cloranfenicol (20 \mug/ml) y
X-gal (40 \mug/ml) y se incubó a 43ºC durante 48
horas. Tras la incubación, se seleccionaron de seis a nueve
colonias (según el gen) en las cuales el plásmido estaba
posiblemente integrado (colonias azules) y se replicaron en placas
precalentadas a 43ºC que contenían un medio de cultivo con
cloranfenicol (20 \mug/ml) y X-gal (40 \mug/ml)
y se incubó a 43ºC durante 48 horas. Las colonias que habían
incorporado el plásmido en el genoma mostraban color azul debido a
la expresión constitutiva del gen de la
\beta-galactosidasa. La integración del plásmido
fue comprobada por PCR utilizando los oligos A y F (vease Fig. 5),
y utilizando las siguientes condiciones de PCR para amplificar la
region cromosómica comprendida entre los oligos A y F:
\newpage
Se seleccionaron aquellas que no presentaban
amplificación y que por lo tanto llevaban el plásmido integrado.
Las cepas con el plásmido integrado se guardaron en glicerol a
-80ºC.
A partir de dos integrados (colonias azules) se
comenzó el proceso de escisión, incubándolos en medio líquido sin
antibiótico a 28ºC durante 24 horas. En esta etapa, como
consecuencia de un segundo proceso de recombinación, en un
porcentaje de la población se producirá la escisión del plásmido
perdiéndose la resistencia a cloranfenicol y la actividad
\beta-galactosidasa. Se sembraron diluciones del
cultivo en placas de cultivo conteniendo X-gal y
sacarosa (5%), y las placas se incubaron 24 horas a 28ºC.
Una serie de colonias blancas (por ejemplo 24)
se seleccionaron y se repicaron en placas de cultivo con
cloranfenicol (20 \mug/ml) y en placas de cultivo conteniendo
X-gal y sacarosa (5%). Se seleccionaron las colonias
cloranfenicol sensibles y de estas colonias se realizó una reacción
de PCR utilizando los oligonucleótidos E y F (véase la Fig. 5) y se
utilizaron las siguientes condiciones en las reacciones de PCR:
El tamaño del fragmento obtenido en la
amplificación permite identificar aquellas colonias que han
incorporado en el cromosoma la mutación deseada (dibujo situado en
la parte inferior derecha en la Fig. 4) y descartar aquellas
colonias en las que tras la segunda recombinación recuperan la copia
salvaje del gen (dibujo situado en la parte inferior izquierda en
la Fig. 4). El producto de la PCR se digiere con la enzima XhoI y
además se secuencia para garantizar su especificidad.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Los oligonucleótidos E y F utilizados para cada
gen delecionado y el tamaño de los fragmentos amplificados por
ellos se muestran en la Tabla 2:
Una vez confirmada la modificación introducida
en el cromosoma de la cepa por PCR, digestión del producto de PCR y
secuenciación del producto de PCR, el proceso se puede repetir
tantas veces como se desee. Para realizar modificaciones sobre
genes cuya alteración puede afectar la termosensibilidad de la
bacteria huésped, se podrán modificar las temperaturas para cada una
de las etapas.
Este procedimiento fue seguido, en primer lugar,
para producir una deleción en el gen adrA (stm0385).
Posteriormente se fueron produciendo deleciones en los genes
stm1987, yciR, yegE, yfiN, yhdA,
stm3388, yhjK, stm4551, yfeA y
stm2503. De esta manera se generó una colección de mutantes
individuales en los que se provocaron deleciones en cada una de los
genes que codifican proteínas GGDEF en el genoma de S.
Enteritidis.
