CN102304493B

CN102304493B - 一株针对鸭疫里默氏杆菌的单抗

Info

Publication number: CN102304493B
Application number: CN201110271032A
Authority: CN
Inventors: 彭大新; 高以明; 陈素娟; 陈冰; 孙化露; 张敬友; 刘秀梵
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2011-09-14
Filing date: 2011-09-14
Publication date: 2012-09-12
Anticipated expiration: 2031-09-14
Also published as: CN102304493A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株针对鸭疫里默氏杆菌的单抗。所说的单抗5G7，其保藏编号为CGMCC No.5165 。用该单抗在制备成检测鸭疫里默氏杆菌的免疫胶体金试纸，不但可以直接检测病原，而且可同时检测血清型1、2、3、11型RA菌株，具有较为广泛的应用价值。

Description

一株针对鸭疫里默氏杆菌的单抗

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及抗体工程技术，具体为识别不同血清型鸭疫里默氏杆菌的单克隆抗体及其以此为基础建立的一种双抗体夹心ELISA方法来检测鸭疫里默氏杆菌。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）是引起鸭传染性浆膜炎的病原菌，它主要侵害以水禽为主的多种家禽而引起急性或慢性传染病。发病病鸭常表现出嗜睡、歪颈、跛行、排黄绿稀粪，眼鼻有浆液性分泌物，随后出现痉挛、角弓反张等神经症状。以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪性输卵管炎和脑膜炎为其病变特征。目前在我国已先后报道了血清1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、13、14型和4个未定名型，其中以血清1型和血清2型为主要流行型。世界各养鸭地区几乎都有该病流行，已成为危害养鸭业最严重的疾病之一，该病病死率高，又可引起鸭生产性能降低，且治疗费用较高，造成的经济损失巨大。因此如何准确、快速的诊断成为防治该病的关键。

针对RA的检测方法目前主要有：细菌分离鉴定、凝集试验、琼扩试验、间接ELISA试验、PCR检测和免疫胶体金试纸条等，其中以ELISA、免疫胶体金试纸条和PCR方法较为快速准确。间接ELISA方法具有检测成本低，灵敏性高、特异性强，适于批量样品测定等优点，目前已建立了一些ELISA检测方法，如辜新贵等应用假定保守蛋白P25包被反应板，以此检测血清中有无RA抗体。张鹤晓等用裂解的1型RA菌体作为包被抗原，建立间接ELISA方法，检测鸭血清中抗RA抗体。胡清海等脂多糖(LPS)作为包被抗原，建立了间接ELISA方法来检测血清中抗体，人工感染RA的鸭在感染72 h即可检出抗体；但由于RA的血清型十分复杂，此法只适用于对同一血清型的不同菌株的抗体进行检测，所以在应用中也具有一定的局限性。目前建立的ELISA方法主要是检测针对RA抗体，而针对RA抗原检测的ELISA方法还没有。所以有必要开展相关研究，以满足现场和生产实践中的需求。本实验建立的双抗体夹心ELISA用于RA病原直接检测，对该病的诊断可提供快速有效的工具。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了1株针对鸭疫里默氏杆菌的单抗，以及该单抗的应用，有效地解决了现有技术存在的问题。

本发明所述的鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体细胞株，命名为5G7，其保藏编号为CGMCC No.5165。该单抗具有良好的特异性，与鸭源巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌无交叉反应，与已知血清型1、2、3、11型RA菌株反应。Western–blot结果显示单抗5G7可结合45KD左右蛋白条带；另以血清1型RA菌株免疫兔制备RA的多抗血清；以纯化的多抗IgG作为捕获抗体，纯化的单抗作为检测抗体，建立双抗体ELISA法来检测鸭疫里默氏杆菌。

应用本发明的单抗建立双抗体ELISA法，不但可以直接检测病原，而且可同时检测血清型1、2、3、11型RA菌株，包含了其主要流行血清型菌株，具有较为广泛的应用价值。为鸭传染性浆膜炎的诊断提供了快速、特异、敏感的检测方法。

