ES2320419T3 - Bacterias gram negativas atenuadas. - Google Patents
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Abstract
Mutante de una bacteria Gram negativa, en el que dicha bacteria tiene una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica originalmente para un polipéptido que tiene una identidad que es igual o superior al 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% con una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos SEC ID No. 37, dando lugar dicha mutación a una virulencia atenuada de la bacteria.
Description
Bacterias gram negativas atenuadas.
La presente invención se refiere a bacterias
Gram negativas atenuadas vivas que pueden utilizarse en
composiciones inmunogénicas o en composiciones de vacuna para la
prevención de infecciones bacterianas. Las bacterias atenuadas
pueden actuar como un vector de expresión para expresar inmunógenos
a partir de otros agentes patogénicos. Los polipéptidos codificados
por las secuencias de nucleótidos o genes que se observó que eran
dianas apropiadas para la atenuación de bacterias, pueden utilizarse
como compuestos inmunogénicos particularmente en composiciones
inmunogénicas o en composiciones de vacuna.
Está bien establecido que los microorganismos
atenuados vivos pueden ser vacunas altamente efectivas; las
respuestas inmunes obtenidas de dichas vacunas son frecuentemente de
mayor magnitud y de más larga duración que aquellas producidas por
inmunógenos no replicantes. Una explicación para esto puede ser que
las cepas atenuadas vivas establecen infecciones limitadas en el
huésped y mimetizan las etapas iniciales de la infección natural.
Además, a diferencia de las preparaciones con microorganismos
muertos, las vacunas vivas son capaces de inducir potentes
respuestas mediadas por células que pueden relacionarse con su
capacidad de replicar en células que presentan antígenos, tales
como los macrófagos.
Ha habido un largo historial del uso de vacunas
atenuadas vivas en animales y humanos, utilizando particularmente
técnicas de mutagénesis química. No obstante, las vacunas atenuadas
empíricamente pueden revertir a virulencia.
Las técnicas biológicas moleculares modernas,
asociadas con el mayor conocimiento de patogénesis bacteriana, han
llevado a la identificación de diversos genes que están implicados
en el crecimiento y en la supervivencia de los microorganismos
in vivo. Esto ha proporcionado nuevas dianas de genes para
atenuación, y al concepto de que las futuras cepas de vacuna pueden
ser atenuadas "racionalmente" mediante la introducción de
mutaciones que no revierten definidas en genes seleccionados que se
sabe que están implicados en la virulencia, ver por ejemplo
WO-A-00/61724,
WO-A-00/68261 y
EP-A-0889120.
Aunque se han producido muchas cepas atenuadas
en laboratorios, sólo unas cuantas se han calificado como
potenciales candidatos de vacunas para su uso en animales. Esto
puede deberse en parte a la necesidad de equilibrar la
inmunogenicidad de la vacuna con la posibilidad de que el
microorganismo revierta, volviéndose reactivo y patogénico.
Está claro que la selección de genes apropiados
para la atenuación, que dará como resultado un candidato de vacuna
apto, no es directa y no puede identificarse fácilmente. Muchos
factores pueden influenciar en la aceptabilidad de un mutante
atenuado como vacuna, y consecuentemente se requiere un esfuerzo de
investigación para identificar y seleccionar genes atenuantes
adecuados. Se llevaron a cabo muchos experimentos de atenuación
sólo in vitro y sus resultados no pueden extrapolarse in
vivo, en particular en relación con la patogenicidad residual
de los mutantes resultantes para los animales vacunados.
WO 00/61724 describe genes de virulencia
bacteriana gram negativos y mutantes bacterianos gram negativos
útiles en vacunas.
May et al (1996; PNAS
98:3460-3465) describe la secuencia completa de un
clon aviar común de Pasteurella multocide Pm70.
Winston et al (1996; Gene
179:199-204) describe clones de ADN genómico de
Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa) que codifica un
miembro de la familia de las proteínas de choque térmico de 90 kDa.
Winston et al (1996) observaron que el gen parece codificar
un homólogo de HtpG. Winston et al (1996) describen un
mutante de inserción de htpG an Aa que comprende un
fragmento adicional de 1,6 kb. Bardwell y Craig (1998; J
Bacteriology 170: 2977-2983) describen un gen de
Escherichia coli aislado que es homólogo a Hsp83 eucariótico
y un mutante de eliminación que comprende todos los codones excepto
18 de la región codificante de C62.5.
Por tanto, es deseable para caracterizar genes
implicados en la atenuación y, en base a esto, para desarrollar
bacterias atenuadas, así como vacunas atenuadas, en particular las
que tienen un alto grado de inmunogenicidad y que muestran un buen
perfil de seguridad con efectos secundarios limitados o
ausentes.
En la presente invención se describe la
identificación de secuencias de nucleótidos y genes implicados en
la atenuación de un microorganismo. Las mutaciones introducidas en
estas secuencias de nucleótidos y genes producen nuevos mutantes
atenuados. Estos mutantes son útiles para la producción de una
composición inmunogénica atenuada viva o vacunas atenuadas vivas
que tienen un alto grado de inmunogenicidad.
En un aspecto de la presente invención se
proporciona un mutante de una bacteria Gram negativa, donde dicha
bacteria tiene una mutación en una secuencia de nucleótidos que
codifica originalmente para un polipéptido que tiene una identidad
que es igual o mayor al 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% con una
secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de
nucleótidos SEC ID Nº: 37 dando como resultado dicha mutación una
virulencia atenuada de la bacteria.
En un aspecto adicional de la presente
invención, se proporciona una composición inmunogénica que comprende
un mutante atenuado, y un diluyente, portador o excipiente
farmacéuticamente aceptable; donde dicho mutante es un mutante de
una bacteria Gram negativa, donde dicha bacteria tiene una mutación
en una secuencia de nucleótidos que codifica originalmente para un
polipéptido que tiene una identidad que es igual o mayor al 90%,
95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% con una secuencia de aminoácidos
codificada por una secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 37 dando
como resultado dicha mutación una virulencia atenuada de la
bacteria.
Se proporciona en otro aspecto de la presente
invención una vacuna que comprende un mutante atenuado
correspondiente, y un diluyente, portador o excipiente
farmacéuticamente aceptable; donde dicho mutante es un mutante de
una bacteria Gram negativa, donde dicha bacteria tiene una mutación
en una secuencia de nucleótidos que codifica originalmente para un
polipéptido que tiene una identidad que es igual o mayor al 90%,
95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% con una secuencia de aminoácidos
codificada por una secuencia de nucleótidos SEC ID Nº:37 dando como
resultado dicha mutación una virulencia atenuada de la bacteria.
En un primer aspecto, se proporcionan bacterias
que contienen una mutación atenuante en una secuencia de
nucleótidos o un gen donde la mutación modifica, reduce o suprime la
expresión y/o la actividad biológica de un polipéptido o una
proteína codificada por un gen, dando como resultado una virulencia
atenuada de la bacteria.
La mutación no se localiza necesariamente en un
gen para interrumpir su función, llevándolo a la atenuación. La
mutación también puede producirse en secuencias de nucleótidos
implicadas en la regulación de la expresión del gen, en particular
regiones que regulan el inicio de la transcripción, la traducción y
la terminación de la transcripción. De este modo, también se
incluyen promotores y regiones de unión a ribosomas (en general,
estos elementos reguladores se extienden aproximadamente entre 60 y
250 nucleótidos en dirección 5' del codón de inicio del gen; Doree
S M et al., J. Bacteriol. 2001, 183(6):
1983-9; Pandher K et al., Infect. Imm. 1998,
66(12): 5613-9; Chung J Y et al., FEMS
Microbiol letters 1998, 166: 289-296), terminadores
de la transcripción (en general el terminador se localiza en
aproximadamente 50 ácidos nucleicos en dirección 3' del codón de
parada del gen; Ward C K et al., Infect. Imm. 1998,
66(7): 3326-36). En el caso de un operón,
dichas regiones reguladoras pueden localizarse en una distancia
mayor en dirección 5' del gen. A veces, una mutación en una región
intergénica puede llevar también a la atenuación.
Una mutación en dichas secuencias reguladoras
asociadas con el gen de modo que la mutación de esta secuencia de
nucleótidos modifica, inhibe o suprime la expresión y/o la actividad
biológica del polipéptido o la proteína codificada por el gen, que
da como resultado una virulencia atenuada de la bacteria, seria un
equivalente a una mutación en un gen descrito en la presente
invención.
La atenuación reduce o suprime la patogenicidad
de las bacterias y la gravedad de las señales o lesiones clínicas,
disminuye la velocidad de crecimiento de las bacterias y evita la
muerte.
En la presente invención se describen en
particular las bacterias Gram negativas, más concretamente la
familia Pasteurellaceae, en concreto Pasteurella
multocida, Pasteurella haemolytica, Pasteurella
anatipestifer y Actinobacillus pleuropneumoniae. Las
bacterias preferidas son Pasteurella multocida.
Pasteurella multocida es una bacteria
Gram negativa, que es el agente causante de varias enfermedades de
animales de producción y un patógeno humano oportunista. Es el
agente etiológico de pasteurelosis grave, tal como el cólera aviar
en pájaros domésticos y salvajes, la septicemia hemorrágica bovina y
la rinitis atrófica porcina (Hunt ML et al., Vet Microbiol
2000, 72(1-2): 3-25).
Los aislados pueden agruparse serológicamente en
base a los antígenos capsulares en serogrupos (A, B, D, E y F) o en
16 serotipos en base a los antígenos somáticos LPS.
Se han identificado secuencias de nucleótidos
potenciales implicadas en la atenuación de bacterias utilizando
Mutagénesis de marcaje (Signature Tagged Mutagénesis - STM). Este
procedimiento se ha descrito en detalle en
WO-A-96/17951.
Brevemente, el procedimiento STM implica la
inserción de un único transposón marcado en el genoma de un
microorganismo. En el punto de inserción, se rompe la secuencia de
nucleótidos del genoma y se revisa la mutación resultante para la
atenuación. La secuencia de la región rota (por ejemplo el gen o el
marco de lectura abierto (ORF)) para cada mutante atenuado se
determina mediante amplificación por PCR (reacción en cadena de la
polimerasa), clonación y secuenciación de las regiones de ADN que
flanquean el transposón. El procedimiento STM descrito en
WO-A-96/17951 se adaptó para que
fuera funcional en Pasteurella multocida. Estas adaptaciones
son en particular el uso del transposón Tn10 mejor que el Tn5, el
uso para la selección de un medio CDM sin leucina en lugar de la
selección de resistencia a la estreptomicina. En los ejemplos se
dan más detalles.
