ES2362041T3 - Composiciones de vacunas antibacterianas. - Google Patents

Abstract

Una bacteria Pasteurella atenuada seleccionada entre Mannheimia haemolytica, Actinobacillus pleuropneumoniae y Haemophilus somnus, comprendiendo la bacteria una mutación en un gen representado por una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido atpG que comprende una secuencia aminoacídica al menos el 80% idéntica a la SEQ ID NO: 167, en la que la atenuación de la bacteria está causada por la mutación.

Description

Composiciones de vacunas antibacterianas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a la identificación de genes responsables de la virulencia de bacterias de la familia Pasteurellaceae, permitiendo de este modo la producción de nuevas cepas mutantes atenuadas útiles en vacunas y para la identificación de nuevos agentes antibacterianos que se dirigen a los genes virulentos y a sus productos.

Antecedentes de la invención

La familia Pasteurellaceae abarca varios patógenos importantes que infectan a una amplia variedad de animales. Además de P. multocida, son miembros destacados de la familia Pasteurella (Mannheimia) haemolytica, Actinobacillus pleuropneumoniae y Haemophilus somnus. P. multocida es un cocobacilo inmóvil gramnegativo que se encuentra en la flora normal de muchos animales silvestres y domésticos, y se sabe que es el causante enfermedades en numerosas especies animales en todo el mundo. [Biberstein, En M. Kilian, W. Frederickson y E. L. Biberstein (ed.). Haemophilus, Pasteurella, and Actinobacillus. Academic Press, Londres, pág. 61-73 (1981)]. Entre las manifestaciones de la enfermedad tras la infección se incluyen septicemias, bronconeumonías, rinitis e infecciones de heridas [Revisado en Shewen, y col., En C. L. Gyles y C. O. Thoen (ed.), Pathogenesis of Bacterial Infections in Animals Iowa State University Press, Ames, pág. 216-225 (1993), incorporado en este documento como referencia].

La infección por P. multocida generalmente es el resultado de la invasión durante periodos de estrés, aunque la transmisión también puede producirse por exposición a aerosol o por contacto, o mediante vectores como pulgas y garrapatas. En las aves de corral, la infección por P. multocida da lugar a una septicemia de aguda a muy aguda, especialmente prevalente en pavos de corral y aves acuáticas silvestres en condiciones de estrés asociadas con hacinamiento, puesta, cambio de pluma o variación climatológica extrema. En el ganado, sigue a la infección una septicemia hemorrágica similar y se manifiestan afecciones como fiebre alta y depresión, seguidas generalmente de una muerte rápida. La transmisión es más probable a través del contacto por aerosol, aunque la infección también puede aparecer durante los periodos de variación climatológica significativa. En conejos, la infección se produce con rinitis purulenta recurrente, generalmente seguida de conjuntivitis, otitis media, sinusitis, abscesos subcutáneos y bronconeumonía crónica. En infecciones graves, la mortalidad del conejo se produce por bronconeumonía fibrinosa aguda, septicemia y endotoxemia. Los estados patológicos surgen normalmente durante periodos de estrés. En cerdos, los estados patológicos de P. multocida normales incluyen rinitis atrófica y neumonía bacteriana. Se han detectado también afecciones de neumonía similares en perros, gatos, cabras y ovejas. P. multocida se detecta normalmente en la flora bucal de muchos animales y es, por tanto, un contaminante frecuente en heridas por mordeduras y arañazos.

Las cepas de P. multocida normalmente se designan por el serogrupo capsular y el serotipo somático. Se distinguen cinco serogrupos capsulares (A, B, D, E y F) y 16 serotipos somáticos por la expresión de antígenos termoestables característicos. La mayoría de las cepas son específicas del hospedador y raramente infectan a más de uno o dos animales. La existencia de serotipos diferentes representa un problema para la vacunación debido a que la célula bacteriana completa muerta tradicional normalmente proporciona sólo protección específica de serotipo. Sin embargo, se ha demostrado que la infección natural con un serotipo puede producir una protección inmunológica frente a serotipos múltiples [Shewen, y col., En C. L. Gyles y C. O. Thoen (Ed.), Pathogenesis of Bacterial Infections in Animals. Iowa State University Press, Ames, pág. 216-225 (1993)] y la protección cruzada también puede estimularse usando bacterias inactivadas crecidas in vivo [Rimler, y col., Am J Vet Res. 42:2117-2121 (1981)]. Se ha utilizado como vacuna una cepa mutante espontánea viva de P. multocida y se ha demostrado que estimula una fuerte respuesta inmunitaria [Davis, Poultry Digest, 20:430-434 (1987), Schlink, y col., Avian Dis. 31(1):13-21 (1987)]. Sin embargo, se ha demostrado que esta cepa atenuada revierte a un estado virulento o causa mortalidad si se estresa al receptor de la vacuna [Davis, Poultry Digest. 20:430-434 (1987), Schlink, y col., Avian Dis, 31 (1):13-21 (1987)].

Otro miembro de la familia Pasteurella, A. pleuropneumoniae muestra una especificidad por el hospedador estricta para cerdos y es el agente causal de la pleuroneumonía porcina altamente contagiosa. La infección normalmente surge en condiciones de reproducción intensiva, y se considera que ocurre mediante un modo directo de transmisión. La enfermedad es a menudo mortal y, en consecuencia, produce graves pérdidas económicas para la industria de la cría del cerdo. La infección por A. pleuropneumoniae puede ser crónica o aguda y la infección se caracteriza por una bronconeumonía necrótica hemorrágica acompañada de pleuritis fibrinosa. Hasta la fecha, la virulencia bacteriana se ha atribuido a proteínas estructurales, incluyendo polisacáridos capsulares específicos de serotipo, lipopolisacáridos y proteínas superficiales, así como toxinas citolíticas extracelulares. A pesar de la purificación y, en algunas ocasiones clonación, de estos factores de virulencia, no se conoce bien la función exacta de estos factores de virulencia en una infección de A. pleuropneumoniae.

Se han identificado doce serotipos de A. pleuropneumoniae basándose en las diferencias antigénicas en los polisacáridos capsulares y en la producción de toxinas extracelulares. Los serotipos 1, 5 y 7 son los más importantes para la infección por A. pleuropneumoniae en Estados Unidos, mientras que los serotipos 1, 2, 5, 7 y 9 son predominantes en Europa. Hay al menos tres toxinas extracelulares significativas de A. pleuropneumoniae que son miembros de la familia de hemolisinas y se denominan toxinas RTX. Las toxinas RTX son producidas por muchas bacterias gramnegativas, incluyendo E. coli, Proteus vulgaris y Pasteurella haemolytica y, generalmente, las proteínas comparten características estructurales y funcionales. Sin embargo, las toxinas de los diversos serotipos difieren en la especificidad del hospedador, células diana y actividades biológicas.

Las principales toxinas RTX de A. pleuropneumoniae son ApxI, ApxII y ApxIII. ApxI y ApxII tienen actividad hemolítica, siendo ApxI más potente. ApxIII no muestra actividad hemolítica, pero es citotóxica para macrófagos y neutrófilos alveolares. La mayoría de los serotipos de A. pleuropneumoniae produce dos de estas tres toxinas. Por ejemplo, los serotipos 1, 5, 9 y 11 expresan ApxI y ApxII, y los serotipos 2, 3, 4, 6 y 8 expresan ApxII y ApxIII. Sin embargo, el serotipo 10 produce sólo ApxI y los serotipos 7 y 12 expresan sólo ApxII. Aquellos serotipos de A. pleuropneumoniae que producen tanto ApxI como ApxII son las cepas más virulentas de la bacteria.

Se demostró que las toxinas Apx son factores de virulencia en modelos murinos y de infección en cerdos usando bacterias naturales mutadas aleatoriamente [Tascon, y col., Mol. Microbiol. 14:207-216 (1994)] También se han generado otros mutantes de A. pleuropneumoniae con mutagénesis dirigida para inactivar el gen que codifica la proteína de virulencia de la membrana externa AopA [Mulks y Buysee, Gene 165:61-66 (1995)].

Se ha demostrado la existencia de al menos once serotipos (1, 2, 5-9, 12-14 y 16) en Mannheimia [Pasteurella] haemolytica [Angen, y col., Vet Microbiol 65(4):283-90 (1999)], una especie de Pasteurellaceae que es responsable de epidemias graves de neumonía aguda en corderos, terneros y cabras recién nacidos, de destete, en crecimiento y adultos [Ackermann, y col., Microbes Infect 2(9):1079-88 (2000)]. El transporte, las infecciones víricas, el hacinamiento y otras condiciones estresantes predisponen a los animales a infecciones por M. haemolytica [Ackermann, y col., supra]. Se considera que la leucotoxina (Lkt) de M. haemolytica tiene una función significativa en la patogénesis, causando lisis celular y apoptosis que inducen la patología pulmonar característica de la fiebre del transporte bovina [Highlander, y col., Infect Immun 68(7):3916-22 (2000)] así como una lesión pulmonar en la pasteurelosis neumónica bovina [Jeyaseelan, y col., Microb Pathog 30(2):59-69 (2001)]. La Lkt es una exotoxina formadora de poros que tiene la propiedad exclusiva de inducir citólisis sólo en leucocitos y plaquetas de rumiantes [Jeyaseelan, y col., (2001), supra]. La citólisis de muchos tipos de células está mediada por el ácido araquidónico (AA) y su generación por fosfolipasa está regulada por receptores conjugados a la proteína G [Jeyaseelan, y col., (2001) supra]. Estudios recientes indican que la Lkt de M. haemolytica se une a CD18 bovino, subunidad común de todas las integrinas beta2 [Jeyaseelan, y col., Infect Immun 68(1):72-9 (2000)]. También se ha visto que LFA-1 es un receptor de Lkt, la unión de Lkt a LFA-1 no es específica de la célula diana, la unión de Lkt a la LFA-1 bovina se correlaciona con la elevación del calcio y con citólisis, y la expresión de LFA-1 bovina se correlaciona con la magnitud de la citólisis inducida por Lkt en la célula diana [Jeyaseelan, y col., Infect Immun 68 1):72-9 (2000)].

En un intento por producir composiciones de vacuna, las células bacterianas completas muertas tradicionales han proporcionado sólo protección específica de serotipo [MacInnes y Smart, supra], sin embargo, se ha demostrado que la infección natural con un serotipo altamente virulento puede estimular una fuerte inmunidad protectora frente a serotipos múltiples [Nielsen, Nord Vet Med, 31:407-13 (1979); Nielsen, Nord Vet Med. 36:221-234 (1984); Nielsen, Can J Vet Res. 29:580-582 (1988), Nielsen, ACTA Vet Scand. 5:80-89 (1994)]. Una cepa de vacuna atenuada definida que produce una forma inactiva de la toxina ApxII se ha mostrado prometedora para la protección cruzada en cerdos [Prideaux y col., Infection & Immunity 67: 1962-1966 (1999)], mientras que otros mutantes vivos atenuados indefinidos también se han mostrado prometedores [Inzana, y col., Infect Immun. 61:1682-6 (1993); Paltineanu, y col., En International Pig Veterinary Society, 1992, pág. 214, Utrera, y col., En International Pig Veterinary Society, 1992, pág. 213].

Debido a los problemas asociados con las formulaciones de vacunas que comprenden cepas bacterianas con mutaciones espontáneas no definidas, existe la necesidad en la técnica de la construcción racional de cepas bacterianas vivas atenuadas para su uso en vacunas que estimulen de forma segura la inmunidad protectora frente a serotipos de Pasteurellaceae homólogos y heterólogos. Además existe la necesidad de identificar cepas bacterianas atenuadas y genes necesarios para la virulencia bacteriana, facilitando de este modo el desarrollo de procedimientos para identificar agentes antibacterianos.

Fuller y col., Microbial Pathogens 29:25-38 (2000), describen la producción de P. multocida atenuada usando la inserción de transposones en los genes de virulencia, incluyendo el gen atpG.

May y col., en la Base de datos del EMBL (en línea) (10 de febrero de 2001), nº de acceso a la base de datos, AE0060604, describen el polinucleótido que codifica el producto del gen atpG de P. multocida.

Resumen de la invención

Un primer aspecto de la presente invención es una bacteria Pasteurella atenuada seleccionada entre Mannheimia haemolytica, Actinobacillus pleuropneumoniae y Haemophilus somnus, comprendiendo la bacteria una mutación en un gen representado por una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido atpG que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 80% idéntica con la SEQ ID NO: 167, en la que la atenuación de la bacteria está causa por la mutación.

