ES2346915T3 - Bacterias gram negativas atenuadas. - Google Patents
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Abstract
Un mutante de una bacteria Gram negativa, en el que dicha bacteria tiene una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad que es igual o mayor que 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%; 98% o 99% con una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC DE ID Nº: 90, dando dicha mutación como resultado una virulencia atenuada de la bacteria.
Description
Bacterias Gram negativas atenuadas.
Esta invención se refiere a bacterias vivas Gram
negativas atenuadas que se pueden usar en composiciones inmunógenas
o en composiciones de vacuna para la prevención de infecciones
bacterianas. Las bacterias atenuadas pueden actuar como un vector
de expresión para expresar inmunógenos procedentes de otros agentes
patógenos. Se ha encontrado que los polipéptidos codificados por
las secuencias de nucleótidos o genes que son dianas apropiadas
para la atenuación de bacterias pueden usarse como compuestos
inmunógenos especialmente en composiciones inmunógenas o en
composiciones de vacuna.
Está bien establecido que los microorganismos
vivos atenuados pueden ser vacunas muy eficaces; las respuestas
inmunes estimuladas por dichas vacunas son a menudo de mayor
magnitud y de duración más larga que las producidas por inmunógenos
no replicantes. Una explicación de esto puede ser que las cepas
vivas atenuadas establecen infecciones limitadas en el huésped e
imitan las etapas tempranas de la infección natural. Adicionalmente,
a diferencia de las preparaciones muertas, las vacunas vivas son
capaces son capaces de inducir potentes respuestas mediadas por
células que se pueden relacionar con su capacidad para replicarse en
células que presentan antígenos, tales como los macrófagos.
Existe una larga historia del uso de vacunas
atenuadas vivas en animales y seres humanos, usando especialmente
técnicas de mutagénesis química, sin embargo, las vacunas
empíricamente atenuadas pueden revertir a virulentas.
Las técnicas modernas de la biología molecular,
junto con el aumento del conocimiento de la patogénesis bacteriana,
han conducido a la identificación de varios genes que están
implicados en el crecimiento y la supervivencia de los
microorganismos in vivo. Esto ha proporcionado nuevos genes
diana para la atenuación y el concepto de que se podrían atenuar
"racionalmente" futuras cepas de vacuna introduciendo
mutaciones no revertientes definidas en genes seleccionados
conocidos por estar implicados en la virulencia, véanse por ejemplo
los documentos WO-A-00161724,
WO-A-00/68261 y
EP-A-0889120.
Aunque se han producido muchas cepas atenuadas
en laboratorios, sólo unas pocas se han calificado como potenciales
vacunas candidatas para uso en animales. Esto puede ser debido en
parte a la necesidad de equilibrar la inmunogenicidad de la vacuna
con la posibilidad del microorganismo de revertir, volviéndose
reactivo y patogénico.
Es evidente que la selección de los genes
apropiados para la atenuación, que se reubicarán en una vacuna
candidata adecuada, no es sencilla y no se puede predecir
fácilmente. Muchos factores pueden tener influencia sobre la
aceptabilidad del mutante atenuado como vacuna, y en consecuencia,
se requiere un esfuerzo de investigación para identificar y
seleccionar genes atenuantes adecuados. Se llevaron a cabo muchos
experimentos de atenuación únicamente in vitro y sus
resultados no se pueden extrapolar in vivo, especialmente, en
relación con la patogenicidad residual de los mutantes resultantes
de los animales vacunados.
Es por tanto deseable caracterizar los genes
implicados en la atenuación y sobre esta base desarrollar bacterias
atenuadas así como vacunas atenuadas, que tengan en particular un
elevado grado de inmunogenicidad y que presenten un buen perfil de
seguridad con efectos secundarios limitados o sin efectos
secundarios.
La presente descripción se refiere a la
identificación de las secuencias de nucleótidos y los genes
implicados en la atenuación de un microorganismo. Las mutaciones
introducidas en estas secuencias de nucleótidos y genes producen
novedosos mutantes atenuados. Estos mutantes son útiles para la
producción de composiciones inmunógenas atenuadas vivas o vacunas
atenuadas vivas que tienen un elevado grado de inmunogenicidad.
La presente invención proporciona un mutante de
una bacteria Gram negativa, en el que dicha bacteria tiene una
mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido
que tiene una identidad que es igual o más de un 80%, 85%, 90%,
95%, 96%, 97%, 98% ó 99% con una secuencia de aminoácidos codificada
por la secuencia de nucleótidos de la SEC DE ID Nº: 90 de dicha
mutación que da como resultado una virulencia atenuada de la
bacteria.
bacteria.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona una composición inmunógena que comprende un mutante
atenuado según la presente invención, y un diluyente, vehículo o
excipiente farmacéuticamente aceptable.
Además, la presente invención proporciona una
vacuna que comprende un mutante atenuado según la presente
invención, y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente
aceptable.
\newpage
La presente invención proporciona, en otro
aspecto, el uso de un mutante de una bacteria Gram negativa según
la presente invención en la producción de una composición o
preparación inmunógena atenuada viva de una composición de vacuna
atenuada viva.
La presente invención proporciona, en un aspecto
adicional, una composición inmunógena según la presente invención,
o una vacuna según la presente invención, para uso en la
inmunización contra o la prevención de una infección bacteriana en
un animal.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona el uso de un mutante de una bacteria Gram negativa
según la presente invención, una composición inmunógena según la
presente invención, o una vacuna según la presente invención, en la
preparación de un medicamento para la inmunización contra o la
prevención de una infección bacteriana en un animal.
En un primer aspecto, la descripción proporciona
bacterias que contienen una mutación atenuante en una secuencia de
nucleótidos o un gen en el que la mutación modifica, reduce o
suprime la expresión y/o la actividad biológica de un polipéptido o
proteína codificada por un gen, dando como resultado una virulencia
atenuada de la bacteria.
La mutación no se localiza necesariamente en el
interior de un gen para perturbar su función, conduciendo a la
atenuación. Se puede llevar a cabo también la mutación en las
secuencias de nucleótidos implicadas en la regulación de la
expresión del gen, en regiones concretas que regulan el inicio de la
transcripción, la finalización de la traducción y la transcripción.
De esta manera, están incluidos también los promotores y las
regiones de unión a los ribosomas (en general, estos elementos
reguladores están situados aproximadamente entre los nucleótidos 60
y 250 en la dirección 5' del codón de inicio del gen, Doree S M y
col., J. Bacteriol. 2001, 183(6):
1-983-9; Pandher K y col., Infect.
Imm. 1998, 66(12): 5613-9; Chung J Y y col.,
FEMS Microbiol Letters 1998, 166: 289-296),
finalizadores de la transcripción (en general, el finalizador se
localiza en aproximadamente 50 ácidos nucleicos en la dirección 3'
del codón de detención del gen; Ward C K y col., Infect. Imm. 1998,
66(7): 3326-36). En el caso de un operón, se
pueden localizar dichas regiones reguladoras en una distancia mayor
en la dirección 5' del gen. Algunas veces, una mutación en una
región intergénica puede conducir también a la atenuación.
Una mutación en el interior de dichas secuencia
reguladoras asociadas con el gen de tal manera que la mutación de
esta secuencia de nucleótidos modifica, inhibe o suprime la
expresión y/o la actividad biológica del polipéptido o la proteína
codificada por el gen, da como resultado una virulencia atenuada de
la bacterias que sería equivalente a una mutación en el interior de
un gen identificado en el presente documento.
La atenuación reduce o suprime la patogenicidad
de las bacterias y la gravedad de los signos o lesiones clínicas,
disminuye la velocidad de crecimiento de las bacterias y evita la
muerte.
La invención se refiere a bacterias Gram
negativas, más concretamente a la familia Pasteurellaceae,
especialmente a Pasteurella multocida, Pasteurella
haemolytica, Pasteurella anatipestifer y
Actinobacillus pleuropneumoniae. La bacteria preferida es
Pasteurella multocida.
Pasteurella multocida es una bacteria Gram
negativa, que es el agente causante de diversas enfermedades de
animales de producción y un patógeno humano oportunista. Es el
agente etiológico de la pasteurolosis grave, tales como la cólera
desatada en pájaros domésticos y silvestres, septicemia hemorrágica
bovina y rinitis atrófica porcina (Hunt ML y col., Vet Microbiol
2000, 72(1-2): 3-25). Se
pueden agrupar serológicamente los aislados basándose en los
antígenos capsulares en los serogrupos (A, B, D, E y F) o en 16
serotipos basándose en los antígenos LPS somáticos.
Se han identificado las secuencias de
nucleótidos potenciales implicadas en la atenuación de las bacterias
usando la Mutagénesis Etiquetada con Firma (STM). Se ha descrito en
detalle este procedimiento en el documento
WO-A-96/17951.
De manera breve, el procedimiento STM implica la
inserción de un único transposón etiquetado con firma en el genoma
de un microorganismo. En el locus de inserción, la secuencia de
nucleótidos del genoma estaba perturbada y la mutación resultante
se comprobó para la atenuación. Se determinó la secuencia de la
región perturbada (por ejemplo, el gen o el marco de lectura
abierto (ORF)) para cada mutante atenuado mediante la amplificación
de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa), la clonación y la
secuenciación de las regiones del ADN que flanqueaban el
transposón. Se adaptó el procedimiento STM descrito en el documento
WO-A-96/17951 para ser funcional en
Pasteurella multocida. Estas adaptaciones son especialmente
el uso del transposón Tn10 más bien que el del Tn5, el uso para la
selección de un medio CDM sin leucina más bien que una selección de
resistencia a la estreptomicina. Se proporcionan más detalles en
los ejemplos.
Una selección adicional de genes implicados en
la atenuación procedente de los genes potenciales identificados
mediante el procedimiento STM, se basó en la ausencia de mortalidad
tras la inoculación de la bacteria mutante a animales. Para la
aplicación veterinaria, un aspecto ventajoso de la descripción
comprende la implementación de una selección experimental
directamente en el animal diana, más bien que en un modelo animal.
Este procedimiento permite una selección más fiable de las
mutaciones apropiadas de la bacteria mutante. Para Pasteurella
multocida, los experimentos se llevaron a cabo en pavos, uno de
sus huéspedes diana naturales. Se inocularon los pavos
intramuscularmente con una cantidad suficiente de mutantes
combinados de P. multocida etiquetada con firma (por
ejemplo, 0,5 ml, 10^{7} UFC por animal). Los mutantes que no se
volvieron a aislar en un momento dado tras la inoculación se
consideraron como potencialmente atenuados. Los mutantes que no se
volvieron a aislar se distinguieron de los que se volvieron a
aislar en los combinados mediante la amplificación de la PCR y el
análisis de las etiquetas con firma. A continuación se inyectó cada
mutante potencialmente atenuado mediante la ruta intramuscular en
los pavos (por ejemplo, 0,5 ml, 10^{4} UFC por animal). Se
registró la mortalidad de los pavos diariamente durante 7 días tras
la inoculación. Los mutantes que no llegaron a morir se consideraron
como atenuados.
