MXPA03008296A - Composiciones de vacuna antibacteriana. - Google Patents

Abstract

Se identifican genes de virulencia de bacterias gramnegativas, permitiendo con esto la identificacion de agentes antibacterianos novedosos; que se dirigen a estos genes de virulencia y sus; productos, y la provision de mutantes bacterianos gramnegativos novedosos utiles en las vacunas.

Description

COMPOSICIONES DE VACUNA ANTIBACTERIANA Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud de patente de los Estados Unidos No. de serie 09/545,199, presentada el 6 de abril ele 2000, que reivindica el beneficio de las reivindicaciones de las solicitudes de patente provisional Nos. de serie 60/153,453, presentada el 10 de septiembre de 1999 y 60/128,689., presentada el 9 de abril de 199.9,-- - - - CAMPO DE A INVENCIÓN La presente invención en general se relaciona con la identificación de los genes responsables de la virulencia de bacterias Pasteurellaceae , permitiendo con esto la producción de cepas mutantes atenuadas novedosas útiles en vacunas u en la identificación de agentes antibacterianos novedosos que se dirigen a los genes de virulencia y sus productos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La familia Pasteurellaceae abarca diversos patógenos significativos que infectan a una amplia variedad de animales. Además de P. multocida, los miembros prominentes de la familia incluyen Pasteurella (Mannheimia) haemolytica , Actinobacillus pleuropneumoniae y Haemophilus somnus. P. multocida es un cocobacilo sin movimiento, gramnega t ivo , que se encuentra en la flora normal de muchos aniíticilas silvestres y domésticos y se sabe que piovncri enfermedades en muchas especies animales cn lodo el mundo [Biberstein, En M. Kilian, W. Frede r i c son , y E. L. Biberstein (ed.), Haemophilus, Pasteurella, y Actinobacillus . Academic Press, Londres, p. 61-73 (1981)] . Las manifestaciones de la enfermedad después de la infección incluyen septicemias, bronconeumonías, rinitis, e infecciones de heridas [Revisado en Shewen, et al., En C. L. Gyles y C. O. Thoen ( ed . ) , Pathogenesis of Bacterial Infections i n Animáis . Iowa State University Press, Ames, Ames, p. 216-225 (1993), incorporado en la presente como referencia] . La infección por P. multocida en general resulta de la invasión durante periodos de tensión, aunque la transmisión también se puede presentar por aerosol o exposición por contacto, o via vectores de pulgas y garrapatas. En aves de corral, la infección por P. multocida da lugar a septicemia de aguda a peraguda, en particular prevaleciente en pavos domésticos y aves acuáticas _ silvestres bajo condiciones de tensión asociadas con hacinamiento, puesta de huevos, muda, o cambios climáticos severos. En ganado, a una._ septicemia hemorrágica similar sigue infección y manifiesta condiciones entre las que se incluyen fiebre alta y depresión,- en general seguirlas por muerte rápida. Es más probable que l transmisión se presente a través de contacto por aerosol, aunque la infección también se puede presentar durante periodos de cambio climático significativo. En conejos, la infección da lugar a rinitis purulenta recurrente, en general seguida por conjuntivitis, otitis media, sinusitis, abscesos subcutáneos, y bronconeumonía crónica. En infecciones graves, la mortalidad de conejos surge de bronconeumonia fibrinosa aguda, septicemia, o endotoxemia. Los estados de enfermedad normalmente surgen durante periodos de tensión. En cerdos, los estados de enfermedad por P . m ul t o ci da común incluyen rinitis atrófica y pulmonía bacteriana. Condiciones similares de pulmonía también se detectan en perros, gatos, cabras, y ovejas. P . m ul t oci da se detecta comúnmente en la flora oral de muchos animales y por lo tanto es un contaminante común en heridas por mordeduras y rasguños.

Las cepas de P. multocida comúnmente se designan por serogrupo capsular y serotipo somático. Cinco serogrupos capsulares (A, B, D, E, y F) y 16 serotipos somáticos se distinguen por la expresión de antigenos característicos estables al calor. I, a mayoría de cepas son hospedero específicas y raramente infectan más de' uno o dos animales . La existencia de serotipos diferentes presenta un problema para la vacunación debido a que las bacterias celulares completas exterminadas tradicionales, comúnmente proporcionan sólo protección serotipo-especifica . Sin embargo, se ha demostrado que la infección natural con un serotipo puede conducir a protección inmunológica contra serotipos múltiples [Shewen, et al. , En C. L. Gyles y C. O. Thoen (Ed.), Pathogenesis of Bacterial Infections In Animáis . Io a State University Press, Ames, p. 216-225 (1993)] y la protección cruzada también se puede estimular al utilizar bacterias inactivadas desarrolladas in vivo [Rimler, et al. , Am J Vet Res. 42:2111-2121 (1981)] . Una cepa de P. multocida mutante espontánea viva se ha utilizado como una vacuna y ha mostrado que estimula una fuerte respuesta inmune [Davis, Poultry Digest. 20:430-434 (1987), Schlink, et ai., Avian Dis. 31 (1) . -13-21 (1987)] . Sin embargo, se ha mostrado que esta cepa atenuada se revierte a un estado virulento o provoca mortalidad si el recipiente de la vacuna está estresado [Davis, Poultry Digest. 20:430-434 (1987), Schlink, et al. , Avian Dis. 31 (1) :13-21 (1987)] . Otro miembro de la familia Pas teu reí la , A. pleuropneumoniae exhibe estricta especificidad hospedera para el cerdo y es el agente causante de pleuropneumonia porcina muy contagiosa.. La infección comúnmente se genera en' condiciones " intensivas de cria, y se cree que se presenta por un modo directo de transmisión. La enfermedad con frecuencia es fatal y, como resultado, conduce a pérdida económica grave en la industria productora de cerdos. La infección por A. pleuropneumoniae puede ser crónica o aguda, y la infección se caracteriza por una bronconeumonia necrótica, hemorrágica, acompañada por pleuritis fibrinosa. A la fecha, la virulencia bacteriana se ha atribuido a las proteínas estructurales, entre las que se incluyen polisacáridos capsulares serot ipo-especí f i eos , lipopolisacáridos, y proteínas superficiales, asi como también toxinas citoliticas extracelulares. A pesar de la purificación y, en algunos casos la clonación, de estos factores de virulencia, se entiende muy poco de la función exacta de estos factores de virulencia en la infección por A. pleuropneumoniae . Se han identificado doce serotipos de A. pleuropneumoniae con base en las diferencias antigénicas de polisacáridos capsulares y la producción de toxinas extracelulares. Los serotipos 1, 5, y 7 son los más relevantes para la infección por A. pleuropneumoniae en los Estados Unidos, mientras que los serotipos 1, 2, 5, 7, y 9 son relevantes en Europa. Existen al menos tres toxinas extracelulares significativas de A. pleuropneumoniae que son miembros de la familia haemolisina y se denominan como toxinas RTX. Las toxinas RTX se producen por muchas bacterias gramnegativas, entre las que se incluyen, E. coli, Proteus vulgar isa , y Pasteurella haemolytica , y las proteínas en general comparten características estructurales y funcionales. Las toxinas provenientes de los diversos serotipos difieren, sin embargo, en la especificidad hospedera, células blanco, y actividades biológicas. Las toxinas RTX de A. pleuropneumoniae incluyen Apxl, ApxII, y ApxIII. Apxl y ApxII tienen actividad haemolitica, con Apxl que es más potente.

ApxIII no muestra ninguna actividad haemolitica, aunque es citotóxica para macrófagos y neutrófiJos alveolares. La mayoría de los serotipos de A. pleuropneumoniae produce dos de estas tres toxinas. Por ejemplo, los serotipos 1, 5, 9, y 11 expresan Apxl y ApxII, y los serotipos 2, 3, 4, 6, y R expresan ApxII y ApxIII. El serotipo 10, sin embargo, produce sólo Apxl, y los serotipos 7 y 12 expresan sólo ApxII. Aquellos serotipos de A. pleuropneumoniae que producen tanto Apxl como ApxII son las cepas más virulentas de las bacterias. Las toxinas Apx demostraron ser factores de virulencia en modelos murinos e infección de cerdos utilizando bacterias tipo silvestre mutadas aleatoriamente [Tascon, et al. , Mol. Microbiol. 14:201-216 (1994)] . También se han generado otros mutantes de A. pleuropneamoniae con mutagénesis dirigida para inactivar el gen que codifica para la proteina de virulencia con membrana externa de AopA [Mulks y Buysee, Gene 165:61-66 (1995)] . Al menos once serotipos (1, 2, 5-9, 12-14 y 16) se han demostrado dentro de Mannheimia [Pasteurella] haemolytica [Angen, et al., Vet Microbiol 65(4):283-90 (1999)], una especie de Pasteurellaceae que es responsable por erupciones serias de pulmonía aguda en corderos, terneros y cabras neonatos, destetados, en crecimiento y adultos, [Ackermann, et al. , Microbes Inf.ect 2(9) :1079-88 (2000)] . El transporte, infecciones virales, sobrepoblación, y otras condiciones estresantes predisponen a los animales a la infección por M. haemolytíca [Ackermann, et al. , supra. ] Se cree que la leucotoxina (Lkt) de M. haemolytira desempeña una función significativa on la patogénesis, provocando lisis y apoptosis celular que conduce a la característica de patología pulmonar de fiebre por embarcación de bovinos [Highlander, et al. , Infect Immun 68 (1 ) : 3916-22 (2000)] asi como también a lesión pulmonar en pasteurelosis neumónica bovina [Jeyaseelan, et al. , Mi crob Pa thog 30(2) : 59-69 (2001)]. Lkt es una exotoxina formadora de poros que tiene propiedad única de inducir citólisis sólo en leucocitos y plaquetas de rumiantes [Jeyaseelan, et al. , (2001), supra. ] . La citólisis de muchos tipos celulares se suministra mediante ácido araquidónico (AA) y su generación mediante fosfolipasas se regula por los receptores acoplados a la proteina G [Jeyaseelan, et al. , (2001) supra] . Estudios recientes indican que la Lkt de M. haemolytica se une a CD18 bovino, la subunidad común de todas las integrinas beta2 [Jeyaseelan, et al. , Infect Immun 68(1) :12-9 (2000)]. También se ha mostrado que LFA-1 es un receptor de Lkt, Lkt que se liga a LFA-1 no es ninguna célula blanco esµeci I ica, Lkt que se liga a LFA-1 bovina se correlaciona con elevación de calcio y citólisis, y la expresión de LFA-1 bovina se correlaciona con la magnitud de citólisis celular blanco inducida por Lkt [Jeyaseelan, et al. , InL'ecL Tmmun 68(1) :12~ ) (2.000) |. En los esfuerzos para producir composiciones de vacuna, las bacterias celulares completas exterminadas tradicionales han '•proporcionado sólo protección serotipo-especifica [Maclnnes y Smart, supra] , sin embargo, se ha demostrado que la infección natural con un serotipo muy virulento puede estimular una fuerte inmunidad protectora contra múltiples serotipos [Nielsen, Nord Vet Med. 31:401-13 (1979), Nielsen, Nord Vet Med. 36:221-234 (1984), Nielsen, Can J Vet Res. 2.9:580-582 (1988), Nielsen, ACTA Vet Scand. 15:80-89 (1994)]. Una cepa definida de vacuna atenuada en vivo que produce una forma inactiva de la toxinaa ApxII ha mostrado la esperanza de una protección cruzada en cerdos [Prideaux, et al., Infección & Immunity 67:1962-1966 (1999) 1, mientras que otros mutantes no definidos atenuados en vivo también han mostrado esa esperanza [Inzana, et al. , Infect Immun . 61:1682-6, (1993), Paltineanu, efc al., In International Pig Veterinary Society, 1992, p. 214, Utrera, et al., In Interna ion l I' i y Veterinary Society, 1992, p. 213] . Debido a los problemas asociados con Las formulaciones de vacuna que comprenden cepas bacterianas con mutaciones espontáneas, indefinidas, existe una neceasidad " en la " técnica por la estructuración racional de cepas bacterianas atenuadas en vivo para utilizarse en vacunas que estimularán de manera segura la inmunidad protectora contra serotipos de Pasteurellaceae homólogos y heterólogos. También existe una necesidad por identificar las cepas bacterianas atenuadas y los genes requeridos para la virulencia bacteriana, facilitando asi el desarrollo de métodos para identificar agentes aritibacterianos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En general, la presente invención proporciona materiales y métodos la producción y uso de composiciones de vacuna que comprenden bacterias gramnegativas atenuadas; En un aspecto, las composiciones de vacuna de la invención comprenden especies atenuadas en la familia de bacterias Pasteurellaceae , que se conoce en la técnica y se describe, én parte, en De hirst, et ai., J. Bacteriol . 174:2002-2013 (1992), inco i p<> i a< lo <t? la presente como referencia en su totalidad. Las especies en la familia incluyen, de manera enunciativa: A. actinomycetemcomitans , A. capsula tus , A. equuli . , A. lignieresii , A. pleuropneumoniae (H. pleuropneumoniae) , A. seminis, A. suis (H. sui s) , ?. ureae (p. ureae) , A. capsulatus, Bisgaard taxon 11, H. aegyptius , H. aphrophilus , H. aphrophil?s (H. paraínfluenzae') , H. ducreyi, H. haemoglobinophilus , H. haemolyticus , H. influenzae , H. paracuniculus , H. paragallinarum, H. parahaemolyticus , H. parainfluenzae, (H. paraphrophilus) , H. paraphrohaemolyticus,_ H_. paraphrophilus ,. H. parasuis , H. parasuis tipo 5, H. segnís, H. somnus, grupo menor de Haemophilus , Haemophilus taxon C, P. aerogenes , P. anatis, P. avium (H. avium) , P. canis, P. dagmatis, P. • gallinarum, P. (Mannheimia) haemolytíca , P. trehalosi (P. haemolytica biotipo T), P. - langaa, P. multocida , P. pneumotropica , P. siomati , /'. volantium (H. parainfluenzae) , P. volantium, especie A de Pasteurella , especie' B de Pasteurella , y Haemophilus paraphrohaemolyticus . De preferencia, las composiciones de vacuna comprenden bacterias atenuadas de Pasteurella (Mannheimia) haemolytica , Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus somnus, o Pasteurella mulLocid . n una mod l i d niáe. preferida, las composiciones de vacuna de la invención comprenden Pasteurella multocida atenuada y cepas bacterianas de A. plueropneumoniae . Un aspecto de la invención proporciona organismos bacterianos gramnegat ivos que conLLuiicu una mutación funcional en una secuencia génica representada por cualquiera de las SEQ ID NOS: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, ""55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, Íl0, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 166, 16», 170, 172, y 174, y especies homologas de las mismas, en donde la mutación inhibe o suprime la expresión y/o actividad biológica de un producto génico codificado (es decir, el polipéptido codificado por un gen); la mutación funcional que produce virulencia atenuada de la cepa bacteriana. Las mutaciones funcionales que modulan (es decir, aumentan o disminuyen) la expresión y/o actividad biológica de un producto génico incluyen inserciones o supresiones en la región de codificación proteinica del gen mismo o en las secuencias responsables de, o implicadas en, el control de expresión del ej n. toe. muí nlo:: d ¡ -supresión incluyen aquellos en donde se suprime I od a o parte de una secuencia génica especifica. También se contemplan composiciones, y de preferencia composiciones de vacuna, que comprenden organismos bacterianos gramnegativos deformados y atenuados, que comprenden opcionalmente un adyuvante adecuado y/o un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. Para que una cepa modificada sea eficaz en una formulación de vacuna, la atenuación debe ser bastante significativa para evitar que el patógeno provoque síntomas clínicos severos, aunque también poco significativa para permitir la replicación y crecimiento limitados 'de las bacterias en el hospedero . La invención también proporciona polinucleótidos que codifican .para los productos génicos que se requieren para la virulencia en las bacterias gramnegativas. Los polinucleótidos de ? a invención incluyen ADN, tal como por ejemplo ADN complementario, ADN genómico que incluye ADN complementario o anti-sentido, y ADN total o parcialmente sintetizado; ARN, que incluye cepas sentido y antisentido; y ácidos nucleicos peptidicos como se describe, por ejemplo en Corey, TIBTECH 15:224-229 (1997) . I, :; po I i uno I oó t ¡ fio:: c| ó n i < ?:; d < -virulencia de la invención incluyen uel lo;; establecido en las SEQ ID NOs: 1, 3, 7, 9, 11, 13 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156 158, 160, 162, 163, 164, 166, 168, 170, 172, y 174, o especies homologas de las mismas, polinucleótidos que codifican para un producto génico de virulencia codificado por un polinucleótido de las SEQ ID NOs 1, 3, 7, 9, 11, ""13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 166 168, 170, 172, y 174, o una especie homologa de las mismas, y el polinucleótido que se hibrida, bajo condiciones de moderada a altamente estrictas, a la cadena no codificante (o complemento) de cualquiera de los polinucleótidos establecidos en las SEQ ID NOs: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 8 , 100, 102, 10 , I 0 (. , I 0 H , 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 1 6, I H, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 166, 168, 170, 172, y 174, o especies homologas d o las mismas. Por lo tanto, la invención abarca las secuencias génicas a partir de Pa s t e urel l a cea e establecidas en las SEQ ID NOs: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 166, 168, 170, 172, y 174, asi como también las secuencias génicas relacionadas a partir de otros organismos bacterianos gramnegativos , incluyendo los que se presentan en la naturaleza (es decir, las especies homologas) y las variantes induc da-s -artificialmente' de' los mismos. La invención también abarca polinucleótidos que codifican para polipéptidos deducidos de cualquiera de los polinucleótidos establecidos en las SEQ ID NOs: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 1 , 122 , 124, 13 , 1 8, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 164, 1 6, X 68, 170, 172, y 174, y especies homologas de las mismas. El conocimiento de la secuencia de un polinucleótido de la invención hace que esté disponible fácilmente cada fragmento de ese polinucleótido. La invención por lo tanto proporciona fragmentos de un polinucleótido de la invención. La invención también abarca construcciones de expresión que comprenden polinucleótidos de la invención. También se contemplan células hospederas transfectadas o sometidas a electroporación, transformadas, con un polinucleótido de la invención. La invención proporciona los métodos para producir un polipéptido codificado por un polinucleótido de la invención que comprende los pasos de desarrollar una célula hospedera de la invención bajo condiciones que permitan, y de preferencia estimulen, la expresión de un producto génico codificado por el polinucleótido, y aislar el producto génico de la célula hospedera o el medio de su desarrollo.

