ES2416154A1

ES2416154A1 - Cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae

Info

Publication number: ES2416154A1
Application number: ES201131801A
Authority: ES
Inventors: Jaume Piñol Ribas; Sergi Bru Virgili; Laura FERRER SOLER; Marta SITJÀ ARNAU; Enrique Querol Murillo
Original assignee: Laboratorios Hipra SA
Current assignee: Laboratorios Hipra SA
Priority date: 2011-11-09
Filing date: 2011-11-09
Publication date: 2013-07-30
Anticipated expiration: 2031-11-09
Also published as: WO2013068629A1; ES2416154B1

Abstract

Cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae. La presente invención se refiere a una cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae que comprende una modificación en al menos uno de los segmentos del gen apxIIA que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxII y una modificación en al menos uno de los segmentos del gen apxIIIA que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxIII. Dicha cepa es inmunógena, no hemolítica y no citolítica. También se refiere a un procedimiento para obtenerla, a una vacuna contra la pleuroneumonía porcina que la contiene, y a un kit vacunal.

Description

CEPA VIVA ATENUADA DE ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE

Campo de la técnica

La presente invención está enmarcada en el ámbito del desarrollo de vacunas contra la pleuroneumonía porcina. En particular, se refiere a vacunas basadas en cepas vivas atenuadas de Actinobacillus pleuropneumoniae.

Estado de la técnica anterior

Actinobacillus pleuropneumoniae (en adelante, "App") es una bacteria Gram-negativa causante de la pleuroneumonía porcina, enfermedad infecciosa respiratoria, de distribución mundial, responsable de grandes pérdidas económicas en la industria porcina.

Los factores de virulencia más importantes de App son proteínas extracelulares: las exotoxinas Apx. Estas exotoxinas pertenecen a la familia de toxinas formadoras de poros denominadas RTX, ampliamente distribuidas entre las bacterias patógenas Gram-negativas. Las principales exotoxinas en App son las siguientes: ApxI, ApxII, ApxIII, y ApxIV.

Si bien todos los serotipos analizados son capaces de producir ApxIV, existe una distribución característica de serotipo para la expresión del resto de exotoxinas Apx. Los serotipos 1, 5, 9 y 11 producen las exotoxinas ApxI y ApxII; los serotipos 10 y 14 producen tan sólo la ApxI; los serotipos 7, 12 y 13 producen solamente la ApxII y los serotipos 2, 3, 4, 6, 8 y 15 producen la ApxII y la ApxIII.

Los genes correspondientes a las exotoxinas ApxI, ApxII y ApxIII están organizados en forma de operón.

El operón de las exotoxinas ApxI y ApxIII dispone de cuatro genes. El gen A (apxIA o apxIIIA) codifica para la exotoxina propiamente dicha. El gen C (apxIC o apxIIIC) codifica para una proteína activadora (acilasa) que se encarga de introducir una modificación post-traduccional en la exotoxina que permite que la misma adquiera la conformación activa, capacitándola para la interacción con los receptores celulares específicos del huésped. Los genes B y D (apxIB y apxID o apxIIIB y apxIIID) codifican para dos proteínas de membrana que se encargan de secretar las correspondientes exotoxinas maduras al medio externo.

El operón de la exotoxina ApxII dispone sólo del gen A (apxIIA) y del gen C (apxIIC), que codifican respectivamente para la ApxII y para la proteína activadora. La exportación de la ApxII madura al medio externo se realiza gracias a las proteínas codificadas por los genes apxIB y apxID, o bien por los genes apxIIIB y apxIIID.

Las exotoxinas ApxI, ApxII y ApxIII presentan diferencias funcionales y estructurales entre ellas, tal como se describe en el artículo de Jansen et al., Infect. Immun., 1993, 61(3), 947-954. Si bien a nivel de la secuencia de aminoácidos las exotoxinas ApxI y ApxII presentan un bajo nivel de identidad, ambas presentan actividad hemolítica y están relacionadas inmunológicamente. La exotoxina ApxI presenta una actividad hemolítica fuerte, mientras que la actividad hemolítica de la ApxII es débil. En el mismo artículo también se describe que, por el contrario, la exotoxina ApxIII difiere de ApxI y ApxII en varios aspectos, entre ellos desde el punto de vista inmunológico y en cuanto a la actividad biológica, ya que dicha exotoxina ApxIII no es hemolítica y es fuertemente citotóxica.

En el estado de la técnica se han descrito diferentes soluciones técnicas para abordar el problema de la pleuroneumonía porcina.

Por ejemplo, en la solicitud de patente WO-A-2004/045639 se describe una vacuna que comprende una cepa viva atenuada de App de serotipo 1 que produce las toxinas ApxI y ApxII sustancialmente exentas de actividad hemolítica, pero con una gran capacidad inmunológica. Dicha vacuna resulta apropiada para proteger frente a las infecciones causadas por bacterias de App que producen las exotoxinas ApxI y/o ApxII.

También se han propuesto numerosas vacunas vivas atenuadas basadas en cepas de App sin capacidad hemolítica, que son menos inmunoprotectivas porque han sufrido modificaciones en su estructura que no les permiten unirse al receptor de membrana de las células diana o porque no pueden generar anticuerpos frente a las toxinas al no ser secretadas por la célula.

Por ejemplo, en el artículo de Tascón et al., Mol. Microbiol., 1994, 14, 207216, se describen dos mutantes de App: uno de ellos tiene una disrupción en el gen apxIBD y el otro una disrupción en el gen estructural apxIA.

En el artículo de Jansen et al., Infect. Immun., 1995, 63, 27-37, se describe la producción de mutantes de App que tienen el gen apxIA inactivado por inserción del gen CMr y/o el gen apxIIA inactivado por inserción del gen TETr.

En Reimer et al., Microb. Pathog., 1995, 18, 197-209 se describe un mutante avirulento de App que no sintetiza la toxina ApxI, pero sí la ApxII, aunque no la secreta de la célula, debido a deleciones que afectan partes importantes del operón apxIABCD.

En la solicitud de patente europea EP-A-0810283 se describe una bacteria viva atenuada que produce una toxina RTX de la familia de las Pasteurellaceae en una forma no activada.

En la solicitud de patente europea EP-A-0861319 se describe la obtención de una cepa vacunal de App modificada que produce una toxina Apx inactivada parcial o totalmente debido a la deleción parcial del gen estructural apxIA y/o a la deleción parcial de un gen activador apxIIC.

En la solicitud de patente europea EP-A-0875574 se describe una bacteria viva atenuada de la especie App que produce la toxina ApxIV en una forma no funcional.

En el artículo de C. T. Prideaux, The 16th International Pig Veterinary Society Congress, Melbourne, Australia, 17-20 Sept. 2000, p. 439-442, se describe una vacuna preparada a partir de una cepa que tiene inactivado el gen apxIIC y que expresa y secreta una toxina ApxII no activada, incapaz, por tanto, de unirse a las células diana.

En el artículo de Lin et al., FEMS Microbio. Lot., 2007, 274, 55-62, se describe la construcción de una cepa de App doble mutante que secreta formas inactivadas de ApxI y ApxII, mediante la deleción de los genes apxIC y apxIIC de una cepa virulenta de App.

En el artículo de Park et al., J. Vet. Med. Sci., 2009, 71(19), 1317, se describe una cepa de App serotipo 2 que tiene inactivados los genes apxIIIB y apxIIID, responsables de la secreción de las exotoxinas.

Alternativamente se han desarrollado vacunas por subunidades basadas en toxinas de App preparadas in vitro, tal como se describe a continuación.

En la solicitud de patente europea EP-A-0453024 se describe una vacuna por subunidades que comprende las tres exotoxinas ApxI, ApxII y ApxIII además de una proteína de la membrana externa de 42 kD purificada de una cepa de App de serotipo 1.

En el artículo de Shao et al., Acta Vet. Scand., 2010, 52, 52 se describen los resultados obtenidos con una vacuna multicomponente de subunidades que comprende rApxI, rApxII, rApxIII y rOMP.

En el artículo de Sjölund et al., Acta Vet. Scand., 2010, 52, 23, se describen diferentes estrategias vacunales para hacer frente a las infecciones de App en las que se emplea una vacuna que contiene tres exotoxinas inactivadas (ApxI, ApxII y ApxIII) y una proteína de membrana exterior (OMP) de 42 KDa. En dicho artículo se pone de relieve que es necesario administrar tres dosis vacunales para llegar a proteger el animal a lo largo de todo el período de engorde hasta las 24 semanas.

Sin embargo, tal como se describe en la patente norteamericana US6013266, las vacunas por subunidades presentan varios inconvenientes entre los que se encuentran: la necesidad de disponer de cantidades elevadas de material inmunogénico para desencadenar el sistema inmunitario de forma adecuada; diversos antígenos se liberan solamente in vivo, y no pueden estar presentes en las vacunas por subunidades, y una bacteria patogénica viva tiene diversas moléculas inmunogénicas como las proteínas de la membrana externa y los polisacáridos capsulares, que también debieran estar incluidas en una vacuna por subunidades efectiva.

Además, según se describe en el artículo de revisión de Ramjeet et al., Animal Health Research Reviews., 2008, 9(1), 25-45, el desarrollo de una vacuna por subunidades no es una tarea fácil, ya que requiere el descubrimiento de antígenos altamente inmunogénicos, y está estrechamente ligado al uso de adyuvantes apropiados para estimular el sistema inmunológico del huésped.

Subsiste pues la necesidad de disponer de nuevas vacunas basadas en cepas vivas atenuadas que permitan obtener una protección eficaz frente a infecciones causadas por App, extender la protección frente a otros serotipos de dicha bacteria y conseguir una duración de la inmunidad a lo largo de todo el período de engorde.

Explicación de la invención

El objeto de la presente invención es una cepa viva atenuada de App que no es hemolítica ni citolítica, y que presenta una elevada capacidad inmunoprotectora.

También forma parte del objeto de la invención la cepa de App depositada por Laboratorios HIPRA, S.A. (17170, Girona, España) en fecha 4 de mayo de 2011 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) (46980, Valencia, España) con el número de registro CECT 7903.

Forma parte también del objeto de la invención un procedimiento para obtener una cepa viva atenuada de App.

También forma parte del objeto de la invención una vacuna que comprende una cepa viva atenuada de App.

También forma parte del objeto de la invención un kit de vacunación que comprende dicha cepa.

Los autores de la presente invención han desarrollado una cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae a partir de una cepa de App, que está modificada en al menos uno de los segmentos del gen apxIIA que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxII y en al menos uno de los segmentos del gen apxIIIA, que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxIII.

Esta cepa atenuada presenta una actividad hemolítica y citolítica sustancialmente reducida, y a la vez mantiene una elevada capacidad inmunoprotectora, que la hace útil para preparar una vacuna viva atenuada contra la pleuroneumonía porcina.

Sorprendentemente se ha encontrado que la vacuna viva atenuada preparada con esta cepa modificada de App puede ser aplicada a dosis relativamente bajas, y que contiene los antígenos necesarios para obtener una respuesta inmunógena efectiva que proporciona una fuerte protección frente a la pleuroneumonía porcina.

Descripción de las figuras

Figura 1

En la figura 1 se muestra el alineamiento realizado mediante el programa ClustalX (Larkin et al., Bioinformatics, 2007, 23, 2947-2948) entre las secuencias de aminoácidos de la exotoxina ApxII de una cepa de serotipo 9 y de la exotoxina ApxIII de una cepa de serotipo 2.

