HUT76975A - Eljárás gének azonosítására - Google Patents

Eljárás gének azonosítására Download PDF

Info

Publication number
HUT76975A
HUT76975A HU9701765A HU9701765A HUT76975A HU T76975 A HUT76975 A HU T76975A HU 9701765 A HU9701765 A HU 9701765A HU 9701765 A HU9701765 A HU 9701765A HU T76975 A HUT76975 A HU T76975A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
gene
microorganism
dna
microorganisms
mutant
Prior art date
Application number
HU9701765A
Other languages
English (en)
Inventor
David William Holden
Original Assignee
Imperial College Innovations Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9424921.6A external-priority patent/GB9424921D0/en
Priority claimed from GBGB9501881.8A external-priority patent/GB9501881D0/en
Priority claimed from GBGB9509239.1A external-priority patent/GB9509239D0/en
Application filed by Imperial College Innovations Limited filed Critical Imperial College Innovations Limited
Publication of HUT76975A publication Critical patent/HUT76975A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/255—Salmonella (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C07K14/3156—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci from Streptococcus pneumoniae (Pneumococcus)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/38—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Aspergillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1065—Preparation or screening of tagged libraries, e.g. tagged microorganisms by STM-mutagenesis, tagged polynucleotides, gene tags
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1082—Preparation or screening gene libraries by chromosomal integration of polynucleotide sequences, HR-, site-specific-recombination, transposons, viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1086—Preparation or screening of expression libraries, e.g. reporter assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/42—Salmonella
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárások egy mikroorganizmus környezethez való alkalmazkodásában szerepet játszó gének azonosítására; közelebbről, eljárások egy patogén mikroorganizmus virulenciájáért felelős gének azonosítására.
A baktériumok és egyéb patogén organizmusok antibiotikumokkal szembeni rezisztenciája egyre nagyobb jelentőségű, következésképpen, a patogén mikroorganizmusok leküzdése érdekében új gyógyászati módszerek kifejlesztésére van szükség.
A patogén mikroorganizmusoknak a fertőzés megvalósítása céljából ki kell kerülniük a gazdaszervezet védekező mechanizmusát, és tápanyagszegény környezetben is képesnek kell lenniük a szaporodásra. Ezek elősegítése érdekében a mikroorganizmusoknak számos virulenciagénre van szükségük.
A virulenciagéneket klasszikus genetikai módszerekkel mutatták ki, és a transzpozon-mutagenezis bakteriális virulenciagének azonosítására történő kihasználása érdekében számos különböző eljárást alkalmaztak. Például, mutánsokat meghatározott fiziológiai defektusokra teszteltek, pl. vas-szabályozta proteinek hiányára [Holland és mtsai.: J. Gén. Microbiol. 138, 509 (1992)], illetve vizsgálták epithelsejteken való áthatolási képességüket [Finlay és mtsai.: Mól. Microbiol 2, 757 (1988)] és makrofágokon belüli életbenmaradásukat [Fields és mtsai.: Science 243, 1059 (1989); Miller és mtsai.: Proc. Natl.
- 2 Acad. Sci. USA 86, 5054 (1989); Groisman és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7077 (1989)]. A transzpozonmutánsokat élő fertőzési állatmodellekben a megváltozott virulenciára is tesztelték [Miller és mtsai.: Infect. Immun. 57, 2758 (1989)]. E megoldásnak az az előnye, hogy segítségével azonosíthatók a fertőzés különböző stádiumaiban fontos gének, azonban hatékonyságát jelentősen korlátozza az a tény, hogy a virulencia megváltozására nagyon sok mutánst kell egyenként tesztelni. Miller és mtsai. [Infect. Immun. 57, 2758 (1989)] 8-10 egérből álló csoportokat alkalmaztak, és 95 egymástól független csoportot szájon keresztül különböző mutánsokkal fertőztek, amihez összesen 760-950 egérre volt szükség. E rendkívül magas szám miatt a bakteriális genom virulenciagénekre történő széleskörű átvizsgálása megvalósíthatatlan volt.
Az utóbbi időben leírtak egy olyan genetikai rendszert [ín vivő expressziós technika; IVET; Mahan és mtsai.: Science 259, 686 (1993)], amellyel pozitív módon szelektálhatók a fertőzés során specifikusan indukálódó Salmonella gének. Ezzel az eljárással olyan gének azonosíthatók, amelyek a fertőzés folyamatának egy adott stádiumában expresszálódnak, azonban nem azonosíthatók a poszt-transzkripcionálisan szabályozott virulehciagének, és ami még fontosabb, ez az eljárás nem nyújt információt arról, hogy az azonosított gén(ek) ténylegesen szükséges(ek)-e a fertőzéshez vagy elősegíti(k)-e azt.
Lee és Falkov [Methods Enzymol. 236, 531 (1994)] leírtak egy nagy behatolási képességű mutánsok izolálásával végzett - eljárást Salmonella emlőssejtekbe történő behatolását befolyásoló faktorok in vitro azonosítására.
Valsh és Cepko [Science 255, 434 (1992)] eljárást írtak le agykérgi őssejtek térbeli elhelyezkedésének agykérgi fejlődés során történő - nyomonkövetésére patkányokban. A Valsh és Cepko féle eljárásban olyan toldalékfragmenst alkalmaznak, amely egyedülálló nukleinsav-szekvenciát és lacZ gént tartalmaz, de nincs arra vonatkozó utalás, hogy eljárásukkal hasznos mutánsokat vagy géneket sikerült volna detektálni.
Eljárásokat írtak le ismert gén (vagy legalább olyan DNS-molekula, amelynek szekvenciájáról rendelkezésre állnak bizonyos információk) funkcionális régiójainak azonosítására [ld. VO 94/26933 számú nemzetközi közzétételi irat; és Smith és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6479 (1995)].
Groisman és mtsai. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1033 (1993)] Salmonella-specifikus szekvenciák molekuláris, funkcionális és evolúciós szintű vizsgálatát írták le.
A patogén mikroorganizmusok (pl. Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Vibrio cholerae, Clostridium botulinum, Yersinia pestis, Shigella felxneri és Listeria monocytogenes) néhány virulenciagénje már ismert, de az egyes mikroorganizmusok összes virulenciagénjéhez viszonyítva csak kevés ilyen gént azonosítottak.
A Salmonella typhimurium által egerekben okozott betegség a hastífusz (typhus abdominalis) jó kísérleti modelljét biztosítja [Carter és Collins: ű. Exp. Med. 139, 1189 (1974)]. Napjainkig hozzávetőleg 42 olyan gént azonosítottak, amelyek befolyásolják a Salmonella virulenciáját [Groisman és Ochman: Trends Microbiol. 2, 289 (1994)]; ezek a megjósolt virulenciagének összes számának kb. egyharmadát képviselik [Groisman és Saier: Trends Biochem. Sci. 15, 30 (1990)].
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tűztük ki olyan gének azonosítását, amelyek szerepet játszanak a mikroorganizmusok környezetükhöz történő alkalmazkodásában; közelebbről, patogén mikroorganizmusok virulenciagénjeinek hatékonyabb azonosítását céloztuk meg. Célul tűztük ki továbbá a virulenciagének azonosításához szükséges kísérleti állatok számának csökkentését, valamint vakcinák, illetve - patogén mikroorganizmusok virulenciáját csökkentő hatóanyagok kiválasztására alkalmas - eljárások kifejlesztését.
A találmány tárgyát képezi egy eljárás olyan mikroorganizmus azonosítására, amely egy adott környezethez csökkent mértékben képes alkalmazkodni; az eljárás során (i) olyan mikroorganizmusok (vagy mikroorganizmusok kiónjainak) sokaságát hozzuk létre, amelyek egymástól függetlenül - egy-egy génjük egyedi markerszekvenciát tartalmazó nukleinsav alkalmazásával végzett inszerciós inaktiválásával kialakított - mutációt hordoznak, melynek eredményeként minden egyes mutáns különböző markerszekvenciát tartalmaz;
···«
- 5 (ii) az előző lépésben előállított egyes mutánsokból, továbbá az egyes mutánsokból származó egyedi markerszekvenciákat tartalmazó nukleinsavakból elkülönítve tárolt mintákat készítünk;
(iii) az (i) lépésben előállított mutánsok sokaságát az adott környezetbe visszük, és az ebben a környezetben szaporodni képes mikroorganizmusokat szaporodni hagyjuk;
(iv) a szóban forgó környezetből vagy annak egy kiválasztott részéből visszanyerjük a mikroorganizmusokat, és a visszanyert mikroorganizmusokból izoláljuk a nukleinsavat;
(v) az (iv) lépésben izolált nukleinsavban lévő markerszekvenciákat összehasonlítjuk az egyes mutánsok (ii) lépésben félretett mintájában lévő egyedi markerszekvenciákkal; és (vi) kiválasztunk egy olyan mutánst, amely az (iv) lépésben izolált markerszekvenciák egyikét sem tartalmazza.
A fenti eljárásban az adott környezetben kevésbé szaporodóképes mikroorganizmusok azonosítására negatív szelekciót alkalmazunk.
Egy mikroorganizmus számos különböző környezetben képes élni, és ismert, hogy megfelelő gének és azok termékei teszik lehetővé a mikroorganizmusok adott környezeti feltételekhez történő alkalmazkodását. Például, egy patogén mikroorganizmus (baktérium vagy gomba) gazdaszervezetben való életbenmaradás'ához egy vagy több virulenciagén termékére van szükség. Ennek megfelelően, a találmány egyik előnyös megvalósítási módja értelmében a mikroorganizmus - adott környezethez való alkalmazkodást lehetővé tevő - génje virulenciagén.
Az adott környezet alkalmas módon egy differenciált, soksejtes organizmus, például növény vagy állat. Számos baktériumról és gombáról ismert, hogy növényeket fertőznek, és a virulenciagének jelenléte és expressziója következtében képesek a növényben életben maradni és betegséget kialakítani. Amennyiben az adott környezet növény, a találmány szerinti megoldás céljaira alkalmas mikroorganizmusok közé tartoznak a következő baktériumok: Agrobacteríum tumefaciens, amely elsősorban szőlőben hoz létre tumorokat (gubacsokat); Erwinia amylovara;
o
Pseudomonas solanacearum, amely különböző növényekben szklerotiniás száradást okoz; Rhizobium leguminosarum, amely babnövényekben okoz betegségeket; Xanthomonas campestris p.v.citri, amely citrom és narancsfélék gyümölcsein üszkösödést okoz; valamint a következő gombák: Magnaporthe grisea, amely a rizs üszkösödéses betegségét okozza; Fusarium fajok, amelyek különféle növényi betegségeket okoznak; Erisyphe fajok; Colletotrichium gloesporoides; Gaeumannomyces graminis, amely gabona- és fűfélékben a gyökér és a elmer megbetegedését okozza; Glomus fajok; Laccaria fajok; Leptosphaeria maculans; Phoma tracheiphila; Phytophthora fajok; Pyrenophora teres; Verticillium alboatrum és V. dahliae; Mycosphaerella musicola és M. fijiensis. Ahogy azt a későbbiekben részletesen leírjuk, abban az esetben, ha a szóban forgó mikroorganizmus gomba, életciklusának haploid fázisúnak kell lenni.
Hasonlóan, számos mikroorganizmusról (baktériumok, gombák, egysejtűek és rrypanosoma-k) ismert, hogy állatokat, elsősorban emlősöket (beleértve az embert) fertőznek. Az állatokban a mikroorganizmusok nagyrészt a virulenciagének jelenléte és expressziója következtében képesek maradni és betegséget kialakítani. A találmány szerinti megoldás céljaira alkalmas baktériumok közé tartoznak a következők: Bordatella fajok, elsősorban a B; pertussis; Campylobacter fajok, elsősorban a C. jejuni; Clostridium fajók, elsősorban a C. botulinum; Enterococcus fajok, elsősorban az E. faecalis; Escherichia fajok, elsősorban az E. coli; Haemophilus fajok, elsősorban a H. ducrey és a H. influenzáé; Helicobacter fajok, elsősorban a H. pylori; Klebsiella fajok, elsősorban a K. pneumoniae; Legionella fajok, elsősorban a L. pneumophila; Listeria fajok, elsősorban a L. monocytogenes; Mycobacterium fajok, elsősorban a M. smegmatis és a M. tuberculosis; Heisseria fajok, elsősorban a W. gonorrhoeae és a N. meningitidis; Pseudomonas fajok, elsősorban a P. aeruginosa; Salmonella fajok; Shigella fajok; Staphylococcus fajok, elsősorban a
S. aureus; Streptococcus fajok,’ elsősorban a S. pyogenes és a S. pneumoniae; Vibrio fajok; fersinia fajok, elsősorban a Y. pestis. Emberben a felsorolt baktériumok mindegyike okoz betegséget, és az általuk okozott betegségekre állatmodellek is rendelkezésre állnak. Amennyiben a találmány szerinti eljárásban ezeket a baktériumokat alkalmazzuk, az adott környezett olyan állat, amelyet a • ♦···
- 8 baktériumok képesek megfertőzni, és abban betegséget okozni. Például, ha egér fertőzésére Salmonella typhimurium-ot alkalmazunk, az egérben olyan betegség alakul ki, amely az ember hastífuszának modelljeként szolgál. A Staphylococcus aureus egerekben bakteriémiát és vesetályog-képződést [Albus és mtsai.: Infect. Immun 59, 1008 (1991)], nyulakban pedig szivbelhártya-gyulladást okoz [Perlman és Freedman; Yale J. Bioi. Med. 44, 206 (1971)].
A találmány szerinti megoldás szempontjából lényeges, hogy egy gomba vagy egy magasabb rendű eukarióta parazita életének megfelelő stádiumában (vagyis az adott környezetben történő szaporodás idején) haploid legyen. Előnyös, ha rendelkezésre áll egy DNS-közvetitette integrációs transzformációs rendszer, és - amennyiben a mikroorganizmus emberi patogén -, ha az emberi betegség állatmodellje is hozzáférhető. A találmány szerinti megoldás céljaira alkalmas emberi patogén gombák közé tartoznak bizonyos Aspergillus fajok (pl. A. funigatus), a Cryptococcus neofbrmans, és a Histoplasma capsulatum. Ezek a gombák egyértelműen haploid fázisúak, és esetükben rendelkezésre áll DNS-közvetitette integrációs transzformációs rendszer. Toxoplasma is alkalmazható, mivel olyan parazita, amely a fertőzés során haploid fázisú. A baktériumok genomja haploid.
Emberi betegségek állatmodelljei gyakran rendelkezésre állnak; ezekben az alkalmazott állat rendszerint egér, patkány, nyúl, kutya vagy majom. Előnyös, ha egérmodell áll rendelkezésre. A találmány szerinti eljárással - emberi ···· * ··« betegség állatmodelljének alkalmazásával - kimutatott virulencia-gének nagy valószínűséggel olyan gének, amelyek emberben meghatározzák a mikroorganizmus virulenciáját.
A találmány szerinti eljárásokban való alkalmazás szempontjából különösen előnyösek a kővetkező mikroorganizmusok: Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, és Aspergillus fumigatus.
Az alábbiakban a találmány előnyös megvalósítási módját ismertetjük.
Egyedi markerszekvenciát tartalmazó nukleinsavat a következők szerint állítunk elő. Oligonukleotid-szintézis és polimeráz láncreakció (PCR) alkalmazásával kettős szálú DNS-szekvencia-toldalékok” komplex állományát állítjuk elő. Mindegyik DNS-toldalék kb. 20-80 bázispáros (bp-os), előnyösen kb. 40 bp-os egyedi szekvenciát tartalmaz, amelyet kb. 15-30 bp-os, előnyösen kb. 20 bp-os karok szegélyeznek, mely karok mindegyik toldalék esetében azonosak. Az egyedi szekvenciát alkotó bázispárok száma elegendő ahhoz, hogy random oligonukleotid-szintézissel nagyszámú (pl. több, mint 1010) egyedi szekvenciát állíthassunk elő, azonban nem túl nagy ahhoz, hogy polimeráz láncreakciót zavaró másodlagos szerkezetek alakuljanak ki. Hasonlóan, a karok hosszúságának elégségesnek kell lenni ahhoz, hogy a polimeráz láncreakció során biztosítva legyen az oligonukleotidok hatékony láncindítása (priming) .
Jól ismert, hogy az oligonukleotid 5’-végén lévő szekvenciának nem kell komplementernek lenni az amplifikálni kívánt célszekvenciával.
A PCR-primerek (láncindítók) rendszerint nem tartalmaznak két bázisnál hosszabb, egymással komplementer struktúrákat (főleg nem 3’-végükön), mivel ez primerdimer elnevezésű mesterséges termékek kialakulását segíthetné elő. Ha két primer 3’-vége hibridizálódik, ún. prímed template komplexet alkotnak, és a primerlánchosszabbítás egy primer dimer elnevezésű rövid duplex terméket eredményez.
A primerekben a belső másodlagos szerkezetet meg kell őrizni. A szimmetrikus polimeráz láncreakció érdekében többnyire mindkét primer számára 40-60 %-os G+C tartalom szükséges, úgy, hogy egyik bázis sem alkothat hosszú szakaszokat. A DNS-próba-hibridizációs vizsgálatokkal kapcsolatban alkalmazott klasszikus olvadáspontszámításokból gyakran arra következtethetünk, hogy egy adott primer egy specifikus hőmérsékleten hibridizálódik, vagy hogy a 72 °C-os lánchosszabbítási hőmérséklet túl korán disszociálja a primer/templát hibridet. A gyakorlatban a hibridek a polimeráz láncreakció során másképp viselkednek, mint ahogy arra az egyszerű olvadáspont számításokból következtethetünk.
Az optimális hibridizálási hőmérsékletet kísérleti úton határozhatjuk meg, és a megjósoltnál magasabb lehet. A Taq-DNS-polimeráz 37 °C és 55 °C közötti hőmérséklettartományban nem aktív, így a primer-lánchosszabbítás a hibridizálási lépés során történik meg, és a hibrid stabilizálódik. A hagyományos (szimmetrikus) polimeráz láncreakcióban a primerek koncentrációja egyforma, rendszerint 0,1-1 μΜ tartományban.
A toldalékokat transzpozonhoz vagy transzpozon-szerű elemhez ligáivá egyedi markerszekvenciát tartalmazó nukleinsavat kapunk. A transzpozont előnyösen egy suicide vektor szállítja, amely egy helper organimusban plazmádként van jelen, de amely a mikroorganizmus találmány szerinti eljárással történő átvitele után elvész. Például, helper organizmusként E. coli törzs, a találmány szerinti eljárásban alkalmazható mikroorganizmusként Sahaonella, átviteli eljárásként pedig konjugációs transzfer alkalmazható. Bár a transzpozon az átvitel után elveszhet, a sejtek bizonyos hányadában transzkripciós eseményen megy keresztül, melynek során - egyedi toldalékéval együtt véletlenszerűen beépül a mikroorganizmus genomjába. Az a legelőnyösebb, ha a transzpozon vagy a transzpozon-szerű elem szelektálható. Például, Sahaonella esetében a transzpozonban jelen lehet egy kanamicin-rezisztencia gén, és az exkonjugánsok kanamicint tartalmazó táptalajon szelektálhatók. Lehetőség van arra is, hogy a recipiens sejtben egy auxotrófia-márkert az egyedi markert tartalmazó nukleinsavban egy funkcionális génnel egészítsünk ki. Ez különösen előnyős akkor, ha az eljárásban gombákat alkalmazunk.
Előnyös, ha a kiegészítő funkcionális gén nem ugyanabból a fajból származik, mint a recipiens mikroorganizmus, mivel egyébként nem véletlenszerű integrációs események fordulhatnának elő.
Szintén rendkívül előnyös, ha a transzpozont vagy transzpozon-szerű elemet olyan vektor hordozza, amely a találmány szerinti - mikroorganizmus azonosítására vonatkozó - eljárásban alkalmazott mikroorganizmusban az első adott körülmények között episzomálisan (vagyis nem a kromoszóma részeként) marad fenn, míg' a körülmények megváltoztatásának hatására a második adott körülmények között az episzóma nem tartható fenn, ami olyan sejt szelektálását teszi lehetővé, amelyben a transzpozon vagy transzpozon-szerű elem olyan transzpozíciós eseményen ment keresztül, amelynek következtében - teljes egyedi toldalékéval együtt - véletlenszerűen az eljárás során alkalmazott mikroorganizmus genomjába integrálódik. Ez a megvalósítási mód azért különösen előnyös, mert ha az episzomális vektort hordozó mikroorganizmust előállítottuk, úgy minden egyes alkalommal, amikor a transzpoziciós eseményt a mikroorganizmus körülményeinek - egy első adott körülményről egy második adott körülményre történő megváltoztatásával szelektáljuk vagy indukáljuk, a transzpozon a mikroorganizmus genomjnak más-más helyére integrálódhat. Ilyenformán, ha létrehoztuk a mikroorganizmusok mintakollekcióját, amelyben minden egyes mikroorganizmus - az episzomális vektorban lévő transzpozonban vagy transzpozon-szerű elemben - egyedi toldalékszekvenciát tartalmaz (az első adott körülmények között), a mintakollekció egymás után olyan véletlenszerű inszerciós mutánsok állományainak előállítására alkalmazható, amely mutánsok mindegyike különböző (az állományon belül egyedi) toldalékszekvenciát tartalmaz. E megvalósítási mód előnyeit a következők szerint foglalhatjuk össze: (a) csökkenti az eljárás (i) lépésében egymástól függetlenül mutált mikroorganizmusok sokaságának (állományának) előállításához szükséges manipulációk számát és bonyolultságát; és (b) csak annyi különböző toldalékra van szükség, mint ahány mikroorganizmus van az eljárás (i) lépésében előállított állományban. Az (a) pontban említett előny lehetővé teszi, hogy az eljárás olyan organizmusok esetében is alkalmazható legyen, amelyekben a transzpozonmutagenezis nehezen valósítható meg (pl. Staphylococcus aureus), a (b) pontban említett előny pedig azt biztosítja, hogy különösen jó hibridizációs jellemzőkkel bíró toldalékszekvenciák választhatók ki, ami könnyebbé teszi a minőségellenőrzést. Ahogy azt a későbbiekben részletesen leírjuk, az állomány alkalmas módon kb. 100 vagy 200 egymástól függetlenül mutált mikroorganizmusból áll, így a mikroorganizmusok mintakollekciója előnyösen egy vagy két 96 üregű mikrotiter tálcán tárolható.
A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módjában az első adott körülmény egy első hőmérséklet vagy hőmérséklet-tartomány, pl. 25-32 °C, legelőnyösebben kb. 30°C, a második adott körülmény pedig egy második hőmérséklet vagy hőmérséklet-tartomány, pl. 35-45 °C, legelőnyösebben 42 °C. Más előnyös megvalósítási módokban az első adott körülmény egy antibiotikum (pl. sztreptomicin) jelenlétét, a második adott körülmény pedig
az említett antibiotikum hiányát jelenti, vagy fordítva, az első adott körülmény lehet az antibiotikum hiánya, a második adott körülmény pedig az antibiotikum jelenléte.
A Gram-negatív baktériumok genomjába történő integrációra alkalmas transzpozonok közé tartozik a Tn5, TnlO, valamint ezek származékai. A Gram-pozitív baktériumok genomjába történő integrációra alkalmas transzpozon példája a Tn916, valamint annak származékai és analógjai. A Staphylococcus aureus esetében különösen előnyösen alkalmazható transzpozonok közé tartozik a Tn917 [Cheung és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6462 (1992)] és a Tn918 [Albus és mtsai.: Infect. Immun. 59, 1008 (1991)].
Különösen előnyös, ha az alkalmazott transzpozonok a Tn917-származékok tulajdonságaival [Camilli és mtsai.: J. Bacteriol. 172, 3738 (1990)] rendelkeznek, és ha a transzpozonokat hőérzékeny vektor, pl. a pE194Ts [Villafane és mtsai.: J. Bacteriol. 169, 4822 (1987)] hordozza.