Un segundo aspecto de la invención es una bacteria Pasteurella atenuada seleccionada entre Mannheimia haemolytica, Actinobacillus pleuropneumoniae y Haemophilus somnus, comprendiendo la bacteria una mutación en una secuencia polipeptídica que codifica un polipéptido atpG, en el que la secuencia polinucleotídica se hibrida con el complemento de la SEQ ID NO: 166 en condiciones rigurosas, comprendiendo las condiciones un lavado final en tampón que comprende SSCx2/SDS al 0,1% a de 35ºC a 45ºC.

Un tercer aspecto de la invención es una composición inmunógena que comprende una bacteria de la invención.

Un cuarto aspecto de la invención es una composición de vacuna que comprende una composición inmunógena de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Un quinto aspecto de la invención es un polinucleótido purificado y aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 167, p. ej., como ADN.

Un sexto aspecto de la invención es un vector que comprende dicho ADN.

Un séptimo aspecto de la invención es una célula hospedadora transformada o transfectada de forma estable con el ADN en una forma que permita la expresión del polipéptido codificado en la célula hospedadora.

Un octavo aspecto de la invención es un polipéptido purificado que comprende la SEQ ID NO: 167.

En una bacteria atenuada de la invención, la mutación inhibe o suprime la expresión y/o actividad biológica de un producto génico codificado (es decir, el polipéptido codificado por un gen), dando lugar la mutación funcional a una virulencia atenuada de la cepa bacteriana. Las mutaciones funcionales que modulan (es decir, aumentan o disminuyen) la expresión y/o actividad biológica de un producto génico incluyen inserciones o deleciones en la región que codifica la proteína del propio gen o en secuencias responsables del control de la expresión génica, o implicadas en la misma. Los mutantes de deleción incluyen aquellos en los que se deleciona toda o parte de una secuencia génica específica. Para que una cepa modificada sea eficaz en una formulación de vacuna, la atenuación debe ser suficientemente significativa como para prevenir que el patógeno evoque varios síntomas clínicos, pero también suficientemente insignificante como para permitir una replicación y crecimiento limitados de la bacteria en el hospedador.

Los polinucleótidos de la invención incluyen ADN, como el ADN complementario, ADN genómico que incluye ADN complementario o no codificante y ADN completa o parcialmente sintético; ARN incluyendo hebras codificantes y no codificantes y ácidos nucleicos peptídicos como los descritos, por ejemplo, en Corey TIBTECH 15:224-229 (1997).

Un polipéptido codificado por un polinucleótido de la invención puede estar producido por el crecimiento de una célula hospedadora de la invención en condiciones que permitan, y preferiblemente promuevan, la expresión de un producto génico codificado por el polinucleótido, y el aislamiento del producto génico a partir de la célula hospedadora o del medio de su crecimiento.

Descripción detallada de la invención

Los "genes de virulencia", según se usa en este documento, son genes cuyas funciones o productos son necesarios para el establecimiento y/o mantenimiento eficaz de la infección bacteriana en un animal hospedador. Por tanto, los genes de virulencia y/o las proteínas que codifican están implicados en la patogénesis del organismo hospedador, pero pueden no ser necesarios para su crecimiento.

La "mutagénesis de marcaje (MM)", como se usa en este documento, es un procedimiento generalmente descrito en la publicación de patente internacional Nº WO 96/17951 e incluye, por ejemplo, un procedimiento para identificar los genes bacterianos necesarios para la virulencia en un modelo murino de bacteriemia. En este procedimiento, se producen cepas bacterianas que tienen cada una mutación aleatoria en el genoma utilizando la integración de un transposón; cada mutación por inserción lleva una etiqueta de marcaje de ADN diferente que permite diferenciar unos mutantes de otros. Las etiquetas comprenden regiones centrales variables de 40 pb flanqueadas por "brazos" invariables de 20 pb que permiten que las porciones centrales se amplifiquen conjuntamente mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las cepas mutantes etiquetadas se reúnen en placas de microvaloración, a continuación, se combinan para formar la "mezcla de inoculación" para estudios de infección. En un tiempo apropiado tras la inoculación, las bacterias se aíslan del animal y se mezclan para formar la "mezcla recuperada". Las etiquetas en la mezcla recuperada y las etiquetas en la mezcla de inoculación se amplifican por separado, se marcan y, a continuación, se usan para incubar filtros expuestos con todas las diferentes etiquetas que representan a los mutantes del inóculo. Las cepas mutantes con virulencia atenuada son aquellas que no pueden recuperarse del animal infectado, es decir, cepas con etiquetas que proporcionan señales de hibridación cuando se incuban con etiquetas de la mezcla de inoculación pero no cuando se incuban con etiquetas de la mezcla recuperada. En una variación de este procedimiento, pueden usarse procedimientos de detección no radiactivos como la quimioluminiscencia.

La mutagénesis de marcaje permite una selección simultánea de un número mayor de cepas mutantes de inserción en un único animal para la pérdida de virulencia. El cribado de diecinueve mezclas de cepas mutantes de P. multocida permitió la identificación de más de 60 cepas con virulencia reducida, en muchas de las cuales se confirmó la virulencia atenuada mediante la determinación posterior de una DL_{50} aproximada para los mutantes individuales. El cribado de los mutantes de A. pleuropneumoniae dio lugar a la identificación de más de 100 cepas que tenían mutaciones en 35 genes diferentes. De estos, las mutaciones en 22 genes dan lugar a cepas de A. pleuropneumoniae significativamente atenuadas. La secuencia de nucleótidos de la fase de lectura abierta interrumpida por la inserción del transposón se determinó secuenciando ambas hebras y se dedujo la secuencia de aminoácidos codificada. Se determinó la novedad tanto de las secuencias del polinucleótido como de aminoácidos mediante comparación de las secuencias con las secuencias de las bases de datos de ADN y proteínas. El conocimiento de los genes de virulencia en estas especies permitió la identificación de especies homólogas en P. (Mannheimia) haemolytica.

La identificación de genes de virulencia bacteriana y, más especialmente de P. multocida, A. pleuropneumoniae y P. (Mannheimia) haemolytica, proporciona microorganismos que muestran virulencia reducida (es decir, cepas atenuadas) que son útiles en vacunas. Entre estos microorganismos se incluyen mutantes de la familia Pasteurellaceae que contienen al menos una mutación funcional que inhibe un gen representado por las SEQ ID NO: 166. Los expertos en la materia comprenderán que puede aparecer una "mutación funcional" en las regiones codificantes de la proteína de un gen de la invención, así como en regiones reguladores que modulan la transcripción del ARN del gen de virulencia.

Los expertos en la materia también apreciarán que entre las cepas de P. multocida, A. pleuropneumoniae y P. (Mannheimia) haemolytica atenuadas de la invención se incluyen aquellas que tienen más de una mutación funcional. Más de una mutación puede dar lugar a un grado de atenuación aditivo o sinérgico. Pueden prepararse mutaciones múltiples mediante diseño, o pueden aparecen de forma fortuita a partir de una deleción incluso originalmente pretendida para introducir una mutación única. Un ejemplo de una cepa atenuada con deleciones múltiples es una cepa de Salmonella typhimurium en la que se han delecionado funcionalmente los genes cya y crp. Esta cepa mutante de S. typhimurium se ha mostrado prometedora como vacuna viva.

La identificación de genes de virulencia en P. multocida, A. pleuropneumoniae y P. (Mannheimia) haemolytica puede proporcionar información con respecto a genes similares en otras especies patógenas. Como ejemplo, la identificación del gen aroA lleva a la identificación de genes conservados en diversos patógenos, como Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, Salmonella dublin, Salmonella gallanerum, Bordella pertussis, Yersinia entericolitica, Neisseria gonorrhoeae y Bacillus anthracis, En muchas de estas especies, se ha demostrado que las cepas bacterianas atenuadas que llevan mutaciones en el gen aroA son eficaces para las formulaciones de vacunas. Usando las secuencias de genes de virulencia identificados en P. multocida, pueden identificarse genes similares u homólogos en otros organismos, especialmente dentro de la familia de Pasteurella, así como en A. pleuropneumoniae, P. (Mannheimia) haemolytica y Haemophilus somnus. Asimismo, la identificación de genes de virulencia de A. pleuropneumoniae puede permitir la identificación de genes relacionados en otros organismos. La hibridación de tipo Southern, usando los genes de P. multocida, A. pleuropneumoniae y P. (Mannheimia) haemolytica como sondas, puede identificar estos genes relacionados en bibliotecas cromosómicas derivadas de otros organismos. Alternativamente, la PCR puede ser igualmente eficaz para la identificación de genes en las demarcaciones de especies. Aún como otra alternativa, también puede usarse la complementación de, por ejemplo, un mutante de P. multocida con una biblioteca cromosómica de otras especies para identificar genes que tienen la misma actividad de virulencia, o una actividad relacionada. Por tanto, la identificación de genes de virulencia relacionados puede llevar a la producción de una cepa atenuada del otro organismo que puede ser útil como otra formulación de vacuna. Entre los ejemplos de genes de P. multocida que se ha demostrado pueden encontrarse en otras especies (p. ej., P. (Mannheimia) haemolytica, A. pleuropneumoniae y H. somnus) se incluyen los genes exbB, atpG, pnp, guaB y yjgF.

Las cepas de P. multocida atenuadas identificadas usando MM son mutantes de inserción en los que un gen de virulencia se ha convertido en no funcional mediante la inserción de secuencias transposón en la fase de lectura abierta o en secuencias de ADN reguladoras. Estos mutantes de inserción siguen conteniendo toda la información genética necesaria para la virulencia bacteriana y, posiblemente, pueden revertirse a un estado patogénico mediante la deleción del transposón insertado. Por tanto, durante la preparación de una formulación de vacuna, es deseable tomar la información recogida de una cepa atenuada y crear una cepa mutante de deleción en la que se elimine parte, la mayoría o toda la secuencia del gen de virulencia excluyendo, por tanto, la posibilidad de que la bacteria revierta a su estado de virulencia.

Se espera que las propiedades para vacuna de un mutante de inserción atenuado identificado usando MM sean las mismas o similares a las de una bacteria portadora de una deleción en el mismo gen. Sin embargo, es posible que una mutación por inserción pueda ejercer efectos "polares" sobre las secuencias génicas colindantes y, como resultado, el mutante de inserción pueda poseer características diferentes a las de una cepa mutante con una deleción en la misma secuencia génica. Pueden construirse mutantes de deleción usando cualquiera de las diversas técnicas bien conocidas y utilizadas de forma rutinaria en la técnica.

En un ejemplo, puede emplearse una estrategia usando marcadores contraseleccionables, que se han utilizado normalmente para la deleción de genes en muchas bacterias. Para revisión, véase, por ejemplo, Reyrat, y col., Infection and Immunity 66:4011-4017 (1998), incorporada a este documento por referencia. En esta técnica, se emplea a menudo una estrategia de selección doble, en la que se construye un plásmido que codifica un marcador seleccionable y un marcador contraseleccionable, con secuencias de ADN flanqueantes derivadas de ambos lados de la deleción deseada. El marcador seleccionable se usa para seleccionar bacterias en las que el plásmido se ha integrado en el genoma en la localización y forma apropiadas. El marcador contraseleccionable se usa para seleccionar el porcentaje muy pequeño de bacterias en las que se ha eliminado espontáneamente el plásmido integrado. Entonces, una fracción de estas bacterias contendrá sólo la deleción deseada sin otro ADN extraño presente. La clave del uso de esta técnica es la disponibilidad de un marcador contraseleccionable adecuado.

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En otra técnica se usa el sistema cre-lox para la recombinación de ADN específica de sitio. El sistema consta de secuencias lox de 34 pares de bases que son reconocidas por el gen de la recombinasa cre bacteriana. Si se presentan sitios lox en el ADN en una orientación apropiada, el ADN flanqueado por los sitios lox será escindido por la recombinasa cre, dando lugar a la deleción de todas las secuencias, excepto una copia restante de la secuencia lox. Usando técnicas de recombinación convencionales, es posible delecionar el gen objetivo de interés en el genoma de P. multocida, A. pleuropneumoniae o P. (Mannheimia) haemolytica y sustituirlo por un marcador seleccionable (p. ej., un gen que codifica para la resistencia a kanamicina) que esté flanqueado por los sitios lox. La expresión transitoria (mediante electroporación de un plásmido suicida que contiene el gen cre bajo el control de un promotor que funciona en P. multocida, A. pleuropneumoniae o P. (Mannheimia) haemolytica) de la recombinasa cre debería dar lugar a la eliminación eficaz del marcador flanqueado por lox. Este proceso podría dar lugar a un mutante que contenga la mutación por deleción deseada y una copia de las secuencias lox.