Una selección adicional de genes implicados en
la atenuación a partir de los genes potenciales identificados
mediante el procedimiento STM, se basa en la ausencia de mortalidad
después de la inoculación de las bacterias mutantes a animales.
Para aplicación veterinaria, un aspecto ventajoso descrito en la
presente invención comprende la implementación de una selección
experimental directamente en el animal diana en lugar de en un
modelo animal. Este procedimiento permite una selección más exacta
para mutaciones apropiadas de las bacterias mutantes. Para
Pasteurella multocida, se realizan los experimentos
directamente en pavos, uno de sus huéspedes diana naturales. Se
inoculan los pavos intramuscularmente con una cantidad suficiente de
grupos de mutantes de mutantes de P. multocida marcados (por
ejemplo, 0,5 ml, 10^{7} CFU por animal). Los mutantes que no se
reaíslan en cierto momento tras la inoculación se consideran como
potencialmente atenuados. Los mutantes que no están reaislados se
distinguen de aquellos del grupo que están reaislados mediante
amplificación por PCR y análisis de los marcadores. A continuación,
se inyecta cada mutante potencialmente atenuado por vía
intramuscular en pavos (por ejemplo 0,5 ml, 10^{4} CFU por
animal). Se registra la mortalidad de los pavos diariamente durante
7 días tras la inoculación. Se consideran atenuados los mutantes que
no causan la muerte.
Las secuencias de nucleótidos que flanquean el
punto de inserción del transposón se designan como SEC ID Nº: 1, 4,
5, 8, 11, 14, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51,
54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 73, 77, 80, 83, 86, 89.
Se han caracterizado los genes donde tuvo lugar
la inserción del transposón. Su secuencia de nucleótidos en la cepa
PM70 de Pasteurella multocida se designa como SEC ID Nº: 2,
6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55,
58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90. La mutación atenuante
puede realizarse en estas secuencias de nucleótidos o genes, así
como en las secuencias complementarias de los mismos. También puede
realizarse una mutación atenuante en secuencias de nucleótidos
implicadas en la región reguladora de dichos genes.
El término "complementario" en la presente
invención significa la secuencia de nucleótidos de la otra cadena
en el genoma de doble cadena, de manera que cubre la cadena
anti-sentido como complemento de la cadena de
sentido, y a la inversa. El término "nucleótido" también abarca
desoxirribonucleótido (constituido con ácidos desoxirribonucleicos
o ADN), ribonucleótido (constituido con ácidos ribonucleicos o ARN)
y ribonucleótido mensajero (ARNm).
De manera más general, pueden introducirse
mutaciones atenuantes en el genoma de una bacteria, en concreto una
bacteria Gram negativa, más concretamente un miembro de la familia
Pasteurellacaea, por ejemplo P. multocida, P.
haemolytica, P. anatipestifer, A. pleuropneumoniae, y más
preferiblemente en el genoma de cualquiera de las diversas cepas de
P. multocida, en por lo menos una secuencia de nucleótidos
que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene por lo
menos aproximadamente un 70% de identidad, por lo menos
aproximadamente un 75% de identidad, por lo menos aproximadamente un
80% de identidad, por lo menos aproximadamente un 85%, por lo menos
aproximadamente un 90% de identidad, y por lo menos aproximadamente
un 95, 96, 97, 98, o 99% o más de identidad con una de las
secuencias de aminoácidos codificadas por una secuencia de
nucleótidos identificada como SEC ID Nº: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22,
25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75,
78, 81, 84, 87, 90. Esto comprende la degeneración del código
genético. Puede establecerse el porcentaje de identidad entre dos
secuencias de aminoácidos mediante las parejas de NCBI (National
Center for Biotechnology Information) blast y la matriz blosum62,
utilizando los parámetros estándar. El verbo "codificar"
utilizado en la presente invención no significa que la secuencia de
nucleótidos está limitada a una secuencia codificante real, sino
también comprende el gen completo incluyendo sus secuencias
reguladoras que son secuencias no codificantes.
En la presente invención se menciona la mutación
de las secuencias de nucleótidos o de los genes que codifican
polipéptidos o proteínas que tienen la misma función biológica. La
similitud de función puede comprobarse mediante la conservación de
sitios activos. Esto puede realizarse mediante una búsqueda NCBI
DART (Domain Architecture Retrieval Tool).
En la presente invención se proporcionan
mutantes atenuados de una bacteria tal y como se describe
anteriormente, que comprende una mutación atenuante tal y como se
define anteriormente.
Los mutantes pueden comprender más de una
mutación, que pueden dar lugar a grados aditivos o sinérgicos de
atenuación, y pueden dar lugar a una mejor prevención de la
reversión de la atenuación.
Estas mutaciones múltiples pueden asociar una
mutación o mutaciones en secuencias de nucleótidos o genes
conocidos por sus propiedades atenuantes, tales como los genes aro,
por ejemplo aroA (Homchampa P. et. al., Veterinary
Microbiology, 1994, 42: 35-44), y mutaciones en las
secuencias de nucleótidos o genes descritos en la presente
invención.
Las mutaciones se pueden introducir en el
microorganismo utilizando cualquier técnica conocida, tal como por
ejemplo tecnología de ADN recombinante con el fin de introducir una
mutación bien definida en el gen seleccionado. Dicha mutación puede
ser una inserción de secuencia de ácido nucleico heteróloga, una
eliminación, una substitución, es decir un reemplazo de por lo
menos un nucleótido por otro o una combinación de los mismos. En
una primera realización preferida, la mutación es una mutación por
eliminación, donde la interrupción del gen está causada por la
eliminación de parte y preferiblemente mediante la eliminación de la
secuencia de ácidos nucleicos completa del gen. La eliminación de
los ácidos nucleicos evita la reversión a patogenicidad. En una
segunda realización preferida, la mutación es una inserción
realizada en un lugar que corresponde a los puntos de inserción de
transposón descritos en los ejemplos. Estos puntos son en concreto
aquellos localizados entre: los nucleótidos 180-181
en la SEC ID Nº: 2, 77-78 ó
1027-1028 en la SEC ID Nº: 6,
416-417 en la SEC ID Nº: 9, 389-390
en la SEC ID Nº: 12, 381-382 en la SEC ID Nº: 16,
219-220 en la SEC ID Nº: 19,
1353-1354 en la SEC ID Nº: 22,
136-137 en la SEC ID Nº: 25, 384-385
en la SEC ID Nº: 28, 222-223 en la SEC ID Nº: 31,
217-218 en la SEC ID Nº: 34,
1411-1412 en la SEC ID Nº: 37,
943-944 en la SEC ID Nº: 40, 855-856
en la SEC ID Nº: 43, 369-370 en la SEC ID Nº: 46,
111-112 en la SEC ID Nº: 49, 443-444
en la SEC ID Nº: 52, 4-5 en la SEC ID Nº: 55,
inmediatamente antes del nucleótido 1 en la SEC ID Nº: 58,
573-574 en la SEC ID Nº: 61, 875-876
en la SEC ID Nº: 64, inmediatamente antes del nucleótido 1 en la
SEC ID Nº: 67, 218-219 en la SEC ID Nº: 70,
1072-1087 en la SEC ID Nº: 75, 64-65
en la SEC ID Nº: 78, 282-283 en la SEC ID Nº: 81,
1431-1432 en la SEC ID Nº: 84,
974-975 en la SEC ID Nº: 87, 802-803
en la SEC ID Nº: 90.
Los mutantes por eliminación incluyen aquellos
donde se elimina toda o parte de una secuencia de un gen
específico. En un aspecto, la mutación da lugar a la eliminación de
por lo menos un ácido nucleico, de por lo menos aproximadamente un
10%, por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos
aproximadamente un 30%, por lo menos aproximadamente un 40%, por lo
menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 60%,
por lo menos aproximadamente un 70%, por lo menos aproximadamente un
80%, por lo menos aproximadamente un 90%, por lo menos
aproximadamente un 95%, por lo menos aproximadamente un 98%, o por
lo menos aproximadamente un 99% de dicho gen. Preferiblemente se
elimina todo el gen.
Son conocidos los procedimientos para introducir
las mutaciones en las regiones genómicas específicas y serán
evidentes para el experto en la materia. Por ejemplo, se clona el
gen completo a mutar o un fragmento en un vector y se modifica con
el fin de suprimir su expresión y/o su actividad biológica. Se
reintroduce el fragmento de ADN modificado en el genoma bacteriano
mediante recombinación genética, preferiblemente mediante
recombinación homóloga entre el cromosoma bacteriano y el vector.
Como ejemplo el vector puede ser un plásmido suicida tal y como se
describe en Cardenas (Cardenas et al. Vet Microbiol 2001 May
3; 80(1): 53-61). De un modo ventajoso, este
vector comprende además entre los dos brazos flanqueantes una
secuencia de poliparada (6 codones de parada, uno en cada marco de
lectura) para bloquear cualquier posible traducción.
El microorganismo atenuado descrito en la
presente invención, por ejemplo P. multocida, puede
comprender adicionalmente por lo menos una secuencia de ácidos
nucleicos heteróloga insertada en su genoma, donde dicha secuencia
de ácidos nucleicos heteróloga preferiblemente codifica para un
inmunógeno a partir de un agente viral patogénico, parasitario o
bacteriano, que es diferente del microorganismo atenuado. Esta
secuencia heteróloga puede codificar un inmunógeno a partir de otra
cepa de P. multocida. Un inmunógeno es una proteína,
polipéptido o péptido que es capaz de inducir una respuesta inmune
contra el agente patogénico o un antígeno secretado.
Las secuencias de ácidos nucleicos heterólogas
que son adecuadas para su uso en dicho vector serán evidentes para
el experto en la materia (Fedorova ND and Highlander SK, Infect
Immun 1997, 65(7):2593-8) e incluye por
ejemplo aquellos que provienen de los miembros de la familia
Pasteurellaceae (particularmente Pasteurella multocida,
Pasteurella haemolytica, Pasteurella anatipestifer, Actinobacillus
pleuropneumoniae), o de bacterias como E. coli, Salmonella,
Campylobacter.
Se inserta la secuencia heteróloga para ser
expresada por el microorganismo en el huésped cuando se administra
con el fin de desarrollar una respuesta inmune contra tanto el
microorganismo atenuado como dicho inmunógeno expresado. La
secuencia heteróloga se inserta preferiblemente con los elementos
reguladores que permiten su expresión, tal como un promotor.