Bár a transzpozonok alkalmasak a gének inszerciós inaktiválására, erre a célra bármilyen más ismert - vagy a jövőben kifejlesztésre kerülő - eljárás is alkalmas lehet. A gének inszerciós inaktiválásának egy másik (különösen bizonyos baktériumokban, pl. Streptococcus-ban) előnyös eljárása az inszerció-duplikációs mutagenezis [a S. pneumoniae vonatkozásában ld. Morrison és mtsai.: 0. Bacteriol. 159, 870 (1984)]. Az általuk leírt eljárás egyéb mikroorganizmusok (elsősoran baktériumok) esetében is alkalmazható.
Gombák esetében az inszerciós mutációk a toldalékokat és - előnyösen - (például higromicin-B-vel vagy phleomicinnel szembeni rezisztenciát kódoló) szelektálható markereket hordozó DNS-fragmensek vagy plazmidok alkalmazásával végzett transzformációval hozhatók létre [ld. Smith és mtsai.: Infect. Immunoi. 62, 5247 (1994)]. A higromicin-B-rezisztenciát kódoló DNS-fragmensek fonalas gombák genomjába - restrikciós enzimek közvetítésével végzett integráció (REMI) alkalmazásával - történő véletlenszerű beépítése ismert eljárás [Schiestl és Petes: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7585 (1991); Lu és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12649 (1994)].
Schiestl és Petes (ld. fentebb) egy gombában alkalmazható egyszerű inszerciós mutagenezises technikát írtak le, amely magában foglalja, például, a Ty-elemek és riboszómális DNS élesztőkben történő alkalmazását.
A transzpozon vagy más DNS-szekvencia véletlenszerű integrációja egymástól függetlenül mutált mikroorganizmusok olyan állományának izolálását teszi lehetővé, amely állomány minden egyes mutánsában más-más gén van inaktiváltva (inszerciós inaktiválással), és minden egyes mutáns különböző markerszekvenciát tartalmaz.
Az ilyen inszerciós mutánsokból üreges mikrotiter tálcákon könyvtárat készítünk, oly módon, hogy a tálca minden egyes ürege különböző mutáns mikroorganizmust tartalmazzon. Az egyes mutánsokból származó egyedi markerszekvenciákat tartalmazó DNS-eket (előnyösen a klónból származó teljes DNS-t alkalmazzuk) félretesszük. Ezt úgy végezzük, hogy a mikrotiter-tálcáról kiveszünk egy mikroorganizmus-mintát, azt nukleinsav-hibridizációs membránra (pl. nitrocellulóz- vagy nylonmembránra) cseppentjük, lúg alkalmazásával lizáljuk a mikroorganizmust, majd a nukleinsavat a membránhoz rögzítjük. Ezzel a módszerrel az üreges mikrotiter-tálcák másolatát hozzuk létre.
Az üreges mikrotiter-tálcából mikroorganizmusállományokat készítünk, és DNS-üket kivonjuk. Az így kapott DNS-t polimeráz láncreakció célszekvenciájaként alkalmazzuk, melynek során a toldalékokat” szegélyező közös karokhoz hibridizálódó primereket használunk, és az amplifikált DNS-t - például 32P-izotóppal - jelöljük. A polimeráz láncreakció termékét az egyes független származó, félretett miáltal az üreges vonatkoztatási hibridizációs mintázatát kapjuk. Ez annak ellenőrzésére szolgál, hogy az egyes mikroorganizmusok valóban tartalmaznak-e markerszekvenciát, és hogy a markerszekvencia hatékonyan amplifikálható-e, illetve hatékonyan jelölhető-e.
Az adott környezetbe történő bevitel céljára a transzpozon-mutánsok állományait állítjuk elő. Előnyösen 96 üregű mikrotiter-tálcákat alkalmazunk, és egy állomány 96 transzpozon-mutánst tartalmaz. Az állomány méretének alsó határa két mutáns; felső határa elméletileg nincs, azonban a felső határt - ahogy azt a későbbiekben részletesen leírjuk - annak a környezetnek a függvényében kell mutánsokból alkalmazzuk, másolatainak
DNS próbájaként mi krotiter-tálcák meghatározni, amelybe a mutánsokat be kívánjuk vinni.
Miután a mikroorganizmusokat bevittük az adott környezetbe, az ilyen környezetben szaporodni képes mikroorganizmusokat szaporodni hagyjuk. Azt, hogy a mikroorganizmusok mennyi időt töltenek az adott környezetben, a mikroorganizmustól és a környezettől függően határozzuk meg. Megfelelő idő elteltével a mikroorganizmusokat kinyerjük az adott környezetből, kivonjuk DNS-üket, és a kivont DNS-t - a toldalékokat szegélyező karokhoz hibridizálódó - primerek alkalmazásával végzett polimeráz láncreakció templátjaiként használjuk fel. A PCR-terméket - például 32P-izotóppal - jelöljük, és az egyes független mutánsok (üreges mikrotiter-tálcáról átmásolt) félretett DNS-ének próbájaként alkalmazzuk. Azokat a félretett DNS-eket azonosítjuk, amelyek gyengén vagy egyáltalán nem hibridizálódnak az adott környezetből kinyert mikroorganizmusokból izolált DNS-sel. Ezek a nem hibridizálódó DNS-ek olyan mutánsoknak felelnek meg, amelyek adott környezethez való alkalmazkodási képessége a transzpozon vagy más DNS-szekvencia inszerciója következtében - csökkent.
A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint a karok” - a toldalékokhoz képest - nem vagy csak alig tartalmaznak jelölt nukleotidot. Például, a PCRprimereket előnyösen úgy alakítjuk tartalmazzanak guanint (vagy csak tartalmazzanak), és ha 32P-izotóppal jelölt nukleotidként dCTP-t alkalmazunk, egyik karba sem fog beépülni ki, hogy ne egy guanint radioaktívan jelölt citozin (vagy csak egy fog beépülni), a ····
- 18 toldalékba” azonban nagyobb mennyiségű radioaktívan jelölt citozin fog beépülni. A toldalék előnyösen legalább tízszer több jelölt nukleotidot tartalmaz, mint a karok; ez a különbség előnyösebben húszszoros vagy még nagyobb arányú; még előnyösebben legalább ötvenszeres vagy még nagyobb arányú. A karok előnyösen megfelelő restrikciós enzim alkalmazásával távolíthatók el a toldalékról, olyan hasítási helynél, amelyet korábban a primerbe építettünk.
Ahogy fentebb említettük, a találmány szerinti megoldás egy különösen előnyös megvalósítási módjában mikroorganizmusként patogén mikroorganizmust, adott környezetként pedig állatot alkalmazunk. E megvalósítási mód értelmében az állatba bejuttatandó mutánsállomány méretét a következő tényezők határozzák meg: (a) az egyes mutánsok sejtjeinek száma, amely valószínűleg elegendő az állatban való életbenmaradáshoz (nem inaktivált virulenciagént feltételezve); és (b) az oltóanyagként használt mikroorganizmus sejtjeinek összes száma. Amennyiben az (a) érték túl alacsony, hamis pozitív eredményeket kaphatunk, míg ha a (b) érték túl magas, az állat elpusztulhat azelőtt, hogy a kívánt módon elegendő mutáns szaporodhatna. Az (a) érték minden egyes alkalmazott mikroorganizmus esetében külön-külön meghatározható, de általában több, mint 50, előnyösen több, mint 100.
Az egy állatba bevihető egyes mutánsok száma előnyösen 50-500, alkalmas módon kb. 100. Előnyös, ha a teljes oltóanyag legfeljebb 106 (előnyösebben 10s) sejtet ··♦*
- 19 tartalmaz, bár az oltóanyag nagysága - az adott mikroorganizmustól és állattól függően - változhat.
Egy különösen előnyös eljárásban 10s sejtből álló oltóanyagot alkalmazunk, amely 100 különböző mutánsból 1000-1000 sejtet tartalmaz. Látható, hogy ezzel az eljárással egyetlen állat 100 mutáns vizsgálatára alkalmazható (szemben a korábbi eljárásokkal, amelyekben 100 mutáns vizsgálatához legalább 100 állatra van szükség).
Előnyösen három állatot oltunk be ugyanazzal a mutánsállománnyal, hogy legalább kettőt vizsgálhassunk (egyet az eljárás megbízhatóságának ellenőrzése céljából), míg a harmadik biztonsági tartalékként szolgál. Mindazonáltal, ez az eljárás az alkalmazott állatok számát tekintve még így is több, mint 30-szoros megtakarítást biztosít.
A mutánsállomány állatba történő bevitelétől a mikroorganizmusok kinyeréséig eltelt idő az alkalmazott mikroorganizmustól és állattól függ. Például, egér és Salmonella typhimurivm alkalmazása esetén a beoltás és a kinyerés között eltelt idő kb. három nap.
A találmány egyik megvalósítási módja szerint a mikroorganizmusok (iv) lépésben történő visszanyerését az (iii) lépésben végzett bevitel helyétől távol végezzük, ami biztosítja, hogy a két hely közötti szétterjedésben szerepet játszó virulenciagéneket vizsgálhassuk.
Például, egy növény esetében a mikroorganizmust egy száron vagy egy levél egyik oldalán lévő - sérülésen keresztül juttatjuk be, és a levél másik oldalán (ahol a
betegség tünetei megjelennek) nyerjük vissza.
Állat esetében a mikroorganizmust szájon keresztül, intraperitoneálisan, intravénásán vagy orron keresztül juttathatjuk be, és későbbi időpontban egy belső szervből (pl. lépből) nyerhetjük vissza. Hasznos lehet a szájon át történő (orális) beadás, illetve az intraperitoneális beadás alkalmazásával azonosított virulenciagének összehasonlítása, mivel néhány gén csak adott bejutási úton képes fertőzést kialakítani. A Salmonella-t előnyösen intraperitoneálisan adjuk be.
A virulenciagének azonosítására alkalmas egyéb előnyös környezetek közé tartoznak a tenyészetben lévő állati sejtek (elsősorban makrofágok és epithelsejtek), illetve a tenyészetben lévő növényi sejtek. Bár a sejttenyészetek alkalmazása önmagában is hasznos, abból a szempontból is előnyös, hogy kiegészítheti a környezetként teljes növény vagy állat alkalmazásával végzett vizsgálat eredményeit.
A találmány szerinti megoldás értelmében az adott környezetként előnyösen alkalmazható egy állat testének egy része is. Egy bizonyos gazda-parazita kölcsönhatáson belül számos különböző környezet lehetséges, beleértve a különböző szerveket és szöveteket, valamint azok részeit (mint pl. a Peyer-plakk) .
Az adott környezetből visszanyert egyes mikroorganizmusok (vagyis sejtek) száma legalább kétszerese, előnyösen legalább tízszerese, még előnyösebben legalább százszorosa a bevitt sejtek számának. Például, egy állatot 100 különböző mutánssal oltunk be, körülbelül 10000 mikroorganizmust kell visszanyerni és azok marker-DNS-eit vizsgálni.
A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja a következő kiegészítő lépéseket tartalmazza:
(i/a) az (i) lépésben előállított mutánsok sokaságából eltávolítjuk az auxotróf mutánsokat; vagy (vi/a) meghatározzuk, hogy a (vi) lépésben kiválasztott mutáns auxotróf-e; vagy az (i/a) és (vi/a) lépést egyaránt elvégezzük.
Előnyös, ha különbséget teszünk az auxotróf mutánsok (olyan mutáns mikroorganizmusok, amelyeknek a vad típusú* vagy prototróf mikroorganizmusok által nem igényelt növekedési faktorokra van szükségük) és az olyan mutáns mikroorganizmusok között, amelyekben egy - a mikroorganizmus adott környezethez történő alkalmazkodását lehetővé tevő - gén inaktiválva van. Ezt előnyösen az (i) és (ii) lépés között vagy a (vi) lépés után hajtjuk végre.
Ha a virulenciagének azonosítva vannak, az auxotróf mutánsokat előnyösen nem távolítjuk el.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás olyan gén azonosítására, amely gén egy mikroorganizmus számára lehetővé teszi, hogy képes legyen egy adott környezethez alkalmazkodni; az eljárás során a - csökkent alkalmazkodási képességű mikroorganizmus azonosítására vonatkozó találmány szerinti eljárás lépéseit végezzük, és további lépésként (vii) a (vi) lépésben kiválasztott mutánsból inszercióval inaktivált gént (vagy egy részét) izolálunk.
Az egyedi markert tartalmazó gének izolálási eljárásai jól ismertek.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint további lépésként (viii) próbaként a (vii) lépésben izolált inszercióval inaktivált - gén alkalmazásával egy vad típusú mikroorganizmusból megfelelő vad típusú gént izolálunk.
A gének próbák alkalmazásával végzett izolálási eljárásai jól ismertek.
A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósítására alkalmas molekuláris biológiai eljárások leírását ld. Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989), amely forrást teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni.
Amennyiben mikroorganizmusként állati patogént alkalmazunk, az azonosítani kívánt gén pedig virulenciagén, és a gén inszerciós inaktiválására transzpozont használtunk, a virulenciagéneket előnyösen úgy klónozzuk, hogy a (vi) lépésben kiválasztott mutánsból származó genomiális DNS-t a transzpozonon kívül eső területen hasító restrikciós enzimmel emésztjük, a transzpozont tartalmazó, méret szerint frakcionált DNS-t plazmidba ligáljuk, és a plazmid-rekombinánsokat a transzpozon által (és nem a plazmid által) biztosított antibiotikum-rezisztencia alapján szelektáljuk. A mikroorganizmus transzpozonnal szomszédos genomiális DNS-ét két (a transzpozon terminális régióival hibridizálódó) primer, és két másik, a plazmid « ·· ·
- 23 vagy GenBank) Amennyiben polilinker-szekvenciáihoz közel hibridizálódó primer alkalmazásával szekvenáljuk. A meghatározott szekvenciákat DNS-adatbázisban arra vizsgálhatjuk, hogy a transzpozon ismert virulenciagént szakít-e ketté. Ennek megfelelően, az e módszerrel kapott szekvenciát nyilvánosság számára hozzáférhető adatbázisok (pl. EMBL szekvenciáival hasonlítjuk össze, bebizonyosodik, hogy a kettészakított szekvencia új virulenciagén, a mutációt új genetikai háttérbe visszük (pl. Salmonella esetében P22-fág-közvetítette transzdukcióval), és meghatározzuk a mutáns törzs LD50értékét, amivel igazolható, hogy az avirulens fenotípus transzpozíciós eseménynek, és nem másodlagos mutációnak tudható be.
A mikroorganizmusban lévő valamennyi virulenciagén kimutatása céljából átvizsgálandó egyes mutánsok száma a mikroorganizmus genomjában lévő gének számától függ. Például, a Salmonella typhimurium-ban lévő virulenciagének többségének kimutatása érdekében valószínű, hogy 3000-5000 mutánst kell átvizsgálni (szkrínelni), mig az Aspergillus fajok esetében (amelyek genomja nagyobb, mint a Salmonella genomja) kb. 20000 mutáns átvizsgálására van szükség. Úgy véljük, hogy a nem kulcsfontosságú S. typhimurium gének kb. 4 %-a szükséges a virulenciához [Groisman és Saier: Trends Biochem. Sci. 15, 30 (1990)], és ha ez valóban így van, a
S. typhimurium genom hozzávetőleg 150 virulenciagént tartalmaz. A találmány szerinti eljárások a virulenciagének azonosításának gyorsabb, egyszerűbb és sokkal használhatóbb módját biztosítják, mint a korábbi eljárások.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy mikroorganizmus, amelyet a - csökkent alkalmazkodási képességű mikroorganizmus azonosítására vonatkozó találmány szerinti eljárással kapunk.
Az ilyen mikroorganizmusok azért előnyösek, mert nem képesek egy adott környezethez alkalmazkodni.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja értelmében a gazdaszervezethez (környezethez) nem alkalmazkodott patogén mikroorganizmus - amely állatokra, elsősorban emlősökre, közelebbről emberre nézve patogén - találmány szerinti eljárással kapott mutánsai vakcina előállítására alkalmazhatók. A mutáns nem virulens, Így alkalmas a páciensnek történő beadásra, de antigén sajátságú, és védő hatású immunreakciót vált ki.
A találmány egy további előnyős megvalósítási módja szerint egy találmány szerinti eljárással azonosított a gazdaszervezetben történő túléléshez nem alkalmazkodott patogén mikroorganizmust - előnyösen megfelelő DNSszekvencia bevitelével - úgy módosítunk, hogy egy másik patogénből származó antigén sajátságú epitópot expresszáljon. Az így módosított mikroorganizmus az említett másik patogén elleni vakcinaként alkalmazható.
Szintén a találmány tárgyát képezi egy olyan mikroorganizmus, amely a találmány szerinti génazonosítási eljárás alkalmazásával azonosított génben mutációt tartalmaz.
Bár a találmány szerinti mikroorganizmus-azonositási eljárás alkalmazásával azonosított mikroorganizmus előnyös, még előnyösebb, ha az azonosított génbe specifikusan be van juttatva egy mutáció. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint - különösen, ha a mikroorganizmust vakcinában kívánjuk alkalmazni - a génben lévő mutációként előnyösen deléciós vagy kereteltolódási (frameshift) mutációt vagy bármilyen más, visszaalakulásra gyakorlatilag képtelen mutációt alakítunk ki. Az ilyen génspecifikus mutációk standard eljárások alkalmazásával hozhatók létre, például oly módon, hogy a mikroorganizmusba - egy önálló replikációra képes struktúrában, például plazmidban vagy vírusgenomban - bevisszük a mutáns gén egy kópiáját, és bízunk abban, hogy a mutáció homológ rekombináció révén bejut a mikroorganizmus genomjában lévő génbe.
Szintén a találmány tárgyát képezi egy vakcinában alkalmazható mikroorganizmus, valamint egy - megfelelő mikroorganizmust és gyógyászati szempontból elfogadható hordozót tartalmazó - vakcina.
A találmány szerinti megoldás értelmében a megfelelő mikroorganizmus a fentebb említett avirulens mutáns.
A páciens immunizálását előnyösen aktív módon végezzük. E megvalósítási mód szerint megfelelő adjuvánsokat és hordozókat tartalmazó immunogén készítményben egy vagy több mutáns mikroorganizmust állítunk elő, és a készítményt ismert módszerekkel beadjuk a páciensnek. Az alkalmas adjuvánsok közé tartoznak a következők: Freund-féle komplett és nem komplett adjuváns, murami1-dipeptid, Iscoms (EP 109942; EP180564; EP231039), aluminium-hidroxid, szaponin, DEAE-dextrán, neutrális olajok (pl. miglyol), növényi olajok (pl. földimogyoróolaj) liposzómák, Pluronic™ poliolok, valamint a Ribi adjuvánsrendszer (ld. pl. GB-A-2,189,141). Az immunizálási eljárással a mikroorganizmus virulens alakja okozta betegséggel szemben megvédeni kívánt pácienst immunizálunk.
A találmány szerinti avirulens mikroorganizmusokat vagy az azokból készített készítményt bármilyen hagyományos módon beadhatjuk, például szájon keresztül vagy parenterális (pl. szubkután vagy intramuszkuláris) injekcióval. A kezelés során a baktériumok egy dózist vagy több dózisban egyaránt beadhatók.
Bár a találmány szerinti avirulens mikroorganizmus önmagában is beadható, előnyösen gyógyászati készítményben, egy vagy több elfogadható hordozóval együtt adjuk be. A hordozó(k)nak abban az értelemben kell elfogadhatónak lenni, hogy a találmány szerinti avirulens mikroorganizmussal kompatibilis legyen, és a páciensre ne legyen káros hatású. Hordozóként jellemzően steril vagy pirogénmentes vizet vagy sóoldatot alkalmazunk.
A találmány szerinti vakcina - a benne lévő mikroorganizmustól függően - humán és állatgyógyászatban egyaránt hasznos lehet.
Sok állat (köztük háziállatok) esetében ismeretesek mikroorganizmusok által okozott betegségek. A találmány szerinti - megfelelő avirulens mikroorganizmust (elsősorban avirulens baktériumot) tartalmazó - vakcinák emberek immunizálására alkalmasak, de alkalmazhatók, például,
- 27 szarvasmarhák, juhok, sertések, lovak, kutyák, macskák és szárnyasok (pl. csirkék, pulykák, ludak és kacsák) immunizálására is.
A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti génazonositási eljárással kapott gén, valamint az általa kódolt polipeptid.
A gén” kifejezésen nemcsak a polipeptidet kódoló DNSrégiókat értjük, hanem a DNS - transzkripciót, transzlációt és (néhány mikroorganizmus esetében) az RNS-splicing-ot szabályozó - régióit is. Ilyenformán, a gén magában foglalja a promótereket, a transzkripciós terminációs régiókat, a riboszómakötő szekvenciákat és (néhány organizmus esetében) az intronokat és a splicingfelismerési helyeket.
A (vii) lépésben kapott inaktivált génből szekvencia információkat származtatunk le. Szekvenáló primerként előnyösen a transzpozon végeihez közeli szekvenciákat alkalmazunk. A leszármaztatott szekvenciát vagy az inaktivált génnel szomszédos restrikciós DNS-fragmenst hibridizációs próba előállítására használjuk, amellyel egy vad típusú organizmus megfelelő vad tipusú génjét azonosítjuk, illetve izoláljuk.
A hibridizációs próbázást előnyösen szigorú feltételek mellett végezzük, hogy biztosítsuk, hogy a kívánt gént - és ne annak egy rokon génjét - kapjuk. A szigorú feltételek alatt azt értjük, hogy egy membránon rögzített gént hibridizáltatunk a próbával, amely (esetünkben több, mint 200 nukleotid hosszúságú) próba oldatban van, és a rögzített gén/hibridizált próba komplexumot 65 °C-on 10 percig 0,lxSSC-oldatban mossuk (az SSC összetétele: 0,15 M NaCl/0,015 M Na-citrát).
A Salmonella virulenciagének klónozására előnyösen alkalmazható próbaszekvenciákat az 5. és 6. ábrán mutatjuk be (részletes leírást ld. 2. példa).
A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módjában a Salmonella virulenciagének az 5. és 6. ábrán bemutatott, és a 2. példában leírt szekvenciát tartalmazzák.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti génazonositási eljárással azonosított gének (vagy legalább egy részük) a 11. és 12. ábrán bemutatott szekvenciák részét képezik. A 11. és 12. ábrán látható szekvenciák a Salmonella typhimurium-ból származó - 2. virulenciagén-cluster (VGC2) elnevezésű géncsoport részei. Az ábrákon feltüntettük a transzpozoninszerciók helyét; ezek a transzpozon-inszerciók az organizmus virulencia-determinánsát inaktiválják. Ahogy azt később (elsősorban a 4. példában) részletesen leírjuk, amennyiben a találmány szerinti génazonosítási eljárást a Salmonella typhimurium virulenciagénjeinek azonosítására alkalmazzuk, a nukleinsav-inszerciók (és így az azonosított gének) közül sok a genom viszonylag kis részén található meg. Ez a régió (VGC2) olyan egyéb virulenciagéneket tartalmaz, amelyek szintén a találmány tárgyát képezik (ld. később).
A találmány szerinti eljárással izolált gén megfelelő gazdasejtben expresszáltatható. Ennek megfelelően, a gén (DNS) - ismert, a kitanításnak megfelelően módosított technikák felhasználásával - expressziós vektor előállítására alkalmazható, amely vektor később a találmány szerinti polipeptid expresszáltatása és előállítása érdekében megfelelő gazdasejt transzformálására alkalmazható. Az ilyen technikák közé tartoznak a következő számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásokban leírt eljárások: 4,440,859 (Rutter és mtsai., 1984. 04. 3.); 4,530,901 (Veissman, 1985. 07. 23.); 4,582,800 (Crowl, 1986. 04. 15); 4,677,063 (Mark és mtsai., 1987. 06. 30.); 4,678,751 (Goeddel, 1987. 07. 07.); 4,704,362 (Itakura és mtsai., 1987. 11. 03.); 4,710,463 (Murray, 1987. 12. 01); 4,757,006 (Toole, Jr. és mtsai., 1988. 07. 12.); 4,766,075 (Goeddel és mtsai., (1988. 08. 23.); és 4,810,648 (Stalker, 1989. 03. 07); melyek mindegyikét a kitanítás részének kell tekinteni.