La secuencia de aminoácidos de la exotoxina ApxII procedente de una cepa de serotipo 9 se encuentra descrita en el artículo de Smits et al., Infect. Immun., 1991, 59, 4497-4504 (Base de datos Genbank número de acceso: X61111), y la secuencia de aminoácidos de la exotoxina ApxIII procedente de una cepa de serotipo 2 se encuentra descrita en el artículo de Chang et al., ADN Cell Biol., 1993, 12(4), 351-362 (Base de datos Genbank número de acceso: L12145).

En la figura se han incluido sólo las secuencias relevantes situadas entre los aminoácidos 110 a 520 de la exotoxina ApxII y 120 a 535 de la exotoxina ApxIII. Sobre este alineamiento se encuentran enmarcadas las regiones hidrofóbicas H1, H2 y H3 de las exotoxinas ApxII y ApxIII. Estas regiones corresponden respectivamente a los tres dominios transmembrana presentes en las dos toxinas, y se encuentran localizados en las siguientes posiciones:

Primer dominio transmembrana (H1): entre los aminoácidos 233 a 253, correspondientes a los nucleótidos 697 a 759 del gen apxIIA y entre los aminoácidos 244 a 264, correspondientes a los nucleótidos 730 a 792 del gen apxIIIA.

Segundo dominio transmembrana (H2): entre los aminoácidos 296 a 315, correspondientes a los nucleótidos 886 a 945 del gen apxIIA y entre los aminoácidos 307 a 326, correspondientes a los nucleótidos 919 a 978 del gen apxIIIA.

Tercer dominio transmembrana (H3): entre los aminoácidos 369 a 405, correspondientes a los nucleótidos 1105 a 1218 del gen apxIIA y entre los aminoácidos 380 a 416, correspondientes a los nucleótidos 1138 a 1248 del gen apxIIIA.

Figura 2

En la figura 2 se muestra un esquema de los plásmidos híbridos utilizados. El plásmido pGP3 se encuentra descrito en la solicitud de patente internacional WO-A-2004/045639. Sobre el plásmido pGP3 se insertaron las regiones flanqueantes 5’ y 3’ (amplificadas mediante PCR) que codifican para el segundo dominio transmembrana de los genes apxIIA y apxIIIA para dar lugar, respectivamente, a los plásmidos pApxIIǻH2 y pApxIIIǻH2.

Las regiones flanqueantes en el plásmido pApxIIǻH2 consisten en dos fragmentos amplificados mediante PCR de 0,9 y 1,1 kb, respectivamente y que incluyen en sus extremos las dianas de restricción EcoRV y EcoRI (región flanqueante del lado 5’) y EcoRI y BglII (región flanqueante del lado 3’). Las regiones flanqueantes en el plásmido pApxIIIǻH2 consisten en dos fragmentos de 0,9 kb amplificados mediante PCR y que, respectivamente, incluyen en sus extremos las dianas de restricción EcoRV y XhoI (región flanqueante del lado 5’) y XhoI y BglII (región flanqueante del lado 3’). Las flechas pequeñas que aparecen en el esquema de los operones apxII y apxIII indican la posición y el sentido de los oligonucleótidos utilizados en las diferentes reacciones de PCR.

Figura 3

La figura 3 está dividida en tres paneles. En el panel A se muestra el mapa de restricción (en kb) y la distribución de los genes en el operón apxII durante los diferentes pasos para la obtención de la cepa HP3179ApxIIH2-. En gris claro se indica el gen apxIIA, diana de los diferentes sucesos de recombinación y en gris oscuro los genes adyacentes apxIIC y apxIIB. Los diferentes genes o regiones del plásmido pApxIIǻH2 están dibujados mediante barras oblicuas de color gris. Los segmentos codificantes para los dominios transmembrana (H1, H2 y H3) del gen apxIIA están resaltados en negro. En (1) y (2) se muestra el mapa de restricción para los enzimas EcoRI y NdeI y la distribución de los genes del operón apxII del genoma de App (cepa HP3179Nlr). En (4) se muestra el mapa de restricción del mismo operón después de la inserción o cointegrado del plásmido pApxIIǻH2. Este cointegrado se produce a consecuencia de un suceso de recombinación homóloga entre las regiones flanqueantes 3’ de H2 situadas respectivamente en el plásmido pApxIIǻH2 y el genoma de App. En (3) se muestra el mapa de restricción de este operón después de la resolución del plásmido insertado en (4) mediante una segunda recombinación por las regiones flanqueantes 5’ de H2.

El panel B de la figura 3 muestra el resultado de la hibridación con una sonda del gen apxIIA de una transferencia Southern de ADNs genómicos digeridos simultáneamente con los enzimas EcoRI y NdeI. Los ADNs genómicos corresponden a muestras de las siguientes cepas:

1) cepa HP3179Nlr de serotipo 2;

2) recombinante obtenido a partir del cointegrado esquematizado en A4

que recupera el mismo genotipo que la cepa paterna; y

3) recombinante obtenido a partir del cointegrado esquematizado en A3

que muestra la presencia de una diana EcoRI en la posición

correspondiente a la región codificante para el dominio transmembrana

H2.

En A3 se muestra un esquema del operón de este recombinante, que fue denominado HP3179ApxIIH2-.

El panel C de la figura 3 muestra el aspecto de colonias sembradas a partir de los cultivos de 2 y 3 descritos en el panel B, junto a una colonia procedente de un cultivo de App de serotipo 1. Las colonias fueron sembradas en placas de agar sangre Columbia suplementadas con NAD. Obsérvese en (1) la presencia de un notable halo hemolítico alrededor de la colonia procedente de un cultivo de serotipo 1, en (2) un discreto halo hemolítico alrededor de la colonia del cultivo 2, correspondiente a una cepa de serotipo 2, y en (3) la ausencia de halo hemolítico alrededor de la colonia del cultivo 3.

Figura 4

La figura 4 está dividida en tres paneles. En el panel A se muestra el mapa de restricción (en kb) y la distribución de los genes en el operón apxIII durante los diferentes pasos para la obtención de la cepa HP3179ApxII/IIIH2-. En gris claro se indica el gen apxIIIA, diana de los diferentes sucesos de recombinación y en gris oscuro los genes adyacentes apxIIIC, apxIIB y apxIIC. Los diferentes genes o regiones del plásmido pApxIIIǻH2 están dibujados mediante barras oblicuas de color gris. Los segmentos codificantes para los dominios transmembrana (H1, H2 y H3) de apxIIIA están resaltados en negro.

En (1) y (2) se muestra el mapa de restricción para los enzimas XhoI y NcoI y la distribución de los genes del operón ApxIII del genoma de App (cepa HP3179ApxIIH2-). En (4) se muestra el mapa de restricción del mismo operón después de la inserción o cointegrado del plásmido pApxIIIǻH2. Este cointegrado se produce a consecuencia de un suceso de recombinación homóloga entre las regiones flanqueantes 3’ de H2 situadas respectivamente en el plásmido pApxIIIǻH2 y el genoma de App. En (3) se muestra el mapa de restricción de este operón después de la resolución del plásmido insertado en (4) mediante una segunda recombinación por las regiones flanqueantes 5’ de H2.

El panel B de la figura 4 muestra el resultado de la hibridación con una sonda del gen apxIIA de una transferencia Southern de ADNs genómicos digeridos simultáneamente con los enzimas XhoI y NcoI. Los ADNs genómicos corresponden a muestras de las siguientes cepas:

1) cepa HP3179ApxIIH2-; 2) recombinante obtenido a partir del cointegrado esquematizado en A4

que recupera el mismo genotipo que la cepa paterna; y

3) recombinante obtenido a partir del cointegrado esquematizado en A3

que muestra la presencia de una diana XhoI en la posición

correspondiente a la región codificante para el dominio transmembrana

H2.

En A3 se muestra un esquema del operón de este recombinante, que fue denominado HP3179ApxII/IIIH2-.

El panel C de la figura 4 muestra el aspecto de colonias de los diferentes cultivos de App obtenidos en este procedimiento una vez sembradas en placas de agar sangre Columbia suplementadas con NAD. Obsérvese en (1) la presencia de un notable halo hemolítico alrededor de la colonia procedente de un cultivo de serotipo 1, en (2) un discreto halo hemolítico alrededor de la colonia del cultivo de la cepa de serotipo 2 HP3179Nlr y la ausencia de halo hemolítico alrededor de las colonias procedentes de los cultivos de HP3179ApxIIH2- (3) y HP3179ApxII/IIIH2(4).

Figura 5

En la figura 5 se muestra la cuantificación de la actividad citolítica de las toxinas de App. Las imágenes muestran macrófagos alveolares porcinos incubados con sobrenadantes filtrados de cultivos de la cepa HP3179 (A) o de la cepa HP3179ApxII/IIIH2- (B). En C se muestran los mismos macrófagos incubados con PBS. Después de la incubación, los macrófagos fueron tratados con yoduro de propidio para detectar aquellas células con alguna rotura en la membrana celular. Sobre las imágenes de contraste de fases (en gama de grises) se han sobreimpuesto las imágenes de epifluorescencia y que corresponden a las células que han incorporado yoduro de propidio. Por motivos de claridad, las células fluorescentes aparecen de color blanco para favorecer el contraste de las mismas sobre el fondo gris. Las imágenes de epifluorescencia se obtuvieron mediante un cubo dicroico con un rango de excitación de 528-553 nm y un rango de emisión de 590-650 nm. La barra de aumento corresponde a 30 micras. En D se muestra el histograma de frecuencias de las células fluorescentes que aparecen en cada una de las condiciones.

Figura 6

La figura 6 muestra tres gráficas con las curvas de crecimiento y la producción de las exotoxinas Apx. En A se representan mediante círculos (cepa HP3179Nlr) o cuadrados (cepa HP3179ApxII/IIIH2-) los valores de absorbancia a 600 nm a intervalos de una hora de un cultivo de cada una de estas cepas. De manera paralela también se tomaron muestras del sobrenadante de los cultivos en los mismos intervalos de tiempo. Estas muestras fueron mantenidas a 0 qC hasta el momento de ser diluidas 1/50 en tampón carbonato (pH 9,6). Después fueron aplicadas a pocillos para cuantificar la presencia de ApxII o ApxIII mediante ELISA y utilizando un anticuerpo monoclonal específico para cada exotoxina. A partir de los valores de absorbancia a 405 nm de cada muestra ensayada se construyeron las curvas que representan la acumulación de cada una de las exotoxinas Apx a lo largo del tiempo. En B y C se representan mediante círculos oscuros las exotoxinas procedentes del cultivo de la cepa de serotipo 2 HP3179Nlr y mediante cuadrados las exotoxinas producidas por el cultivo de la cepa HP3179ApxII/IIIH2-. En B se representa la acumulación de ApxII (círculos) y ApxIIH2- (cuadrados) y en C aparece representada la acumulación de ApxIII (círculos) y ApxIIIH2-(cuadrados).

Figura 7

En (A) se muestra una tinción con azul de Coomasie de una electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida con muestras de los sobrenadantes de cultivos de 5 horas de:

1) cepa HP3179Nlr de serotipo 2;

2) HP3179ApxIIH2-;

3) HP3179ApxII/IIIH2-; y

4) una cepa control de serotipo 1 (que produce y excreta las exotoxinas

ApxI y ApxII, con una masa molecular muy parecida).

En (B) se encuentra una transferencia tipo Western de un gel con muestras idénticas a las analizadas en el gel de (A) detectadas mediante un anticuerpo monoclonal específico para la exotoxina ApxII. En (C) se encuentra una transferencia tipo Western de un gel con muestras idénticas a las analizadas en el gel de (A) y revelada mediante un anticuerpo monoclonal específico para la exotoxina ApxIII. Obsérvese una señal de intensidad similar en todas las imágenes de los carriles 1 a 3 y la ausencia de señal en el carril 4C.