Tal como se ha comentado previamente, para
conseguir la mutación secuencial de varios genes y si la cepa Gram
negativa que se quiere mutagenizar es sensible a la transducción
por fagos se puede utilizar el siguiente procedimiento: Al
construir las cepas en las que se ha delecionado/insertado/alterado
cada uno de los genes diana de forma individual utilizando el
proceso descrito anteriormente, pueden guardarse en glicerol a -80ºC
las cepas en las que el plásmido pKO3blue está integrado en estos
genes diana. Estas cepas deben ser incubadas a 43ºC y en presencia
de cloranfenicol para evitar que el plásmido se escinda. Partiendo
de un mutante individual en un gen A, se lleva a cabo un proceso de
transducción utilizando un lisado obtenido a partir de una cepa que
contiene el plásmido pKO3blue integrado en uno de los genes diana,
por ejemplo el gen B. El fago transporta el plásmido integrado
junto a la región flanqueante del cromosoma y por recombinación
homóloga de las regiones flanqueantes se integra el plásmido en la
cepa en la que se ha producido previamente la mutación del gen A
para proceder a la modificación del gen B. Posteriormente se
procede a la escisión del plásmido mediante el proceso descrito
anteriormente. De esta manera se obtiene un doble mutante en los
genes A y B. Este proceso se puede repetir secuencialmente tantas
veces como se desee y en el orden que se desee.
En este ejemplo, para conseguir la mutación
secuencial de cada uno de los genes que codifican estas proteínas
se siguió el siguiente procedimiento: Una vez confirmada la
deleción del gen stm0385 (adrA), esta cepa fue
sometida a un proceso de transducción utilizando un lisado del fago
P22 obtenido a partir de la cepa que contiene el plásmido pKO3blue
integrado en el gen stm1987. Posteriormente se procedió a la
escisión del plásmido mediante el proceso descrito anteriormente.
De esta manera se obtuvo un doble mutante en los genes adrA
y stm1987. Este proceso se repitió secuencialmente con cada
uno de los genes yciR, yegE, yfiN, yhdA,
stm3388, yhjK, stm4551, yfeA y
stm2503. El gen yeaJ se delecionó mediante
recombinación con un fragmento lineal de ADN introduciendo un
cassette de resistencia a Kanamicina o a Cloranfenicol mediante el
método de Datsenko y Wanner (Datsenko & Wanner, 2000) y de esta
forma se obtuvieron las dos cepas que carecen de los doce genes que
codifican proteínas con dominio GGDEF: \DeltaXII::Km y
\DeltaXII::Clo, respectivamente. En este proceso, junto al
mutante completo, se genera una colección de cepas intermedias, que
se caracterizan por carecer sucesivamente de un gen que codifica
una proteína GGDEF:
La ausencia de los genes que codifican para las
proteínas GGDEF se confirmó mediante Southern blot (Fig. 10). El
DNA cromosómico del mutante \DeltaXII::Km fue purificado,
digerido con las enzimas de restricción PstI y SaII, sometido a
electroforesis en un gel de agarosa y transferido a una membrana de
nylon utilizando metodos ya establecidos (Ausubel et al.,
1990). Se utilizaron como sondas fragmentos de cada uno de los
genes que codifican las correspondientes proteínas GGDEF que fueron
amplificados con los oligos que se presentan en la Tabla 3 y las
siguientes condiciones de PCR:
El marcaje de las sondas y la hibridación del
DNA se llevo a cabo de acuerdo con el protocolo suministrado con el
PCR-DIG DNA-Labelling and
Chemiluminiscent Detection Kit (Boehringer Mannheim).
La ausencia de los genes que codifican para las
proteínas GGDEF se confirmó tambien mediante PCR utilizando los
oligonucleótidos E y F de las regiones flanqueantes de cada uno de
los genes como se ha explicado anteriormente.
La distinción de la cepa mutante \DeltaXII::Km
o \DeltaXII::Clo de cualquier otra cepa se puede realizar
mediante la reacción de PCR anteriormente descrita utilizando los
oligonucleótidos E y F, que hibridan en las zonas flanqueantes de
cada uno de los genes, y digestión con la enzima de restricción
XhoI. El tamaño de los fragmentos de ADN resultado de la reacción
de amplificación y digestión con XhoI para cada gen son los
recogidos en la Tabla 2.