Las secuencias de nucleótidos que flanqueaban el
locus de inserción del transposón se designaron la SEC DE ID Nº: 1,
4, 5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51,
54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89.
Se han caracterizado los genes en los que se
produjo la inserción del transposón. Sus secuencias de nucleótidos
en la cepa PM70 de Pasteurella multocida se designaron la SEC DE ID
Nº: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49,
52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90. Se puede llevar
a cabo la mutación atenuante en el interior de estas secuencias de
nucleótidos o los genes así como en sus secuencias complementarias.
Se puede llevar a cabo también la mutación atenuante en las
secuencias de nucleótidos implicadas en la región reguladora de
dichos genes.
El término de "complementariedad" significa
en el presente documento la secuencia de nucleótidos de la otra
cadena en el genoma de doble cadena, que cubre de esta manera, la
cadena de sentido contrario como complemento de la cadena de
sentido directo, y a la inversa. El término "nucleótido" abarca
también desoxiribonucleótido (constituido de esta manera con ácidos
desoxirribonucleicos o ADN), ribonucleótido (constituido de esta
manera con ácidos ribonucleicos o ARN) y ribonucleótido mensajero
(ARNm).
Más generalmente, se pueden introducir
mutaciones atenuantes en el genoma de una bacteria, en particular
una bacteria Gram negativa, más particularmente un miembro de la
familia Pasteurellaceae, por ejemplo, P. multocida,
P. haemolytica, P. anatipestifer, A.
pleuropneumoniae, y más preferiblemente en el genoma de una
cualquiera de las diversas cepas de P. multocida, en al menos
una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de
aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad, al menos
aproximadamente un 75% de identidad, al menos aproximadamente un
80% de identidad, al menos aproximadamente un 85% de identidad, al
menos aproximadamente un 90% de identidad, y al menos
aproximadamente un 95, 96, 97, 98, o 99% o más de identidad con una
de las secuencias de aminoácidos codificadas por una secuencia de
nucleótidos identificada como la SEC DE ID Nº: 2, 6, 9, 12, 16, 19,
22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70,
75, 78, 81, 84, 87, 90. Esto abarca la degeneración del código
genético. Se puede establecer el porcentaje de identidad entre dos
secuencias de aminoácidos mediante la matriz emparejada de blast y
blosum62 del NCBI (National Center for Biotechnology Information)
usando los parámetros normalizados. El verbo "codificar" usado
en el presente documento no significa que la secuencia de
nucleótidos está limitada a una secuencia de codificación real sino
que abarca también el gen completo que incluye sus secuencias
reguladoras que son secuencias no codificantes.
La descripción se refiere a la mutación de las
secuencias de nucleótidos o los genes que codifican los polipéptidos
o las proteínas que tienen la misma función biológica. Se puede
comprobar la similitud de la función mediante la conservación de
los emplazamientos activos. Se puede llevar a cabo esto mediante una
investigación con DART del NCBI (Herramienta de Búsqueda de la
Arquitectura de la Región por sus siglas en inglés).
La presente invención proporciona de esta manera
mutantes atenuados de una bacteria según se ha descrito
anteriormente, que comprenden una mutación atenuante según se ha
definido anteriormente.
Los mutantes pueden comprender más de una
mutación, que puede dar como resultado grados aditivos o sinérgicos
de atenuación, y que puede dar como resultado una mejor prevención
de la reversión de la atenuación.
Estas múltiples mutaciones pueden asociar una
mutación(es) en las secuencias de nucleótidos o los genes
conocidos por sus propiedades atenuantes tales como los genes aro,
por ejemplo aroA (Homchampa P. y col., Veterinary Microbiology,
1994, 42: 35-44), y mutaciones en las secuencias de
nucleótidos o los genes según la descripción.
Se pueden introducir las mutaciones en los
microorganismos usando cualquier técnica conocida, tal como por
ejemplo, tecnología de ADN recombinante, con el fin de introducir
una mutación bien definida en el gen seleccionado. Dicha mutación
puede ser una inserción de la secuencia heteróloga de ácido
nucleico, una delección, una sustitución, una sustitución de ese
tipo de al menos un nucleótido por otro o una de sus combinaciones.
En una primera realización preferida, la mutación es una mutación
por delección, en la que la perturbación del gen está producida por
la delección de parte y preferiblemente por la delección de la
secuencia completa de ácido nucleico del gen: la delección de los
ácidos nucleicos evita la reversión de la patogenicidad. En una
segunda realización, la mutación es una inserción realizada en un
locus que corresponde a los loci de inserción del transposón
descritos en los ejemplos. Estos loci son en particular los que se
localizan entre: los nucleótidos 180-181 en la SEC
DE ID Nº: 2, 77-78 ó 1027-1028 en la
SEC DE ID Nº: 6, 416-417 en la SEC DE ID Nº: 9,
389-390 en la SEC DE ID Nº: 12,
381-382 en la SEC DE ID Nº: 16,
219-220 en la SEC DE ID Nº: 19,
1353-1354 en la SEC DE ID Nº: 22,
136-137 en la SEC DE ID Nº: 25,
384-385 en la SEC DE ID Nº: 28,
222-223 en la SEC DE ID Nº: 31,
217-218 en la SEC DE ID Nº: 34,
1411-1412 en la SEC DE ID Nº: 37,
943-944 en la SEC DE ID Nº: 40,
855-856 en la SEC DE ID Nº: 43,
369-370 en la SEC DE ID Nº: 46,
111-112 en la SEC DE ID Nº: 49,
443-444 en la SEC DE ID Nº: 52, 4-5
en la SEC DE ID Nº: 55, inmediatamente antes del nucleótido 1 en la
SEC DE ID Nº: 58, 573-574 en la SEC DE ID Nº: 61,
875-876 en la SEC DE ID Nº: 64, inmediatamente antes
del nucleótido 1 en la SEC DE ID Nº: 67, 218-219 en
la SEC DE ID Nº: 70, 1072-1087 en la SEC DE ID Nº:
75, 64-65 en la SEC DE ID Nº:
78,282-283 en la SEC DE ID Nº: 81,
1431-1432 en la SEC DE ID Nº: 84,
974-975 en la SEC DE ID Nº: 87,
802-803 en la SEC DE ID Nº: 90.
Los mutantes de delección incluyen aquellos en
los que se elimina toda o parte de una secuencia específica del
gen. En un aspecto, la mutación da como resultado una delección de
al menos un ácido nucleico, de al menos aproximadamente el 10%, al
menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 30%, al
menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 50%, al
menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al
menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 90%, al
menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 98%, o al
menos aproximadamente el 99% de dicho gen. Preferiblemente, se
elimina el gen completo.
Se conocen bien los procedimientos para
introducir las mutaciones en las regiones genómicas específicas y
serán aparentes para una persona experta en la técnica. Por ejemplo,
el gen completo que se va a mutar o un fragmento se clona en un
vector y se modifica con el fin de suprimir su expresión y/o su
actividad biológica. El fragmento de ADN modificado se reintroduce
en el genoma bacteriano mediante recombinación genética,
preferiblemente mediante recombinación homóloga entre el cromosoma
bacteriano y el vector. Como ejemplo, el vector puede ser un
plásmido suicida según se describe en Cardenas (Cardenas M y col.,
Vet Microbiol 3 de Mayo de 2001; 80(1):
53-61). Ventajosamente, este vector comprende
adicionalmente entre los dos brazos flanqueantes una secuencia de
polidetención (6 codones de detención, uno en cada marco de lectura)
para bloquear una posible traducción.
El microorganismo atenuado de la invención, por
ejemplo, P. multocida, puede comprender adicionalmente al
menos una secuencia heteróloga de ácido nucleico insertada en su
genoma, en la que dicha secuencia heteróloga de ácido nucleico
codifica preferiblemente un inmunógeno de una agente vírico,
parasítico o bacteriano patógeno que es diferente del
microorganismo atenuado. Esta secuencia heteróloga puede codificar
un inmunógeno de otra cepa de P. multocida. Un inmunógeno es
una proteína, polipéptido o péptido que es capaz de inducir una
respuesta inmune contra el agente patógeno o un antígeno
segregado.
Serán aparentes a la persona experta las
secuencias heterólogas de ácido nucleico que son adecuadas para su
uso en dicho vector (Fedorova ND y Highlander SK, Infect Immun 1997,
65(7): 2593-8) e incluyen, por ejemplo, las
procedentes de los miembros de la familia Pasteurellaceae
(especialmente Pasteurella multocida, Pasteurella
haemolytica, Pasteurella anatipestifer, Actinobacillus
pleuropneumoniae), o de bacterias del tipo de E. coli,
Salmonella, Campylobacter.
La secuencia heteróloga se inserta de tal manera
que el microorganismo la expresa cuando se administra en el
huésped con el fin de desarrollar una respuesta inmune contra el
microorganismo atenuado y dicho inmunógeno expresado. Se inserta
preferiblemente la secuencia heteróloga permitiendo la expresión de
los elementos reguladores, tales como un promotor. Se pueden añadir
también secuencia de nucleótidos útiles para la dirección y la
secreción de la proteína.
En una realización, se inserta la secuencia
heteróloga en el interior de la secuencia de nucleótidos
seleccionada o el gen seleccionado usado para la atenuación,
insertado en concreto en uno de los loci correspondientes a los
loci de inserción del transposón identificados en el presente
documento.
Para mejorar la expresión, se puede adaptar la
utilización del codón al vector bacteriano usado.
Los mutantes atenuados de la invención pueden
comprender también una secuencia de ácido nucleico que codifica una
proteína, un alérgeno, un factor de crecimiento o una citocina
terapéutica.
Según un aspecto adicional de la invención, se
usan microorganismos atenuados para producir composiciones
inmunógenas atenuadas vivas o composiciones de vacuna atenuada viva.
Según un aspecto concreto de la invención, el microorganismo
atenuado es P. multocida. Ventajosamente, según se ha
descrito anteriormente, el microorganismo puede actuar como un
vector recombinante para inmunizar animales o un ser humano contra
las infecciones producidas por otros agentes diferentes de
Pasteurella.
Las composiciones inmunógenas de las
composiciones de vacuna comprenden el mutante atenuado y un
excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable, y
opcionalmente un estabilizante y/o un adyuvante.
El término de "composición inmunógena"
cubre en el presente documento cualquier composición capaz, una vez
se ha inyectado a animales o a un ser humano, de estimular una
respuesta inmune contra el patógeno diana. El término de
"composición de vacuna" o "vacuna" cubre en el presente
documento cualquier composición capaz, una vez se ha inyectado a
animales o a un ser humano de inducir una respuesta inmune
protectora contra el patógeno diana.
El vehículo farmacéuticamente aceptable puede
ser agua o solución salina, pero puede, por ejemplo, comprender
también medio de cultivo de bacterias.