Descripción detallada de la invención

Cepa atenuada La invención se refiere a una cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae que comprende: a) una modificación en al menos uno de los tres segmentos del gen apxIIA que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxII y

b) una modificación en al menos uno de los tres segmentos del gen

apxIIIA, que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina

ApxIII.

El término “atenuada” se refiere a que la cepa de App presenta una actividad virulenta reducida en comparación con la cepa de la que procede.

El término “modificación” se refiere a la transformación de un gen mediante el uso de las técnicas convencionales de ADN recombinante como es, por ejemplo, la sustitución de uno o varios nucleótidos, la inserción de uno o varios nucleótidos, la deleción parcial o total de un gen, y también a la transformación de un gen mediante la disrupción por mutagénesis inducida químicamente o por radiación.

Los dominios transmembrana presentes en el gen apxIIA y en el gen apxIIIA de las exotoxinas con mayor actividad citolítica fueron identificados mediante el uso de los programas TransMem (descrito en el artículo de Aloy et al., Comp. Appl. Biosc., 1997, 13, 213-234) y Helixmem (descrito en el artículo de Eisenbeg et al., J. Mol. Biol., 1984, 179, 125-142). De la predicción realizada sobre las secuencias de aminoácidos de las exotoxinas ApxII y ApxIII se desprende que los dominios transmembrana, también denominados transmembranas o hélices transmembrana, se encuentran localizados en las siguientes zonas de las secuencias de las exotoxinas:

-: Primer dominio transmembrana H1: entre los aminoácidos 233 y 253, correspondiente a los nucleótidos 697 a 759 del gen apxIIA y entre los aminoácidos 244 a 264, correspondientes a los nucleótidos 730 a 792 del gen apxIIIA.

-: Segundo dominio trasmembrana H2: entre los aminoácidos 296 a 315, correspondiente a los nucleótidos 886 a 945 del gen apxIIA y entre los aminoácidos 307 a 326, correspondientes a los nucleótidos 919 a 978 del gen apxIIIA.

-: Tercer dominio transmembrana H3: entre los aminoácidos 369 a 405, correspondiente a los nucleótidos 1105 a 1215 del gen apxIIA y entre los aminoácidos 380 a 416, correspondientes a los nucleótidos 1138 a 1248 del gen apxIIIA.

En una realización preferida, la cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae comprende: a) una deleción en al menos uno de los tres segmentos del gen apxIIA que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxII y b) una deleción en al menos uno de los tres segmentos del gen apxIIIA, que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxIII.

En una realización más preferida, la cepa objeto de la invención comprende:

a) una deleción en el segmento del gen apxIIA, que codifica para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxII de App definido por los nucleótidos 886 a 945 del gen apxIIA, y

b) una deleción en el segmento del gen apxIIIA, que codifica para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxIII de App definido por los nucleótidos 919 a 978 del gen apxIIIA.

En una realización todavía más preferida la cepa objeto de la invención comprende: a) la deleción de los nucleótidos 886 a 945 del gen apxIIA, que codifican para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxII de App y b) la deleción de los nucleótidos 919 a 978 del gen apxIIIA, que codifican para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxIII de App.

En una realización preferida la cepa objeto de la invención comprende una modificación que consiste esencialmente en:

a) introducir una deleción en al menos uno de los tres segmentos del gen apxIIA que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxII e

b) introducir una deleción en al menos uno de los tres segmentos del gen apxIIIA, que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxIII.

En una realización preferida la cepa objeto de la invención comprende una modificación que consiste esencialmente: a) en la deleción de los nucleótidos 886 a 945 del gen apxIIA, que codifican para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxII de App y

b) en la deleción de los nucleótidos 919 a 978 del gen apxIIIA, que codifican para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxIII de App.

Forma parte del objeto de la invención la cepa de App depositada por Laboratorios HIPRA, S.A. (17170, Girona, España) en fecha 4 de mayo de 2011 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) (46980, Valencia, España) con el número de registro CECT 7903, según el Tratado de Budapest. Dicha cepa de App está caracterizada por la deleción de los nucleótidos 886 a 945 del gen apxIIA que codifican para la segunda transmembrana de la exotoxina ApxII, y la deleción de los nucleótidos 919 a 978 del gen apxIIIA que codifican para la segunda transmembrana de la exotoxina ApxIII.

La cepa de la invención también puede comprender modificaciones adicionales en zonas del genoma de la cepa de App que no afecten la capacidad inmunogénica de la misma.

Procedimiento

También forma parte del objeto de la invención un procedimiento para obtener una cepa viva atenuada de App a partir de una cepa de App que comprende:

a) modificar al menos uno de los tres segmentos del gen apxIIA que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxII y b) modificar al menos uno de los tres segmentos del gen apxIIIA, que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxIII. La cepa obtenida mediante este procedimiento es una cepa de App inmunógena, no hemolítica y no citolítica.

La cepa de App que se puede emplear para aplicar el procedimiento de la invención puede ser una cepa de campo, también denominada cepa salvaje, o una cepa modificada genéticamente. La cepa de App apropiada para aplicar el procedimiento de la invención se puede aislar de casos clínicos, subclínicos, o se puede seleccionar de entre las cepas que están depositadas en Colecciones de Cultivos Tipo. En los casos clínicos la cepa presenta la patología propia de la pleuroneumonía porcina, mientras que en los casos subclínicos la cepa se encuentra colonizando las mucosas del animal, pero no presenta patología. La cepa de App que se puede emplear para aplicar el procedimiento de la invención puede presentar diversos grados de virulencia. En el procedimiento de la invención se emplea preferiblemente una cepa virulenta.

Como ya se ha explicado anteriormente, el término “modificar” se refiere a transformar un gen mediante el uso de las técnicas convencionales de ADN recombinante como es, por ejemplo, la sustitución de uno o varios nucleótidos, la inserción de uno o varios nucleótidos, la deleción parcial o total de un gen, y también a la transformación de un gen mediante la disrupción por mutagénesis inducida químicamente o por radiación. Preferiblemente la modificación consiste en una deleción.

En una realización preferida, el procedimiento comprende:

En una realización más preferida, el procedimiento comprende introducir:

a) una deleción en el segmento del gen apxIIA, que codifica para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxII definido por los nucleótidos 886 a 945 del gen apxIIA y

b) una deleción en el segmento del gen apxIIIA, que codifica para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxIII definido por los nucleótidos 919 a 978 del gen apxIIIA.

En una realización todavía más preferida el procedimiento comprende:

a) introducir la deleción del segmento del gen apxIIA, que codifica para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxII definido por los nucleótidos 886 a 945 del gen apxIIA e

b) introducir la deleción del segmento del gen apxIIIA, que codifica para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxIII definido por los nucleótidos 919 a 978 del gen apxIIIA.

En una realización preferida el procedimiento de la invención consiste esencialmente en:

En una realización aún más preferida el procedimiento de la invención comprende una modificación que consiste esencialmente: a) en la deleción de los nucleótidos 886 a 945 del gen apxIIA, que codifican para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxII de App y

El procedimiento de la invención también puede comprender introducir modificaciones adicionales en zonas del genoma de la cepa de App que no afecten la capacidad inmunogénica de la misma.

En una realización especialmente preferida de la presente invención las únicas modificaciones que se producen en el genoma de App consisten en la deleción de 60 bases en el interior de las secuencias codificantes de los genes apxIIIA y apxIIA y la sustitución de las mismas por dianas de restricción, preferiblemente las correspondientes a los enzimas XhoI y EcoRI, respectivamente.

En general no se producen inserciones adicionales de secuencias procedentes del ADN plasmídico como, por ejemplo, el gen de resistencia a kanamicina en el genoma de App. Esto permite que la cepa obtenida pueda ser nuevamente modificada en el mismo gen u otro gen diana siguiendo exactamente la misma estrategia que se utilizó para producir la primera modificación.

La diana de restricción en particular que se utiliza en la presente invención no es crítica. Aunque podría utilizarse una construcción que no introdujese diana de restricción alguna, es preferible su utilización para disponer de un mecanismo adicional para detectar los clones recombinantes deseados y para poder efectuar un seguimiento de la estabilidad de la cepa o cepas obtenidas. Para ello puede utilizarse cualquier diana que no introduzca un codón de finalización de la síntesis de proteínas y que dé lugar a fragmentos de restricción analizables por electroforesis (por ejemplo de más de cien pares de bases) con las dianas flanqueantes que puedan existir previamente en el genoma de App.

La cepa avirulenta de App obtenible mediante el procedimiento de la invención también forma parte de la invención.

En una forma de realización preferida de la presente invención, que se describe ampliamente en el apartado de Ejemplos, la obtención de una cepa de App inmunógena, no hemolítica y no citolítica se puede realizar mediante un proceso que comprende las siguientes etapas:

A.- Elección de una cepa virulenta de App obtenida de animales infectados que padezcan la enfermedad. Dicha elección se puede realizar según los métodos habituales empleados por el experto en la materia.

B.- Predicción de las hélices alfa del dominio transmembrana de las exotoxinas ApxII y ApxIII mediante programas como TransMem o Helixmen que analizan secuencias de aminoácidos, tal como se describe para E. coli en el artículo de Ludwig et al., Mol. Gen. Genet., 1991, 226,198-208, para diseñar una construcción nucleotídica que permita la modificación de dichos dominios.

C.- Construcción de un vector de clonación capaz de integrarse en el genoma de App y que disponga de genes marcadores que permitan monitorizar de manera eficiente la integración de dicho vector.

C.1.- Construcción de un vector de clonación híbrido que contenga las secuencias flanqueantes 5' y 3' del segundo dominio transmembrana especificado por el gen apxIIIA. Para ello se construyó el plásmido híbrido pApxIII¨H2 con objeto de seleccionar y clonar dichos fragmentos adyacentes a los extremos 5’ y 3’ del segmento que codifica el segundo dominio transmembrana en el gen apxIIIA. Este plásmido fue utilizado como vector final para la transformación de App.

C.2.- Construcción de un vector de clonación híbrido que contenga las secuencias flanqueantes 5' y 3' del segundo dominio transmembrana especificado por el gen apxIIA. Para ello se construyó el plásmido híbrido pApxII¨H2 con objeto de seleccionar y clonar dichos fragmentos adyacentes a los extremos 5’ y 3’ del segmento que codifica para el segundo dominio transmembrana en el gen apxIIA. Este plásmido fue utilizado como vector final para la transformación de App.

D.- Obtención de bacterias recombinantes que han resuelto el plásmido híbrido insertado en el genoma.

D.1.- Obtención de un cointegrado entre el plásmido pApxII¨H2 y el genoma de la cepa de App HP3179Nlr mediante un suceso de recombinación homóloga entre dicho plásmido y el genoma de App. La cepa HP3179Nlr es una cepa resistente a ácido nalidíxico obtenida a partir de un mutante espontáneo de la cepa salvaje de App de serotipo 2 denominada HP3179.

D.2.- Obtención de la cepa HP3179ApxIIH2-mediante un procedimiento que permite, una vez identificadas las bacterias recombinantes obtenidas en el paso D.1., resolver el vector recombinante integrado en el genoma mediante un segundo suceso de recombinación homóloga, así como detectar y aislar las bacterias que, gracias a esta segunda recombinación, hayan adquirido la deleción parcial en el gen apxIIA.

D.3.- Obtención de un cointegrado entre el plásmido pApxIII¨H2 y la cepa de App HP3179ApxIIH2-, como resultado de un suceso de recombinación homóloga entre dicho plásmido y el genoma de App.