La identificación de los polinucleótidos de la invención hace que estén disponibles los polipéptidos codificados. Los polipéptidos de la invención incluyen proteínas de longitud toi l y fragmentadas, o truncadas; variantes de las mism s; proteínas de fusión, o quiméricas; y análogos, entre los que incluyen aquellos en donde se han introducido sustituciones conservadoras de aminoácidos en los polipéptidos tipo silvestre. También se proporcionan los anticuerpos que reconocen específicamente los polipéptidos de la invención, e incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos de cadena individual, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, y anticuerpos injertados a la región para determinación complementaria (CDR, por sus siglas en inglés), así como también los compuestos que incluyen las secuencias CDR que reconocen específicamente un polipéptido de la invención. La invención también proporciona anticuerpos inmunoespecí fieos anti-idiotípicos para los anticuerpos de la invención. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporcionan los métodos para identificar agentes antibacterianos novedosos que modulan la función de los genes de virulencia de bacterias gramnegativas o los productos génicos. Los métodos de la invención incluyen la selección de agentes potenciales para la capacidad de interferir con la expresión de productos génicos de virulencia codificados por las sernono i ;; de ADN establecidas en cualquiera de las SEQ TD NOS: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 1, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 166, 168, 170, 172, y 174, o especies homologas de las mismas, o la selección de agentes potenciales para la capacidad de interferir con la función biológica de un producto génico bacteriano codificado en la totalidad o una porción de una secuencia de ADN establecida en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 166, 168, 170, 172, y 174, especies homologas de las mismas, o la cadena complementaria de las mismas, seguidas por la identificación de agentes que proporcionan resultados positivos en estos análisis de selección. En particular, los agentes que interfieren con la expresión de productos génicos de virulencia .incluyen polinucleótidos anti-sentido y ribozimas que son complementarias para las secuencias génicas de virulencia. La invención también abarca los métodos para modular transcripción de los productos génicos de la invención a través del uso de .la formación e espirales triples oligonucleótido-dirigidas. Loa agentes que interfieren con la función de productos génicos de virulencia incluyen las variantes de los productos génicos de virulencia, los patrones de unión de los productos génicos de virulencia y las variantes de estos patrones de unión, e inhibidores enzimáticos (cuando el producto es una enzima ) . Se proporcionan agentes antibacterianos novedosos identificados por los métodos descritos en la presente, así como también los métodos para tratar a un sujeto que sufre de una infección con bacterias gramnegativas que implican la administración de estos agentes antibacterianos novedosos en una cantidad eficaz para reducir la presencia bacteriana.

Muchos aspectos y ventajas adicionales de la invención se harán más evidentes para aquellos con experiencia en la técnica en el momento de tomar en consideración la siguiente descripción detallad de la invención que describe las modalidades preparadas actualmente de las mismas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN "Genes de virulencia", en el sentido en que se utiliza en la presente, son genes cuya función o productos se requieren para el establecimiento y/o mantenimiento exitoso de una infección bacteriana en un animal hospedero. De esta forma, los genes de •virulencia y/o las proteínas codificadas por- los mismos están implicadas en la patogénesis del organismo hospedero, aunque puede no ser necesario para el desarrollo. "Mutagénesis marcada por características (STM)", en el sentido en que se utiliza en la presente, en general es un método descrito en la publicación de patente internacional No. WO 96/17951, incorporada en la presente como referencia, e incluye, por ejemplo, un método para identificar los genes bacterianos requeridos para la virulencia en un modelo murino de bacteremia. En este método, se producen cepas bacterianas que cada una tienen una mutación aleatoria en el genoma al utilizar la integración del transposón; cada mutación de inserción porta una marca característica de ADN diferente que permite diferenciar a los mutantes entre sí. Las -marcas comprenden " regiones centrales de 40 pares de bases variables flanqueadas por "ramas" no variables de 20 pares de bases que permiten que las porciones centrales se coamplifiquen por la reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Las cepas mutantes marcadas se ensamblan en placas microtituladoras, luego se combinan para formar la "agrupación de inóculos" para estudios de infección. En un momento adecuado después de la inoculación, las bacterias se aislan del animal y se agrupan para formar la "agrupación recuperada". Las marcas en la agrupación recuperada y las marcas en la agrupación de inóculos se amplifican por separado, se marcan, y luego se utilizan para filtros de sonda arreglados con todas las marcas diferentes que representan los mutantes en el inoculo. Las cepas mutantes con virulencia atenuada son aquellas que no se pueden recuperar del animal infectado, es decir, las cepas con marcas que proporcionan señales de hibridación cuando se sondean con las marcas provenientes de la agrupación de inóculos aunque no se sondean con .. las. marcas -de- -la - agrupación recuperada. En una variación de este método, se pueden utilizar métodos para detección no radioactiva tales como por ejemplo, quimioluminiscenc i a La mutagénesis marcada por caracterís icas permite que muchas cepas mutantes de inserción se seleccionen simultáneamente en un solo animal para pérdida de virulencia. La selección de diecinueve agrupaciones de cepas mutantes de P. m ul t o ci da dio por resultado en la identificación de más de 60 cepas con virulencia reducida, se confirmó que muchas de las mismas tuvieron atenuación de virulencia mediante la determinación posterior de un LD50 aproximado para mutantes individuales. La selección de mutantes de A . pl e u ropn e umon i a e dio por resultado en la identificación de más de 100 cepas que tienen mutaciones en 35 genes diferentes. De éstos, las mutaciones en 22 genes dieron por resultado en cepas de A . pl europn eumoni a e significativamente atenuadas. La secuencia nucleotídica del marco de lectura abierta rota por la inserción del transposón se determinó al secuenciar ambas cadenas y se dedujo una secuencia codificada de aminoácidos. La novedad tanto del polinucleótido como de las secuencias de aminoácidos se determinó por comparación de las secuencias con ADN y las secuencias de base de datos proteínica. El conocimiento de los genes de virulencia en estas especies permitió l identificación de especies homologas en P. (Mannhei ia) haemolyti ca . Se proporciona la identificación de genes de virulencia bacteriana, y más particularmente P. multocida, A. pleu ropneumoni a e y P. (Mannheimia) haemolytica para microorganismos que exhiben virulencia reduci.da- (-es- decir, cepas atenuadas), que son útiles en vacunas. Estos microorganismos incluyen mutantes de Pasteurellaceae que contienen al menos una mutación funcional que inactiva a un gen representado por cualquiera de las SEQ ID NOS: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 166, 168, 170, 172, y 174. La persona con experiencia normal en la técnica se dará cuenta que se puede presentar una "mutación funcional" en regiones para codificación proteínica de un gen de la invención, así como también en las regiones reguladoras que modulan la transcripción de ARN del gen de virulencia . La persona con experiencia norm l Lambió.n 5 apreciará que las cepas atenuadas de P. multocida , A. pleuropneumoniae y P. (Mannheimia ) haemolytica de la invención incluyen aquellas que portan más de una mutación funcional,. . .Más de ..una., mutación puede producir grados de atenuación aditivos o sinérgicos. 10. Se pueden preparar mutaciones múltiples mediante diseño o pueden surgir accidentalmente a partir de un evento de supresión que originalmente estaba destinado a introducir una sola mutación. Un ejemplo de una cepa atenuada con múltiples supresiones es una 15 cepa de Salmonella typhimurium en donde los genes cya y crp se suprimen funcionalmente. Esta cepa de S. typhi unium mutante ha mostrado una esperanza corno una vacuna viva . La identificación de genes de virulencia en 20 P. multocida , A. pleuropneumoniae y P. (Mannheimia ) haemolytica puede proporcionar información que se relaciona con genes similares en otras especies patogénicas. Como un ejemplo, la identificación del gen aroA condujo a la identificación de genes 25 conservados en un número diverso de patógenos, entre los que se incluyen Aeromonas hydrophila , Aeromonas salmonicida , Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis , Salmonella dublin, Salmonel a gallanerum, Bordella pertusis, Yersinia entericolitica, Neisseria gonorrhoeae, y BacJ Llus anthracis . En muchas de e as especies, l s copas bacterianas atenuadas que portan mutaciones en el gen aroA han demostrado ser eficaces en formulaciones de vacuna. Al utilizar las secuencias génicas de virulencia identificadas en P. multocida , se pueden identificar genes similares u homólogos en otros organismos, en particular dentro de la familia de Pasteurella , asi como también A. pleuropneumoniae , P.

(Mannheimia ) haemolytica y Haemophilus somnus . Asimismo, la identificación de genes de virulencia de A. pleuropneumoniae puede permitir la identificación de genes relacionados en otros organismos. La hibridación southern utilizando los genes de P. multocida , A. pleuropneumoniae y P. (Mannheimia ) haemolytica como soluciones de ensayo puede identificar estos genes relacionados en bibliotecas cromosómicas derivadas de otros organismos. Alternativamente, PCR puede ser igualmente eficaz en la identificación de genes a través de la unión de especies. Todavía como otra alternativa, también se puede utilizar la complementación de, por ejemplo, un mutante de P. uí to ida con una bihlioreoa cromosómica a partir de otras especies para identificar genes que tengan la misma actividad de virulencia o una relacionada. La iden t i I i oa c i n fio genes de vi ulencia rela ion da po lo an l o so puo o conducir para la producción de una cepa atenuada del otro organismo que puede ser útil todavía como otra formulación de vacuna. Los ejemplos de genes de P. multocida que se ha demostrado existen en otras especies (por ejemplo, P. (Mannheimia) haemolytica , A. pleuropneumon-iae y H. 'somnus)- incluyen -genes exbB , atpG, pnp, guaB y yjgF. Las cepas atenuadas de P. multocida identificadas al utilizar STM son mutantes de inserción en donde un gen de virulencia se ha hecho no funcional a través de la inserción de secuencias de transposón ya sea en el marco de lectura abierta o en las secuencias reguladoras de ADN . Estos mutantes de inserción todavía contienen toda la información genética requerida para virulencia bacteriana y posiblemente pueden revertirse a un estado patogénico mediante la supresión del transposón insertado. Por consiguiente, en la preparación de una formulación de vacuna, es conveniente tomar la información recogida de la cepa atenuada y crear una cepa de un mutante de supresión en donde algo, la mayoría, o toda la secuencia de gen de virulencia se haya eliminado, evitando así la posibilidad de que las bacterias se revertirán a un estado virulento. Se espera que las propiedades de la vacuna de un mutante de inserción atenuado, identificadas al utilizar STM, sean iguales o similares a aquellas de las bacterias que portan una supresión en el mismo gen. Sin embargo, es posible que una mutación por inserción pueda ejercer efectos "polares" sobre las secuencias génicas colindantes, y como resultado, el mutante de inserción puede poseer características distintas de una cepa mutante con una supresión en la misma secuencia génica. Se pueden construir mutantes de supresión utilizando cualquiera de las varias técnicas conocidas y practicadas rutinariamente en este campo. En un ejemplo, se puede emplear una estrategia utilizando marcadores contraseleccionables que comúnmente se han utilizado para suprimir genes en muchas bacterias. Para una revisión, véase, por ejemplo, Reyrat, et ai., Inf e c ti on an d Imm un i ty 66 : 4011-4017 (1998), incorporado en la presente como referencia. En esta técnica, con frecuencia se emplea una estrategia de doble selección cuando se construye un plasmado qué codifica "para un marcador tanto seleccionable como cont raseleccionable , con secuencias de ADN flanqueantes derivadas de ambos lados de la supresión deseada. El marcador seleccionable se utiliza para seleccionar bacterias en las cuales se ha integrado el plásmido en el genoma en la ubicación y forma adecuada. El marcador contraseleccionable se utiliza para seleccionar el porcentaje muy pequeño de bacterias que han eliminado espontáneamente el plásmido integrado. Una fracción de estas bacterias contendrá entonces sólo la supresión deseada sin otro ADN extraño presente. La clave para el uso de esta técnica es la disponibilidad de un marcador contraseleccionable adecuado . En otra técnica, se utiliza el sistema cre-l ox para la recombinación sitio-específica de ADN. El sistema consta de secuencias l ox de 34 pares de bases que se reconocen por el gen de recombinasa ere bacteriana. Si los sitios l ox están presentes en el ADN en una orientación adecuada, el ADN flanqueado por los sitios iox se eliminará por la recombinasa ere , dando por resultado en la supresión de todas las secuencias excepto para una copia restante de la secuencia iox. Utilizando técnicas de recombinación estándar, es posible suprimir el gen blanco de interés en el genoma de P. multocida , A. pleuropneumoniae o P. (Mannheimia) haemolytica y reemplazarlo con un marcador seleccionable (por ejemplo, un gen que codifica para resistencia a kanamicina) que está flanqueado por los sitios lox. La expresión transitoria (mediante la electroporación de un plásmido suicida que contiene el gen ere bajo el control de __. un -promotor que - -funciona en P. multocida , A. pleuropneumonia , o P. (Mannheimia ) haemolytica) de la recombinasa ere debe dar por resultado en la eliminación eficaz del marcador flanqueado lox. Este proceso podría producir un mutante que contenga la mutación de supresión deseada y una copia de las secuencias lox. En otro enfoque, es posible reemplazar directamente una secuencia suprimida deseada en el genoma de P. multocida , A. pleuropneumoniae o P. (Mannheimia) haemolytica con un gen marcador, tal como por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP), ß-galactosidasa, o luciferasa. En esta técnica, los segmentos de ADN que flanquean una supresión deseada se preparan mediante PCR y se clonan en un vector suicida (sin replicación) para P. multocida , A. pleuropneumoniae, o P. (Mannheimia) haemolytica . Un cásete de expresión, que contiene a un activo promotor en P. multoci da , A. pl europneumon i ae , o P. (Mannheimia) haemolytica y el gen marcador adecuado, se clona entre las secuencias flanqueantes. El plásmido se -intro'duce en P". multocida , A. pleuropneumoniae o P. (Mannheimia) haemolytica tipo silvestre. Las bacterias que incorporan y expresan el gen marcador (probablemente a una frecuencia muy baja) se aislan y se examinan para ol evento o recombinación adecuada (es decir, el reemplazo del gen tipo silvestre con el gen marcador) . La virulencia reducida de estos organismos y su inmunogenicidad se puede confirmar mediante la administración a un sujeto animal. Mientras que es posible para un microorganismo no virulento de la invención que se administre solo, uno o más de estos microorganismos mutantes de preferencia se administran en una composición de vacuna que contiene adyuvantes y diluyentes o portador farmacéuticamente aceptables, adecuados. Los portadores deben ser "aceptables" en el sentido de que sean compatibles con el microorganismo no virulento de la invención y no perjudicial para el sujeto que será inmunizado. Típicamente, los portadores serán agua o solución salina que serán estériles y estarán libres de pirógeno. El sujeto que será inmunizado es un sujeto que necesita de protección contra una enfermedad provocada por una forma virulenta de P. multocida , A. pleuropneumoniae , P. (Mannheimia ) haemolytica u otros microorganismos patogénicos. Se apreciará que la vacuna de la invención puede ser útil en los campos de la medicina humana y la medicina veterinaria. De esta forma, el suj'eto que será inmunizado puede ser un ser humano u otro animal, por ejemplo, animales de granja entre los que se incluyen vacas, ovejas, cerdos, caballos, cabras y aves de corral (por ejemplo, pollos, pavos, patos y gansos) ; animales de compañía tales como por ejemplo, perros y gatos; animales exóticos y/o de parques zoológicos; y animales de laboratorio entre los que se incluyen ratones, ratas, conejos, cobayos, y hámsteres . La invención también proporciona los polipéptidos y polinucleótidos correspondientes requeridos para la virulencia de P. multocida, A. pleuropneumoniae o P. (Mannheimia) haemolytica. La invención incluye tanto polinucleót idos que se presentan en la naturaleza como los que no se presentan naturalmente y los productos polipeptídicos de los mismos. Los productos de virulencia que se presentan en la naturaleza incluyen genes distintos y especies polipeptídicas, así como también, las especies homologas correspondientes expresadas en organismos distintos de las cepas P. multocida , A. pleuropneumoniae, o P. (Mannheimia) haemolytica. Los productos de virulencia que no se presentan naturalmente incluyen variantes de los productos que se presentan naturalmente tales como por ejemplo, los análogo y productos de virulencia que incluyen modificaciones covalentes. En una modalidad preferida, la -invención proporciona polinucleótidos de virulencia que comprenden las secuencias establecidas en las SEQ ID NOs: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 166, 168, 170, 172, y 174 y especies homologas de las mismas, y polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos codificadas por los polinucleótidos . La presente invención proporciona polinucleótidos purificados y aislados, novedosas, de P. mul tocida , A . pl europn emn oni a e . y P . (Mannheim i a ) ha em olyti ca (por ejemplo, secuencias de ADN y transcripciones de ARN, las dos cadenas sentido y antisentido complementarias) que codifican para los productos génicos de virulencia bacteriana. Las secuencias de ADN de la invención incluyen secuencias genómicas y de ADN-c,- así' como también', secuencias de ADN sintetizadas 'químicamente total o parcialmente. El ADN genómico de la invención comprende la región de codificación proteinica para un polipéptido de la invención e incluye variantes que se pueden encontrar en otras cepas bacterianas de la misma especie. "Sintetizado", en el sentido en que se utiliza en la presente, y como se entiende en la técnica, se refiere a los métodos para la producción de polinucleótidos puramente químicos, según se opone a los métodos enzimáticos. Las secuencias de ADN sintetizadas "por completo" por lo tanto se producen completamente por medios químicos, y los ADN sintetizados "parcialmente" abarcan aquellos en donde se producen sólo porciones del ADN resultante por medios químicos. Las secuencias preferidas de ADN que " codifican para los productos génicos de virulencia de P . m ul t o ci da se establecen en la-s SEQ ID NOs: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, -11-4," 116, 118, y 120, y especies homologas de las mismas. Las secuencias preferidas de ADN de A . pl europn eumoni a e que codifican los productos génicos de virulencia se establecen en las SEQ ID NOs: 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163, y 164, y 'especies homologas de las mismas. Los productos preferi os do gen de virulencia de P. (Ma nnh eimi a ) ha emoly li cd ae establecen en las SEQ ID NOs: 166, 168, 170, 172 y 174, y especies homologas de las mismas. Alguien con experiencia en la técnica apreciará fácilmente que el ADN preferido de la invención comprende una molécula de doble cadena, por ejemplo, las moléculas que tienen las secuencias establecida en las SEQ ID NOs: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108-, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 166, 168, 170, 172, y 174 y especies homologas de las mismas, junto con la molécula complementaria (la "cadena no codificante" o "complemento") que tiene una secuencia deducible de la secuencia SEQ ID NO: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 166, 168, 170, 172, y 174, de acuerdo con las reglas Watson-Crick para formación de pares, de„ bases del ADN. También se- prefieren los polinucleótidos que codifican para los productos génicos codificados por cualquiera de los polinucleótidos establecidos en las SEQ ID NOs: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 166, 168, 170, 172, y 174 y especies homologas de las mismas. La invención también abarca las especies, de preferencia bacterianas, homologas del ADN de P. mul t ocida , A . pl europn e umon ia e y P .