A találmány szerinti vegyületet képező polipeptidet kódoló DNS a megfelelő gazdába történő bejuttatás céljából sokféle egyéb DNS-szekvenciához kapcsolható. A kísérő DNS kiválasztása a gazda természetétől, a DNS gazdába történő bejuttatás! módjától, valamint attól függ, hogy a DNS episzomálisan fenntartására vagy a genomba történő integrációjára van-e szükség.
A DNS-t rendszerint pontos orientációban és az expresszióhoz megfelelő leolvasási keretben inszertáljuk az expressziós vektorba (pl. plazmidba). Kívánt esetben a DNSt megfelelő - a kívánt gazdasejt által felismert
• · · · transzkripciós és transzlációs szabályozószekvenciákhoz kapcsolhatjuk, bár ezek általában megtalálhatók az expressziós vektorban. A vektort ezután standard technikák alkalmazásával visszük be a gazdába. Általában nem mindegyik gazdasejt lesz transzformálva a vektorral, ezért a transzformált sejtek szelekciójára van szükség. Az egyik alkalmas szelekciós technika szerint az expressziós vektorba - a szükséges szabályozóelemekkel együtt - olyan DNS-szekvenciát foglalunk, amely a transzformált sejtben szelektálható sajátságot (pl. antibiotikum-rezisztenciát) kódol. Más lehetőség szerint, a szelektálható sajátságot kódoló gén egy másik vektorban helyezhető el, amelyet a kívánt gazdasejt együttes transzformálására alkalmazunk.
A találmány szerinti rekombináns DNS-sel transzformált gazdasejteket a polipeptid expressziójához megfelelő ideig és (a találmány leírása alapján szakember számára kézenfekvő) feltételek mellett tenyésztjük, majd a tenyészetből kinyerjük a polipeptidet.
Számos expressziós rendszer ismert; ezek közé baktériumok (például E. coli és Bacillus subtilis), élesztők (például Saccharomyces cerevisiae), fonalas gombák (például Aspergillus fajok), növényi sejtek, állati sejtek, illetve rovarsejtek tartoznak.
A vektor - prokariótákban történő szaporítás céljából - tartalmaz egy prokarióta replikont (pl. ColEl őri), még akkor is, ha a vektort egyéb (nem prokarióta) sejttípusokban végzett expresszáltatásra kívánjuk alkalmazni. A vektorok tartalmazhatnak megfelelő promótert is, például - transzformált bakteriális gazdasejtben (pl. E. coli-ban) a transzformálásra alkalmazott gének expressziójának (transzkripciójának és transzlációjának) irányítására alkalmas - prokarióta promótert.
A promóter egy olyan expressziós szabályozóelem (DNSszekvencia), amely lehetővé teszi az RNS-polimeráz kötődését és a transzkripció beindulását. A hagyományosan alkalmazott baktérium gazdasejtekkel kompatibilis promóterszekvenciák rendszerint megtalálhatók a plazmidvektorokban, amelyek a találmány szerinti DNS-szegmens inszertálásához megfelelő restrikciós helyeket tartalmaznak.
Prokarióta gazdasejtek alkalmazása esetén előnyös plazmidvektorok a pUC18, pUCl9, pBR322 és pBR329 (Biorad Laboratories, Richmond, CA, USA), valamint a pTrc99A és a pKTC223-3 (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA).
Emlősökből származó gazdasejtekben előnyösen alkalmazható plazmidvektor a pSVL (Pharmacia), amely a klónozott gének expressziójának irányítására kései SV40promótert tartalmaz; e vektor alkalmazása esetén a legnagyobb szintű expresszió antigéntermelő T-sejtekben, pl. COS-1 sejtekben figyelhető meg.
Az emlősökben alkalmazható indukálható expressziós vektorok egyik példája a pMSG (Pharmacia). Ez a vektor a klónozott gének expressziójának irányítása céljából az emlőstumorvírus hosszú terminális ismétlődésének glükokortikoidokkal indukálható - promóterét tartalmazza.
Élesztőkben alkalmazható plazmidok közé tartozik a pRS403-406 és a pRS413-416 (Stratagene Cloning Systems, La
Jolla, CA 92037, USA). A pRS403-, pRS4O4-, pRS405- és pRS406-plazmid élesztőgenomba integrálódó plazmidok (Yeast Integrating plasmid; YIp), és szelektálható élesztőmarkereket (HIS3, TRP1, LEU2 és URA3) tartalmaznak. A pRS413-, pRS414-, pRS415- és pRS416-plazmid ún. élesztő centromer plazmid (Ycp).
Egy adott DNS - ragadós komplementer végek segítségével - vektorba történő működőképes inszertálására számos eljárást fejlesztettek ki. Például, a vektor-DNS-be inszertálni kívánt DNS-szegmenshez komplementer homopolimer szekvenciák kapcsolhatók; ilyen esetben a vektor-DNS és a DNS-szegmens a komplementer homopolimer farkak között kialakuló hidrogénkötésekkel kapcsolódik egymáshoz, miáltal rekombináns DNS-molekulát kapunk.
A DNS-szegmens vektorhoz történő kapcsolásának egy másik lehetőségét az egy vagy több restrikciós helyet tartalmazó szintetikus kapcsolószekvenciák alkalmazása képezi. Ebben az esetben a restrikciós endonukleázos emésztéssel előállított DNS-szegmenst T4-DNS-polimerázzal vagy E. coli DNS-polimeráz-I-gyel kezeljük (ezek az enzimek 3’->5’ exonukleáz-aktivitásuknak köszönhetően eltávolítják a túlnyúló 3’-oldali egyszálú végeket, polimerázaktivitásuk révén pedig feltöltik a megmaradó 3’-végeket).
A fenti enzimaktivitások kombinálása tompa vég DNSszegmenseket eredményez, melyeket - tompa végű DNSmolekulák ligálásának katalizálására képes enzim (pl. T4DNS-ligáz) jelenlétében - a kapcsolómolekulák nagy moláris feleslegével inkubáljuk. A ligálási reakció eredményeként
- 33 ·· ·· olyan DNS-szegmenseket kapunk, amelyek végükön polimer kapcsolószekvenciákat tartalmaznak. Ezeket a DNSszegmenseket megfelelő restrikciós enzimmel hasítjuk, és a DNS-szegmens végeivel komplementer végeket kialakító enzimmel hasított - expressziós vektorba ligáljuk.
A különböző restrikciós endonukleázos helyet tartalmazó szintetikus kapcsolószekvenciák számos forrásból beszerezhetők (pl. International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, USA).
A találmány szerinti polipeptidet kódoló DNS módosításának előnyös eljárása a polimeráz láncreakció [Saiki és mtsai.: Science 239, 487 (1988)] alkalmazása.
A polimeráz láncreakció során az enzimatikusan amplifikálni kívánt DNS-t két specifikus oligonukleotid primer szegélyezi, amelyek maguk is beépülnek az amplifikált DNS-be. Ezek a specifikus primerek olyan restrikciós endonukleázos hasítási helyeket tartalmaznak, amelyek felhasználhatók az amplifikált DNS expressziós vektorokba történő klónozása során.
A találmány szerinti gének változatai szintén a találmány tárgyát képezik. Az ilyen változatok szekvenciája előnyösen legalább 70 %-ban, előnyösebben legalább 85 %bán, legelőnyösebben legalább 95 %-ban azonos a találmány szerinti eljárással izolált gének szekvenciájával (természetesen megengedhetők bizonyos szubsztitúciók, deléciók és inszerciók). Két nukleinsav-szekvencia közötti hasonlóság mértéke a university of wisconsin computer Group GAP-programja alkalmazásával határozható meg.
• ·
- 34 Hasonlóan, szintén a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti gének által kódolt proteinek változatai is.
A változat kifejezésen olyan proteineket értünk, amelyek inszerciókat, deléciókat és - konzervatív vagy nem konzervatív - szubsztitúciókat tartalmaznak, feltéve, hogy az ilyen módosítások alapvetően nem változtatják meg a protein normális működését.
Konzervatív szubsztitúciók a következő aminosavak között lehetségesek: Gly és Alá; Val, Ile és Leu; Asp és Glu; Asn és Gin; Ser és Thr; Lys és Arg; Phe és Tyr.
Az ilyen változatok a protein-szintézis és a helyspecifikus mutagenezis ismert eljárásaival állíthatók elő.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás egy mikroorganizmus adott környezethez történő alkalmazkodási képességét csökkentő vegyület azonosítására, melynek során kiválasztunk egy olyan vegyületet, amely gátolja (a) a találmány szerinti génazonosítási eljárással azonosított gén működését vagy (b) az ilyen gén által kódolt polipeptid működését.
A találmány e tárgyát olyan molekulák páronként! tesztelése (szkrínelése) képezi, amelyek a vad típusú sejtekre hatnak, a találmány szerinti eljárással izolált gént túlzott mértékben expresszáló sejtekre azonban nem.
Például, a találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint az egyik sejt vad típusú sejt, a másik pedig olyan Salmonella sejt, amelyet úgy módosítottunk, hogy a ·· · · ·
- 35 találmány szerinti eljárással izolált gént túlzott mértékben expresszálja. Az adott környezetben - a tesztelni kívánt vegyület jelenlétében - meghatározzuk az egyes sejtek életképességét és/vagy szaporodását, hogy megállapítsuk, melyik vegyület károsítja a vad típusú sejt életképességét, illetve szaporodását, miközben az említett gént túlzott mértékben expresszáló sejt életképességét, illetve szaporodását nem befolyásolja. Előnyös, ha az említett gén virulenciagén.
A találmány egyik megvalósítási módjában a mikroorganizmust (pl. S. typhimurium-ot) úgy módosítunk, hogy a találmány szerinti eljárással azonosított virulenciagént túlzott mértékben expresszálja. Tenyésztett sejtek fertőzésére (a) a túlexpresszáló mikroorganizmust, és (b) egy - a virulenciagént nem túlzott mértékben expresszáló - egyenértékű mikroorganizmust egyaránt felhasználunk. A tesztelt vegyület virulenciagén-működést szelektíven gátló hatásának meglétét vagy hiányát úgy határozzuk meg, hogy megvizsgáljuk a vegyület azon mennyiségét, amely a gazdasejtek - túlexpresszáló mikroorganizmus, illetve az egyenértékű mikroorganizmus által okozott - fertőzésének megakadályozásához szükséges (néhány virulenciagéntermék esetében előnyős, ha a tesztvegyület inaktiválja őket, miközben a virulenciagéntermékhez kapcsolódva maguk is inaktiválódnak). Ha a tesztelt vegyületből a túlexpresszáló organizmus által okozott fertőzés megakadályozásához nagyobb mennyiségre van szükség, mint az egyenértékű mikroorganizmus által okozott • ·
- 36 fertőzés megakadályozásához, úgy a tesztelt vegyület szelektív. A mikroorganizmusokat (pl. Salmonella-kát) előnyösen extracellulárisan, gyenge antibiotikummal például (a gazdasejtbe hatolni nem képes) gentamicinnel pusztítjuk el, és a tesztelt vegyületnek a sejt mikroorganizmus által okozott - fertőzését megakadályozó hatását előnyösen úgy teszteljük, hogy a sejtet lizissel feltárjuk, és meghatározzuk, hogy mennyi mikroorganizmus található benne (pl. agaron végzett szélesztéssel).
A vegyületek páronként! és egyéb módszerekkel végzett tesztelésének (szkrínelésének) leírását ld. Kirsch és Di Domenico: The Discovery of Natural Products vith a
Therapeutocal Potential”, szerk.: V.P. Gallo, 6. fejezet, 177-221. old. (Butterworths, V.K., 1993), melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni.
A páronként! tesztelés több változatban is megvalósítható, melyek során egy vegyület relatív érzékenységét két genetikailag rokon törzs alkalmazásával hasonlítjuk össze. Ha az alkalmazott törzsek egyetlen lokuszban különböznek, az e lokuszra specifikus vegyületet úgy azonosíthatjuk, hogy összehasonlítjuk az egyes törzsek inhibitorra vonatkozó érzékenységét. Például, a lokuszra specifikus inhibitorok nagyobb aktivitást mutatnak a szuperérzékeny teszt-törzzsel szemben, mint egy egyébként izogén testvértörzzsel szemben. Agar-diffúziós rendszerben a vegyület hatását a vegyületet hordozó korongot vagy üreget körülvevő gátlási zóna mérésével határozzuk meg. A diffúzió következtében a vegyület folytonos koncentráció♦ * · ··♦ · · ··· · ·
- 37 gradiense alakul ki, és a törzs inhibitorokra vonatkozó érzékenysége arányos a korong vagy üreg és a gátlási zóna széle közötti távolsággal. Az ilyen vizsgálat során az általános mikrobaellenes szerek, illetve a kívánt hatástól eltérő hatású mikrobaellenes szerek általában mindkét törzzsel szemben hasonló aktivitást fejtenek ki.
A törzspárok alkalmazásával végzett molekuláris genetikai tesztelések egy másik típusában egy klónozott génterméket egy törzsben - egy kontroll törzshöz képest túlexpresszálunk. E vizsgálati típusnak az az elvi alapja, hogy a fokozott mennyiségű célproteint tartalmazó törzsnek - egy izogén törzshöz képest - rezisztensebbnek kell lennie a klónozott géntermékre specifikus inhibitorokra. Agardiffúziós rendszerben azt várjuk, hogy a célproteint túlzott mértékben expresszáló törzs esetében a specifikus vegyület körüli gátlási zóna kisebb, mint egy egyébként izogén törzs esetében.
Egy - találmány szerinti megoldás céljaira alkalmas vegyület kiválasztásának egy másik eljárása a következő lépésekből áll:
1) kontrollként egy találmány szerinti eljárással azonosított mutáns mikroorganizmust alkalmazunk, amely adott fenotípusú (pl. avirulens);
2) a tesztelni kívánt vegyületet érintkeztetjük a vad típusú mikroorganizmussal;
3) a vad típusú mikroorganizmust bejuttatjuk az adott környezetbe (a tesztelni kívánt vegyülettel együtt vagy anélkül);
• · * « ·
- 38 4) ha a vad típusú mikroorganizmus (a vegyülettel végzett kezelés után vagy a vegyület jelenlétében) nem képes alkalmazkodni a környezethez, a szóban forgó vegyületről megállapítható, hogy képes gátolni a mikroorganizmus adott környezethez való alkalmazkodását, illetve az adott környezetben való életbenmaradását.
Amennyiben az adott környezet egy állat teste, a mikroorganizmus pedig egy patogén mikroorganizmus, a fenti eljárással azonosított vegyület felhasználható a mikroorganizmus által okozott fertőzés megakadályozására vagy enyhítésére.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy olyan vegyület, amely a találmány szerinti vegyületazonosítási eljárással azonosítható.
Az ilyen vegyület alkalmazása azonosítási eljárásával, közelebbről, a patogén mikroorganizmus gazdájával függ össze. Például, ha a szóban forgó vegyület egy emlőst fertőző baktériumból származó virulenciagén (vagy az általa kódolt polipeptid) alkalmazásával végzett eljárással azonosítható, a vegyület az említett baktérium által emlősökben okozott fertőzés kezelésére alkalmazható.
Hasonlóan, ha a vegyület egy növényt fertőző gombából származó virulenciagén (vagy az általa kódolt polipeptid) alkalmazásával végzett eljárással azonosítható, a vegyület az említett gomba által növényekben okozott fertőzés kezelésére alkalmazható.
Szintén a találmány tárgyát képezi egy olyan molekula, amely a találmány szerint génazonositási eljárással azonosított génnel vagy annak nukleinsav-termékével szelektív kölcsönhatásba lép, és alapvetően gátolja annak működését.
A nukleinsav-termék” kifejezésen a génről átíródó bármilyen RNS-t, elsősorban mRNS-t értünk.
Az említett génnel vagy annak nukleinsav-termékével szelektív kölcsönhatásba lépő (és a gén vágy a nukleinsavtermék működését gátló) molekula előnyösen antiszensz nukleinsav vagy nukleinsav-származék, még előnyösebben antiszensz oligonukleotid.
Az antiszensz oligonukleotidok egyszálú nukleinsavak, amelyek komplementer nukleinsav-szekvenciához specifikusan kötődnek. A megfelelő célszekvenciához történő kötődés eredményeként RNS-RNS-, DNS-DNS- vagy RNS-DNS-duplex jön létre. Az ilyen nukleinsavakat gyakran antiszensz nukleinsavaknak nevezik, mivel a gén szensz vagy kódoló szálával komplementerek. Az utóbbi időben tripla hélix kialakulásának lehetőségét is bebizonyosodott; a tripla hélixben egy oligonukleotid DNS-duplexhez kapcsolódik. Azt találtuk, hogy az oligonukleotidok a kettős DNS-hélix fő barázdájában lévő szekvenciákat képesek felismerni, és így tripla hélix jön létre. Ez arra utal, hogy szintetizálhatók olyan szekvencia-specifikus molekulák, amelyek a hidrogénkötő helyek fő barázdájának felismerése révén specifikusan képesek a kettős szálú DNS-hez kötődni.
Az antiszensz nukleinsav vagy oligonukleotid szekvenciája a kérdéses gén nukleotidszekvenciája ismeretében könnyen meghatározható. Például, olyan
- 40 antiszensz nukleinsavak vagy oligonukleotidok alakíthatók ki, amelyek a 11. vagy 12. ábrán bemutatott szekvencia egy részével (elsősorban az olyan szekvenciákkal, amelyek virulenciagén részét képezik) komplementerek.
Az oligonukleotidok endogén celluláris nukleázok lebontó, illetve inaktiváló hatásának vannak kitéve. E probléma megoldása céljából olyan módosított oligonukleotidok alkalmazhatók, amelyek - például megváltoztatott nukleotidok közötti kötéseket tartalmaznak (a természetes foszfodiészter kötések más kötéssel vannak helyettesítve). Például, Agrawal és mtsai. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7079 (1988)] oligonukleotidfoszf oramiditek és -foszfortioátok alkalmazásával HIV-1 szövettenyészetben fokozott HIV-1 gátlást mutattak ki. Sárin és mtsai. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7448 (1988)] oligonukleotid-metil-foszfonátok alkalmazásával a HIV-1 fokozott gátlását mutatták ki. Agrawal és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7790 (1989)] frissen fertőzött és krónikusan fertőzött sejttenyészetekben nukleotidszevekvencia-specifikus oligonukleotid-foszfortioátok alkalmazásával - a HIV-1 replikáéiójának gátlását mutatták ki. Leither és mtsai. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3430 (1990)] influenzavírus replikáéiójának oligonukleotid-foszfortioátok alkalmazásával - szövettenyészetben végzett gátlásáról számoltak be.
A mesterséges kötéseket tartalmazó oligonukleotidokról kimutatták, hogy in vivő rezisztensek a lebontással szemben. Például, Shaw és mtsai. [Nucleic Acids Rés. 19,
- 41 • ····· ·
747 (1991)] leírták, hogy az egyébként nem módosított oligonukleotidok in vivő rezisztensebbek a nukleázokkal szemben, ha 3’-végükön bizonyos sapkaképző (capping) struktúrákat tartalmaznak, továbbá leírták, hogy a sapka nélküli oligonukleotid-foszfortioátok in vivő nem bomlanak le.
Az oligonukleozid-foszfor-tioátok előállításának Hfoszfonátos eljárásának részletes leírását ld. Agrawal és Tang: Tetrahedron Letters 31, 7541 (1990); mely leírást teljes terjedelmében a kitanitás részének kell tekinteni. Az oligonukleozid-metil-foszfonátok, *-foszfor-ditioátok, -foszfor-amidátok, és -foszfát-észterek jól ismertek [ld. pl. Agrawal és Goodchild: Tetrahedron Letters 28, 3539 (1987); Nielsen és mtsai.: Tetrahedron Letters 29, 2911 (1988); Jager és mtsai.: Biochemistry 27, 7237 (1988);
Uznanski és mtsai.: Tetrahedron Letters 28, 3401 (1987);
Bannwarth: Helv. Chim. Acta 71, 1517 (1988); Crosstick és Vyle: Tetrahedron Letters 30, 4693 (1989); Agrawal és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1401 (1990), mely hivatkozásokat teljes terjedelmükben a kitanítás részének kell tekinteni]. Az ilyen oligonukleotidok szintetizálásának és előállításának egyéb eljárásai is alkalmazhatók. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az oligonukleotid dezoxiribonukleinsav (DNS), bár ribonukleinsav (RNS) szekvenciák szintén szintetizálhatók és alkalmazhatók.
A találmány szerinti megoldás értelmében hasznos oligonukleotidokat előnyösen úgy alakítjuk ki, hogy ···· rezisztensek legyenek az endogén nukleolitikus enzimek lebontó hatásával szemben. Az oligonukleotidok in vivő lebomlása kisebb hosszúságú oligonukleotid bomlástermékeket eredményez. Az ilyen bomlástermékek - teljes hosszúságú megfelelőikhez képest - nagyobb valószínűséggel vesznek részt nem specifikus hibridizációban, és kisebb valószínűséggel hatásosak. Ennek megfelelően, olyan oligonukleotidok alkalmazására van szükség, amelyek a testben ellenállóak a lebomlással szemben, és képesek a megcélzott sejtekhez eljutni. Ezek az oligonukleotidok még rezisztensebbé tehetők a in vivő lebomlással szemben, oly módon, hogy a természetes foszfodiészter kötésekét egy vagy több mesterséges (nukleotidok közötti) kötéssel helyettesítjük, például, a foszfátcsoport helyett kénatom beiktatásával. A módosított kötések példái közé tartoznak a foszfor-tioátok, metil-foszfonátok, szulfonok, szulfátok, ketilek, foszfor-ditioátok, különféle foszfor-amidátok, foszfor-észterek, valamint a foszfor-tioát hidak és foszfor-amidát hidak. E példákon kívül egyéb nukleotid közötti kötések is ismertek [ld. pl. Cohen: Trends in Biotechnology (1990)]. A foszfodiészter kötés helyett a fentiek valamelyikét tartalmazó oligonukleotidok (köztük a többféle nukleotid közötti kötést tartalmazó oligonukleotidok) szintetizálási eljárásai jól ismertek.
Az oligonukleotidok az endogén enzimek okozta lánchosszabbítással szemben sapkaképzéssel, illetve az 5’- vagy 3’-végi nukleotidokon hasonló csoportok elhelyezésével tehetők rezisztenssé. Egy sapkaképző reagens
Amino-Link II™ néven az Applied BioSystems Inc.-tói (Foster City, CA) szerezhető be. A sapkaképzési eljárások leírását ld. pl. Shaw és mtsai.: Nucleic Acids Rés. 19, 747 (1991); és Agrawal és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7595 (1991); mely forrásokat teljes terjedelmükben a kitanítás részének kell tekinteni.
Az oligonukleotidok nukleázok hatásával szembeni ellenállása kialakításának egy másik eljárása az önstabilizálás” [Tang és mtsai.: Nucl. Acids Rés. 21, 2729 (1993), melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni]. Az önstabilizált oligonukleotidok 3’végeiken haj tűhurok struktúrákat tartalmaznak, és fokozott ellenállást mutatnak a kígyóméreg-foszfodiészteráz, a DNSpolimeráz-I és a magzati borjúszérum okozta lebontással szemben. Az oligonukleotid önstabilizálódott régiója nem zavarja a komplementer nukleinsavakkal történő hibridizációt; egerekben végzett phamrakokinetikai és stabilitási vizsgálatokkal kimutatták, hogy az önstabilizált oligonukleotidok lineáris megfelelőikhez képest fokozott in vivő stabilitást mutatnak.