Este proceso puede ser utilizado para delecionar
la secuencia de genes que se desee, y en el orden que se desee, con
la única limitación que el efecto de la deleción puede tener sobre
la viabilidad de la bacteria.
Una vez terminado el proceso, se observa que la
cepa deficiente en la familia completa de proteínas GGDEF
\DeltaXII::Km:
- No presenta niveles detectables de
c-di-GMP medidos mediante HPLC y
espectrometría de masas, como puede comprobarse en la Fig. 7, que
muestra los niveles de c-di-GMP
mediante HPLC en la cepa silvestre (S. Enteritidis 3934) y el
mutante \DeltaXII::Km. La cepa salvaje acumula una cantidad de
c-di-GMP de 1,46 pmoles/mg después
de 24 horas de incubación en placas de LB sin sal a 28ºC. Nótese
que los niveles de c-di-GMP en el
\DeltaXII::Km no son detectables. Los resultados representan la
media de tres experimentos independientes. Las muestras se
analizaron utilizando un sistema de HPLC Waters 2695 Alliance y se
inyectaron en una columna de fase reserva 100C_{18} 10 \mum 25 x
0,46 y una precolumna WP300C_{18}. La columna se eluyó a una
velocidad de flujo de 1 ml/min utilizando un gradiente de 0% a 15%
de B en 30 minutos (A, Acetato de amonio; B, acetonitrilo:agua
(1:1)).
- El mutante \DeltaXII::Km es inmóvil,
deficiente en la formación de biofilm, deficiente en la síntesis de
celulosa y de fimbrias de tipo curli. Esto puede comprobarse en la
Fig. 6, en la que se compara el comportamiento de la cepa silvestre
S. Enteritidis 3934 (parte izquierda de las fotos de la serie
A a E) con el de la cepa mutante \DeltaXII::Km (parte derecha de
las fotos de la serie A a E).
- El mutante \DeltaXII::Km es avirulento.
Estudios de virulencia en ratones BALB/c, en los que 10^{9}
bacterias se inocularon por vía oral a ratones hembra BALB/c de 20
g, mostraron que el mutante \DeltaXII::Km es avirulento (véase la
Fig. 8). En la parte (A), lotes de ratones BALB/c fueron infectados
por vía oral con 10^{9} ufc (unidades formadoras de colonia) y se
determinó el número de animales que sobrevivían tras 24 días
post-infección. Todos los ratones infectados con la
, cepa salvaje murieron antes del día 12
post-infección, mientras que ninguno de los ratones
infectados por la cepa \DeltaXII::Km murió. La parte (B) muestra
el ensayo de asa intestinal, en el que, sobre tres ratones
anestesiados se realizó un ligamiento de intestino delgado de
aproximadamente 1 cm, se inoculó una cantidad de 10^{7} ufc y se
incubó durante 90 minutos. Tras la incubación, el animal se
sacrificó, se cortó el trozo de intestino comprendido entre las dos
ligaduras y se analizó la cantidad de bacterias que habían sido
capaces de atravesar la barrera intestinal y colonizar las células
del epitelio, siendo menor en el caso del mutante \DeltaXII::Km
(barra con relleno), pero cercano a 10^{3} ufc por asa. La parte
(C) corresponde al ensayo de colonización de órganos; para ello, se
inocularon oralmente 5 ratones BALB/c con una dosis subletal de
10^{4} ufc y tras 5 días de infección los animales se
sacrificaron y se cuantificó la cantidad de ufc en órganos diana
como bazo e hígado; tanto en hígado como en bazo, las bacterias
detectadas fueron más de 3 órdenes de magnitud inferiores en el
caso del mutante \DeltaXII::Km (barras con relleno) con respecto a
la cepa de tipo silvestre (barras sin relleno).