(Mannheimi a ) ha emolyti ca .

La información de la secuencia de polinucleótidos proporcionada por la invención hace posible la identificación y aislamiento de polinucleótidos que codifican para las moléculas de virulencia bacteriana relacionadas por técnicas bien conocidas que incluyen hibridación Southern y/o Northern, y reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Los ejemplos de polinucleótidos relacionados incluyen polinucleótidos que codifica para polipéptidos homólogos con un producto gen ico dra vi I HII H'Í.I codificado mediante cualquiera de los polinucleótidos establecidos en las SEQ ID NOs: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 166, 168, 170, 172, y 174, y las especies homologas de las mismas, y polipéptidos estructuralmente relacionados que comparten una o más propiedades biológicas y/o físicas de un producto génico de virulencia de la invención. La invención también abarca secuencias de ADN que codifican para productos génicos bacteriano^ que se hibridan bajo condiciones de moderada a bastante estrictas para la cadena no codificante, o complemento, de cualquiera de los polinucleótidos establecidos en las SEQ ID NOs: 1, 3, 7, 9, 11", 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, y 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 166, 168, 170, 172 y 174, y las especies homologas de las mismas. So con I omp 1 an las secuencias de ADN que codifican para polipéptidos de virulencia que se hibridan a las mismas aunque para la degeneración del código genético por la invención. Las condiciones de alto rigor de ejemplo incluyen un lavado . final en ... amortiguador que comprende 0.2X SSC/SDS al 0.1%, a 65°C y hasta 75°C, I mientras que las condiciones de rigor moderadas de ejemplo incluyen un lavado final en amortiguador que comprende 2X SSC/SDS al 0.1%, a 35°C y hasta 45°C. Se entiende en la técnica que se pueden alcanzar condiciones de rigor equivalentes a través de la variación de temperatura y amortiguador, o concentración salina como se describe en Ausubel, e t a l . (Eds.), Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons (1994), pp . 6.0.3 a 6.4.10. Las modificaciones en las condiciones de hibridación se pueden determinar empíricamente o calcular exactamente con base en la longitud y el porcentaje de la formación de pa es de ases rio guanosina/ci tosina (GC) de la solución de ensayo. Las condiciones de hibridación se pueden calcular como se describe en Sambrook, et a l . , (Eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York (1989), pp . 9.47 a 9.51. También se proporcionan construcciones de expresión recombinante de reproducción autónoma tales como por ejemplo, plásmido y vectores de ADN viral que incorporan secuencias génicas de virulencia. También se proporcionan las construcciones de expresión en donde los polinucleótidos que codifican para polipéptidos de virulencia se unen operativamente a una secuencia de ADN para el control de expresión endógena o exógena y un terminador de transcripción. Los genes de virulencia se pueden clonar mediante PCR, utilizando ADN genómico de P. mul t ocida como molde. Para facilidad de inserción del gen en los vectores de expresión, los cebadores PCR se seleccionan de tal forma que el gen amplificado por PCR tenga un sitio enzimático de restricción en el extremo 5' que precede al codón de iniciación ATG, y un sitio enzimático de restricción en el extremo 3' después del codón de terminación TAG, TGA o TAA. Si se desea, los codones en el qen se cambian, sin cambiar los aminoácidos, dea amoldo con el codón de E . col . i de preferencia d scrito por Grosjean y Fiers, Gen e , 18:199-209 (IXX), y Konigsberg y Godson, Pro c . Na t i . Aca d . Sci . (USA) , 80 : 68 1 - 691 (1983) . La optimización de uso del codón puede conducir a un aumento en la expresión- del producto génico cuando se produce en E . co l i . Si ol producto génico será producido extracelularmente, ya sea en el periplasma de E . col i u otras bacterias, o en el medio de cultivo celular, el gen se clona sin su codón de iniciación y se coloca en un vector de expresión detrás de una secuencia de señal. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporcionan células hospederas, entre las que se incluyen células procariotas y eucariotas, transformadas, transfectadas, o sometidas a electroporación ya sea estable o temporalmente, con las secuencias polinµcl.eitídicas de la invención de una manera que permitan la expresión de los polipéptidos de virulencia de la invención. Los sistemas de expresión de la invención incluyen sistemas celulares bacterianos, de levadura, fúngales, virales, de invertebrados, y de mamíferos. Las células hospederas de la invención son una valiosa fuente de inmunógenos para el desarrollo de anticuerpos cspoc i í i camón I e ol i nmuno r roa <• I i o;: oon el producto génico de virulencia. 1.a:; r- lnl :; hospederas de la invención son v i. si blemen I e ú l i lo.*; on los métodos para la producción a gran escala de polipéptidos de virulencia en donde las células se desarrollan en un medio de cultivo adecuado y los productos polipep ídicos deseados se aislan < o la células o del medio en el cual las células se desarrollaron mediante, por ejemplo, purificación por inmunoafinidad o cualquiera de las muchas técnicas de purificación bien conocidas y practicadas habitualmente en este campo. Cualquier célula hospedera adecuada se puede utilizar para la expresión del producto génico, tal. como p.or ejemplo, E. coli, otras bacterias, entre las que se incluyen P. multocida , Bacillus y S. aureus, levaduras, entre las que se incluyen Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae , células de insectos, o células mamíferas, entre las que se incluyen células CHO, que utilizan vectores adecuados conocidos en la técnica. Las proteínas se pueden producir directamente o se pueden fusionar a un péptido o polipéptido, y ya sea intracelular o extracelularmente por secreción en el espacio periplásmico de una célula bacteriana o en el medio de cultivo celular. La secreción de una proteína requiere de un péptido señalado (l m iép conocido como pre-secuencia); se conocen v r ias secuencias señaladas de procariot.es y euc riólos fiara que funcionen para la secreción de proteínas recombinantes. Durante el proceso de secreción de proteínas, el péptido señalado se elimina por la peptidasa señalada para proporcionar la prol. oí na madura . Para simplificar el proceso de purificación de proteína, se puede agregar una marca de •purificación ya sea en el extremo 5' ó 3' de la secuencia de codificación génica. Las marcas de purificación utilizadas comúnmente incluyen un estiramiento de seis residuos de histidina (patentes de los Estados Unidos Nos. 5,284,933 y 5,310,663), una marca de afinidad con estreptavidina descrita por Schmidt y Skerra, Protein, Engineering, 5:109-122 (1993), un péptido FLAG [Hopp et al., Biotechnology, :1205-1210 (1988)], glutatión S-transferasa [Smith y Johnson, Gene, 67:31-40 (1988)], y tioredoxina [LaVallie et al., Bio/Technology, 11:181-193 (1993)]. Para eliminar estos péptidos o polipéptidos, se puede insertar un sitio de reconocimiento de escisión proteolítica en la unión de fusión. Las proteasas utilizadas comúnmente son factor Xa, trombina, y enterocina sa . La invención también proporciona polipópl idos de virulencia purificados y aislados de P . m u l l o c i da , A . pl europn eumoni a e y P . (Mannheimi a) de ha emolyt i ca codificados por un polinucleótido de la invención. Actualmente se prefieren los polipéptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos cod i í ¡cadas por cualquier de los polinucleótidos establecidos en las SEQ ID NOs: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 164, 166, 168, 170, 172 y 174, y especies homologas de las mismas. La invención abarca polipéptidos de virulencia codificados por un ADN seleccionado del grupo que consiste: a) la secuencia de ADN establecida en cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23; 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53,~~55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 164, 166, 168, 170, 172, y 174 y especies homologas de las mismas; b) moléculas de ADN que codifican para polipéptidos de P . m ul t oci da , A . pl e u ropn e umo i a e o P . (M n n h i m i a ) ha em oly ti ca , codificados por cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 164, 166, 168, 170, 172, y 174, y especies homologas de las mismas; y c) una molécula de ADN, que codifica para un producto génico de virulencia que se hibrida bajo condiciones ligeramente estrictas para el ADN de (a) o (b) . La invención también abarca los polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 99%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 55%, y al menos aproximadamente 50% de identidad y/o homología con los polipéptidos preferidos de la invención. La "identidad" de la secuencia de aminoácidos porcentual con respecto a los polipéptidos preferidos de la invención se define en la presente como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la ' secuencia candidato que sean idénticos con los residuos en la secuencia de producto génico de virulencia después de aJ inear ambas secuencias e introducir huecos, si es necesario, hasta alcanzar la identidad de secuencia porcentual máxima, y sin considerar ninguna de las sustituciones conservadoras como parte de la identidad de la secuencia. La "homología" de secuencia porcentual con respecto a los polipéptidos preferidos de la invención se define en la presente como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidato que son idénticos con los residuos en una de las secuencias del polipéptido de virulencia después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, hasta alcanzar la identidad de secuencia porcentual máxima, y considerando también cualesquiera sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. Se pueden definir sustituciones conservadoras como se establece en las Tablas A y B.

TABLA A SUSTITUCIONES CONSERVADORAS I CARACTERÍSTICA DE LA CADENA LATERAL AMINOÁCIDO Alifática No polar G A P . I L V — "Polar-no cargada C S T M N Q Polar-cargada D E KR Aromática H F W Y Distinta N Q D E Los polipéptidos de la invención se pueden aislar de las fuentes celulares bacterianas naturales o se pueden sintetizar químicamente, aunque de preferencia se producen mediante procedimientos recombinantes que implican las células hospederas de la invención. Los productos génicos de virulencia de la invención pueden ser polipéptidos de longitud total, fragmentos biológicamente activos, o variantes de los mismos que conservan la actividad biológica o inmunológica específica. Las variantes pueden comprender análogos polipeptídicos de virulencia en donde se suprimen o se reemplazan uno o más de los aminoácidos especificados (es decir, codificados naturalmente) o en donde se agregan uno o más aminoácidos no especificados: (1) sin la pérdida de una o más de las actividades biológicas o características inmunológicas específicas para el producto génico- —dea virulencia;" o" (2) con la inhabilitación específica de una actividad biológica particular del producto génico de virulencia. l.a.s variantes de supresión contempladas también incluyen fragmentos que carecen de las porciones del polipéptido no esencial para la actividad biológica, y las variantes de inserción incluyen polipéptidos de fusión en los cuales el polipéptido tipo silvestre o fragmento del mismo se han fusionado a otro polipéptido . Los polipéptidos de virulencia alternativos incluyen aquellos en donde las sustituciones conservadoras se ha introducido mediante la modificación de polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de la invención. Las sustituciones conservadoras se reconocen en la técnica para clasificar los aminoácidos de acuerdo con sus propiedades físicas relacionadas y se pueden definir como se establecen en la Tabla A (a partir de la WO 97/09433, página 10, publicada el 13 de marzo de 1997 (PCT/GB96/02197, presentada el 9/6/96) . Alternativamente, los aminoácidos conservadores se pueden agrupar como se define en Lehninger, [Biochemistry, Segunda Edición; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975) , pp . 71-77] como se establece en las Tabla ' B .

TABLA B SUSTITUCIONES CONSERVADORAS II CARACTERÍSTICA DE LA CADENA LATERAL EL AMINOÁCIDO No polar (hidrófobo) A. Alifático: A L 1 V P V. Aromático: D' W C. Azufre que contiene: M D. Limite: G No cargada-polar - A. Hidroxilo: S T Y B. Amidas: N Q C. Sulfhidrilo: C D. Limite: G Cargada positivamente (Básica) : K R H Cargada negativamente (Acida) : D E Los productos de virulencia alternativos de la invención incluyen productos génicos de virulencia maduros, es decir, en donde se eliminan las secuencias líderes o de señal, que tienen residuos amino terminales adicionales. Se contemplan los productos génicos de virulencia que tienen un ron ¡dúo de metionina adicional en la posición-1, a medida que son productos de virulencia que tienen residuos adicionales de metionina y lisina en las posiciones -2 y 1. Las variantes de estos tipos son particularmente útiles para la producción de proteínas recombinantes en tipos celulares bacterianos. Las variantes de la invención lambión incluyen productos génicos en donde se hayan introducido secuencias, amino terminales derivadas de otras proteínas, así como también variantes que comprenden secuencias ..amino terminales -que no se encuentran en las proteínas que se presentan en la naturaleza. La invención también abarca polipéptidos alternativos que tienen residuos adicionales de aminoácidos que son el resultado del uso de sistemas de expresión específicos. Por ejemplo, el uso de vectores disponibles comercialmente que expresan un polipéptido deseado como una proteína de fusión glut atión-S-transferasa (GST) proporcionan el polipéptido deseado que tiene un residuo adicional de glicina en la posición -1 después de la escisión del componente GST a partir del polipéptido deseado. También se contemplan las variantes que son el resultado de la expresión utilizando otros sistemas de vector .

También se abarcan por la presente invención los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos de cadena individual, anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos, y anticuerpos injertados con CDR, entre los que se incluyen los compuestos quo inoluyon, secuencias CDR que reconocen específicamente un polipéptido de la invención) y otras proteínas de unión específicas para los productos génicos de virulencia o fragmentos de los mismos. El término "específico para" indica que las regiones variables de los anticuerpos de la invención reconocen y se unen a un polipéptido de virulencia exclusivamente (es decir, son capaces de distinguir uno de los polipéptidos de virulencia individual de los polipéptidos de virulencia relacionados a pesar de la identidad de secuencia, homología, o similitud encontradas en la familia de polipéptidos), aunque también pueden "interactuar con otras proteínas (por ejemplo, proteína de S . a ure u s u otros anticuerpos en técnicas ELISA) a través de las interacciones con las secuencias fuera de la región variable de los anticuerpos, y en particular, en la región constante de la molécula. Los análisis de selección para determinar la especificidad de unión de un anticuerpo de la invención son bien conocidos y practicados habitualmente en la técnica. Para un análisis comprensivo de estos análisis, véase Harlow et a l . (Eds), Antibodies A Laboratory Manual; Col. d Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), Capítulo 6. También se contemplan los apl i cuo i por: que reconocen y se unen a los fragmentos de los polipéptidos de virulencia, con la condición de que los anticuerpos sean los primeros y más específico para, como se definió anteriormente, un polipéptido de virulencia de la invención a partir de los cuales se deriva el fragmento. El ADN y la información de la secuencia de aminoácidos proporcionados por la presente invención también hacen posible .el análisi_s sistemático de la estructura y función de los genes de virulencia y sus productos génicos codificados. El conocimiento de un polinucleótido que codifica un producto génico de virulencia de la invención también hace -que estén disponibles los polinucleótidos anti-sentido que reconoce y se hibridan para los polinucleótidos que codifican para un polipéptido de virulencia de la invención. Se proporcionan polinucleótidos antisentido de longitud total y fragmentarios. Alguien con experiencia normal apreciará que las moléculas anti-sentido fragmentarias de la invención incluyen (i) aquellas que se reconocen específicamente y se hibridan a un ARN específico (como se determina por la comparación de secuencia del ADN que codifica para un polipéptido de virulencia de la invención a un ?üN que codifica pa a otras m l ó nulas conocida.-:) a í n m también (ii) aquellas que se reconocen e hibridan para un ARN que codifica para variantes de la familia de proteínas de virulencia. Los polinucleótidos antisentido que hibridan para un ARN que codifica para otros miembros de la familia de proteínas de virulencia también se pueden identificar a través de la comparación de secuencia para identificar secuencias características, o particulares para la familia de moléculas. La invención también contempla los métodos para modular la expresión génica a través del uso de ribozimas. Para una revisión, véase Gibson y Shillitoe, Mol , Bi o te ch . 7 : 125-137 (1997) . La tecnología de ribozimas se puede utilizar para inhibir la traducción de ARNm en una secuencia de manera específica a través de (i) la hibridación de un ARN complementario a un ARNm blanco y (ii) la escisión del ARÑm hibridado a través de la actividad de la nucleasa inherente a la cadena complementaria.