La bacteria atenuada viva según la invención
puede criocongelarse, preferiblemente con un estabilizante. Se
puede llevar a cabo la criocongelación según los procedimientos de
criocongelación normalizados bien conocidos. Los estabilizantes
farmacéuticamente aceptables pueden ser carbohidratos (por ejemplo,
sorbitol, manitol, lactosa, sacarosa, glucosa, dextrano,
trehalosa), glutamato de sodio (Tsvetkov T y col., Cryobiology 1983,
20(3): 318-23; Israeli E y col., Cryobiology
1993, 30(5): 519-23), proteínas tales como
peptona, lactoalbúmina o caseína, proteínas que contienen agentes
tales como leche desnatada (Mills CK y col., Cryobiology 1988,
25(2): 148-52; Wolff E y col., Cryobiology
1990, 27(5): 569-75), y tampones (por
ejemplo, tampón fosfato, tampón fosfato de metal alcalino).
Se puede usar un adyuvante para hacer solubles
las preparaciones criocongeladas.
Ejemplos de adyuvantes son aceite en agua,
emulsiones de agua en aceite en agua basadas en aceite mineral y/o
aceite vegetal y tensioactivos no iónicos tales como copolímeros en
bloque, Tween®, Span®. Otros adyuvantes adecuados son por ejemplo
la vitamina E, las saponinas, y Carbopol®, hidróxido de aluminio o
fosfato de aluminio ("Vaccine Design, The subunit and adjuvant
approach", Pharmaceutical Biotechnology, vol. 6, editado por
Michael F. Powell y Mark J. Newman, 1995, Plenum Press Nueva
York).
Se pueden almacenar las bacterias atenuadas
vivas a -70ºC en un medio que contiene glicerol.
Opcionalmente, la composición inmunógena o la
vacuna se puede combinar con uno o más inmunógenos seleccionados
entre otros microorganismos o virus patógenos en una forma
inactivada o viva.
Otro aspecto de la descripción es el uso de las
secuencias de nucleótidos o los genes según la descripción, para la
expresión y la producción de inmunógenos. En una primera
realización, se pueden usar los polipéptidos codificados por estas
secuencias de nucleótidos o los genes como subunidades de
inmunógenos en las composiciones o vacunas inmunógenas.
Los polipéptidos preferidos son los que tienen
las secuencias de aminoácidos identificadas como la SEC DE ID Nº:
3, 7, 10, 13, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53,
56, 59, 62, 65, 68, 71, 76, 79, 82, 85, 88, 91, o las codificadas
por las secuencias de nucleótidos de la SEC DE ID Nº: 2, 6, 9, 12,
16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64,
67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90.
La descripción abarca los polipéptidos
equivalentes procedentes de otra bacteria, en particular una
bacteria Gram negativa, más particularmente un miembro de la
familia Pasteurellaceae, por ejemplo, P. multocida,
P. haemolytica, P. anatipestifer, A.
pleuropneumoniae, y más preferiblemente en el genoma de una
cualquiera de las diversas cepas de P. multocida. Se incluyen
de esta manera por equivalencia los polipéptidos cuyas secuencias
de aminoácidos tienen al menos aproximadamente un 70%, al menos
aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos
aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos
aproximadamente un 95%, y al menos aproximadamente un 96, 97, 98 o
99% de identidad con una de las secuencias de aminoácidos
identificada como la SEC DE ID Nº: 3, 7, 10, 13, 17, 20, 23, 26, 29,
32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 76, 79, 82,
85, 88, 91, y/o los polipéptidos que tienen la misma
función(es) biológica que la de los polipéptidos
identificados anteriormente con la SEC. Se han descrito
anteriormente los criterios para establecer la identidad o la misma
función biológica.
La descripción abarca también los fragmentos
inmunógenos de estos polipéptidos, que tienen al menos una cadena
de 10 aminoácidos del polipéptido, al menos 20, en particular al
menos 20, preferiblemente al menos 50 y más preferiblemente al
menos 70.
Los polipéptidos o fragmentos se producen
preferiblemente mediante expresión in vitro. La secuencias de
nucleótidos según la descripción (por ejemplo, la SEC DE ID Nº: 2,
6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55,
58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90) o sus fragmentos, se
insertan en un vector, unido de manera operable a elementos
reguladores tales como un promotor, región de unión al ribosoma y
finalizador, y el codón de inicio y el codón de detención. Los
vectores preferidos son plásmidos útiles para la expresión in
vitro, es decir, Escherichia coli (Mahona F y col.,
Biochimie 1994, 46(1): 9-14; Watt M A y col.,
Cell Stress Chaperones 1997, 2(3): 180-90;
Frey J Res. Microbiol. 1992, 143(3):
263-9).
Se pueden sintetizar también estos polipéptidos
químicamente (Luo Y y col., Vaccine 1999,
17(7-8): 821-31).
Un objeto de la descripción es por tanto una
composición inmunógena o vacuna que comprende al menos un
polipéptido o fragmento según la descripción (subunidad de la
composición inmunógena o vacuna) o al menos un vector de expresión
in vivo según se ha descrito anteriormente (composición
inmunógena recombinante o vacuna viva), y un excipiente, diluyente
o vehículo farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente un
adyuvante. Se han descrito anteriormente ejemplos de dicho
ingredientes en relación con la vacuna viva.
En una segunda realización, se pueden insertar
estas secuencias de nucleótidos o sus fragmentos en vectores
recombinantes para producir composiciones inmunógenas recombinantes
o vacunas vivas capaces de expresar in vivo en el huésped el
polipéptido codificado por esta secuencia o fragmento de
nucleótido.
El vector de expresión in vivo puede ser un
vector o plásmido polinucleótido (documento
EP-A2-1001025; Chaudhuri P Res. Vet
Sci. 2001, 70(3), 255-6), virus (por ejemplo,
adenovirus, virus de la viruela tales como la difteroviruela aviar
(documentos US-A 5.174.993,
US-A-5.505.941 y
US-A-5.766.599) o el virus de la
viruela del canario
(US-A-5.756.103)) o bacterias, es
decir, Escherichia coli o Salmonella sp.
Se pueden usar polipéptidos y fragmentos de la
descripción en terapia.
Se pueden usar también dichos polipéptidos y
fragmentos como reactivos en una reacción
antígeno-anticuerpo. Otros objetos de la
descripción son de esta manera un procedimiento diagnóstico para
detectar la infección por la bacteria Gram negativa, así como kits
(por ejemplo, ELISA) que incluyen al menos un polipéptido o
fragmento según la descripción.
Se pueden usar anticuerpos contra los anteriores
polipéptidos o fragmentos como un reactivo diagnóstico o en
inmunización o vacunación pasiva o en terapia, Otros objetos de la
descripción son una preparación de anticuerpos que comprende un
anticuerpo específico de un polipéptido o un fragmento según la
descripción y los procedimientos de diagnóstico que usan el mismo.
Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Las personas
expertas en la técnica conocen bien los procedimientos para
producir anticuerpos. Si se desean anticuerpos policlonales, se
inmuniza un animal seleccionado (por ejemplo, ratón, conejo, cabra,
caballo, etc) con un polipéptido o un fragmento. Se recoge el suero
del animal inmunizado y se trata según los procedimientos conocidos
y se purifica en la medida de lo posible. Véase, por ejemplo,
Jurgens y col. J. Chrom., 1985, 348: 363-370. Se
conoce bien la metodología general para preparar anticuerpos
policlonales usando la tecnología del hibridoma. Se pueden crear
líneas celulares inmortales productoras de anticuerpos mediante
fusión celular, y también mediante otras técnicas tales como
transformación directa de linfocitos B con ADN oncogénico, o
transfección con virus de Epstein-Barr. Véase, por
ejemplo, J. E. Liddell "A practical guide to monoclonal
antibodies" ed. John Wiley and sons, 1991, p.188; S. J. de
StGroth y col. J. Immunol. Methods, 1980,
35(1-2), 1-21.
Se pueden usar las secuencias de nucleótidos
según la descripción y sus fragmentos como una sonda par la
hibridación, por ejemplo, en un procedimiento diagnóstico.
Se usan preferiblemente condiciones restrictivas
de hibridación. Una se puede referir a la descrita por Sambrook y
col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1989), 1.101-1.104. la
hibridación en condiciones de restricción significa que se observa
aún una señal positiva de hibridación tras lavar durante 1 hora con
tampón 1 x SSC y SDS al 0,1% a 55ºC, preferiblemente a 62ºC y lo más
preferible a 68ºC, en particular, durante 1 hora en tampón 0,2 x
SSC y SDS al 0,1% a 55ºC, preferiblemente a 62ºC y lo más
preferible a 68ºC.
Se pueden usar las secuencias de nucleótidos
según la descripción y sus fragmentos como cebadores par la PCR o
similar, en particular para la detección de bacterias Gram negativas
en cualquier medio, por ejemplo, muestras de tejidos, fluidos
biológicos, agua, alimento.
Se hace preferible el uso de los fragmentos de
las secuencia de nucleótidos que tienen al menos 20, al menos 30,
al menos 50, al menos 70 o al menos 100 ácidos nucleicos de las
secuencias de nucleótidos o los genes según la descripción, en
particular de la SEC DE ID Nº: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31,
34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84,
87, 90.
Adicionalmente, la presente descripción se
refiere a los procedimientos para inmunizar contra o para evitar la
infección bacteriana en animales, preferiblemente en especies
aviares, conejo, bovina y porcina y más preferiblemente para
especies aviares en pollo, pavo, y pato (esto incluye reproductores,
pollos y gallinas ponedoras) o en un ser humano. Según estos
procedimientos, se administran (1) una composición inmunógena
atenuada o vacuna viva, (2) una subunidad de la composición
inmunógena o vacuna, (3) una composición inmunógena recombinante o
vacuna viva, o sus combinaciones.
La administración puede ser especialmente hecha
mediante inyección intramuscular (IM), intradérmica (ID) o
Subcutánea o mediante administración intranasal, intratraqueal u
oral. La composición inmunógena o la vacuna según la invención se
administra mediante jeringuilla, equipos sin aguja (del tipo, por
ejemplo, Pigjet, Avijet, Dermojet o Biojector (Bioject, Oregón,
EE.UU.)), pulverizador, agua potable, gotas oculares.
Las administraciones preferidas de la
composición inmunógena atenuada o vacuna viva son in ovo, mediante
las rutas oral (por ejemplo, agua potable, pulverización corporal
completa), ocular (por ejemplo, gotas oculares, pulverización
corporal completa, traqueal (por ejemplo, pulverización),
intradérmica, subcutánea (SC) o intramuscular (IM).
Una persona experta en la técnica puede
determinar y optimizar la cantidad de microorganismos atenuados
vivos. Sin embargo, generalmente, se pueden administrar a un animal
10^{4}-10^{9} UFC, preferiblemente,
aproximadamente 10^{5}-10^{8} UFC y más
preferiblemente, aproximadamente 10^{8}-10^{7}
UFC en una unidad de dosificación única.