En otro enfoque, es posible sustituir directamente una secuencia de deleción deseada en el genoma de P. multocida, A. pleuropneumoniae o P. (Mannheimia) haemolytica, con un gen marcador, como la proteína fluorescente verde (GFP), \beta-galactosidasa o luciferasa. En esta técnica, los segmentos de ADN que flanquean una deleción deseada se preparan mediante PCR y se clonan en un vector suicida (no replicante) para P. multocida, A. pleuropneumoniae o P. (Mannheimia) haemolytica, Un casete de expresión, que contiene un promotor activo en P. multocida, A. pleuropneumoniae o P. (Mannheimia) haemolytica y el gen marcador apropiado, se clona entre las secuencias flanqueantes. El plásmido se introduce en P. multocida, A. pleuropneumoniae o P. (Mannheimia) haemolytica naturales, Se aíslan las bacterias que incorporan y expresan el gen marcador (probablemente a una frecuencia muy baja) y se examina el acontecimiento de recombinación apropiado (es decir, sustitución del gen natural por el gen marcador).

La virulencia reducida de estos organismos y su inmunogenicidad pueden confirmarse mediante su administración a un animal. Mientras que sea posible administrar sólo un microorganismo avirulento de la invención, preferiblemente se administran uno o más de estos microorganismos mutantes en una composición de vacuna que contiene adyuvantes adecuados y diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Los vehículos pueden ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con el microorganismo virulento de la invención y no perjudiciales para el sujeto que se va a inmunizar. Típicamente, los vehículos serán agua o solución salina que estará estéril o libre de pirógenos. El sujeto que se va a inmunizar es un sujeto que necesita protección para una enfermedad causada por una forma virulenta de P. multocida, A. pleuropneumoniae, P. (Mannheimia) haemolytica y otros microorganismos patogénicos.

Se apreciará que la vacuna de la invención puede ser útil en los campos de la medicina y la veterinaria. Por tanto, el sujeto que se va a inmunizar puede ser un ser humano u otro animal, por ejemplo, animales de granja, como vacas, ovejas, cerdos, caballos, cabras y aves de corral (p. ej., pollos, pavos, patos y gansos), animales de compañía como perros y gatos; animales exóticos y/o de zoológico y animales de laboratorio como ratones, ratas, conejos, cobayas y hámsteres. Las secuencias de ADN que codifican polipéptidos de virulencia que podrían hibridar con los anteriores, pero que debido a la degeneración del código genético no lo hacen, se contemplan en la invención. Entre los ejemplos de condiciones muy rigurosas se incluyen un lavado final con tampón que comprende SSCx0,2/SDS al 0,1%, de 65ºC a 75ºC, mientras que entre los ejemplos de condiciones moderadamente rigurosas se incluye un lavado final con tampón que comprende SSCx2/SDS al 0,1% de 35ºC a 45ºC. En la técnica se entiende que pueden lograrse condiciones de rigurosidad equivalente variando la temperatura y el tampón, o la concentración de sal como se describe en Ausubel y col. (Eds.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994), pág. 6.0.3 a 6.4.10. Las modificaciones en las condiciones de hibridación pueden determinarse empíricamente o calcularse de forma precisa en función de la longitud y del porcentaje de pares de bases guanosina/citosina de la sonda. Las condiciones de hibridación pueden calcularse como se describe en Sambrook, y col., (Eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, Nueva York (1989), pág. 9.47 a 9.51.

También se proporcionan construcciones de expresión recombinantes de replicación automática, como plásmidos y vectores de ADN vírico que incorporan secuencias de genes de virulencia. También se proporcionan construcciones de expresión en las que los polinucleótidos que codifican polipéptidos de virulencia están unidos operativamente a una secuencia de ADN de control de expresión endógena o exógena y un terminador de la transcripción. Los genes de virulencia pueden clonarse mediante PCR, usando ADN genómico de P. multocida como molde. Para facilitar la inserción del gen dentro de los vectores de expresión, se eligen cebadores de PCR de modo que el gen amplificado por PCR tenga un sitio para enzimas de restricción en el extremo 5' que precede al codón de inicio ATG, y un sitio para enzimas de restricción en el extremo 3' después de los codones de parada TAG, TGA o TAA. Si es conveniente, se cambian los codones en el gen, sin cambiar los aminoácidos, según la preferencia de codón de E. coli descrita por Grosjean y Fiers, Gene, 18:199-209 (1982) y Konigsberg y Godson, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 80:687-691 (1983). La optimización del uso de codones puede llevar a un aumento en la expresión del producto génico cuando se produce en E. coli. Si el producto génico se va a producir extracelularmente, en el periplasma de E. coli o de otra bacteria, o dentro del medio de cultivo celular, el gen se clona sin su codón de inicio y se coloca dentro de un vector de expresión detrás de una secuencia señal.

Según otro aspecto de la invención, se proporcionan células hospedadoras, incluyendo células procariotas y eucariotas, transformadas, transfectadas o electroporadas de forma estable o transitoria, con secuencias polipeptídicas de la invención de forma que se permita la expresión de polipéptidos de virulencia de la invención. Entre los sistemas de expresión de la invención se incluyen sistemas bacterianos, de levaduras, víricos, en células de invertebrados y mamíferos. Las células hospedadoras de la invención son una fuente valiosa de inmunógeno para el desarrolló de anticuerpos específicamente inmunorreactivos con el producto del gen de virulencia. Las células hospedadores de la invención son notablemente útiles en procedimientos de producción a gran escala de polipéptidos de virulencia, en los que las células se crecen en un medio de cultivo adecuado y se aíslan los productos polipeptídicos deseados de las células o del medio en el que se crecen las células mediante, por ejemplo, purificación por inmunoafinidad o cualquiera de las múltiples técnicas de purificación bien conocidas y practicadas de forma rutinaria en la técnica. Puede usarse cualquier célula hospedadora adecuada para la expresión del producto génico, como E. coli, otras bacterias, como P. multocida, Bacillus y S. aureus, levaduras, como Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae, células de insectos o células de mamíferos, como células CHO, utilizando vectores adecuados conocidos en la técnica. Pueden producirse proteínas directamente, o fusionarse con un péptido o polipéptido, y tanto intracelular como intracelularmente, mediante la secreción en el espacio periplásmico de una célula bacteriana y dentro del medio de cultivo celular. La secreción de una proteína requiere un péptido señal (también conocido como presecuencia); se conocen varias secuencias señal de procariotas y eucariotas que funcionan en la secreción de proteínas recombinantes. Durante el proceso de secreción de proteínas, el péptido señal es eliminado por la señal peptidasa para obtener la proteína madura.

Para simplificar el proceso de purificación de la proteína, puede añadirse una etiqueta de purificación en los extremos 5' o 3' de la secuencia génica codificadora. Entra las etiquetas de purificación más frecuentes se incluyen una extensión de seis restos de histidina (patentes de EE. UU. Nº 5.284.933 y 5.310.663), una etiqueta de afinidad a estreptavidina descrita por Schmidt y Skerra, Protein Engineering, 6:109-122 (1993), un péptido FLAG [Hopp y col., Biotechnology, 6:1205-1210 (1988)], glutatión S-transferasa [Smith y Johnson, Gene, 67:31-40 (1988)] y tiorredoxina [LaVallie y col., Bio/Technology, 114:187-193 (1993)]. Para eliminar estos péptidos o polipéptidos, puede insertarse un sitio de reconocimiento de escisión proteolítica en la unión de la fusión. Las proteasas utilizadas más frecuentemente son el factor Xa, la trombina y la enteroquinasa.

Una bacteria atenuada de la inserción comprende una mutación en un gen que codifica un polipéptido atpG que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90% o al menos el 95%, o al menos el 99% idéntica a la SEQ ID NO: 167.

El porcentaje de "identidad" de la secuencia de aminoácidos con respecto a los polipéptidos preferidos de la invención se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos a los restos de la secuencia del producto génico de virulencia tras alinear ambas secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia.

Entre los productos variantes de virulencia de la invención se incluyen productos génicos de virulencia maduros, es decir, en los que se han eliminado secuencias líderes o señal, que tienen restos amino terminales adicionales. Se contemplan productos génicos de virulencia que tienen un resto de metionina adicional en la posición -1, así como los productos de virulencia que tienen restos adicionales de metionina y lisina en las posiciones -2 y -1. Las variantes de estos tipos son especialmente útiles para la producción de proteínas recombinantes en tipos celulares bacterianos. Entre las variantes de la invención también se incluyen productos génicos en los que se han introducido secuencias amino terminales derivadas de otras proteínas, así como variantes que comprenden secuencias amino terminales que no se encuentran en las proteínas naturales.

La invención también abarca polipéptidos variantes que tienen restos aminoacídicos adicionales que son el resultado del uso de sistemas de expresión específicos. Por ejemplo, el uso de vectores disponibles en el mercado que expresan un polipéptido deseado como una proteína de fusión con glutatión S-transferasa (GST) proporciona el polipéptido deseado con un resto adicional de glicina en la posición -1 tras la escisión del componente GST del polipéptido deseado. También se contemplan variantes que son el resultado de la expresión usando otros sistemas de vector.

En la composición de vacuna puede usarse cualquier adyuvante conocido en la técnica, como adyuvantes a base de aceite, como adyuvante completo de Freund y adyuvante incompleto de Freund, adyuvantes a base de micolato (p. ej., dimicolato de trehalosa), lipopolisacárido bacteriano (LPS), peptidoglucanos (es decir, mureínas, mucopéptidos y glucopéptidos, como N-Opaca, dipéptido muramilo [MDP] o análogos de MDP], proteoglicanos (p. ej. extraídos de Klebsiella pneumoniae), preparaciones de estreptococos (p. ej., OK432), Biostim^{TM} (p. ej., 01K2), los "Iscoms" de los documentos EP 109.942, EP 180.564 y EP 231.039, hidróxido de aluminio, saponina, DEAE-dextrano, aceites neutros (como migliol), aceites vegetales (como aceite de maní), liposomas, polioles Pluronic®, el sistema adyuvante Ribi (véase, por ejemplo, el documento GB-A-2.189.141) o interleucinas, especialmente aquellas que estimulan la inmunidad mediada por células.

Se ha descrito un adyuvante alternativo compuesto por extractos de Amycolata, un género bacteriano del orden Actinomycetales, en la patente de EE.UU. Nº 4.877.612. Adicionalmente, están disponibles en el mercado mezclas de adyuvantes patentadas. El adyuvante utilizado dependerá, en parte, del organismo receptor. La cantidad de adyuvante administrado dependerá del tipo y tamaño del animal. Las dosis óptimas pueden determinarse fácilmente mediante procedimientos rutinarios.

Las composiciones de vacuna pueden incluir opcionalmente diluyentes líquidos, semisólidos o sólidos farmacéuticamente aceptables (es decir, estériles y no tóxicos) compatibles con la vacuna que sirvan como vehículos, excipientes o medios farmacéuticos. Puede usarse cualquier diluyente conocido en la técnica. Entre los ejemplos de diluyentes se incluyen, pero sin limitaciones, polioxietileno monolaurato de sorbitán, estearato de magnesio, metil y propilhidroxibenzoato, talco, alginatos, almidones, lactosa, sacarosa, dextrosa, sorbitol, manitol, goma de acacia, fosfato cálcico, aceite mineral, manteca de cacao y aceite de teobroma.

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Las composiciones de vacuna pueden envasarse en formas convenientes para administración. Las composiciones pueden incluirse dentro de una cápsula, pastilla, oblea, sello, gelatina, papel y otro recipiente. Se prefieren estas formas de administración cuando son compatibles con la entrada de la composición inmunógena dentro del organismo receptor y, especialmente, cuando la composición inmunógena se está administrando en forma de dosis unitaria. Las dosis unitarias pueden estar envasadas, por ejemplo, en comprimidos, cápsulas, supositorios o sellos.