附图说明

图1是RA全菌SDS-PAGE电泳图。M: marker

图2是单抗5G7Western-blot 分析。

图3 是纯化多抗SDS-PAGE电泳结果。

图4 纯化单抗SDS-PAGE电泳结果，M:marker; 单抗:5G7。

具体实施方式

本发明中生物材料可通过以下途径获得

1、2、3、11四个血清型的RA：参考文献1、3型：言天久.百色市鸭疫里默氏杆菌病流行病学调查与防治的研究[D]. 广西大学,2007。2型与11型：杨勇.江苏部分地区鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及致病性研究[D],扬州大学,专业硕士论文,2008；云水丽,杨勇,王小波等.11型鸭疫里默氏杆菌分离鉴定及致病性研究[J].预防兽医学报,2009,8:605-609。

巴氏杆菌(国内标准强毒菌株C48-1，购自中国兽医药品监察所)。

沙门氏菌（鸡肠炎沙门氏菌参考株C500041，购自美国ATCC）。

大肠杆菌( DH5α，购自Promega公司)。

1 、单抗的制备

1.1 抗原的制备

复苏血清1型和2型鸭疫里默氏杆菌，经传代后全板划线，扩大培养。收获并进行细菌计数，0.1%甲醛灭活后最终将细菌稀释至10⁹CFU/mL。

1.2 动物免疫

分别取血清1型和2型适量的菌液（100μL左右）与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下分点注射8周龄BALB/c小鼠200μL/只；2周后、4周后以相同方法使用弗氏不完全佐剂乳化的抗原再各免疫一次；6周后取相同剂量抗原腹腔注射，不加佐剂；3天后融合。

1.3 融合

取加强免疫后3天的小鼠，摘除眼球采血作为阳性血清；颈脱臼将小鼠致死，无菌取脾脏，分离脾细胞，经台盼蓝计数，按5:1的比例与SP2/0骨髓瘤细胞（2×10⁷）混合，在PEG4000作用下进行细胞融合；融合细胞经洗涤后，用HAT选择培养基重悬，置37℃ 5% CO₂培养箱内培养；5d后半量换液；10d后改用HT培养基；观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取100μl细胞上清进行抗体检测。

1.4 杂交瘤细胞的筛选

分别以血清1型和血清2型全菌为检测抗原，采用间接ELISA方法来筛选阳性克隆。将全菌用PBS稀释，10⁸CFU/mL，100μL/孔包被酶标板，50℃烘箱过夜烘干；每孔加入冷甲醇固定，100μL/孔，15min；用PBST洗涤3遍，每次5min，在吸水纸上拍干；加封闭液200μL/孔，4℃反应过夜，同上洗涤3遍；加入待检细胞上清100μL/孔，37℃孵育1h，同上洗涤3遍；加入工作浓度(1：8000稀释)的羊抗鼠HRP-IgG 50μLl/孔，37℃孵育1h，同上洗涤3遍；加入TMB显色液50μL/孔，37℃反应10-15min；加入2M H₂SO₄50μl/孔终止反应。测定孔内的OD₄₅₀。免疫小鼠血清作为筛选时的阳性对照，非免疫的ICR小鼠血清作为阴性对照，同时设立空白调零孔。

1.5 杂交瘤细胞的亚克隆

采用有限稀释法对ELISA检测为阳性的杂交瘤细胞进行亚克隆。将阳性孔中的杂交瘤细胞吹下，经计数后用HT培养基稀释，按1个细胞/孔、3个细胞/孔、10个细胞/孔加入到装有饲养细胞的96孔板中；37℃ 5％CO₂培养箱培养7-10天，对出现单个细胞克隆孔的上清再用间接ELISA方法进行检测；连续进行3-4次亚克隆，至每个细胞孔上清均为阳性时定株，扩大培养，冻存细胞。

1.6 腹水的制备

取10周龄的BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡，0.5mL/只；1周后腹腔注射用PBS稀释的处于对数生长期的杂交瘤细胞，1×10⁶CFU/只；待小鼠腹部明显隆起时，用16号针头从腹腔采集腹水，2500rpm离心10min，去除脂肪组织，将上清取出，-70℃保存备用。

1.7 单抗特性的鉴定

1.7.1单抗特异性鉴定

取巴氏杆菌C48-1、沙门氏菌C500041、大肠杆菌DH5α包被96孔酶标板，分别对单抗进行间接ELISA试验，步骤同1.4。

采用间接ELISA方法，各种细菌包被浓度10⁸CFU/mL，每孔100μL，单抗腹水1:1000稀释，结果显示以血清2型RA免疫小鼠融合后获得的1株单抗5G7与1、2、3、11四个血清型的RA产生交叉反应(表1) 。