A találmány szerinti megoldás értelmében az antiszensz oligonukleotidok bázispárosodásból eredő kötési specifitását úgy fokozzuk, hogy korlátozzuk az antiszensz vegyület kívánt helyszín számára való in vivő hozzáférhetőségét, ami kisebb dózisok alkalmazását teszi lehetővé, és minimálisra csökkenti a szisztémás hatásokat. Ennek megfelelően, az oligonukleotikokat a kívánt hatás elérése érdekében lokálisan alkalmazzuk; ilyenkor a megcélzott helyen az • · · * · · · • ··· ··· · • · · · · · • · ··«··· ···· ··· ··· · e· ·
- 44 oligonukleotidok koncentrációja sokkal nagyobb, mint ha szisztémásán adnánk be őket, és a gyógyászati hatás lényegesen kisebb mennyiség alkalmazásával érhető el. Az oligonukleotidok nagy helyi koncentrációja fokozza a megcélzott sejtek átjárhatóságát, és hatásosan gátolja a megcélzott nukleinsav-szekvenciák transzlációját.
Az oligonukleotidok a kívánt helyre bármilyen gyógyászati készítmények lokalizált beadására alkalmas eljárással beadhatók; például, oligonukleotidok oldatát közvetlenül a kívánt helyre injektálhatunk vagy infúziós pumpa segítségével infúzióval adagolhatjuk. Ezen túlmenően, az oligonukleotidokat beültethető eszközökbe foglalhatjuk, amelyek a kívánt helyre beültetve az oligonukleotidokat a környező helyekre szabadítják fel.
Az oligonukleotidokat legelőnyösebben hidrogélben adhatjuk be. A hidrogél nem vált ki gyulladást és biológiailag lebontható. Számos hidrogél ismeretes, melyek természetes és szintetikus polimerekből egyaránt készülhetnek. A találmány egyik előnyös megvalósítási módjában olyan hidrogélt alkalmazunk, amely testhőmérséklet alatt folyékony, testhőmérsékleten (vagy ahhoz közeli hőmérsékleten) viszont alaktartó, ’ félszilárd gél halmazállapotú. Az előnyös hidrogélek ismétlődő etilénoxid/propilén-oxid egységekből állnak. Az ilyen polimerek tulajdonságai a molekulatömegtől, valamint a polietilénoxid és a polipropilén-oxid százalékos arányától függnek.
Az előnyös hidrogélek kb. 10-80 tömegszázalék (t%) etilénoxidot és kb. 20-90 t% propilén-oxidot tartalmaznak. Egy
- 45 különösen előnyös hidrogél kb. 70 t% polietilén-oxidot és 30 t% polipropilén-oxidot tartalmaz. A találmány szerinti megoldás céljaira alkalmazható hidrogélek pl. a BASF Corp.től (Parsippany, NJ) Pluronic™ márkanéven szerezhetők be.
A találmány szóban forgó megvalósítási módja értelmében a hidrogélt folyékony halmazállapotnak megfelelő hőmérsékletre hűtjük, és az oligonukleotidokat kb. 1 mg oligonukleotid/1 g hidrogél koncentrációban elegyítjük a folyadékban, majd a kapott elegyet a kezelendő felületre visszük (például, sebészeti beavatkozás esetén permetezéssel vagy ecseteléssel, illetve katéter vagy endoszkóp alkalmazásával). Ahogy a polimer melegszik, géllé szilárdul, és az oligonukleotidok - a gél pontos összetételétől függő idő alatt - a gélből a környező sejtekbe diffundálnak.
Az oligonukleotidok egyéb, kereskedelmi forgalomban beszerezhető, illetve az idevonatkozó szakirodalomban leírt implantátumok segítségével is beadhatók. Az ilyen eszközök közé tartoznak pl. a liposzómák, a mikrokapszulák és a beültethető eszközök. Például, az oligonukleotid lokális beadására biológiailag lebontható anyagokból, például polianhidridekből, poliortoészterekből, politejsavból, poliglikolsavból és ezek kopolimereiből, kollagóből, protein-polimerekből, illetve biológiailag nem lebontható anyagokból [etilén-vinil-acetátból (EVAc), polivinilacetátból, etilén-vinilakoholból és ezek származékaiból) álló implantátumok alkalmazhatók. Az oligonukleotidok olvadékok vagy oldószer-elpárologtatásos technikák alkalmazásával - a polimerizáció vagy kikeményedés során foglalhatók a polimerekbe, illetve mechanikus módszerekkel elegyíthetők. Az egyik megvalósítási mód értelmében az oligonukleotidokat beültethető eszközök (pl. dextránnal bevont gyöngyök vagy katéterek) burkolatában elegyítjük (vagy a burkolatra visszük fel).
Az oligonukleotidok alkalmazott' dózisa az oligonukleotid méretétől és beadásának céljától függ. A dózistartományt általában a kezelni kívánt szövet felületének nagysága alapján számítjuk ki. Az oligonukleotid hatásos dózisa némileg az oligonukleotid hosszúságától és kémiai összetételétől is függ, de általában - a szövet felületére vonatkoztatva - kb. 30-3000 gg/cm2 tartomány előnyös.
A találmány szerinti oligonukleotidokat szisztémásán is beadhatók a páciensnek (terápiás és megelőzési célból egyaránt); ez bármilyen hatásos módon megvalósítható, például, parenterálisan (intravénásán, szubkután vagy intramuszkulárisan), továbbá szájon vagy orron át, illetve minden olyan módon, amely lehetővé teszi, hogy a beadott oligonukleotidok a páciens véráramába kerüljenek és ott keringjenek. A szisztémásán beadott oligonukleotidokat előnyösen lokálisan beadott oligonukleotidokkal együtt alkalmazzuk, de a szisztémás beadás önmagában is alkalmazható. Felnőtt ember esetében a szisztémás adagolás hatásos dózisa rendszerint kb. 0,1-10 g alkalmanként.
A találmány szerinti molekula, amely gátolja a találmány szerinti eljárással azonosított gén (vagy annak
- 47 nukleinsav-terméke) működését, hatásosan alkalmazható az említett gének forrásaként szolgáló mikroorganizmusok (vágyközeli rokonaik) által okozott fertőzések kezelésére és megelőzésére. Ilyenformán, az ilyen molekula antibiotikum.
A fentieknek megfelelően, a találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti molekula gyógyszerkészítmény hatóanyagaként történő alkalmazásra.
Szintén a találmány tárgyát képezi egy eljárás egy mikroorganizmus által okozott fertőzésre fogékony mikroorganizmus-gazda kezelésére, melynek során a találmány szerinti eljárással azonosított - a szóban forgó mikroorganizmusból vagy közeli rokonaiból származó - gén működését gátló molekula hatásos mennyiségét adjuk be.
A hatásos mennyiségben a molekula fertőzést lényegében megakadályozó vagy a fertőzés lefolyását enyhítő mennyiségét értjük. A mikroorganizmus-gazda olyan állat vagy növény, amely fogékony a mikroorganizmus által okozott fertőzésre.
A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti eljárással azonosított gén (vagy nukleinsavterméke) működését gátló molekulából készített gyógyászati készítmények. Az ilyen készítmények a találmány szerinti molekulát egy vagy több megfelelő hordozóval együtt tartalmazzák. A hordozó(k)nak olyan értelemben kell megfelelő(k)nek lenni, hogy kompatibilisek legyenek a találmány szerinti molekulával, és ne legyen(ek) káros hatású(ak) a páciensre. Hordozóként rendszerint steril vagy pirogénmentes vizet vagy sóoldatot alkalmazunk.
• ·
- 48 Ahogy fentebb említettük (és a 4. példában részletesen leírjuk), felismertük, hogy a Salmonella typhimurium-ban bizonyos virulenciagének - az általunk VGC2-nek elnevezett - kromoszómarégióban csoportosulnak. DNS-DNShibridizációs kísérletekkel kimutattuk, hogy a VGC2-régió legalább egy részével homológ szekvenciák sok más fajban és Salmonella törzsben is megtalálhatók, de a tesztelt E. coli és Shigella törzsekben nincsenek jelen (ld. 4. példa). Ezek a szekvenciák majdnem bizonyosan konzervált géneknek felelnek meg (legalább a Salzaonella-ban), és a legalább néhány közülük virulenciagén. Úgy tartjuk, hogy más Salmonella fajokban lévő egyenértékű gének és az egyéb bélbaktériumok vagy más baktériumok egyenértékű génjei szintén virulenciagének lehetnek.
Könnyen meghatározható, hogy egy VGC2-régión belüli gén virulenciagén-e. Például, a VGC2-régió azon génjei, amelyeket a találmány szerinti eljárással (mikroorganizmusként Salmonella typhimurium, környezetként pedig állat, pl. egér alkalmazásával) azonosítottunk, virulenciagének. A virulenciagének úgy is azonosíthatók, hogy a génben mutációt hozunk létre (előnyösen nem poláris mutációt), és meghatározzuk, hogy a mutáns törzs avirulens lett-e. A mutációk kialakításának eljárásai jól ismertek (ld. később).
A találmány tárgyát képezi továbbá a Salmonella typhimurium VGC2-DNS-e vagy annak részlete, illetve az említett DNS változata vagy a DNS részletének változata.
A Salmonella typhimurium VGC2-DNS-ét a 8. ábrán • · · « · « · ···· ·· « · · • · » · · · · • · ··*··* · ·· · * ·· · ··* · · a mutatjuk be vázlatosan. Ez a DNS a 4. példában leírt tudnivalók alkalmazásával a Salmonella typhimurium ATCC 1428 törzsből nyerhető ki [ez a törzs az American Type Culture Collection-nél (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA) férhető hozzá; NCTC 12021 deponálási számon az NCTC Public Health Laboratory Service-nél (Colindale, Egyesült Királyság) is hozzáférhető]. Például, a Salmonella typhimurium genomiális könyvtárból a 11. és
12. ábrán bemutatott szekvenciákból származó próbák alkalmazásával lambda-kiónok azonosíthatók. Az összes VGC2DNS kinyeréséhez standard genomséta eljárás alkalmazható.
A 8. ábrán bemutatott restrikciós térkép a VGC2-régió DNSfragmenseinek azonosítására és lokalizálására alkalmazható.
A Salmonella typhimurium VGC2-DNS-ének részlete kifejezésen olyan DNS-szekvenciát értünk, amely a VGC2-DNS legalább 10 nukleotidját, előnyösen legalább 20 nukleotidját, előnyösebben legalább 50 nukleotidját, még előnyösebben legalább 100 nukleotidját, és legelőnyösebben legalább 500 nukleotidját tartalmazza. A VGC2-DNS különösen előnyös részlete a 11. ábrán bemutatott szekvencia vagy annak egy része, míg a VGC2-DNS egy másik különösen előnyös részlete a 11. ábrán bemutatott szekvencia vagy annak egy része.
A VGC2-DNS részlete előnyösen egy gén vagy egy gén része.
A VGC2-régióban a gének a nyitott leolvasási keretek ismert számítógépes programok alkalmazásával végzett statisztikai analízisével azonosíthatók. Kísérleti úton megállapítható, hogy egy nyitott leolvasási keret megfelele egy gén kódoló régiójának. Például, a nyitott leolvasási keretnek megfelelő DNS egy része northern-blot analízisben próbaként alkalmazható annak meghatározására, hogy expresszálódik-e olyan mRNS, amely hibridizálódik az említett DNS-sel? más módon (vagy ezenkívül) a nyitott leolvasási keretbe mutációt vihetünk be, és meghatározhatjuk a mutáció mikroorganizmus fenotípusára gyakorolt hatását. Ha a fenotípus megváltozott, a nyitott leolvasási keret egy génnek felel meg. A gének DNS-szekvencián belüli azonosítási eljárásai jól ismertek.
Az említett DNS változata vagy a DNS részletének változata kifejezésen a találmány szerinti génazonosítási eljárással azonosított gén ismertetése kapcsán a változat meghatározásában leírtaknak megfelelő változatokat értjük.
Ennek megfelelően, a Salmonella typhimurium VGC2-DNSének változatai közé egyéb Salmonella fajokból (pl. Salmonella typhi-ből vagy Salmonella enterica-ból), valamint egyéb baktériumokból (pl. egyéb bélbaktériumokból) származó egyenértékű gének (vagy azok részletei) tartoznak.
Az egyenértékű gén kifejezésen olyan géneket értünk, amelyek funkcionális szempontból ‘ egyenértékűek, továbbá olyan géneket, amelyekben egy mutáció hasonló fenotípust (pl. avirulenciát) eredményez. A találmány szerinti megoldás kidolgozása előtt nem azonosították a VGC2-régiót, illetve a benne található géneket, és valószínűleg nem alkalmazták a virulencia meghatározására.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy mutáns baktérium, amelyben (ha a normális baktérium tartalmaz egy olyan gént, amely azonos vagy egyenértékű a VGC2-régió egy génjével), a szóban forgó gén mutációt hordoz vagy hiányzik. Szintén a találmány tárgyát képezik az olyan mutáns baktériumok előállítási eljárásai, amelyekben (ha a normális baktérium tartalmaz egy olyan gént, amely azonos vagy egyenértékű a VGC2-régió egy génjével), a szóban forgó gén mutációt hordoz vagy hiányzik. A következőkben egy VGC2-gén inaktiválásának előnyös eljárását ismertetjük. Először a gént egy Salmonella lambda-DNS-könyvtárból vagy más DNS-könyvtárból származó DNS-fragmensen szubklónozzuk, amihez a hibridizációs kísérletekben próbaként a VGC2-gén egy fragmensét alkalmazzuk, majd a gént restrikciós hasítási helyek alapján térképezzük, és Escherichia coliban végzett DNS-szekvenálással karakterizáljuk. Ezután a gén kódoló régiójába - restrikciós enzimek alkalmazásával antibiotikum-rezisztenciát (pl. kanamicin-rezisztenciát) kódoló DNS-szegmenst viszünk be, lehetőség szerint azt követően, hogy a klónozott gén kódoló régiójának egy részét restrikciós enzimekkel eltávolítottuk. Rendelkezésre állnak olyan eljárások és - antibiotikum-rezisztencia markert tartalmazó - DNS-konstrukciók, amelyekkel biztosítható, hogy a szóban forgó gén inaktiválása előnyösen ne poláris legyen, vagyis a kérdéses géntől 3’-irányban lévő gén expresszióját ne zavarja. A gén mutáns változatát ezután P22-fág transzdukeióval E. coli-ból Salmonella typhimuriumba visszük át, és a transzduktánsokat Southernhibridizációval arra vizsgáljuk, hogy a mutáns gén
- 52 kromoszómába történő homológ rekombinációja megvalósult-e.
Ez az eljárás Salmonella fajok esetében általánosan alkalmazott (és felhasználható a Salmonella typhi esetében); az eljárás további részletei számos forrásban megtalálhatók [ld. pl. Gálán és mtsai.: 174, 4338 (1992)].
Szintén a találmány tárgyát képezik a következők: a találmány szerinti mutáns baktérium alkalmazása vakcinában; az ilyen baktériumot és gyógyászati szempontból elfogadható hordozót tartalmazó gyógyászati készítmények; a Salmonella typhimurium VGC2-DNS-e által kódolt polipeptid, annak egy része vagy egy részének változata; eljárás egy baktérium gazdaszervezetet megfertőző vagy abban betegséget okozó képességét csökkentő vegyület azonosítására; egy ilyen eljárással azonosítható vegyület; a VGC2-régió egy génjével (vagy annak nukleinsav-termékével) szelektív kölcsönhatásba lépő, és működését alapvetően gátló molekula; valamint az ilyen molekula gyógyászati alkalmazása, és az ilyen molekulából készült gyógyászati készítmények.
A VGC2-DNS a találmány szerinti eljárásokkal azonosított géneket tartalmaz, továbbá olyan géneket, amelyeket elhelyezkedésük alapján azonosítottunk (annak ellenére, hogy a találmány szerinti eljárásokkal is azonosíthatók) . A találmány fentebb felsorolt tárgyai szoros kapcsolatban állnak a találmány korábbiakban ismertetett tárgyaival, és ilyenformán, a korábban leirt tudnivalók és előnyös megvalósítási módok ez utóbbi tárgyakra is érvényesek.
A találmány szerinti megoldás szempontjából előnyös,
• · · « « » ha a gén a VGC2-régióból származik vagy ha egy másik Salmonella fajból, pl. S. typhi-ből származó egyenértékű gén. A mutáns baktérium előnyösen mutáns SaTmonp7.7 a typhimurium vagy egy másik Salmonella faj, pl. S. typhi mutánsa.
Úgy tartjuk, hogy a VGC2-régióban lévő gének közül legalább néhány képes arra, hogy a baktérium számára biztosítsa a sejtekbe történő behatolást.
Az alábbiakban az ábrák rövid leírását ismertetjük.
Az 1. ábrán a találmány egy különösen előnyös megvalósítási módját mutatjuk be vázlatosan.
A 2. ábrán 12 S. typhimurium exkonjugáns DNS-ének (EcoRV restrikciós enzimmel végzett emésztés utáni) Southern hibridizációs analízisének eredményét mutatjuk be.
A 3. ábrán egy mikrotiter tálca (A1-H6) feléről származó 48 S. typhimurium exkonjugáns DNS-ének teleplenyomat- hibridizációs analízisének eredményét mutatjuk be. A filtert az első 24 telep közös állományából (pool; AlD6) izolált DNS jelölt, amplifikált toldalékait tartalmazó próbával hibridizáltattuk.
A 4. ábrán egy mikrotiter tálcáról (Al-Hll) származó 95 s. typhimurium exkonjugáns (melyeket egérbe injektáltunk) DNS-ének teleplenyomat-hibridizációs analízisének eredményét mutatjuk be. A replika-filtereket a közös állományból származó jelölt, amplifikált toldalékokkal (oltóanyag mintázat) vagy a fertőzött állat lépéböl kinyert, több, mint 10000 egyesített telepből izolált DNS54 bői származó jelölt, amplifikált toldalékokkal (lép mintázat) hibridizáltattuk. A B6, All és C8 telep mindkét filteren gyenge hibridizációs jelet eredményezett. Az A3, C5, G3 (aroA) és F10 hibridizációs jelei csak az oltóanyag mintázaton vannak jelen.
Az 5. ábrán egy - találmány szerinti eljárás alkalmazásával izolált - Salmonella gén szekvenciájának és az Escherichia coli clp proteáz genomjának összehasonlítását mutatjuk be.
A 6. ábrán a találmány szerinti eljárással izolált további Salmonella gének részleges szekvenciáit mutatjuk be (8-36. azonosítószámú szekvenciák).
A 7. ábrán a VGC2 S. typhimurium kromoszómán végzett térképezésének eredményét mutatjuk be. 7/A ábra: a VGC2 három régiójából származó DNS-próbákat - bezárt Mud-P22 profágokat hordozó - S. typhimurium törzsek sorozatából származó lizátumok Southern hibridizációs vizsgálatára alkalmaztuk. Ezen az ábrán egy 7,5 kb-os Pstl-fragmenshez (8. ábra, A próba) hibridizáló lizátumokat mutatunk be. A másik két alkalmazott próba ugyanezen lizátumokhoz hibridizálódott. A 7/B ábrán az inszerciós pontokat és a fág csomagolódási irányát mutatjuk be [a percekben megadott térképi helyeknek megfelelően; Sanderson és mtsai.: Microbiol. Rév. 59, 241 (1995)]. A f ágelnevezések a következő törzseknek felelnek meg: 18P - TT15242; 18Q TT15241; 19P - TT15244; 19Q - TT15243; 20P - TT15246; és 20Q - TT15245 (hivatkozást ld. 4. példában). A térképezett gének elhelyezkedését vízszintes vonalakkal jelöltük, és
- 55 egyéb gének hozzávetőleges elhelyezkedését is feltüntettük.
A 8. ábrán a VGC2 fizikai és genetikai térképét mutatjuk be. (A) 16 transzpozon-inszerció helyét a vonal felett tüntetjük fel. A VGC2 kiterjedését a vastagabb vonal jelzi. A nyitott leolvasási keretek transzkripciójának helyét és irányát (ld. 4. példa) a vonal alatti nyilak jelzik (hasonló gének nevével együtt), kivéve a 12. és 13. nyitott leolvasási keretet, amelyek termékei kétkomponensű szabályozórendszerek egy változatának szenzor, illetve szabályozó komponenséhez hasonlóak. (B) A vastag vonalak átfedő kiónok és a TT15244 Mud-P22 profág törzs EcoRI/Xbal restrikciós fragmensének elhelyezkedését jelzik. Az ábrán csak a térképezett lambda-klón részleteket mutatjuk be (a kiónok e határokon túlnyúlhatnak). (C) Feltüntettük a restrikciós helyeket: B - BamHI; E - EcoRI; V - EcoRV; H HindlII; P - PstI; X - Xbal. A 7. ábrán bemutatott kísérlet próbájaként alkalmazott 7,5 kb-os Pstl-fragmenst (A próba), és a 10. ábrán bemutatott kísérlet próbájaként alkalmazott 2,2 kb-os PstI/HindiII-fragmenst (B próba) a restrikciós térkép alatt tüntetjük fel. Az 1. szekvencia (ld. 11. ábra) és a 2. szekvencia (ld. 12. ábra) elhelyezkedését nyilakkal jelezzük.
A 9. ábrán a VGC2 határainak térképezését mutatjuk be. Az E. coli K12 kromoszómájának 37. és 38. perce között lokalizált géneket a S. typhiwurium LT2 kromoszómájának 30. és 31. perce közötti megfelelő régiójával rendeztük egymás mellé. Az ábrán a VGC2-régió felnagyított térképét is bemutatjuk, amely mellett feltüntettük a 11 próbaként
- 56 alkalmazott S. typhimurium (S. t.) DNS-fragmenst (vastag oszlopok) , valamint az előállításukhoz alkalmazott restrikciós helyeket, melyek a következők: B - BamHI; C Clal; H - HindlII; K - KpnI; P - PstI; N - Nsil; S - Sáli. Az E. coli K12 (E. c.) genomiális DNS-hez hibridizálódó próbákat + jellel, a nem hibridizálódókat pedig jellel azonosítottuk.
A 10. ábrán látható, hogy a VGC2 a Salmonella fajokban konzervált, és e fajokra specifikus. A Salmonella szerológiai változatokból (serovar) és más patogén baktériumokból származó genomiális DNS-t Pstl-gyel (A), HindlII-mal és EcoRV-tel (B) emésztettük, és - próbaként a
7. lambda-klón 2,2 kb-os Pstl/HindlII-fragmensének alkalmazásával (B próba; ld. 8. ábra) - Southern hibridizációs analízist végeztünk. A filtereket szigorú (A), illetve mérséklet feltételek mellett (B) hibridizáltattuk.
A 11. ábrán a VGC2 1. szekvenciájának DNSszekvenciáját mutatjuk be a középponttól a bal oldali vég irányába (ld. a 8. ábrán feltüntetett 1. szekvencia feliratú nyilat). A DNS mind a hat leolvasási keretben transzlálódik. A szekvenciák felett feltüntettük a feltételezett gének starthelyét és végét, valamint az STM alkalmazásával azonosított különböző mutánsok transzpozoninszerciós helyeit (37. azonosítószámú szekvencia). A * jel hagyományosan stopkodont jelöl. Ahol szükséges volt, a standard kétértelmű nukleotid kódokat alkalmaztuk.
A 12. ábrán a VGC2 2. szekvenciájának DNS- 57 szekvenciáját mutatjuk be (C cluster; ld. a 8. ábrán feltüntetett 2. szekvencia feliratú nyilat). A DNS mind a hat leolvasási keretben transzlálódik. A szekvenciák felett feltüntettük a feltételezett gének starthelyét és végét, valamint az STM alkalmazásával azonosított különböző mutánsok transzpozon-inszerciós helyeit (37. azonosítószámú szekvencia). A * jel hagyományosan stopkodont jelöl. Ahol szükséges volt, a standard kétértelmű nukleotid kódokat alkalmaztuk.
A 7. és 12. ábra a 4. példához kapcsolódik.