Las ribozimas se pueden identificar mediante métodos empíricos aunque de ' mayor preferencia se pueden diseñar específicamente con base en los sitios accesibles en el ARNm blanco [Bramlaqe, et a l . , Trencas in Bi o t ech 1 6 : 434-438 (1998)]. El sumí ni si ro de ribozimas a las células blanco se puedo llevar a cabo utilizado, técnicas de suministro ya sea e?óqeno o endógeno bien conocidas y practicadas habitualmente en este campo. Los métodos para suministro exógeno pueden incluir el uso de liposomas blanco o inyección local directa. Los métodos endógenos incluyen el uso de vectores virales y plásmidos no virales . Las ribozimas pueden modular específicamente la expresión de genes de virulencia cuando se diseñan para ser complementarios a las regiones únicas para un polinucleótido que codifica para un producto génico de virulencia. Por lo tanto, "modular específicamente" pretende dar a entender que las ribozimas de la invención reconocen únicamente un polinucleótido individual. De manera similar, las ribozimas se pueden diseñar para modular la expresión de todas o algunas de una familia de proteínas. Las ribozimas de este tipo se diseñan para que reconozcan secuencias de polinucleótido conservadas en todos o algunos de los polinucleótidos que codifican para la familia de proteínas. La invención también abarca los métodos para modular la transcripción de un gen de virulencia rio la invención a través del uso de la formación do espirales triples oligonucleót ido-dirigi d s . Para una revisión, véase Lavrovsky, et a l . , Bi o ch em . Mo l . Med . 62 : 11 - 22 (1997) . La formación de espirales triples se lleva a cabo utilizando oligonucleótidos de secuencia específica que se hibridan para ADN de doble cadena en el canal principal como se del i no on el modelo Watson-Crick. La hibridación de un oligonucleótido de secuencia específica puede modular por lo tanto la actividad de las proteínas de unión con ADN, incluyendo, por ejemplo, los factores de transcripción y las polimerasas. Las secuencias blanco preferidas para hibridación incluyen las regiones reguladoras de transcripción que modulan la expresión del producto génico de virulencia. Los oligonucleótidos que tienen la capacidad de la formación de espirales triples también son útiles para la modificación covalente sitio-específica de secuencias de ADN blanco. Los oligonucleótidos útiles para la modificación covalente se acoplan a diversos agentes que dañan el ADN como describe en Lavrovsky, el et a l . [ s upra ] . La identificación de los genes de virulencia de P . mul tocida , A . pl eu ropn eumon i a e y P. (Ma nnheim i a ) ha emolyti ca hace que los genos y productos génicos sean tiles en los métodos para identificar a los agentes a tibacterianos. Eslos métodos incluyen agentes potenciales de análisis para la capacidad de interferir con la expresión do productos génicos de virulencia representados por las secuencias de ?DN establecidas en cualquiera do las SEQ ID NOS: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 'l02, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 166, 168, 170, 172, y 174 y especies homologas de las mismas (es decir, los genes representados por las secuencias de ADN de las SEQ ID NOS: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 166, 168, 170, 172, y 174 codifican el producto génico de virulencia, o las secuencias de ADN de las SEQ ID NOS: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74,"76", X 8", '80, 82, 84, 100,' 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 163, 164, 166, 168, 170, 172, y 174 están adyacentes al gen que codifica para el producto (jónico dc virulencia, o están implicadas en la regulación de la expresión del producto génico de virulencia), o los agentes potenciales de análisis para la capacidad de interferir con la función de un producto génico bacteriano codificado en la totalidad o en parte de una secuencia de ADN establecida en cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 51, 53, 55, 57, 58, 60, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132,. 134, 135, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160," 162, 163, 164, 166, 168, 170, 172, y 174, las especies homologas de las mismas, o la cadena complementaria de las mismas, seguidas por agentes de identificación que son positivos en estos análisis. Los polinucleótidos y polipéptidos útiles en estos análisis no sólo incluyen los genes y polipéptidos codificados como se expone en la presente, aunque las variantes de los mismos también tienen prácticamente la misma actividad que los genes y polipéptidos de tipo silvestre . Los productos génicos de virulencia producidos por los métodos descritos anteriormente se utilizan en los análi is de alto rendimie o p r l selección de agentes inhibitorios. Las Cuentos para agentes potenciales que serán seleccionados son bibliotecas de compuestos químicos, medios de fermentación de S trep t omyce t es , otras bacterias y hongos, y extractos celulares de plantas y otros vegetales. Para proteínas con actividad enzimática conocida, los análisis se establecen con base en la actividad, y muchos agentes potenciales se seleccionan por su capacidad para inhibir la actividad. Para las proteínas que interactúan con otra proteína o ácido nucleico, se establecen análisis de unión para medir esta interacción directamente, y los agentes potenciales se seleccionan por su capacidad para inhibir la interacción de unión. Se contempla el uso de diferentes análisis conocidos en la técnica de acuerdo con este aspecto de la invención. Cuando la función del producto génico de virulencia es conocida o predicha por L similitud de secuencia con un producto génico conocido, los inhibidores potenciales se pueden seleccionar en tipos enzimáticos u otros de análisis biológicos y/o bioquímicos codificados para la función y/o propiedades del producto géniro. Cuando el producto génico de virulencia se conoce o predice por similitud de secuencia con un producto génico conocido para interactuar con otra proteína o ácido nucleico, los inhibidores de la interacción se pueden seleccionar directamente en análisis de unión. La invención contempla una multitud de análisis para seleccionar e identificar los inhibidores de unión por el producto génico de virulencia. En un ejemplo, el producto génico de virulencia se inmoviliza y la interacción con un compañero de unión se evalúa en presencia y ausencia de un compuesto inhibidor putativo. En otro ejemplo, la interacción entre el producto génico de virulencia y su compañero de unión se evalúa en un análisis de solución, ambos en presencia y ausencia de un compuesto inhibidor putativo. En ambos análisis, se identifica un inhibidor como un compuesto que disminuye la unión entre el producto génico de virulencia y su compañero de unión. También se contemplan otros análisis en aquellos casos é~n "donde el compañero de unión del producto génico de virulencia es una proteína. Por ejemplo, se contemplan las variaciones del análisis di-híbrido en donde un inhibidor de las interacciones proteína/proteína se identifican por la detección de una señal positiva en una célula hospedóla transformada o transfectada como se describe can la publicación del PCT número WO 95/20652, publicada el 3 de agosto de 1995. Los inhibidores candidato contemplados por la invención incluyen los compuestos seleccionados de las bibliotecas de inhibidores potenciales. Existen varias bibliotecas diferentes utilizadas para la identificación de moduladores de molécula pequeña, incluyendo: (1) bibliotecas químicas, (2) bibliotecas de productos naturales, y (3) bibliotecas combinatorias comprendidas de péptidos aleatorios, oligonucleótidos o moléculas orgánicas. Las bibliotecas químicas constan de análogos estructurales de compuestos conocidos o compuestos que se identifican como "aciertos" o "guías" vía la selección de productos naturales . Las bibliotecas de productos naturales son colecciones de microorganismos, animales, plantas, u organismos marinos que se utilizan para crear las mezclas para selección mediante: (1) fermentación y extracción de caldos de la tierra, microorganismos vegetales o marinos o (2) extracción de plantas u organismos marinos. Las bibliotecas de productos naturales incluyen poliquétidos , péptidos no ribosomales, y variante (que se presentan en la naturaleza) de los mismos. Para una revisión, véase Sci en ce 282 : 63 - 68 (1998) . Las bibliotecas combinatorias se componen de muchos péptidos, oligonucleótidos, o compuestos orgánicos como una mezcla. Los mismos son relativamente fáciles de preparar mediante los métodos de síntesis automatizados tradicionales, PCR, clonación, o los métodos sintéticos adecuados. De interés particular son las bibliotecas combinatorias de péptidos y oligonucleótidos. Todavía otras bibliotecas de interés incluyen bibliotecas de péptidos, proteínas, peptidomiméticas , de colección sintética multiparalela , recombinatorias, y polipeptídicas. Para una revisión de química combinatoria y las bibliotecas creadas de l misma, véase Myers, Curr . Opi n . Bi o t e chn ol . 8:701-707 (1997) . La identificación de moduladores a través del uso de diversas bibliotecas descritas en la presente permite la modificación del candidato "acierto" ("guía") para optimizar la capacidad del "acierto" para modular la actividad. Todavía otros inhibidores candidato contemplados por la invención se pueden diseñar e incluyen las formas solubles de compañeros de unión, así como también, los compañeros de unión como proteínas quiméricas, o de fusión. Compañeros de unión, en el sentido en que se utiliza en la presente, abarca ampliamente anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, y compuestos modificados que comprenden dominios de anticuerpo que son inmunoespecíficos para el producto de expresión del gen de virulencia identificado. Se pueden utilizar otros análisis cuando no se conoce un compañero de unión (es decir, ligando) para el producto géniso de virulencia, que incluyen los análisis que identifican a los compañeros de unión de la proteína blanco a través de la medición de unión directa del compañero de unión de prueba para la proteína blanco, y los análisis que identifican a los . compañeros ..de .unión de las proteínas blanco a través de ultrafil ración de afinidad con métodos de espectroscopia .másica por rocío iónico/HPLC u otros métodos físicos y analíticos. Alternativamente, e.stas interacciones de unión se evalúan indirectamente utilizando el sistema de dos-híbrido de levadura descrito en Fields y Song, Na t ure , 34 0 : 2 4 5 - 2 4 6 (1989), y Fields y Stemglanz, Trends in Genetics, 10:286-292 (1994) los dos se incorporan en la presente como referencia. El sistema de dos-híbridos es un análisis genético para detectar las interacciones entre dos proteínas o polipéptidos. Se puede utilizar para iden ificar proteínas que se unen a una proteína conocida de interés, o para delinear los dominios o residuos críticos para una interacción. Se han desarrollado variaciones en esta metodología para clonar genes que codifican para proteínas de unión con ADN, para identificar los péptidos que se unen a una proteína, y para seleccionar fármacos . El sistema de dos-híbridos aprovecha la capacidad de un par de proteínas de interacción para traer un dominio de activación para transcripción en proximidad estrecha con un dominio de unión con ADN que se une a una secuencia de activación en la dirección 5' (UAS, por sus siglas en inglés) de un gen reportero, y en general se realiza en levadura. El análisis requiere la construcción - e- os genes híbridos" que codifican para (1) un dominio de unión con ADN que se fusiona a una primera proteína y (2) un dominio de activación fusionado a una segunda proteina. El dominio <\ o unión con ADN dirige la primera proteína híbt ida a la ÜAS del gen del reportero; sin embargo, debido a que la mayoría de las proteínas carece de un dominio de activación, esta proteína híbrida de unión con AD no activa la transcripción del gen reportero. La segunda proteína híbrida que contiene el dominio de activación, no puede en sí misma activar la expresión del gen reportero debido a que no se una mediante la UAS . Sin embargo, cuando están presentes ambas proteínas híbridas, la interacción no covalente de la primera y segunda proteínas une el dominio de activación a la UAS, activando la transcripción del gen del reportero. Cuando el producto génico de virulencia (la primera proteína, por ejemplo) ya se sabe que interactúa con otra proteína o ácido nucleico, este análisis se puede utilizar para detectar agentes que interfieren con la interacción de unión. La expresión del gen reportero se monitorea a medida que los diferentes agentes de prueba se agregan al sistema; la presencia de un agente inhibidor produce falta de una señal reportera. Cuando se desconoce la función del producto génico de virulencia y se sabe que ninguno de los ligandos se unen al producto génico, o I an l ¡ i;: e dos-híbridos de levadur también se puc a ul i I ¡ :a¡ i para identificar las proteínas que se unen al producto génico.— ?n'un análisis para identificar las proteínas que se unen a la primera proteína (la proteína blanco), se producen muchos genes híbridos que codifican cada uno para segundas proteínas diferentes y se seleccionan en el análisis. Típicamente, la segunda proteína se codifica para una agrupación de plásmidos en los cuales un ADNc total o ADN genómico se liga al dominio de activación. Este sistema se puede aplicar a una amplia variedad de proteínas, e incluso no es necesario conocer la identidad o función de la segunda proteína de unión. El sistema es muy sensible y puede detectar las interacciones no reveladas por otros métodos; incluso las interacciones transitorias pueden activar la transcripción para producir un ARNm estable que' se puede traducir repetidamente para proporcionar la proteína reportera.

Se pueden "utilizar otros análisis para buscar agentes que se ligan a la proteína blanco. Uno de estos métodos de selección para identificar la unión directa de ligandos de prueba para una proteína blanco se describe en la patente de leas Pstados Unidos No. 5,585,277, incorporada en la presento nomo referencia. Este método depende del principio do que las proteínas en general existen como una mezcla de estados doblados y desdoblados, y continuamente se alternan entre los dos estados. Cuando un ligando de prueba se une a la forma doblada de una proteína blanco (es decir, cuando el ligando de prueba es un ligando de la proteína blanco) , la molécula de la proteína blanco limitada por el ligando permanece en su estado doblado. De esta forma, la proteína blanco doblada está presente a un mayor grado en presencia de un ligando de prueba que se une la proteína blanco, que en ausencia de un ligando. La unión del ligando a la proteína blanco se pueden determinar mediante cualquier método que distinga entre los estados doblados y desdoblados de la proteína blanco. La función de la proteína blanco no necesita ser conocida para que este análisis se realice. Virtualmente cualquier agente se puede evaluar por este método como un ligando de prueba, incluyendo de manera enunciativa: metales, polipéptidos, proteínas, lípidos, polisacáridos, polinucleótidos y moléculas orgánicas pequeñas. Otro método para identificar ligandos para una proteína blanco se describe en Wieb l l. <•/ .1 I . , An a l . Ch em . , 69 : 1683- 1691. (1997), incorporado on I ,1 presente como referencia. Esta técnica selecciona bibliotecas combinatorias de 20-30 agentes a la vez en fase de solución para la unión a la proteína blanco. Los agentes que se unen a la proteina blanco se separan de otros componentes de la biblioteca mediante ultrafiltración centrífuga. Las moléculas seleccionadas específicamente que se retienen sobre el filtro se liberan posteriormente a partir de la proteína blanco y se analizan mediante HPLC y espectroscopia másica por - ionización con electro-rocío (rocío iónico) ayudado neumáticamente. Este procedimiento selecciona los componentes de la biblioteca con la mayor afinidad por la proteína blanco, y es particularmente útil para las bibliotecas de molécula pequeña. Los inhibidores /aglutinantes identificados por las selecciones iniciales se evalúan por su efecto sobre la virulencia en modelos de ratón i n vi vo de infecciones por P . m ul to ci da . Se pueden utilizar modelos de bacteremia, endocarditis, artritis séptica, absceso de tejido suave, o pulmonía. Los modelos que implican el uso de otros animales también están comprendidos por la invención. Por ejemplo, se pueden inocular conejos con una cepa de P . m u l t o c i da tipo silvestre antes o después d e la administración de cantidades variables de un compuesto inhibidor/aglutinante putativo. Los animales control, administrados sólo con solución salina en lugar del compuesto inhibidor /aglutinante putativo proporcionan un estándar mediante el cual se puede determinar el deterioro del animal de prueba. Otros modelos animales incluyen aquellos descritos en el Animal and Plant Health Inspection Service, USDA, 1 de enero de 1994, Edición, §§113.69-113.70; Panciera y Corstvet, Am . J. Ve t . Res . 45 : 2532-2537 ; Ames, et a l . , Can . J. Comp . Med . 45:395-400 (1984); y Mukkur, In fec ti on an d Imm un i ty 18:583-585 (1977) . Los inhibidores/aglutinantes que interfieren con la virulencia bacteriana son los que pueden prevenir el establecimiento de una infección o revertir el resultado de una infección una vez que se establece. Cualquier adyuvante conocido en la técnica se puede utilizar en la composición de vacuna, incluyendo adyuvantes con base oleosa tales como por ejemplo el Adyuvante Completo de Freund y Adyuvante Incompleto de Freund, adyuvantes con base en micolato (por ejemplo, dimicolato de trehalosa), lipopolisacárido bacteriano (LPS), pept idoglicanos (es decir, mureina's, ' mucopéptidos", o " glucoproteí ñas tales como por ejemplo, N-Opaca, dipéptido de muramilo [MDP], o análogos de MDP), proteoglicanos (por ejemplo, extraídos de Kl ebsi el l a pn e um on i a e ) , preparaciones es t rept ococales (por ejemplo, OK432), BiostimMR (por ejemplo, 01K2), los " Is com s" de las EP 109 942, EP 180 564 y EP 231 039, hidróxiclo ele aluminio, saponina, DEAE-dextrano, aceites neutros (tales como por ejemplo, migliol), aceites vegetales (tales como por ejemplo, aceite de cacahuate), liposomas, polioles Pluronic®, el sistema adyuvante Ribi (véase, por ejemplo la GB-A-2 189 141), o int erleucinas , particularmente aquellas que estimulan una inmunidad suministrada por células. Un adyuvante alternativo que consta de extractos de Amycol a ta , un género bacteriano en el orden de Act inomycet ales , se ha descrito en la patente de los Estados Unidos No. 4,877,612. Adicionalmente, las mezclas adecuadas de adyuvantes están disponibles comercialmente. El adyuvante utilizado dependerá, en parte, del organismo recipiente. La cantidad del adyuvante para administrar dependerá del tipo y tamaño de animal. Las dosificaciones óptimas se pueden determinar fácilmente mediante métodos rutinarios . Las composiciones de vacuna pueden incluir opcionalmente líquidos, semisólidos, o di láyenlos sólidos, farmacéuticamente aceptables, compatibles con la vacuna (es decir, estériles y no tóxicos) que sirven como vehículos farmacéuticos, excipientes, o medios de comunicación. Se puede utilizar cualquier diluyente conocido en la técnica. Los diluyentes de ejemplo incluyen, de manera enunciativa: monolaurato de polioxietilen sorbitán, estearato de magnesio, hidroxibenzoato de metilo y propilo, talco, alginatos, almidones., .lactosa, . sacar-osa,. dextrosa, sorbitol, manitol; goma acacia, fosfato de calcio, aceite mineral, manteca de cacao, y aceite de teobroma . Las composiciones de vacuna se pueden envasar en las formas convenientes para suministro. Las composiciones se pueden encerrar dentro de una cápsula, comprimido, bolsita, sello, gelatina, papel, u otro recipiente. Estas formas de suministro se prefieren cuando son compatibles con la entrada de la composición inmunogénica en el organismo recipiente y, particularmente, cuando la composición inmunogénica se está suministrando en forma de dosis unitaria. Las unidades de dosificación se pueden envasar, por ejemplo, en tabletas, cápsulas, supositorios o sellos. Las composiciones de vacuna se pueden administrar en el sujeto que será inmunizado mediante cualquier método convencional, incluyendo por ejemplo, mediante inyección intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamaria , intraperitoneal, o subcutánea; mediante suministro oral, sublingual, nasal, anal, o vaginal. El tratamiento puede consistir de una dosis individual o una pluralidad de dosis durante un periodo de tiempo. La invención también comprende el uso de una cepa bacteriana atenuada de la invención para la fabricación de un medicamento de vacuna para prevenir o aliviar una infección bacteriana y/o los síntomas asociados con la misma. La invención también proporciona el uso de inhibidores de la invención para la fabricación de un medicamento para prevenir o aliviar una infección bacteriana y/o los síntomas asociados con la misma. La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos. El Ejemplo 1 describe las construcciones de los mutantes de P . mul toci da . El Ejemplo 2 se relaciona con la selección de mutantes de P. multocida . El Ejemplo 3 se dirige a los métodos para determinar la virulencia de los mutantes de P. multocida . El Ejemplo 4 describe la clonación de los genes de virulencia de P. multocida . El Ejemplo 5 se dirige a la identificación de genes en otras especies relacionadas con los genes ele virulencia de P. multocida . El Ejemplo 6 describe la construcción de los mutantes de A. pleuropneumoniae . El ejemplo 7 se dirige a la selección de mutantes atenuados de A. pleuropneumoniae . El Ejemplo 8 se relaciona con la identificación de los genes de virulencia de A. pleuropneumoniae . El Ejemplo 9 describe la inoculación de competencia de los mutantes de A. pleuropneumoniae y las bacterias tipo silvestre. El Ejemplo 10 caracteriza los genes identificados de"' AX pleuropneumoniae . El ejemplo 11 se dirige a la eficacia del mutante de A. pleuropneumoniae para la protección contra la inoculación de bacterias tipo silvestre. El Ejemplo 12 describe la identificación de la especie homologa de genes de virulencia en P. (Mannheimia ) haemolytica .