Otra utilidad del procedimiento de modificación
de la invención es la inserción de genes o cualquier fragmento de
ADN en el cromosoma de una bacteria mediante un proceso de
recombinación homóloga.
Un ejemplo lo representa la inserción de los
genes stm1987 y stm4551 en el genoma de bacterias
mutantes generadas en el Ejemplo anterior, para obtener las cepas
S. Enteritidis 3934 \DeltaXII+stm1987, S.
Enteritidis 3934 \DeltaXII+stm4551.
En el caso de la primera de ellas, para su
obtención, el gen stm1987 se insertó siguiendo el mismo
procedimiento descrito para la deleción de genes en el apartado
anterior, aunque variando los cebadores de amplificación y el
fragmento insertado en el plásmido pKO3blue: se amplificó el gen
stm1987 utilizando la pareja de oligonucleótidos
04-A (SEQ ID NO:19) y 04-D (SEQ ID
NO:22) y las siguientes condiciones de PCR:
y se clonó en el plásmido
pGEMt-easy. Este plásmido se digirió con las
enzimas de restricción NotI-BglII. El producto de la
digestión se resolvió en geles de agarosa y el fragmento
conteniendo el gen stm1987 así como las regiones de ADN
adyacentes a dicho gen (2816 pb) se purificó desde un gel de
agarosa utilizando un kit comercial. El fragmento purificado se ligó
en el plásmido pKO3blue digerido con las enzimas
NotI-BglII y se transformó la cepa de E.
coli XLI Blue mediante electroporación. Los transformantes
obtenidos se analizaron mediante PCR utilizando los oligos
04-A (SEQ ID NO:19) y 04-D (SEQ ID
NO:22) y las condiciones de PCR descritas anteriormente y se
purificó el plásmido de un clon positivo. Este plásmido se
introdujo mediante electroporación en la cepa S. Enteritidis
3934 \DeltaXII::Km. La cepa de S. Enteritidis 3934
\DeltaXII::Km transformada se seleccionó como una colonia azul en
placas con un medio de cultivo conteniendo cloranfenicol (20
\mug/ml), y X-gal
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranósido)
(40 \mug/ml) a
28ºC.
Una vez seleccionada, la cepa se incubó a 43ºC
en medio líquido en presencia de cloranfenicol (20 \mug/ml)
durante 48 horas para permitir la integración del plásmido en el
cromosoma de la bacteria por un proceso de recombinación homóloga
(Recombinación tipo Campbell). Dado que el plásmido tiene un origen
de replicación termosensible, no es capaz de replicarse a 43ºC y
sólo podrán crecer en presencia de cloranfenicol a 43ºC, aquellas
bacterias que integren el plásmido en el cromosoma. 75 \mul del
cultivo se plaquearon en una placa precalentada a 43ºC que contenía
un medio de cultivo con cloranfenicol (20 \mug/ml) y
X-gal (40 \mug/ml) y se incubó a 43ºC durante 48
horas. Tras la incubación, se seleccionaron seis colonias en las
cuales el plásmido estaba posiblemente integrado (colonias azules) y
se replicaron en placas precalentadas a 43ºC que contenían un medio
de cultivo con cloranfenicol (20 \mug/ml) y X-gal
(40 \mug/ml) y se incubaron a 43ºC durante 48 horas. Las colonias
que habían incorporado el plásmido en el genoma tenían color azul
debido a la expresión constitutiva del gen de la
\beta-galactosidasa.
Tras la incubación, a partir de dos integrados
(colonias azules) se comienza el proceso de escisión, incubándolos
en medio líquido sin antibiótico a 28ºC durante 24 horas. En esta
etapa, como consecuencia de un segundo proceso de recombinación, en
un porcentaje de la población se producirá la escisión del plásmido
perdiéndose la resistencia a cloranfenicol y la actividad
\beta-galactosidasa. Se sembraron diluciones del
cultivo en placas de cultivo conteniendo X-gal y
sacarosa (5%), y las placas se incubaron 24 h a 28ºC.