Las composiciones de vacuna pueden introducirse en el sujeto que se va a inmunizar mediante cualquier procedimiento convencional, p. ej., mediante inyección intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamaria, intraperitoneal o subcutánea, mediante administración oral, sublingual, nasal, anal o vaginal. El tratamiento puede consistir en una única dosis o diversas dosis durante un periodo de tiempo.

La invención también abarca el uso de una cepa bacteriana atenuada de la invención para la fabricación de un medicamento vacuna para prevenir o aliviar la infección bacteriana y/o los síntomas asociados con la misma.

La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos: en el ejemplo 1 se describen las construcciones de los mutantes de P. multocida. El ejemplo 2 se refiere al cribado de los mutantes de P. multocida. En el ejemplo 3 se abordan procedimientos para determinar la virulencia de los mutantes de P. multocida. En el ejemplo 4 se describe la clonación de los mutantes de P. multocida. En el ejemplo 5 se aborda la identificación de genes en otras especias relacionados con los genes de virulencia de P. multocida. En el ejemplo 6 se describe la construcción de mutantes de A. pleuropneumoniae. En el ejemplo 7 se aborda la selección de mutantes atenuados de A. pleuropneumoniae. El ejemplo 8 se refiere a la identificación de genes de virulencia de A. pleuropneumoniae. En el ejemplo 9 se describe la exposición competitiva de mutantes y bacterias naturales de A. pleuropneumoniae. En el ejemplo 10 se caracterizan los genes de A. pleuropneumoniae identificados. En el ejemplo 11 se aborda la eficacia del mutante de A. pleuropneumoniae para proteger frente a la exposición a bacterias naturales. En el ejemplo 12 se describe la identificación de genes de virulencia homólogos de especie en P. (Mannheimia) haemolytica.

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Ejemplo 1 Construcción de una biblioteca de mutantes de P. multocida con transposón etiquetado

Se construyó una biblioteca de mutantes con transposón etiquetado en el vector parental pLOF/Km [Herrero y col., J Bacteriol. 172:6557-67 (1990)] que previamente se había demostrado era funcional y aleatorio en P. multocida [Lee, y col., Vet Microbiol. 50:143-8 (1996)]. El plásmido pLOF/Km se construyó como una modificación del vector suicida pGP704 e incluía un gen transposasa bajo el control del promotor Tac así como el elemento transponible mini-Tn10 que codifica para la resistencia a kanamicina. El plásmido pTEF-1 se construyó como se describe a continuación mediante la modificación de pLOF/Km para que acepte etiquetas de secuencia que contienen una secuencia semialeatoria
[NK]_{35}.

El plásmido pLOF/Km se modificó en primer lugar para eliminar el único sitio de restricción KpnI en la región de clonación múltiple y, a continuación, para introducir un nuevo sitio KpnI en la región mini-Tn10. El plásmido se digirió con KpnI y los extremos colgantes resultantes se rellenaron con el fragmento Klenow de la polimerasa según el protocolo sugerido por el fabricante. Las digestiones de restricción y las ligaduras descritas en este documento se realizaron según los protocolos sugeridos por el fabricante (Gibco BRL, Gaithersburg, MD y Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). El producto de extremos romos se autoligó para producir un plásmido designado pLOF/Km-KpnI que se transformó en E. coli DH5\alpha:\lambdapir para su amplificación. La cepa de E. coli DH5\alpha:(\lambdapir \Phi80dlacZ\DeltaM15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17 (r_{k-}, m_{k}, supE44, relAl, deoR, \Delta(lacZYA-argF)U169, se propagó a 37ºC en medio de Luria-Bertani (LB). Los plásmidos se prepararon usando QIAGEN SpinPreps de QIAGEN Inc., (Santa Clarita, CA) y se digirieron con SfiI que corta en un sitio único dentro del elemento transponible mini-Tn10. Se preparó un adaptador SfiI-KpnI-SfiI mediante la hibridación de oligonucleótidos TEF1 (SEQ ID NO: 86) y TEF3 (SEQ ID NO: 87) y el adaptador de doble cadena resultante se ligó en el sitio SfiI para crear el plásmido pTEF-1. Los oligonucleótidos TEF1 y TEF3 (así como todos los demás oligonucleótidos descritos en este documento) fueron sintetizados por Genosys Biotechnologies (The Woodlands, TX).

TEF1	5'-AGGCCGGTACCGGCCGCCT	SEQ ID NO: 86
TEF3	5'-CGGCCGGTACCGGCCTAGG	SEQ ID NO: 87

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Las etiquetas de secuencia exclusivas para su inserción dentro del sitio KpnI de pTEF-1 se prepararon de la siguiente forma. Se realizó una PCR para generar etiquetas de ADN de hebra doble usando un kit de PCR GeneAmp XL (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) en condiciones que incluían 250 \muM de cada dNTP, Mg(OAc)_{2} 1,5 mM, 100 pmoles de cada cebador TEF14 (SEQ ID NO: 88) y TEF15 (SEQ ID NO: 89), 1 ng de TEF26 (SEQ ID NO: 90) como ADN molde y 2,5 unidades de Tth ADN polimerasa XL recombinante.

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TEF14	5'-CATGGTACCCATTCTAAC	SEQ ID NO: 88
TEF15	5'-CTAGGTACCTACAACCTC	SEQ ID NO: 89
TEF26	5'-CTAGGTACCTACAACCTCAAGCTT-[NK]_{35}-
	AAGCTTGGTTAGAATGGGTACCATG	SEQ ID NO: 90

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Las condiciones de reacción incluían una incubación inicial a 95ºC durante un minuto, seguido de treinta ciclos de 30 segundos a 95ºC, 45 segundos a 45ºC y 15 segundos a 72ºC, seguido de una incubación final a 72ºC durante dos minutos. Los productos de PCR se digirieron con KpnI y se purificaron usando un kit de eliminación de nucleótidos de QIAGEN (QIAGEN, Inc., Chatsworth, GA) según el protocolo sugerido por el fabricante. Las secuencias etiqueta exclusivas se ligaron en el elemento mini-Tn10 de pTEF-1 linearizado, digerido previamente con KpnI y desfosforilado con fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Boeringer Mannheim) usando procedimientos convencionales. La biblioteca de plásmidos resultante se transformó en E. coli DH5\alpha:\lambdapir. El análisis de transferencia de colonias se realizó según la guía para usuarios DIG (Boehringer-Mannheim) con la hibridación y detección realizadas como
sigue.

Las hibridaciones se realizaron esencialmente según la Genius Non-Radioactive User's Guide (Boehringer Mannheim Biochemicals), el prospecto del kit de marcaje DIG-PCR (Boehringer Mannheim Biochemicals) y el prospecto de CSPD (Boehringer Mannheim Biochemicals). Para la preparación de sondas, se dispuso una reacción de PCR principal en 100 \mul usando tampón de PCR Amplitaq (PE Applied Biosystems), dNTPs 200 \muM, 149 pmoles de cada uno de los cebadores TEF5 (SEQ ID NO: 91) y TEF6 (SEQ ID NO: 92), MgCl_{2} 2 mM, 2,5 unidades de Amplitaq (PE Applied Biosystems) y 1 ng de ADN del plásmido.

TEF5	5'-TACCTACAACCTCAAGCT	SEQ ID NO: 91
TEF6	5'-TACCCATTCTAACCAAGC	SEQ ID NO: 92

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Las condiciones del ciclo incluían una incubación inicial a 95ºC durante dos minutos, seguido de 35 ciclos de 95ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 45 segundos, 72ºC durante 15 segundos y una incubación final a 72ºC durante tres minutos. Los productos de amplificación se separaron usando electroforesis en un gel NuSieve GTG (FMC BioProducts, Rockland, ME, EE.UU.):agarosa relación 3:1 al 2% y se escindió y purificó el producto de 109 pb. Las extracciones del gel se realizaron usando un kit de extracción en gel de QIAGEN (QIAGEN).

Aproximadamente 15 ng del producto principal se marcaron en una reacción de PCR de 50 \mul usando el kit de PCR DIG, 50 pmoles de los cebadores TEF24 y TEF 25 y una mezcla 1: 1 de la mezcla de síntesis de sondas DIG con de la solución madre de dNTP 2 mM.

TEF24	5'-TACCTACAACCTCAAGCTT	SEQ ID NO: 93
TEF25	5'-TACCCATTCTAACCAAGCTT	SEQ ID NO: 94

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Las condiciones de PCR incluían una incubación inicial a 95ºC durante dos minutos, seguido de 25 ciclos de 95ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 45 segundos, 72ºC durante 15 segundos y una incubación final a 72ºC durante tres minutos. El producto de PCR marcado se digirió con HindIII en un volumen de reacción total de 90 \mul y se purificó a partir de los brazos constantes del cebador usando un gel NuSieve GTG (FMC BioProducts): agarosa 3:1 al 2%. La región que contenía la etiqueta variable marcada se escindió y los cortes de gel enteros se disolvieron y desnaturalizaron en 10 ml de DIG EasyHyb a 95ºC durante 10 minutos.

Las transferencias dot-blot se prepararon usando una membrana Hybond®-N^{+} (Amersham Pharmacia Biotech). El ADN diana para cada etiqueta se preparó en placas de 96 pocillos usando aproximadamente 30 ng del producto de PCR. Se añadió un volumen igual de NaOH 0,1 N para desnaturalizar la muestra y cada muestra se aplicó a la membrana con vacío mínimo usando un aparato de transferencia dot-blot Minifolds^{TM} de Scheleicher y Schuell (Keene, NH, EE.UU.). Cada pocillo se lavó con 150 \mul de solución de neutralización (Tris 0,5 M/NaCl 3 M, pH 7,5) y 150 \mul de SSCx2. Las membranas se entrecruzaron mediante luz UV en un Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.) y se prehibridaron durante una hora en 20 ml de tampón DIG EasyHyb a 42ºC. Se añadió la sonda desnaturalizada y se realizó la hibridación durante toda la noche a 42ºC. La membrana se lavó dos veces en SSCx2 que contenía SDS al 0,1% durante cinco minutos por lavado. Se realizaron dos lavados en condiciones altamente rigurosas en 50 ml de tampón SSCx0,1 precalentado que contenía SDS al 0,1% a 68ºC durante 15 minutos antes de proceder con los protocolos de detección convencionales de Genius (Manual de Genius).

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Es conveniente utilizar un sistema de detección no radiactivo por seguridad, menor coste, facilidad de uso y reducción de materiales peligrosos. En los experimentos iniciales usando procedimientos similares previamente descritos [Mei y col., Mol. Microbiol. 26:399-407 (1997)], se obtuvieron niveles de fondo de hibridación inaceptables en los controles negativos. Para disminuir el fondo, se aumentó la longitud de la etiqueta de 30 pb a un total de 70, los cebadores de amplificación se alargaron para incluir toda la secuencia que flanquea a la región variable, se uso una concentración menor de dig-dUTP y se eliminaron las secuencias conservadas que flanquean a la secuencia de la región etiqueta mediante purificación en gel. Lo más significativo, se usó PCR para generar etiquetas de secuencia [NK]_{35} según el ADN diana de las transferencias dot-blot mejor que los plásmidos completos que contenían los transposones etiquetados antes de detectar la hibridación de fondo del transposón mismo. Usando estas modificaciones se eliminó el fondo haciendo el análisis quimioluminiscente no radiactivo más eficaz.