EJEMPLO 1 Construcción de una Biblioteca de Mutantes de P.multocida Marcados con Transposón Se construyó una biblioteca de mutantes marcados con transposón en el vector precursor pLOF/Km [Herrero, et a l . , J. Ba c teri ol . 1 12 : 6557-67 (1990)] que se ha demostrado anteriormente para que sea funcional y aleatoria en P. mul toci da [Lee, et al . , Vet Mi crobi ol . 50:143-8 (1996)]. El plásmido pLOF/Km se construyó como una modificación del vector suicida pGP704 e incluyó un gen transposasa bajo el el control del promotor Ta c , así como tambión, o I elemento transponible mini-TnlO que codifica para la resistencia a kanamicina. El plásmido pTEF-1 se construyó como se describirá más adelante al modificar pLOF/Km para aceptar las marcas de secuencia que contuvieron una secuencia [NK]35 semi-aleatoria . El plásmido pLOF/Km se modificó primero para eliminar el único sitio de restricción de Kpnl en la región de clonación múltiple y luego introducir un nuevo sitio de Kpnl en la región mini-TnlO. El plásmido se digirió con Kpnl y los extremos colgantes resultantes se rellenaron con polimerasa Klenow de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante.

Las digestiones de restricción y las ligaciones descritas en la presente se realizaron de acuerdo con los protocolos sugeridos por el fabricante (Gibco BRL, Gaithersburg, MD y Boehringer Mannheim, Indianapolis , IN) . El producto de extremo romo se autoligó para producir un plásmido designado pLOF/Km--K nl que se transformó en DH5a:?pir de E . col i para amplificación. DH5a: de E . col i (?pir f8 OdlacZ?Ml 5 , recAl, extremoAl, gyrA96, thi-1, hsdR17(rk", m1: , supE44, relAl, deoR ? ( lacZYA-argF) Ul 69 , se propagó a 37°C en medio Luria-Bertani (LB) . Se prepararon plásmidos que utilizan QIAGEN SpinPreps de QL?GEN Inc. (Santa Clarita, CA) y se digirieron con Sfi l que se segmenta en un sitio único dentro del elemento transponible mini-TnlO. Un adaptador Sfí l - Kpn l - Sfi l se preparó al fijar los oligonucleótidos TEFl (SEQ ID NO: 86) y TEF3 (SEQ ID NO:- 87) y el adaptador DE doble cadena resultante se ligó en el sitio Sfi l para crear el plásmido pTEF-1. Los oligonucleótidos TEFl y TEF3 (así como todos los otros oligonucleótidos descritos en la presente) se sintetizaron por Genosys Biotechnologies (The Woodlands, TX) .

TEFl 5' -AGGCCGGTACCGGCCGCCT SEQ ID NO: 86 TEF3 5' -CGGCCGGTACCGGCCTAGG SEQ ID NO: 87 Las marcas de secuencia única para inserción en el sitio Kpnl de pTEF-1 se prepararon como sigue. La PCR se llevó a cabo para generar marcas de ADN de doble cadena utilizando un Equipo GeneAmp XL PCR (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) bajo condiciones que incluyen 250 µM cada dNTP, Mg(OAc)2 1.5 mM , 100 pmol cada cebador TEF14 (SEQ ID NO: 88) y TEF15" (SEQ ID NO: 89), 1 ng TEF26 (SEQ ID NO: 90) como molde de ADN y 2.5 unidades de Polimerasa XL de ADN Tt h recombinante .

TEF14 SEQ ID NO 88 TEF15 5' -CTAGGTACCTACAACCTC SEQ ID NO 89 TEF26 SEQ ID NO 90 5' -CTAGGTACCTACAACCTCAAGCTT- [NK] 35- AAGCTTGGTTAGAATGGGTACCATG Las condiciones de reacción incluyeron una incubación inicial _a _ 95 ° C durante., un minuto, seguida por treinta ciclos- de 30 segundos a 95°C, 45 segundos a 45°C , y 15 segundos a 72°C, seguida por una última incubación a 72°C durante dos minutos. Los productos de la PCR se digirieron con Kpnl y se purificaron utilizando un Equipo para Retiro de Nucleótidos QIAGEN (QIAGEN, Inc., Chatsworth, GA) de acuerdo non J 4 el protocolo sugerido por el fabricante. Las secuencias de marca única se ligaron en el elemento mini-TnlO de pTEF-I linealizado, digerido anteriormente con Kpnl y desfos foriladas con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (Boehringer Mannhéim) utilizandio procedimientos estándar. La biblioteca del plásmido resultante se transformó en DH5 :?pir de E . col i . El análisis de transferencia de colonias se realizó de acuerdo con la Guía del Usuario DIG ( Boehringer-Mannheim) con la hibridación y detección realizada como sigue. Las hibridaciones se realizaron esencia .1 mn n L e de acuerdo con la Guía del Usuario Genius Non-Radioactive (Boehringer Mannheim Biochemicals ) , la hoja de producto para el equipo de mareaje DIG-PCR (Boehringer Mannheim Biochemicals), y la hoja de producto para CSPD (Boehringer Mannheim Biochemicals) . Para la preparación de soluciones de ensayo, una reacción PCR primaria de 100 µl se ajustó utilizando amortiguador de PCR Amplitaq (PE Applied Biosystems), dNTPs 200 µM, 140 pmol cada uno de cebadores TEF5 (SEQ ID NO: 91) y TEF6 (SEQ ID NO: 92), MgCl2 2 M, 2.5 unidades Amplitaq (PE Applied Biosystems) y 1 ng de ADN de plásmido.

TEF5 5' -TACCTACAACCTCAAGCT SEQ ID NO: 91 TEF6 5' -TACCCATTCTAACCAAGC SEQ ID NO: 92 Las condiciones del ciclo incluyeron una incubación inicial a 95°C durante dos minutos, seguida por 35 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 50°C durante 45 segundos, 72°C durante 15 segundos y una incubación final a 72°C durante tres minutos. Los productos de amplificación se separaron utilizando electroforesis en un 2%- 3:1 NuSieve GTG (FMC BioProducts, Rockland, ME, USA) :Gel de agarosa y el producto de 109 pares de bases se segmen I a i on y impurificaron. Se llevaron a cabo extracciones en gel utilizando un equipo para extracción en gel QIAGEN (QIAGEN) . Aproximadamente 15 ng del producto primario se etiquetaron en una reacción PCR de 50 µl utilizando el Equipo DIG PCR, 50 pmol de cada uno de los cebadores TEF24 y TEF25, y una mezcla 1:1 de DIG Probé Synthesis Mix con solución madre de dNTP 2mM.

TEF24 5'-TACCTACAACCTCAAGCTT SEQ ID NO: 93 TEF25 5' -TACCCATTCTAACCAAGCTT _SEQ ID NO: 94 Las condiciones PCR incluyeron una incubación inicial a 95°C durante cuatro minutos, seguida por 25 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 50°C durante 45 segundos, 72°C durante 15 segundos y una incubación final a 72°C durante tres minutos. El producto de la PCR marcado se digirió con Hi n dl l l en un volumen d o reacción total de 90 µl y se purificaron a partir de secciones constantes del cebador utilizando un 2%-3:1 NuSieve GTG (FMC BioProduct s ) : gel de Agarosa. La región que contiene la marca variable etiquetada se segmentó y la porción de gel total de disolvió y se desnaturalizó en 10 ml de DIG EasyHyb a 95°C du antc diez minutos . Se prepararon transferencias en mancha utilizando una membrana Hybond®-N+ (Amersham-Pharmacia Biotech) . El ADN blanco para cada marca se preparó en placas de 96 cavidades utilizando aproximadamente 30 ng de producto PCR. Se agregó un volumen igual de NaOH 0.1 N para desnaturalizar la muestra y cada muestra se aplicó a la membrana con vacío mínimo utilizando un aparato para transferencia en mancha Minifold IMR de Schleicher y Schuell (Keene, NH, USA) . Cada cavidad se lavó con 150 µl de Solución de Neutralización (Tris 0.5 M/NaCl 3M, pH 7.5) y 150 µl de 2X SSC. Las membranas se curaron con rayos UV en un Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA, USA) y se prehibridaron durante una hora en 20 mis de amortiguador DIG EasyHyb a 42°C. La solución de ensayo desnaturalizada se agregó y la hibridación se llevó a cabo durante la noche a 42°C. La membrana s lavó dos veces en 2X SSC que contenía SDS al 0.1" durante cinco minutos en cada lavado. Se realizaron dos lavados de alto rigor en 50 ml de amortiguador 0. IX SSC pre-calentado que contenía 0.1% SDS a 68°C durante 15 minutos antes de proceder con los protocolos estándar para Detección Genius (Genius Manual) . Por seguridad es conveniente utilizar un sistema de detección no radiactiva, de bajo costo, de facilidad de uso, y para reducción de materiales peligrosos. En experimentos iniciales que utilizan procedimientos similares descritos anteriormente [Mei, et a l . , Mol Mi crobi ol . 2 6 : 399-407 (1997)], se obtuvieron en controles negativos niveles de hibridación antecedentes inaceptables. Para disminuir el antecedente, la longitud de la marca se aumentó en 30 pares de bases a un total de 70, los cebadores de amplificación se alargaron para que incluyeran toda la secuencia que flanquea la región variable, se utilizó una concentración menor de dig-dUTP, y las secuencias conservadas que flanquean la región de marca de secuencia se eliminaron mediante purificación en gel. De manera más significativa, se utilizó PCR para generar marcas de secuencia [NK] ¡., como el ADN blanco en las transferencias en mancha en lugar de los plásmidos totales que contienen los transposones marcado después de la detección de la hibridación antecedente del transposón mismo. Utilizando estas modificaciones se eliminó el antecedente haciendo que la selección quimiolumini scente /no radiactiva sea más eficaz. Aproximadamente cuatrocientos transformantes diferentes que son el resultado de la ligación de pTEF-1 con las marcas de secuencia generadas por PCR se seleccionaron mediante transferencia de colonias y las 96 colonias de hibridación más fuertes se ensamblaron en placas microtituladoras para utilizarse adicionalmente. Incluso aunque la probabilidad de marcas duplicadas fue muy baja, la mitad de la placa de marcas principales se sondeó contra las otras para confirmar que ninguna marca se duplicó. Los plásmidos que contenían estas marcas se purificaron y se transformaron en S17-l:?pir (pir, recA, th i , pro , h sd, (r-m+), RP4-2, (Tc::Mu), (Km::Tn7), [TmpR], [SmR]) de E . col i y las bacterias transformadas propagadas a 37°C en medio Luria-Bertani (LB) . Cada uno de los 96 transformantes S17-l:?pir de E . col i que contenían el plásmido pTEF-1 marcado se utilizó en los apareamientos conjugativos para generar mutantes transposón de P. m u l t o ci da . La cepa TF5 de P. mul t o ci da es un mutante espontáneo resistente a ácido nalidixico derivado de UC6731, un aislado bovino clínico. Las cepas de P. m ul t o ci da se desarrollaron en medio de infusión de cerebro y corazón (BHI) (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) a 37°C y en C02 al 5% cuando se desarrollaron en placas. Los apareamientos se ajustaron al desarrollar cada clon S17- 1 : ?pir/pTEFI : [NK] 35 de E . col i y la cepa TF5 a la fase log tardía. Cincuenta µl de cultivo para cada clon pTEF-1 marcado se mezclaron con 200 µl del cultivo de TF5 y 50 µl de cada mezcla de apareamiento se manchó sobre filtros 0.22 TM colocados anteriormente sobre placas BHI que contenían IPTG 100 mM y MgS04 10 mM . Después de la incubación durante la noche a 37°C con C02 al 5%, las mezclas de apareamiento se extrajeron por lavado de cada filtro en 3 ml de PBS y 25 µl de cada uno se colocaron en placas sobre discos BHINsoKnoo Después del desarrollo selectivo durante la noche, las colonias se ensamblaron en placas microtituladoras mediante transferencia con palillos en 200 µl de BHIN50K50 asegurándose de que cada cavidad en una placa microtituladora siempre contuviera un mutante transposón con la misma marca de secuencia. Después del desarrollo durante la noche, se agregaron 50 µl de glicerol al 75% a cada cavidad y las placas se almacenaron congeladas a -80°C. Diecinueve agrupaciones se ensamblaron al transferir los mutantes transposón a las placas microtituladoras,, asegurándose de- que- cada cavidad contuviera un mutante transposón con la marca adecuada para esa cavidad. En otras palabras, una cavidad especifica en cada placa microtituladora siempre contuvo un mutante transposón con la misma marca de secuencia incluso aunque la ubicación del transposón dentro de aquellos mutantes pudiera ser diferente .

EJEMPLO 2 Selección murina para Mutantes Atenuados de P. multoc±da Diecinueve agrupaciones de mutantes transposón de Pa s t eurel l a m ul t oci da se seleccionaron utilizando un modelo murino de septicemia. Las placas congelados de mutantes transposón de P. mul t oci da agrupados se retiraron del almacenamiento a -80°C y se subcultivaron al transferir 10 µl de cada cavidad a una nueva placa de fondo redondo de 96 cavidades (Corning Costar, Cambridge, MA, USA) que contenía 200 µiX d-e -infusión de "cerebro' y corazón (DIFCO) con 50 µg/ml de ácido nalidíxico (Sigma) y 50 µg/ml de kanamicina (Sigma) (BHIN50K50) . Se incubaron placas sin agitación virogosa durante la noche a 37°C en C02 al 5%. Las placas se subcultivaron durante la noche al transferir 10 µl de cada cavidad a una nueva placa de 96 cavidades de fondo redondo (Corning Costar) que contenía 100 µl de BHI por cavidad e incubando a 37°C con agitación vigorosa a aproximadamente 150 rpm. La OD540 se monitoreó utilizando un lector de placas micro-tituladoras . A una OD540 de aproximadamente 0.2 a 0.25, cada placa se agrupó para formar la "agrupación de entrada" al combinar 100 µl de cada una de las cavidades de la placa micro-t ituladora . El cultivo se diluyó adecuadamente en BHI para dosis de aproximadamente 104, 105, 106 UFC/ml y 0.2 ml de cada dilución se utilizaron para infectar a ratones BALB/c hembras de 14-16 g mediante administración intraperitoneal. A los dos días después de la infección, uno o dos ratones sobrevivientes se sacrificaron y se recolectaron los bazos. El bazo total se homogeneizó en 1.0 ml de solución salina estéril al 0.9%. Se prepararon diluciones del homogeneizado de 10~2 a 10-5 y se colocaron en placas sobre discos B111 N''°K''° . Después del desarrollo durante la noche, se agruparon al menos 20,000 colonias en 10 mis de caldo BHI para formar la "agrupación recuperada" y 0.5 m I. de la agrupación recuperada se centrifugaron a 3,500 X g y el sedimento se utilizó para preparar el ADN genómico de acuerdo con un protocolo descrito anteriormente [Wilson, In F. M., Ausubel, et a.1 . , (ed. ) , Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1. John Wiley and Sons, Nueva York, p. 2.4.1-2.4.5. (1997)] . Los experimentos iniciales con P. m ul t o ci da virulenta tipo silvestre indicaron que los organismos se podrían recuperar del bazo, pulmones, riñones, e hígado indicando un modelo de infección verdaderamente septicémico. Las transferencias en mancha para ambas agrupaciones de "entrada" y "recuperadas" se realizaron como se describe en el Ejemplo 1 y se evaluaron las dos mediante inspección visual y mediante análisis semi-cuantitativo . La hibridación se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1 con la excepción de que 5 µg de ADN genómico de las agrupaciones de entrada y recuperadas se utilizaron como el molde. El análisis semi-cuantitativo indica si se ha presentado o no una reducción significativa en un clon individual. Si un mutante es incapaz de sobrevivir dentro del hospedero, entonces la señal recuperada debe ser muy baja en comparación con la señal de entrada que proporciona una alta proporción de entrada/recuperada. La mayoría de los mutantes se desarrollarán tanto i n vi vo como in vi t ro y por consiguiente una proporción de sus señales debe ser aproximadamente igual a 1. Los clones seleccionados mediante análisis cuantitativo a medida que son muy reducidos en la agrupación recuperada se seleccionaron para el estudio adicional. Los clones adicionales con proporciones de entrada/recuperadas cuestionables también se seleccionaron después de evaluar visualmente las películas formadas a partir de las transferencias en mancha.