Se seleccionaron 24 colonias blancas para
realizar una reacción de PCR utilizando los oligonucleótidos
04-E (SEQ ID NO:23) y 04-F (SEQ ID
NO:24) y las siguientes condiciones:
\vskip1.000000\baselineskip
El tamaño del fragmento obtenido en la
amplificación permitió identificar aquellas colonias que habían
recuperado en el cromosoma el gen stm1987 y descartar
aquellas colonias en las que tras la segunda recombinación se había
recuperado la deleción presente en el \DeltaXII::Km.
La inserción del gen stm1987 se confirmó
mediante amplificación del gen stm1987 utilizando los
oligonucleótidos 04-E (SEQ ID NO:23) y
04-F (SEQ ID NO:24) y las condiciones de PCR
descritas anteriormente y la especificidad del producto de
amplificación de la reacción de PCR se determinó mediante
secuenciación del producto de PCR.
Este mismo proceso también se realizó con otros
8 genes que codifican para proteínas GGDEF de S.
Enteritidis: adrA, yeaJ, yciR, yegE,
yfiN, yhdA, stm3388, yhjK, utilizando
en cada caso los oligonucleótidos correspondientes, según lo
descrito en las Tablas 1 y 2. Nótese que en el caso del gen
yeaJ se utilizó la pareja de oligonucleótidos
02-H (SEQ ID NO:75) y 02-I (SEQ ID
NO:76).
La cepa S. Enteritidis 3934
\DeltaXII+stm4551 fue construida a partir del mutante intermedio
\DeltaIX (S. Enteritidis 3934 \DeltaadrA
\Deltastm1987 \DeltayeaJ::Km \DeltayciR
\DeltayegE \DeltayfiN \DeltayhdA
\Deltastm3388 \DeltayhjK) en el que se delecionó
el gen stm2503 utilizando el procedimiento descrito en esta
invención y en la que posteriormente se mutó el gen yfeA
mediante la inserción de un cassette de cloranfenicol utilizando el
método de Datsenko y los oligonucleótidos 06-Clo Fw
(SEQ ID NO:37) y 06-Clo Rv (SEQ ID NO:38). De esta
forma se obtuvo la cepa S. Enteritidis 3934
\DeltaadrA \Deltastm1987 \DeltayeaJ::Km
\DeltayciR \DeltayegE \DeltayfiN
\DeltayhdA \Deltastm3388 \DeltayhjK
\Deltastm2503 \DeltayfeA-Clo a la
que se ha denominado S. Enteritidis 3934 \DeltaXII+stm4551
y que sólo produce una única proteína GGDEF.
La cepa S. Enteritidis 3934
\DeltaXII+yfeA fue construida a partir del mutante
intermedio \DeltaX (S. Enteritidis 3934 \DeltaadrA
\Deltastm1987 \DeltayeaJ-Km
\DeltayciR \DeltayegE \DeltayfiN
\DeltayhdA \Deltastm3388 \DeltayhjK
\Deltastm4551) en el que se delecionó el gen
stm2503 utilizando el procedimiento descrito en esta
invención. De esta forma se obtuvo la cepa S. Enteritidis
3934 \DeltaadrA \Deltastm1987
\DeltayeaJ-Km \DeltayciR \DeltayegE
\DeltayfiN \DeltayhdA \Deltastm3388
\DeltayhjK \Deltastm4551 \Deltastm2503 a
la que se ha denominado S. Enteritidis 3934
\DeltaXII+yfeA y que sólo produce una única proteína
GGDEF.