D.4.- Obtención de la cepa HP3179ApxII/IIIH2-mediante un procedimiento que permite, una vez identificadas las bacterias recombinantes obtenidas en el paso D.3., resolver el vector recombinante integrado en el genoma mediante un segundo suceso de recombinación homóloga, así como detectar y aislar las bacterias que, gracias a esta segunda recombinación, hayan adquirido la deleción parcial en el gen apxIIIA.

En la presente invención el mutante obtenido HP3179ApxIIH2- es idéntico a la cepa original salvaje de App excepto por la deleción de los nucleótidos 886 a 945 (ambos inclusive) de la secuencia codificante del gen apxIIA, que se corresponde con la ausencia de los aminoácidos 296 a 315 (ambos inclusive) en la ApxII producida.

En la presente invención el mutante obtenido HP3179ApxII/IIIH2- es idéntico a la cepa HP3179ApxIIH2- excepto por la deleción de los nucleótidos 919 a 978 (ambos inclusive) de la secuencia codificante del gen apxIIIA, que se corresponde con la ausencia de los aminoácidos 307 a 326 (ambos inclusive) en la ApxIII producida.

Vacunas

Forma parte del objeto de la invención una vacuna contra la pleuroneumonía porcina caracterizada porque comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de la cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae de la invención.

La expresión “inmunológicamente efectiva” significa que la cantidad de bacterias administradas en el proceso de vacunación es suficiente para inducir en el huésped una respuesta inmunológica efectiva frente a una infección por formas virulentas de App.

Es conocido que la dosis a emplear depende de la edad y del peso del animal a vacunar y del modo de administración.

Generalmente las dosis adecuadas se encuentran comprendidas en el rango entre 103 y 1010 unidades formadoras de colonias (ufc), preferiblemente entre 106 y 1010 ufc, y más preferiblemente entre 108 y 109 ufc.

Los animales pueden ser vacunados en cualquier tiempo apropiado. Preferiblemente una dosis de la vacuna de la invención se administra entre la primera y las 12 semanas de edad, preferiblemente entre las 6 y las 12 semanas de edad, y más preferiblemente la vacuna se administra a partir de las 8 semanas de edad. En ciertos casos puede ser necesaria la administración de dosis complementarias para conseguir una protección satisfactoria. En estas circunstancias se administra preferiblemente una segunda dosis entre las 2 y las 5 semanas después de la primera dosis, más preferiblemente después de 3 semanas desde la primera dosis.

La vacuna de la invención está destinada a la especie porcina, incluyendo entre otros cerdos, verracos, cerdas, y lechones, de cualquier edad o en cualquier fase de su ciclo productivo; preferiblemente está destinada a cerdos en fase de engorde, y más preferiblemente a cerdos de 6 a 12 semanas de vida.

La vacuna puede ser administrada por vía intranasal, intradérmica, subcutánea, mediante aerosol, intramuscular, u oral.

Dicha vacuna puede prepararse según los métodos habituales empleados por el experto en la materia para la preparación de formulaciones farmacéuticas apropiadas para las diferentes formas de administración, tal como se describe por ejemplo en el manual Remington The Science and Practice of Pharmacy, 20ª edición, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, 2000 [ISBN: 0-683-306472].

Típicamente las vacunas son preparadas como inyectables en forma de soluciones o suspensiones líquidas. También se pueden preparar en una forma sólida apropiada para ser disuelta o suspendida en un vehículo líquido antes de la inyección.

El volumen típico de una dosis de una vacuna inyectable se encuentra entre 0,5 ml y 5 ml, preferiblemente entre 1 ml y 3 ml, y más preferiblemente 2 ml.

Para inmunizar un animal con la vacuna de la invención la cepa viva atenuada de App habitualmente se mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Entre los vehículos líquidos que se pueden emplear para preparar la vacuna se encuentra, por ejemplo, el agua, una solución salina con una concentración fisiológica de sal, o el líquido de cultivo en el que se cultivan las bacterias.

Adicionalmente, si se desea, el vehículo puede contener sustancias auxiliares o excipientes como, por ejemplo, agentes humectantes, agentes dispersantes, agentes emulsionantes, agentes tampón (por ejemplo, el tampón fosfato), agentes estabilizantes como hidratos de carbono (por ejemplo, glucosa, sacarosa, manitol, sorbitol, almidón, o dextranos), o proteínas (por ejemplo, albúmina, caseína, suero bovino, o leche descremada).

Las características físico-químicas de los excipientes, así como el nombre de los productos comerciales bajo los que se comercializan se pueden encontrar en el libro R.C. Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4ª edición, Pharmaceutical Press, Londres, 2003 [ISBN: 0-85369-472-9].

Opcionalmente, también se pueden incorporar adyuvantes a la vacuna para potenciar la efectividad de la misma. Preferiblemente la vacuna de la invención comprende además un adyuvante.

Los adyuvantes son estimulantes inespecíficos del sistema inmunológico, que aumentan la respuesta inmunológica del huésped frente al patógeno invasor. Ejemplos de adyuvantes son: hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, óxido de aluminio, vitamina E, escualano, escualeno, aceite vegetal, saponinas, ginseng, zymosán, glucanos, dimetilaminoetildextrano, dextranos, polímeros no iónicos en bloque, adyuvante de Freund completo, adyuvante de Freund incompleto, muramildipéptidos, y mezclas de los mismos.

En una realización preferida la vacuna puede comprender la cepa de la invención en forma congelada o liofilizada. Preferiblemente la vacuna comprende además uno o más de un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Preferiblemente la cepa congelada se encuentra formulada con un excipiente farmacéuticamente aceptable, y más preferiblemente con un agente crioprotector. Una realización particular de esta presentación puede ser, por ejemplo, un cultivo de la cepa de la invención resuspendido en tampón de fosfato salino, formulado con un excipiente farmacéuticamente aceptable y conservado a baja temperatura, por ejemplo a -20 qC o a -80 qC. Antes de su administración la cepa congelada se combina con un vehículo líquido o diluyente estéril.

En el contexto de la invención, un agente crioprotector es un excipiente farmacéuticamente aceptable que se emplea para proteger una cepa bacteriana del daño que puede producir la congelación de la misma.

En una realización preferida la vacuna comprende la cepa de la invención en forma liofilizada que generalmente consiste en la cepa liofilizada en presencia de un excipiente farmacéuticamente aceptable, y más preferiblemente con un agente crioprotector. En este caso, antes de ser administrada al animal, la cepa liofilizada es reconstituida con un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable.

La liofilización de la cepa viva se efectúa de acuerdo con los procedimientos habituales conocidos por el experto en la materia. Preferiblemente la liofilización de la cepa se lleva en presencia de uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, y más preferiblemente en presencia de uno más agentes crioprotectores.

Entre los excipientes farmacéuticamente aceptables apropiados que se pueden emplear para conservar la vacuna congelada o en la liofilización de la misma se pueden mencionar, por ejemplo, povidona, trehalosa, glicerina, manitol, glucosa, dextrosa, maltosa, sorbitol, lactosa, fructosa, sacarosa, glutamato sódico, glicina, gelatina, dextrano, hidroxietilalmidón, y mezclas de los mismos.

En otra realización preferida la vacuna de la presente invención puede ser una vacuna de combinación, también denominada polivalente o combinada, para proteger los cerdos frente a la pleuroneumonía porcina y, opcionalmente, una o más enfermedades o condiciones patológicas que pueden afectar a dichos animales.

La vacuna combinada comprende habitualmente un primer componente, un segundo componente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una realización preferida la vacuna combinada comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de la cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae de la invención como primer componente, y una cantidad inmunológicamente efectiva de uno o más de un antígeno que es diferente del antígeno del primer componente y que son capaces de inducir o de contribuir a la inducción de una respuesta protectora frente a enfermedades o condiciones patológicas que pueden afectar a los cerdos como segundo componente. Dichas composiciones inmunogénicas incluyen, pero no están limitadas a aquéllas que proporcionan protección frente a Actinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp., Isospora sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Mycoplasma sp., Lawsonia intracellularis, Escherichia coli, virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino, virus de la gripe porcina, virus de la gastroenteritis transmisible, parvovirus porcino, virus de la encefalomiocarditis, coronavirus, y circovirus.

En una realización más preferida de la vacuna combinada, el segundo componente es una cantidad inmunológicamente efectiva de una cepa de App descrita en la solicitud de patente internacional WO-A-2004/045639, que comprende una deleción en el segmento del gen apxIA, que codifica el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxI de App, y una deleción en el segmento del gen apxIIA, que codifica el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxII de App; más preferiblemente el segundo componente es una cepa de App descrita en la solicitud de patente internacional WO-A-2004/045639, que comprende una deleción de los nucleótidos 885 a 944 del gen apxIA, que codifican el segundo dominio trasmembrana de la exotoxina ApxI de App y una deleción de los nucleótidos 885 a 944 del gen apxIIA, que codifican el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxII de App; y todavía más preferiblemente el segundo componente es la cepa depositada por Laboratorios HIPRA, S.A. (17170, Girona, España) en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) (46980, Valencia, España) con el número de registro CECT 5994, según el Tratado de Budapest de 28 de abril de 1977.

En la vacuna combinada los diferentes antígenos que la forman pueden estar indistintamente en un mismo recipiente o en recipientes separados. Las formas de presentación de la vacuna combinada, los excipientes, los adyuvantes y los vehículos líquidos apropiados pueden ser iguales o diferentes para cada antígeno.

Los excipientes, coadyuvantes y vehículos líquidos apropiados para la vacuna combinada se seleccionan de entre los mencionados anteriormente para la vacuna que comprende únicamente la cepa de la invención.

Kit vacunal

El objeto de la presente invención también incluye un kit vacunal para vacunar cerdos frente a una infección o enfermedad causada por App.

Dicho kit vacunal comprende un recipiente que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de la cepa viva atenuada de la invención.

En una realización preferida, dicha cepa está en forma liofilizada. En otra realización preferida, dicha cepa está en forma congelada.

El kit puede comprender además un recipiente que comprende un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable apropiado para la reconstitución de la cepa congelada o liofilizada.

En el caso de una vacuna combinada, el kit comprende además una cantidad inmunológicamente efectiva de uno o más de un antígeno que es diferente de la cepa de la invención, capaces de inducir o de contribuir a la inducción de una respuesta protectora frente a enfermedades o condiciones patológicas que pueden afectar a los cerdos. Los antígenos pueden estar en el mismo recipiente o en recipientes separados.

El kit vacunal, que comprende una vacuna combinada, preferiblemente comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de la cepa viva atenuada de la invención combinada con una cantidad inmunológicamente efectiva de una cepa de App que comprende una deleción en el segmento del gen apxIA, que codifica el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxI de App, y una deleción en el segmento del gen apxIIA, que codifica el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxII de App; más preferiblemente combinada con una cepa de App que comprende una deleción de los nucleótidos 885 a 944 del gen apxIA, que codifican el segundo dominio trasmembrana de la exotoxina ApxI de App y una deleción de los nucleótidos 885 a 944 del gen apxIIA, que codifican el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxII de App; y todavía más preferiblemente combinada con la cepa depositada por Laboratorios HIPRA, S.A. (17170, Girona, España) en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) (46980, Valencia, España) con el número de registro CECT 5994, según el Tratado de Budapest de 28 de abril de 1977.

La aplicación industrial de la invención se desprende claramente de la descripción. Solamente destacar que la pleuroneumonía porcina es una enfermedad infecciosa respiratoria de distribución mundial responsable de grandes pérdidas económicas en la industria porcina y que la cepa de App inmunógena, no hemolítica y no citolítica de la invención permite la preparación de vacunas eficaces para combatir la pleuroneumonía porcina.