EJEMPLO 3 Determinación de Virulencia para los Mutantes Candidato de P. muítrocida Cada mutante potencial que exhibió recuperación reducida de tejido esplénico se aisló de la placa de agrupación original y se utilizó individualmente en un experimento de inoculación para verificar y estimar aproximadamente la atenuación provocada por la mutación del transposón. Los mutantes candidato individuales provenientes de selecciones i n vi vo se desarrollaron en placas de Agar con Sangre de Oveja durante la noche en C02 al 5% a 37°C. Aproximadamente se inocularon seis colonias de cada mutante Bn "caldo BHI y se dejaron desarrollar durante seis horas. Se prepararon diluciones y se infectaron cada uno de cinco ratones como se describió anteriormente con 102, 103, 104 y 105 UFC cada una. La atenuación se determinó al comparar la mortalidad después de seis días con relación al tipo silvestre. Se supuso que los ratones sobrevivientes estarían -protegidos y luego se inocularon con una dosis de P. m ul t o ci da tipo silvestre a una concentración de aproximadamente 200 veces mayor que LD50 para la cepa tipo silvestre. Luego se determinó la proporción de supervi encia para cada grupo de ratones inoculados. Los resultados indicaron que se atenuaron 62 de 120 mutantes transposón potenciales, que tienen una LD50 aproximada de al menos 10 veces superior a la cepa tipo silvestre. Los clones y sus valores LD50 aproximados se listan en la Tabla 1. Se corrió un experimento control con la cepa tipo silvestre en paralelo con cada conjunto de inoculaciones y en todos los casos la mortalidad en los grupos inoculados con tipo silvestre fue del 100%. Además de los valores LD50, la Tabla 1 también proporciona datos a partir de la vacunación y experimentos de inoculación. Brevemente, los grupos de ratones (n = 5 a 10) se vacunaron mediante inyección intraperitoneal con las cepas individuales de P. mul t o cida mostradas en la Tabla 1 a una dosis que fue de aproximadamente 200 veces mayor que el LDso de la cepa tipo silvestre, virulenta. Los animales se observaron durante 28 días después de que se calcularon las cifras de mortalidad.

TABLA 1 Genes de Virulencia de P . multoc±da.

EJEMPLO 4 Clonación e Identi icación de Genes Requeridos para Virulencia de P. multocida Cada mutante transposón que se verificó para atenuarse se analizó además para determinar la identidad del marco de lectura abierta rota. El ADN proveniente de cada mutante se amplificó, se purificó, y se digirió con las enzimas de restricción que se sabía no se segmentan dentro del transpoasón y en general produjo fragmentos de 4-8 kb que se hibridaron con el transposón. Utilizando la selección para resistencia de kanamicina codificada mediante el transposón, se clonó al menos un fragmento para cada mutante del transposón. La hibridación southern con múltiples enzimas de restricción se realizó para cada mutante atenuado utilizando un fragmento Ml ul de 1.8 kb etiquetado proveniente de pLOF/Km como una solución de ensayo para identificar un fragmento de tamaño adecuado para clonación. El elemento mini-TnlO y el ADN de flanqueo proveniente de cada mutante se clonó en pUC19 y la secuencia de flanqueo se determinó utilizando los cebadores internos TEF32 y TEF40, cebador de avance y en algunos casos cebadores pUC-19 universales .

TEF-32 GGCAGAGCATTACGCTGAC SEQ ID NO: 95 TEF-40 GTACCGGCCAGGCGGCCACGCGTATTC SEQ ID NO: 96 Se realizaron reacciones de secuenciación utilizando el equipo de Química de Tinte Terminador BigDyeMR de PE Applied Biosystems (Foster City, CA) y se corrieron en un Secuenciador de ADN ABI Prism 377. Se obtuvo la secuencia de doble cadena para marcos de lectura abierta interrumpida, putativa, para cada clon. Se utilizó el software Sequencer 3.0 (Genecodes, Corp., Ann Arbor, MI) para ensamblar y analizar los datos de secuencia. Se utilizaron los programas GCG [Devereux, et a l . , 1997. Wisconsin Package Versión 9.0, 9.0 ed . Genetics Computer Group, Inc., Madison] para la búsqueda de secuencias homologas en bases de datos disponibles actualmente. En 37% de los clones que se identificaron para atenuarse, hubo múltiples inserciones del elemento transpdñible mini-TnlO. Cada inserción que incluye su secuencia de flanqueo se clonó individualmente en pGP704 y se apareó en la cepa tipo silvestre para producir nuevos mutantes de P . mul to ci da , cada uno que porta únicamente una de las múltiples inserciones originales. Los mutantes individuales se volvieron a probar individualmente para determinar la inserción responsable del fenotipo atenuado. La secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierta, predicho, roto, se determinó al secuenciar ambas cadenas, y la secuencia de aminoácidos predicha se utilizó para buscar las bases de datos disponibles actualmente para secuencias similares. Las secuencias ya sea coincidieron con genes conocidos, con genes desconocidos, y con los marcos de lectura abierta, hipotéticos, secuenciados o no coincidieron con ninguna secuencia identificada anteriormente. Para aquellos genes que tienen homología con las secuencias identific das anteriormente se asignaron funciones potenciales como se establece en la Tabla 1.

EJEMPLO 5 Identificación de Genes Relacionados en Otras Especies En experimentos por separado, también se realizó STM utilizando el de Actinobacíllus plettropneumoniae (App) . Una de las cepas de App contuvo una inserción en un gen que se secuenció (SEQ ID NO: 97) y se identificó como una especie homologa del gen atpG de P. multocida . Este resultado sugiere la presencia en " otras especies bacterianas de homólogos para genes de P. multocida anteriormente desconocidos que se también pueden mutar para producir cepas atenuadas de las otras especies bacterianas para utilizarse en las composiciones de vacuna. Con el fin de determinar si los homólogos de otros genes de P. multocida existen en otras especies bacterianas, se realizó una hibridación Southern sobre el ADN genómico de otras especies utilizando el gen atpG de A. pleuropneumoniae como una solución de ensayo . ; Se aisló ADN genómico de Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella haemolytica (Ph), P. multocida , y Haemophilus somnus (Hs) utilizando el método CTAB y se digirió con EcoRI e HindTTT durante dos horas a 37°C. El ?DN digerido se separó en un gel de agarosa al 0.7% a 40V en amortiguador TAE durante la noche. El ge] se sumergió secuencialmente en HCl 0. ÍM durante 30 minutos, dos veces en NaOH 0.5M/NaCl 1.5M durante 15 minutos cada vez, y dos veces en NaCl 2.5M/Tris ÍM, pH 7.5. El ADN se transfirió a membranas de nitrocelulosa (Amersham Hybond N+) durante la noche utilizando amortiguador 20X SSC (NaCl 3M/citrato de sodio 0.3M) . El ADN se reticuló a la membrana utilizando un LTV Stratalinker en ajuste de autorreticulación (120 millij oules ) . La membrana se prehibridó en 5X SSC/solución bloqueadora al 1% /sodio lauroil sarcosina al 0.1%/SDS al 0.02% a 50°C durante aproximadamente siete horas y se híbrido durante la noche a 50°C en la misma solución que contenía una solución de ensayo atgG generada mediante PCR. La solución de ensayo se preparó utilizando los cebadores DEL-1389 (SEQ ID NO: 98) y TEF-46 (SEQ ID NO: 99) con un equipo GeneAmp XL PCR en un GeneAmp PCR System 2400. El molde fue ADN de A . pleuropneumonia e genómico.

DEL-1389 TCTCCATTCCCTTGCTGCGGCAGGG SEQ ID NO: 98 TEF-46 GGAATTACAGCCGGATCCGGG ' SEQ TD NO: ^ 1 Se llevó a cabo una PCR con un paso de calentamiento inicial a 94°C durante cinco minutos, 30 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 30 seg, con fijación a 50°C durante 30 seg, y alargamiento a 72°C durante tres minutos, y un paso de extensión final a 72°C durante cinco minutos. Los productos de amplificación se separaron en un gel del agarosa, purificado, utilizando un equipo para purificación de gel QIAquick (QIAGEN), y se etiquetaron utilizando un equipo Cebador Dig-High (Boehringer Mannheim) . La transferencia se eliminó de la solución de hibridación y enjuagó en 2X SSC y se lavó dos veces por cinco minutos cada vez en el mismo amortiguador. La transferencia luego se lavó dos veces durante 15 minutos cada vez en 0.5X SSC a 60°C. Se visualizaron bandas homologas utilizando un Equipo para Detección de Ácido nucleico DIG (Boehringer Mannheim) .

Se detectaron bandas individuales en Pasteurella haemolytica , Haemophilus somnus y A. pleuropneumoniae utilizando ADN digerido con £coRI .

Se detectaron dos bandas utilizando ADN digerido £coRi de Pasteurella multocida .

EJEMPLO 6 Construcción de una Biblioteca de Mutantes de P. multocida Marcados con Transposón Se ha reportado anteriormente que la mutagénesis de transposones utilizando pLOF/Km es funcional y aleatoria en A. pleuropneumoniae [Tascon, et al., J. Bacteriol. 175:5111-22 (1993)]. Para construir mutantes transposón marcados de A. pleuropneumoniae , se utilizó cada uno de 96 transformantes S17-l:?pir de E. coli que contenían los plásmidos — m'arcados preseleccionados (pTEF-1: [NK]35) en apareamientos conjugativos para generar mutantes transposón de la cepa AP225 de A. pleuropneumoniae , mutante resistente a ácido nalidíxico espontáneo de serotipo 1 derivado de una cepa ATCC 27088 subcultivada in vivo. Las cepas de A. pleuropneumoniae se desarrollaron en medio de Infusión de Cerebro y Corazón (BHI) (Difco Laboratoies, Detroit, MI) con 10 µg/ml de dinucleótido de B~nicotinamida adenina (V10), (Sigma, St . Louis, Missouri) a 37°C y C02 al 5% cuando se desarrollaron en placas. E . col i S17-1 : ?pir (?pir , recA, t i, pro , hs dR ( rk" , mk+ ) , RP4-2, (Tc''::Mu), (KmR::Tn7), [TmpR] , [SmR]) se propagó a 37°C en medio Luria-Bertani (LB) . Los antibióticos cuando tue necesario se utilizaron a 100 µg/ml de ampici Lina (Sigma), 50 µg/ml de ácido nalidíxico (N^°) (Sigma), y 50 (K50) o 100 (K100) µg/ml de kanamicina (Sigma). Los apareamientos se establecieorn al desarrollar cada clon de E . col i S17-l:?pir/pTEFl : [NK] 35 y la cepa AP225 a la fase log tardía. Una alícuota 50 µl del cultivo para cada clon pTEF-1 marcado se mezcló con 150 µl del cultivo APP225, y luego 50 µl de cada mezcla de apareamiento se mancharon' sobre filtros 0.22 µM colocados previamente sobre placas BHIV10 que contenían IPTG lOOµM y MgS04 lOmM. Después de incubar durante la noche a 37°C con C02 al 5%, las mezclas de apareamiento se extrajeron mediante lavado de cada filtro en 2 ml de PBS y 200 µl de cada placa se colocaron sobre discos BHIV10N50K100. Después de un desarrollo selectivo durante la noche, las colonias se ensamblaron en placas microtituladoras mediante transferencia .con- palillos en 200- µl de BHIV10N50K50 asegurándose de que cada cavidad en una placa microtituladora siempre contuviera un mutante transposón con la- misma marca de secuencia. Después del desarrollo durante la noche, se agregaron 50 µl. de glicerol al 75% a cada cavidad y las placas se almacenaron congeladas a -80°C. APP no parece tener tanto daño hacia inserciones múltiples del elemento mini-TnlO como lo fue para P. multocida. Se determinó que sólo aproximadamente 3% de los mutantes contuvieron múltiples inserciones, lo que está de acuerdo con el 4% reportado anteriormente [Tascon, et al., J Bacteriol. 175:5111-22 (1993)] . Un problema en APP consistió en identificar muchos mutantes (analizados más adelante) que contenían inserciones en regiones del ARN 23S: 28 mutantes del total con inserciones en 13 sitios únicos. Esto puede indicar que el ARN 23S contiene los sitios de inserción preferenciales y que el desarrollo de APP se ve afectado por estas inserciones bastarnté paira dar por" resultado en la supervivencia diferencial dentro del hospedero. El análisis de transferencia Southern utilizando una solución de ensayo de ARN APP 23S sugiere que APP puede contener sólo tres operones ribosomales según se compara con cinco en H. influenzae [ Fleischmann, et al., Science 269:496-512 (1995)] y siete operones completos en E. coli [Blattner, et al., Science 277:1453-1474 (1997)]. Este sitio preferido y su efecto sobre el desarrollo pueden ser una barrera significativa para la "mutagénesis de saturación" debido a que un número significativo do clones contendrá inserciones en estos ARNr y serán necesarios grandes volúmenes de selección para obtener mutaciones de atenuación únicas adicionales.

EJEMPLO 7 Selección Porcina para Mutantes Atenuados de A. pleuropneumoniae Veinte agrupaciones de mutantes transposón de A. pleuropneumoniae , que contenían un total de aproximadamente 800 mutantes, se seleccionaron utilizando a un modelo de infección intratraqueal porcino. Cada agrupación se seleccionó en dos animales por separado. Las placas de mutantes transposón congelados de A. pleuropneumoniae agrupados, se retiraron del almacenamiento a -80°C y se subcultivaron al transferir 20µl de cada cavidad a una nueva placa de fondo redondo de 96 cavidades (Corning Costar, Cambridge, MA, USA) que contenían 180 µl de BHIV10N50K50. Las placas se incubaron sin agitación vigorosa durante la noche a 37°C en C02 al 5%. Después las placas se subcultivaron durante la noche al transferir 10 µl de cada cavidad a una nueva plací de fondo plano de 96 cavidades (Corning Costar) que contenía 100 µl de BHIV10 por cavidad e incubando a 37°C con agitación vigorosa a 150 rpm. La OD562 se monitoreó utilizando un lector de placa microtituladora. A una OD562 de aproximadamente 0.2 hasta 0.25, cada placa se agrupó para formar la "agrupación de entrada" al combinar 100 µl de cada una de las cavidades de la placa microtituladora. El cultivo se diluyó adecuadamente en BHI a aproximadamente 2 X 106 UFC/ml. Para cada agrupación diluida, se utilizaron 4.0 ml para infectar cerdos SPF de 10-20 kg ( hiteshire-Hamroc , Albion, IN) mediante administración intratraqueal utilizando un tubo traqueal. En aproximadamente 20 horas después de la infección, todos los animales sobrevivientes se sacrificaron y se retiraron los pulmones. Se realizó un lavado para recuperar las bacterias sobrevivientes mediante la infusión de 150 mis de PBS estéril en los pulmones, a los- que" se 'les dio "masaje después para distribuir el fluido. El fluido de lavado se recuperó, y el proceso se repitió una segunda vez. El fluido de lavado se centrifugó a 450 x g durante 10 minutos para- -separar' Xos r'esXos 'grandes. Los sobrenadantes luego se centrifugaron a 2,800 x g para sedimentar las bacterias. Los sedimentos se resuspendieron en 5 mis de BHI y se colocaron en placas en diluciones que varían de 10-2 a 10"5 sobre discos BHIV10NS50K10. Después de desarrollo durante la noche, se agruparon al menos 100,000 colonias en 10 mis de " caldo BHI para formar las "agrupaciones recuperadas". Una porción de 0.7 ml de cada agrupación recuperada se utilizó para preparar el ADN genómico mediante el método CTAB [Wilson, Tn Ausubel, et a l . , (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1. John Wiley and Sons, New York, p. 2.4.1-2.4.5 (1997) ] . La recuperación a partir de los animales habitualmente estuvo en el intervalo de 108 UFC a partir del lavado de pulmones . Las transferencias en mancha se realiza-ron y se evaluaron tanto mediante inspección visual como mediante análisis semi-cuant it at ivo como se describió anteriormente. Todas las hibridaciones y detecciones se realizaron como se describió. Brevemente, las soluciones de ensayo se prepararon mediante una amplificación PCR "primaria , seguida por purificación en gel de agarosa del producto deseado y amplificación PCR secundaria incorporando dig-dUTP. Los oligonúcleo t idos quo incluyen TF,F5, TE I1'6, TE I'"' 4 , TEF25, TEF48 y TEF62, se sintetizaron por Genosys Biotechnologies (Woodlands, TX) . También se utilizaron los cebadores TEF69, TEF65, y TEF66 para las reacciones PCR inversas y de secuenciación.