1. példa
Virulenciagének azonosítása Salsanella typh±nrarin»-ban
Baktériumtörzsek és plazmidok
A Salmonella typhimurium 12023 törzset (amely egyenértékű az ATCC 14028 deponálási számú törzzsel) a National Collection of Type Cultures gyűjteményből (NCTC; Public Health Laboratory Service, Colindale, London, Egyesült Királyság) kaptuk. Laboratóriumunkban e törzs spontán nalidixilsav-rezisztens mutánsát (12023 Nalr) szelektáltuk. A 12023-as törzs egy másik származékát, a CL1509-et (aroA:TnlO) Fred Heffron-tól kaptuk. Az E. coli CC118 Xpir törzset (Á[ara-leu], araD, ÁlacX74, galE, galK, phoA20, thi-1, rpsE, rpoB, argE(Am), recAl, Apir fág lizogén) és az E. coli S17-1 Xpir törzset (Tpc, Smr, recA, thi, pro, hsdR7'M+m RO4:2-Tc:Mu: KmTn7, Xpir) Kenneth Timmis• · ·· « ·
- 58 tői kaptuk. Az E. coli DH5a törzset S. typhimurium DNS-t tartalmazó pUC18 plazmid (Gibco-BRL) és Bluescript plazmid (Stratagene) szaporítására alkalmaztuk. A pUTmini-Tn5Km2 plazmidot [de Lorenzo és mtsai.: J. Bacteriol. 172, 6568 (1990) Kenneth Timmis-től kaptuk.
Félig véletlenszerű (sémi-random) szekvenciatoldalékok előállítása és ligálása
Az RT 1 (5 ’ -CTAGGTACCTACAACCTCAAGCTT- [ NK] 20-AAGCTTGGTTAGAATGGGTACCATG-3*; 1. azonosítószámú szekvencia) oligonukleotid állományt (pool), valamint a P2 prímért (5*-TACCTACAACCTCAAGCT-3’; 2. azonosítószámú szekvencia), a P3 prímért (5*-CATGGTACCCATTCTAAC-3*; 3. azonosítószámú szekvencia); a P4 prímért (5’-TACCCATTCTAACCAAGC-3’; 4.
azonosítószámú szekvencia); és a P5 prímért (5*CTAGGTACCTACAACCTC-3’; 5. azonosítószámú szekvencia) oligonukleotid-szintetizáló készülék (Applied Biosystems, 380B modell) alkalmazásával szintetizáltuk. Az RTl-ből polimeráz láncreakcióval (PCR) kettős szálú DNStoldalékokat állítottunk elő. A reakciót 100 μΐ térfogatú elegyben [1,5 mM MgClí, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl puffer (pH=8,0); 20 pg RT1 (célszekvencia); 250-250 μΜ dATP, dCTP, dGTP és dTTP; 100 pM P3 és P5 primer; és 2,5 egység Amplitaq (Perkin-Elmer Cetus)], 30 ciklussal (95 °C-on 30 másodperc, 50 °C-on 45 másodperc és 72 °C-on lo másodperc) végeztük. A PCR-terméket géltisztítással tisztítottuk [ld. Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory
Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)], elutipD oszlopon (Schleicher és Schull) átfolyattuk, majd KpnI-gyel emésztettük, és pUC18 vagy pUTmini-Tn5Km2 plazmidba ligáltuk. A ligálás érdekében a plazmidokat KpnI-gyel emésztettük és borjúbél alkalikus foszfatázzal (Gibco-BRL) defoszforiláltuk. A ligálás előtt a linearizált plazmidokat géltisztítottuk [Sambrook és mtsai., ld. fentebb], hogy az emésztményből eltávolitsuk a nem hasított DNS-fragmenseket. A ligálási reakcióelegyek 25 μΐ térfogatban hozzávetőleg 50-50 ng plazmidot és kettős szálú DNS-toldalékot, valamint (a forgalmazó által biztosított pufferrel együtt) 1 egység T4-DNS-ligázt (Gibco-BRL) tartalmaztak. A ligálásokat 24 °C-on két óra hosszat végeztük. A plazmid-DNS önligálódásából, illetve az emésztetlen plazmid-DNS-ből származó baktériumtelepek arányának meghatározása céljából kontroll reakciót végeztünk, amelyben a kettős szálú DNS-t kihagytuk a ligálási reakcióelegyből. E kontroll reakció az E. coli CC118 törzs transzformálása (Sambrook és mtsai., ld. fentebb) után nem eredményezett ampicillin-rezisztens baktériumtelepeket, míg a kettős szálú toldalék-DNS-t tartalmazó ligálási reakció eredményeként 185 ampicillinrezisztens telepet kaptunk.
Bakteriális transzformáció és a baktériumok konjugálása
A pUTminiTn5-Km2 plazmid és a kettős szálú toldalékDNS közötti ligálási reakciók termékeit E. coli CC118 törzs transzformálására alkalmaztuk [Sambrook és mtsai. (1989), ld. fentebb]. összesen kb. 10300 transzformánst gyűjtöttünk egybe, és az ebből az állományból kivont plazmid-DNS-t E. coli S-17 Xpir törzs [de Lorenzo és Timmis: Methods in Enzymol. 264, 386 (1994)] transzformálására alkalmaztuk. A konjugálás! kísérletekhez hozzávetőleg 40000 ampicillinrezisztens E. coli S-17 Xpir transzf ormánsból álló állományt és a S. typhimurium 12023 Nalr törzset elkülönítve 1,0 OD5eo érték eléréséig tenyésztettük. Az egyes tenyészetek 0,4 ml-es alikvotjait 5 ml 10 mM magnézium-szulfát-oldatban összekevertük, és Millipore membránon (0,45 pm átmérő) leszűrtük. A szűrőmembránokat M9-sókat [de Lorenzo és Timmis: Methods in Enzymol. 264, 386 (1994)] tartalmazó agar felületre helyeztük, és 37 ‘’Con 16 óra hosszat inkubáltuk. A baktériumok kinyerése érdekében a szűrőmembránokat 37 °C-on folyékony LBtápközegben 40 percig rázattuk, és az exkonjugánsok szelektálása céljából a szuszpenziót 100 gg/ml nalidixilsavat (a donortörzzsel szembeni szelekcióhoz) és 50 μς/πιΐ kanami cint (a recipiens törzs szelekciójához) tartalmazó LB-táptalajra szélesztettük. Az egyes exkonjugánsokat úgy ellenőriztük, hogy nalidixilsavrezisztens (nalr) és kanamicin-rezisztens (kanr) telepeket (az E. coli és a S. typhimurium megkülönböztetése céljából) MacConkey laktóz indikátor táptalajra, illetve ampicillint tartalmazó LB-táptalajra helyeztünk. A nalr, kanr telepek hozzávetőleg 90 %-a érzékeny volt az ampicillinre, ami azt jelzi, hogy ezek valódi transzpoziciós eseményekből származtak [de Lorenzo és Timmis: Methods in Enzymol. 264, 386 (1994)]. Az egyes ampicillin-rezisztens exkonjugánsokat - LB tápközeget tartalmazó - 96 üregű mikrotiter tálcákon tároltuk. A -80 °C-on végzett hosszú időtartamú tárolás céljából a tápközegbe 7 % DMSO-t vagy 15 % glicerint kevertünk.
A mutánsok fenotípusos karakterizálása
A mutánsokat az auxotróf mutánsok azonosítása céljából a mikrotiter tálcákról - M9-sókat és 0,4 % glükózt tartalmazó - szilárd táptalajra másoltuk [Sambrook és mtsai. (1989), ld. fentebb]. A durva telepmorfológiájú mutánsokat az agarlemezeken lévő telepek kis nagyítású mikroszkóppal végzett vizsgálatával figyeltük meg.
Teleplenyomat vizsgálatok, DNS-kivonások, polimeráz láncreakciók, DNS jelölések és hibridizálások
A teleplenyomat-hibridizációk esetében az exkonjugánsok mikrotiter tálcákról - 50 gg/ml kanamicint tartalmazó LB-agar táptalaj felületére helyezett - Hybond N nylon szűrőkre (Amersham, Egyesült Királyság) történő átvitele céljából 48 üregű fém replikátort (Sigma) alkalmaztunk. 37 °C-on végzett egy éjszakás inkubálás után a baktériumtelepeket hordozó szűrőket eltávolítottuk, és szobahőmérsékleten 10 percig szárítottuk. A baktériumokat 0,4 N NaOH-oldattal emésztettük, és a szűrőket - a gyártó
útmutatásai szerint - 0,5 N Tris-Cl pufferrel (pH = 7,0) mostuk. A bakteriális DNS-t Stratalinker”-bői (Stratagene) kibocsátott UV-fénnyel rögzítettük a szűrőkhöz. A 32Pizotóppal jelölt próbákhoz történő hibridizációkat szigor feltételek mellett, korábbi leírás szerint [Holdén és mtsai.: EMBO J. 8, 1927 (1989)] végeztük. A DNS kivonása céljából a transzpozon-mutáns S. typhimurium törzseket mikrotiter tálcákon, folyékony LB tápközegben, majd szilárd táptalajon szaporítottuk. Teljes DNS-t Ausubel és mtsai. leírása alapján [Current Protocols in Molecular Biology, John Viley and Sons, New York (1987)] hexadecil-trimetilammónium-bromidos (CTAB) eljárással állítottunk elő.
Röviden; 150-1000 μΐ térfogatot kitevő sejteket centrifugálással kicsaptunk, és 576 μΐ TE-pufferben újraszuszpendáltunk. A szuszpenzióhoz 15 μΐ 20 %-os SDS-t és 3 μΐ 20 mg/ml proteináz-K-t adtunk. 37 °C-on egy óra hosszat végzett inkubálás után az elegyhez 166 jil 3 M NaCloldatot adtunk, alaposan elkevertük, majd 80 μΐ 10 vegyes%os CTAB-t és 0,7 M NaCl-oldatot adtunk hozzá. Alapos keverés után az oldatot 65 °C-on 10 percig inkubáltuk. Fenol és fenol/kloroform eleggyel végzett extrakció után a DNS-t izopropanol hozzáadásával kicsaptuk, 70 %-os etanollal mostuk, és hozzávetőleg 1 gg/|il koncentrációban TE-pufferben újraszuszpendáltuk.
A DNS-mintákat - jelölt próbák előállítása érdekében két menetben polimeráz láncreakcióba vittük. Az első polimeráz láncreakciót 100 μΐ reakciótérfogatban a következő összetételű elegy alkalmazásával végeztük: 20 mM
Tris-Cl puffer (pH = 8,3); 50 mM KCl; 2 mM MgCl2; 0,01 % Tween 80; 200-200 μΜ dATP, dCTP, dGTP és dTTP; 2,5 egység Amplitaq polimeráz (Perkin-Elmer Cetus); 770 ng P2 primer és 770 gg P4 primer; valamint 5 gg cél-DNS. 95 °C-on 4 percig végzett kezdeti denaturálás után a láncreakciót 20 ciklussal végeztük: 50 °C-on 45 másodperc; 72 °C-on 10 másodperc; és 95 °C-on 30 másodperc. Á PCR-termékekét kloroform és izoamil-alkohol 24:1 arányú elegyével extraháltuk, majd etanollal kicsaptuk. A DNS-t 10 gl TEpufferben újraszuszpendáltuk, és a PCR-termékekét 1,6 %-os Seaplaque gélen (FMC Bioproducts) TAE pufferben végzett elektroforézissel tisztítottuk. A kb. 80 bp-os fragmenseket tartalmazó gélszeleteket kivágtuk, és ezeket a második polimeráz láncreakcióban használtuk fel. Ezt a láncreakciót 20 gl össztérfogatban végeztük; a reakcióelegy összetétele a következő volt: 20 mM Tris-Cl puffer (pH = 8,3); 50 mM KCl; 2 mM MgCl2; 0,01 % Tween 80; 50-50 μΜ dATP, dCTP, dGTP és dTTP; 10 μΐ 32P-dCTP (3000 Ci/mmól; Amersham); 150 ng P2 primer és 150 gg P4 primer; 10 ng cél-DNS (az első PCR termékét tartalmazó 1-2 gl 1,6 %-os Seaplaque agaróz); és 0,5 egység Amplitaq polimeráz (Perkin-Elmer Cetus)- A reakcióelegyet 20 gl ásványi olajjal felülrétegeztük, és a láncreakciót a fentebb leírt feltételekkel végeztük. A radioaktív izotóp beépülésének mennyiségi meghatározását Vhatman DE81 papír alkalmazásával, abszorbancia alapján végeztük [Sambrook és mtsai. (1989), ld. fentebb].
*··· * · • ·*
Fertőzési vizsgálatok
A toldalékkal megjelölt transzpozonokat hordozó egyes Salmonella exkonjugánsokat mikrotiter tálcákon, 2 % triptont, 1 % élesztőkivonatot, 0,92 V/V % glicerint, 0,5 % Na2P04-ot, 1 % KN03-ot tartalmazó tápközegben [TYGPN tápközeg; Ausubel és mtsai. (1987), ld. fentebb], 37 °C-on egy éjszakán keresztül szaporítottuk. Az egy éjszakás tenyészetek kis térfogatának friss mikrotiter tálcára történő átvitelére fém replikátort alkalmaztunk, és a tenyészeteket 37 °C-on körülbelül 0,2 ODseo érték eléréséig inkubáltuk (az optikai denzitást Titertek Multiscan mikrotitertálca-leolvasó készülék alkalmazásával mértük). Az egyes üregekből származó tenyészeteket egyesítettük, és spektrofotométer alkalmazásával meghatároztuk az OD55o értéket. A tenyészetet steril sóoldatban hozzávetőleg 5xl05 cfu/ml koncentrációra hígítottuk. Az oltóanyagban lévő telepképző egységek (cfu) számának ellenőrzése érdekében a hígított tenyészetek mintáit nalidixilsavat (100 mg/ml) és kanamicint (50 mg/ml) tartalmazó TYGPN táptalajra szélesztettük.
Három 20-25 g-os nőstény BALB/c egérből álló csoportokat intraperitoneálisan 0,2 ml baktériumszuszpenzióval (kb. lxl0s cfu/ml) fertőztünk. Az egereket a beoltás után három nappal leültük, és lépjeikét a baktériumok kinyerése érdekében kivettük.
mikrocentrifugáló csőben 1 lép felét sóoldatban
Mindegyik ml steril homogenizáltuk. A sejttörmeléket hagytuk leülepedni, és a szuszpendált sejteket tartalmazó steril sóoldat 1 ml-ét új csőbe tettük át, majd mikrocentrifugában két percig centrifugáltuk. A felülúszót leszívtuk, és az üledéket 1 ml steril desztillált vízben újraszuszpendáltuk. Steril desztillált vízben hígítássorozatot készítettünk, és az egyes hígítások 100-100 ml-ét nalidixilsavat (100 μg/ml) és kanamicint (50 gg/ml) tartalmazó TYGPN agartáptalajra szélesztettük. Az egyenként 1000-4000 telepet tartalmazó csészékről kinyertük a baktériumokat, és egy-egy lépből összesen több, mint 10000 telepet egyesítettünk, melyeket a teleplenyomatok szkrínelésére alkalmazható próbák polimeráz láncreakcióval történő szintetizálására alkalmas DNS előállítására alkalmaztunk.
Virulenciagén klónozása és DNS-szekvenálása
S. typhimurium exkonjugánsokból teljes DNS-t izoláltunk, és külön-külön Sstl-gyel, Sall-gyel, Pstl-gyel és SphI-gyel emésztettük. Az emésztményeket agarózgélen frakcionáltuk, Hybond N+ membránokra (Amersham) másoltuk, és - próbaként a pUT mini-Tn5Km2 kanamicin-rezisztencia génjének alkalmazásával - Southern hibridizációs analízisnek vetettük alá. A próbát digoxygeninnel (BoehringerMannheim) jelöltük, és a gyártó útmutatásai szerint kemilumineszcencia detektálást végeztünk. A hibridizáláshoz és mosáshoz a fentebb leírt feltételeket alkalmaztuk.
Preparatív agarózgélhez alkalmas DNS emésztésére olyan restrikciós enzimeket alkalmaztunk, amelyek 3-5 kb-os mérettartományba tartozó hibridizáló fragmensekét eredményeznek, majd a hibridizációs jelek méreteinek megfelelő DNS-fragmenseket kivágtuk a gélből, tisztítottuk és pUC18-plazmidba ligáltuk. A ligálási reakcióelegyeket E. coli DH5a törzs kanamicin-irezisztenssé történő transzformálására alkalmaztuk. A kanamicin-rezisztens transzformánsokból származó plazmidokat elutipD oszlopon átfolyatva tisztítottuk, és restrikciós enzimes emésztéssel ellenőriztük. A plazmid inszerteket a didezoxi eljárással (Sanger és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)] részlegesen szekvenáltuk, melynek során a -40 prímért és reverz prímért (United States Biochemical Corporation), illetve a Tn5 transzpozon I-terminálisához hibridizáló P6 prímért (5’-CCTAGGCGGCCAGATCTGAT-3’), illetve az O-terminálisához hibridizáló P7 prímért (5’GCACTTGTGTATAAGAGTCAG-3’) alkalmaztuk. A nukleotidszekvenciákat és a leszármaztatott aminosav-szekvenciákat Macintosh SE/30 számítógépen Macvector 3.5 szoftvercsomag alkalmazásával állítottuk össze. A szekvenciákat a Humán Genome Mapping Project Resource Centre központban (Harrow, Egyesült Királyság) UNIX/SUN számitógép-rendszer alkalmazásával összehasonlítottuk az EMBL és a Genbank DNSadatbázisaival.
DNS-toldalékok
A DNS-toldalékok szerkezetét az 1/A ábrán mutatjuk be. Mindegyik toldalék tartalmaz egy variábilis központi régiót, amelyet változatlan karok” szegélyeznek. A központi régió szekvenciáját ([NK]2o) úgy alakítottuk ki, hogy ne legyenek benne felismerési helyek az általánosan alkalmazott - hat bázispáros helyeket felismerő restrikciós enzimek számára, de kellőképpen variábilisek legyenek ahhoz, hogy azonos szekvenciák csak minden 2x1ο11 molekulában fordulhassanak elő (12 véletlenül kiválasztott toldalék DNS-szekvenálása azt mutatta, hogy a variábilis régiót tekintve egyik sem mutatott 50 %-osnál nagyobb azonosságot). A központi régió jelölésében N jelentése bármely bázis (A, G, C vagy T), K jelentése pedig G vagy T. A kiindulási klónozási lépés elősegítése érdekében a karok végeik közelében - KpnI helyeket tartalmaznak, a hibridizációs vizsgálatot megelőzően a radioaktívan jelölt variábilis régió kivágására pedig a variábilis régiót szegélyező Hindin helyeket alkalmaztuk. A karokat úgy alakítottuk ki, hogy a P2 és a P4 primer csak egy-egy guanint tartalmazzon, így az e primerek alkalmazásával folytatott polimeráz láncreakció során mindegyik újonnan szintetizált karba csak egyetlen citozin épül be, míg az egyedi szekvenciába átlagosan tíz citozin kerül. Amennyiben a polimeráz láncreakcióban radioaktív izotóppal jelölt dCTP-t alkalmazunk, az egyedi szekvenciában - az egyes karokhoz képest - átlagosan tízszer több izotóp lesz. Ez az egyedi szekvenciákról HindlII-mal végzett emésztéssel lehasított karokból származó háttér hibridizációs jelek minimális szintre történő csökkentését szolgálja. A kettős szálú toldalékokat a mini-Tn5 Km2 transzpozon (melyet a • · • · • · ·· • · 9 ···· ·· ·· pUT-plazmid [de Lorenzo és Timmis (1994), ld. fentebb] hordoz) KpnI helyére ligáltuk. E plazmid replikációja a pir gén R6K-specifikus π termékétől függ. Ez a plazmid az RP4plazmid oriT szekvenciáját - ami különböző baktériumfajokba történő bevitelt tesz lehetővé [Miller és Mekalanos: J. Bacteriol. 170, 2575 (1988)] -, valamint a miniTn5 elem transzpozíciójához szükséges tnp* gént ' tartalmazza. A toldalékkal jelölt mini-Tn5 transzpozonokat konjugációval
S. typhimurium-ba vittük be, és a transzpozíciós eseményből származó 288 exkonjugánst mikrotiter tálcák üregeiben tároltuk. 12 exkonjugánsból izolált teljes DNS-t EcoRV-tel emésztettünk, majd - próbaként a mini-Tn5 transzpozon kanamicin-rezisztencia génjének alkalmazásával - Southern hibridizációs analízist végeztünk. Az exkonjugánsok mindegyik esetben a transzpozon - baktériumgenom különböző helyére történő - beépülésének eredményeként jöttek létre (2. ábra).
Specifitási és érzékenységi vizsgálatok
Következő lépésként a DNS-toldalékok - cél-DNS-ként az exkonjugánsok egy állományba összegyűjtött DNS-einek alkalmazásával végzett - polimeráz láncreakció során bekövetkező amplifikációjának hatékonyságát és egységességét vizsgáltuk. A toldalékok egyenlőtlen amplifikációjának minimálisra csökkentésére tett egyik kísérletünkben meghatároztuk a cél-DNS 100 μΐ reakcióelegy-térfogatban alkalmazható maximális mennyiségét, illetve a PCR-ciklusok minimális számát, ami olyan termékeket eredményezett, amelyek agarózgélen etídium-bromidos festéssel láthatóvá tehetők (5 μg DNS, illetve 20 ciklus).
A stacionárius szaporodási fázist elérő S. typhimurium exkonjugánsokat mikrotiter tálcákon összekevertük, és DNS-t vontunk ki belőlük. A kivont DNS-sel - a P2 és P4 primer alkalmazásával - polimeráz láncreakciót végeztünk. A 80 bpos PCR-termékekét géltisztítottuk, és egy második polimeráz láncreakció cél-DNS-eiként alkalmaztuk. A második PCR reakcióban az előzővel megegyező primereket, de 32Pizotóppal jelölt dCTP-t alkaltnaztunk; ennek eredményeként a PCR-termékekbe a radioaktív izotóppal jelölt dCTP több, mint 60 %-a épült be. A radioaktívan jelölt termékeket HindlII-mal emésztettük, és a megfelelő mikrotiter tálcákról átmásolt DNS teleplenyomatok próbázására alkalmaztuk. Az így tesztelt 1510 mutáns közül a teleplenyomat egy éjszakás exponálása után az autoradiogramon 358 mutáns nem adott egyértelmű jelet. Erre három lehetséges magyarázat van. Először, elképzelhető, hogy a transzpozonok bizonyos hányada nem tartalmaz toldalékot, azonban a - transzpozonokat a toldalékok jelenlétében vagy hiányában tartalmazó' - ligálási reakcióelegyek alkalmazásával kapott transzformációs gyakoriság összehasonlítása alapján úgy tűnik, hogy a toldalék nélküli transzpozonok az összes transzpozon legfeljebb kb. 0,5 %-át teszik ki. Valószínűbb magyarázat az, hogy a variábilis szekvencia néhány toldalékban csonkított volt és/vagy a szekvenciák másodlagos • · · · · szerkezeteket hoztak létre; e két jelenség egyformán az amplifikáció megakadályozását eredményezi. Az egyértelmű jeleket nem adó mutánsokat egy újabb vizsgálatban tanulmányoztuk. A hatékonyan amplifikálható toldalékok specifitását úgy demonstráltuk, hogy egy mikrotiter tálca 24 telepéből próbát készítettünk, és ezt 48 telep (ezek között volt a próba előállítására alkalmazott 24 telep is) lenyomatának próbázására alkalmaztuk. A próba előállítására nem használt 24 telep esetében a hibridizációs jel hiánya (ld. 3. ábra) azt mutatja, hogy az alkalmazott hibridizációs feltételek elég szigorúak voltak a jelölt toldalékok közötti kereszt-hibridizáció megakadályozásához, és arra következtethetünk, hogy az egyes exkonjugánsok nem ismétlődnek meg egy mikrotiter tálcán belül.