También pueden añadirse secuencias de nucleótidos útiles para el
direccionamiento y la secreción de la proteína.
En una realización, la secuencia heteróloga se
inserta en la secuencia de nucleótidos seleccionada o el gen
seleccionado utilizado para la atenuación, en concreto se inserta en
uno de los puntos correspondientes a los puntos de inserción de
transposón identificados en la presente invención.
Para mejorar la expresión, puede adaptarse el
uso de codón al vector bacteriano utilizado.
Los mutantes atenuados descritos en la presente
invención también pueden comprender una secuencia de ácidos
nucleicos que codifica una proteína terapéutica, un alérgeno, un
factor de crecimiento o una citoquina.
Según un aspecto adicional, se utilizan
microorganismos atenuados para producir composiciones inmunogénicas
atenuadas vivas o composiciones de vacuna atenuadas vivas. Según un
aspecto particular, el microorganismo atenuado es P.
multocida. De un modo ventajoso, tal y como se describe
anteriormente, el microorganismo puede actuar como un vector
recombinante para inmunizar animales o un humano contra infecciones
causadas por otros agentes diferentes a Pasteurella.
Las composiciones inmunogénicas o las
composiciones de vacuna comprenden el mutante atenuado y un
excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable, y
opcionalmente un estabilizador y/o un adyuvante.
El término "composición inmunogénica" cubre
en la presente invención cualquier composición capaz, una vez se ha
inyectado a animales o a un humano, de provocar una respuesta inmune
contra el patógeno reconocido. El término "composición de
vacuna" o "vacuna" cubre en la presente invención cualquier
composición capaz, una vez se ha inyectado a animales o a un
humano, de inducir una respuesta inmune protectora contra el
patógeno reconocido.
El vehículo farmacéuticamente aceptable puede
ser agua o solución salina, pero también puede comprender por
ejemplo medio de cultivo de bacterias.
Las bacterias atenuadas vivas descritas en la
presente invención pueden liofilizarse preferiblemente con un
estabilizador. La liofilización puede realizarse según los
procedimientos de liofilización estándar bien conocidos. Los
estabilizadores farmacéuticamente aceptables pueden ser
carbohidratos (por ejemplo sorbitol, manitol, lactosa, sacarosa,
glucosa, dextrano, trehalosa), glutamato sódico (Tsvetkov T et
al., Cryobiology 1983, 20(3): 318-23;
Israeli E et al., Cryobiology 1993, 30(5):
519-23), proteínas tales como peptona, albúmina,
lactalbúmina o caseína, agentes que contienen proteínas, tales como
la leche desnatada (Mills CK et al., Cryobiology 1988,
25(2): 148-52; Wolff E et al.,
Cryobiology 1990, 27(5): 569-75), y tampones
(por ejemplo tampón fosfato, tampón de fosfato de metal
alcalino).
alcalino).
Puede utilizarse un adyuvante para hacer
solubles las preparaciones liofilizadas.
Son ejemplos de adyuvantes las emulsiones
aceite-en-agua,
agua-en-aceite-en-agua
basadas en aceite mineral y/o aceite vegetal y tensoactivos no
iónicos, tales como copolímeros de bloque, Tween®, Span®. Otros
adyuvantes adecuados son por ejemplo vitamina E, saponinas y
Carbopol®, hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio ("Vaccine
Design, The subunit and adjuvant approach", Pharmaceutical
Biotechnology, vol. 6, Editado por Michael F. Powell y Mark J.
Newman, 1995, Plenum Press New York).
Las bacterias vivas atenuadas pueden guardarse a
-70ºC en un medio que contiene glicerol.
Opcionalmente, la composición inmunogénica o la
vacuna pueden combinarse con uno o más inmunógenos seleccionados de
otros microorganismos patogénicos o virus en una forma inactivada o
viva.
Otro aspecto mencionado en la presente invención
es el uso de las secuencias de nucleótidos o genes descritos en la
presente invención, para la expresión y la producción de
inmunógenos. En una primera realización, los polipéptidos
codificados por estas secuencias de nucleótidos o genes pueden
utilizarse como inmunógenos de subunidad en composiciones
inmunogénicas o vacunas.
Los polipéptidos preferidos son aquellos que
tienen las secuencias de aminoácidos identificadas como SEC ID Nº:
3, 7, 10, 13, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53,
56, 59, 62, 65, 68, 71, 76, 79, 82, 85, 88, 91, o aquellos
codificados por las secuencias de nucleótidos SEC ID Nº: 2, 6, 9,
12, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61,
64, 67, 70, 75, 78, 81, 84, 87, 90.
En la presente invención también se mencionan
los polipéptidos equivalentes de otra bacteria, en concreto una
bacteria Gram negativa, más concretamente un miembro de la familia
Pasteurellacaea, por ejemplo P. multocida, P.
haemolytica, P. anatipestifer,
A-pleuropneumoniae, y más preferiblemente en el
genoma de cualquiera de las diversas cepas de P. multocida.
De este modo, están incluidas como polipéptidos de equivalencia
cuyas secuencias de aminoácidos tienen por lo menos aproximadamente
un 70%, por lo menos aproximadamente un 75%, por lo menos
aproximadamente un 80%, por lo menos aproximadamente un 85%, por lo
menos aproximadamente un 90%, por lo menos aproximadamente un 95%,
y por lo menos aproximadamente un 96, 97 98 o 99% de identidad con
una de las secuencias de aminoácidos identificadas como SEC ID Nº:
3, 7, 10, 13, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53,
56, 59, 62, 65, 68, 71, 76, 79, 82, 85, 88, 91, y/o polipéptidos que
tiene la misma función o funciones biológicas que los polipéptidos
identificados anteriormente con SEC. Anteriormente se han descrito
los criterios para el establecimiento de la identidad o la misma
función biológica.
En la presente invención también se describen
los fragmentos inmunogénicos de estos polipéptidos, que tienen por
lo menos una cadena de 10 aminoácidos del polipéptido, por lo menos
20, en concreto por lo menos 30, preferiblemente por lo menos 50 y
más preferiblemente por lo menos 70.
Los polipéptidos y fragmentos se producen
preferiblemente mediante la expresión in vitro. Las
secuencias de nucleótidos tal y como se describen en la presente
invención (por ejemplo SEC ID Nº: 2, 6, 9, 12, 16, 19, 22, 25, 28,
31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 75, 78, 81,
84, 87, 90) o fragmentos de las mismas se insertan en un vector,
unido operativamente a elementos reguladores, tales como promotor,
región de unión a ribosoma y terminador, y codón de inicio y codón
de parada. Los vectores preferidos son plásmidos útiles para la
expresión in vitro en bacterias, es decir Escherichia
coli (Mahona F et al., Biochimie 1994, 46(1):
9-14; Watt M A et al., Cell Stress Chaperones
1997, 2(3): 180-90; Frey J Res. Microbiol.
1992, 143(3): 263-9).
Estos polipéptidos también pueden sintetizarse
químicamente (Luo Y et al., Vaccine 1999,
17(7-8): 821-31).
En la presente invención también se menciona una
composición inmunogénica o de vacuna que comprende por lo menos un
polipéptido o un fragmento tal y como se describe en la presente
invención (composición inmunogénica o vacuna subunidad) o por lo
menos un vector de expresión in vivo tal y como se describe
anteriormente (composición inmunogénica o vacuna recombinante
viva), y un excipiente, diluente o vehículo farmacéuticamente
aceptable, y opcionalmente un adyuvante. Anteriormente se han
descrito ejemplos de dichos componentes en relación con la vacuna
viva.
En una segunda realización, pueden insertarse
estas secuencias de nucleótidos o sus fragmentos en vectores
recombinantes para producir composiciones inmunogénicas o vacunas
recombinantes vivas capaces de expresar in vivo en el
huésped el polipéptido codificado por esta secuencia de nucleótidos
o fragmento.
El vector de expresión in vivo puede ser
un vector o un plásmido de polinucleótidos
(EP-A2-1001025; Chaudhuri P Res.
Vet. Sci. 2001, 70 (3), 255-6), virus (por ejemplo
adenovirus, virus de la viruela, tal como la viruela aviar
(US-A-5.174.993
US-A-5.505.941 y
US-A-5.766.599) o viruela del
canario (US-A-5.756.103)) o
bacterias, es decir Escherichia coli o Salmonella
sp.
Los polipéptidos y fragmentos tal y como se
describen en la presente invención también pueden utilizarse en
terapia.
Dichos polipéptidos y fragmentos también pueden
utilizarse como reactivos en la reacción
anticuerpo-antígeno. En la presente invención
también se menciona un método de diagnóstico para detectar la
infección mediante la bacteria Gram negativa, así como kits (por
ejemplo ELISA) que incluyen por lo menos un polipéptido o fragmento
tal y como se describe en la presente invención.
Los anticuerpos contra los polipéptidos o
fragmentos anteriores pueden utilizarse como un reactivo de
diagnóstico o en inmunización o vacunación pasivas o en terapia.
En la presente invención se menciona una
preparación de anticuerpo que comprende un anticuerpo específico
para un polipéptido o un fragmento tal y como se describe en la
presente invención y métodos de diagnóstico que utilizan el mismo.
Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Los
procedimientos de producción de anticuerpos son bien conocidos por
el experto en la materia. Si se desean anticuerpos policlonales, se
inmuniza un animal seleccionado (por ejemplo ratón, conejo, cabra,
caballo, etc.) con un polipéptido o un fragmento. Se recoge el
suero del animal inmunizado y se trata de acuerdo con los
procedimientos conocidos y posiblemente se purifica. Ver, por
ejemplo Jurgens et al. J. Chrom. 1985, 348:
363-370. Se conoce bien la metodología general para
producir anticuerpos monoclonales mediante el uso de la tecnología
de hibridomas. Pueden crearse líneas celulares productoras de
anticuerpos inmortales mediante fusión celular, y también mediante
otras técnicas tales como la transformación directa de linfocitos B
con ADN oncogénico, o la transfección con virus
Epstein-Barr. Ver, por ejemplo J.E. Liddell "A
practical guide to monoclonal antibodies" ed. John Wiley and
sons, 1991, p.188; S. J. de StGroth et al. J. Immunol.
Methods, 1980, 35(1-2),
1-21.