Se analizaron por transferencia de colonias aproximadamente cuatrocientos transformantes diferentes resultado de la ligadura de pTEF-1 con las etiquetas de secuencia generadas por PCR y las 96 colonias que hibridaban con mayor potencia se reunieron en placas de microvaloración para su uso posterior. Incluso aunque la probabilidad de etiquetas duplicadas era muy baja, se comprobó la mitad de la placa original de etiquetas frente a la otra mitad para confirmar que no se habían duplicado etiquetas. Los plásmidos que contenían estas etiquetas se purificaron y transformaron en la cepa de E. coli S17-1:\lambdapir (pir, recA, thi, pro, hsd, (r-m+), RP4-2, (Tc::Mu), (Km::Tn7), [TmpR], [SmR]), y las bacterias transformadas se propagaron a 37ºC en medio de Luria-Bertani (LB). Cada una de las 96 transformantes de E. coli S17-1:\lambdapir que contenía el plásmido etiquetado pTEF-1 se usó en emparejamientos conjugativos para generar mutantes de transposón de P. multocida. La cepa TF5 de P. multocida es un mutante espontáneo resistente al ácido nalidíxico derivado de UC6731, un aislado clínico bovino. Las cepas de P. multocida se hicieron crecer en medios de infusión cerebro corazón (BHI) (Difco Laboratories, Detroit, MI, EE.UU.) a 37ºC y en CO_{2} al 5% cuando se hicieron crecer en placas. Los emparejamientos se establecieron mediante crecimiento de cada clon de E. coli S171:\lambdapir/pTEF1:[NK]_{35} y la cepa TF5 hasta fase logarítmica tardía. Se mezclaron 50 \mul de cultivo de cada clon pTEF-1 etiquetado con 200 \mul del cultivo de TF5 y se colocaron 50 \mul de cada mezcla de emparejamiento sobre filtros TM de 0,22 colocados previamente en placas BHI que contenían IPTG 100 mM y MgSO_{4} 10 mM. Tras la incubación durante toda la noche a 37ºC con CO_{2} al 5%, las mezclas de emparejamiento se levantaron de cada filtro en 3 ml de PBS y se colocaron en placas 25 \mul de cada en placas con BHIN^{50}K^{100}. Tras el crecimiento selectivo durante toda la noche, las colonias se reunieron en placas de microvaloración mediante transferencia con un palillo en 200 \mul de BHIN^{50}K^{50}, asegurándose de que cada pocillo de una placa de microvaloración contuviera siempre un mutante de transposón con la misma etiqueta de secuencia. Tras el crecimiento durante toda la noche se añadieron 50 \mul de glicerol al 75% en capa pocillo y las placas se conservaron congeladas a -80ºC.

Se reunieron diecinueve mezclas transfiriendo los mutantes de transposón a placas de microvaloración asegurándose de que cada pocillo contenía un mutante de transposón con la etiqueta apropiada para dicho pocillo. En otras palabras, un pocillo específico en cada placa de microvaloración contenía siempre un mutante de transposón con la misma etiqueta de secuencia aunque la localización del transposón dentro de dichos mutantes pudiera ser diferente.

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Ejemplo 2 Cribado de mutantes de P. multocida atenuados en murinos

Las diecinueve mezclas de mutantes de transposón de Pasteurella multocida se analizaron usando un modelo murino de septicemia. Las placas congeladas de los mutantes de transposón de P. multocida agrupadas se retiraron de su conservación a -80ºC y se subcultivaron mediante transferencia de 10 \mul de cada pocillo a una nueva placa de 96 pocillos de fondo redondo (Corning Costar, Cambridge, MA, EE.UU.) que contenían 200 \mul de infusión cerebro corazón (DIFCO) con ácido nalidíxico a 50 \mug/ml (Sigma) y kanamicina a 50 \mug/ml (Sigma) (BHIN^{50}K^{50}). Las placas se incubaron sin agitación durante toda la noche a 37ºC en CO_{2} al 5%. Las placas cultivadas toda la noche se subcultivaron mediante transferencia de 10 \mul de cada pocillo a una nueva placa de 96 pocillos de fondo plano (Corning Costar) que contenían 100 \mul de BHI por pocillo y se incubaron a 37ºC con agitación a aproximadamente 150 rpm. La DO_{540} se controló usando un lector de placas de microvaloración. A una DO_{450} de aproximadamente 0,2 a 0,25, cada placa se mezcló para formar la "mezcla de entrada" combinando 100 \mul de cada uno de los pocillos de la placa de microvaloración. El cultivo se diluyó de forma apropiada en BHI hasta dosis de aproximadamente 10^{4}, 10^{5}, 10^{6} UFC/ml y se usaron 0,2 ml de cada dilución para infectar a ratones BALB/c hembras de 14-16 g mediante administración intraperitoneal. A los dos días tras la infección, se sacrificaron uno o dos ratones supervivientes y se extrajeron los bazos. El bazo completo se homogeneizó en 1 ml de solución salina al 0,9% estéril. Se prepararon diluciones del homogeneizado de 10^{-2} a 10^{-5} y se dispusieron en placas con BHIN^{50}K^{50}. Tras el crecimiento durante toda la noche, se agruparon al menos 20.000 colonias en 10 ml de medio de cultivo BHI para formar la "mezcla recuperada" y se centrifugaron 0,5 ml de la mezcla recuperada a 3.500 g y el sedimento se usó para preparar ADN genómico según un protocolo descrito previamente [Wilson, En F. M. Ausubel, y col., (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1. John Wiley e hijos, Nueva York, pág. 2.4.1-2.4.5. (1997)].

Los experimentos iniciales con P. multocida natural virulenta indicaron que podrían recuperarse organismos del bazo, pulmones, riñones e hígado, lo que indicaba un modelo de infección realmente septicémico. Se realizaron transferencias dot-blot de las mezclas "de entrada" y "recuperada" como se describe en el Ejemplo 1 y ambas se evaluaron mediante inspección visual y análisis semicuantitativo. La hibridación se realizó según se describe en el Ejemplo 1, excepto por que se usaron como molde 5 \mug de ADN genómico de las mezclas de entrada y recuperada. El análisis semicuantitativo indica si había tenido lugar una reducción significativa en un único clon. Si es mutante es incapaz de sobrevivir dentro del hospedador, entonces la señal recuperada sería muy baja en comparación con la señal de entrada obteniéndose una alta relación entrada/recuperada. La mayoría de los mutantes crecerán tan bien in vivo como in vitro y, por tanto, la relación de sus señales debería ser aproximadamente igual a 1. Los clones seleccionados mediante análisis cuantitativo que se habían reducido en gran medida en la mezcla recuperada se seleccionaron para estudios adicionales. También se seleccionaron clones adicionales con relaciones introducción/recuperación cuestionables tras la evaluación visual de las películas obtenidas de las transferencias dot-blot.

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Ejemplo 3 Determinación de virulencia de los mutantes candidatos de P. multocida

Cada posible mutante que mostraba una recuperación reducida del tejido esplénico se aisló de la placa de mezcla original y se usó individualmente en un experimento de exposición para verificar y estimar aproximadamente la atenuación causada por la mutación de transposón. Los mutantes candidatos individuales de los análisis in vivo se hicieron crecer en placas de agar sangre de oveja durante toda la noche en CO_{2} al 5% a 37ºC. Aproximadamente seis colonias de cada mutante se inocularon en medio de cultivo BHI y se permitió que crecieron durante seis horas. Se prepararon diluciones y se infectó a cinco ratones cada vez como se describió anteriormente con 10^{2}, 10^{3}, 10^{4} y 10^{5} UFC cada uno. La atenuación se determinó comparando la mortalidad después de seis días con respecto a la bacteria natural. Se supuso que los ratones supervivientes estaban protegidos y, a continuación, se expusieron a una dosis de P. multocida natural a una concentración aproximadamente 200 veces mayor que la DL_{50} para la cepa natural. A continuación, se determinó la tasa de supervivencia de cada grupo de ratones expuestos.

Los resultados indican que 62 de los 120 posibles mutantes de transposón estaban atenuados, teniendo una DL_{50} aproximada al menos 10 veces mayor que la cepa natural. En la Tabla 1 se enumeran los clones y sus valores de DL_{50} aproximados. Se realizó en paralelo un experimento control con la cepa natural con cada conjunto de exposición y en todos los casos, la mortalidad de los grupos naturales expuestos fue del 100%.

Además de los valores de DL_{50}, en la Tabla 1 también se proporcionan los datos de los experimentos de vacunación y exposición. Brevemente, se vacunó a grupos de ratones (n=5 a 10) mediante inyección intraperitoneal con las cepas individuales de P. multocida mostradas en la Tabla 1 a una dosis que era aproximadamente 200 veces mayor que la DL_{50} de la cepa natural virulenta. Se observó a los animales durante 28 días tras lo cual se calcularon los datos de mortalidad.

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TABLA 1 Genes de virulencia de P. multocida

1

2

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3

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Ejemplo 4 Clonación e identificación de genes necesarios para la virulencia de P. multocida

Cada mutante de transposón que se verificó como atenuado se analizó adicionalmente para determinar la identidad de la fase de lectura abierta interrumpida. El ADN de cada mutante se amplificó, purificó y digirió con enzimas de restricción que se sabía no cortaban dentro del transposón y, generalmente, producían fragmentos de 4-8 kb que hibridaban con el transposón. Usando la selección para resistencia a kanamicina codificada por el transposón, se clonó al menos un fragmento de cada mutante de transposón.

Se realizó la hibridación de tipo Southern con múltiples enzimas de restricción para cada mutante atenuado usando un fragmento marcado MluI de 1,8 kb de pLOF/Km como sonda para identificar un fragmento de tamaño adecuado para la clonación. El elemento mini-Tn10 y el ADN flanqueante de cada mutante se clonó en pUC19 y se determinó la secuencia flanqueantes usando los cebadores internos TEF32 y TEF40, secuenciación por paseo con cebador o, en algunos casos, cebadores pUC-19 universales.

TEF-32	GGCAGAGCATTACGCTGAC	SEQ ID NO: 95
TEF-40	GTACCGGCCAGGCGGCCACGCGTATTC	SEQ ID NO: 96

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Las reacciones de secuenciación se realizaron usando el kit de terminaciones de secuencia marcados BigDye^{TM} de PE Applied Biosystems (Foster City, CA) y se desarrolló en un secuenciador de ADN ABI Prism 377. Se obtuvo la secuencia de doble hebra para las posibles fases de lectura abierta de cada clon. Se usó el software Sequencher 3.0 (Genecodes, Corp. Ann Arbor, MI) para reunir y analizar los datos de secuencia. Se usaron los programas GCG [Devereux, y col., 1997. Wisconsin Package Versión 9.0, 9.0 ed. Genetics Computer Group, Inc., Madison] para la búsqueda de secuencias homólogas en las bases de datos actualmente disponibles.

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En el 37% de los clones que se identificaron como atenuados, se observaron inserciones múltiples del elemento transponible mini-Tn10. Cada inserción, incluyendo su secuencia flanqueante se clonó por separado en pGP704 y se apareó con la cepa natural para producir nuevos mutantes de P. multocida, llevando cada uno sólo una de las inserciones múltiples originales. Los mutantes individuales se probaron de nuevo por separado para determinar la inserción responsable del fenotipo atenuado. La secuencia de nucleótidos de la fase de lectura abierta prevista interrumpida se determinó secuenciando ambas hebras, y la secuencia de aminoácidos prevista se usó para la búsqueda de secuencias similares en las bases de datos actualmente disponibles. Las secuencias coincidían con genes conocidos, genes desconocidos y fases de lectura abierta teóricas previamente secuencias o no coincidían con ninguna secuencia previamente identificada. A aquellos genes que presentaban homología con secuencias previamente identificadas, se les asignaron posibles funciones como se establece en la Tabla 1.

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Ejemplo 5 Identificación de genes relacionados en otras especies

En experimentos independientes, también se realizó MM usando Actinobacillus pleuropneumoniae (App). Una de las cepas de App contenía una inserción de un gen que se secuenció (SEQ ID NO: 97) e identificó como un homólogo de especie del gen atpG de P. multocida. Este resultado sugería la presencia en otras especies bacterianas de homólogos a genes previamente desconocidos de P. multocida que también pueden mutarse para producir cepas atenuadas de la otra especie bacteriana para su uso en composiciones de vacuna. Para determinar si existen homólogos de otros genes de P. multocida en otras especies bacterianas, se realizaron hibridaciones de tipo Southern con el ADN genómico de otras especies usando el gen atpG de A. pleuropneumoniae como sonda.

Se aisló ADN genómico de Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella haemolytica (Ph), P. multocida y Haemophilus somnus (Hs) usando el procedimiento CTAB y se digirió con EcoRI e HindIII durante dos horas a 37ºC. El ADN digerido se separó en un gel de agarosa al 0,7% a 40V en tampón TAE durante toda la noche. El gel se sumergió secuencialmente en HCl 0,1 M durante 30 minutos, dos veces en NaOH 0,5 M/NaCl 1,5 M durante 15 minutos cada vez y dos veces en NaCl 2,5 M/Tris 1 M, pH 7,5. El ADN se transfirió a membranas de nitrocelulosa (Amersham Hybond N^{+}) durante toda la noche usando tampón SSCx20 (NaCl 3 M/citrato sódico 0,3 M). El ADN se entrecruzó con la membrana usando un Stratalinker UV en condiciones de autoentrecruzamiento (120 milijulios). La membrana se hibridó previamente en SSCx5/solución de bloqueo al 1%/lauril sarcosina sódica al 0,1%/SDS al 0,02% a 50ºC durante aproximadamente siete horas y se hibridó durante toda la noche a 50ºC en la misma solución que contenía una sonda de atgG generada por PCR.