Ensayo de atenuación

Para ensayar el nivel de atenuación de la cepa recombinante, ésta fue inoculada por vía intratraqueal a un grupo de animales. A otro grupo de animales se les administró una cepa salvaje de App de serotipo 2.

Siete días después de la inoculación se practicó la eutanasia a los animales y se valoraron las lesiones macroscópicas observadas en los órganos respiratorios.

Los cinco animales del grupo que recibió la cepa salvaje murieron durante el ensayo. Las necropsias de los animales de este grupo mostraron lesiones pulmonares graves en los cinco animales. No murió ninguno de los animales del grupo al que se inoculó la cepa atenuada de la invención, y ninguno de ellos exhibió lesiones pulmonares en la posterior necropsia. Según estos resultados, la cepa de la invención está sustancialmente atenuada y puede ser usada de forma segura como vacuna viva.

Ensayos de vacunación

La cepa de la invención se ensayó como vacuna frente a la infección por una cepa virulenta heteróloga de App de serotipo 2.

En un primer ensayo se seleccionaron dos grupos de animales. Uno de ellos fue vacunado con dos dosis de la vacuna en el día 0 (a las 8 semanas de vida) y en el día 21 (a las 11 semanas de vida) por vía intramuscular. Al grupo control se le administró tampón fosfato en lugar de la vacuna siguiendo la misma pauta.

En el día 42 ambos grupos de animales fueron infectados por vía intranasal con una cepa virulenta de App de serotipo 2, y los signos clínicos que presentaban los animales fueron registrados hasta una semana tras la infección.

Tal como se explica con más detalle en los Ejemplos, la vacuna presentó una buena seguridad con relación al incremento medio de la temperatura rectal y a las reacciones locales y sistémicas. En cuanto a la eficacia, se observaron diferencias favorables al grupo vacunado con relación a los siguientes parámetros: signos clínicos como el comportamiento, respiración en reposo, respiración en estado de estrés, y tos; lesiones pulmonares, y mortalidad. En el grupo vacunado no murió ningún animal durante el ensayo, mientras que en el grupo no vacunado murieron el 50% de los animales.

En otro ensayo de vacunación se administraron a un grupo de animales dos dosis de la vacuna de la invención a las 8 y a las 11 semanas de vida por vía intramuscular. Al grupo control se le administró tampón fosfato también por vía intramuscular.

A las 20 semanas de vida se infectaron los animales por vía intranasal con una cepa heteróloga de App de serotipo 2.

Al final del ensayo los animales vacunados habían presentado un menor índice de signos clínicos que los no vacunados, un nivel de lesiones pulmonares sustancialmente inferior, y una menor mortalidad.

Estos resultados demuestran que la vacuna que comprende la cepa atenuada de la invención es apropiada para su uso como vacuna viva atenuada en cerdos, y que puede ofrecer una protección efectiva contra una infección heteróloga con una cepa de App de serotipo 2 en términos de mortalidad, y reducción de la patología pulmonar y signos clínicos. Se observó además que el efecto protector se extendió como mínimo hasta 12 semanas después de haberse iniciado la vacunación, siendo una indicación de la protección duradera que experimentaron los animales vacunados.

Los ejemplos que siguen a continuación se exponen a efectos de proporcionar al experto en la materia una explicación suficientemente clara y completa de la presente invención, pero no deben ser considerados como limitaciones a los aspectos esenciales del objeto de la misma, tal y como han sido expuestos en los apartados anteriores de esta descripción.

Ejemplos

Las técnicas y métodos de ADN recombinante aplicados a continuación están descritos detalladamente en los manuales de Sambrook y Russell, Molecular Cloning 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York (2001) y de Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1998). Todos los productos de PCR fueron clonados previamente en un plásmido pBE antes de ser digeridos con enzimas de restricción. Este plásmido es un derivado del vector pBluescript SK2 (Stratagene) y presenta el lugar de clonaje múltiple sustituido por una pequeña secuencia nucleotídica que especifica tan sólo la diana del enzima de restricción EcoRV.

La cepa de E. coli XL1-blue (Stratagene) ha sido utilizada como huésped de los vectores híbridos basados en los plásmidos pUC118 o pBluescript SK. La cepa de E. coli S17-1 Ȝpir (Simon et al., Biotechnology, 1983, 1, 784-791) ha sido utilizada como huésped de los vectores híbridos basados en el plásmido pGP704.

Todas las secuencias oligonucleotídicas descritas a continuación están escritas en sentido 5’ a 3’ a menos que se indique explícitamente lo contrario. En todas las reacciones de PCR se utilizó la termopolimerasa Deep Vent (New England Biolabs) que dispone de actividad correctora de pruebas.

A.-Elección de una cepa de App

La cepa salvaje de App HP3179 corresponde a un aislado natural virulento del serotipo 2 de App de Laboratorios Hipra S.A. (Amer-Girona-España).

La cepa de App HP3179Nlr es una cepa resistente a ácido nalidíxico obtenida a partir de un mutante espontáneo de la cepa salvaje HP3179.

La cepa salvaje de App HP816 corresponde a un aislado natural virulento del serotipo 1 de App de Laboratorios Hipra S.A. (Amer-Girona-España).

B.-Identificación de los dominios transmembrana de las exotoxinas ApxII y ApxIII

Los tres dominios transmembrana, que adoptan una estructura de hélice alfa, fueron determinados mediante el uso de los programas TransMem (Aloy et al., Comp. Appl. Biosc., 1997, 13, 213-234) y Helixmem (Eisenbeg et al., J. Mol. Biol., 1984, 179, 125-142) aplicados a la secuencia de aminoácidos de la exotoxina ApxII de una cepa de serotipo 9 (Smits et al., Infect. Immun., 1991, 59, 4497-4504, número de acceso en la base de datos Genbank: X61111) y de la exotoxina ApxIII procedente de una cepa de serotipo 2 (Chang et al., ADN Cell Biol., 1993, 12(4), 351-362, número de acceso en la base de datos Genbank: L12145).

Estos programas detectaron tres regiones que podían actuar como dominios transmembrana en ambas exotoxinas tal como se muestra en la figura 1.

C.-Construcción de vectores de clonación híbridos capaces de integrarse en genoma de App

En la figura 2 se encuentra un esquema con los mapas de los plásmidos que se describen en este apartado.

C.1.- Construcción del plásmido híbrido pApxIIIǻH2

El primer objetivo de este paso era obtener un fragmento de ADN contiguo al extremo 5' del segmento codificante para el segundo dominio transmembrana del gen apxIIIA. Para ello se amplificó mediante PCR un fragmento de 904 pb a partir de ADN genómico purificado de la cepa de App HP3179 utilizando como cebadores los oligonucleótidos ApxIIIa5’ (GAT ATC AAG CAT GTT AGC CGA C) (SEQ ID NO 1) y ApxIIIa3’ (CTC GAG ACC AGC AGC TAA AC) (SEQ ID NO 2), que incluyen las dianas de restricción EcoRV y XhoI en sus extremos 5’ respectivos. La base número 4 del oligonucleótido ApxIIIa5’ se corresponde con la base número quince del gen apxIIIA. La séptima base del oligonucleótido ApxIIIa3’ es complementaria a la base 918 de la secuencia codificante del gen apxIIIA, siendo ésta la última base antes del inicio de la secuencia para el segundo dominio transmembrana.

El segundo objetivo de este paso era obtener un fragmento de ADN contiguo al extremo 3' del segmento codificante para el segundo dominio transmembrana del gen apxIIIA. Para ello se amplificó mediante PCR un fragmento de 869 pb a partir de ADN genómico purificado de la cepa de App HP3179 utilizando como cebadores los oligonucleótidos ApxIIIb5’ (CTC GAG TTG GCG TTT TTA CGT G) (SEQ ID NO 3) y ApxIIIb3 (AGA TCT TCA CCA CGT GCT ACT G) (SEQ ID NO 4), que incluyen las dianas de restricción XhoI y BglII en sus extremos 5’ respectivos. La base número 7 del oligonucleótido ApxIIIb5 se corresponde con la base 982 de la secuencia codificante del gen apxIIIA, siendo ésta la tercera base después del final de la secuencia para el segundo dominio transmembrana. La séptima base del oligonucleótido ApxIIIb3’ es complementaria a la base 1853 de la secuencia codificante del gen apxIIIA.

Una vez obtenidos los dos fragmentos descritos anteriormente, el primero fue digerido con los enzimas de restricción EcoRV y XhoI, mientras que el segundo fue digerido con los enzimas XhoI y BglII. Ambos fragmentos fueron entonces ligados con el vector pGP3, preparado según se describe en la solicitud de patente WO-A-2004/045639, y que fue previamente cortado con los enzimas de restricción EcoRV y BglII. El plásmido híbrido resultante recibió el nombre de pApxIIIǻH2.

C.2.- Construcción del plásmido híbrido pApxIIǻH2

El primer objetivo de este paso era obtener un fragmento de ADN contiguo al extremo 5' del segmento codificante para el segundo dominio transmembrana del gen apxIIA. Para ello se amplificó mediante PCR un fragmento de 871 pb a partir de ADN genómico purificado de la cepa de App HP816 utilizando como cebadores los oligonucleótidos ApxIIa5’ (GAT ATC AAA TCG TCC TTA CAA CAA GGA TTG) (SEQ ID NO 5) y ApxIIa3’ (GAA TTC ACC TGA AGC GAC TCG TTG GGC) (SEQ ID NO 6), que incluyen las dianas de restricción EcoRV y EcoRI en sus extremos 5’ respectivos. La base número 7 del oligonucleótido ApxIIa5’ se corresponde con la base 27 de la secuencia codificante del gen apxIIA. La séptima base del oligonucleótido ApxIIa3’ es complementaria a la base 885 de la secuencia codificante del gen apxIIA, siendo ésta la última base antes del inicio de la secuencia para el segundo dominio transmembrana.

El segundo objetivo de este paso era obtener un fragmento de ADN contiguo al extremo 3' del segmento codificante para el segundo dominio transmembrana del gen apxIIA. Para ello se amplificó mediante PCR un fragmento de 952 pb a partir de ADN genómico purificado de la cepa de App HP816 utilizando como cebadores los oligonucleótidos ApxIIb5’ (GAA TTC CCT CTT TCA TTC TTA AAT GTA GC) (SEQ ID NO 7) y ApxIIb3’ (AGA TCT GCC ATC AAT AAC GGT AGT ACT TG) (SEQ ID NO 8), que incluyen las dianas de restricción EcoRI y BglII en sus extremos 5’ respectivos. La base número 7 del oligonucleótido ApxIIb5’ se corresponde con la base 946 de la secuencia codificante del gen apxIIA, siendo ésta la primera base después del final de la secuencia para el segundo dominio transmembrana. La séptima base del oligonucleótido ApxIIb3’ es complementaria a la base 1845 de la secuencia codificante del gen apxIIA.

Una vez obtenidos los dos fragmentos descritos anteriormente, el primero fue digerido con los enzimas de restricción EcoRV y EcoRI, mientras que el segundo fue digerido con los enzimas EcoRI y BglII. Ambos fragmentos fueron entonces ligados con el vector pGP3, ya mencionado, que fue previamente digerido con los enzimas de restricción EcoRV y BglII. El plásmido híbrido resultante recibió el nombre de pApxIIǻH2.

D.-Obtención de bacterias recombinantes que han resuelto el plásmido híbrido insertado en el genoma D.1.- Obtención de cointegrados entre el plásmido pApxIIǻH2 y el genoma de la cepa HP3179Nlr.