La cepa S. Enteritidis 3934
\DeltaXII+stm2503 fue construida a partir del mutante intermedio
AX (S. Enteritidis 3934 \DeltaadrA
\Deltastm1987 \DeltayeaJ-Km \DeltayciR
\DeltayegE \DeltayfiN \DeltayhdA \Deltastm3388 \DeltayhjK
\Deltastm4551) en el que se delecionó el gen yfeA
utilizando el procedimiento descrito en esta invención. De esta
forma se obtuvo la cepa S. Enteritidis 3934
\DeltaadrA \Deltastm1987 \DeltayeaJ-km
\DeltayciR \DeltayegE \DeltayfiN
\DeltayhdA \Deltastm3388 \DeltayhjK
\Deltastm4551 \DeltayfeA a la que se ha denominado
S. Enteritidis 3934 \DeltaXII+stm2503 y que sólo produce
una única proteína GGDEF.
De esta forma se generó una colección de 12
cepas que se caracterizan por producir cada una de ellas, una única
proteína GGDEF:
La inserción de fragmentos de ADN en el
cromosoma de cualquier bacteria Gram negativa puede realizarse
siguiendo el procedimiento similar al descrito en este ejemplo.
Todo el c-di-GMP
que es capaz de sintetizar la cepa S. Enteritidis 3934
\DeltaXII+stm4551 depende de la presencia de la proteína STM4551.
La producción de c-di-GMP por esta
proteína activa la expresión de genes concretos que se han
identificado mediante experimentos con microarrays. Uno de los genes
cuya expresión se activa con más intensidad en presencia de
stm4551 es el gen csgA. Este gen se ha sustituido por
el gen indicador lacZ, aunque podría ser sustituido por
cualquier otro gen indicador (gus, GFP). La cepa S.
Enteritidis 3934 \DeltaXII+stm4551 en la que el gen
csgA ha sido sustituido por lacZ presenta unos niveles
de actividad \beta-galactosidasa medidos según el
método de Miller modificado por Maloy (Maloy et al., 1996)
de 400 unidades, cuando la cepa crece en pocillos de una placa de
ELISA en medio LB tras 24 horas de incubación a 28ºC .
Cuando la cepa S. Enteritidis 3934
\DeltaXII+stm4551 se complementa cor un plásmido que sobreproduce
el gen yciR, que codifica una proteína cor actividad
fosfodiesterasa, capaz de degradar el
c-di-GMP, los niveles de actividad
\beta-galactosidasa disminuyen hasta unos valores
de 20 unidades, cuando la cepa crece en pocillos de una placa de
ELISA en medio LB tras 24 horas de incubación a 28ºC.
Para determinar si un determinado compuesto
químico es capaz de interferir con el
c-di-GMP, se añaden distintas
concentraciones de ese compuesto en los pocillos de una placa de
ELISA en la que se ha inoculado la cepa testigo. Para determinar
que el compuesto no afecta al crecimiento de la bacteria, se mide
el crecimiento de la bacteria mediante lectura de la densidad
óptica a 600 nm. Los compuestos que afectan al crecimiento de la
bacteria se descartan, y de aquellos compuestos que no afectan al
crecimiento se mide la actividad
\beta-galactosidasa siguiendo el procedimiento
descrito por Griffith et al. (Griffith & Wolf, 2002).
Aquellas sustancias cuya presencia bloquee la transcripción del gen
indicador y, consecuentemente, la actividad de la proteína
expresada por dicho gen, serán posibles candidatos para el
desarrollo de drogas que bloqueen el
c-di-GMP.
La Fig. 9 hace referencia a la estructura del
genoma de la cepa S. Enteritidis 3934 \DeltaXII+stm4551 en
la que el gen csgA ha sido sustituido por lacZ,
válida para la identificación de sustancias químicas que inhiban la
síntesis de c-di-GMP.
Las cepas S. Enteritidis 3934
\DeltaXII::Clo, S. Enteritidis 3934 \DeltaXII::Km, S.