Állatkísérletekben az oltóanyagban alkalmazható állomány (pool) maximális méretének meghatározása során további tényezőket is figyelembe kell venni. Mivel az egyes transzpozonok esetében a kelőit toldalék mennyisége fordítottan arányos a toldalékállomány komplexitásával, az állomány méretének van egy felső határa, amely felett a hibridizációs jelek túl gyengék ahhoz, hogy az autogram egy éjszakás exponálása után detektálhatók legyenek. Ennél is lényegesebb, hogy az állomány komplexitásának növekedésével egyre nagyobb annak valószínűsége, hogy az állomány egy virulens képviselője (amelynek a fertőzött állat lépében megfelelő mennyiségben kell lenni ahhoz, hogy elegendő jelölt próbát eredményezzen) hiányozzék. A salmonellosis egérmodellje esetében az állomány méretének felső határát nem határoztuk meg, de minden bizonnyal több, mint 96.
A transzpozon-mutánsok virulenciatesztje
BALB/c egerekben két mikrotiter tálcáról összesen 1152 egyedi toldalékot tartalmazó - inszerciós mutánst virulenciájukra teszteltünk (12 állományban, melyek mindegyike egy 96 üregű mikrotiter tálcát reprezentált). Az egereket egy mikrotiter tálca 96 transzpozon-mutánsából kb. 103-103 sejttel (összesen 105 sejttel) intraperitoneálisan oltottuk. Az injektálás után három héttel az egereket leöltük, és a baktériumok kinyerése érdekében a léphomogenátumokat laboratóriumi táptalajra szélesztettük. Egy-egy egérből kinyert kb. 10000 telepet összekevertünk, és DNS-t vontunk ki belőlük. Az így kapott DNS-mintában lévő toldalékokat polimeráz láncreakcióval amplifikáltuk és jelöltük, teleplenyomat próbázást végeztünk, és a hibridizációs mintázatot összehasonlítottuk az oltóanyagból amplifikált toldalékokkal kapott hibridizációs mintázattal (3. ábra) . Kontrollként a S. typhimurium aroA mutánsát toldalékkal láttuk el, és az oltóanyag 96 mutánsának egyikeként alkalmaztuk. E törzs esetében nem várható, hogy a lépből kinyerhető legyen, mivel virulenciája jelentős mértékben csökkentve van [Buchmeier és mtsai.: Mól. Microbiol. 7, 933 (1993)]. 41 olyan mutánst azonosítottunk, amelyek DNS-e az oltóanyagból származó jelölt toldalékokkal hibridizálódott, a lépből kinyert baktériumokból származó jelölt toldalékokkal azonban nem. A kísérletet
megismételtük, az ugyanazt a 41 mutánst azonosítottuk. Ezek közül kettő - a várakozásnak megfelelően - aroA mutáns volt (állományonként egy). Egy másik ilyen mutáns auxotróf mutáns volt, amely minimáltáptalajon nem szaporodott. Valamennyi mutáns normális telepmorfológiájú volt.
2. példa
A transzpozont szegélyező szekvenciák klónozása és részleges karakterizálása
Az 1. példában leírt mutánsok egyikéből (1. állomány, F10) DNS-t vontunk ki. A kivont DNS-t Sstl-gyel emésztettük és kanamicin-rezisztencia alapján szubklónoztuk. A transzpozon egyik végét szegélyező 450 bp szekvenciáját a P7 primer alkalmazásával határoztuk meg. Ez a szekvencia 80 %-ban azonos az E. coli - hőszabályozott proteázt kódoló clp (Ion) génjének szekvenciájával (5. ábra). Ismereteink szerint ezt a gént korábban nem tekintették virulenciadeterminánsnak.
A 6. ábrán 13 további Salmonella typhimurium virulenciagén részleges szekvenciáját mutatjuk be (A2-A9, és B1-B5). A P2D6, S4C3, P3F4, P7G2 és P9B7 leszármaztatott aminosav-szekvenciák olyan szekrécióval kapcsolatos proteinekkel mutatnak hasonlóságot, amelyek állatok és növények patogén baktériumaiban konzerváltak, és amelyek Salmonella-ban inv családként ismeretesek. S. typhimurium-ban az inv gének a baktériumok bélszövetbe történő behatolásához szükségesek. Az inv mutánsok virulenciája orális beadás esetén csökken, intraperitoneális beadás esetén azonban nem. Az intraperitoneális oltás után a virulencia fennmaradásához szükséges inv-rokon gének felismerése olyan új szekréciós apparátus létezésére utal, amely a lép és egyéb szervek nem fagocitáló sejtjeinek megtámadásához szükséges. Az ilyen új gének termékei a kialakult fertőzések kezelése céljából jobb gyógyszer-célpontot képviselnek.
Az e példában azonosított gének további karakterizálását a 4. példában ismertetjük.
3. példa
LDS0-meghatározások és egérvakcinálási vizsgálatok
A találmány szerinti eljárással azonosított mutációk csökkentik a patogén mikroorganizmusok virulenciáját.
Korábban virulenciával összefüggésben nem említett génmutációk közül ötöt P22-közvetítette transzdukcióval a nalidixilsavra érzékeny S. typhimurium 12028 szülői törzsbe vittünk be. A transzduktánsokat restrikciós térképezéssel ellenőriztük, majd intraperitoneálisan BALB/c egerekbe injektáltuk, hogy meghatározzuk az 50 %-os letális dózist (LD5o) . Az S4C3, P7G2, P3F4 és P9B7 mutánsok LD50 értéke több nagyságrenddel nagyobb volt, mint a vad típusú törzsé. A P1F10 mutáns esetében az LD5o értékben nem mutattunk ki különbséget, azonban e törzs és a vad típusú törzs azonos mennyiségét tartalmazó oltóanyaggal beoltott egerek lépéből kinyert P1F10 sejtek aránya statisztikailag szignifikáns mértékben csökkent. Ez arra utal, hogy ez a mutáció • · csökkenti a virulenciát, de olyan mértékben, amely LD50 érték alapján nem mutatható ki.
A P3F4 és P9B7 mutánst 107 sejt/egér mennyiségben szájon át is beadtuk az egereknek. Egyik egér sem betegedett meg, ami azt jelzi, hogy e mutánsok orális LDso értékei legalább egy nagyságrenddel nagyobbak, mint a vad típusú törzsé.
Az egérvakcinálási vizsgálatban öt 20-25 grammos, nőstény BALB/c egérből álló csoportokat először szájon keresztül (p.o.), majd intraperitoneálisan (i.p.) a Salmonella typhimurium P3F4 és P9B7 mutáns törzsek tízszeres sorozathígításaival fertőztük. Négy hét elteltével az egereket a szülői vad típusú törzs 500 telepképző egységével (cfu) oltottuk be. Az elhullások számát négy héten keresztül regisztráltuk.
A mutáns törzzsel oltott egerekkel azonos korú és származású két egeret pozitív kontrollként a vad típusú törzs 500 telepképző egységével (cfu) intraperitoneálisan oltottuk be. A várakozásnak megfelelően négy héten belül mindkét immunizálatlan egér elpusztult.
Az eredményeket az alábbiakban foglaljuk össze:
1) P3F4 mutáns törzzsel végzett kezdeti p.o. immunizálás
Kiindulási oltóanyag (cfu) Az első immunpróbát túlélő egerek száma A vad típusú törzzsel végzett immunpróbát túlélő egerek száma
5 x 109 5 2 (40 %)
5 x 108 5 2 (40 t)
5 x 107 5 0 (0 %)
2) P3F4 mutáns törzzsel végzett kezdeti i.p. immunizálás
Kiindulási oltóanyag (cfu) Az első immunpróbát túlélő egerek száma A vad típusú törzzsel végzett immunpróbát túlélő egerek száma
5 x 106 3 3 (100 %)
5 x 105 5 2 (80 %)
5 x 104 6 5 (83 %)
5 x 103 5 4 (80 %)
3) P9B7 mutáns törzzsel végzett kezdeti p.o. immunizálás
Kiindulási oltóanyag (cfu) Az első immunpróbát túlélő egerek száma A vad típusú törzzsel végzett immunpróbát túlélő egerek száma
5 x 109 5 0 (0 1)
4) P9B7 mutáns törzzsel végzett kezdeti i.p. immunizálás
Kiindulási oltóanyag (cfu) Az első immunpróbát túlélő egerek száma A vad típusú törzzsel végzett immunpróbát túlélő egerek száma
5 x 106 4 2 (50 S)
A fenti kísérleti eredményekből azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a P3P4 mutáns törzs a vad típusú törzzsel végzett fertőzéssel szemben bizonyos védelmet nyújt. Ez a védelem az intraperitoneálisan immunizált egerek esetében nagyobb.
4. példa
Egy második III. típusú szekréciós rendszert kódoló virulencialokusz azonosítása salmonella typh±nuxium-ban
Az e példában alkalmazott rövidítések jelentése a következő: VGC1 - 1. virulenciagén-cluster; VGC2 - 2. virulenciagén-cluster.
A Salmonella typhimurium emberekben a gyomor-bélhurut fő kórokozója, egerekben pedig olyan szisztémás betegséget okoz, ami az emberi hastífusz jó modelljeként szolgál [Carter és Collins; . ű. Exp. Med. 139, 1189 (1974)]. Egerekben a S. typhimurium orális beadása után a baktériumok a vékonybél üregéből - enterociták vagy a Peyer-plakk tüszők M-sejtjei közvetítésével - a bélnyálkahártyába vándorolnak [Takeuchi: Am. 3. Pathol. 50, 109 (1967)]. A baktériumok ezután behatolnak a makrofágokba és a neutrocitákba, elérik a retikuloendoteliális rendszert, és más szervekbe (köztük a lépbe és májba) is szétszóródnak, ahol további szaporodásuk halálos kimenetelű bakteriémiát eredményez [Finlay, B.B.: Curr. Top. Microbiol. Immunoi. 192, 163 (1994)]. A gazdasejtek megtámadására, a különböző, fiziológiailag megterhelő intraeelluláris és extracelluláris környezetekben történő életbenmaradásra és szaporodásra, valamint az immunrendszer specifikus antibakteriális aktivitásainak kikerülésére a S. typhimurium a virulenciafaktorok kifinomult választékát alkalmazza [Groisman és Ochman: Trends Microbiol. 2, 289 (1994)].
- 77 A S. typhimurium és egyéb patogének virulenciamechanizmusának szélesebb körű megismerésére ad lehetőséget az 1. példában leirt transzpozon-mutagenezis rendszer, melyet signature-tagged mutagenesis-nek (STM; jelölt toldalék-DNS-sel végzett mutagenezis) nevezünk, és amelyben a mutációs analízis előnye azzal van kombinálva, hogy egyetlen állatban egyidejűleg nagyszámú különböző mutáns sorsa követhető nyomon [Hensel és mtsai.: Science 269, 400 (1995); valamint 1. példa; Hensel és mtsai. leírását találmányunk elsőbbségi dátuma után publikálták]. Ezzel a módszerrel összesen1 1152 vizsgált mutáns közül 43 csökkentett virulenciájú mutánst azonosítottunk. E mutánsok közül ötben a transzpozonok inszerciós pontjait szegélyező DNS nukleotidszekvenciái különböző patogén baktériumok III. típusú szekréciós rendszerét kódoló génekkel mutattak rokonságot [Salmond és Reeves: Trends Biochem. Sci. 18, 7 (1993); Van Gijsegem és mtsai.: Trends Microbiol. 1, 175 (1993)]. A S. typhimurium inv/spa génclusterének [Gálán és Curtiss: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6383 (1989); Groisman és Ochman: EMBO J. 12, 3779 (1993)] termékeit az epithelsejtekbe történő behatolást közvetítő felületi függelékek összeállításához szükséges III. típusú szekréciós rendszert alkotó proteinek képezik [Ginocchio és mtsai.: Cell 76, 717 (1994)]. Ilyenformán, az inv/spa clusterben mutációkat hordozó törzsek virulenciája csak akkor csökken, ha az oltóanyagot szájon keresztül, és nem intraperitoneálisan adjuk be [Gálán és Curtiss: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6383 (1989)]. Ezzel szemben, az STM
- 78 eljárással azonosított őt mutáns intraperitoneális beoltás után avirulens volt [Hensel és mtsai.: Science 269, 400 (1995)].
Ebben a példában bemutatjuk, hogy a szóban forgó öt mutáns, valamint további 11, STM eljárással azonosított mutáns transzpozon-inszerciós pontjai a S. typhimurium kromoszómájának ugyanazon régiójában lokalizálhatók. E régió további vizsgálata olyan újabb géneket tár fel, amelyek leszármaztatott termékei szekvencia-homológiát mutatnak a III. típusú szekréciós rendszer egyéb komponenseivel. Az általunk 2. virulenciagén-clusternek (VGC2) nevezett kromoszómális régió számos egyéb bélbaktériumban nem található meg, és a S. typhimurium virulenciájának lényeges lokuszát reprezentálja.
Az alkalmazott baktériumtörzsek és szaporító tápkőzegek;
transzdukció
Az 5791-es {aberdeen}, 423180-as {gallinarum), 7101-es (cubana) és 12416-os {typhimurium LT2) Salmonella entericum szerotípusokat a National Collections of Type Cultures gyűjteménytől (Public Health Laboratory Service, Egyesült Királyság) kaptuk. A Salmonella typhi BRD123 törzs genomiális DNS-ét G. Dougan-tól kaptuk. Enteropatogén Escherichia coli-t (EPEC), bélvérzést előidéző E. coli-t (EHEC), Vibrio cholerae El Tor biotípust, Shigella flexneri
2. szerotípust és Staphylococcus aureus-t klinikai izolátumként a Royal Postgraduate Medical School (Egyesült
Királyság) Department of Infectious Diseases and Bacteriology osztályától kaptuk. A Yersinia pestis genomiális DNS-ét □ . Heesemann-tól kaptuk, azonban ez hagyományos eljárások alkalmazásával izolálható. A S. typhimurium NCTC 12023-as törzs jelölt toldalékkal ellátott mini-Tn5 transzpozont hordozó mutánsainak előállítására alkalmazott baktériumtörzseket és eljárásokat korábban leírták [Hensel és mtsai.: Science 269, 400 (1995); de Lorenzo és Timmis; Methods Enzymol. 264, 386 (1994)]. A plazmidok rutinszerű szaporítását E. coli DH5a törzsben végeztük. A baktériumokat megfelelő antibiotikumokkal kiegészített LB-táplevesben [Davis és mtsai.: Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1980)] szaporítottuk. Az egyes mutáns törzsek virulenciaszintjének értékelése előtt a mutációkat P22-fág közvetítette transzdukeióval [Davis és mtsai. (1980), ld. fentebb] a nalidixilsavra érzékeny szülői S. typhimurium 12023-as törzsbe vittük. Az oltóanyagként történő felhasználás előtt a transzduktánsokat restrikciós emésztéssel és Southern hibridizációs analízissel vizsgáltuk.
Lambda-fág könyvtár szkrinelése
A VGC2-t átívelő, egymással átfedő DNS-inszerteket tartalmazó λ-kiónokat - a S. typhimurium LT2 törzs genomiális DNS-ének részleges Sau3A emésztésével kapott inszertjeit tartalmazó - X1059 könyvtárból [Maurer és • · mtsai.: Genetics 108, 1 (1984)] standard eljárások alkalmazásával [Ausubel és mtsai.: Current Protocols in Molecular Biology, 4. kötet, John Viley and Sons, Inc., New York (1987)] kaptuk. A könyvtárat K. Sanderson révén a Salmonella Genetic Stock Centre központtól (SGSC; Calgary, Kanada) kaptuk.
Mud-P22 lizogének
A S. typhimuriuia genom ismert helyein Mud-P22 profágokat tartalmazó S. typhimurium törzsek sorozatának lizátumaiból készített DNS-t hordozó Hybond N filterekhez (Amersham) radioaktív izotóppal jelölt * DNS-próbákat hibridizáltattunk. A mitomicinnel indukált Mud-P22 lizátumokat ismert eljárással állítottuk elő [Davis és mtsai.: Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1980); Youderain és mtsai.: Genetics 118, 581 (1988)]. Az Mud-P22 profágok sorozatát (melyet az SGSC-től kaptunk) eredetileg Bensőn és Goldman állította össze [J. Bacteriol. 174, 1673 (1992)].
Gélelektroforézis és Southern-hibridizáció
A gélelektroforézist 0,5 x TBE pufferben 1 %-os vagy 0,6 %-os agarózgéleken végeztük. A gélen frakcionált DNS-t Hybond N vagy N+ membránokra (Amersham) másoltuk. A szigorú feltételek mellett végzett hibridizációt és mosást [ami legfeljebb 10 % arányú hibás bázispárosodással (mismatch) • ·
- 81 teszi lehetővé a nukleotidszekvenciák hibridizálódását] Holdén és mtsai. [EMBO J. 13, 1927 (1989)] leírása szerint hajtottuk végre. A nem szigorú feltételek mellett végzett hibridizáció esetén (ami 50 %-ban hibás bázispárosodású szekvenciák hibridizációját is lehetővé teszi) a filtereket 42 °C-on egy éjszakán át 10 % formamidot, 0,25 M Na2HP04-ot és 7 % SDS-t tartalmazó elegyben hibridizáltattuk, és a legszigorúbb feltételekkel végzett lépést 42 °C-on 20 mM Na2HPO4 és 1 % SDS elegyében hajtottuk végre. A próbaként alkalmazott DNS-fragmenseket a Radprime rendszer (GibcoBRL) alkalmazásával [32P]dCTP-vel vagy [digoxigeninll]dITP-vel jelöltük, és a Digoxigenin-rendszer (Boehringer Mannheim) alkalmazásával detektáltuk, a gyártó útmutatásai szerint, azzal a különbséggel, hogy a hibridizációt a radioaktív izotóppal jelölt próbákhoz alkalmazottal azonos oldatban végeztük. A Southern-hibridizációhoz alkalmazható genomiális DNS-t Ausubel és mtsai. leírása szerint (ld. fentebb) állítottuk elő.
Molekuláris klónozás és nukleotid-szekvenálás
A restrikciós endonukleázokat és a T4-DNS-ligázt a Gibco-BRL-től kaptuk. Az általános molekuláris biológiai technikák leírását ld. Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989). A nukleotid-szekvenálást a didezoxi láncterminációs eljárással [Sanger és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA
74, 5463 (1977)], Τ7 szekvenáló reagenskészlet (Pharmacia) alkalmazásával végeztük. A szekvenciákat MacVector 3.5 szoftver vagy AssemblyLIGN programcsomag alkalmazásával állítottuk össze. A nukleotidszekvenciákat és a belőlük leszármaztatott aminosav-szekvenciákat a Humán Genome Mapping Project Resource Centre (Hinxton, Egyesült Királyság) hálózatán keresztül a Visconsin Egyetem GCG csomagjának BLAST ós FASTA programjának (version 8) alkalmazásával az European Molecular Biology Laboratory (EMBL) és a SwissProt adatbázisaival hasonlítottuk össze.
Virulenciateszte k öt 20-25 grammos nőstény BALB/c egérből álló csoportokat fiziológiai sóoldatban szuszpendált baktériumok tízszeres hígításaival orálisan (p.o.) vagy intraperitoneálisan (i.p.) fertőztünk. Az oltóanyag előállításához a baktériumokat rázatás mellett 37 °C-on LB-táplevesben szaporítottuk, majd friss tápközegbe áthelyezve 0,4-0,6-es ODsgo érték eléréséig inkubáltuk. Az 5xl08 cfu/ml vagy nagyobb sejtsűrűség elérése érdekében a tenyészeteket centrifugálással besűrítettük, majd sóoldatban újraszuszpendáltuk. A cfu/ml-ben mért koncentrációt úgy ellenőriztük, hogy az oltóanyag sorozathígításait LB agarlemezekre szélesztettük. Az egereket intraperitoneálisan, illetve gyomorszondán át orálisan 0,2 ml oltóanyaggal oltottuk be. Az LDSo értékeket 28 nap elteltével Reed és Meunch eljárásával [Am. J. Hyg. 27,
493 (1938)] számítottuk ki.
A transzpozon-inszerciók lokalizálása
A Salmonella typhimurium mini-Tn5 transzpozon-mutánsok bankjának előállítási eljárása, és a 43 csökkentett virulenciát mutató mutáns szkrínelése korábbi leírásban megtalálható [Hensel és mtsai.: Science 269, 400 (1995)]. A transzpozonokat és a szegélyező DNS-régiókat kanamicinrezisztenciára végzett szelekcióval vagy reverz polimeráz láncreakcióval' exkonjugánsokból klónoztuk. A transzpozonokat szegélyező DNS-ek 300-600 bp-os nukleotidszekvenciákat 33 mutáns esetében izoláltuk. E szekvenciák DNS- és protein-adatbázisokban található szekvenciákkal történő összehasonlítása azt mutatta, hogy 14 mutáns korábban ismert virulenciagénbe történő transzpozon-inszerció révén; hét mutáns a bélbaktériumok ismert génjeihez hasonló új génekbe történő inszerció eredményeként; 12 mutáns pedig a DNS- és protein-adatbázisok szekvenciáival hasonlóságot nem mutató szekvenciákba történő inszerció eredményeként keletkezett [Hensel és mtsai.: Science 269, 400 (1995); valamint 1. és 4. példa].
Három különböző bizonyíték utal arra, hogy a 19 új szekvenciákba történt transzpozon-inszerció közül 16 a genom három (eredetileg A, B és C jelzésű) régiójában csoportosul. Először; a transzpozon-inszerciós pontokat szegélyező régiók nukleotidszekvenciáinak egymással és az adatbázisok szekvenciáival történő összehasonlítása azt ···· · ···· mutatta, hogy néhány szekvencia egymással átfedő volt, vagy nagymértékben hasonló volt ugyanazon gén más régióihoz. Másodszor; a több restrikciós enzimmel emésztett és a transzpozon-inszerciós pontokat szegélyező restrikciós fragmensekkel próbázott genomiális DNS Southern-analízise azt mutatta, hogy néhány transzpozon-inszerció ugyanazon a restrikciós fragmensen lokalizálódott. ' Harmadszor; ha ugyanezeket a DNS-próbákat S. typhimurium lambda-fág DNSkönyvtárból származó plakkokkal hibridizáltattuk, az előző két lépésben kapcsoltnak bizonyult mutánsokból származó próbák ugyanahhoz a λ-DNS-kiónokhoz hibridizálódtak. Ilyenformán, két mutáns (P9B7 és P12F5) az A cluster-be, öt mutánst (P2D6, P9B6, P11C3, P11D10 és P11H10) a B clusterbe, kilenc mutánst (P3F4, P4F8, P7A3, P7B8, P7G2, P8G12, P9G4, P10E11 és P11B9) pedig a C cluster-be soroltunk (8. ábra).
E három cluster-ből származó DNS-próbák - bezárt MudP22 profágokat hordozó - S. typhimuriun törzsek [Youderain és mtsai.: Genetics 118, 581 (1988); Bensőn és mtsai.: J. Bacteriol. 174, 1673 (1992)] sorozatából származó lizátumokkal végzett hibridizációjának eredményei ezt mutatták, hogy a három lokusz a 30. perctől a 31. percig terjedő régióban helyezkedett el [Reed és Muench: Am. 3. Hyg. 27, 493 (1938)] (ld. 7. ábra), ami azt jelzi, hogy a három lokusz szorosan kapcsolt, vagy egy nagy virulencia-lokuszt alkot. Annak meghatározása érdekében, hogy az A, B és C cluster-t átfogó λ-klónok valamelyike tartalmaz-e átfedő DNS-inszerteket, az egyes kiónok terminális régióiból
- 85 származó DNS-fragmenseket más λ-kiónok Southern-hibridizációs analízisében próbaként alkalmaztuk. A hibridizálódó DNS-fragmensek azt mutatták, hogy több λ-klón átfedő volt, és az A, B és C cluster egy összefüggő régiót alkot (8. ábra). Az e régió végeiről származó DNS-fragmenseket - a szomszédos régiókat reprezentáló inszerteket tartalmazó további kiónok azonosítása céljából . - a λ-könyvtár próbázására alkalmaztuk. Egy olyan λ-kiónt sem azonosítottunk, amely lefedte volna a lokusz jobb oldali végét, így ezt a régiót a TT15244 Mud-P22 profág törzs [Bensőn és Goldman: J. Bacteriol. 174, 1673 (1992)] lizátumából származó 6,5 kb-os EcoRI/Xbal fragmensének klónozásával kaptuk.