Las secuencias de nucleótidos mencionadas en la
presente invención y sus fragmentos pueden utilizarse como una
sonda para hibridación, por ejemplo en un método de diagnóstico.
Preferiblemente se utilizan condiciones de
hibridación astringentes. Se puede hacer referencia a aquellas
descritas por Sambrook et al., Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989),
1.101-1.104. La hibridación bajo condiciones
astringentes significa que una señal de hibridación positiva aún se
observa después de lavar durante 1 hora con 1 x tampón SSC y SDS al
0,1% a 55ºC, preferiblemente a 62ºC y más preferiblemente a 68ºC,
en concreto, durante 1 hora en 0,2 x tampón SSC y SDS al 0,1% a
55ºC, preferiblemente a 62ºC y más preferiblemente a 68ºC.
Las secuencias de nucleótidos mencionadas en la
presente invención y sus fragmentos pueden utilizarse como
cebadores para PCR o similar en particular para la detección de
bacterias Gram negativas en cualquier medio, por ejemplo muestras
de tejido, fluidos biológicos, agua, comida.
Se utilizan preferentemente fragmentos de
secuencias de nucleótidos que tienen por lo menos 20, por lo menos
30, por lo menos 50, por lo menos 70 o por lo menos 100 ácidos
nucleicos de secuencias de nucleótidos o genes descritos en la
presente invención en concreto de las SEC ID Nº: 2, 6, 9, 12, 16,
19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67,
70, 75, 78, 81, 84, 87, 90.
Además en la presente invención también se
mencionan procedimientos para inmunizar contra o para prevenir la
infección bacteriana en animales, preferiblemente en especies
aviares, conejos, bovinas y porcinas y más preferiblemente para
especies aviares, tal como pollo, pavo y pato (esto incluye de
crianza, pollos jóvenes y ponedoras) o en un humano. Según estos
procedimientos, se administran (1) una composición inmunogénica o
vacuna atenuada viva, (2) una composición inmunogénica o vacuna
subunidad, (3) una composición inmunogénica o vacuna recombinante
viva, o sus combinaciones.
La administración puede realizarse
particularmente mediante inyección intramuscular (IM), intradérmica
(ID) o subcutánea (SC) o vía intranasal, intratraqueal o
administración oral. Se administra la composición inmunogénica o la
vacuna descrita en la presente invención mediante jeringa, aparato
sin aguja (como por ejemplo Pigjet, Avijet, Dermojet o Biojector
(Bioject, Oregon, USA)), pulverizador, bebiendo agua, colirio.
Las administraciones preferentes para la
composición inmunogénica o vacuna atenuada viva son in ovo, por vía
oral (por ejemplo bebiendo agua, pulverizador para todo el cuerpo),
ocular (por ejemplo, colirio, pulverizador para todo el cuerpo),
traqueal (por ejemplo, pulverizador), intradérmica, subcutánea (SC)
o intramuscular (IM).
La cantidad de microorganismos atenuados vivos
puede determinarse y optimizarse por una persona experta. No
obstante, generalmente puede administrarse a un animal
aproximadamente 10^{4}-10^{9} CFUs,
preferiblemente aproximadamente 10^{5}-10^{6}
CFUs y más preferiblemente aproximadamente
10^{6}-10^{7} CFUs en una única dosis
unitaria.
Por vía inatramuscular se pueden administrar a
un animal aviar aproximadamente 10^{4}-10^{7}
CFUs, preferiblemente aproximadamente
10^{5}-10^{6} CFUs en una única dosis unitaria.
El volumen de una única dosis unitaria puede estar entre 0,2 ml y
0,5 ml y preferiblemente 0,3 ml. Por las vías oral, traqueal u
ocular puede administrarse a un animal aviar aproximadamente
10^{5}-10^{8} CFUs, preferiblemente
aproximadamente 10^{6}-10^{7} CFUs en una única
dosis unitaria. Para la administración con pulverizador el volumen
depende del aparato y del tamaño de las gotas, desde
aproximadamente 30 hasta aproximadamente 600 ml para 1000 animales
y preferiblemente 0,2 ml por animal.
Para animales bovinos y porcinos, las vías
preferidas son IM y SC. Puede administrarse al animal
aproximadamente 10^{4}-10^{9} CFUs,
preferiblemente aproximadamente 10^{5}-10^{8}
CFUs en una única dosis unitaria. El volumen de una única dosis
unitaria puede estar entre 0,2 ml y 5,0 ml y preferiblemente entre
0,5 ml y 2,0 ml y más preferiblemente
1,0 ml.
1,0 ml.
Puede administrarse a conejos aproximadamente
10^{4}-10^{8} CFUs por vía IM o SC,
preferiblemente aproximadamente 10^{5}-10^{7}
CFUs en una única dosis unitaria. El volumen de una única dosis
unitaria puede estar entre 0,2 ml y 0,5 ml y preferiblemente 0,5
ml. También puede administrárseles aproximadamente
10^{4}-10^{8} CFUs por vía ID, preferiblemente
aproximadamente 10^{5}-10^{7} CFUs en una única
dosis unitaria. El volumen de una única dosis unitaria puede estar
entre 0,1 ml y 0,2 ml.
Los siguientes ejemplos ilustran realizaciones
descritas en la presente invención. Ninguno pretende limitar su
alcance de aplicabilidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se produjeron marcadores tal y como se describe
en Hensel et. al., (Science, 1995,
269:400-403). Inicialmente se seleccionaron
plásmidos pUTminiTn5Km2 marcados que contienen marcadores que se
hibridizan bien pero no se hibridan de forma cruzada entre sí. Se
observó que el transposón mini-Tn5 en el vector
pUTminiTn5Km2 marcado no se transpone en diversas cepas de
Pasteurella multocida. En cambio, se ha observado que el
transposón mini-Tn10 funciona en P.
multocida (Lee et. al., Vet Microbiol, 1996,
50:143-8). Por lo tanto, se transfirieron los
marcadores preseleccionados desde los vectores pUTminiTn5 al
plásmido pLOF/Km que contenía mini-Tn10 (Herrero
et al., J. Bacteriology, 1990, 172:
6557-6567). Se amplificaron los marcadores mediante
PCR utilizando cebadores que se unen al vector pUTminiTn5Km2, en
cualquier lado del sitio KpnI en el que se clonaron los
marcadores. Estos cebadores incluían secuencias para la enzima de
restricción SalI. A continuación, se digirieron los
productos de PCR con SalI y se clonaron en el sitio
SalI de una versión modificada del vector pLOF/Km, en el
cual un sitio SalI ha reemplazado el único sitio de clonación
SfiI. A continuación se transformaron los plásmidos pLOF/Km
marcados en la cepa SM10\lambdapir de E. coli (Km^{r},
thi, thr, leu, tonA, lacY, supE,
recA::RP4-2-Tc::Mu\lambdapir)
(Miller V.L. et al., J. Bacteriol., 1998, 170:
2575-82). Esta cepa puede movilizar plásmidos, tales
como pLOF/Km en bacterias receptoras mediante
conjugación.
conjugación.
\vskip1.000000\baselineskip
El proceso de conjugación requiere un
procedimiento de selección para la P. multocida receptora,
que ha adquirido el plásmido pLOF/KM y un procedimiento de
contra-selección contra el dador SM10\lambdapir
de E. coli.
En el procedimiento de selección se seleccionan
las P. multocida receptoras para utilizar canamicina, que es
codificada por el transposón mini-Tn10.
Inicialmente para la
contra-selección contra el dador de E. coli
en conjugaciones, se utilizó espontáneamente un mutante resistente
a la estreptomicina de la cepa P-1059 de
Pasteurella. No obstante, parecía que se atenuó esta cepa en su
virulencia por pavos y de este modo no era utilizable en la presente
invención. Las cepas de Pasteurella multocida pueden crecer
en un medio definido químicamente (CDM) (HU et al., Infection
and Immunity 1986, 804-810). Se utilizó una versión
modificada de este medio definido químicamente que contiene agar
pero no contiene leucina para permitir la
contra-selección contra el dador de E. coli.
La cepa de Pasteurella era capaz de crecer en este medio, la
composición del cual se indica en la tabla 1, mientras que la cepa
SM10\lambdapir de E. coli, que es una auxótrofa de leucina,
no lo era.
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Se estimuló una ampolla liofilizada de cepa de
P. multocida (USDA P-1059, disponible ante la
American Type Culture Collection, número de acceso ATCC 15742)
mediante la adición de 200 \mul de BHI (infusión de
cerebro-corazón) y se puso en estrías una alícuota
de la suspensión en una placa de agar y se incubó la placa a 37ºC
durante toda una noche. Se utilizó el material de la colonia de esta
placa para inocular un caldo de cultivo BHI, que se incubó con
agitación a 37ºC durante toda una noche. Se añadió glicerol a una
concentración final de 15% v/v y se guardaron alícuotas congeladas
a -80ºC. Se puso en estrías una muestra de una de estas alícuotas
congeladas en una placa de agar BHI y se incubó durante toda la
noche. A continuación, se puso en estrías el material de la colonia
de esta placa BHI en placas de agar CDM con la composición dada en
la tabla 1 y se incubó a 37ºC durante 3 días. Se inoculó el
material de la colonia de esta placa con CDM en un caldo de cultivo
BHI y se incubó con agitación a 37ºC durante toda la noche. Se
añadió glicerol a este cultivo a una concentración final de 15% v/v
y se congelaron las alícuotas a -80ºC. Esta cepa se denominó 16084
(CDM).
\vskip1.000000\baselineskip
Se conjugaron los transformantes pLOF/km de
SM10\lambdapir marcados con la cepa de P. multocida 16084
(CDM). Para minimizar el aislamiento de mutantes hermanos (mutantes
con el transposón localizado en la misma posición que surge debido
a la replicación del mutante durante el procedimiento de
conjugación) se conjugó cada transformante de SM10\lambdapir
marcado con la cepa de P. multocida en por lo menos tres
conjugaciones separadas. Se seleccionaron los mutantes de
transposón de Pasteurella en placas de agar CDM complementadas con
canamicina 50 \mug/ml.