La sonda se preparó usando los cebadores DEL-1389 (SEQ ID NO: 98) y TEF-46 (SEQ ID NO: 99) con un kit de PCR GeneAmp XL en un PCR GeneAmp System 2400. El molde fue ADN genómico de A. pleuropneumoniae.

DEL-1389	TCTCCATTCCCTTGCTGCGGCAGGG	SEQ ID NO: 98
TEF-46	GGAATTACAGCCGGATCCGGG	SEQ ID NO: 99

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La PCR se realizó con una etapa de calentamiento inicial a 94ºC durante cinco minutos, 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, hibridación a 50ºC durante 30 segundos y elongación a 72ºC durante tres minutos, y una etapa de extensión final a 72ºC durante cinco minutos. Los productos de amplificación se separaron en un gel de agarosa, se purificaron usando un kit de purificación en gel QIAquick (QIAGEN) y se marcaron usando un kit DIG-High Primer (Boehringer Mannheim). La transferencia se retiró de la solución de hibridación, se aclaró en SSCx2 y se lavó dos veces durante cinco minutos cada lavado en el mismo tampón. A continuación, la transferencia se lavó dos veces durante 15 minutos cada vez en SSCx0,5 a 60ºC. Las bandas homólogas se visualizaron usando un kit de detección de ácidos nucleicos DIG (Boehringer Mannheim).

Se detectaron bandas únicas en Pasteurella haemolytica, Haemophilus somnus y A. pleuropneumoniae usando ADN digerido con EcoRI. Se detectaron dos bandas usando ADN digerido con EcoRI a partir de Pasteurella multocida.

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Ejemplo 6 Construcción de una biblioteca de mutantes de P. multocida con transposón etiquetado

Previamente se ha publicado que la mutagénesis de transposón usando pLOF/Km es funcional y aleatoria en A. pleuropneumoniae [Tascon, y col., J Bacteriol. 175:5717-22 (1993)]. Para construir mutantes de transposón etiquetados de A. pleuropneumoniae, se usó cada uno de los 96 transformantes de E. coli S17-1:\lambdapir que contenían plásmidos etiquetados preseleccionados (pTEF-1:[NK]_{35}) en emparejamientos conjugativos para generar mutantes de transposón de la cepa AP225 de A. pleuropneumoniae, un mutante espontáneo resistente al ácido nalidíxico de serotipo 1 derivado de la cepa ATCC 27088 tras un pase in vivo. Las cepas de A. pleuropneumoniae se hicieron crecer en medios de infusión cerebro corazón (BHI) (Difco Laboratories, Detroit, MI) con dinucleótidos B-nicotinamida y adenina a 10 \mug/ml (V^{10})(Sigma, St. Louis, Missouri), a 37ºC y en CO_{2} al 5% cuando se hicieron crecer en placas. La cepa de E. coli S17-1:\lambdapir (\lambdapir, recA, thi, pro, hsdR(r_{k}-, m_{k}+), RP4-2, (Tc^{R}::Mu), (Km^{R}::Tn7), [Tmp^{R}], [Sm^{R}]) se propagó a 37ºC en medio de Luria-Bertani (LB). Cuando fue necesario, se usaron los antibióticos ampicilina (Sigma) a 100 \mug/ml, ácido nalidíxico (N^{50}) (Sigma) a 50 \mug/ml y kanamicina (Sigma) a 50 (K^{50}) o 100 (K^{100}) \mug/ml.

Los emparejamientos se establecieron mediante crecimiento de cada clon de E. coli S17-1:\lambdapir/pTEF1:[NK]_{35} y la cepa Ap225 hasta fase logarítmica tardía. Se mezcló una alícuota de 50 \mul de cultivo de cada clon pTEF-1 etiquetado con 150 \mul del cultivo de APP225 y, a continuación, se colocaron 50 \mul de cada mezcla de emparejamiento sobre filtros de 0,22 \muM colocados previamente en placas BHIV^{10} que contenían IPTG 100 \muM y MgSO_{4} 10 mM. Tras la incubación durante toda la noche a 37ºC con CO_{2} al 5%, las mezclas de emparejamiento se levantaron de cada filtro en 2 ml de PBS y se colocaron 200 \mul de cada en placas con BHIV^{10}N^{50}K^{100}. Tras el crecimiento selectivo durante toda la noche, las colonias se reunieron en placas de microvaloración mediante transferencia con un palillo en 200 \mul de BHIV^{10}N^{50}K^{50}, asegurándose de que cada pocillo de una placa de microvaloración contenía siempre un mutante de transposón con la misma etiqueta de secuencia. Tras el crecimiento durante toda la noche se añadieron 50 \mul de glicerol al 75% en capa pocillo y las placas se conservaron congelada a -80ºC.

No parece que APP tenga más sesgo hacia inserciones múltiples del elemento mini-Tn10 del que tenía P. multocida. Se determinó que sólo aproximadamente el 3% de los mutantes contenían inserciones múltiples, que coincidía con el 4% publicado previamente [Tascon, y col., J Bacteriol. 175:5717-22 (1993)]. El problema en APP consistía en la identificación de numerosos mutantes (discutido a continuación) que contenían inserciones dentro de las regiones del ARN 23S: un total de 28 mutantes con inserciones dentro de 13 sitios exclusivos. Esto puede indicar que el ARN 23S contiene sitios preferenciales de inserción y que el crecimiento de APP se ve afectado suficientemente por estas inserciones como para dar lugar a una supervivencia diferencial dentro del hospedador. Los análisis de transferencias Southern usando una sonda de ARN 23S de APP sugieren que APP puede contener sólo tres operones ribosómicos en comparación con cinco en H. influenzae [Fleischmann, y col., Science 269:496-512 (1995)] y siete operones completos en E. coli [Blattner, y col., Science 277:1453-1474 (1997)]. Esta preferencia de sitio y su efecto sobre la tasa de crecimiento pueden ser una barrera significativa para la "mutagénesis de saturación" ya que un número significativo de clones contendrán inserciones en estos ARN y será necesario analizar un volumen más grande para obtener mutaciones adicionales exclusivas atenuantes.

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Ejemplo 7 Análisis de mutantes atenuados de A. pleuropneumoniae en porcino

Se cribaron veinte conjuntos de mutantes de transposón de A. pleuropneumoniae que contenían un total de aproximadamente 800 mutantes, usando un modelo porcino de infección intratraqueal. Cada conjunto se analizó en dos animales independientes.

Las placas congeladas de mutantes de transposón de A. pleuropneumoniae mezclados se retiraron de su conservación a -80ºC y se subcultivaron transfiriendo 20 \mul de cada pocillo a una placa de 96 pocillos de fondo redondo nueva (Corning Costar, Cambridge, MA, EE.UU.) que contenían 180 \mul de BHIV^{10}N^{50}K^{50}. Las placas se incubaron sin agitación durante toda la noche a 37ºC en CO_{2} al 5%. A continuación, las placas cultivadas toda la noche se subcultivaron mediante transferencia de 10 \mul de cada pocillo a una nueva placa de 96 pocillos de fondo plano (Corning Costar) que contenían 100 \mul de BHIV^{10} por pocillo y se incubaron a 37ºC con agitación a 150 rpm. La DO_{562} se controló usando un lector de placas de microvaloración. A una DO_{562} de aproximadamente 0,2 a 0,25, cada placa se mezcló para formar la "mezcla de entrada" combinando 100 \mul de cada uno de los pocillos de la placa de microvaloración. El cultivo se diluyó aproximadamente en BHI hasta aproximadamente 2x10^{6} UFC/ml. Para cada mezcla diluida, se usaron 4 ml para infectar a cerdos SPF de 10-20 kg (Whiteshire-Hamroc, Albion, IN) mediante administración intratraqueal usando un tubo endotraqueal. Aproximadamente 20 horas después de la infección, se sacrificaron todos los animales supervivientes y se extirparon los pulmones. Se realizó un lavado para recuperar las bacterias supervivientes mediante infusión de 150 ml de PBS estéril en los pulmones que, a continuación, se masajearon para distribuir el líquido. Se recuperó el líquido de lavado y el proceso se repitió una segunda vez. El líquido de lavado se centrifugó a 450 g durante 10 minutos para separar los restos grandes. A continuación, los sobrenadantes se centrifugaron a 2.800 g para sedimentar las bacterias. Los sedimentos se resuspendieron en 5 ml de BHI y se sembraron en placas en diluciones que abarcaban de 10^{-2} a 10^{-5} en placas con BHIV^{10}N^{50}K^{50}. Tras el crecimiento durante toda la noche, se mezclaron al menos 100.000 colonias en 10 ml de medio de cultivo BHI para formar las "mezclas recuperadas". Se usó una porción de 0,7 ml de cada mezcla recuperada para preparar el ADN genómico mediante el procedimiento CTAB [Wilson, En Ausubel, y col., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1. John Wiley e hijos, Nueva York, pág.
2.4.1-2.4.5 (1997)].

La recuperación a partir de los animales rutinariamente estaba en el intervalo de 10^{8} UFC a partir del lavado pulmonar.

Las transferencias dot-blots se realizaron y evaluaron ambas mediante inspección visual y mediante análisis semicuantitativo como se ha describo previamente. Todas las hibridaciones y detecciones se realizaron como se ha descrito. Brevemente, las sondas se prepararon mediante una amplificación por PCR primaria, seguida de la purificación en gel de agarosa del producto deseado y una amplificación por PCR secundaria incorporando dig-dUTP. Los oligonucleótidos, incluyendo TEF5, TEF6, TEF24, TEF25, TEF48 y TEF62 fueron sintetizados por Genosys Biotechnologies (The Woodlands, TX). También se usaron los cebadores TEF69, TEF65 y TEF66 para las reacciones de PCR inversa y la secuenciación.

TEF69	GACGTTTCCCGTTGAATATGGCTC
TEF65	GCCGGATCCGGGATCATATGACAAGA
TEF66	GACAAGATGTGTATCCACCTTAAC

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A continuación, el producto de PCR marcado se digirió con HindIII para separar los brazos constantes del cebador de la región etiqueta exclusiva. La región que contenía la etiqueta variable marcada se escindió y, a continuación, la sección completa del gel se disolvió y desnaturalizó en DIG EasyHyb. Se prepararon las transferencias dot-blots y se detectaron usando el protocolo de detección CSPD convencional. Se realizaron exposiciones de películas para su evaluación visual y se determinaron las cuentas de luminiscencia por segundo (CLPS) para cada muestra de transferencia dot-blot. Se usó la proporción CLPS_{entrada}/CLPS_{recuperadas} para cada mutante para determinar los mutantes que probablemente estaban atenuados.

Los clones seleccionados porque aparecían en la mezcla de entrada pero estaban muy reducidos en la mezcla recuperada se seleccionaron para un estudio adicional. También se seleccionaron clones adicionales con proporciones de entrada/recuperada cuestionables tras la evaluación visual de las películas obtenidas de las transferencias dot-blot. Se seleccionaron un total de 110 clones.

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Ejemplo 8 Identificación de genes de virulencia de A. pleuropneumoniae

Se determinó la secuencia flanqueante parcial para cada uno de los 110 mutantes mediante PCR inversa y secuenciación directa del producto. La PCR inversa se usó para generar productos de ADN flanqueantes para la secuenciación directa como se describió anteriormente. Las reacciones de secuenciación se realizaron usando el kit del terminador de secuenciación marcado BigDye^{TM} de PE Applied Biosystems (Foster City, CA) y se desarrolló en un secuenciador de ADN ABI Prism 377. Se usó el software Sequencher 3.0 (Genecodes, Corp. Ann Arbor, MI) para reunir y analizar los datos de secuencia. Los programas GCG [Devereux y Haerbeli, Wisconsin Package Version 9.0, 9.0 ed. Genetics Computer Group, Inc., Madison] se usaron para la búsqueda de secuencias homólogas en las bases de datos actualmente disponibles.