表1单抗特异性鉴定结果

1型RA

2型RA

3型RA

11型RA

巴氏杆菌

沙门氏菌

大肠杆菌

5G7

1.885

1.860

1.816

2.060

0.072

0.091

0.099

2F7

2.115 ^*

1.891

1.794

0.096

0.079

0.110

0.100

2E6

1.869

1.711

1.638

0.070

0.067

0.101

0.081

3C9

1.811

1.919

1.722

0.096

0.079

0.091

0.079

^*ELISA实验OD值

1.7.2单抗腹水效价测定

采用间接ELISA的方法，将腹水先按1:50稀释，再按2倍倍比稀释，依次加入包被抗原的酶标孔内，其他步骤同前，结果单抗5G7的腹水ELISA效价为1：1.6×10⁴。

1.7.3亚类鉴定

按Sigma公司单克隆抗体亚类试剂盒说明书介绍的方法进行亚类鉴定，结果显示单抗5G7为IgG₃。

1.7.4 SDS-PAGE及Western-blot

将1、2、3、11型RA全菌按分子克隆介绍的方法进行SDS-PAGE电泳，这4种RA细菌具有相似的蛋白表达模式。以1:800稀释的单抗腹水作为一抗进行免疫印迹试验，单抗5G7可以与四种血清型的RA约45kDa左右的蛋白带呈阳性反应（图1、图2）。

1．8保藏

将单抗5G7于2011年8月23日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名为：鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体细胞株；保藏编号为CGMCC N o.5165；保藏单位地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2 、双抗体夹心ELISA方法的建立

2.1多抗血清的制备与纯化

2.1.1抗原的制备

复苏实验室保存的血清1型鸭疫里默氏杆菌，经传代后全板划线，扩大培养，收获并进行细菌计数，经0.1%甲醛灭活后最终将细菌稀释至10⁹CFU/mL。

2.1.2免疫程序及高免血清的制备

抗原经弗氏佐剂乳化后，采用皮下注射的方式对家兔进行免疫，免疫程序为：首免取1mL抗原与等量弗氏完全佐剂充分乳化，皮下分点注射；15天后、30天后以相同方法使用弗氏不完全佐剂乳化的抗原再各免疫一次；45天后颈动脉插管收集全身血液，4℃静置过夜后3000rpm 离心15min 收集血清。

2.1.3 兔高免多抗血清的纯化

按辛酸饱和硫酸铵法纯化，具体步骤为:

取10mL血清，加入40mL 0.06M的醋酸盐缓冲液(pH4.0)，用0.1N的NaOH溶液调pH至4.5；按每毫升溶液加入25μL的量将辛酸逐滴加入到溶液中，边加边摇匀，然后继续在磁力搅拌器上作用30min，10000rpm离心30min；上清用滤纸过滤去掉沉淀，加入1/10滤液体积的10×PBS(pH7.2)，用5N NaOH调pH至7.4；将上清冷却至4℃，加入硫酸铵(每毫升溶液体积加入0.277g硫酸铵，达到45%饱和度)，在磁力搅拌器上作用30min，5000rpm离心15min，弃掉上清，用1/10腹水体积的1×PBS将沉淀重悬；悬液使用50~100倍体积的PBS 4℃过夜透析，透析样品55℃加热20min，5000rpm离心20min，小量分装后-20℃保存。纯化结果显示兔抗1型RA多抗血清的浓度为1.47mg/mL。SDS-PAGE电泳，可见两条清晰的条带（图3）。

2.2 单抗纯化

2.2.1 样品前处理

单抗5G7腹水500rpm，10min 离心，保留上清。2-8℃低温离心1000rpm，10min，离心上清，除去杂质。小心除去漂在上清中的脂肪。测定上清体积，并移置冰上。逐滴等量加入饱和硫酸铵溶液，边加边摇匀。在冰上轻柔混合1h，避免产生气体和泡沫。2-8℃离心10000rpm，10min。弃去上清，用Starting buffer重悬沉淀物。用3倍体积的Starting buffer稀释，并装入透析袋透析，透析袋预留至少2倍体积的空间。透析过夜。离心透析好的液体，并弃去沉淀。