Por ruta intramuscular, se pueden administrar a
un animal aviar aproximadamente 10^{4}-10^{7}
UFC, preferiblemente, aproximadamente
10^{5}-10^{6} UFC en una unidad de dosificación
única. El volumen de una unidad de dosificación única puede estar
entre 0,2 ml y 0,5 ml y preferiblemente 0,3 ml. Por ruta oral,
traqueal u ocular, se pueden administrar a un animal aviar
aproximadamente 10^{5}-10^{8} UFC,
preferiblemente, aproximadamente 10^{8}-10^{7}
UFC en una unidad de dosificación única. Para la administración en
pulverización, el volumen es dependiente del equipo y el tamaño de
las gotitas, entre aproximadamente 30 y aproximadamente 600 ml para
1000 animales y preferiblemente 0,2 ml por animal.
\newpage
Para animales bovinos y porcinos, las rutas
preferidas son IM y SC. Se pueden administrar al animal
aproximadamente 10^{4}-10^{9} UFC,
preferiblemente, aproximadamente 10^{5}-10^{8}
UFC de una unidad de dosificación única. El volumen de una unidad
de dosificación única puede estar entre 0,2 ml y 5,0 ml y
preferiblemente entre 0,5 ml y 2,0 ml y más preferiblemente 1,0
ml.
Se pueden administrar a conejos por ruta IM o SC
aproximadamente 10^{4}-10^{8} UFC,
preferiblemente, aproximadamente 10^{5}-10^{7}
UFC en una unidad de dosificación única. El volumen de una unidad de
dosificación única puede estar entre 0,2 ml y 0,5 ml y
preferiblemente 0,5 ml. Se pueden administrar también mediante ruta
ID aproximadamente 10^{4}-10^{8} UFC,
preferiblemente, aproximadamente 10^{5}-10^{7}
UFC en una unidad de dosificación única. El volumen de una unidad
de dosificación única puede estar entre 0,1 ml y 0,2 ml.
Los siguientes ejemplos ilustran la descripción.
No se pretende que limiten su alcance de aplicabilidad.
Se produjeron las etiquetas según se describe en
Hensel y col., (Science, 1995, 269:400-403). Se
seleccionaron inicialmente los plásmidos pUTminiTn5Km2 etiquetados
que contienen etiquetas que se hibridan bien pero no se hibridan en
cruzado entre sí. Se encontró que el transposón
mini-Tn5 en el vector pUTminTn5Km2 etiquetado no se
transponía en las diversas cepas de Pasteurella multocida. En
contraste, el transposón mini-Tn10 ha demostrado
funcionar en P. multocida (Lee y col., Vet Microbiol, 1996,
50:143-8). Las etiquetas preseleccionadas se
transfirieron por tanto desde los vectores pUTminiTn5 en el plásmido
pLOF/Km que contenía mini-Tn10 (Herrero y col., J.
Bacteriology, 1990, 172: 6557-6567). Se amplificaron
las etiquetas mediante la PCR usando cebadores que se unen con el
vector pUTminiTn5Km2, en cualquiera de los lados del emplazamiento
KpnI en el que se clonaron las etiquetas. Estos cebadores
incluían las secuencias del enzima de restricción SaII. A
continuación se digirieron los productos de la PCR con SaII
y se clonaron en el emplazamiento SaII de una versión
modificada del vector pLOF/Km, en la que un emplazamiento
SaII ha sustituido el único emplazamiento de clonación
SfII. A continuación se transformaron lo plásmidos pLOF/Km
etiquetados en la cepa 8M10\lambdapir de E. coli
(Km^{r}, thi, thr, leu, tonA,
lacY, supE,
recA::RP4-2-Tc::Mu\lambdapir)
(Miller V.L. y col., J. Bacteriol., 1988, 170:
2575-83). Esta cepa puede movilizar plásmidos tales
como pLOF/Km en bacterias receptoras mediante conjugación.
El proceso de conjugación requiere un
procedimiento de selección de la P. multocida receptora, que
ha adquirido el plásmido pLOF/KM y un procedimiento de
contraselección frente al donante SM10\lambdapir de E.
coli.
En el procedimiento de selección, se selecciona
la P. multocida receptora para usar kanamicina, que está
codificada por el transposón mini-Tn10.
Inicialmente, par la contraselección en
conjugaciones frente al donante E. coli, se usó un mutante
espontáneamente resistente a la estreptomicina de la cepa
P-1059 de Pasteurella. Sin embargo, pareció que esta
cepa atenuaba su virulencia en pavos y de esta manera no era
utilizable aquí. Las cepas de Pasteurella multocida pueden
crecer en medios químicamente definidos (CDM) (Hu y col., Infection
and Immunity 1986, 804-810). Se utilizó una versión
modificada de este medio químicamente definido que contenía agar
pero no contenía leucina para permitir la contraselección frente al
donante E. coli. La cepa de Pasteurella fue capaz de crecer
en este medio, la composición del cual se proporciona en la tabla
1, mientras que la cepa SM10\lambdapir de E. coli, que es
un auxótrofo de leucina no.
Se reavivó una ampolla liofilizada de la cepa
P. multocida (USDA P-1059, disponible
anteriormente de la American Type Culture Collection, número de
acceso ATCC 15742) mediante la adición de 200 \mul de BHI
(infusión de cerebro-corazón) y se pasó rápidamente
una alícuota de la suspensión sobre una placa de agar BHI, y se
incubó la placa a 37ºC durante la noche. El material de las
colonias de esta placa se usó para inocular un caldo de cultivo
BHI, que se incubó con agitación a 37ºC durante la noche. Se añadió
glicerol hasta una concentración final de 15% v/V y se almacenaron
las alícuotas congeladas a -80ºC. Se pasó rápidamente una muestra de
una de estas alícuotas congeladas sobre una placa de agar BHI y se
incubó durante la noche. El material de la colonia de esta placa
BHI se pasó rápidamente a continuación sobre placas de agar CDM con
la composición proporcionada en la tabla 1 y se incubó a 37ºC
durante 3 días. El material de la colonia de esta placa CDM se
inoculó en un caldo de cultivo BHI y se incubó con agitación a 37ºC
durante la noche. Se añadió glicerol a este cultivo hasta una
concentración final de 15% v/v y se congelaron las alícuotas a
-80ºC. Se denominó esta cepa 16084 (CDM).
Se conjugaron los transformantes pLOF/km
etiquetados con SM10\lambdapir con la cepa 16084 (CDM) de P.
multocida. Para minimizar el aislamiento de los mutantes
hermanos (mutantes con el transposón localizado en la misma
posición que surge debido a la replicación del mutante durante el
procedimiento de conjugación) cada transformante etiquetado con
SM10\lambdapir se conjugó con la cepa P. multocida en al
menos tres conjugaciones separadas. Se seleccionaron los mutantes
de transposón obtenidos de Pasteurella en placas de agar CDM
suplementadas con 50 \mug/ml de kanamicina. A continuación se
pasaron rápidamente los mutantes resistentes a la kanamicina de
cada uno de los transposones etiquetados para formar colonias únicas
dos veces sobre placas de agar BHI con 50 \mug/ml de kanamicina.
A continuación se inocularon las colonias únicas en caldos de
cultivo BHI, se hicieron crecer durante la noche a 37ºC con
agitación. A continuación se añadió glicerol hasta una
concentración final de 15% v/v y se almacenaron los mutantes a -80ºC
en viales individuales.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hicieron crecer cultivos de mutantes de P.
multocida para la inoculación de pavos mezclando 20 \mul de
cada uno de los cultivos madre con glicerol de los mutantes
obtenidos en el ejemplo I con 200 \mul de medio de cultivo BHI,
suplementado con 50 \mug/ml de kanamicina, y colocándolos en
placas de microvaloración de 96 pocillo. Estas placas de
microvaloración se incubaron en condiciones estáticas durante
aproximadamente 18 horas a 37ºC. A continuación, se mezclaron
alícuotas de 10 \mul de los cultivos de 18 horas de cada mutante
con 200 \mul de medio de cultivo BHI suplementado con 50 \mug/ml
de kanamicina en una placa de microvaloración reciente y se incubó
la placa a 37ºC durante aproximadamente 4 horas. Se detuvieron los
cultivos en la fase exponencial de crecimiento y se transfirieron
100 \mul de los cultivos de cada mutante a una placa de
microvaloración reciente y se usaron para la determinación de la
densidad óptica (DO) a 650 nm.
Se formaron combinados de inóculos o de entrada
mezclando los restantes 100 \mul de los cultivos de 4 horas cada
cultivo de entrada estaba constituido por 48 mutantes diferentes. Se
determinó el título de estas suspensiones combinadas mediante
análisis FACS (clasificador celular activado por fluorescencia) de
alícuotas de 1000 \mul. A continuación se diluyeron alícuotas (1
ml) de la suspensión combinada en agua fisiológicamente tamponada
para obtener una suspensión con un título de 2. 10^{7} ufc/ml. A
continuación se inocularon grupos de 5 pavos de tres semanas de
edad intramuscularmente con alícuotas de 0,5 ml de esta suspensión
(10^{7} ufc por animal). Se determinó el estado serológico de los
pavos antes de la inoculación mediante cribado para la presencia de
anticuerpos de Pasteurella en muestras de sangre tomadas un día
antes de la inoculación. Se cosecharon las células del resto de
combinados de entrada mediante centrifugación y se extrajo el ADN
cromosómico de los aglomerados celulares.
Aproximadamente 14 horas después de la
inoculación, se tomó 1 ml de muestras de sangre de 3 de los 5 pavos
Se plaquearon las diluciones en serie (10^{-1} a 10^{-7}) de las
muestras de sangre en placas de agar Columbia suplementado con
sangre de ovejas al 5%. Se incubaron las placas a 37ºC durante 24
horas tras lo cual se volvieron a suspender 10000 colonias de
Pasteurella en medio BHI. Estas suspensiones, que se denominaron
combinado de salida, se centrifugaron a continuación y se extrajo el
ADN cromosómico procedente del aglomerado celular.