En la Tabla 2 se muestran los genes de A. pleuropneumoniae identificados y el grado al que las fases de lectura abierta se podían determinar. Se proporcionan los números de identificación de secuencia para las secuencias de nucleótidos así como se establecen las secuencias de aminoácidos deducidas.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Fases de lectura abierta de A. pleuropneumoniae

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Las posibles identidades enumeradas en la Tabla 3 (a continuación, Ejemplo 9) se asignaron por comparación con bases de datos bacterianas. Los 110 mutantes representaban a 35 grupos de inserciones de transposón exclusivas. El número de mutaciones diferentes por loci variaba, conteniendo siempre algunos clones una inserción en un sitio único de la ORF hasta clones que contenían inserciones en sitios diferentes de la misma ORF. Se detectaron tres inserciones múltiples en los 110 mutantes analizados según se determinó por la producción de bandas de PCR múltiples y la generación de electroferogramas de secuencias múltiples.

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Ejemplo 9 Exposición competitiva de mutantes de A. pleuropneumoniae con APP225 natural

Un clon representativo de cada uno de los grupos de mutantes exclusivos atenuados identificados anteriormente que no aparecía o estaba altamente reducido en la población recuperada se aisló de la placa mezcla original y se uso en un experimento de exposición competitiva con la cepa natural (AP225) para verificar la atenuación relativa causada por la mutación de transposón. Las cepas mutante y natural se hicieron crecer en BHIV^{10} hasta una DO_{590} de 0,6-0,9. Aproximadamente 5,0x10^{6} UFC de cada una de las cepas natural y mutante se añadieron a 4 ml de BHI. Se usó la dosis total de 4 ml para infectar a un cerdo SPF de 10-20 kg mediante administración intratraqueal con un tubo endotraqueal. Aproximadamente 20 horas después de la infección, se sacrificó a todos los animales supervivientes y se extirparon los pulmones. Los lavados pulmonares se realizaron como se describió anteriormente. Los recuentos de las placas se realizaron en BHIV^{10}N^{50} y BHIV^{10}N^{50}K^{100} para determinar los valores relativos de la cepa natural con respecto al mutante tanto en los cultivos de entrada como en las muestras de lavado pulmonar. Se calculó el índice de competitividad (IC) como el [UFC del mutante/UFC de la cepa natural]_{entrada}/[UFC del mutante/UFC de la cepa natural]_{recuperada}.

De los 35 posibles mutantes de transposón, 22 estaban significativamente atenuados, teniendo un índice de competitividad (IC) de menos de 0,2. Se eligió como control positivo un mutante de transposón que no parecía estar atenuado Basándose en los resultados del análisis de la MM a partir de uno de las mezclas. Este mutante tenía un IC in vivo de aproximadamente 0,6. También se realizó una competición in vitro para este mutante que dio como resultado un IC de 0,8. Posteriormente, se determinó que el mutante contenía una inserción entre los 2 ARNt de fenilalanina.

En la Tabla 3 se enumeran los índices de competitividad de los mutantes atenuados con una única inserción exclusivos. Los índices de competitividad para los mutantes de App de atpG, pnp y exbB indicaban que los mutantes eran incapaces de competir de forma eficaz con las cepas naturales y, por tanto, estaban atenuados.

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TABLA 3 Virulencia y función propuesta de los mutantes A. pleuropneumoniae

6

La precisión del IC parece ser muy buena ya que el mutante exbB compitió dentro de tres animales diferentes proporcionando IC de 0,003, 0,003 y 0,006. El uso del valor del índice de competitividad para asignar la atenuación en función de la competencia en un estudio en animales grandes se confirmó posteriormente en función de los resultados preliminares de vacunación en cerdos con 7 mutantes (n=8) descritos a continuación en el Ejemplo 11.

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Ejemplo 10 Caracterización de los genes de virulencia de A. pleuropneumoniae atenuados

Los genes de A. pleuropneumoniae identificados representan cuatro amplias clases funcionales: enzimas biosintéticas, componentes del transporte celular, componentes de la regulación celular y desconocidos. El gen atpG es importante para la presente invención.

El gen atpG, que codifica la subunidad F1-\gamma del complejo F_{0}F_{1} H^{+}-ATPasa, puede trabajar en la producción de ATP o en el transporte de protones hidrolizando el ATP. También se ha identificado un mutante de atpG atenuado relacionado en P. multocida. También se ha identificado otro gen atp, atpH, que codifica la subunidad F_{1} \delta. Entre los fenotipos de mutantes atp se incluyen el fenotipo sensible a ácido no adaptable [Foster, J Bacteriol. 173:6896-6902 (1991)], la pérdida de virulencia en Salmonella typhimurium [García del Portillo, y col., Infect Immun. 61:4489-4492 (1993)] y en P. multocida (arriba) y una reducción tanto en las frecuencias de transformación como en la inducción de los genes reguladores de competencia en Haemophilus influenzae Rd [Gwinn, y col., J Bacteriol. 179:7315-20 (1997)].

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Ejemplo 11 Seguridad y eficacia de los mutantes de A. pleuropneumoniae

Se usaron nueve grupos (n=8) de cerdos SPF (4-5 semanas de edad, 3-10 kg) para determinar la seguridad y eficacia de siete mutantes de A. pleuropneumoniae como cepas de vacunas atenuadas vivas. Se infectó a siete grupos por vía intranasal con 10^{10} UFC de cada mutante el día 1. Un grupo se vacunó los días 1 y 15 con la vacuna Pleuromune (Bayer) disponible en el mercado y un grupo sin exposición previa no se vacunó. El día 29, todos los grupos fueron expuestos por vía intranasal a 1-5 x 10^{5} UFC por cerdo de APP225 natural. Todos los animales supervivientes fueron sacrificados y sometidos a autopsia el día 42 del estudio. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

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TABLA 4 Eficacia de los mutantes de A. pleuropneumoniae

8

Los mutantes exbB, atpG, pnp y yaeA no produjeron mortalidad cuando se administraron a dosis de 10^{10} UFC por vía intranasal. Los grupos de mutantes fspA y tig presentaron una muerte cada uno y el grupo HI0379 (IC mayor de los 7 mutantes probados mostrados en el Ejemplo 9) presentó cuatro muertes. La DL_{50} de la cepa natural usando este modelo generalmente era de 1 x 10^{7} UFC, lo que indicaba que cada uno de estos mutantes se había atenuado al menos 100 veces y que existe una correlación razonable entre el IC y la atenuación.

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Ejemplo 12 Identificación de homólogos de especie en P. (Mannheimia) haemolytica

Basándose en las secuencias de genes de virulencia identificados en P. multocida y en A. pleuropneumoniae, se intentó identificar genes relacionados, es decir, homólogos de especie, en P. (Mannheimia) haemolytica. Se utilizó la PCR con los cebadores degenerados mostrados a continuación para intentar amplificar los genes de P. (Mannheimia haemolytica) según se ha indicado. Las secuencias de los cebadores, sintetizados por Sigma-Genosys (The Woodlands, TX), incluyen designaciones convencionales de una letra donde B indica cualquiera de (C, G o T), D indica cualquiera de (G, A o T), H indica cualquiera de (A, C o T), K indica cualquiera de (G o T), M indica cualquiera de (A o C), N indica cualquiera de (A, G, C o T), R indica cualquiera de (A o G), S indica cualquiera de (G o C), V indica cualquiera de (G, A o C), W indica cualquiera de (A o T) e Y indica cualquiera de (C o T).

atpG	TEF146 ATG GCN GGN GCN AAR GAR AT	SEQ ID NO: 176
	TEF148 GCN GCY TTC ATN GCN ACC AT	SEQ ID NO: 177
guaB	TEF240 GGN TTY ATY CAY AAA AAY ATG	SEQ ID NO: 178
	TEF243 TCT TTN GTR ATN GTN ACA TCR TG	SEQ ID NO: 179
pnp	TEF141 GCS GGY AAA CCR CGT TGG GAT TGG	SEQ ID NO:180
	TEFl42 CRC CTA ARA TRT CTG AAA GCA CCA C	SEQ ID NO:181
purF	TEF244 ATG TGY GGN ATY GTN GGN AT	SEQ ID NO: 182
	TEF247 CAT ATC AAT ACC ATA CAC ATT	SEQ ID NO: 183
yjgF	TEF162 GGN CCN TAY GTN CAR G	SEQ ID NO: 184
	TEF163 NGC NAC YTC NAC RCA	SEQ ID NO: 185

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Para amplificar los productos de PCR iniciales degenerados, se dispusieron 50 \mul de reacción usando tapón II XL x3,3 (PE Applied Biosystems), dNTP 200 \muM, 25 pmoles de cada uno de los cebadores apropiados, MgCl_{2} 0,8 mM, 0,5 U de ADN polimerasa rTth, XL (PE Applied Biosystems) y aproximadamente 1 \mug de ADN de TF1.

Las condiciones del ciclo fueron 94ºC durante 1,5 min; seguido de 35 ciclos de 94ºC durante 15 s, 40-60ºC durante 60 s, 72ºC durante 1,5 min y un mantenimiento final a 72ºC durante 5 min. Cada producto de PCR se purificó de la banda de un gel de agarosa usando el kit de extracción de gel QIAGEN (QIAGEN, Valencia CA).

Las reacciones de secuenciación se realizaron usando el kit de terminador de secuenciación marcado BigDye^{TM} de PE Applied Biosystems (Foster City, CA) y se desarrolló en un secuenciador de ADN ABI Prism 377. Se obtuvo la secuencia de doble hebra para las posibles fases de lectura abierta (ORF) de cada clon. Se usó el software Sequencher 3.0 (Genecodes, Corp., Ann Arbor, MI) para reunir y analizar los datos de secuencia. Se usaron programas GCG para confirmar la identidad de la ORF mediante la búsqueda de secuencias homólogas en bases de datos actualmente disponibles.

El kit Vectorette (Genosys Biotechnologies, The Woodlands, TX) se usó para obtener la secuencia flaqueante adicional de cada uno de los genes. Se prepararon bibliotecas Vectorette según el protocolo sugerido por el fabricante. Los componentes del kit de PCR GeneAmp XL de Perkin Elmer Applied Biosystems se usaron para crear los productos de PCR Vectorette con las condiciones de reacción siguientes. Se dispuso una reacción de 50 \mul usando tampón II XLx3,3 (PE Applied Biosystems), dNTP 200 \muM, 20 pmoles de cada uno de los cebadores apropiados (mostrados a continuación), MgCl_{2} 0,8 mM, 0,5 U de ADN polimerasa rTth, XL (PE Applied Biosystems) y 1 \mul de la biblioteca Vectorette apropiada. Las condiciones del ciclo fueron 94ºC durante 1,5 min; seguido de 35 ciclos de 94ºC durante 20 s, 6ºC durante 45 s, 72ºC durante 4 min; y un mantenimiento final de 72ºC durante 7 min. El cebador segundo de cada biblioteca fue el cebador Vectorette del fabricante.

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TABLA 5

10

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Los productos de PCR de Vectorette se purificaron a partir de bandas y se secuenciaron como se describió anteriormente. Las secuencias de polinucleótidos de los genes atpG, guaB, pnp, purF y yjgF se presentan en las SEQ ID NO: 166, 168, 170, 172 y 174, respectivamente. Los polipéptidos codificados por estos genes se presentan en las SEQ ID NO: 167, 169, 171.173 y 175, respectivamente.

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Listado de secuencias

Misc feature = características misc.

DNA = ADN

Artificial Sequence = Secuencia artificial

Description of Artificial Sequence: PRIMER = Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

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<110> Lowery E., David, et al.