E lokusz fizikai térképének előállítása céljából restrikciós térképezést és Southern-hibridizációs analízist végeztünk (8. ábra). E lokusz és - a 63. percnél lokalizált - részletesen karakterizált inv/spa géncluster [Sanderson és mtsai.: Microbiol. Rév. 59, 241 (1995); Gálán és Curtiss: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6383 (1989):
Groisman és Ocman: EMBO J. 12, 3779 (1993); Gálán és mtsai.: J. Bacteriol. 174, 4338 (1992); Ginocchio és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5976 (1992);
Eichelberg és mtsai.: □. Bacteriol. 176, 4501 (1994);
Collazo és mtsai.: Mól. Microbiol. 15, 25 (1995)] (melyet
1. virulencia-géncluster-nek (VGC1) nevezünk) megkülönböztetése érdekében az új lokuszt 2. virulencia-géncluster-nek (VGC2) neveztük el. A 8. ábrán két olyan DNS-részlet elhelyezkedését mutatjuk be, amelyek nukleotidszekvenciáját • · ·· meghatároztuk (1. és 2. szekvencia). A nukleotidszekvenciákat a 11. és 12. ábrán mutatjuk be.
A VGC2 határoló szekvenciáinak térképezése a S. typhimurium kromoszómán
A VGC2 bal oldalán lévő 7. λ-klón nukleotid-szekvenálásával olyan nyitott levolasási keretet (ORF) azonosítottunk, amelynek leszármaztatott aminosavszekvenciája 90 %-nál nagyobb arányban azonos az E. coli ydhE+ génje egyik szegmensének leszármaztatott termékével. A VGC2 jobb oldalán lévő 6,5 kb-os klónozott EcoRI/Xbalfragmens szekvenálásával olyan nyitott leolvasási azonosítottunk, amelynek leszármaztatott aminosavszekvenciája 90 %-nál nagyobb arányban azonos az E. coli pykF gén által kódolt - piruvát-kináz-I enzimének szekvenciájával [Ohara és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6883 (1989)]. Az E. coli kromoszómáján az ydhE és pykF gének a 37. és 38. perc között, egymáshoz közel helyezkednek el [Bachman: Micro. Rév. 54, 130 (1990)]. A
VGC2 teljes hosszában elhelyezkedő 11 nem átfedő DNSfragmenst próbaként alkalmaztunk az E. coli és S. typhimurium - enyhe feltételek mellett végzett - Southernhibridizációs analízisében. A hibridizálódó DNS-fragmensek alapján megállapítottuk, hogy egy hozzávetőleg 40 kb-os VGC2-t tartalmazó - régió hiányzott az E. coli genomból, és a VGC2 határait 1 kb-os szakaszon belülre lokalizáltuk (9. ábra). A VGC2 jobb oldali végéhez közeli Xbal hely (8.
- 87 ábra) elhelyezkedését a kromoszóma [Sanderson és mtsai.: Microbiol. Rév. 59, 241 (1995)] 30. percnél lévő régióján lévő ismert Xbal helyek térképével [Liu és mtsai.: J. Bacteriol. 175, 4104 (1993)] végzett összehasonlítás alapján a VGC2 térképi elhelyezkedését a 30,7 percnél lokalizáltuk.
A VGC2 szerkezete
A VGC2 részleteinek nukleotid-szekvenálásával 19 nyitott leolvasás keret (ORF) jelenlétét azonosítottuk (8. ábra). A VGC2-n belüli hozzávetőleg 26 kb-os nukleotidszekvencia G+C tartalma 44,6 %, míg a VGC1 G+C tartalma 47 % [Groisman és Ochman: EMBO J. 12, 3779 (1993)], a teljes
Salmonella genomé pedig - becslések szerint - 51-53 % [Fasman: CRC Handbook of Biochemistry and Molecular Biology CRC Press, Cleveland (1976)].
Az 1-11. nyitott leolvasási keretek komplett leszármaztatott aminosav-szekvenciái hasonlóak . a III. tipusú szekréciós rendszer proteinjeinek aminosavszekvenciáihoz [Salmond és Reeves: Trends Biochem. Sci. 18, 7 (1993); Van Gijsegem és mtsai.: Trends Microbiol. 1, 175 (1993)], melyekről ismert, hogy számos növény- és állatpatogén baktériumban a virulenciadeterminánsok exportjához szükségesek [Van Gijsegem és mtsai.: Trends Microbiol. 1, 175 (1993)]. Az 1-8. nyitott leolvasási keretek (ld. 8. ábra) leszármaztatott proteinjei organizációjukat és szekvenciájukat tekintve - hasonlóak a ·· · · i ·» • · ·· ··· 9 · • 9 ··«<·· • · 9 ···» 9 » ···· 999 999 9 99
- 88 Yersinia pseudotuberculosis yscN-U génjeinek termékeihez [Bergman és mtsai.: J. Bacteriol. 176, 2619 (1994)] a salmonella typhimurium VGCl-cluster-ében az inv/spa cluster invC/spaS génjeinek termékeihez [Gálán és Curtiss: Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86, 6383 (1989); Groisman és Ochman:
EMBO ű. 12, 3779 (1993)] és a Shigella flexneri spa/mxi cluster-ének spa47/spa40 génjeinek termékeihez [Andrews és Maurelli: Infect. Immun. 60, 3287 (1992); Allaoui és mtsai.: Mól. Microbiol. 7, 59 (1993); Venkatesan és mtsai.:
J. Bacteriol. 174, 1990 (1992); Sasakawa és mtsai.: J.
Bacteriol. 175, 2334 (1993)]. Például, a 3. nyitott leolvasási keret (8. ábra) leszármaztatott aminosavszekvenciája 50%-ban azonos a Yersinia pseudotuberculosis yscS géntermékével [Bergman és mtsai.: □. Bacteriol. 176,
2619 (1994)], 34 %-ban azonos a S: flexneri Spa9 géntermékével [Sasakawa és mtsai. (1993), ld. fentebb], és 37 %-ban azonos a S. typhimurium VGCl-cluster-ének SpaQ géntermékével [Groisman és Ochman: EMBO J. 12, 3779 (1993)]. A 9. nyitott leolvasási keret leszármaztatott protein-terméke közeli rokonságban áll az LcrD proteincsaláddal; szekvenciája a Y. enterocolitica LcrD proteinjével [Piano és mtsai.: J. Bacteriol. 173, 7293 (1991)] 43 %-os, a S. flexneri MxiA proteinjével [Andrews és Maurelli: Infect. Immun. 60, 3287 (1992)] 39 %-os a VGCl InvA proteinjével [Gálán és mtsai.: J. Bacteriol. 174, 4338 (1992)] pedig 40 %-os szekvenciaazonosságot mutat. A 8. ábrán látható többi nyitott leolvasási keret részleges nukleotidszekvenciái alapján megállapítható, hogy a 10.
·« • · e
• ' ···· nyitott leolvasási keretből leszármaztatott protein legjobban a Y. enterocolitica YscJ proteinjéhez [Michielis és mtsai.: J. Bacteriol. 173, 4994 (1991)] hasonlít (amely a külső bakteriális membránban elhelyezkedő lipoprotein). A
11. nyitott leolvasási keret leszármaztatott proteinje hasonló a S. typhimurium InvG proteinjéhez, amely a transzlokázok PulD családjának tagja [Kániga és mtsai.: Mól. Microbiol. 13, 555 (1994)]. A 12. és 13. nyitott leolvasási keret nagymértékben hasonló számos kétkomponensű szabályozórendszert tartalmazó - protein szenzor, illetve regulátor alegységéhez [Ronson és mtsai.: Cell 49, 579 (1987)]. A 9. ORF és 10. ORF, a 10. ORF és 11. ORF, illetve a 19. ORF és a VGC2 jobb oldali vége között bőséges kódoló kapacitás áll rendelkezésre további gének számára.
A VGC2 a Salmonella nemzetségben konzervált, és Salmonella fajokra specifikus
A Salmonella szerológiai változatokból és más patogén baktériumokból származó genomiális DNS Southernhbiridizációs analízisében (10/A ábra) próbaként a VGC2 középpontjában elhelyezkedő (DNS- és protein-adatbázisok szekvenciáival hasonlóságot nem mutató) 2,2 kb-os Pstl/HindlII fragmenst (B próba, 8. ábra) alkalmaztuk. Az enyhe feltételek mellett hibridizálódó DNS-fragmensek alapján megállapítható, hogy a VGC2 megtalálható a S. aberdeen-ben, a S. gallinarum-bán, a S. cubana-ban, a S.
• · typhi-ben; az EPEC-ben, EHEC-ben, Y. pestis-ben, S. flexneri-ben, V. cholera-bax\ és S. aureus-ban azonban nem. Ennek megfelelően, a VGC2 a Salmonella fajokban konzervált, és valószínűleg specifikus e baktériumokra. Annak meghatározása érdekében, hogy a lokusz szerveződése konzervált-e a tesztelt Salmonella szerológiai változatok között, két másik restrikciós endonukleázzal emésztett genomiális DNS-sel szigorú feltételek mellett Southernhibridizációs analízist végeztünk. A hibridizálódó DNSfragmensek alapján megállapítottuk, hogy a S. typhimurium LT2, illetve a S. gallinarum, S. cubana és S. typhi restrikciós helyeinek elrendeződésében némi heterogenitás tapasztalható (10/B ábra). Ezen túlmenően, a S. gallinarum és a S. typhi a többi vizsgált Salmonella esetében jelenlevőkön kivül további hibridizálódó fragmenseket is tartalmaz, ami arra utal, hogy a VGC2 régiói ezekben a fajokban megkettőződtek.
Egerekben a virulencia kialakulásához szükség van a VGC2-re
Korábbi kísérletek eredményei azt mutatják, hogy a P3F4, P7G2, P9B7 és P11C3 transzpozon-mutánsok i.p. oltása esetében az LD50 értékek legalább 100-szor nagyobbak voltak, mint a vad típusú törzs LD50 értékei [Hensel és mtsai.: Science 269, 400 (1995)]. A VGC2 fertőzési folyamatban betöltött szerepének tisztázása érdekében a P3F4 és P9B7 mutáns p.o. és i.p. LD50 értékeit (ld. 1. táblázat). Az eredeti (szülői) törzshöz képest mindkét
• · · · mutáns legalább öt nagyságrendű virulenciacsökkenést mutatott (mindkét oltási mód esetében). A virulencia ilyen nagymértékű csökkenése azt bizonyítja, hogy BALB/c egerekben a VGC2 a fertőzési folyamat azon eseményeihez szükséges, amelyek a baktériumok epithelsejtekbe történő behatolása után következnek.
1. táblázat
S. tTphinaxian törzsek LD50 értékei
Törzs L1D50 (cfu)
i.p. p.o.
12023 (vad típus) 4,2 6,2 x 10*
P3F4 1,5 x 106 >5 x 109
P9B7 >1,5 x 106 >5 x 10®
Jelölt toldalékkal ellátott transzpozonokat hordozó (csökkentett virulenciájú) mutánsok csoportjának inszerciós pontjainak térképezésével S. typhimurium-ban egy korábban ismeretlen, hozzávetőleg 40 kb-os virulencialokuszt azonosítottunk, amely a kromoszóma 30,7 percénél helyezkedik el [Hensel és mtsai.: Science 269, 400 (1995)]. Ezt a lokuszt 2. virulenciagén-cluster-nek (VGC2) neveztük el, megkülönböztetésül a 63. percnél lévő inv/spa virulenciagénektől [Sanderson és mtsai.: Microbiol. Rév. 59, 241 (1995)], melyek elnevezésére az 1. virulenciagén-clustert (VGC1) javasoljuk. A VGC1 és VGC2 egyaránt III. típusú szekréciós rendszerek komponenseit kódolják, azonban ezek a • · szekréciós rendszerek funkcionálisan különbözők.
Az új génekbe [Sanderson és mtsai. (1995), ld. fentebb; illetve 4. példa] történő inszerciók eredményeként kapott 19 mutáns közül 16-ot a kromoszóma ugyanazon régióján lokalizáltunk. Valószínű, hogy a mini-Tn5inszerciók elsősorban a VGC2-ben fordulnak elő. Más lehetőség szerint, mivel a csökkent virul'enciájú mutánsok azonosítására alkalmazott negatív szelekciót nagyon szigorú feltételek mellett végeztük (amit a VGC2 mutánsok nagy LDso értékei tükröznek), lehetséges, hogy a korábban ismeretlen gének közül csak a VGC2 lokusz génjeinek mutációi eredményeznek olyan mértékű virulenciacsökkenést, amely elégséges ahhoz, hogy a szkrínelés során ki lehessen választani. A S. typhimurium virulencia-determinánsainak sikertelen azonosítása abból eredhet, hogy a kutatók a fertőzési állatmodellekkel szemben a sejttenyészeti vizsgálatokat részesítik előnyben. Egy korábbi - a S. typhimurium LT2 kromoszómáján a Salmonella fajokra egyedülállóan jellemző régiókat azonosító - vizsgálat az egyik ilyen régiót (RF333) a 30,5 és 32. perc között lokalizálta. Ennek megfelelően, az RF333 a VGC2-nek felelhet meg, bár nem volt ismert, hogy az RF333 virulenciadeterminánsként szerepet játszott-e.
A Yersinia és Shigella virulenciaplazmidok által kódolt III. típusú szekréciós rendszerekkel, illetve a Salmonella VGC1 lokuszával végzett összehasonlítás azt mutatja, hogy a VGC2 a szekréciós apparátus alapvető strukturális komponenseit kódolja. Ezenfelül, a VGC2-ben az • · · ·
1-8. nyitott leolvasási keretek sorrendje azonos a Yersinia és Shigella homológ lokuszainak, valamint a S. typhimurium VGC1 lokuszának génsorrendjével. Az a tény, hogy a VGC2 szekréciós rendszer szerveződése és szerkezete nem áll közelebbi rokonságban a VGCl-gyel, mint a Yersinia megfelelő génjeivel, valamint a VGC2 kis G+C tartalma arra enged következtetni, hogy a VGC2 - hasonlóan a VGCl-hez [Groisman és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1033 (1993); Altmeyer és mtsai.: Mól. Microbiol. 7, 89 (1993); Li és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7252 (1995)] horizontális öröklődés útján kerül a S. typhímurium-ba. A
12. és 13. nyitott leolvasási keret által kódolt proteinek igen hasonlóak a kétkomponensű bakteriális regulátorokhoz [Ronson és mtsai.: Cell 49, 579 (1987)], és képesek az 111. nyitott leolvasási keretek és/vagy e rendszer szekretált proteinjeinek vezérlésére.
A VGC1 sok génjéről bebizonyosodott, hogy lényeges szerepet játszanak a S. typhimurium epithelsejtekbe történő behatolásában. Ez a folyamat bakteriális kontaktust igényel [Takeuchi és Collins: J. Exp. Med. 139, 1189 (1974)], és a citoszkeleton átrendeződését eredményezi, ami lokalizált membrángyűrődéseket okoz [Finlay és Rauchkowski: J. Cell Sci. 99, 283 (1991); Francis és mtsai.: Mól. Microbiol. 6, 3077 (1992)]. A VGCl-nek a fertőzés e stádiumára korlátozódó szerepét a VGC1 mutánsokkal szájon át kezelt BALB/c egerekben a baktérium virulenciájának hozzávetőleg 50-szeres csökkenése, illetve az a tény mutatja, hogy a VGC1 mutánsok intraperitoneális beadás esetén nem veszítik • · ······ ···· ··· ··· · · ·
- 94 el virulenciájukat [Gálán és Curtiss: Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 86, 6383 (1989)]. Ez utóbbi megfigyelés magyarázatot ad arra is, hogy szkríneléstlnkkel miért nem kaptunk VGC1 mutánsokat [Hensel és mtsai.: Science 269, 400 (1995)]. Ezzel ellentétben, a VGC2 mutánsok virulenciája mind a p.o., mint az i.p. oltás után jelentős mértékben csökkent. Ez azt mutatja, hogy egerekben á VGC2 - a VGC1gyel ellentétben - a virulencia szempontjából az epithelsejtekbe történő behatolás után szükséges, azonban ez nem zárja ki a VGC1 e korai fertőzési stádiumban betöltött szerepét.
összegzésül; a 16 - jelölt toldalékkal ellátott transzpozont hordozó - mutáns inszerciós pontjainak Salmonella typhimurium kromoszómán végzett térképezésével a 30,7 percnél egy 4 kb-os virulenciagén-cluster-t azonosítottunk. Ez a lokusz valamennyi vizsgálat Salmonella fajban konzervált, de más különböző patogén baktériumokban, illetve az E. coli K12 törzsben nincs jelen. E lokusz egy részletének nukleotid-szekvenálásával 11 nyitott leolvasási keretet azonosítottunk, melyek a III. típusú szekréciós rendszer komponenseit képező proteineket kódolnak. E szekréciós rendszer és az inv/spa lokusz által kódolt III. típusú szekréciós rendszer megkülönböztetése érdekében az inv/spa lokuszt 1. virulenciagén-cluster-nek (VGC1), az új lokuszt pedig VGC2-nek neveztük el. A VGC2 G+C tartalma kisebb, mint a Salmonella genomé, és olyan gének szegélyezik, amelyek termékei több, mint 90 %-ban azonosak az E. coli ydhE és pykF géntermékeivel. Ilyenformán, a VGC2 • · · · · · * ········ ···· ··· ··· ·
- 95 feltehetően inszerció útján, horizontálisan került egy - az E. coli ydhE és pykF génje közötti régiónak megfelelő régióba. A VGC2 mutánsok virulenciájának vizsgálata azt mutatta, hogy orális vagy intraperitoneális beadást követően legalább öt nagyságrenddel csökken a vad típusú törzs virulenciájához képest.
5. példa
Virulenciagének azonosítása Streptococcus pneononiae-ben
Mutagenezis
Alkalmas transzpozonrendszer hiányában a Streptococcus pneumoniae toldalékkal ellátott mutánsai előállításának leghatásosabb módja az inszerció-duplikációs mutagenezis [Morrison és mtsai.: J. Bacteriol. 159, 870 (1984)]. E módszer szerint - a genomiális DNS restrikciós enzimekkel végzett emésztésével vagy ultrahangkezeléssel, illetve gélfrakcionálással és T4-DNS-polimerázos DNS-vég-repair alkalmazásával - 200-400 bp-os véletlenszerű S. pneumoniae DNS-fragmenseket állítunk elő, majd a fragmenseket - E. coli-ban és' S. pneumoniae-ben eritromicin-szelekciót lehetővé tevő erm gént tartalmazó, és a polilinker klónozóhelyek egyikére DNS-toldalékok beiktatásával módosított - pJDC9-plazmidba [Pearce és mtsai.: Mól. Microbiol. 9, 1037 (1993)] ligáljuk. A klónozott S. pneumoniae DNS mérete elégséges a homológ rekombináció biztosításához, és csökkenti annak lehetőségét, hogy E.
• · coli-ban nem reprezentatív könyvtárat állítsunk elő (a S. pneumoniae proteinek expressziója toxikus lehet az E. colira) . A pJDC9-plazmid helyett alkalmazhatók más szelektálható markereket tartalmazó vektorok is. A DNSfragmenseket hordozó plazmidokat megfelelő S. pneumoniae törzsbe visszük be, mely törzset szerotipusa és pneumococcus-fertőzés okozta tüdőgyulladás egérmodelljóben mutatott - virulenciája alapján választottunk ki. s. pneumoniae-ben a genetikai transzformációra való alkalmasságot egy kompetenciafaktor (egy 17 aminosavas peptid) szabályozza, amelyet Don Morrison csoportja (Universi ty of Illinois at Chicago) részletesen karakterizált, és amelyet Havarstein, Coomaraswamy és Morrison írták le [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11140 (1995)]. A transzformációs kísérletekben e peptid kis mennyiségben történő alkalmazásával a S. pneumoniae néhány betokozott klinikai izolátumában nagyon jó transzformációs gyakoriság érhető el; ezáltal leküzdhető a pneumococcus-ok molekuláris genetikai vizsgálatának fő akadálya. A peptid hozzáférhetősége elősegíti a S. pneumoniae mutánsbankok előállítását, és a mutációnak alávetni kívánt törzs(ek) kiválasztását rugalmasabbá teszi. A transzformánsok egy részét a plazmidszekvenciák homológ integrációjának igazolása érdekében vizsgáltuk, és ellenőriztük stabilitásukat. Az inszerció-duplikációs mutagenezissel létrehozott mutánsokkal kapcsolatos visszaalakulás nagyon alacsony szintjét a duplikált régiók rövidsége (200-400 bp) minimálisra csökkenti; ha azonban a visszaalakulás szintje
- 97 elfogadhatatlanul magas, a transzformánsok tenyészetben végzett szaporítása, valamint az állatban történő szaporodás során antibiotikumos szelekciót végzünk.
Állatmodell
A S. pneumoniae mutánsbankot Sviss és/vagy C57B1/6 egerek fertőzése céljából állományokra osztottuk. Az állományok optimális komplexitásának, valamint az oltóanyag optimális nagyságának meghatározása céljából előzetes kísérleteket végeztünk. Az egyik előnyös modellben 10s telepképző egységet (cfu) tartalmazó oltóanyagot alkalmaznak, melyet szájon keresztül juttatnak a légcsőbe [Veber és mtsai.: J. Antimicrobial Chemotherapy 32, 473 (1993)]. A Sviss egerekben a fertőzés után 3-4 napon belül akut tüdőgyulladás alakul ki, míg a C57B1/6 egerekben 8-10 napon belül szubakut tüdőgyulladás figyelhető meg. Ezek a fertőzési modellek az állatok elpusztulásakor tüdőnként 108 telepképző egységet eremdényeznek [Veber és mtsai.: J. Antimicrobial Chemotherapy 32, 473 (1993)]. A véráramban a fertőzéshez szükséges gének azonosítása érdekében az egerek intraperitoneálisan is beolthatók [Sullivan és mtsai.: Antimicrobial Agents and Chemotherapy
37, 234 (1993)].
Virulenciagének azonosítása
A fertőzési modell paramétereinek optimális beállítása • * * ·
után a virulenciatesztben több ezer törzset tartalmazó mutánsbankot vizsgálunk. A csökkentett virulenciájú mutánsokat hibridizációs analízissel azonosítjuk, melynek során próbaként a betáplált” és a kinyert állományokból származó jelölt toldalékokat alkalmazzuk. Amennyiben a S. pneumoniae DNS teleplenyomatai nehezen készíthetők el, a kromoszómális DNS-t mikrotiter tálcák üregeiben kémiai vagy enzimatikus úton felszabadítjuk, majd dot-blot eljárás alkalmazásával nylonmembránokra másoljuk. Az integrált plazmidot szegélyező DNS-t E. coli-ban plazmidmentéssel (plasmid rescue) klónoztuk [Morrison és mtsai.: J. Bacteriol. 159, 870 (1984)] és szekvenáltuk. E. coli-ban vagy Gram-pozitív gazdatörzsben fenntartott alkalmas vektorokban genomiális DNS-könyvtárakat készítettünk, amelyeket klónozott virulenciagének izolálása céljából próbaként az integrálódott plazmidot szegélyező restrikciós fragmensek alkalmazásával - szkríneltünk. Az izolált virulenciagéneket megszekvenáltuk, és ‘ részletes funkcionális vizsgálatnak vetettük alá.