Los mutantes de Pasteurella que estaban
presentes en el combinado de entrada pero que no se volvieron a
aislar de los pavos, se identificaron mediante la amplificación de
la PCR de las etiquetas con firma presentes en las muestras de ADN
procedentes de los combinados de entrada y salida, y se llevó a cabo
la hibridación de los productos de la PCR amplificados frente a las
inmunotransferencias cargadas con el ADN que codificaba las
etiquetas con firma, según se describe en Hensel y col. (Science
1995, 269:400-403). Se consideraron estos mutantes
como de virulencia potencialmente atenuada. Se confirmó esta
atenuación mediante cribado para una ausencia de mortalidad tras
las infecciones únicas de los potenciales mutantes en pavos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se revivieron los mutantes de transposón como
potencialmente atenuados en el ejemplo 2 o los mutantes que tienen
limitada la capacidad para crecer en el cultivo, mezclando 20 \mul
de los cultivos madre con glicerol con 200 \mul de medio de
cultivo BHI suplementado con 50 \mug/ml de kanamicina en placas de
microvaloración. Se incubaron estas placas de microvaloración en
condiciones estáticas durante 18 horas a 37ºC. A continuación se
tomaron alícuotas de 10 \mul de cada mutante de estos cultivos y
se mezclaron con 200 \mul de medio BHI, suplementado con 50
\mug de kanamicina en una placa de microvaloración reciente y se
incubó esta placa en condiciones estáticas durante aproximadamente
4 horas. Se detuvieron los cultivos en la fase exponencial de
crecimiento y se transfirieron 100 \mul de los cultivos de cada
mutante a una placa de microvaloración reciente y se usaron para la
determinación de la densidad óptica (DO) a 650 nm. A continuación se
diluyeron los cultivos de cada uno de los mutantes 1 en 1000 en
agua fisiológicamente tamponada para obtener una concentración de
aproximadamente 2.10^{4} ufc/ml. A continuación se inocularon
alícuotas (0,5 ml) de estas diluciones intramuscularmente en 2
pavos de cinco semanas de edad (10^{4} ufc por animal). Se
determinó el estado serológico de unos pocos animales de cada grupo
de pavos a partir de las muestras de sangre tomadas el día antes de
la inoculación. Se vigilaron los pavos durante los siguientes 7
días para la mortalidad. De los mutantes ensayados 72 no dieron
como resultado mortalidad en cualquiera de las dos aves inoculadas.
Estos 72 mutantes se consideraron con virulencia atenuada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificaron los emplazamientos de inserción
del transposón en el genoma de los mutantes atenuado de P.
multocida clonando el ADN que flanqueaba un lado de la inserción
del transposón, tanto mediante PCR inversa como mediante PCR
arbitrariamente cebada.
Se revivieron estos mutantes de los cultivos
madre con glicerol a -80ºC pasando rápidamente una alícuota sobre
placas de agar BHI con 50 \mug/ml de kanamicina. A continuación se
usaron las colonias únicas para inocular caldos de cultivo BHI a
partir de los cuales se preparó ADN cromosómico.
Para la PCR inversa, se digirió el ADN
cromosómico con un enzima de restricción que tenía un emplazamiento
de reconocimiento de 4 pares de bases, tales como Tsp509I,
\alphaTaqI o Rsal. A continuación se unió el ADN en un volumen
grande para estimular la ligadura intramolecular. A continuación se
amplificó el ADN que flanqueaba el transposón procedente de esta
plantilla de ADN unido usando cebadores aparentemente enfrentados
que se hibridan a la secuencia conocida del transposón. A
continuación se clonaron y se secuenciaron estos productos de la
PCR inversa.
Para la PCR arbitrariamente cebada se usó como
plantilla el ADN cromosómico en un primer ciclo de reacción de la
PCR con un cebador aparentemente enfrentado que se hibrida con el
transposón y un cebador arbitrario. El cebador arbitrario tiene 5
bases conocidas en el extremo 3' y a continuación 10 bases
aleatorias. Las 20 bases en el extremo 5' del cebador son de
secuencia conocida. La temperatura de hibridación de este primer
ciclo de reacción de la PCR se ajusta inicialmente muy baja,
aumentándose la temperatura de hibridación en los ciclos
posteriores. A continuación se usó una parte de los productos de
este primer ciclo de la PCR como plantilla en un segundo ciclo de
la PCR. Este segundo ciclo de la PCR utiliza otro cebador
aparentemente enfrentado, que se hibrida con el transposón en una
posición que está más cercana al extremo del transposón que la del
cebador usado en el primer ciclo de la PCR. El otro cebador usado en
este segundo ciclo de la PCR tiene la misma secuencia que las 20
bases de la secuencia conocida en el extremo 5' del cebador
arbitrario usado en el primer ciclo de la PCR A continuación se
clonaron y se secuenciaron los productos de la PCR de esta segunda
PCR.
A continuación se analizaron las secuencias
obtenidas para identificar los marcos de lectura abiertos (ORF),
que puede perturbar el transposón y se usaron también para las
secuencias similares actualmente disponibles en la base de datos
EMBL, y en la secuencia del genoma de la cepa PM70 de Pasteurella
multocida, determinada por la Universidad de Minnesota (May BJ y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, 98(6):
3460-5).
Para información, en las siguientes secuencias
de nucleótidos, N se corresponde con cualquier ácido nucleico (A o
C o G o T).
Se proporciona la secuencia de ADN que flanquea
el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE ID Nº: 1
(775 mer). El transposón se inserta inmediatamente en el extremo 5'
de esta secuencia.
Se localiza un codón de inicio en las posiciones
179-181.
Se identificaron cuatro proteínas y genes de las
Pasteurellaceae mediante blasts llevados a cabo con una secuencia
de 60 aminoácidos codificada por la SEC DE ID Nº: 1.
La localización del transposón en el mutante 1G4
corresponde a la posición 8507-8508 de la secuencia
del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de
Acceso del Genbank AE006115. El transposón perturba un homólogo del
gen PM0773 de PM70, PhyA. Se predijo que el gen PhyA estaba
implicado en la síntesis de la cápsula. La secuencia de PM0773 se
identifica en el presente documento como la SEC DE ID Nº: 2 y su
secuencia de aminoácidos como la SEC DE ID Nº: 3.
En el mutante 1G8, el transposón se inserta
inmediatamente en el extremo 3' de la secuencia de la SEC DE ID Nº:
4 (226 mer). Esta secuencia tiene dos marcos de lectura abiertos (+2
y -2) que codifican potenciales proteínas más largas. El ORF
descrito en el presente documento está en el marco 2.
El transposón insertado en el mutante 9D1 está
inmediatamente en el extremo 3' de la secuencia de la SEC DE ID Nº:
5 (87 mer). Los transposones en los mutantes 1G8 y 9D1 perturban un
homólogo del gen PM70, PM0871. Las localizaciones de los
transposones en estos mutantes corresponden a las posiciones
9849-9850 (mutante 1G8) u 8899-8900
(mutante 9D1) de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella
multocida con número de acceso del Genbank AE006125.La
secuencia de nucleótidos de PM0871 se identifica en el presente
documento como la SEC DE ID Nº: 6 y su secuencia de aminoácidos
como la SEC DE ID Nº: 7.
Se identificó otro gen/proteína de las
Pasteurellaceae mediante blasts llevados a cabo con la SEC DE ID Nº:
7. Este es HI1586 de Haemophilus influenzae (números de
acceso del Genbank U32832 y AAC23234). Los inventores han
encontrado una identidad del 72% sobre 507 aminoácidos entre PM0871
y HI1586.
Se proporciona la secuencia de ADN que flanquea
el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE ID Nº: 8
(78 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo 5' de esta
secuencia. Esta secuencia tiene tres marcos de lectura abiertos
(+1, +2 y -1) que codifican potenciales proteínas más largas. El ORF
descrito en el presente documento es el marco +2.
El transposón en el mutante 2F2 perturba un gen
homólogo del gen PM1727 de PM70. Este transposón se localiza en la
posición que corresponde a 644-645 de la secuencia
de PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso al
Genbank AE006210 (PM1727). La secuencia de nucleótidos de PM1727 se
identifica en el presente documento como la SEC DE ID Nº: 9 y su
secuencia de aminoácidos como la SEC DE ID Nº: 19. Se identificó
otro gen/proteína de las Pasteurellaceae mediante blasts llevados a
cabo con la SEC DE ID Nº: 10. Este es HI0621 de Haemophilus
influenzae (números de acceso del Genbank U32744 y AAC22281).
Los inventores han encontrado una identidad del 77% sobre 183
aminoácidos entre PM1727 y HI0621.
PM1727 es un miembro de la superfamilia de las
hidrolasas, en particular, está relacionado con las histidinol
fosfato fosfatasas.
Se proporciona la secuencia de ADN que flanquea
el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE ID Nº: 11
(467 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo 5' de
esta secuencia.
Se localiza un codón de detención en las
posiciones 428-430.
El transposón en el mutante 3A2 está localizado
en una posición que corresponde a 5103-5104 de la
secuencia de PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso
al Genbank AE006094 (PM0586). La secuencia de nucleótidos de PM0596
se identifica en el presente documento como la SEC DE ID Nº: 12 y su
secuencia de aminoácidos como la SEC DE ID Nº: 13. Se identificaron
otros dos genes y proteínas de las Pasteurellaceae mediante blasts
llevados a cabo con la SEC DE ID Nº: 13. Estos genes y proteínas
son PlpD de Pasteurella haemolytica A1 (números de acceso al
Genbank AF058703 y AAC32565) y Haemophilus somnus de 31 kDa
(números de acceso al Genbank L07795 y AAA24941). Los inventores
han encontrado una identidad del 73% sobre 276 aminoácidos entre
PM0586 y PlpD de P. Haemolytica y del 71% sobre 273
aminoácidos entre PM0586 y H. somnus de 31 kDa.
PlpD y PM0586 son miembros de la familia de la
proteína ompA.
Se proporcionan las secuencias de ADN que
flanquean ambos lados del emplazamiento de inserción del transposón
en la SEC DE ID Nº: 14 (204 mer, transposón en el extremo 5') y la
SEC DE ID Nº: 15 (35 mer, transposón en el extremo 5').
Se localiza un codón de detención en las
posiciones 7-9 de la SEC DE ID Nº: 14 y en las
posiciones 33-35 de la SEC DE ID Nº: 15.
Se identificó otro gen/proteína de las
Pasteurellaceae mediante blasts llevados a cabo con la SEC DE ID Nº:
14 y su secuencia codificada de aminoácidos (65 aminoácidos). Los
inventores han encontrado una identidad del 100% sobre 65
aminoácidos con la proteína PM0064. La localización del transposón
en el mutante 3D3 corresponde a las posiciones
4778-4779 ó 4787-4788 de la
secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número
de acceso del Genbank AE006042, posiciones deducidas de la SEC DE
ID Nº: 13 y 15, respectivamente. Esta diferencia se debe
probablemente a la inserción del transposón que da como resultado la
duplicación de unos pocos nucleótidos en el emplazamiento de
inserción del transposón. La posición 4788 se localiza en el gen
PM0064. La posición 4778 está 6 pb en la dirección 3' del codón de
detención de PM0064. La secuencia de nucleótidos de PM0064 se
identifica en el presente documento como la SEC DE ID Nº: 16 y su
secuencia de aminoácidos como la SEC DE ID Nº: 17.
Se identificaron otros genes y proteínas de
bacterias Gram negativas mediante blasts llevados a cabo con la SEC
DE ID Nº: 17.
Se proporciona la secuencia de ADN que flanquea
el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE ID Nº: 18
(75 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de esta
secuencia.
La localización del transposón en el mutante 3D8
corresponde a entre las posiciones 7769-7770 de la
secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de
acceso al Genbank AE006080. El transposón perturba un homólogo del
gen PM0445 de PM70. La secuencia de nucleótidos de PM0445 se
identifica en el presente documento como la SEC DE ID Nº: 19 y su
secuencia de aminoácidos como la SEC DE ID Nº: 20.