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<120> Composiciones de vacuna antibacterial

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<130> 28341/00435

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<140> 09/809,665

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<141> 2001-03-15

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<150> 60/153,453

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<151> 1999-09-10

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<150> 60/128,689

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<151> 1999-04-09

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 09/545,199

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-04-06

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 197

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (210)..(1001)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> atpB

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1099

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A o T o G o C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1104

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A o T o G o C

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 264

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1972

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (364)..(1230)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> atpG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 289

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1357

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(813)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cap5E

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 271

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6132

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4032)..(4727)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> devB

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

24

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 232

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2438

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1635)..(2396)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> dnaA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 254

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

32

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2060

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (856)..(1389)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> dsbB

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4426

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2756)..(3211)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exbB

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

38

40

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

42

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6876

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (534)..(6863)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> fhaB1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

54

55

56

57

58

59

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3247

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1479)..(3245)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> fhaB2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

61

62

63

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 589

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

65

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3427

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1446)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> fhaC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

68

69

70

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 482

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

72

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1170

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (639)..(1022)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> greA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

75

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

77

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4666

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (980)..(2440)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> guaB

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

79

80

81

82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 487

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

83

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2364

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (191)..(1828)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Hi1501

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

85

86

87

88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 546

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

89

90

91

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1353

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> hmbR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(1351)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

92

93

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 450

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

95

97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4936

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1078)..(2769)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> hxuC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

98

99

100

101

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 564

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

103

104

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9814

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4762)..(7662)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> iroA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

106

107

108

109

110

111

112

113

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 967

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

114

115

116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2990

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1106)..(1564)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> kdtB

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

117

118

119

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1683

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (325)..(1230)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> lgtC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 219

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 226

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 270

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 274

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

121

122

123

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 302

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 219

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 226

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 270

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 274

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

124

125

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2029

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(499)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> mglB

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 928

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1007

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1740

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1808

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1816

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1820

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

126

127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

128

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2628

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (326)..(766)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> mioC

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

129

130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

131

132

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5191

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3203)..(4255)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> mreB

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

133

134

135

136

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 351

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

138

139

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2172

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1464)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> pnp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

140

141

142

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 488

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

143

144

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 633

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(631)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> purF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

145

146

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 210

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

147

148

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4788

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(876)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> rci

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Nucleotide at position 3084 is A, T, G or C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

149

150

151

152

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 292

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

153

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1618

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(1195)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> scpE

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

155

156

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 398

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

157

158

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 353

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(351)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unknown C1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

159

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

160

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 509

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(507)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unknown C2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

161

162

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

163

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 443

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(441)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unknown C3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

164

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

165

166

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8498

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unknown C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

167

168

169

170

171

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5798

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2686)..(4446)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unknown D1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

172

173

174

175

176

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 587

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

177

178

179

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5798

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (698)..(1468)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unknown D2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

180

181

182

183

184

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 257

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

185

186

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1788

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(600)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unknown K

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

187

188

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 200

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

190

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 278

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (108)..(278)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unknown O

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

191

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

192

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1020

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(597)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unknown P

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

193

194

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 199

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

195

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2584

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1042)..(2286)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> xylA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

196

197

198

199

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 415

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

200

201

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3501

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (298)..(1905)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> yabk

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

202

203

204

205

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 536

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

206

207

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3182

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1544)..(2809)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ygiK

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 452

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

208

209

210

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 422

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

211

212

213

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2787

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (463)..(936)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> yhcJ

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

214

215

216

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

217

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2787

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1949)..(2785)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> yiaO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

218

219

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 279

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

221

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2590

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (908)..(1294)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> yjgF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

223

224

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

226

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6642

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (463)..(1884)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> yleA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

227

228

229

230

231

232

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 474

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

233

234

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4835

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (407)..(1156)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> yojB

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

235

236

237

238

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 250

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

239

240

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3494

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2411)..(2719)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> yyaM

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

241

242

243

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

244

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: PRIMER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: PRIMER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1001

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1002

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1003

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: transposon insert

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

245

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1004

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1005

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1006

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1007

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1008

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1009

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 531

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> atpG

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

246

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1010

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1011

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1034

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cap5E

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1032)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

247

248

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 344

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

249

250

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4931

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> fhaB2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(4929)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1632

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

251

252

253

254

255

256

257

258

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1643

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1632

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any or unknown amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

259

260

261

262

263

264

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2009

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> hmbR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(2007)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

265

266

267

268

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 669

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

269

270

271

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 908

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> lgtC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(906)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

272

273

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 302

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

274

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2054

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> pnp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(2052)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

275

276

277

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 684

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

278

279

280

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1514

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> purF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1512)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

281

282

283

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 504

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

284

285

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 989

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> rci

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(987)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

286

287

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 329

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

288

289

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1190

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sopE

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1188)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

290

291

292

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 396

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

293

294

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2204

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unkK

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(2202)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

295

296

297

298

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 734

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

299

300

301

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unkO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(249)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

303

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\vskip1.000000\baselineskip

304

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 548

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> unkP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(546)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\vskip1.000000\baselineskip

305

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 182

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella multocida

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\vskip1.000000\baselineskip

307

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> apvA-or1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(69)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\vskip1.000000\baselineskip

308

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

310

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> apvA-or2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(62)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

311

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

312

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 653

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> apvB

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(651)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\vskip1.000000\baselineskip

313

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 217

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

314

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 242

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> apvC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(240)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

315

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

317

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 527

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> apvD

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(525)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 130

318

319

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 175

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 131

\vskip1.000000\baselineskip

320

321

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 867

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> atpG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(864)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

\vskip1.000000\baselineskip

322

323

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 133

\vskip1.000000\baselineskip

324

325

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 534

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(531)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

\vskip1.000000\baselineskip

326

327

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 177

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 135

\vskip1.000000\baselineskip

328

329

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 321

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> dksA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(318)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 136

\vskip1.000000\baselineskip

330

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

\vskip1.000000\baselineskip

331

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> dnaK

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(30)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 138

\vskip1.000000\baselineskip

332

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 139

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

333

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 453

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exbB

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(450)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 140

\vskip1.000000\baselineskip

334

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 141

\vskip1.000000\baselineskip

335

336

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 720

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> fkpA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(717)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 142

\vskip1.000000\baselineskip

337

338

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 143

\vskip1.000000\baselineskip

339

340

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 290

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> HI0379

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(287)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 144

\vskip1.000000\baselineskip

341

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 145

\vskip1.000000\baselineskip

342

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 273

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> hupA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(270)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 146

\vskip1.000000\baselineskip

344

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 345

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 147

\vskip1.000000\baselineskip

345

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 551

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> lpdA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(549)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 148

\vskip1.000000\baselineskip

347

348

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 149

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 149

\vskip1.000000\baselineskip

349

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1095

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Omp5-2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1092)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 150

\vskip1.000000\baselineskip

350

351

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 364

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 151

\vskip1.000000\baselineskip

352

353

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Omp5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1107)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 152

\vskip1.000000\baselineskip

354

355

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 369

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 153

\vskip1.000000\baselineskip

356

357

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1076

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> pnp new

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1074)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 154

\vskip1.000000\baselineskip

358

359

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 155

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 358

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 155

\vskip1.000000\baselineskip

360

361

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 156

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1055

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> potD

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1053)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 156

\vskip1.000000\baselineskip

362

363

364

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 351

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 157

\vskip1.000000\baselineskip

365

366

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 525

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> rpmF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(522)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 158

\vskip1.000000\baselineskip

367

368

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 159

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 174

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 159

369

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 160

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1302

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> tig

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1299)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 160

\vskip1.000000\baselineskip

371

372

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 161

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 433

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 161

\vskip1.000000\baselineskip

373

374

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 316

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> tRNA-glu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 162

\vskip1.000000\baselineskip

375

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 163

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> tRNA-leu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 163

\vskip1.000000\baselineskip

376

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 164

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 623

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> yaeE

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(621)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 164

\vskip1.000000\baselineskip

378

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 207

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 165

\vskip1.000000\baselineskip

380

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 866

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella (Mannheimia) haemolytica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(864)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> atpG

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 166

\vskip1.000000\baselineskip

381

382

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 167

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella (Mannheimia) haemolytica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 167

\vskip1.000000\baselineskip

383

384

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 168

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1463

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella (Mannheimia) haemolytica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1461)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> guaB

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 168

\vskip1.000000\baselineskip

385

386

387

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 487

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella (Mannheimia) haemolytica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 169

\vskip1.000000\baselineskip

388

389

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2150

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella (Mannheimia) haemolytica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(2148)

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> pnp

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<400> 170

\vskip1.000000\baselineskip

390

391

392

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 171

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 716

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella (Mannheimia) haemolytica

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 171

\vskip1.000000\baselineskip

393

394

395

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1517

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella (Mannheimia) haemolytica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1515)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> purF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 172

\vskip1.000000\baselineskip

396

397

398

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 173

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 505

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella (Mannheimia) haemolytica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 173

\vskip1.000000\baselineskip

399

400

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 174

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 386

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella (Mannheimia) haemolytica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(384)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> yjgF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 174

\vskip1.000000\baselineskip

402

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 175

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella (Mannheimia) haemolytica

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 175

403

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 176

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pasteurella (Mannheimia) haemolytica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: PRIMER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 176

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1013

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 177

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221>

\vskip0.400000\baselineskip

<222>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: PRIMER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 177

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1014

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: PRIMER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 178

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\hskip1cm

1015

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 179

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: PRIMER

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 6

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<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 179

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\hskip1cm

1016

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 180

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: PRIMER

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 180

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\hskip1cm

1017

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<210> 181

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: PRIMER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 181

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1018

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 182

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: PRIMER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 15

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<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 18

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<223> N = A or T or G or C

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 182

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1019

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: PRIMER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 183

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\hskip1cm

1020

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: PRIMER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

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<222> 3

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<223> N = A or T or G or C

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 6

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<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 184

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\hskip1cm

1021

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 185

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<211> 15

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: PRIMER

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

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<222> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A or T or G or C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 185

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1022

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 186

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: PRIMER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 186

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1023

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 187

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: PRIMER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 187

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1024

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 188

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: PRIMER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 188

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1025

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 189

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: PRIMER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 189

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1026

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 190

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: PRIMER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 190

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1027

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 191

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: PRIMER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 191

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1028

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 192

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: PRIMER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 192

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1029

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 193

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: PRIMER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 193

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1030

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 194

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: PRIMER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 194

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1031

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 195

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: PRIMER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 195

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1032

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 196

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: PRIMER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 196

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1033

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: PRIMER

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 197

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1034

Claims (18)

1. Una bacteria Pasteurella atenuada seleccionada entre Mannheimia haemolytica, Actinobacillus pleuropneumoniae y Haemophilus somnus, comprendiendo la bacteria una mutación en un gen representado por una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido atpG que comprende una secuencia aminoacídica al menos el 80% idéntica a la SEQ ID NO: 167, en la que la atenuación de la bacteria está causada por la mutación.

2. La bacteria de la reivindicación 1, en la que la mutación da lugar a la disminución de la expresión de un producto génico codificado por el gen mutado.

3. La bacteria de la reivindicación 1, en la que la mutación da lugar a la expresión de un producto génico inactivo codificado por el gen.

4. La bacteria de la reivindicación 1, en la que la mutación comprende la deleción de todo o parte del gen.

5. La bacteria de la reivindicación 1, en la que la mutación comprende una inserción en el gen.

6. La bacteria de cualquier reivindicación precedente, en la que la bacteria es Mannheimia haemolytica.

7. Una bacteria Pasteurella atenuada seleccionada entre Mannheimia haemolytica, Actinobacillus pleuropneumoniae y Haemophilus somnus, comprendiendo la bacteria una mutación en una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido atpG, en la que la secuencia polinucleotídica se hibrida con el complemento de la SEQ ID NO: 166 en condiciones rigurosas, comprendiendo las condiciones un lavado final en tampón que comprende SSCx2/SDS al 0,1%, de 35ºC a 45ºC.

8. La bacteria de la reivindicación 7, en la que la mutación está en la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 166.

9. Una composición inmunógena que comprende la bacteria según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Una composición de vacuna que comprende la composición inmunógena según la reivindicación 9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. La composición de vacuna según la reivindicación 10 que, además, comprende un adyuvante.

12. Un polinucleótido purificado y aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que tiene la SEQ ID NO: 167.

13. El polinucleótido de la reivindicación 12, que comprende la SEQ ID NO: 166.

14. El polinucleótido de la reivindicación 13, que es un ADN.

15. Un vector que comprende el ADN de la reivindicación 14.

16. El vector de la reivindicación 15 que es un vector de expresión, en el que el ADN está unido de forma operativa a una secuencia de ADN de control de la expresión.

17. Una célula hospedadora transformada o transfectada de forma estable con el ADN de la reivindicación 15 de forma que se permita la expresión del polipéptido codificado en la célula hospedadora.

18. Un polipéptido purificado que comprende la SEQ ID NO: 167.