2.2.2 Protein G- Agarose纯化

利用ROCH公司的Protein G- Agarose纯化系统纯化单抗：用2-5倍体积的Starting buffer 预平衡柱子。将粗提抗体样品用Starting buffer 将PH值调至7.0。将样品缓慢透过柱子。用Washing buffer洗，直至流出的液体中测不到蛋白（用A280测定）。用Elution buffer 洗脱（冰上操作）。用A280检测洗脱下了的IgG浓度，并用PBS透析后保存。结果显示单抗5G7经纯化后浓度为1.3mg/mL。SDS-PAGE电泳，结果呈现两条清晰的条带（图4）。

2.3多抗与单抗最佳工作浓度的确定

用方阵试验确定多抗与单抗最佳工作浓度。

①包被用包被液将多抗作l:200、l:400、1:800、l:1600、l:3200、l:6400、l:12800稀释，100μL/孔，每个稀释度一行，37℃包被2h后4℃过夜；甩出孔内液体，用洗涤液洗涤3次，5min/次，在吸水纸上拍干。

②封闭用10%小牛血清作封闭剂，200μL/孔，37℃封闭2h，同上洗涤三次，拍干。

③加抗原用PBS稀释的1型RA以相同浓度加入一块酶标板中（10⁸CFU/mL），100μL/孔，同时设PBS空白对照，37℃作用1h，同上洗涤三次，拍干。

④加单抗用稀释液将单抗作l:100、l:200、l:400、l:800、l:1600、1:3200等稀释，加入酶标板中，100μL孔，每一列一个稀释度，同时设PBS空白对照，37℃作用1h，同上洗涤三次，拍干。

⑤加酶标二抗加入1:8000稀释的HRP--羊抗兔IgG，100μL/孔，37℃作用1h，同上洗涤三次，拍干。

⑥显色与终止加入TMB显色液100μL孔,室温避光作用10min，加入终止液(2M H₂SO₄)，100μL/孔,在酶标仪上读取OD₄₅₀。以阳性孔OD值接近1，P/N值最大时，单抗和多抗的浓度组合为其最佳工作浓度。结果显示多抗包被量为184ng（1：800稀释），5G7单抗用量为375ng（1：200稀释）时，P/N值最大为3.16(表2 )。

Figure 2011102710321100002DEST_PATH_IMAGE001

注：单抗5G7作为捕获抗体，多抗作为检测抗体，该表格反映了不同工作浓度组合时P/N的值。

2.4封闭液的选择

根据确定的单抗和多抗的最佳工作浓度组合，分别以4％明胶－PBST、1％BSA－PBST、5％脱脂乳-PBST、5%小牛血清-PBST和10%小牛血清-PBST作为封闭剂作ELISA检测。不同封闭液作用后，P/N的值不同（表3），小牛血清作为封闭液的结果明显优于其他几种封闭液，且10%小牛血清的封闭效果要优于5%小牛血清。

表3最佳封闭液的确定

	4％明胶	1％BSA	5％脱脂乳	5%小牛血清	10%小牛血清
						P/N	2.79	3.24	5.97	5.68	6.69

2.5 封闭时间的选择

根据确定的单抗和多抗的最佳工作浓度组合以及封闭液，采用不同的封闭时间进行ELISA检测。封闭时间不同，P/N的值也不同（表4）。封闭时间采用4℃过夜时，效果最佳，但考虑到实验整体时间，本实验选择120min封闭。

表4 最佳封闭时间的确定

	60min	120min	4℃过夜
				P/N	3.54	4.31	4.62

2.6 检测抗原、多抗、酶标抗体作用时间的选择

按照确定好的ELISA多抗、单抗组合、封闭液和封闭时间后，对检测抗原、多抗和酶标抗体的采用不同的作用时间（30min、60min，90min）进行ELISA检测。不同作用时间的P/N值见表5，结果显示采用60min的作用时间效果较好。