Se proporciona la secuencia de ADN que flanquea
el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC de ID Nº: 21
(229 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de
esta secuencia.
La localización del transposón en el mutante 3E1
corresponde a entre las posiciones 9195-9196 de la
secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida,
número de acceso al Genbank AE006133. El transposón perturba un
homólogo del gen PM0940 de PM70. La secuencia de PM0940 se
identifica en el presente documento como la SEC DE ID Nº: 22 y su
secuencia de aminoácidos como la SEC DE ID Nº: 23.
Se identificaron otros genes y proteína de
bacterias gram negativas mediante blasts llevados a cabo con la SEC
DE ID Nº: 17.
Se proporciona la secuencia de ADN que flanquea
el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE ID Nº: 24
(58 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de esta
secuencia. Esta secuencia tiene dos marcos de lectura abiertos (+1
y -3) que codifican potenciales proteínas más largas. El ORF
descrito en el presente documento está en el marco +1. Se
identificó otro gen de las Pasteurellaceae mediante blasts
llevados a cabo con la SEC DE ID Nº: 24 y con su secuencia
codificada de aminoácidos (19 aminoácidos). Los inventores han
encontrado una identidad del 100% sobre los 19 aminoácidos con la
proteína PM1951. La localización del transposón en el mutante 3H2
corresponde a entre las posiciones 9418-9419 de la
secuencia de PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso
al Genbank AE006231 (PM1951, uvrA). La secuencia de nucleótidos de
PM1951 se identifica en el presente documento como la SEC DE ID Nº:
25 y su secuencia de aminoácidos como la SEC DE ID Nº: 26. Se
identificaron otros genes y proteínas de bacterias Gram negativas
mediante blasts llevados a cabo con la SEC DE ID Nº: 26.
UvrA es un ADN de reparación de la nucleasa de
excisión ABC.
Se proporciona la secuencia de ADN que flanquea
el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE ID Nº: 27
(54 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo 5' de esta
secuencia. Esta secuencia tiene dos marcos de lectura abiertos (+1
y -2) que codifican potenciales proteínas más largas. El ORF
descrito en el presente documento está en el marco +1. La
localización del transposón en el mutante 4D6 corresponde a entre
las posiciones 6492-6493 de la secuencia de PM70 de
Pasteurella multocida, número de acceso al Genbank AE006036.
El transposón perturba un homólogo del gen PM0032 o hktE de PM70. La
secuencia de nucleótidos de PM0032 se identifica en el presente
documento como la SEC DE ID Nº: 28 y su secuencia de aminoácidos
como la SEC DE ID Nº: 29. Esta es la catalasa de Actinobacillus
actinomycetemcomitans (números de acceso al Genbank AF162654 y
AAF17882). Los inventores han encontrado una identidad del 85% sobre
482 aminoácidos entre PM0032 y la catalasa de Actinobacillus
actinomycetemcomitans.
HktE es una catalasa.
Se proporciona la secuencia de ADN que flanquea
el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE ID Nº: 30
(172 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de
esta secuencia.
Se identificaron otros cuatro genes y proteínas
de las Pasteurellaceae mediante blasts llevados a cabo con
la secuencia de 57 aminoácidos codificada por la SEC DE ID Nº:
30.
La localización del transposón en el mutante 4F4
corresponde a entre las posiciones 5272-5273 de la
secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida,
número de acceso al Genbank AE00616. El transposón perturba un
homólogo del gen PM0776 de PM70. La secuencia de nucleótidos de
PM0776 se identifica en el presente documento como la SEC DE ID Nº:
31 y su secuencia de aminoácidos como la SEC DE ID Nº: 32. Estas
proteínas son UDP glucosa deshidrogenasas.
Se proporciona la secuencia de ADN que flanquea
el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE ID Nº: 33
(226 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo 5' de
esta secuencia.
La localización del transposón en el mutante
4F12 corresponde a entre las posiciones 9263-9264 de
la secuencia de PM70 de Pasteurella multocida, número de
acceso al Genbank AE006038. El transposón perturba un homólogo del
gen PM0048 o fadR de PM70. La secuencia de nucleótidos de PM0048 se
identifica en el presente documento como la SEC DE ID Nº: 34 y su
secuencia de aminoácidos como la SEC DE ID Nº: 35. FadR es un
homólogo de una proteína de E. coli que es un regulador de
la transcripción del metabolismo de los ácidos grasos, que afecta
de manera diversa a los genes de la biosíntesis de los ácidos grasos
(fab) y de la degradación de los ácidos grasos
(fad).
(fad).
Se proporciona la secuencia de ADN que flanquea
el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE ID Nº: 36
(214 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de
esta secuencia.
Se identificó otro gen de las
Pasteurellaceae mediante blasts llevados a cabo con la SEC DE
ID Nº: 36 y su secuencia codificada de aminoácidos (70
aminoácidos). Los inventores han encontrado una identidad del 100%
sobre los 70 aminoácidos con la proteína PM1024. La localización del
transposón en el mutante 4G11 corresponde a entre las posiciones
3532-3533 de la secuencia del genoma de PM70 de
Pasteurella multocida, número de acceso al Genbank AE006143.
El transposón perturba un homólogo del gen PM1024 o HtpG de PM70. La
secuencia de nucleótidos de PM1024 se identifica en el presente
documento como la SEC DE ID Nº: 37 y su secuencia de aminoácidos
como la SEC DE ID Nº: 38.
Se identificaron otros genes y proteínas de
bacterias Gram negativas mediante blasts llevados a cabo con la SEC
DE ID Nº: 38.
HtpG es una proteína de choque térmico.
Se proporciona el ADN de la secuencia que
flanquea el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE
ID Nº: 39 (252 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo
3' de esta secuencia.
La localización del transposón en el mutante 5D5
corresponde a entre las posiciones 5695-5696 de la
secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida,
número de acceso al Genbank AE006188. El transposón perturba un
homólogo del gen PM1517 o PlpE de PM70. La secuencia de nucleótidos
de PM1517 se identifica en el presente documento como la SEC DE ID
Bº: 40 y su secuencia de aminoácidos como la SEC DE ID Nº: 41.
Se predijo que PlpE era una lipoproteína de
membrana.
Se proporciona la secuencia de ADN que flanquea
el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE ID Nº: 42
(546 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo 5' de
esta secuencia.
Se localiza un codón de detención en las
posiciones 148-150.
La localización del transposón en el mutante
5F11 corresponde a las posiciones 572-573 del genoma
de PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso al
Genbank AE006150. El transposón perturba un homólogo del gen PM1087
o NifR3 de PM70. La secuencia de nucleótidos de PM1087 se identifica
en el presente documento como la SEC DE ID Nº: 43 y su secuencia de
aminoácidos como la SEC DE ID Nº: 44. Se identificó otro
gen/proteína de las Pasteurellaceae mediante blasts llevados a cabo
con la SEC DE ID Nº: 44. Esta es HI0979 de Haemophilus
influenzae (números de acceso al Genbank U32778 y AAC22639). Los
inventores han encontrado una identidad del 78% sobre 332
aminoácidos entre PM1087 y HI0979.
NifR3 es un gen regulador de la nitrogenasa.
Se proporciona la secuencia de ADN que flanquea
el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE ID Nº: 45
(43 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de esta
secuencia. Esta secuencia tiene tres marcos de lectura abiertos
(+2, +3 y -1) que codifican potenciales proteínas más largas. El ORF
descrito en el presente documento está en el marco +2.
Se identificaron otros cuatro genes y proteínas
de las Pasteurellaceae mediante blasts llevados a cabo con
la secuencia de 14 aminoácidos codificada por la SEC DE ID Nº:
45.
La localización del transposón en el mutante 5G9
corresponde a entre las posiciones 573-574 de la
secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida,
número de acceso al Genbank AE006116. El transposón perturba un
homólogo del gen PM0774 o HyaE de PM70. La secuencia de nucleótidos
de PM0774 se identifica en el presente documento como la SEC DE ID
Nº: 46 y su secuencia de aminoácidos como la SEC DE ID Nº: 47. Estos
genes están implicados en la síntesis de la cápsula.
Se proporciona la secuencia de ADN que flanquea
el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE ID Nº: 48
(279 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de
esta secuencia.
Se localiza un codón de inicio en la posiciones
169-171
La localización del transposón en el mutante 6E5
corresponde a entre las posiciones 6673-6674 del
genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso al
Genbank AE006182. El transposón perturba un homólogo del gen PM1459
o pgtB de PM70. La secuencia de nucleótidos de PM1459 se identifica
en el presente documento como la SEC DE ID Nº: 49 u su secuencia de
aminoácidos como la SEC DE ID Nº: 50. PgtB es una proteína
reguladora de transporte de fosfoglicerato.
Se proporciona la secuencia de ADN que flanquea
el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE ID Nº: 51
(93 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de esta
secuencia.
Se localiza un codón de detención en las
posiciones 12-14.
La localización del transposón en el mutante 6E6
corresponde a entre las posiciones 9051-9052 de la
secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida,
número de acceso al Genbank AE006096. El transposón perturba un
homólogo del gen PM0605 de PM70. La secuencia de nucleótidos de
PM0605 se identifica en el presente documento como la SEC DE ID Nº:
52 y su secuencia de aminoácidos como la SEC DE ID Nº: 53.
Se proporciona la secuencia de ADN que flanquea
el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE ID Nº: 54
(772 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo 5' de
esta secuencia.
Se localiza un codón de inicio en las posiciones
2-4. La localización del transposón en el mutante
6F12 corresponde a entre las posiciones 5362-5363
de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida,
número de acceso al Genbank AE006192, El transposón perturba un
homólogo del gen PM1556 o del gen comF de PM70. La secuencia de
nucleótidos de PM1556 se identifica en el presente documento como la
SEC DE ID Nº: 55 y su secuencia de aminoácidos como la SEC DE ID
Nº: 56.
ComF es la proteína de competencia F
Se proporciona la secuencia de ADN que flanquea
el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE ID Nº: 57
(700 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo 5' de
esta secuencia.
La localización del transposón en el mutante 6G4
corresponde a entre las posiciones 3758-3759 de la
secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida,
número de acceso al Genbank AE006206. La inserción está entre los
genes PM1696 y PM1697. El transposón se inserta entre la región del
promotor y el codón de inicio de PM1696.
El codón de inicio de PM1696 se localiza en las
posiciones 26-28 en la secuencia de la SEC DE ID Nº:
57.
La secuencia de nucleótidos de PM1696 se
identifica en el presente documento como la SEC DE ID Nº: 58 y su
secuencia de aminoácidos como la SEC DE ID Nº: 59.
Se identificaron otros genes y proteínas de
bacterias Gram negativas mediante blasts llevados a cabo con la SEC
DE ID Nº: 59.
Se proporciona la secuencia de ADN que flanquea
el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE ID Nº: 60
(188 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de
esta secuencia.