TEF69 GACGTTTCCCGTTGAATATGGCTC SEQ ID NO: 166 TEF65 GCCGGATCCGGGATCATATGACAAGA SEQ ID NO: 167 TEF66 GACAAGATGTGTATCCACCTTAAC SEQ ID NO: 168 El producto PCR marcado se digirió entonces con fíindlll para separar las secciones constantes del cebador de la región de marca única. La región que contiene la marca variable etiquetada se cortó y la porción de gel de sílice completa se di-solvió entonces y se desnaturalizó en DIG EasyHyb. Las transferencias en mancha se prepararon y se detectaron utilizando el protocolo para detección CSPD estándar. Se realizaron exposiciones de la película para la evaluación visual, y se determinaron conteos luminiscentes por segundo (LCPS) para cada muestra de transferencia en mancha. La proporción de LCPSde entra a/LCPSrecu erada para cada mutante se utilizó para determinar los mutantes que probablemente serían atenuados . Los clones seleccionados para que estuvieran presentes en la agrupación de entrada aunque muy reducidos en la agrupación recuperada se seleccionaron para un estudio adicional. Los clones adicionales con_. p-roporciones de -entrada/recuperadas cuestionables también se seleccionaron después de evaluar visualmente las películas formadas a partir de las transferencias en mancha. Se seleccionaron un total de 110 clones.

EJEMPLO 8 Identificación de Genes de virulencia de A . pleuropnßumoniae Se determinó una secuencia de flanqueo parcial para cada- uno de los 110 mutantes mediante PCR inversa y la secuenciación directa del producto. Se utilizó PCR inversa para generar los productos de ADN flanqueante para la secuenciación directa como se describió anteriormente. Se realizaron reacciones de secuenciación utilizando el equipo BigDyeMR Dye Terminator Chemistry de PE Applied Biosystems (Foster City, CA) y se corrieron sobre un Secuenciados ABI Prism 377 ADN. Se utilizó el software Sequencher 3.0 (Genecodes, Corp., Ann Arbor, MI) para ensamblar y analizar los datos de la secuencia. Se utilizaron los programas GCG [Devereux y Haeberli, Wisconsin Package Versión "~9.0 , 9.0 ed. Genetics Computer Group, Inc., Madison (1997)] para la búsqueda de secuencias homologas en las bases de datos disponibles actualmente . La Tabla 2 muestra los genes de A . pl europn e umon i a e identificado y el grado en el cual se pudieron determinar los marcos de lectura abierta. Se proporcionan los números de identificación de la secuencia para las secuencias de nucleótidos, así como también, las secuencias de aminoácidos deducidas donde se localicen.

TABLA 2 Marcos de Lectura Abierta de A. pleuropnecrmoniae Marco de Lectura Abierta Completo SIN Codón de Inicio-Codón de Paro atpH SEQ ID NO: 134 d sA SEQ ID NO: 136 aptG SEQ TD NO: 1 ? rirviK f.F'.O ID NO: 1 < exbB SEQ ID NO: 140 HT0379 SEQ ID NO: 1 4 0mpP5 SEQ ID NO: 152 OmpP5-2 SEQ ID NO: 150 SIN Codón de Inicio-SIN Codón <i l\p<> tig SEQ ID NO: 160 pnp SEQ ID NO: 1S4 fkpA SEQ ID NO: 142 apvA-o 1 SEQ ID NO: .22 hupA SEQ ID NO: 146 dpv?-o :;K(.) Il> lio: l.'l rpmF SEQ ID NO: 158 apvB SEQ ID NO: 126 apvD SEQ ID NO: 130 Codón de Inicio-SIN Codón de Paro IpdA SEQ ID NO 148 ARN o Secuencias No codificantes potD SEQ ID NO 156 ARNt-leu SEQ ID NO: 162 yaeE SEQ ID NO 164 ARNt-glu SEQ ID NO: 163 apvc SEQ ID NO 128 Las identidades putativas listadas en la Tabla 3 (más adelante, Ejemplo 9) se asignaron por comparación con las bases de datos bacterianas. Los 110 mutantes representaron 35 grupos de inserciones de transposón único. El número de diferentes mutaciones por lugares varió, con algunos clones que siempre contenían una inserción a un solo sitio dentro de un ORF para clones que contenían inserciones dentro de sitios diferentes del mismo ORF. Se detectaron tres inserciones múltiples en los 110 mutantes seleccionados como se determinó mediante la producción de bandas PCR múltiples y la generación de múltiples electroferogramas de secuencia.

EJEMPLO 9 Inoculación de Competencia de Mutantes de A . pleuropneumoniae con APP225 Tipo Silvestre Un clon representativo de cada uno de los únicos grupos mutantes atenuados identificados anteriormente estuvo ausente o muy reducido en la población recuperada se aisló de la placa de agrupación original y se utilizó en un experimento de inoculación de competencia con la cepa tipo silvestre (AP225) para verificar la atenuación relativa provocada por la mutación del transposón. El mutante y las cepas tipo' silvestre se desarrollaron en BHIV10 a una OD590 de 0.6-0.9. Aproximadamente 5.0 x 106 UFC cada una de las cepas de tipo silvestre y mutantes se agregó a 4 mis de BHI . Se utilizó una dosis total de 4 ml para infectar a un cerdo SPF de 10-20 kg mediante administración intratraqueal con un tubo traqueal. En aproximadamente 20 horas después de la infección, todos los animales sobrevivientes se sacrificaron y los pulmones se retiran. Se realizaron lavados pulmonares como se describió anteriormente. Los conteos en placas se llevaron a cabo sobre BHIV10N50 y BHIV10N50K100 para determinar los números relativos de tipo silvestre a mutante en ambos cultivos de entrada y en las muestras de lavado pulmonar. Se calculó un índice Competitivo (Cl) como el [UFC de mutantes/UFC de tipo silvestre ] rle entrada/ [UFC de mutantes/UFC de tipo silvest re 1 rn ??r,,-? ,?i,?.<; - De los 35 mutantes transposón potenciales, 22 se atenuaron significativamente, teniendo un índice competitivo (Cl) de menos de 0.2. Un mutante de transposón que no pareció atenuarse con base en los resultados de selección STM se seleccionó de una de las agrupaciones como un control positivo. Este mutante tenía un Cl in vi vo de aproximadamente 0.6. También se realizó una competición in vi tro para este mutante dando por resultado en un Cl de 0.8. Posteriormente se determinó que el mutante contenía una inserción entre 2 ARNt..de fenilalaniña.. Los índices competitivos para los únicos mutantes de inserción individual atenuada se listan en la Tabla 3. Los índices competitivos para mutantes App de atpG, pnp , y exbB indicaron que los mutantes fueron incapaces de competir eficazmente con las cepas tipo silvestre y por lo tanto se atenuaron.

TABLA 3 Virulencia y Función Propuesta de Mutantes de A . pleuropneumoniae La exactitud del Cl pareció ser muy buena a medida que el mutante exbB compitió dentro de tres animales diferentes que proporcionaron los Cl de 0.003, 0.003 y 0.006. El uso de un número de índico Competitivo para asignar la atenuación con base en una competición en un gran estudio con animales se confirmó adicionalmente con base en resultados de vacunación preliminares en cerdos con 7 mutantes (n=8) descritos más adelante en el Ejemplo 11.

EJEMPLO 10 Caracterización de Genes de Virulencia de A . pleuropmeumoniae Atenuado Los genes de A . pl europn eumon i a e identificados representan cuatro amplias clases funcionales: enzimas biosintéticas, componentes de transporte celular, componentes de regulación celular y desconocidos. El gen a tpG, que codifica para la subunidad Fl-? del complejo F0F? H+-ATPasa, puede funcionar en la producción de ATP o en el transporte de protones mediante la hidroli zación de ATP. Un mutante atenuado de a tpG relacionado también se identificó en P . mul tocida . ___También -se identi-ficó- otro gen a tp, a tpH, que codifica para la subunidad Fi d. Los fenotipos de los mutantes atp incluyen el fenotipo sensible a ácidos no adaptable [Foster, J. Bacteriol. 173:6896-6902 (1991)], pérdida de virulencia en Salmonella typhimur.i nm [García del. Porti I lo, ol ,? l . , Infect Immun. 61:4489-4492 (1993)] y P. multocida (anterior) y una reducción tanto en las frecuencias de transformación como en la inducción de genes reguladores de competencia en Haemophilus influenzae Rd [Gwinn, et al., J. Bacteriol. 179:1315-20 (1997)] . LpdA es una dihidrolipoamida deshidrogenasa que es un componente de dos complejos enzimáticos: piruvato deshidrogenasa y 2-oxoglut arato deshidrogenasa. Mientras"' que se desconoce la relación de virulencia, la producción de pd? se induce en Salmonella typhimurium cuando se expone a una proteína bactericida proveniente de humano que puede sugerir que esta inducción se puede implicar en los esfuerzos para reparar la membrana externa [Qi, et al., Mol Microbiol. 17:523-31 (1995)]. El transpo-rte de • compuestos -escasos necesario para el desarrollo y supervivencia son decisivos in vivo. ExbB es una parte del complejo de transporte TonB [Hantke, y Zimmerman, Microbiology Letters . 45:31-35 (1981)], interactuando con TonB al menos en dos formas distintas [Karlsson, et al. , Mol Microbiol. 8:389-^96 (1993), Karlsson, et al., Mol Microbiol. 8:319-88 (1993)]. La adquisición de hierro es esencial para los patógenos. En este trabajo, se han identificado los mutantes do 1 cy.hB atenuado tanto en APP como en P. multocida . Se han identificado diversos receptores de hierro dependientes de TonB-dependent en otras bacterias [Biswas, et al., Mol. Microbiol. 24: 169-179 (1997), Braun, FEMS Microbiol, Rev. 16:295-301 (1995), Elkins, et al., Infect Immun. 66: 151-160 (1998), Occhino, et al., Mol Microbiol. 29: 1493-507 (1998), Stojiljkovic y Srinivasan, J Bacteriol. 179: 805-12 (1997)] . A. pleuropneumoniae produce 2 proteínas de unión con transferrina que probablemente dependen del sistema ExbB/ExbD/TonB , para la adquisición de hierro. PotD es una proteína de unión periplásmica que se requiere para el transporte de espermidina (una poliamina) [Kashiwagi, et al. , J Biol Chem. 268: 19358-63 (1993)]. Otro miembro de la familia Pasteurellaceae , Pasteurella haemolytica , contiene un homólogo de potD (Lpp38) que es un inmunógeno principal en terneros convalecientes o vacunados con la proteína de membrana externa [Pandher y Murphy, Vet Microbiol . 51:331-41 (1996)] . En P. haemolytica, PotD pareció estar asociado con las membranas tanto internas como externas. Se desconoce la función de PotD en la virulencia o en la relación con anticuerpos protectores aunque el trabajo anterior ha mostrado que serán atenuados Jos mu tan les /?> / I' e Streptococcus pneumoniae [Polissi, et al., ínlect. Immun. 66:5620-9 (1998)]. Se identificaron relativamente pocos "factores clásicos de virulencia", tales como por ejemplo, adhesinas o toxinas con la excepción de los homólogos para OMP P5 de Haemophilus influenzae . OMP P5 de H. influenzae es una proteína de membrana externa principal que se relaciona con la familia de de proteínas OmpA porin. [Munson,...et. al., M Infect Immun. 61:4011-20 (1993)] . Se ha mostrado que OMP P5 en Haemophilus influenzae no tipificable codifica para una proteína de subunidad fimbrial expresada como una estructura filamentosa [Sirakova, et al., Infect Immun. 62:2002-20 (1994)] que contribuye a la virulencia y a la unión de las células tanto mucina como epiteliales [Miyamoto y Bakaletz, Microb Pathog. 21:343-56 (1996), Reddy, et al., Infect Immun. 64: 1477-9 (1996), Sirakova, et al., Infect Immun . 62:2002-20 (1994)] . Un hallazgo significativo fue la identificación de dos ORF distintos que parece que codifican para los homólogo OMP P5. Éste también es el caso con dos proteínas muy similares, MOMP y 0mpA2 provenientes de Ha emoph i l us du creyi . Se debe determinar si ambas están funcionalmente implicadas en la producción de fimbriae y si la presencia de dos de estos ORF representa' una duplicación divergente con funciones redundantes o complementarias. De manera interesante, los dos mutantes OMP P5 parecen tener valores Cl dispares, lo que sugiere una diferencia en esencialidad o funcionalidad para sólo una copia. Se ha mostrado que OMP P5 experimenta variación molecular durante infecciones crónicas [Duim, et ai., Infe c t Imm un . 65:1351-1356 (1997)], sin embargo, aparece estar restringido a un gen individual que está experimentando mutaciones en mancha que dan por resultado en cambios de aminoácidos en lugar de "conmutación de tipo" debido a 'la expresión diferencial de múltiples genes. Las enzimas para doblado de proteínas son complementos importantes para el doblado eficiente de proteínas periplátsmicas - -y extracelulares , y se identificaron . dos genes cuyos productos tienen actividad peptidil-prolil isomerasa: fkpA y ti g (factor activador) . FkpA es una proteína periplásmica que es un miembro de la familia de proteínas para unión con FK506 [Horne y Young, Arch Microbiol. 163:351-65 (1995); Missiakas, et ai., Mol Microbiol. 21:811-84 (1996)]. Se ha mostrado que FkpA contribuye a la supervivencia intracelular de Salmonella typhimurium [Horne, et al. , Infect Immu . 65:806-10 (1997)] y un homólogo de Legionella pneumphila , mip [Engleberg, et al.; Infect Immun . 57:1263-1270 (1989)], es responsable de la virulencia e infección de macrófagos [Cianciotto, et al. , J. Infect. Dis. 162:121-6 (1990); Cianciotto, et al., Infect. Immun. 57:1255-1262 (1989)]. Tig, o factor activador [Crooke y ickner, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 84:5216-20 (1987), Guthrie, y Wickner, J Bacteriol. 172: 5555-62 (1990), revisado en Hesterka p, y Bukau., FEBS Lett. 389:32-4 (1996)], es una peptidil prolil isomerasa que contiene una región FKBP típica [Callebaut y Mornon, FEB Lett. 374:211-215 (1995)], aunque no se afecta por FK506 [Stoller, et al., EMBO J. 14:4939-48 (1995)]. Se ha mostrado que Tig se asocia con los ribosomas y las cadenas polipeptídicas nacientes [Hesterkamp, et al. , Proc Nati Acad Sci USA 93:4431-41 (1996), Stoller, et al., EMBO J. 14:4939-48 (1995)] . Las posibles funciones incluyen una influencia desconocida en la división celular [Guthrie, y Wickner, J Bacteriol . 172:5555-62 (1990)] en E. coli, una función en la secreción y activación de la cisteína proteinasa de Streptoccocus pyogenes [Lyon, et al., EMBO J. 17:6263-75 (1998)] y la supervivencia bajo condiciones de inanición en Bacillus subtilis [Gothel, et al., Biochemistry 37:13392-9 (1998) ] . Los patógenos bacterianos emplean muchos mecanismos para regular coordinadamente la expresión génica para sobrevivir a una amplia variedad de condiciones ambientales dentro del hospedero. Las diferencias en la estabilidad de ARNm pueden modular la expresión génica en procariotes [Belasco y Higgins, Gene 72:15-23 (1988)] . Por ejemplo, se requiere rnr (vacB) para la expresión de genes de virulencia que portan plásmidos en Shigella flexneri [Tobe, et ai., J Bacteriol. 174:6359-61 (1992)] y codifica para la ribonucleasa RnaseR [Cheng, et al., J. Biol. Chem. 273:1 077-14080 (1998)] . PNP es una polinucleótido fosforilasa que está implicadas en la degradación de ARNm. Los mutantes pnp/rnr nulos son letales, lo que sugiere un probable traslape de funciones. Por consiguiente es posible que tanto rnr como pnp estén implicados en la regulación de la expresión génica de virulencia. Un mutante pnp de P. multocida no es virulento en un. mpdelo septicémico de ratón (Ejemplo 2)] . Otros fenotipos asociados con pnp incluyen deficiencia de competencia y sensibilidad al frío en Bacillus subtilis [Wang y Bechhofer, J Bacteriol 178:2315-82 (1996)] . HupA es - una proteína bacteriana similar a histona que en combinación con HupB constituyen la proteína HU en E . coli. Los reportes han sugerido que los mutantes hupA y hupB no demuestran ningún fenotipo observable [Huisman, et al. , J Bacteriol. 171:3104-12 (1989), Wada, et al, J Mol Biol. 204:581-91 (1988)], sin embargo, los mutantes dobles hupA-hupB han mostrado ser sensibles al frío, sensibles al choque térmico y se bloquean en muchas formas de recombinación de ADN sitio-específico [Wada, et al. , J Mol Biol. 204: 581-91 (1988), Wada, et al., Gene. 76:345-52 (1989)]. Un dato limitado indicó anteriormente que hupA está implicado directamente en la virulencia [Turner, et al., Infect Immun. 66:2099-106 (1998)]. El mecanismo de la atenuación hupA sigue siendo desconocido". DnaK es una proteína de choque térmico bien conocida y bastante conservada, involucrada en las respuestas reguladoras a diversos cambios ambientales estresantes [revisado en Lindquist y Craig, Annu Rev Genet. 22:631-77 (1988)] . DnaK también es una de las proteínas para tensión inducida más significativamente en Yersinia enterocolitica después de ser fagocitadas por macrófagos [Yamamoto, et al., Microbiol Inmunol. 38:295-300 (1994)] y un mutante dnaK de Brucella suís fracasó en multiplicarse dentro de células humanas similares a macrófagos [Kohier, et al., Mol Microbiol. 20:701-12 (1996)] . Por contraste, otro patógeno intracelular, Listeria monocytogenes , no mostró inducción de dnaK después de la fagocitosis [Hanawa, et al., Infect Immun. 63:4595-9 (1995)]. Un mutante dnaK de Vibrio cholera afectó la producción de ToxR y sus factores de virulencia regulados in vitro aunque no se obtuvieron resultados similares a partir de células desarrolladas in vivo [Chakrabarti, et al., I_nfect Immun. 67:1025-1033 (1999)]. El Cl de un mutante de dnaK de A. pleuropneumonia fue superior a la mayoría de los mutantes atenuados aunque todavía aproximadamente la mitad de la cepa de control positivo . DksA es un supresor dependiente de la dosificación del desarrollo filamentoso y sensible a la temperatura en un mutante dnaK de E . col i [Kan?. y Craig, PJ Bacteriol. 172:2055-64 (1990)]. Actualmente no existe ninguna función molecular definida para DksA, aunque se ha identificado que el gen es decisivo para la virulencia de Salmonella typhímurium en pollos y polluelos recién nacidos [Turner, et al. , Infect Immun. 66:2099-106 (1998)]. En ese trabajo, se observa que el mutante dksA no se desarrolla bien con glucosa o histidina aunque se desarrolló bien con glutamina o glutamato como la única fuente de carbono. Esta observación puede indicar que el mutante dksA se daña de algún modo en la biosíntesis del glutamato [Turner, et al., Infect Immun. 66: 2099-106 (1998) ] . Se identificaron tres genes que tienen funciones en la síntesis de proteínas: ARNt-leu, ARNt- glu y rpmF . La síntesis de proteína por exclusión, los ARNt también tienen una amplia variedad de roles funcionales en la síntesis de pept idoglicanos [Stewart, et al., Nature 230:36-38 (1971)], la síntesis de anillo por porfirina [Jahn, et al., Trends Biochem Sci. 17:215-8 (1992)], la fijación de proteínas para degradación [Tobías, et al., Science 254:131 -1 (1991)], la adición post-traduccional de amino.ácidos para- p-roteínas- [Leibowitz y Soffer, B.B.R.C. 36:47-53 (1969)] y la mediación de interacciones bact erianas-eucarióticas [Gray, et al., J Bacteriol. 174:1086-98 (1992), Hromockyj, et al. , Mol Microbiol. 6:2113-24 (1992)]. De manera más específica, ARNt-leu se implica en la atenuación de transcripción [Cárter, et ai., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:8127-8131 (1986)], la formación de lesiones por Pseudomonas syringae [Rich y Willis, J Bacteriol . 179:2247-58 (1997)] y la virulencia de E. coli uropatogénico [Dobrindt, et al., FEMS Microbiol Lett. 162:135-141 (1998), Ritter, et al., Mol Microbiol . 17:109-21 (1995)]. Se' desconoce si el ARNt que se ha identificado representa una especie menor de ARNt- leu en A. pleuropneumoniae . A pesar de todo, es posible que ARNt-leu pueda tener cualquiera de una amplia variedad de funciones . RpmF es una proteína ribosomal cuyo gen también forma parte de un operón que contiene enzimas para la biosíntesis con ácido graso en E. coli. Se requerirá trabajo adicional para indicar si éste puede ser el caso en A. pleuropneumoniae , aunque la misma agrupación de genes fab y rpmF se presenta en Haemophilus influenzae [Fleisch ann, et al., Science 269: 496-512 (1995)]. La expresión de los genes fab no depende necesariamente de las transcripciones que se originan en la dirección 5' de rpmF a medida que se haya identificado un promotor secundario dentro de rpmf [Zhang y Cronan, Jr . , J Bacteriol. 180:3295-303 (1998) ] .