A continuación se pusieron en estrías los
mutantes resistentes a la canamicina para cada uno de los
transposones marcados para formar colonias individuales dos veces
en placas de agar con canamicina 50 \mug/ml en BHI. A
continuación, se inocularon las colonias individuales en los caldos
de cultivo de BHI, se dejaron crecer durante toda la noche a 37ºC
con agitación. A continuación, se añadió glicerol a una
concentración final de 15% v/v y se guardaron los mutantes a -80ºC
en viales individuales.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se desarrollaron los cultivos de mutantes de
P. multocida para la inoculación de pavos mediante la mezcla
de 20 \mul de cada uno de las soluciones madre de glicerol de los
mutantes obtenidos en el ejemplo 1 con 200 \mul de medio de
cultivo BHI, complementado con 50 \mug/ml de canamicina, y
colocándolos en platos de microtitulación de 96 pocillos. Se
incubaron estos platos de microtitulación en condiciones estáticas
durante aproximadamente 18 horas a 37ºC. A continuación, se
mezclaron alícuotas de 10 \mul de los cultivos de 18 horas de
cada mutante con 200 \mul de medio de cultivo BHI complementado
con 50 \mug/ml de canamicina en una placa de microtitulación
nueva y la placa se incubó a 37ºC durante aproximadamente 4 horas.
Se pararon los cultivos en la fase exponencial del crecimiento y se
transfirieron 100 \mul de los cultivos de cada mutante a una
placa de microtitulación nueva y se utilizó para la determinación de
la densidad óptica (OD) a 650 nm.
Se formaron pools de inoculaciones o de entrada
mediante la mezcla de los 100 \mul restantes de los cultivos de 4
horas. Cada pool de entrada consistía en 48 mutantes diferentes. Se
determinó el título de estas suspensiones agrupadas mediante
análisis FACS (clasificador de células activado por fluorescencia)
de alícuotas de 100 \mul. A continuación, se diluyeron alícuotas
(1 ml) de la suspensión agrupada en agua tamponada fisiológicamente
para obtener una suspensión con un título de 2,10^{7} cfu/ml. A
continuación, se inocularon intramuscularmente grupos de 5 pavos de
tres semanas de vida con alícuotas de 0,5 ml de esta suspensión
(10^{7} cfu por animal). Se determinó el estado serológico de los
pavos antes de la inoculación mediante cribado de la presencia de
anticuerpos para Pasteurella en muestras de sangre extraídas un día
antes de la inoculación. Se recogieron las células del resto de los
pools de entrada mediante centrifugación y se extrajo ADN
cromosómico a partir de los residuos celulares.
Se extrajeron muestras de sangre de 1 ml de 3 de
los 5 pavos aproximadamente 14 horas después de la inoculación. Se
pusieron series de dilución (10^{-1} a 10^{-7}) de las muestras
de sangre en placas de agar de Columbia complementado con sangre de
oveja al 5%. Se incubaron las placas a 37ºC durante 24 horas
después de lo cual, se resuspendieron aproximadamente 10000 colonias
de Pasteurella en medio BHI. A continuación, se centrifugaron estas
suspensiones, que se denominan el pool de salida, y se extrajo el
ADN cromosómico del residuo celular.
Se identificaron los mutantes de Pasteurella que
estaban presentes en el pool de entrada pero no se reaislaron de
los pavos mediante amplificación de PCR de los marcadores patrón
presentes en las muestras de ADN a partir de los pools de entrada y
de salida, y la hibridación de los productos de la amplificación de
PCR contra transferencias de tipo "dot" cargadas con ADN que
codifica los marcadores patrón, tal y como se describe en Hensel
et al. (Science 1995, 269: 400-403). Se
consideraron estos mutantes como potencialmente atenuados en
virulencia. Se confirmó esta atenuación mediante el cribado a través
de una ausencia de mortalidad después de infecciones individuales
de los mutantes potenciales en los pavos.
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Ejemplo
3
Se reactivaron los mutantes del transposón
identificados como potencialmente atenuados en el Ejemplo 2 o los
mutantes que han limitado su capacidad de crecer en el cultivo
mediante la mezcla de 20 \mul de las soluciones madre de glicerol
con 200 \mul de medio de cultivo BHI complementado con 50
\mug/ml de canamicina en platos de microtitulación. Se incubaron
estos platos de microtitulación en condiciones estáticas durante 18
horas a 37ºC. A continuación se tomaron alícuotas de 10 \mul de
cada mutante de estos cultivos y se mezclaron con 200 \mul de
medio BHI, complementado con 50 \mug/ml de canamicina en una placa
de microtitulación nueva y se incubó esta placa en condiciones
estáticas durante aproximadamente 4 horas. Se detuvieron los
cultivos en la fase exponencial del crecimiento y se transfirieron
100 \mul de los cultivos de cada mutante a una placa de
microtitulación nueva y se usó para la determinación de la densidad
óptica (DO) a 650nm. A continuación, los cultivos de cada uno de
los mutantes se diluyeron 1 en 10000 en agua tamponada
fisiológicamente para obtener una concentración de aproximadamente
2\cdot10^{4} cfu/ml. A continuación, se inocularon
intramuscularmente alícuotas (0,5 ml) de estas diluciones en 2
pavos de cinco semanas de edad (10^{4} cfu por animal). Se
determinó el estado serológico de unos pocos animales de cada grupo
de pavos a partir de muestras de sangre extraídas el día antes de
la inoculación. Se monitorizaron la mortalidad de los pavos durante
los 7 días siguientes. De los mutantes probados 72 no dieron lugar
a mortalidad en alguno de los dos pájaros inoculados. Estos 72
mutantes se consideraron atenuados en virulencia.
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Ejemplo
4
Se identificaron los sitios de inserción en un
transposón en el genoma de mutantes de P. multocida
atenuados mediante la clonación del ADN que flanquea un lado de la
inserción de transposón, ya sea mediante PCR Inversa o mediante PCR
cebada arbitrariamente.
Se reactivaron estos mutantes a partir de las
soluciones madre de glicerol a -80ºC mediante la disposición en
estrías de una alícuota sobre placas de agar con canamicina 50
\mug/ml en BHI. A continuación, se utilizaron colonias
individuales para inocular caldos de cultivo BHI a partir del cual
se preparó ADN cromosómico.
Para el PCR Inverso se digirió el ADN
cromosómico con una enzima de restricción que tiene un sitio de
reconocimiento de 4 pares de bases, tal como Tsp5091, \alphaTaqI o
RsaI. A continuación, se liga el ADN en un volumen grande para
provocar la unión intra-molecular. A continuación,
se amplifica el ADN que flanquea el transposón a partir de esta
plantilla de ADN ligado utilizando cebadores orientados hacia el
exterior que se hibridan a la secuencia conocida del transposón. A
continuación, se clonan y se secuencian estos productos de PCR
Inversa.
Para PCR cebada arbitrariamente, se utilizó ADN
cromosómico como una plantilla en una reacción PCR de primer ciclo
con un cebador orientado hacia el exterior que se híbrida al
transposón y un cebador arbitrario. El cebador arbitrario tiene 5
bases conocidas en el extremo 3' y luego 10 bases aleatorias. Las 20
bases en el extremo 5' del cebador son de secuencia conocida. La
temperatura de hibridación de esta reacción de PCR de primer ciclo
se establece inicialmente de manera muy baja, elevándose la
temperatura de hibridación en ciclos posteriores. A continuación,
se utiliza una parte de los productos de esta reacción de PCR de
primer ciclo como una plantilla en una PCR de segundo ciclo. Esta
PCR de segundo ciclo utiliza otro cebador orientado hacia el
exterior, que se híbrida al transposón en una posición que está más
cerca del extremo del transposón que el cebador utilizado en el PCR
de primer ciclo. El otro cebador utilizado en esta PCR de segundo
ciclo tiene la misma secuencia que las 20 bases de secuencia
conocida en el extremo 5' del cebador arbitrario utilizado en la
PCR de primer ciclo. A continuación, se clonan y se secuencian los
productos de PCR de esta PCR de segundo ciclo.
A continuación, se analizaron las secuencias
obtenidas para identificar marcos de lectura abiertos (ORF), que
pueden interrumpirse por el transposón y también se utilizaron para
buscar secuencias similares disponibles actualmente en la base de
datos EMBL y en la secuencia del genoma de la cepa PM70 de
Pasteurella multocida, determinada por la University of
Minnesota (May BJ et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001,
98(6): 3460-5).
Como información, en las secuencias de
nucleótidos siguientes, N se corresponde a cualquier ácido nucleico
(A o C o G o T).
Mutante 1G4
En SEC ID Nº: 1 (775 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
Se inserta el transposón directamente en el extremo 5' de esta
secuencia.
Se localiza un codón de inicio en las posiciones
179-181.
Se identificaron otras cuatro proteínas y genes
de Pasteurellaceae mediante blasts realizados con una
secuencia de 60 aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 1.
La localización del transposón en el mutante 1G4
corresponde a la posición 8507-8508 de la secuencia
del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso
AE006115 de Genbank. El transposón interrumpe un homólogo del gen
de PM70, PM0773, PhyA. Se prevé que el gen PhyA está implicado en la
síntesis de la cápsula. En la presente invención se identifica la
secuencia de nucleótidos de PM0773 como SEC ID Nº: 2 y su secuencia
de aminoácidos como SEC ID Nº: 3.
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Mutantes 1G8 y 9D1
En el mutante 1G8, se inserta el transposón
directamente en el extremo 3' de la secuencia SEC ID Nº: 4 (226
unidades). Esta secuencia tiene dos marcos de lectura abiertos (+2 y
-2) que codifican potenciales proteínas más largas. El ORF descrito
en la presente invención está en el marco -2.
El transposón insertado en el mutante 9D1 se
encuentra directamente en el extremo 3' de la secuencia SEC ID Nº:
5 (87 unidades).
Los transposones en los mutantes 1G8 y 9D1
interrumpen un homólogo del gen de PM70, PM0871. Las localizaciones
de los transposones en esos mutantes corresponden a las posiciones
9849-9850 (mutante 1G8) u 8899-8900
(mutante 9D1) de la secuencia de genoma de PM70 de Pasteurella
multocida de número de acceso AE006125 de Genbank. En la
presente invención se identifica la secuencia de nucleótidos de
PM0871 como SEC ID Nº: 6 y la secuencia de aminoácidos como SEC ID
Nº: 7.
Se identificó otro gen/proteína de
Pastaurallaceae mediante blasts realizados con la SEC ID Nº: 7.
Este es HI1586 de Haemophilus influenzae (números de acceso
de Genbank U32832 y AAC23234). Encontramos una identidad del 72%
sobre 507 aminoácidos entre PM0871 y HI1586.