La localización del transposón en el mutante 6H1
corresponde a entre las posiciones 4139-4140 de la
secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida,
número de acceso al Genbank AE006119. El transposón perturba un
homólogo del gen PM0806 o del gen speF de PM70. La secuencia de
nucleótidos de PM0806 se identifica en el presente documento como
la SEC DE ID Nº: 61 y su secuencia de aminoácidos como la SEC DE ID
Nº: 62.
Se identificaron otros dos genes de las
Pasteurellaceae y las Vibrionaceae mediante blasts llevados a cabo
con la SEC DE ID Nº: 62. Estos genes son speF de Haemophilus
influenzae (números de acceso al Genbank U32740 y AAC22248) y
la ornitina decarboxilasa de Vibrio cholerae (AE004431 y
AAF96957) Los inventores han encontrado una identidad del 88% sobre
719 aminoácidos entre PM0806 y speF de Haemophilus
influenzae.
SpeF es una ornitina decarboxilasa.
Se proporciona la secuencia de ADN que flanquea
el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE ID Nº: 63
(101 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de
esta secuencia. Esta secuencia tiene dos marcos de lectura abiertos
(+1 y -1) que codifican potenciales proteínas más largas. El ORF
descrito en el presente documento está en el marco +1. La
localización del transposón en el mutante 6H6 corresponde a entre
las posiciones 983-984 de la secuencia del genoma de
PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso al Genbank
AE006155. El transposón perturba un homólogo del gen PM1138 de PM70.
La secuencia de nucleótidos de PM11387 se identifica en el presente
documento como la SEC DE ID Nº: 64 y su secuencia de aminoácidos
como la SEC DE ID Nº: 65.
\newpage
Se proporciona la secuencia de ADN que flanquea
el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE ID Nº: 66
(222 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo 5' de
esta secuencia.
La localización del transposón en el mutante 7A7
corresponde a entre las posiciones 7853-7854 de la
secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida,
número de acceso al Genbank AE006170 (en la región intergénica
entre PM1321 y PM1322). Se inserta el transposón entre la región del
finalizador y el codón de detención de PM1322.
Este codón de detención se localiza en la
posiciones 25-27 en la secuencia de la SEC DE ID Nº:
66. La secuencia de nucleótidos de PM1322 se identifica en el
presente documento como la SEC DE ID Nº: 67 y su secuencia de
aminoácidos como la SEC DE ID Nº: 68.
Se proporciona la secuencia que flanquea el
emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE ID Nº: 69
(55 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de esta
secuencia. Esta secuencia tiene tres marcos de lectura abiertos
(+1, +3 y -3) que codifican potenciales proteínas más largas. El ORF
descrito en el presente documento está en el marco +3.
La localización del transposón en el mutante 7F8
corresponde a entre las posiciones 8292-8293 de la
secuencia del genoma de Pasteurella multocida, número de
acceso al Genbank AE006224. El transposón perturba un homólogo del
gen PM1866 de PM70. Esta secuencia de nucleótidos de PM1866 se
identifica en el presente documento como la SEC DE ID Nº: 70 y su
secuencia de aminoácidos como la SEC DE ID Nº: 71.
Se proporcionan las secuencias de ADN que
flanquean ambo lados del emplazamiento de inserción del transposón
en la SEC DE ID Nº: 72 (598 mer, transposón en el extremo 5') y la
SEC DE ID Nº: 73 (561 mer, transposón en el extremo 5').
Se localiza un codón de detención en las
posiciones 26-28 de la SEC DE ID Nº: 72. Las
secuencias de la SEC DE ID Nº: 72 y 73 se combinaron conjuntamente
y se limitan al ORF. La secuencia resultante se designó SEC DE ID
Nº: 74 (575 mer).
La localización del transposón en el mutante 9C8
corresponde a entre las posiciones 2224-2225 ó
2210-2211 de la secuencia del genoma de PM70 de
Pasteurella multocida, número de acceso al Genbank AE006132,
deducidas las posiciones de la SEC DE ID Nº: 72 y 73,
respectivamente. Ambas posiciones están en el interior del gen
PM0926 (fimA): La secuencia de nucleótidos de PM0926 se identifica
en el presente documento como la SEC DE ID Nº: 75 y su secuencia de
aminoácidos como la SEC DE ID Nº: 76.
Se identificó otro gen/proteína de las
Pasteurellaceae mediante blasts llevados a cabo con la SEC DE ID Nº:
76. Éste es FimA de Haemophilus influenzae (números de
acceso al Genbank AF053125 y AAC08991). Los inventores han
encontrado una identidad del 77% sobre 171 aminoácidos entre PM0926
y FimA de H. influenzae.
FimA es una adhesina, una proteína fímbrica
Se proporciona la secuencia de ADN que flanquea
el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE ID Nº: 77
(70 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo 5' de esta
secuencia. Se localiza un codón de inicio en las posiciones
62-64.
La localización del transposón en el mutante
10G11 corresponde a entre las posiciones 2938-2939
de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida,
número de acceso al Genbank AE006056. El transposón perturba un
homólogo del gen PM0220 de PM70 (rpL31_1). La secuencia de
nucleótidos de PM0220 se identifica en el presente documento como
la SEC DE ID Nº: 78 y su secuencia de aminoácidos como la SEC DE ID
Nº: 79.
RpL31_1 es una proteína ribosómica de 50S.
Se proporciona la secuencia de ADN que flanquea
el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE ID Nº: 80
(506 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo 5' de
esta secuencia.
Se localiza un codón de inicio en las posiciones
195-197 de la SEC DE ID Nº: 80.
La localización del transposón en el mutante
11E8 corresponde a entre las posiciones 282-283 de
la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida,
número de acceso al Genbank AE006085. El transposón perturba un
homólogo del gen PM0488 de PM70. La secuencia de nucleótidos de
PM0488 se identifica en el presente documento como la SEC DE ID Nº:
81 y su secuencia de aminoácidos como la SEC DE IID Nº: 82.
Se proporciona la secuencia de ADN que flanquea
el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE ID Nº: 83
(243 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de
esta secuencia.
Se identificó otro gen de las
Pasteurellaceae mediante blasts llevados a cabo con la SEC DE
ID Nº: 38 y su secuencia codificada de aminoácidos (81
aminoácidos). Los inventores han encontrado una identidad del 100%
sobre los 81 aminoácidos con la proteína PM0063. La localización del
transposón en el mutante 12A1 corresponde a entre las posiciones
2880-2881 de la secuencia del genoma de PM70 de
Pasteurella multocida, número de acceso al Genbank AE006042.
El transposón perturba un homólogo del gen PM0063 o del gen lepA de
PM70. La secuencia de nucleótidos de PM0063 se identifica en el
presente documento como la SEC DE ID Nº: 84 y su secuencia de
aminoácidos como la SEC DE ID Nº: 85. Se identificaron otros genes y
proteínas de bacterias Gram negativas mediante blasts llevados a
cabo con la SEC DE ID Nº: 85.
Se proporciona la secuencia de ADN que flanquea
el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE ID Nº: 86
(147 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de
esta secuencia.
La localización del transposón en el mutante
12B3 corresponde a entre las posiciones 4028-4029 de
la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida,
numero de acceso al Genbank AE006152. El transposón perturba un
homólogo del gen PM1112 o del gen deaD de PM70. La secuencia de
nucleótidos de PM1112 se identifica en el presente documento como
la SEC DE ID Nº: 87 y su secuencia de aminoácidos como la SEC DE ID
Nº: 88.
Se identificó otros gen/proteína de las
Pasteurellaceae mediante blasts llevados a cabo con la SEC DE ID Nº:
88. Éste es HI0231 de Haemophilus influenzae (números de
acceso al Genbank U32709 y AAC21900) Los inventores han encontrado
una identidad del 80% sobre 605 aminoácidos entre PM1112 y
HI0231.
DeaD es una ARN helicasa.
Se proporciona la secuencia de ADN que flanquea
el emplazamiento de inserción del transposón en la SEC DE ID Nº: 89
(187 mer). El transposón está inmediatamente en el extremo 3' de
esta secuencia. Esta secuencia tiene dos marcos de lectura abiertos
(+1 y -3) que codifican potenciales proteínas más largas. El ORF
según la invención está en el marco -3.
La localización del transposón en el mutante
13E1 corresponde a entre las posiciones 2173-2174 de
la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida,
número de acceso al Genbank AE006138 (PM0989). La secuencia de
nucleótidos de PM0989 se identifica en el presente documento como la
SEC DE ID Nº: 90 y su secuencia de aminoácidos como la SEC DE ID
Nº: 91.
Se identificó otro gen/proteína de las
Pasteurellaceae mediante blasts llevados a cabo con la SEC DE ID Nº:
91. Éste fue HI0325 de Haemophilus influenzae (números de
acceso al Genbank U32717 y AAC21988). Los inventores han encontrado
una identidad del 79% sobre 414 aminoácidos entre PM0989 y
HI0325.
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar, se amplificaron el gen diana
más las secuencias de ADN que lo flanqueaban mediante la PCR usando
polimerasa de elevada fidelidad y se clonaron en un vector de
clonación adecuado. Se diseñaron los cebadores de la PCR que
borraban el gen cuando se usaban en la PCR inversa para generar una
construcción inicial Los cebadores de la PCR pueden contener un
emplazamiento XbaI para introducir un nuevo emplazamiento de
restricción y de esta manera proporcionar un marcador para la
delección del gen. A continuación se transfirió la construcción de
la delección en un vector suicida pCVD442 o equivalente (Donnenberg
y col., Infection and Immunity, 1991, 59:
4310-4317) para transferirla al cromosoma de
Pasteurella. Se introdujo esta construcción en la cepa
deseada mediante electroporación o conjugación y se seleccionaron
los recombinantes que contenían el plásmido integrado en el
cromosoma en el emplazamiento homólogo (merodiploides) usando el
marcador de resistencia a los antibióticos presente en el plásmido.
El plásmido pCVD442 requiere la proteína Pir para la replicación.
Esta proteína está codificada por el gen pir, que está presente como
un fago lambda lisógeno en la cepa donante SM10lamda pir, pero no
en la P. multocida receptora. De esta manera, el plásmido
pCVD442 no se replica en la cepa P. multocida receptora: se
obtienen por tanto colonias resistentes a los antibióticos
únicamente si se integra el plásmido en el cromosoma. Este vector
suicida contiene también el gen sacB que codifica el enzima
levan sacarasa, que es tóxico para las bacterias Gram negativas en
presencia de sacarosa. Se puede emplear por tanto la selección de
la sacarosa como una contraselección para aislar las colonias en las
que se ha producido un segundo episodio de recombinación, dando
como resultado una pérdida del plásmido procedente del cromosoma.
Este segundo episodio de recombinación puede dar como resultado dos
consecuencias, la regeneración del alelo de tipo natural o la
generación de colonias mutantes de delección que contienen la
mutación de la delección y se identifican mediante la PCR de la
colonia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron los mutantes de delección
atenuados obtenidos en el ejemplo 5 en medio de cultivo CDM (Hu y
col., Infection and Immunity 1986, 804-810) en
condiciones de agitación durante 24 a 48 horas.