La transformación de App con el plásmido híbrido pApxIIǻH2 se realizó por conjugación a partir de células de Escherichia coli S17-1 Ȝpir portadoras de este plásmido. La cepa empleada para la transformación con el plásmido híbrido pApxIIǻH2 fue la HP3179Nlr.

Antes de proceder a la conjugación se obtuvo un cultivo en fase estacionaria para dichas bacterias. El medio de cultivo empleado para App HP3179Nlr fue TSYN (Caldo de soja tríptica 30 g/l, extracto de levadura 6 g/ l y una vez autoclavado suplementado con NAD al 0,004%) y ácido nalidíxico 50 μg/ml. El medio de cultivo empleado para Escherichia coli S17-1 Ȝpir fue LB (triptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 10 g/l) que una vez autoclavado fue suplementado con kanamicina 25 μg/ml. Una vez alcanzada la fase estacionaria, se añadieron 0,2-0,3 unidades de A600 del cultivo de App y 0,6-0,8 unidades de A600 del cultivo de E. coli a 1 ml de MgSO4 10 mM. A continuación se centrifugó durante 2 minutos a

15.000 g y el sedimento fue resuspendido en 200 μl de MgSO4 10 mM. Una vez obtenida la mezcla de ambos cultivos, esta se extendió sobre un filtro de nitrocelulosa de 2,5 cm de diámetro y 0,45 μm de tamaño de poro previamente depositado sobre una placa de Petri con medio TSYN suplementado con agar noble 15 g/l. Después de incubar durante 6 horas a 37 qC el filtro con la conjugación se depositó en un tubo con 2 ml de PBS (Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1 mM, NaCl 137 mM, KCl 2 mM pH 7,4). Después de agitar vigorosamente, se retiró el filtro y la suspensión celular se centrifugó durante 2 minutos a 15.000 g y el sedimento fue resuspendido en 500 μl de PBS. La suspensión así obtenida se distribuyó en placas de Petri con medio TSYN suplementado con agar noble 15 g/l, kanamicina 50 μg/ml y ácido nalidíxico 50 μg/ml, a razón de 100 μl de suspensión celular por placa de Petri. Los cultivos resultantes se incubaron a 37 qC durante 24-36 horas. Con este procedimiento se obtuvieron un total de 65 colonias resistentes a kanamicina y ácido nalidíxico para la conjugación con el plásmido pApxIIǻH2, que equivale a una frecuencia de transformación de 1,3x10-7 por célula receptora.

Varias colonias fueron resembradas por agotamiento de asa en placas de Petri con LB suplementado con agar noble 15 g/l. NAD 0,004 %, kanamicina 50 μg/ml y ácido nalidíxico 50 μg/ml. Todas las colonias resultantes exhibían un mayor

o menor grado de fluorescencia cuando eran iluminadas con luz ultravioleta, indicación de la integración del plásmido en el genoma de App en un único suceso de recombinación. Como puede observarse en la figura 3, en el caso de producirse una doble recombinación, los exconjugantes serán incapaces de crecer en un medio con kanamicina. La presencia de este antibiótico en las placas permite por lo tanto el crecimiento sólo de aquellos recombinantes que han integrado la totalidad del plásmido en su genoma. El gen de la proteína fluorescente GFP es un indicador que permite discriminar si alguna de las colonias resistentes a kanamicina es el producto de una mutación espontánea.

D.2.- Obtención de la cepa HP3179ApxIIH2-

Una vez obtenidos los cointegrados con el plásmido pApxIIǻH2 es preciso fijar la deleción en el genoma de App mediante una segunda recombinación. Para ello uno de los cointegrados del paso anterior fue sometido a pases seriados en medio de cultivo suplementado sólo con ácido nalidíxico. Un medio sin kanamicina permite que, en el caso de producirse una segunda recombinación entre el genoma de App y el plásmido integrado, las bacterias resultantes sean viables. Este segundo suceso de recombinación da lugar a la aparición de dos genotipos diferentes. En el caso que se produzca por el mismo segmento en el que ya tuvo lugar la primera recombinación, el genotipo resultante será idéntico al de la cepa paterna usada en el apartado D.1. En el caso que esta segunda recombinación tenga lugar por el segmento en el que no tuvo lugar la primera recombinación, el genotipo resultante presentará la deleción en el fragmento que codifica para el segundo dominio transmembrana de la hemolisina (Fig. 3, panel A). La aparición de recombinantes puede monitorizarse de varias maneras diferentes: a) desaparición de la fluorescencia al iluminar las colonias con luz ultravioleta; b) sensibilidad a la kanamicina y c) recuperación del halo hemolítico que exhibía la cepa paterna usada en el apartado D.1. Los métodos a) y b) detectan los dos tipos de recombinantes. El método c) permite distinguir sólo los recombinantes que recuperan el genotipo paterno. Esto es debido a que en los recombinantes que presentan la deleción en el segmento codificante para el segundo dominio transmembrana del gen apxIIA no se restaura la actividad hemolítica del correspondiente fenotipo paterno.

Los pases seriados fueron realizados a partir de diluciones 1/10000 del pase anterior con la excepción del primer pase, que consistió simplemente en un cultivo realizado a partir de una colonia aislada procedente de la transformación con el plásmido pApxIIǻH2. El medio de cultivo fue LB suplementado con NAD 0,004 % y ácido nalidíxico 50 μg/ml. Para cada pase se empleó un volumen total de 10 ml de medio.

Después de cuatro pases en medio no selectivo se replicaron varias colonias no fluorescentes sobre agar Columbia suplementado con NAD y LB agar suplementado con NAD, ácido nalidíxico 50 μg/ml y kanamicina 20 μg/ml (LBNKm). Se seleccionaron para estudios posteriores varias colonias que no mostraron crecimiento sobre LBNKm y que no disponían de actividad hemolítica. Uno de los cultivos correspondientes fue caracterizado en detalle y se denominó HP3179ApxIIH2-.

D.3.- Obtención de cointegrados entre el plásmido pApxIIIǻH2 y el genoma de la cepa HP3179ApxIIH2-

La transformación de App con el plásmido híbrido pApxIIIǻH2 se realizó mediante conjugación a partir de células de Escherichia coli S17-1 Ȝpir portadoras de estos plásmidos. La cepa empleada para la transformación con el plásmido híbrido pApxIIIǻH2 fue la HP3179ApxIIH2-. El procedimiento y los medios de cultivo son idénticos a los descritos en el apartado D.1. La frecuencia de transformación con el plásmido pApxIIIǻH2 fue similar a la obtenida en el apartado D.1. para el plásmido pApxIIǻH2.

Varias colonias fueron resembradas por agotamiento de asa en placas de Petri con LB suplementado con agar noble 15 g/l, NAD 0,004 %, kanamicina 50 μg/ml y ácido nalidíxico 50 μg/ml. Todas las colonias resultantes exhibían un mayor

o menor grado de fluorescencia cuando eran iluminadas con luz ultravioleta, indicación de la integración del plásmido en el genoma de App en un único suceso de recombinación. Como puede observarse en la figura 4, en el caso de producirse una doble recombinación, los exconjugantes serán incapaces de crecer en un medio con kanamicina. La presencia de este antibiótico en las placas permite por lo tanto el crecimiento sólo de aquellos recombinantes que han integrado la totalidad del plásmido en su genoma. El gen de la proteína fluorescente GFP es un indicador que permite discriminar si alguna de las colonias resistentes a kanamicina es el producto de una mutación espontánea.

D.4.- Obtención de la cepa HP3179ApxII/IIIH2-

Una vez obtenidos los cointegrados con el plásmido pApxIIIǻH2 es preciso fijar la deleción en el genoma de App mediante una segunda recombinación. Para ello los recombinantes del paso anterior fueron sometidos a pases seriados en medio de cultivo suplementado sólo con ácido nalidíxico tal y como se ha descrito en D.2. Después de cuatro pases seriados se replicaron varias colonias no fluorescentes sobre agar Columbia suplementado con NAD y LB agar suplementado con NAD, ácido nalidíxico 50 μg/ml y kanamicina 20 μg/ml (LBNKm). Se seleccionaron para estudios posteriores varias colonias que no mostraron crecimiento sobre LBNKm. Uno de los cultivos correspondientes fue caracterizado en detalle y se denominó HP3179ApxII/IIIH2-.

E.-Análisis del ADN purificado a partir de las colonias aisladas en el paso anterior con objeto de comprobar la homogeneidad de los cultivos y la presencia de la deleción en los genes apxIIA y apxIIIA

Los recombinantes de los pasos D.2. y D.4. anteriores fueron cultivados en 10 mL de medio TSYN suplementado con ácido nalidíxico 50 μg/ml hasta fase estacionaria, realizándose posteriormente una extracción de ADN de cada uno de ellos.

E.1.- Análisis del recombinante HP3179ApxIIH2-

Las muestras de ADN genómico correspondientes a cada uno de los cultivos de los recombinantes obtenidos en el apartado D2 (plásmido pApxIIǻH2) fueron digeridas con los enzimas de restricción NdeI y EcoRI. Estas digestiones, junto a otra realizada a partir del ADN extraído de un cultivo de la cepa paterna HP3179Nlr, se analizaron mediante Southern-blot utilizando como sonda dos fragmentos de ADN de 663 y 1156 pb respectivamente procedentes de la digestión del plásmido pApxIIǻH2 con los enzimas de restricción EcoRV y BglII (Fig. 2). En la figura 3B se muestra el resultado de estas hibridaciones. Los resultados de la hibridación de la cepa control HP3179Nlr establecen la presencia de dos dianas de restricción NdeI separadas 3 kb y adyacentes al gen apxIIA. El análisis del recombinante con el plásmido resuelto a partir de una segunda recombinación por la misma región 5’ por donde tuvo lugar la primera, muestra un patrón de restricción similar. El análisis del recombinante con el plásmido resuelto a partir de una segunda recombinación por la región flanqueante 3’ del segmento que codifica para el segundo dominio transmembrana muestra la desaparición de la banda de 3 kb y la aparición de dos nuevas bandas de 1,9 y 1,1 kb respectivamente. Esta distribución de bandas es la esperada a partir de la desaparición del segmento codificante para el segundo dominio transmembrana y su sustitución por una diana EcoRI. Esta nueva diana insertada en el genoma de App origina el fragmento observado de 1,1 kb i la disminución consiguiente de 1,1 kb en la banda de 3 kb que se observa en la cepa HP3179ApxIIH2-(Fig. 3A y 3B). Este recombinante carece de actividad hemolítica (Figura 3C) indicando que la deleción del segundo dominio transmembrana elimina, o reduce considerablemente, la actividad hemolítica de la exotoxina ApxII de App. La exotoxina ApxII modificada mediante la deleción descrita será nombrada a partir de ahora como ApxIIH2-.