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Mutante 2F2
En la SEC ID Nº: 8 (78 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
El transposón se encuentra directamente en el extremo 5' de esta
secuencia. Esta secuencia tiene tres marcos de lectura abiertos
(+1, +2 y -1) que codifican potenciales proteínas más largas. El ORF
descrito en la presente invención está en el marco +2.
El transposón en el mutante 2F2 interrumpe un
gen homólogo del gen de PM70, PM1727. Este transposón se localiza
en una posición que corresponde a 644-645 de la
secuencia de PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso
de Genbank AE006210 (PM1727). En la presente invención se identifica
la secuencia de nucleótidos de PM1727 como SEC ID Nº: 9 y su
secuencia de aminoácidos como SEC ID Nº: 10.
Se identificó otro gen/proteína de
Pastaurallaceae mediante blasts realizados con la SEC ID Nº: 10.
Éste es HI0621 de Haemophilus influenzae (números de acceso
de Genbank U32744 y AAC22281). Encontramos una identidad del 77%
sobre 183 aminoácidos entre PM1727 y HI0621.
PM 1727 es un miembro de una superfamilia de
hidrolasas, en particular se relaciona con histidinol fosfato
fosfatasas.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 3A2
En la SEC ID Nº: 11 (467 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
El transposón se encuentra directamente en el extremo 5' de esta
secuencia.
Se localiza un codón de parada en las posiciones
428-430.
El transposón en el mutante 3A2 se localiza en
una posición que corresponde a 5103-5104 de la
secuencia de PM70 de Pasteurella multocida, número de
acceso de Genbank AE006094 (PM0586). En la presente invención se
identifica la secuencia de nucleótidos de PM1727 como SEC ID Nº: 12
y su secuencia de aminoácidos como SEC ID Nº: 13.
Se identificaron otros dos genes y proteínas de
Pasteurellaceae mediante blasts realizados con la SEC ID Nº: 13.
Estos genes y proteínas son A1 PIpD de Pasteurella
haemolytica (números de acceso de Genbank AF058703 y AAC32565)
y 31 kDa de Haemophilus somnus (números de acceso de Genbank
L07795 y AAA24941). Encontramos una identidad de 73% sobre 276
aminoácidos entre PM0586 y PIpD de P. haemolytica y de 71%
sobre 273 aminoácidos entre PM0586 y 31 kDa de H. somnus.
PIpD y PM0586 son miembros de la familia de la
proteínas ompA.
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Mutante 3D3
Se indican las secuencias de ADN que flanquean
ambos lados del sitio de inserción del transposón en SEC ID Nº: 14
(204 unidades, transposón en el extremo 5') y SEC ID Nº: 15 (35
unidades, transposón en el extremo 5').
Se localiza un codón de parada en las posiciones
7-9 de SEC ID Nº: 14 y en las posiciones
33-35 de SEC ID Nº: 15.
Se identificó otro gen/proteína de
Pasteurellaceae mediante blasts realizados con la SEC ID Nº:
14 y su secuencia de aminoácidos codificada (65 aminoácidos).
Encontramos una identidad de 100% sobre 65 aminoácidos con la
proteína PM0064. La localización del transposón en el mutante 3D3
corresponde a las posiciones 4778-4779 o
4787-4788 de la secuencia de genoma de PM70 de
Pasteurella multocida, número de acceso de Genbank AE006042,
posiciones deducidas de SEC ID Nº: 14 y 15 respectivamente. Esta
diferencia se debe probablemente a la inserción del transposón que
da lugar a la duplicación de unos pocos nucleótidos en el sitio de
inserción del transposón. La posición 4788 se localiza en el gen
PM0064. La posición 4778 está 6 pb en dirección 3' del codón de
parada de PM0064. En la presente invención se identifica la
secuencia de nucleótidos de PM0064 como SEC ID Nº: 16 y su
secuencia de aminoácidos como SEC ID Nº: 17.
Se identificaron otras bacterias Gram negativas
y proteínas mediante blasts realizados con la SEC ID Nº: 17.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante
3D8
En la SEC ID Nº: 18 (75 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
El transposón se encuentra directamente en el extremo 3' de esta
secuencia.
La localización del transposón en el mutante 3D8
se corresponde entre las posiciones 7769-7770 de la
secuencia genómica de PM70 de Pasteurella multocida, número
de acceso de Genbank AE006080. El transposón interrumpe un homólogo
del gen PM70, PM0445. En la presente invención se identifica la
secuencia de nucleótidos de PM0445 como SEC ID Nº: 19 y su
secuencia de aminoácidos como SEC ID Nº: 20.
\newpage
Mutante 3E1
En la SEC ID Nº: 21 (229 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
El transposón se encuentra directamente en el extremo 3' de esta
secuencia.
La localización del transposón en el mutante 3E1
se corresponde entre las posiciones 9195-9196 de la
secuencia genómica de PM70 de Pasteurella multocida, número
de acceso de Genbank AE006133. El transposón interrumpe un homólogo
del gen PM70, PM0940. En la presente invención se identifica la
secuencia de nucleótidos de PM0940 como SEC ID Nº: 22 y su
secuencia de aminoácidos como SEC ID Nº: 23.
Se identificaron otros genes y proteínas de
bacterias Gram negativas mediante blasts realizados con la SEC ID
Nº: 17.
Mutante
3H2
En la SEC ID Nº: 24 (58 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
El transposón se encuentra directamente en el extremo 3' de esta
secuencia. Esta secuencia tiene dos marcos de lectura abiertos (+1
y -3) que codifican potenciales proteínas más largas. El ORF
descrito aquí está en el marco +1. Se identificó otro gen de
Pasteurellaceae mediante blasts realizados con la SEC ID Nº: 24 y
con su secuencia de aminoácidos codificada (19 aminoácidos).
Encontramos una identidad de 100% sobre 19 aminoácidos con la
proteína PM1951. La localización del transposón en el mutante 3H2 se
corresponde entre las posiciones 9418-9419 de la
secuencia de PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso
de Genbank AE006231 (PM1951, uvrA). En la presente invención se
identifica la secuencia de nucleótidos de PM1951 como SEC ID Nº: 25
y su secuencia de aminoácidos como SEC ID Nº: 26. Se identificaron
otros genes y proteínas de bacterias Gram negativas mediante blasts
realizados con la SEC ID Nº: 26.
Mutante
4D6
En la SEC ID Nº: 27 (54 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
El transposón se encuentra directamente en el extremo 5' de esta
secuencia. Esta secuencia tiene dos marcos de lectura abiertos (+1
y -2) que codifican potenciales proteínas más largas. El ORF
descrito aquí está en el marco +1. La localización del transposón
en el mutante 4D6 se corresponde entre las posiciones
6492-6493 de la secuencia de PM70 de Pasteurella
multocida, número de acceso de Genbank AE006036. El transposón
interrumpe un homólogo del gen PM70, PM0032 o hktE. En la presente
invención se identifica la secuencia de nucleótidos de PM0032 como
SEC ID Nº: 28 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID Nº: 29. Se
identificó otro gen/proteína de bacterias Gram negativas mediante
blasts realizados con la SEC ID Nº: 29. Este es Actinobacillus
actinomycetemcomitans catalasa (números de acceso de Genbank
AF162654 y AAF17882). Encontramos una identidad de 85% sobre 482
aminoácidos entre PM0032 y A. actinomycetemcomitans
catalasa.
HktE es una catalasa.
Mutante 4F4
En la SEC ID Nº: 30 (172 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
El transposón se encuentra directamente en el extremo 3' de esta
secuencia.
Se identificaron otros cuatro genes y proteínas
de Pasteurellaceae mediante blasts realizados con la
secuencia de 57 aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 30.
La localización del transposón en el mutante 4F4
se corresponde entre las posiciones 5272-5273 de la
secuencia genómica de PM70 de Pasteurella multocida, número
de acceso de Genbank AE006116. El transposón interrumpe un homólogo
del gen PM70, PM0776. En la presente invención se identifica la
secuencia de nucleótidos de PM0776 como SEC ID Nº: 31 y su
secuencia de aminoácidos como SEC ID Nº: 32. Estas proteínas son UDP
glucosa deshidrogenasas.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 4F12
En la SEC ID Nº: 33 (226 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
El transposón se encuentra directamente en el extremo 5' de esta
secuencia.
La localización del transposón en el mutante
4F12 se corresponde entre las posiciones 9263-9264
de la secuencia de PM70 de Pasteurella multocida, número de
acceso de Genbank AE006038. El transposón interrumpe un homólogo
del gen PM70, PM0048 o fadR. En la presente invención se identifica
la secuencia de nucleótidos de PM0048 como SEC ID Nº: 34 y su
secuencia de aminoácidos como SEC ID Nº: 35. FadR es un homólogo de
una proteína de E. coli que es un regulador transcripcional
del metabolismo de ácidos grasos, que afecta a muchos genes de la
biosíntesis de ácidos grasos (fab) y de la degradación de ácidos
grasos (fad).
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 4G11
En la SEC ID Nº: 36 (214 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
El transposón se encuentra directamente en el extremo 3' de esta
secuencia.
Se identificó otro gen de Pasteurellaceae
mediante blasts realizados con la SEC ID Nº: 36 y su secuencia de
aminoácidos codificada (70 aminoácidos). Encontramos una identidad
de 100% sobre 70 aminoácidos con la proteína PM1024. La
localización del transposón en el mutante 4G11 se corresponde entre
las posiciones 3532-3533 de la secuencia genómica
de PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso de Genbank
AE006143. El transposón interrumpe un homólogo del gen PM70, PM1024
o HtpG. En la presente invención se identifica la secuencia de
nucleótidos de PM 1024 como SEC ID Nº: 37 y su secuencia de
aminoácidos como SEC ID Nº: 38.
Se identificaron otros genes y proteínas de
bacterias Gram negativas mediante blasts realizados con la SEC ID
Nº: 38.
\newpage
Mutante
5D5
En la SEC ID Nº: 39 (252 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
El transposón se encuentra directamente en el extremo 3' de esta
secuencia.
La localización del transposón en el mutante 5D5
se corresponde entre las posiciones 5695-5696 de la
secuencia genómica de PM70 de Pasteurella multocida, número
de acceso de Genbank AE006188. El transposón interrumpe un homólogo
del gen PM70, PM1517 o PIpE. En la presente invención se identifica
la secuencia de nucleótidos de PM1517 como SEC ID Nº: 40 y su
secuencia de aminoácidos como SEC ID Nº: 41.