Se cosecharon los cultivos cuando se detuvo el
crecimiento, que se continuó con la medida de la densidad óptica
(DO) o el pH.
Se determinó la concentración bacteriana
mediante densidad óptica y cuando se necesitó, se ajustó la
concentración hasta una concentración final de 10^{9} UFC por ml
con medio de cultivo reciente.
Se probó la eficacia de la vacuna en pavos de 3
semanas de edad mediante vacunación y estímulo.
Se comprobaron los pavos antes de la vacunación
para la ausencia de anticuerpos de Pasteurella mediante ELISA de
muestras de sangre.
Se vacunó un primer grupo de pavos mediante
inyección de 10^{8} UFC en 0,1 ml mediante la ruta ocular.
Un segundo grupo permaneció sin vacunar (grupo
control).
Se estimularon todos los animales en el D21 o
D23 con la cepa P-1059 de P. multocida
mediante la ruta ocular (10^{6} UFC en 0,1 ml por animal).
Se observó la mortalidad cada día hasta el
D35.
Se observó una mortalidad más baja en los
animales vacunados en comparación con los controles.
\vskip1.000000\baselineskip
Se define la presente invención en las
reivindicaciones y en las descripción que las compaña
Por conveniencia, se presentan en el presente
documento otros aspectos de la presente descripción por medio de
párrafos numerados (párrafos).
- 1-
- un mutante de una bacteria Gram negativa, en el que dicha bacteria tiene una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica originalmente un polipéptido que tiene una identidad que es igual o mayor de un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de nucleótidos identificadas como la SEC DE ID Nº: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 dando como resultado dicha mutación una virulencia atenuada de la bacteria.
- 2-
- El mutante de párrafo 1, en el que la bacteria es una Pasteurellaceae.
- 3-
- El mutante de párrafo 2, en el que se escoge la bacteria entre el grupo de: Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Pasteurella anatipestifer y Actinobacillus pleuropneumoniae.
- 4-
- El mutante del párrafo 3, en el que la bacteria es Pasteurella multocida.
- 5-
- El mutante de uno cualquiera de los párrafos 1 a 4, en el que la mutación es una delección en la secuencia de nucleótidos, o una inserción en ésta o la sustitución de ácidos nucleico.
- 6-
- El mutante de párrafo 5, en el que la mutación es la delección de la secuencia completa de nucleótidos.
- 7-
- El mutante de párrafo 5, en el que la inserción se lleva a cabo entre; los nucleótidos 180-181 en la SEC DE ID Nº: 2, 77-78 o 1027-1028 en la SEC DE ID Nº: 6, 416-417 en la SEC DE ID Nº: 9, 389-390 en la SEC DE ID Nº:12, 381-382 en la SEC DE ID Nº: 16, 219-220 en la SEC DE ID Nº: 19, 1353-1354 en la SEC DE ID Nº: 22, 136-137 en la SEC DE ID Nº: 25, 384-385 en la SEC DE ID Nº: 28, 222-223 en la SEC DE ID Nº: 31, 217-218 en la SEC DE ID Nº: 34, 1411-1412 en la SEC DE ID Nº: 37, 943-944 en la SEC DE ID Nº: 40, 855-856 en la SEC DE ID Nº: 43, 369-370 en la SEC DE ID Nº: 46, 111-112 en la SEC DE ID Nº: 49, 443-444 en la SEC DE ID Nº: 52, 4-5 en la SEC DE ID Nº: 55, inmediatamente antes del nucleótido 1 en la SEC DE ID Nº: 58, 573-574 en la SEC DE ID Nº: 61, 875-876 en la SEC DE ID Nº: 64, inmediatamente antes del nucleótido 1 en la SEC DE ID Nº: 67, 218-219 en la SEC DE ID Nº: 70, 1072-1087 en la SEC DE ID Nº: 75, 64-65 en la SEC DE ID Nº: 78, 282-283 en la SEC DE ID Nº: 81, 1431-1432 en la SEC DE ID Nº: 84, 974-975 en la SEC DE ID Nº: 87, 802-803 en la SEC DE ID Nº: 90.
- 8-
- El mutante de uno cualquiera de los párrafos 1 a 7, que comprende una secuencia heteróloga de ácido nucleico que codifica un inmunógeno de un agente vírico, parasítico o bacteriano patógeno, de una proteína terapéutica, de un alérgeno, de un factor de crecimiento o de una citocina.
- 9-
- Una composición inmunógena que comprende un mutante atenuado según uno cualquiera de los párrafos 1 a 8, y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
- 10-
- La composición inmunógena del párrafo 9que comprende adicionalmente un adyuvante.
- 11-
- Una vacuna que comprende un mutante atenuado según uno cualquiera de los párrafos 1 a 8, y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
- 12-
- La vacuna del párrafo 11 que comprende adicionalmente un adyuvante.
- 13-
- Una composición inmunógena que comprende un polipéptido que tiene una identidad que es igual o mayor de por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de nucleótidos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia de aminoácidos codificada identificadas con la SEC DE ID Nº: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90 y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente un adyuvante.
- 14-
- Una preparación de anticuerpos que comprende un anticuerpo específico de un polipéptido que tiene una identidad que es igual o mayor de un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de nucleótidos identificadas como la SEC DE ID Nº: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90.
- 15-
- Procedimiento diagnóstico para detectar la infección por una bacteria Gram negativa, usando un polipéptido que tiene una identidad que es igual o mayor de un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de nucleótidos identificadas como la SEC DE ID Nº: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, o un anticuerpo específico de dicho polipéptido.
- 16-
- Uso de una preparación de anticuerpos según el párrafo 14 para la producción de una composición de inmunización pasiva o una composición terapéutica contra bacterias Gram negativas.
- 17-
- Uso de una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de nucleótidos identificadas como la SEC DE ID Nº: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90, o un fragmento de al menos 20 nucleótidos, como cebadores de la PCR para la detección de bacterias Gram negativas en unos medios.
<110> MERIAL
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Bacterias gram negativas
atenuadas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> XXXX
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<160> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 775
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<212> ADN
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<213> Pasteurella multocida
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (579)..(579)
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<223> A o C o G o T
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<220>
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<222> (580)..(580)
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<223> A o C o G o T
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<220>
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<222> (598)..(598)
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<223> A o C o G o T
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<220>
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<222> (599)..(599)
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<223> A o C o G o T
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (616)..(616)
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<223> A o C o G o T
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (617)..(617)
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<223> A o C o G o T
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<220>
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<222> (636)..(636)
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<223> A o C o G o T
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<220>
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<222> (637)..(637)
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<223> A o C o G o T
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<220>
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<222> (667)..(667)
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<223> A o C o G o T
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (668)..(668)
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<223> A o C o G o T
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (697)..(697)
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<223> A o C o G o T
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (698)..(698)
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<223> A o C o G o T
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (702)..(702)
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<223> A o C o G o T
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (703)..(703)
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<223> A o C o G o T
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (707)..(707)
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<223> A o C o G o T
<22C>
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<221> misc_feature
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<222> (706)..(706)
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<223> A o C o G o T
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (714)..(715)
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<223> A o C o G o T
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (715)..(716)
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<223> A o C o G o T
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (717)..(718)
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<223> A o C o 3 o T.
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (718)..(719)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (721)..(721)
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<223> A o C o G o T
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (722)..(722)
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<223> A o C o G o T
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (742)..(744)
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<223> A o C o G o T
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (743)..(745)
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<223> A o C o G o T
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (746)..(749)
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<223> A o C o G o T
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (747)..(750)
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<223> A o C o G o T
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (755)..(756)
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<223> A o C o G o T
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (756)..(757)
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<223> A o C o G o T
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (767)..(768)
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<223> A o C o G o T
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (766)..(767)
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<223> A o C o G o T
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 2091
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<212> ADN
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<213> Pasteurella multocida
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 696
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\newpage
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Pasteurella multocida
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<400> 11
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 819
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<212> DNA
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<213> Pasteurella multocida
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<400> 12
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 272
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Pasteurella multocida
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
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<210> 14
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<211> 204
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<212> ADN
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<400> 14
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<212> ADN
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<213> Pasteurella multocida
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggtgttttt ttaagaggta aatggatgcc aatta
\hfill35
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<210> 16
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<211> 384
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<212> ADN
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<213> Pasteurella multocida
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<211> 127
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<212> PRT
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<213> Pasteurella multocida
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 75
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pasteurella multocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
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<221> misc_feature
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<222> (574)..(575)
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<223> A o C o G o T
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<213> Pasteurella multocida
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<400> 91
Claims (15)
1. Un mutante de una bacteria Gram negativa, en
el que dicha bacteria tiene una mutación en una secuencia de
nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad que
es igual o mayor que 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%; 98% o 99% con una
secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos
de la SEC DE ID Nº: 90, dando dicha mutación como resultado una
virulencia atenuada de la bacteria.
2. El mutante de la reivindicación 1, en el que
la bacteria es una Pasteurellaceae.
3. El mutante de la reivindicación 2, en el que
la bacteria se escoge entre el grupo de: Pasteurella
multocida, Pasteurella haemolytica, Pasteurella
anatipestifer y Actinobacillus pleuropneumoniae.
4. El mutante de la reivindicación 3, en el que
la bacteria es Pasteurella multocida.
5. El mutante de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la mutación es una delección en la
secuencia de nucleótidos, o una inserción en ésta o la sustitución
de ácidos nucleicos.
6. El mutante de la reivindicación 5, en el que
la mutación es una delección de la secuencia completa de
nucleótidos.
7. El mutante de la reivindicación 5, en el que
la inserción se lleva a cabo entre los nucleótidos
802-803 en la SEC DE ID Nº: 90.
8. El mutante de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, que comprende una secuencia heteróloga de
ácido nucleico que codifica inmunógenos de un agente vírico,
parasítico o bacteriano patógeno, de una proteína terapéutica, de
un alérgeno, de un factor de crecimiento o de una citocina.
9. Una composición inmunógena que comprende un
mutante atenuado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8, y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente
aceptable.
10. La composición inmunógena de la
reivindicación 9 que comprende adicionalmente un adyuvante.
11. Una vacuna que comprende un mutante atenuado
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y un diluyente,
vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
12. La vacuna de la reivindicación 11 que
comprende adicionalmente un adyuvante.
13. Uso de un mutante de una bacteria Gram
negativa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la
producción de una composición inmunógena atenuada viva o en la
preparación de una composición de vacuna atenuada viva.
14. Una bacteria Gram negativa según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, una composición inmunógena
según la reivindicación 9 ó 10, o una vacuna según la
reivindicación 11 ó 12, para uso en la inmunización contra o en la
prevención de una infección bacteriana en un animal.
15. Uso de un mutante de una bacteria Gram
negativa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, una
composición inmunógena según la reivindicación 9 ó 10, o una vacuna
según la reivindicación 11 ó 12, en la preparación de un
medicamento para la inmunización contra o en la prevención de una
infección bacteriana en un animal.
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