E.2.-Análisis del recombinante HP3179ApxII/IIIH2-

Las muestras de ADN genómico correspondientes a cada uno de los cultivos de los recombinantes obtenidos en el apartado D4 (plásmido pApxIIIǻH2) fueron digeridas con los enzimas de restricción NcoI y XhoI. Estas digestiones, junto a otra realizada a partir del ADN extraído de los cultivos de la cepa HP3179ApxIIH2-, se analizaron mediante Southern-blot utilizando como sonda el fragmento de ADN de 1783 pb procedente de la digestión del plásmido pApxIIIǻH2 con los enzimas de restricción EcoRV y BglII (Fig. 2). En la figura 4B se muestra el resultado de estas hibridaciones. Los resultados de la hibridación de la cepa control HP3179Nlr establecen la presencia de una diana de restricción NcoI situada a 7,9 kb por el lado 5’ de la diana NcoI presente en el gen apxIIIA. El análisis del recombinante con el plásmido resuelto a partir de una segunda recombinación por la misma región 5’ por donde tuvo lugar la primera, muestra un patrón de restricción similar. El análisis del recombinante con el plásmido resuelto a partir de una segunda recombinación por la región flanqueante 3’ del segmento que codifica para el segundo dominio transmembrana muestra la desaparición de la banda de 7,9 kb y la aparición de dos nuevas bandas de 6,6 y 1,3 kb respectivamente. Esta distribución de bandas es la esperada a partir de la desaparición del segmento codificante para el segundo dominio transmembrana y su sustitución por una diana XhoI. Esta nueva diana insertada en el genoma de App origina el fragmento observado de 1,3 kb i la disminución consiguiente de 1,3 kb en la banda de 7,9 kb que se observa en la cepa HP3179ApxIIH2- (Fig. 4A y 4B). La exotoxina ApxIII modificada mediante la deleción descrita será nombrada a partir de ahora como ApxIIIH2-.

E3.-Análisis de la actividad citolítica de los recombinantes apxII/IIIH2-

Como se ha podido observar en el apartado D2, la deleción del segmento codificante para el segundo dominio transmembrana H2 en el gen apxIIA elimina completamente la actividad hemolítica de la cepa de App de serotipo 2 HP3179, aún cuando esta cepa dispone de otra toxina Apx, la ApxIII. Esto es debido a que la toxina ApxIII no dispone de actividad hemolítica y sólo muestra actividad citolítica. Esto impide que se pueda caracterizar la cepa recombinante HP3179ApxII/IIIH2mediante el crecimiento en placas de agar sangre Columbia.

La actividad citolítica de la cepa HP3179ApxII/IIIH2-se ensayó sobre macrófagos alveolares porcinos obtenidos mediante métodos que el experto en la materia conoce suficientemente. Los macrófagos alveolares fueron resuspendidos finalmente en medio RPMI suplementado con 10 % de suero bovino fetal y gentamicina 50 μg/ml a una a una concentración de 2x106 células/ml y se dispensaron alícuotas de 100 μl en placas de bioensayo de 96 pocillos. Después de incubar las placas durante 15 horas a 37 qC se añadió a cada pocillo 100 μl de diluciones seriadas 1/2 en PBS del sobrenadante filtrado de los cultivos de las cepas HP3179 y HP3179ApxII/IIIH2-. Como control negativo, en algunos pocillos sólo se añadieron 100 μl de PBS. Después de incubar 2 horas a 37 qC, se añadieron a cada pocillo 5 μl de una solución de yoduro de propidio 1 mg/ml y después de unos minutos se examinó la placa mediante microscopia de contraste de fases y epifluorescencia. Dado que el yoduro de propidio es un fluorocromo que no puede atravesar la membrana celular, sólo las células con roturas en la membrana exhiben una intensa fluorescencia rojo-anaranjada en presencia de este fluorocromo. Para cuantificar la actividad citolítica de las diferentes toxinas se realizó un recuento de células fluorescentes. Como puede observarse en la figura 5, la incubación de los macrófagos alveolares con las toxinas procedentes de un cultivo de la cepa HP3179 da lugar un 59,6 % de células fluorescentes. En las misma condiciones, sólo se observó un 22,3 % de células fluorescentes después de incubar con la toxinas procedentes de la cepa HP3179ApxII/IIIH2-. Este último porcentaje es muy similar al que se obtuvo incubando los macrófagos solamente con PBS. Estos datos indican que la toxina ApxIIIAH2- producida por la cepa recombinante HP3179ApxII/IIIH2-carece de actividad citolítica, confirmando de esta manera que la eliminación del segundo dominio transmembrana H2 da lugar a una toxina atenuada incapaz de formar poros sobre las células diana.

De acuerdo con las condiciones del Tratado de Budapest y una vez comprobada la ausencia de actividad citolítica, la cepa recombinante HP3179ApxII/IIIH2- fue depositada por Laboratorios HIPRA, S.A. (17170, Girona, España) el día 4 de mayo de 2011 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) (46980, Valencia, España) con el número de registro CECT 7903.

F.- Análisis de la producción de las exotoxinas ApxIIH2-y ApxIIIH2-por parte de las cepas recombinantes obtenidas

Para determinar si las cepas recombinantes obtenidas seguían produciendo las exotoxinas ApxH2-, se estudió la acumulación de las mismas en cultivo líquido con medio LB. Las exotoxinas producidas fueron detectadas mediante anticuerpos monoclonales específicos para la exotoxina ApxII y la exotoxina ApxIII mediante técnicas de inmunoensayo y Western blot.

Tal como se muestra en la figura 6A, el crecimiento de la cepa recombinante HP3179ApxII/IIIH2- no se vio alterado por la presencia de las modificaciones en las dos exotoxinas.

De forma similar, la producción y excreción al medio de las exotoxinas ApxIIH2-y ApxIIIH2-por parte de la cepa recombinante sigue el mismo patrón temporal que la producción y excreción al medio de las exotoxinas no modificadas de la cepa salvaje HP3179Nlr. Todas las toxinas (modificadas o no) aparecen en el medio de cultivo hacia la segunda mitad de la fase de crecimiento exponencial y alcanzan valores máximos al principio de la fase estacionaria, si bien la exotoxina ApxIII empieza acumularse una hora antes que la exotoxina ApxII (Fig. 6A). Como puede observarse en la misma figura, las exotoxinas ApxIIH2-y ApxIIIH2-se acumulan hasta alcanzar niveles similares a los que muestran las respectivas exotoxinas no modificadas producidas por la cepa salvaje paterna HP3179Nlr.

Por otra parte, las deleciones introducidas son muy pequeñas (18-19 aminoácidos) y sólo se espera una disminución de 2 kDa en la masa molecular de las dos exotoxinas ApxH2-. Dado que las dos toxinas salvajes tienen una masa molecular aparente superior a los 100 kDa, una disminución de 2 kDa en su masa molecular es inapreciable en los geles de poliacrilamida y sus correspondientes Western-blots (Figura 7). Finalmente también hay que destacar que en esta misma figura no aparecen, de manera significativa, productos polipeptídicos truncados o mal procesados. Todos estos datos indican que la pequeña deleción introducida en ambas exotoxinas no impide que éstas sean sintetizadas de manera completa y exportadas hasta el medio de cultivo. Una vez liberadas al medio de cultivo, las exotoxinas ApxH2- exhiben una estabilidad similar a la mostrada por las respectivas exotoxinas no modificadas.

G.-Efectividad de la atenuación en la cepa obtenida

Para ensayar el nivel de atenuación de la cepa recombinante obtenida se emplearon cerdos híbridos Large White x Landrace (LWxLD) de tres meses de edad y sin distinción de sexo. Se establecieron tres grupos de animales para los diferentes ensayos. El método para inocular cada una de las diferentes cepas fue una inyección intratraqueal de la cepa salvaje HP3179 y la cepa atenuada en 10 ml de PBS a cada uno de los animales de los dos primeros grupos. Previamente se determinó que la dosis letal 50 para la cepa salvaje HP3179 estaba alrededor de 107 ufc en cerdos de esta edad. Los animales del tercer grupo recibieron tan sólo una inyección de 5 ml de PBS.

Siete días después de la inoculación se practicó la eutanasia a los animales y se valoraron las lesiones macroscópicas observadas en los órganos respiratorios. La valoración de las lesiones pulmonares se realizó según se describe en el artículo de Hannan et al., Res. Veter. Sci., 1982, 33, 76-88. Los valores que se muestran en la tabla 1 son las medias aritméticas de cada grupo acompañadas de su correspondiente desviación típica.

Tabla 1

Cepa: Nº de animales Dosis App (ufc) Mortalidad Animales con lesiones pulmonares Índice medio de las lesiones pulmonares

HP3179: 5 2x107 5/5 5/5 15.20 ± 9.23

HP3179ApxII/IIIH2: 5 2x109 0/5 0/5 0

Control (PBS): 5 N.A. 0/5 0/5 0

10 Los cinco animales del grupo que recibió la cepa salvaje murieron durante el ensayo. Las necropsias de los animales de este grupo mostraron lesiones pulmonares graves en los cinco animales. El segundo grupo fue inoculado con la cepa HP3179ApxII/IIIH2-. Aunque se inocularon 100 veces más bacterias que en el grupo anterior, ninguno de los animales causó baja y ninguno de ellos exhibió

15 lesiones pulmonares en la posterior necropsia. Según estos resultados, la cepa HP3179ApxII/IIIH2- está sustancialmente atenuada y puede ser usada de forma segura como vacuna viva.

H.-Ensayos de vacunación

20 1) Se seleccionaron 30 cerdos que se dividieron en dos grupos de 15 animales cada uno de ellos. Al primer grupo se le administraron dos dosis de una vacuna que comprendía al menos 2 x 108 unidades formadoras de colonias (ufc)/dosis de la cepa atenuada de la invención CECT 7903. La vacuna se administró por vía

25 intramuscular en el lomo del animal. La primera dosis se aplicó a tiempo cero (a las 8 semanas de vida), y la segunda dosis el día 21 (a las 11 semanas de vida).

Al segundo grupo, denominado Grupo Control, se le administró una inyección de tampón fosfato según el mismo régimen que al grupo vacunado.

El día 42 ambos grupos fueron infectados por vía intranasal con la cepa salvaje de App serotipo 2 denominada HP3412.

El ensayo se prolongó siete días tras la infección. Durante este período de tiempo de mantuvo un control sobre los signos clínicos que manifestaban los animales y se registraba la mortalidad de los mismos.

En este ensayo se estudió tanto la seguridad de la vacuna como su eficacia.

Para la valoración de la seguridad se hizo un seguimiento de la temperatura rectal de los animales y de las reacciones locales y sistémicas tras la vacunación.

En cuanto a la temperatura rectal, el incremento medio de dicha temperatura no superó los 1,5 qC, y ninguno de los animales presentó un incremento superior a los 2 qC.

No se observaron diferencias significativas entre las reacciones locales y sistémicas manifestadas por ambos grupos de animales.

Por tanto, la vacuna que comprende la cepa atenuada de la invención presentó una seguridad elevada para los animales.

La evaluación de la eficacia de la vacuna se llevó a cabo con base en tres conceptos: signos clínicos después de la infección, mortalidad, y lesiones pulmonares evaluadas post mortem.

Se observaron diferencias significativas entre el grupo vacunado y el grupo control en todos los signos clínicos analizados: comportamiento, respiración en reposo y en estrés, y tos. En todos los casos el grupo vacunado presentó una menor incidencia en los signos clínicos.

El examen post mortem de los animales sacrificados al finalizar el ensayo mostró una clara reducción de lesiones pulmonares y de su gravedad en los animales vacunados, en comparación con los animales no vacunados.

La mortalidad durante el ensayo solamente se dio en el caso del grupo control en el que murieron el 50 % de los animales. Ninguno de los animales vacunados murió durante el período de tiempo que duró el ensayo.

Por tanto, los resultados de este estudio demuestran que la vacuna que comprende la cepa atenuada de la invención es apropiada para su uso como vacuna viva atenuada en cerdos, y que puede conferir protección efectiva frente una infección heteróloga con una cepa de App de serotipo 2 en términos de mortalidad, reducción de la patología pulmonar y los signos clínicos.

2) Se seleccionaron 30 cerdos que se dividieron en dos grupos de 15 animales cada uno de ellos.