Se prevé que PIpE es una lipoproteína de
membrana.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 5F11
En la SEC ID Nº: 42 (546 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
El transposón se encuentra directamente en el extremo 5' de esta
secuencia.
Se localiza un codón de parada en las posiciones
148-150.
La localización del transposón en el mutante
5F11 se corresponde entre las posiciones 572-573 del
genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso de
Genbank AE006150. El transposón interrumpe un homólogo del gen
PM70, PM1087 o NifR3. En la presente invención se identifica la
secuencia de nucleótidos de PM1087 como SEC ID Nº: 43 y su
secuencia de aminoácidos como SEC ID Nº: 44. Se identificó otro
gen/proteína de Pasteurellaceae mediante blasts realizados
con la SEC ID Nº: 44. Éste es HI0979 de Haemophilus
influenzae (números de acceso de Genbank U32778 y AAC22639).
Encontramos una identidad del 78% sobre 332 aminoácidos entre PM1087
y HI0979.
NifR3 es un gen regulador de nitrogenasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 5G9
En la SEC ID Nº: 45 (43 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
El transposón se encuentra directamente en el extremo 3' de esta
secuencia. Esta secuencia tiene tres marcos de lectura abiertos
(+2, +3 y -1) que codifican potenciales proteínas más largas. El ORF
descrito aquí está en el marco +2.
Se identificaron otros cuatro genes y proteínas
de Pasteurellaceae mediante blasts realizados con la
secuencia de 14 aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 45.
La localización del transposón en el mutante 5G9
se corresponde entre las posiciones 573-574 de la
secuencia genómica de PM70 de Pasteurella multocida, número
de acceso de Genbank AE006116. El transposón interrumpe un homólogo
del gen PM70, PM0774 o HyaE. En la presente invención se identifica
la secuencia de nucleótidos de PM0774 como SEC ID Nº: 46 y su
secuencia de aminoácidos como SEC ID Nº: 47. Estos genes están
implicados en la síntesis de la cápsula.
Mutante 6E5
En la SEC ID Nº: 48 (279 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
El transposón se encuentra directamente en el extremo 3' de esta
secuencia.
Se localiza un codón de inicio en las posiciones
169-171.
La localización del transposón en el mutante 6E5
se corresponde entre las posiciones 6673-6674 del
genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso de
Genbank AE006182. El transposón interrumpe un homólogo del gen
PM70, PM1459 o pgtB. En la presente invención se identifica la
secuencia de nucleótidos de PM1459 como SEC ID Nº: 49 y su
secuencia de aminoácidos como SEC ID Nº: 50. PgtB es una proteína
reguladora del transporte de fosfoglicerato.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 6E6
En la SEC ID Nº: 51 (93 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
El transposón se encuentra directamente en el extremo 3' de esta
secuencia.
Se localiza un codón de parada en las posiciones
12-14.
La localización del transposón en el mutante 6E6
se corresponde entre las posiciones 9051-9052 de la
secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número
de acceso de Genbank AE006096. El transposón interrumpe un homólogo
del gen de PM70, PM0605. En la presente invención se identifica la
secuencia de nucleótidos de PM0605 como SEC ID Nº: 52 y su
secuencia de aminoácidos como SEC ID Nº: 53.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 6F12
En la SEC ID Nº: 54 (772 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
El transposón se encuentra directamente en el extremo 5' de esta
secuencia.
Se localiza un codón de inicio en las posiciones
2-4.
La localización del transposón en el mutante
6F12 se corresponde entre las posiciones 5362-5363
de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida,
número de acceso de Genbank AE006192. El transposón interrumpe un
homólogo del gen de PM70, el gen PM1556 o comF. En la presente
invención se identifica la secuencia de nucleótidos de PM1556 como
SEC ID Nº: 55 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID Nº: 56.
ComF es la proteína F de competencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 6G4
En la SEC ID Nº: 57 (700 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
El transposón se encuentra directamente en el extremo 5' de esta
secuencia.
La localización del transposón en el mutante 6G4
se corresponde entre las posiciones 3758-3759 de la
secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número
de acceso de Genbank AE006206. La inserción se encuentra entre los
genes PM1696 y PM1697. Se inserta el transposón entre la región
promotora y el codón de inicio de PM1696.
El codón de inicio de PM1696 se localiza en las
posiciones 26-28 en la secuencia SEC ID Nº:57.
En la presente invención se identifica la
secuencia de nucleótidos de PM1696 como SEC ID Nº: 58 y su
secuencia de aminoácidos como SEC ID Nº: 59.
Se identificaron otros genes y proteínas de
bacterias Gram negativas mediante blasts realizados con la SEC ID
Nº: 59.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante
6H1
Se indica la secuencia de ADN que flanquea el
sitio de inserción del transposón en SEC ID Nº: 60 (188 unidades).
El transposón se encuentra directamente en el extremo 3' de esta
secuencia.
La localización del transposón en el mutante 6H1
se corresponde entre las posiciones 4139-4140 de la
secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número
de acceso de Genbank AE006119. El transposón interrumpe un homólogo
del gen de PM70, el gen PM0806 o speF. En la presente invención se
identifica la secuencia de nucleótidos de PM0806 como SEC ID Nº: 61
y su secuencia de aminoácidos como SEC ID Nº: 62.
Se identificaron otros dos genes de
Pasteurellaceae y Vibrionaceae mediante blasts realizados con la
SEC ID Nº: 62. Estos genes son speF de Haemophilus influenzae
(números de acceso de Genbank U32740 y AAC22248) y ornitina
descarboxilasa de Vibrio cholerae (AE004431 y AAF96957).
Encontramos una identidad de 83% sobre 719 aminoácidos entre PM0806
y speF de H. influenzae.
SpeF es una ornitina decarboxilasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 6H6
En la SEC ID Nº: 63 (101 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
El transposón se encuentra directamente en el extremo 3' de esta
secuencia. Esta secuencia tiene dos marcos de lectura abiertos (+1
y -1) que codifican potenciales proteínas más largas. El ORF
descrito aquí está en el marco +1. La localización del transposón
en el mutante 6H6 se corresponde entre las posiciones
983-984 de la secuencia del genoma de PM70 de
Pasteurella multocida, número de acceso de Genbank AE006155.
El transposón interrumpe un homólogo del gen PM70, PM1138. En la
presente invención se identifica la secuencia de nucleótidos de
PM1138 como SEC ID Nº: 64 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID
Nº: 65.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 7A7
En la SEC ID Nº: 66 (222 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
El transposón se encuentra directamente en el extremo 5' de esta
secuencia.
La localización del transposón en el mutante 7A7
se corresponde entre las posiciones 7853-7854 de la
secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número
de acceso de Genbank AE006170 (en la región intergénica entre
PM1321 y PM1322). El transposón se inserta entre la región de
terminación y el codón de parada de PM1322.
El codón de parada se localiza en las posiciones
25-27 en la secuencia SEC ID Nº: 66. En la presente
invención se identifica la secuencia de nucleótidos de PM1322 como
SEC ID Nº: 67 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID Nº: 68.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 7F8
En la SEC ID Nº: 69 (55 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
El transposón se encuentra directamente en el extremo 3' de esta
secuencia. Esta secuencia tiene tres marcos de lectura abiertos
(+1, +3 y -3) que codifican potenciales proteínas más largas. El ORF
descrito en la presente invención está en el marco +3.
La localización del transposón en el mutante 7F8
se corresponde entre las posiciones 8292-8293 de la
secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida, número
de acceso de Genbank AE006224. El transposón interrumpe un homólogo
del gen PM70, PM1866. En la presente invención se identifica la
secuencia de nucleótidos de PM1866 como SEC ID Nº: 70 y su
secuencia de aminoácidos como SEC ID Nº: 71.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 9C8
En la SEC ID Nº: 72 (598 unidades, transposón en
el extremo 5') y la SEC ID Nº: 73 (561 unidades, transposón en el
extremo 5') se indican las secuencias de ADN que flanquean ambos
lados del sitio de inserción del transposón.
Se localiza un codón de parada en las posiciones
26-28 de SEC ID Nº: 72. Las secuencias SEC ID Nº:
72 y 73 se combinan y se limitan al ORF. Se designa como SEC ID Nº:
74 (575 unidades) a la secuencia resultante.
La localización del transposón en el mutante 9C8
se corresponde entre las posiciones 2224-2225 ó
2210-2211 de la secuencia del genoma de PM70 de
Pasteurella multocida, número de acceso de Genbank AE006132,
posiciones deducidas de SEC ID Nº: 72 y 73 respectivamente. Ambas
posiciones están dentro del gen PM0926 (fimA). En la presente
invención se identifica la secuencia de nucleótidos de PM0926 como
SEC ID Nº: 75 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID Nº: 76.
Se identificó otro gen/proteína de
Pasteurellaceae mediante blasts realizados con la SEC ID Nº: 76.
Éste es FimA de Haemophilus influenzae (números de acceso de
Genbank AF053125 y AAC08991). Encontramos una identidad de 77%
sobre 171 aminoácidos entre PM0926 y FimA de H.
influenzae.
FimA es una adhesina, una proteína fimbrial.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 10G11
En la SEC ID Nº: 77 (70 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
El transposón se encuentra directamente en el extremo 5' de esta
secuencia. Se localiza un codón de inicio en las posiciones
62-64.
La localización del transposón en el mutante
10G11 se corresponde entre las posiciones 2938-2939
de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida,
número de acceso de Genbank AE006056. El transposón interrumpe un
homólogo de gen de PM70, PM0220 (rpL31_1). En la presente invención
se identifica la secuencia de nucleótidos de PM0220 como SEC ID Nº:
78 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID Nº: 79.
RpL31_1 es una proteína ribosomal 50S.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante 11E8
En la SEC ID Nº: 80 (506 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
El transposón se encuentra directamente en el extremo 5' de esta
secuencia.
Se localiza un codón de inicio en las posiciones
195-197 de SEC ID Nº: 80.
La localización del transposón en el mutante
11E8 se corresponde entre las posiciones 282-283 de
la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida,
número de acceso de Genbank AE006085. El transposón interrumpe un
homólogo del gen PM70, PM0488. En la presente invención se
identifica la secuencia de nucleótidos de PM0488 como SEC ID Nº: 81
y su secuencia de aminoácidos como SEC ID Nº: 82.
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Mutant 12A1
En la SEC ID Nº: 83 (243 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
El transposón se encuentra directamente en el extremo 3' de esta
secuencia.