La clase final de mutantes atenuados incluye mutaciones dentro de genes de función desconocida o genes que no se habían identificado anteriormente. Anteriormente se habían identificado homólogos de yaeA y HI0379 en Escherichia coli [Blattner, et al. , Science 277:1453-1474 (1997)] y Haemophilus influenzae [ Fleischmann , et al., Science 269:496-512 (1995)], respectivamente. Se han designado desconocimientos restantes de genes de virulencia de Actinobacillus pleuropneumoniae (vap) . El gen vapC muestra una similitud significativa para HI0893, sin embargo, es dudosa la similitud propuesta de HI0893 como un represor transcripcional similar al regulador de respuesta a ácido graso Bm3Rl [Palmer, J Biol Chem. 273:18109-16 (1998)]. El gen vapD también es muy similar a una proteína de membrana putativa (b0878) con función desconocida de E. coli [Blattner, et al., Science 277:1453-1474 (1997)] . Otros dos desconocidos, apvA y apvB no tuvieron coincidencias significativas en las bases de datos públicas.

EJEMPLO 11 Seguridad y Eficacia de Mutantes de A . pleuropneumoniae Se utilizaron nueve grupos (n= 8) de cor dos SPF (4-5 semanas de edad, 3-10 kg) para determinar la seguridad y eficacia de siete mutantes de A . pl e uropn e umoni a e como cepas vivas de vacuna atenuada. Se infectaron siete grupos intranasalmente con 10iü UFC de cada mutante en el dia 1. Un grupo se vacunó en los días 1 y 15 con la vacuna disponible comercialmente Pleuromune (Bayer), y un grupo natural no se vacunó. En el día 29, todos los grupos se inocularon intranasalmente con 1-5 x 105 UFC por cerdo de APP225 tipo silvestre. Todos los animales sobrevivientes se sacrificaron y se les practicó necroscopia el día 42 del estudio. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4 Eficacia de los Mutantes de A . plei tropneumoniae % de Mortalidad después de inoculación intranasal Vacuna Vacunación Inoculación Pleuromune 0 37.5 exbB 0 0 tig 12.5 0 fkpA 12.5 0 HI0385 50.0 0 pnp 0 0 yaeE 0 0 atpG 0 0 Ninguna N/A 50.0 Los mutantes exbB , a tpG, pnp , y ya eA no provocaron mortalidad cuando se administraron a una dosificación de 1010 UFC intranasalmente. Los grupos de mutantes fspA y ti g tuvieron una muerte cada uno y el grupo HI0379 (el Cl más alto de los 7 mutantes probados se muestra en el Ejemplo 9) tuvo cuatro muertes. La LD50 tipo silvestre utilizando este modelo fue en general 1 x 107 UFC, indicando que cada uno de estos mutantes está atenuado al menos 100 veces y que exis-te—una correlación razonable entre el Cl y la atenuación.

EJEMPLO 12 Identificación de los Homólogos de la Especie P. (Mannheimia) haemolytica Con base en las secuencias génicas de virulencia identificadas en P. multocida y A. pleuropneumoniae , se han realizado esfuerzos por identificar genes relacionados, es decir, especies homologas, en P. (Mannheimia) haemolytica . Se utilizó PCR con los cebadores degenerados mostrados más adelante para intentar la amplificación de los genes de P. (Mannheimia ) haemolytica según se indique. Las secuencias de cebadores, sintetizadas por Sigma-Genosys (Woodlands, TX), incluyen designaciones estándar de letras individuales, en donde B indica cualquiera (C, G o T), D indica cualquiera (G, A o T), H indica cualquiera (A, C o T), K indica cualquiera (G o T), M indica cualquiera (A o C) , N indica cualquiera (A, G, C o T), R indica cualquiera (A o G) , S indica cualquiera (G o C) , V indica cualquiera (G, A, o C) , W indica cualquiera (A o T) , e Y indica cualquiera (C o T) . atpG TEFl 6 ATG GCN GGN GCN AAR GAR AT SEQ ID NO: 176 TEP148 GCN GCY TTC ATN GCN ACC AT SEQ ID NO: 177 guaB TEF240 GGN TTY ATY CAY AAA AAY ATG SEQ TD NO: 178 TEF243 TCT TTN GTR ATN GTN ?CA TCR TG SEQ ID NO: 17') pnp TEF141 GCS GGY ??? CCR CGT TCC G?T TGG SEO II) NO: 1HO TEF142 CRC CTA ARA TRT CTG AAA GCA CCA C SEQ ID NO: 181 purF TEF144 ATG TGY GGN ATY GTN GGN AT SEQ ID NO: 182 TEF247 CAT ATC AAT ACC ATA CAC ATT SEQ ID NO: 183 yjgF TEFl 62 GGN CCN TAY GTN CAR G SEQ ID NO: 184 ' TEFl63 NGC NAC YTC NAC RCA SEQ ID NO: 185 Para la amplificación de productos PCR degenerados iniciales, se estableció una reacción de 50 µl utilizando amortiguador II de 3.3X XL_ (PE Applied Biosystems), dNTPs 200 µM, 25 pmol cada uno de los cebadores adecuados, MgCl2 0.8 mM, 0.5 U de polimerasa de ADN r Tth , XL (PE Applied Biosystems) y aproximadamente 1 µg de ADN TF1. Las condiciones del ciclo fueron a 94°C durante 1.5 min; seguidas por 35 ciclos de 94°C durante 15 s, 40-60°C durante 60 s, 72°C durante 1.5 min; y un mantenimiento final a 72°C durante 5 min. Cada producto de la PCR se purificó en bando de un gel de agarosa utilizando el Equipo para Extracción con Gel QIAGEN (QIAGEN, Valencia CA) .

Se realizaron reacciones de secuenciación utilizando el equipo BigDyeMR Dye Terminator Chemistry de PE Applied- Biosystems (Foster City, CA) y se corrieron en un corre en un Secuenciador de ADN AB L Prism 377. Se _pb_tuvo -la secuencia" de' doble cadena para el marco de' lectura abierta (ORF) para cada clon. Se utilizó el software Sequencher 3.0 (Genecodes, Corp., Ann Arbor, MI) para ensamblar y analizar los datos de la secuencia. Se utilizaron los programas GCG para confirmar la identidad del ORF al buscar las secuencias homologas en las bases de datos disponibles actualmente. Se utilizó el equipo Vectorette (Genosys Biotechnologies , The Woodlands, TX) para obtener la secuencia de flanqueo adicional para cada uno de los genes. Las bibliotecas Vectorette se prepararon de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. Se utilizaron componentes del Equipo Perkin Elmer Applied Biosystems GeneAmp XL PCR para crear los productos PCR Vectorette con las siguientes condiciones de reacción. Una reacción de 50 µl se ajustó utilizando amortiguador II 3.3X XL (PE Applied Biosystems), dNTPs 200 µM, 25 pmol cada uno de los cebadores adecuados (mostrados más adelante), MgCl2 .0.8 M, 0.5 U de polimerasa de ADN r Tth , XL (PE Applied Biosystems) y 1 µl de la biblioteca vectorette adecuada. Las condiciones del ciclo fueron 94°C durante 1.5 min; seguidas por 35 ciclos a 94°C durante 20 s , 60°C durante 45s, 72°C durante 4 min; y un mantenimiento final de 72°C durante 7 min. El segundo cebador para cada biblioteca fue el cebador vectorette del fabricante.

TABLA 5 Los productos de la PCR Vectorette se purificaron y se secuenciaron en banda como se describió anteriormente. Las secuencias de polinucleótidos para los genes atpG, guaB, pnp, pucF, e yjgF se establecen en las SEQ ID NOs: 166, 168, 170, 172 y 174, respectivamente. Los polipéptidos codificados por estos genes se establecen en las SEQ ID NOs: 167, 169, 171, .173, y 175 , ..respectivamente . Se espera que se presenten para aquellos con experiencia en la técnica muchas modificaciones y variaciones en la invención como se establece en los ejemplos ilustrativos anteriores. Por consiguiente, se deben colocar sobre la invención únicamente estas limitaciones como aparece en las reivindicaciones anexas .

Claims (29)

1. REIVINDICACIONE S 1. Una bacteria de Ma nnh eimi a atenuada que comprende una mutación en un gen representado por una secuencia nucleotídica establecida en cualquiera de las SEQ ID NOsT '166 , 168, 170, 172 y 174 o una especie homologa de las mismas, la mutación da por resultado en la actividad disminuida de un producto génico codificado por el gen mutado.
2. 2. La bacteria de Ma nn h eimi a según la reivindicación 1, en donde la mutación da por resultado en la expresión disminuida de un producto génico codificado por el gen mutado.
3. 3. La bacteria de Ma nnh eimi a según la reivindicación 1, en donde la mutación da por resultado en la expresión de un producto génico inactivo codificado por el gen mutado.
4. 4. La bacteria de Mannh eimi a según la reivindicación 1 en donde la mutación da por resultado en la supresión de todos o parte del gen.
5. 5. La bacteria de Ma nnheimi a según la reivindicación 1, en donde la bacteria de Mannh eim i a es Mannh eimi a ha em olyti ca .
6. 6. La bacteria de Ma nnh eimi a según i a reivindicación 5 en donde la mutación da por resultado en la expresión disminuida de un producto génico codificado por el gen mutado.
7. 7. La bacteria de Mannheimi a según la reivindicación 5 en donde la mutación da ' por resultado en la expresión de un producto génico inactivo codificado por el gen mutado.
8. 8. La bacteria de ' Ma nnh eimi a según la reivindicación 5 en donde la mutación da por resultado en la supresión de todo o parte de gen.
9. 9. Una composición inmunogénica que comprende las bacterias según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. 10. Una composición de vacuna que comprende la composición inmunogénica según la reivindicación 9 y un portador fa-rma'céuticamente aceptable.
11. 11. La composición de vacuna según la reivindicación 10 que comprende además un adyuvante.
12. 12. Un método para producir un mutante de bacteria gramnegativa .que comprende el paso de introducir una mutación en un gen representado por una secuencia de nucleótidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NOS: 166, 168, 170, 172 y 174 o una especie homologa de las mismas, la mutación da por resultado en actividad disminuida de un producto génico codificado por el gen mutado.
13. 13. Un método para producir una bacteria de Mannheimi a atenuada que comprende el paso de introducir una mutación en un gen representado por una secuencia de nucleótidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NOS: 166, 168, 170, 172 y 174 o una especie homologa de las mismas, la mutación da por resultado en actividad disminuida de un producto génico codificado por el gen mutado.
14. 14. Un polinucleótido de Ma nnh eimi a purificado y aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias nucleotídicas establecidas en la-s SEQ ID NOS: 166, 168, 170, 172 y 174.
15. 15. Un polinucleótido de Ma n n h e i m i a purificado y aislado que comprende una secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 166.
16. 16. Un polinucleótido purificado y aislado que codifica para un producto génico de virulencia de Mannheimi a o especies homologas del mismo, seleccionado del grupo que consiste de: a) el polinucleótido según la reivindicación 14; . . .. .. :. - - - b) los polinucleótidos que codifican para un polipéptido codificado por el polinucleótido de (a); y c) los polinucleótidos que se hibridan para el complemento de los polinucleótidos de (a) o (b) bajo condiciones de severidad moderada.
17. 17. Un polinucleótido purificado y aislado de Mannheimi a que codifica para un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de los polipéptidos que tienen las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NOS: 167, 169, 171, 173 y 175.
18. 18. El polinucleótido según la reivindicación 17 que es un ADN.
19. 19. Un vector que comprende el ADN según la reivindicación 18.
20. 20. El vector según la reivindicación 19 que es un vector de expresión, en donde el ADN está unido funcionalmente a una secuencia de ADN para control de expresión.
21. 21. Una célula hospedera transformada o transfectada establemente con el ADN según la reivindicación 18, de una forma que permita la expresión del polipéptido codificado en la célula hospedera .
22. 22. Un método para producir un polipéptido recombinante que comprende cultivar la célula hospedera según la reivindicación 21 en un medio nutriente y aislar el polipéptido codificado de la célula hospedera o el medio nutriente.
23. 23. Un polipéptido purificado producido mediante el método, según la reivindicación 22.
24. 24. Un polipéptido purificado que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de polipéptidos que tienen las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NOS: 167, 169, 171, 173 y 175.
25. 25. Un anticuerpo que es reactivo específicamente con el polipéptido según la reivindicación 24.
26. 26. El anticuerpo según la reivindicación 25 que es un anticuerpo monoclonal.
27. 27. Un método para utilizar el anticuerpo monoclonal según la reivindicación 26 para identificar una bacteria de las reivindicaciones 1 ó 5, que comprende los_ pagos de poner .en contacto un extracto de bacterias con el anticuerpo monoclonal y detectar la ausencia de unión del anticuerpo monoclonal .
28. 28. Un método para identificar un agente antibacteriano que comprende los pasos de analizar los agentes potenciales para. la capacidad de interferir con la expresión o actividad de los productos génicos representados por las secuencias de aminoácidos establecidas en cualquiera de las SEQ ID NOS: 167, 169, 171, 173 y 175 e identificar un agente que interfiere con la expresión o actividad de los productos génicos.
29. 29. Un método para identificar un agente antibacteriano que comprende los pasos de: a) medir la expresión o actividad de un producto génico según se establece en cualquiera de las SEQ ID NOS: 167, 169, 171, 173 y 175; b) poner el contacto el producto génico en (a) con un compuesto de prueba; c) medir la expresión o actividad del producto génico en presencia del compuesto de prueba; y d) identificar el compuesto de prueba como un agente antibacteriano cuando disminuye la expresión o actividad del producto génico en presencia del compuesto de prueba según se compara con la expresión o actividad en ausencia del compuesto de prueba.