Al primer grupo se le administraron dos dosis de una vacuna que comprendía al menos 2 x 108 unidades formadoras de colonias (ufc)/dosis de la cepa atenuada de la invención CECT 7903. La vacuna se administró por vía intramuscular en el lomo del animal. La primera dosis se aplicó a tiempo cero (a las 8 semanas de vida), y la segunda dosis el día 21 (a las 11 semanas de vida).

El día 84 (a las veinte semanas de vida) ambos grupos fueron infectados por vía intranasal con la cepa salvaje de App serotipo 2 denominada HP3412.

Se observó que los animales vacunados presentaban una menor incidencia de mortalidad, de signos clínicos y de lesiones pulmonares provocados por una infección de App de serotipo 2 en comparación con los animales del grupo control no vacunados.

Por tanto, los resultados de este estudio demuestran que la vacuna que comprende la cepa atenuada de la invención es apropiada para su uso como vacuna viva atenuada en cerdos, y que puede conferir protección efectiva frente una infección heteróloga con una cepa de App de serotipo 2 en términos de mortalidad, reducción de la patología pulmonar y los signos clínicos, incluso como mínimo tras 12 semanas desde el inicio de la vacunación.

Claims

R E I V I N D I C A C IO N E S

1.- Una cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae caracterizada porque comprende: a) una modificación en al menos uno de los tres segmentos del gen apxIIA que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxII y

b) una modificación en al menos uno de los tres segmentos del gen apxIIIA, que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxIII.
2.- Una cepa según la reivindicación 1, caracterizada porque comprende: a) una deleción en al menos uno de los tres segmentos del gen apxIIA que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxII y b) una deleción en al menos uno de los tres segmentos del gen apxIIIA, que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxIII.
3.- Una cepa según la reivindicación 2, caracterizada porque comprende:

a) una deleción en el segmento del gen apxIIA que codifica para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxII definido por los nucleótidos 886 a 945 del gen apxIIA y

b) una deleción en el segmento del gen apxIIIA que codifica para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxIII definido por los nucleótidos 919 a 978 del gen apxIIIA.
4.- Una cepa según la reivindicación 3, caracterizada porque comprende: a) la deleción de los nucleótidos 886 a 945 del gen apxIIA que codifican para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxII y b) la deleción de los nucleótidos 919 a 978 del gen apxIIIA que codifican para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxIII.
5.- La cepa de Actinobacillus pleuropneumoniae depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de registro CECT 7903.
6.- Un procedimiento para obtener una cepa viva atenuada de Actinobacillus

pleuropneumoniae a partir de una cepa de A. pleuropneumoniae, caracterizado

porque comprende: a) modificar al menos uno de los tres segmentos del gen apxIIA que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxII y b) modificar al menos uno de los tres segmentos del gen apxIIIA, que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxIII.
7.- Un procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque comprende: a) introducir una deleción en al menos uno de los tres segmentos del gen apxIIA que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxII e b) introducir una deleción en al menos uno de los tres segmentos del gen apxIIIA, que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxIII.
8.- Un procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque comprende: a) introducir una deleción en el segmento del gen apxIIA, que codifica para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxII definido por los nucleótidos 886 a 945 del gen apxIIA e b) introducir una deleción en el segmento del gen apxIIIA, que codifica para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxIII definido por los nucleótidos 919 a 978 del gen apxIIIA.
9.- Un procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque comprende: a) introducir la deleción del segmento del gen apxIIA, que codifica para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxII definido por los nucleótidos 886 a 945 del gen apxIIA e b) introducir la deleción del segmento del gen apxIIIA, que codifica para el segundo dominio transmembrana de la exotoxina ApxIII definido por los nucleótidos 919 a 978 del gen apxIIIA.
10.- Una vacuna contra la pleuroneumonía porcina caracterizada porque comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de la cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
11.- Una vacuna contra la pleuroneumonía porcina caracterizada porque comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de la cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae de la reivindicación 5.
12.- Una vacuna según la reivindicación 10 ó 11, caracterizada porque comprende la cepa en forma liofilizada o congelada.
13.- Una vacuna según la reivindicación 12, caracterizada porque comprende además uno o más de un excipiente farmacéuticamente aceptable.
14.- Una vacuna según la reivindicación 13, caracterizada porque el excipiente farmacéuticamente aceptable se selecciona de entre el grupo formado por povidona, trehalosa, glicerina, manitol, glucosa, dextrosa, maltosa, sorbitol, lactosa, fructosa, sacarosa, glutamato sódico, glicina, gelatina, dextrano, hidroxietilalmidón, y mezclas de los mismos.
15.- Una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, caracterizada porque comprende además un adyuvante.
16.- Una vacuna según la reivindicación 15, caracterizada porque el adyuvante se selecciona de entre el grupo formado por hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, óxido de aluminio, vitamina E, escualano, escualeno, aceite vegetal, saponinas, ginseng, zymosán, glucanos, dimetilaminoetildextrano, dextranos, polímeros no iónicos en bloque, adyuvante de Freund completo, adyuvante de Freund incompleto, muramildipéptidos, y mezclas de los mismos.
17.- Una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, caracterizada porque comprende además como segundo componente una cantidad inmunológicamente efectiva de uno o más de un antígeno que es diferente del antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y que son capaces de

inducir o de contribuir a la inducción de una respuesta protectora frente enfermedades o condiciones patológicas que pueden afectar a los cerdos.
18.- Una vacuna según la reivindicación 17, caracterizada porque el segundo componente se selecciona de entre el grupo de antígenos que proporcionan protección frente a Actinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp., Isospora sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Mycoplasma sp., Lawsonia intracellularis, Escherichia coli, virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino, virus de la gripe porcina, virus de la gastroenteritis transmisible, parvovirus porcino, virus de la encefalomiocarditis, coronavirus, y circovirus.
19.- Una vacuna según la reivindicación 18, caracterizada porque el segundo componente es la cepa depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de registro CECT 5994.
20.- Kit vacunal caracterizado porque comprende un recipiente que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de la cepa viva atenuada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
21.- Kit vacunal según la reivindicación 20, caracterizado porque comprende la cepa en forma liofilizada o congelada.
22.- Kit vacunal según cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 21, caracterizado porque comprende además un recipiente que comprende un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable.
23.- Kit vacunal según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, caracterizado porque comprende además una cantidad inmunológicamente efectiva de uno o más de un antígeno diferente de la cepa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, capaces de inducir o de contribuir a la inducción de una respuesta protectora frente enfermedades o a condiciones patológicas que pueden afectar a los cerdos, en

donde los antígenos se encuentran en un mismo recipiente o en recipientes separados.
24.- Kit vacunal según la reivindicación 23, caracterizado porque el antígeno diferente es la cepa depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de registro CECT 5994.

FIGURA 1

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

N.º solicitud: 201131801

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 09.11.2011

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

Int. Cl. : Ver Hoja Adicional

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoría

56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas

X

WO 2004045639 A1 (HIPRA LAB SA et al.) 03.06.2004, todo el documento. Citado en la solicitud 1-24

A

JANSEN RUUD et al., "Cloning and characterization of the Actinobacillus pleuropneumoniae RTX toxin III (ApxIII) gene." Infection and Immunity (1993), vol. 61, no: 3, págs: 947-954, todo el documento. Citado en la solicitud 1-24

A

SEAH J N et al., "Localization of linear cytotoxic and pro-apoptotic epitopes in RTX toxin ApxIII of Actinobacillus pleuropneumoniae", Vaccine (2004), vol. 22, no: 11-12, págs: 1494-1497, todo el documento. 1-24

A

MAAS A et al: "Development of a DIVA subunit vaccine against Actinobacillus pleuropneumoniae infection", VACCINE (2006), vol. 24, no. 49-50, págs. 7226-723, todo el documento. 1-24

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:

Fecha de realización del informe 28.06.2013

Examinador M. Hernández Cuéllar Página 1/4

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 201131801

CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD A61K39/102 (2006.01)

C07K14/285 (2006.01) C12N1/36 (2006.01) Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

C07K, C12N Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) EPODOC, WPI, MEDLINE, EMBASE, BIOSIS, CAPLUS

Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201131801

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 28.06.2013

Declaración

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

Reivindicaciones 1-24 SI

Reivindicaciones

NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

Reivindicaciones SI

Reivindicaciones

1-24 NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

Base de la Opinión.-

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Técnica Página 3/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201131801

1. Documentos considerados.-

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

Documento

Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

D01

WO 2004045639 A1 (HIPRA LAB SA et al.) 03.06.2004

D02

JANSEN RUUD et al., "Cloning and characterization of the Actinobacillus pleuropneumoniae RTX toxin III (ApxIII) gene.” Infection and Immunity (1993), vol. 61, no: 3, págs: 947-954, todo el documento. Citado en la solicitud 30.11.1992

D03

SEAH J N et al., "Localization of linear cytotoxic and pro-apoptotic epitopes in RTX toxin ApxIII of Actinobacillus pleuropneumoniae", Vaccine (2004), vol. 22, no: 11-12, págs: 1494-1497, todo el documento. 29.03.2004

D04

MAAS A et al: "Development of a DIVA subunit vaccine against Actinobacillus pleuropneumoniae infection", VACCINE (2006), vol. 24, no. 49-50, págs. 7226-723, todo el documento.
2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

La presente invención se refiere a una cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae que comprende una modificación en al menos uno de los segmentos del gen apxIIA que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxII y una modificación en al menos uno de los segmentos del gen apxIIIA que codifican para los dominios transmembrana de la exotoxina ApxIII. Dicha cepa es inmunógena, no hemolítica y no citolítica. También se refiere a un procedimiento para obtenerla, a una vacuna contra la pleuroneumonía porcina que la contiene, y a un kit vacunal. En particular se reivindica la cepa con nº registro CECT 7903.

1.- NOVEDAD

Los documentos D01-D04 establecen el estado de la técnica relativo a la invención.

Ninguno de estos documentos describe una cepa igual a la reivindicada en la solicitud. En este sentido, en opinión de esta Oficina, las reivindicaciones 1-24 son nuevas según el Art. 8.1 LP 11/1986.
2.- ACTIVIDAD INVENTIVA

El documento D01 se considera el estado de la técnica más cercano a la invención. Este documento describe un método para obtener una cepa de Actinobacillus pleuropneumoniae inmunógena y no hemolítica modificada al menos en un segmento del gen apxIA y eventualmente en un segmento del gen apxIIA, que codifican un dominio transmembrana de las exotoxinas Apx hemolíticas y citolíticas. También se refiere a las cepas obtenidas, y a la vacuna viva atenuada obtenida con ellas contra la pleuroneumonía porcina.

En este sentido, el problema técnico planteado corresponde a la provisión de una nueva cepa viva atenuada de Actinobacillus pleuropneumoniae capaz de conferir protección contra la pleuroneumonía porcina. La solución es la cepa atenuada objeto de la invención.

La diferencia entre ambas cepas radica en que en D01 se modifica al menos en un segmento del gen apxIA y eventualmente en un segmento del gen apxIIA y en la cepa de la invención se modifica al menos uno de los segmentos del gen apxIIA y al menos uno de los segmentos del gen apxIIIA. A pesar de esta diferencia no se obtiene un efecto técnico inesperado y el resultado obtenido es equivalente al proporcionado por la cepa descrita en D01. Ambas cepas son inmunógenas, y no hemolíticas y por tanto susceptibles de ser utilizadas como vacunas contra la pleuroneumonía porcina. En este sentido, la cepa objeto de la invención se considera una mera alternativa. En consecuencia, en opinión de esta Oficina, las reivindicaciones 1-24 carecen de la actividad inventiva requerida en el Art. 8.1 LP 11/1986.

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