Se identificó otro gen de Pasteurellaceae
mediante blasts realizados con la SEC ID Nº: 83 y su secuencia de
aminoácidos codificada (81 aminoácidos). Encontramos una identidad
de 100% sobre 81 aminoácidos con la proteína PM0063. La
localización del transposón en el mutante 12A1 se corresponde entre
las posiciones 2880-2881 de la secuencia del genoma
de PM70 de Pasteurella multocida, número de acceso de Genbank
AE006042. El transposón interrumpe un homólogo del gen de PM70, gen
PM0063 o lepA. En la presente invención se identifica la secuencia
de nucleótidos de PM0063 como SEC ID Nº: 84 y su secuencia de
aminoácidos como SEC ID Nº: 85. Se identificaron otros genes y
proteínas de bacterias Gram negativas mediante blasts realizados con
la SEC ID Nº: 85.
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Mutante
12B3
En la SEC ID Nº: 86 (147 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
El transposón se encuentra directamente en el extremo 3' de esta
secuencia.
La localización del transposón en el mutante
12B3 se corresponde entre las posiciones 4028-4029
de la secuencia del genoma de PM70 de Pasteurella multocida,
número de acceso de Genbank AE006152. El transposón interrumpe un
homólogo del gen PM70, gen PM1112 o deaD. En la presente invención
se identifica la secuencia de nucleótidos de PM1112 como SEC ID Nº:
87 y su secuencia de aminoácidos como SEC ID Nº: 88.
Se identificó otro gen/proteína de
Pasteurellaceae mediante blasts realizados con la SEC ID Nº: 88.
Éste es HI0231 de Haemophilus influenzae (números de acceso
de Genbank U32709 y AAC21900). Encontramos una identidad de 80%
sobre 605 aminoácidos entre PM1112 y HI0231.
DeaD es una ARN helicasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Mutant 13E1
En la SEC ID Nº: 89 (187 unidades) se indica la
secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción del transposón.
El transposón se encuentra directamente en el extremo 3' de esta
secuencia. Esta secuencia tiene dos marcos de lectura abiertos (+1
y -3) que codifican potenciales proteínas más largas. El ORF
descrito aquí está en el marco -3. La localización del transposón
en el mutante 13E1 se corresponde entre las posiciones
2173-2174 de la secuencia del genoma de PM70 de
Pasteurella multocida, número de acceso de Genbank AE006138
(PM0989). En la presente invención se identifica la secuencia de
nucleótidos de PM0989 como SEC ID Nº: 90 y su secuencia de
aminoácidos como SEC ID Nº: 91.
Se identificó otro gen/proteína de
Pasteurellaceae mediante blasts realizados con la SEC ID Nº: 91.
Éste es HI0325 de Haemophilus influenzae (números de acceso
de Genbank U32717 y AAC21988). Encontramos una identidad de 79%
sobre 414 aminoácidos entre PM0989 y HI0325.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
En primer lugar, el gen diana más las secuencias
de ADN flanqueantes se amplifican mediante PCR utilizando
polimerasa de alta fidelidad y se clonan en un vector de clonación
adecuado. Los cebadores de PCR se diseñan de manera que eliminan el
gen cuando se utilizan en PCR inversa para generar una construcción
inicial. Los cebadores de PCR pueden contener un sitio XbaI para
introducir un nuevo sitio de restricción y, de este modo,
proporcionar un marcador para la eliminación del gen. La
construcción por eliminación se transfiere a continuación a un
vector suicida pCVD442 o equivalente (Donnenberg et al.,
Infection and Immunity, 1991, 59: 4310-4317) para
transferirse al cromosoma de Pasteurella. Esta construcción se
introduce en la cepa deseada mediante electroporación o conjugación
y se seleccionan los recombinantes que contienen el plásmido
integrado en el cromosoma en el sitio homólogo (merodiploides)
utilizando un marcador de resistencia a antibiótico presente en el
plásmido. El plásmido pCVD442 requiere la proteína Pir para la
replicación. Esta proteína es codificada por el gen pir, el cual
está presente como fago lisógeno de lambda en la cepa dadora SM10
lambda pir, pero no en la P. multocida receptora. Por tanto,
el plásmido pCVD442 no se replica en la cepa de P. multocida
dadora: las colonias resistentes a antibiótico se obtienen por
tanto únicamente si el plásmido se integra en el cromosoma. Este
vector suicida también contiene el gen sacB que codifica la enzima
levan sacarosa, la cual es tóxica para la mayoría de bacterias Gram
negativas en presencia de sacarosa. Por lo tanto, la selección de
sacarosa se puede utilizar como una
contra-selección para aislar colonias cuando ha
tenido lugar una segunda recombinación, dando lugar a una pérdida
del plásmido del cromosoma. Esta segunda recombinación puede dar
lugar a dos resultados, la regeneración del alelo de tipo natural o
la generación de un mutante por eliminación. Las colonias que
contienen la mutación por eliminación se identifican mediante una
PCR de colonias.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Los mutantes atenuados por eliminación obtenidos
en el ejemplo 5 se cultivaron en medio de cultivo CDM (Hu et
al., Infection and Immunity 1986, 804-810) bajo
condiciones de agitación durante 24 a 48 horas.
EL cultivo se recogió cuando para el
crecimiento, y a continuación se midió la densidad óptica (DO) o el
pH.
La concentración bacteriana se determinó por
densidad óptica y cuando fue necesario la concentración se ajustó
hasta una concentración final de 10^{9} CFU por ml con medio de
cultivo nuevo.
La eficacia de la vacuna se analizó en pavos de
3 semanas de vida mediante vacunación y estimulación.
Antes de la vacunación se comprobó la ausencia
de anticuerpos de Pasteurella en los pavos mediante ELISA de
muestras de sangre.
Se vacunó un primer grupo de pavos mediante
inyección de 10^{8} CFU en 0,1 ml por vía ocular.
Un segundo grupo se mantuvo sin vacunar (grupo
de control).
Todos los animales se estimularon en D21 o D23
con la cepa P-1059 de P. multocida por vía
ocular (10^{8} CFU en 0,1 ml por animal).
La mortalidad se observó cada día hasta D25.
Se observó una mortalidad inferior en los
animales vacunados en comparación con los controles.
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<213> Pasteurella multocida
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> ADN
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<213> Pasteurella multocida
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<220>
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<221> características diversas
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<223> A o C o G o T
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<220>
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<220>
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> A o C o G o T
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<222> (507)..(507)
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<220>
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<211> 1983
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 660
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<212> PRT
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<213> Pasteurella multocida
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 51
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<212> ADN
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<213> Pasteurella multocida
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pasteurella multocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pasteurella multocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 772
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pasteurella multocida
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
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<222> (537)..(537)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (540)..(540)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (545)..(545)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (581)..(581)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (613)..(614)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (665)..(665)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (668)..(668)
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<223> A o C o G o T
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<220>
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<221> características diversas
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
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<223> A o C o G o T
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<220>
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<220>
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (623)..(623)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
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<222> (625)..(625)
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
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<223> A o C o G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> A o C o G o T
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
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<223> A o C o G o T
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
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<223> A o C o G o T
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (661)..(661)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> A o C o G o T
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
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<222> (666)..(666)
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<223> A o C o G o T
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
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<223> A o C o G o T
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (673)..(674)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (678)..(678)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
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<222> (682)..(682)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
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<222> (686)..(687)
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<223> A o C o G o T
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
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<222> (694)..(694)
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<223> A o C o G o T
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
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<222> (696)..(697)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (699)..(700)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<212> PRT
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<212> ADN
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<400> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 720
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<400> 62
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Pasteurella multocida
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 65
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<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 222
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<212> ADN
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<213> Pasteurella multocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
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<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 831
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pasteurella multocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 276
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pasteurella multocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pasteurella multocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Pasteurella multocida
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Pasteurella multocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (412)..(412)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (451)..(451)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (471)..(471)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (503)..(503)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (546)..(546)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (562)..(564)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (576)..(576)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (588)..(590)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (595)..(595)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o C o G o T.
\newpage
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<400> 72
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<210> 73
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Pasteurella multocida
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (560)..(561)
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<223> A o C o G o T
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<212> ADN
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<213> Pasteurella multocida
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<220>
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<221> características diversas
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<222> (574)..(575)
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<223> A o C o a o T
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\newpage
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<212> PRT
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<213> Pasteurella multocida
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<212> ADN
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<213> Pasteurella multocida
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\newpage
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<211> 1833
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<213> Pasteurella multocida
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<400> 87
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<211> 610
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<212> PRT
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<213> Pasteurella multocida
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<400> 88
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<211> 187
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<211> 1359
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<213> Pasteurella multocida
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<400> 90
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<213> Pasteurella multocida
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (12)
1. Mutante de una bacteria Gram negativa, en el
que dicha bacteria tiene una mutación en una secuencia de
nucleótidos que codifica originalmente para un polipéptido que tiene
una identidad que es igual o superior al 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó
99% con una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de
nucleótidos SEC ID No. 37, dando lugar dicha mutación a una
virulencia atenuada de la bacteria.
2. Mutante según la reivindicación 1, en el que
la bacteria es una Pasteurellaceae.
3. Mutante según la reivindicación 2, en el que
la bacteria se elige del grupo que consiste en Pasteurella
multocida, Pasteurella haemolytica, Pasteurella
anatipestifer y Actinobacillus pleuropneumoniae.
4. Mutante según la reivindicación 3, en el que
la bacteria es Pasteurella multocida.
5. Mutante según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la mutación es una eliminación en
la secuencia de nucleótidos o una inserción en la misma o una
sustitución de ácidos nucleicos.
6. Mutante según la reivindicación 5, en el que
la mutación es la eliminación de toda la secuencia de
nucleótidos.
7. Mutante según la reivindicación 5, en el que
la inserción se realiza entre los nucleótidos
1411-1412 en la SEC ID No. 37.
8. Mutante según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, que comprende una secuencia de ácidos
nucleicos heteróloga que codifica para un inmunógeno de un agente
patogénico viral, parasitario o bacteriano, para una proteína
terapéutica, para un alérgeno, para un factor de crecimiento o para
una citoquina.
9. Composición inmunogénica que comprende un
mutante atenuado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y
un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
10. Composición inmunogénica según la
reivindicación 9, que comprende además un adyuvante.
11. Vacuna que comprende un mutante atenuado
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y un diluyente,
portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
12. Vacuna según la reivindicación 11, que
comprende además un adyuvante.
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