Enteritidis 3934 \DeltaXII+stm1987, S. Enteritidis 3934
\DeltaXII+stm4551 y la cepa Escherichia coli XL1 Blue
conteniendo el plásmido pKO3blue han sido depositadas en la
Colección Española de Cultivo Tipo (Burjassot, Valencia, España)
siguiendo las normas del Tratado de Budapest para el depósito de
microorganismos para fines de patentes en las siguientes fechas y se
les ha asignado el siguiente número de acceso:
La presente invención no está limitada al ámbito
de los microorganismos depositados en la patente dado que estos
representan una ilustración puntual de un aspecto de la invención.
Cualquier microorganismo o plásmido que sea funcionalmente
equivalente a los descritos en la invención se incluye dentro de la
invención.
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Claims (24)
1. Una cepa mutante de Salmonella spp. en
la que se han delecionado todos : los genes que codifican las
proteínas GGDEF.
2. Cepa mutante según la reivindicación 1, que
es una cepa mutante del serotipo Enteritidis de Salmonella
enterica.
3. Cepa mutante según la reivindicación 2, que
es el mutante \DeltaXII::Km o el mutante \DeltaXII::Clo.
4. Uso de una cepa mutante según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3 como intermedio para la obtención de
cepas mutantes en las que reinserta uno o más genes que codifican
proteínas GGDEF.
5. Uso según la reivindicación 4, en el que la
cepa mutante es el mutante \DeltaXII::Km o el mutante
\DeltaXII::Clo.
6. Uso de una cepa mutante según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3 para la fabricación de un medicamento
destinado a ser utilizado como vacuna.
7. Uso de una cepa mutante según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3 como vector de expresión de antígenos
de cualquier organismo (xenoantígenos).
8. Uso de una cepa mutante según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3 como vector de expresión de un
fármaco.
9. Una cepa mutante de Salmonella spp. en
la que se ha delecionado al menos uno de los genes que codifica
para proteinas GGDEF.
10. Cepa según la reivindicación 9, que es una
cepa mutante del setoripo Enteritidis de Salmonella
enterica.
11. Cepa según la reivindicación 10, que se
selecciona del grupo de las cepas \DeltaI, \DeltaII,
\DeltaIII, \DeltaIV, \DeltaV, \DeltaVI, \DeltaVII,
\DeltaVIII, \DeltaIX, \DeltaX, \DeltaXI.
12. Cepa según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 11, en la que se ha reinsertado uno de los
genes que codifica para proteína GGDEF previamente delecionado.
13. Cepa según una cualquier de las
reivindicaciones 9 a 12, en cuya genoma está presente únicamente un
gen funcional que codifica para proteínas GGDEF a partir del cual
se expresa una proteína GGDEF funcional.
14. Cepa según la reivindicación 13, que se ha
generado reinsertando en el mutante \DeltaXII::Km uno de los
genes que codifica para proteínas GGDEF previamente
delecionado.
15. Cepa según la reivindicación 14, que es la
cepa S. Enteritidis 3934 AXII+stm 1987.
16. Cepa según la reivindicación 13, que es la
cepa S. Enteritidis 3934 \DeltaXII+stm4551.
17. Uso de una cepa mutante según una cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 16 para la fabricación de un
medicamento destinado a ser utilizado como vacuna.
18. Uso de una cepa mutante según una cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 16 como vector de expresión de
antígenos de cualquier organismo (xenoantígenos).
19. Uso de una cepa mutante según una cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 16 como vector de expresión de un
fármaco en el interior de células diana con fines terapeúticos.
20. Uso de una cepa mutante según una cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 16 para el estudio del metabolismo del
c-di-GMP.
21. Uso según la reivindicación 20 para la
identificación y desarrollo de sustancias químicas que bloqueen la
síntesis de c-di-GMP.
22. Uso según la reivindicación 20 ó 21, en el
que la cepa mutante es una cepa según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 16.
23. Uso de una cepa mutante según una cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 16, para el estudio de los mecanismos
de formación y/o bloqueo de la formación de biofilms.
24. Uso de una cepa mutante según una cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 16 para el estudio de la relación de
los biofilms con la virulencia.
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EP2223997B1 (en) | 2013-12-25 |
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