表5 检测抗原、多抗、酶标抗体作用时间确定

	30min	60min	90min
				P/N	4.91	6.35	5.31

因此，双抗体夹心ELISA的优化条件为：用184ng/孔纯化的多抗包被酶标板，包被过夜；PBST洗3遍；用10%小牛血清37℃封闭2h；PBST洗3遍；加入待检样品，37℃孵育1h；PBST洗3遍；每孔加入纯化的单抗375ng，37℃孵育1h；PBST洗3遍；加入工作浓度的羊抗鼠酶标二抗50μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗3遍；加入TMB显示液50μL/孔，室温显色20min；最后加入50μL/孔终止液终止，读取OD₄₅₀的值。读值高于阳性判定结果且P/N＞2.1，判定为阳性。

2.7特异性试验

用确立的ELISA方法，加样时分别加入相同细菌个数（10⁹CFU/mL）的RA 1、2、3、11血清型标准分离株、巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌每孔各100μL，同时设空白对照。结果显示沙门氏菌、大肠杆菌、巴氏杆菌的检测结果均为阴性，而1、2、3、11型RA均为阳性。特异性实验结果详见表6。

表6特异性实验结果

	1型	2型	3型	11型	巴氏杆菌	沙门氏菌	大肠杆菌
								OD值	1.714	1.547	1.365	1.290	0.235	0.243	0.209

2.8 敏感性试验

将已计数好的1型RA，其浓度为10⁹CFU/mL，进行连续10倍稀释，用所建立的ELISA方法测定，最后2孔分别设阴性对照和空白对照。以此建立检出最低检出剂量的方法。结果显示，最低检出浓度是10⁴CFU/mL，由于每孔加样100μL，因此最低检测量为10³CFU（表7），其阳性判定标准为P/N＞2.1。

表7 敏感性实验结果

	10⁸	10⁷	10⁶	10⁵	10 ⁴	10³	阴性对照
								OD值	1.527	0.833	0.528	0.319	0.293	0.200	0.127

3 、模拟病料及临床病料的检测

3.1 模拟病料敏感性检测

选取一阴性病料，将1型RA 10⁹CFU混入病料中，研磨，加入1mLPBS制成悬液，并进行连续10倍稀释。用建立的方法检测，以确定在模拟临床病料中的最低检测量。

首先建立阴阳性判定标准。用实验室保存的24份禽组织样品，每份取约0.5g，用1.5ml PBS研磨，将悬液10000rpm，3min离心。用2.6所建立ELISA方法进行实验，同时做空白对照，测得OD₄₅₀值。这些样品均为经PCR检测不含RA的阴性样品。根据文献方法计算24份阴性样品的平均OD值，则阳性样品OD值下限=阴性样品平均OD值+3SD。然后用双抗体夹心ELISA方法对模拟病料的检测。结果显示24份阴性样品的平均OD值为0.229，标准差SD为0.033，因此阳性判断标准为0.329。检测样品的OD值在0.330以上，阳性对照的OD值为1.0以上时可以判断为阳性。用所建立的DAS-ELISA进行检测。结果见表8。其最低检出浓度是10⁵CFU/mL，由于每孔加入100μL样品，因此其最低检测量在10⁴CFU。

表8 双夹心ELISA敏感性实验结果

10⁷

10⁶

10 ⁵

10⁴

10³

10²

OD值

1.406

0.799

0.331

0.304

0.213

0.219

3.2 临床病料的检测

对来自不同鸭场、鹅场的鸭疫里默氏杆菌疑似病例27例，且具有较典型的病理剖检变化如心包炎、肝周炎等。无菌取病禽的肝脏约取0.2g，加1mL PBS研磨，6000rpm离心5分钟，取上清用于双抗体夹心ELISA检测。

对27例临床疑似病禽的肝脏分离细菌和研磨，如分离出鸭疫里默氏杆菌为细菌分离阳性；双夹心ELISA读值在0.330以上判定为阳性。判定结果见表9。结果显示传统的细菌分离的阳性率为40.7%（11/27）；双夹心ELISA的阳性率为55.6%（15/27）。

Figure 2011102710321100002DEST_PATH_IMAGE003

通过对不同检测方法的对比，表明与传统细菌分离法相比，双抗夹心ELISA法的敏感性为100%；符合率分别为85.2%（表10）：

。

Claims

1.一株鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer）单克隆抗体细胞株5G7，它的保藏编号是CGMCC No.5165。