6. példa
Virulenciagének azonosítása Entexococcus faecalls-ban
Mutagenezis
Az E. faecalis mutagenezisét a pAT112-plazmid vagy annak e célra kifejlesztett származékának alkalmazásával végeztük. A pAT112-plazmid olyan géneket tartalmaz, amelyek • ·
- 99 Gram-negativ és Gram-pozitív baktériumokban egyaránt biztosítják a szelektálhatóságot. Ezenkívül, a pAT112 a Tnl545 att helyét is tartalmazza, következésképpen, a transzpozícióhoz a gazdatőrzsben szükség van az integráz jelenlétére, és amennyiben a gazdasejt nem tartalmaz excisionase gént, stabil, egykópiájú inszerciókat kapunk [Trieu-Cuot és mtsai.: Gene 106, 21 (1991)]. Az integrálódott plazmidot szegélyező DNS kinyerése érdekében a genomiális DNS-t restrikciós enzimekkel emésztjük, intramolekuláris ligálást végzünk, és a kapott DNSfragmenssel E. coli-t transzformálunk. A pATll2-plazmidban és származékaiban a restrikciós enzimek egyedi felismerési helyei [Trieu-Cuot és mtsai.: Gene 106, 21 (1991)] lehetővé teszik a DNS-szekvencia-toldalékok beillesztését, majd az így kapott plazmid konjugációval, elektroporációval vagy transzformációval [Trieu-Cuot és mtsai.: Gene 106, 21 (1991); Virth és mtsai.: J. Bacteriol. 165, 831 (1986)] az integráz-funkció biztosítása céljából pAT145-plazmidot hordozó - virulens E. faecalis törzsbe vihető be.
Állatmodell
A transzcipiensekből izolált DNS restrikciós enzimes emésztésével és Southern-hibridizációs analízisével nagy mennyiségű inszerciós mutánsban vizsgáljuk a plazmid véletlenszerű integrációját. Az egyes mutánsokat mikrotiter tálcák üregeiben tartjuk; az oltóanyag állománynagyságának és komplexitásának optimális szintjét a mutánsbank * · · · · * • · · ···» * · ·««« *·« *»· η
100 szkrinelése előtt állítjuk be. Az E. faecalis által okozott fertőzés két különböző modelljét alkalmazzuk. Az egyik a szívbelhártya-gyulladás széles körben elfogadott patkánymodellje, melynek során legfeljebb 10® cfu E. faecalis-t olyan állatok farki vénájába injektálunk, amelyeknek aortabillentyűjükön katétert vezettünk át [Vhitman és mtsai.: Animicrobial Agents and Chemotherapy 37, 1069 (1993)]. Az állatokat fertőzés után különböző időpontokban leöltük, majd az aortabillentyűikről kinyert baktériumvegetációt homogenizáltuk, és tenyésztő táptalajra szélesztve baktériumtelepeket hoztunk létre. A fertőzés után különböző időpontokban az állatok véréből virulens baktériumokat nyertünk ki. A második modell a hashártyagyulladás egérmodellje, amelyben az egereket maximum 109 cfu E. faecalis-szal fertőzzük [Chenoveth és mtsai.: Antimicrobial Agents and Chemotherapy 34, 1800 (1990)]. A S. pneumoniae modellhez hasonlóan e modell esetében is előzetes kísérleteket végzünk, amelyek során a mutánsbank szkrinelése előtt - meghatározzuk az állományok optimális komplexitását és az oltóanyag optimális nagyságát.
Virulenciagén-azonos!tás
A pAT112-plazmid integrációs helyét szegélyező DNS E. coli replikációs kezdőhelyének alkalmazásával történő izolálását megkönnyíti az a tény, hogy a vektorból hiányzik a legtöbb általánosan alkalmazott - hat bázispárt felismerő • · · · ·
- 101 restrikciós enzim felismerési helye. Ilyenformán, a szóban forgó törzsekből származó DNS-t az ilyen enzimek egyikével emésztjük, önmagával ligáljuk, majd E. coli-ba transzformáljuk, és a plazmid att helyeivel szomszédos szekvenciákon alapuló primerek alkalmazásával szekvenáljuk. A E. faecalis genomiális DNS-könyvtárát a virulenciagének ép kópiáinak azonosítása érdekében - próbaként a szóban forgó szekvenciák alkalmazásával - szkríneljük, majd az azonosított géneket szekvenáljuk.
7. példa
Virulenciagének azonosítása Pseudomonas aeruginosa-ban
Mutagenezis
Mivel a Tn5 transzpozon korábban már alkalmazták Pseudomonas aeruginosa mutagenezisére, és a Salmonella typhimurium virulenciagének azonosítására alkalmazott (ld.
1. példa) mini-Tn5-származékról leírták, hogy Gram-negatív baktériumokban (köztük több Pseudomonas-ban) széles körűen alkalmazható [DeLorenzo és Timaris: Methods Enzymol. 264, 386 (1994)], jelölt toldalékkal ellátott mini-Tn5 transzpozonjaink alkalmazásával P. aeruginosa mutánsbankot állítunk elő, oly módon, hogy egy vagy több virulens (és feltehetően mucoid) recipiens törzsbe konjugációval bevisszük a ”suicide vektort. Ez a megoldás jelentős időmegtakarítást eredményez. A mini-Tn5 transzpozon mellett a Tn5 transzpozon - speciálisan Pseudomonas aeruginosa • · · · ·
- 102 mutagenezisére kifejlesztett - egyéb származékai [Rella és mtsai.: Gene 33, 293 (1985)] is alkalmazhatók.
Állatmodell; virulenciagén-azonositás alkalmazzuk bakteriémia
A P. aeruginosa inszerciós mutánsainak gyűjteményét a krónikus tüdőgyulladás patkánymodelljében csökkentett virulenciára vizsgáljuk (szkrineljük). P. aeruginosa sejtek szuszpenzióit légcsőmetszés után a hörgőkbe juttatjuk, és a betegség 30 nap alatt kifejlődik [Voods és mtsai.: Inféct. Immun. 36, 1223 (1982)]. A baktériumok kinyeréséhez a tüdőből készített homogenátumokat laboratóriumi tápközegre szélesztjük, és az így kapott baktériumokból származó toldalékszekvenciákat a fertőzéshez oltóanyagként alkalmazott baktériumok teleplenyomatainak próbájaként A mutánsbank virulenciatesztjét endogén egérmodellben [Hirakata és mtsai.:
Antimicrobial Agents and Chemotherapy 36, 1198 (1992)] és a cisztikus fibrózis egérmodelljében [Davidson és mtsai.: Natúré Genetics 9, 351 (1995)] is elvégezhetjük. A transzpozonokat szegélyező DNS klónozását és szekvenálását az 1. példában leírtak szerint végezzük. A gének ép kópiáinak izolálására és szekvenálására alkalmas genomiális DNS-könyvtárakat standard eljárásokkal állítottuk elő.
• · • · ······ · • · · · ··· ··· · ··
- 103 8. példa
Virulenciagének azonosítása Aspexgillas ftnnigatus-ban
Mutagenezis
Gombák esetében a transzpozon-mutagenezis funkcionális megfelelője a transzformáló DNS restrikciós enzim közvetítette integrációja [REMI; Schiestl és Petes: Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 7585 (1991)]. Ebben az eljárásban a gombasejteket szelektálható markert tartalmazó DNSfragmensekkel restrikciós enzim jelenlétében transzformálják, amelynek eredményeként a genom különböző a restrikciós enzim célszekvenciája által meghatározott helyein egykópiás integrációk jönnek létre. A REMI eljárást Cochliobolus [Lu és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12649 (1994)] és Ustilago esetében [Mól. Gén. Génét. 248, 547 (1995)] sikeresen alkalmazták virulenciagének izolálására, és kimutatták, hogy az aktív restrikciós enzim higromicin-rezisztenciát kódoló - plazmiddal együttes alkalmazása a lineáris plazmid A. fumigatus genomba történő egyszeri, és nyilvánvalóan véletlenszerű integrációját eredményezi. A higromicin-rezisztenciát kódoló két vektor egyikének alkalmas helyére szekvencia-toldalékokat iktatunk be, és az így kapott vektort A. fumigatus klinikai izolátumának transzformálására alkalmazzuk.
• · • · · · ·
- 104 Állatmodell; virulenciagén-azonositás
Neutropéniás egerekben az aspergillosis alacsony dózisú modellje különösen jól modellezi az emberi tüdőbaj lefolyását [Smith és mtsai.: Infect. Immun. 62, 5247 (1994)]. Az egereket intranazálisan maximum 1 000 000 konidiospóra/egér mennyiségben fertőzzük, majd 7-10 nap elteltével a tüdőhomogenátumokat folyékony tápközegbe oltjuk, és kinyerjük a virulens gombamutánsokat. Néhány óra múlva összegyűjtjük a gombák hifáit, melyekből a toldalékok amplifikálása és jelölése céljából DNS-t vonunk ki. A jelölt toldalékszekvenciákat a fertőzéshez alkalmazott oltóanyagot alkotó transzformánsállományból származó DNS teleplenyomatainak próbázására alkalmazzuk. A REMI inszerciós pontokat szegélyező régiókból származó DNS-t úgy klónozzuk, hogy a transzformáns DNS-t - a REMI vektoron kivül hasitó - restrikciós enzimmel emésztjük, a DNS-t önmagával ligáijuk, és E. coli transzformálására alkalmazzuk. A szomszédos A. fumigatus DNS-szekvenciák meghatározása céljából a plazmid ismert szekvenciája alapján előállított primereket alkalmazunk. Annak bizonyítása céljából, hogy az avirulens fenotípust a vektor inszerciója okozta, a kinyert plazmidot a klónozáshoz alkalmazott restrikciós enzimmel újra hasítjuk, és visszatranszformáljuk a vad típusú szülői A. fuaigatus törzsbe, és a homológ rekombinációval létrejött transzformánsokat virulenciatesztnek vetjük alá.

Claims (56)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Eljárás olyan mikroorganizmus azonosítására, amely egy adott környezethez csökkent mértékben képes alkalmazkodni, azzal jellemezve, hogy (i) olyan mikroorganizmusok (vagy mikroorganizmusok kiónjainak) sokaságát hozzuk létre, amelyek egymástól függetlenül - egy-egy génjük egyedi markerszekvenciát tartalmazó nukleinsav alkalmazásával végzett inszerciós inaktiválásával - vannak mutagenizálva, melynek eredményeként minden egyes mutáns különböző markerszekvenciát tartalmaz;
    (ii) az előző lépésben előállított egyes mutánsokból külön-külön tárolt mintákat készítünk, és olyan elkülönítve tárolt nukleinsavakat állítunk elő, amelyek az egyes mutánsokból származó egyedi markerszekvenciákat tartalmazzák;
    (iii) az (i) lépésben előállított mutánsok sokaságát az adott környezetbe visszük, és az ebben a környezetben szaporodni képes mikroorganizmusokat szaporodni hagyjuk;
    (iv) a szóban forgó környezetből vagy annak egy kiválasztott részéből visszanyerjük a mikroorganizmusokat, és a visszanyert mikroorganizmusokból izoláljuk a nukleinsavat;
    (v) az (iv) lépésben izolált nukleinsavban lévő markerszekvenciákat összehasonlítjuk az (ii) lépésben félretett egyes mutánsokban lévő egyedi markerszekvenciákkal; és • ·
    - 106 (vi) kiválasztunk egy olyan mutánst, amely az (iv) lépésben izolált markerszekvenciák egyikét sem tartalmazza.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépésben a mikroorganizmusok sokaságát egyedi markerszekvenciát hordozó nukleinsavat tartalmazó mikroorganizmusokból oly módon állítjuk elő, hogy a mikroorganizmusok állapotát egy első adott állapotról egy második adott állapotra változtatjuk, melyek során (a) az egyedi markert tartalmazó nukleinsav az első adott állapotban episzomálisan van fenntartva, és (b) a második adott állapotban az egyedi markerszekvenciát tartalmazó nukleinsav inszerció következtében inaktiválja a gént.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további lépésekként (i/a) az (i) lépésben előállított mikroorganizmus sokaságból eltávolítjuk az auxotróf mutánsokat; vagy (vi/a) meghatározzuk, hogy a (vi) lépésben kiválasztott mutáns auxotróf-e; vagy elvégezzük mind az (i/a), mind a (vi/a) lépést.
  4. 4. Eljárás egy mikroorganizmus adott környezethez történő alkalmazkodását elősegítő gén azonosítására, azzal jellemezve, hogy elvégezzük az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárást, és további lépésként (vii) a (vi) lépésben kiválasztott mutánsból izoláljuk az inszercióval inaktivált gént.
    • · · · · • · · ·
    - 107
  5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további lépésként (viii) egy vad típusú mikroorganizmusból, próbaként a (vii) lépésben izolált inszercióval inaktivált gén alkalmazásával megfelelő vad típusú gént izolálunk.
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az adott környezetként differenciált soksejtű organizmust alkalmazunk.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy soksejtű organizmusként egy növényt alkalmazunk.
  8. 8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy soksejtű organizmusként egy állatot alkalmazunk.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy állatként egeret, patkányt, nyulat, kutyát vagy majmot alkalmazunk.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy állatként egeret alkalmazunk.
  11. 11. A 6-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (iv) lépésben a mikroorganizmusokat az (iii) lépésben végzett bevitel helyétől távoli helyen nyerjük vissza az adott környezetből.
    • ·
    - 108
  12. 12. A 8-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (iii) lépésben a mikroorganizmusokat orálisan vagy intraperitoneálisan adjuk be az állatnak.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, amennyiben az a
    8. vagy a 9. igénypont szerinti eljárásra vonatkozik, azzal jellemezve, hogy az (iv) lépésben a mikroorganizmusokat az állat lépéből nyerjük vissza.
  14. 14. A 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként baktériumot alkalmazunk.
  15. 15. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként gombát alkalmazunk.
  16. 16. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként növénypatogén baktériumot alkalmazunk.
  17. 17. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként növénypatogén gombát alkalmazunk.
  18. 18. A 8-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként állatpatogén baktériumot alkalmazunk.
    • · · · ·
    - 109
  19. 19. A 8-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként állatpatogén gombát alkalmazunk.
  20. 20. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy baktériumként Bordatella pertussis-t, Campylobacter jejuni-t, Clostridium ' botulinum-ot, Escherichia coli-t, Haemophilus ducrey-t, Haemophilus influenzae-t, Helicobacter pylori-t, Klebsiella pneumoniaet, Legionella pneumophila-t, Listeria fajokat, Neisseria gonorrhoeae-t, Neisseria meningitidis-t, Pseudomonas fajokat, Salmonella fajokat, Shigella fajokat, Staphylococcus aureus-t, streptococcus pyogenes-t, Streptococcus pneumoniae-t, Vibrio fajokat vagy Yersinia pestís-t alkalmazunk.
  21. 21. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gombaként Aspergillus fajokat, Cryptococcus neoformans-t vagy Histoplasma capsulatűm-ot alkalmazunk.
  22. 22. Az 1-21. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépésben a gént egyedi markerszekvenciát tartalmazó transzpozon, transzpozon-szerű elem vagy más DNS-szekvencia alkalmazásával inszercióval inaktiváljuk.
  23. 23. Az 1-22. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, • · • · · ···· ·
    - 110 - y azzal jellemezve, hogy az (i) lépésben a mikroorganizmusokat olyan nukleinsavak alkalmazásával
    mutagenizáljuk, amelyekben minden egyes különböző markerszekvenciát egyik oldalról a nukleinsavakban közös szekvencia szegélyez.
  24. 24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (ii) lépésben az egyedi markerszekvenciát tartalmazó nukleinsavat DNS-amplifikációs technikák, valamint a közös szekvenciákkal hibridizálódó oligonukleotid primerek alkalmazásával izoláljuk.
  25. 25. A 23. vagy 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (iv) lépésben a markerszekvenciák sokaságát tartalmazó nukleinsavat DNS-amplifikációs technikák, valamint a közös szekvenciákkal hibridizálódó oligonukleotid primerek alkalmazásával izoláljuk.
  26. 26. Mikroorganizmus, amely az 1-25. igénypontok bármelyike szerinti eljárással van azonosítva.
  27. 27. Mikroorganizmus, amely az 5. igénypont szerinti eljárás alkalmazásával azonosított génben mutációt tartalmaz.
  28. 28. A 26. igénypont (amennyiben az a 8. igénypontra vonatkozik) vagy a 27. igénypont szerinti eljárással azonosított mikroorganizmus vakcinában történő alkalmazás• « · · ·
    - 111 ra.
  29. 29. Vakcina, amely a 26. igénypont (amennyiben az a 8. igénypontra vonatkozik) vagy a 27. igénypont szerinti mikroorganizmust, valamint gyógyászati szempontból elfogadható hordozót tartalmaz.
  30. 30. Gén, amely a 4. vagy 5. igénypont szerinti eljárással van azonosítva.
  31. 31. A 30. igénypont szerinti gén, amely Salmonella typhimurium genomból van izolálva, és amely szigorú feltételek mellett az 5. ábrán bemutatott szekvenciához hibridizálódik.
  32. 32. A 30. igénypont szerinti gén, amely Salmonella typhimurium genomból van izolálva, és amely szigorú feltételek mellett az 6. ábrán bemutatott szekvenciához hibridizálódi k.
  33. 33. Polipeptid, amelyet a 30-32. igénypontok bármelyike szerinti gén kódol.
  34. 34. Eljárás egy mikroorganizmus adott környezethez történő alkalmazkodási képességét csökkentő vegyület azonosítására, azzal jellemezve, hogy kiválasztunk egy olyan vegyületet, amely megakadályozza a 30-32. igénypontok bármelyike szerinti gén vagy a 33. igénypont szerinti • · · ·· t« ·
    112 polipeptid működését.
  35. 35. Vegyület, amely a 34. igénypont szerinti eljárással azonosítható.
  36. 36. A 35. igénypont szerinti vegyület, amely egy mikroorganizmus gazdaszervezethez történő alkalmazkodási képességét csökkenti.
  37. 37. A 36. igénypont szerinti vegyület, amely egy mikroorganizmus növény gazdaszervezethez történő alkalmazkodási képességét csökkenti.
  38. 38. A 36. igénypont szerinti vegyület, amely egy mikroorganizmus állat gazdaszervezethez történő alkalmazkodási képességét csökkenti.
  39. 39. A 36-38. igénypontok bármelyike szerinti vegyület alkalmazása a gazdaszervezet említett mikroorganizmus által okozott fertőzésének kezelésére.
  40. 40. Molekula, amely a 30-32. igénypontok bármelyike szerinti génnel vagy annak nukleinsav-termékével szelektív módon kölcsönhatásba lép, és alapvetően gátolja működését.
  41. 41. A 40. igénypont szerinti molekula, amely egy antiszensz nukleinsav vagy nukleinsav-származék.
    * * · ♦ · · » ·
    113
  42. 42. A 40. vagy 41. igénypont szerinti molekula, amely egy antiszensz oligonukleotid.
  43. 43. A 40-42. igénypontok bármelyike szerinti molekula gyógyszerkészítményben történő alkalmazásra.
  44. 44. Eljárás egy mikroorganizmus · által okozott fertőzéstől szenvedő vagy arra fogékony gazdaszervezet kezelésére, azzal jellemezve, hogy egy 36. vagy 40. igénypont szerinti - a fertőzést okozó mikroorganizmusban vagy annak közeli rokonában lévő gén működését gátló molekula vagy vegyület hatásos mennyiségét adjuk be.
  45. 45. Gyógyászati készítmény, amely 38. vagy 40. igénypont szerinti molekulát vagy vegyületet, valamint gyógyászati szempontból elfogadható hordozót tartalmaz.
  46. 46. A Salmonella typhimurium VGC2 DNS-e, annak részlete vagy változata, vagy részletének változata.
  47. 47. Mutáns baktérium, amelyben - amennyiben a baktérium nórmális esetben tartalmaz egy olyan gént, amely azonos vagy egyenértékű egy VGC2 lokuszban lévő génnel - a gén mutációt hordoz vagy hiányzik a mutáns baktériumból.
  48. 48. Eljárás a 47. igénypont szerinti baktérium előállítására.
    114
  49. 49. A 47. igénypont szerinti mutáns baktérium alkalmazása vakcinában.
  50. 50. Gyógyászati készítmény, amely 47. igénypont szerinti baktériumot és gyógyászati szempontból elfogadható hordozót tartalmaz.
  51. 51. A Salmonella typhimurium VGC2 DNS-e által kódolt polipeptid, annak részlete vagy változata, vagy részletének változata.
  52. 52. Eljárás egy baktérium gazdaszervezetet megfertőző vagy abban betegséget okozó képességét csökkentő vegyület azonosítására, azzal jellemezve, hogy kiválasztunk egy olyan vegyületet, amely megakadályozza a 46. igénypont szerinti, VGC2 lokuszba tartozó gén vagy az 51. igénypont szerinti polipeptid működését.
  53. 53. Vegyület, amely az 52. igénypont szerinti eljárással azonosítható.
  54. 54. Molekula, amely szelektív módon kölcsönhatásba lép a Salmonella typhimurium VGC2 lokuszának egy génjével vagy nukleinsav-termékével, és alapvetően gátolja működését.
  55. 55. Az 53. vagy 54. igénypont szerinti molekula vagy vegyület gyógyszerkészítményben történő alkalmazásra.
    115
  56. 56. A találmány leírásában feltárt bármilyen újdonság vagy újdonságok kombinációja.
HU9701765A 1994-12-09 1995-12-11 Eljárás gének azonosítására HUT76975A (hu)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9424921.6A GB9424921D0 (en) 1994-12-09 1994-12-09 Identification of genes
GBGB9501881.8A GB9501881D0 (en) 1995-01-31 1995-01-31 Identification of genes
GBGB9509239.1A GB9509239D0 (en) 1995-05-05 1995-05-05 Identification of genes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUT76975A true HUT76975A (hu) 1998-01-28

Family

ID=27267507

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9701765A HUT76975A (hu) 1994-12-09 1995-12-11 Eljárás gének azonosítására

Country Status (21)

Country Link
US (7) US5876931A (hu)
EP (3) EP1285960A3 (hu)
JP (3) JP3522285B2 (hu)
KR (4) KR100445103B1 (hu)
CN (3) CN1912141B (hu)
AT (2) ATE171477T1 (hu)
AU (1) AU711524C (hu)
CA (2) CA2206515C (hu)
CZ (1) CZ296981B6 (hu)
DE (3) DE889120T1 (hu)
DK (2) DK0796341T3 (hu)
ES (2) ES2126332T3 (hu)
FI (1) FI121601B (hu)
HK (2) HK1009833A1 (hu)
HU (1) HUT76975A (hu)
NO (2) NO320492B1 (hu)
NZ (3) NZ511170A (hu)
PT (1) PT889120E (hu)
RU (1) RU2370541C2 (hu)
SG (4) SG165157A1 (hu)
WO (1) WO1996017951A2 (hu)

Families Citing this family (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996017951A2 (en) * 1994-12-09 1996-06-13 Rpms Technology Limited Identification of genes responsible for in vivo survival of microorganisms
EP0920530A1 (en) * 1996-06-17 1999-06-09 Microcide Pharmaceuticals, Inc. Screening methods using microbial strain pools
US6455323B1 (en) 1997-07-03 2002-09-24 Pharmacia & Upjohn Company Anti-bacterial methods and materials
NO974299D0 (no) * 1997-09-18 1997-09-18 Forskningsparken I Aas As Metode for stabil merking av mikroorganismer
EP0943681A1 (en) * 1998-01-22 1999-09-22 Vrije Universiteit Brussel Live attenuated salmonella vaccine
WO1999037759A2 (en) * 1998-01-22 1999-07-29 Vrije Universiteit Brussel Live attenuated salmonella vaccine
WO1999045136A1 (en) * 1998-03-05 1999-09-10 University Of British Columbia Methods for assaying type iii secretion inhibitors
AU758565B2 (en) * 1998-03-18 2003-03-27 Board Of Trustees Of The University Of Illinois, The Selection subtraction approach to gene identification
AU4188199A (en) * 1998-05-15 1999-12-06 University Of California, Los Angeles Type iii (bordetella) secretion system
DK1108034T3 (da) * 1998-09-04 2008-11-10 Emergent Product Dev Uk Ltd Svækkede salmonella SPI2-mutanter som antigenbærere
AU6504399A (en) * 1998-09-30 2000-04-17 Boston Medical Center Corporation Identification of virulence determinant activators in prokaryotic pathogens government support
US6720139B1 (en) 1999-01-27 2004-04-13 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Genes identified as required for proliferation in Escherichia coli
US6299850B1 (en) 1999-03-16 2001-10-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Energy Carbon activation process for increased surface accessibility in electrochemical capacitors
US6790950B2 (en) 1999-04-09 2004-09-14 Pharmacia & Upjohn Company Anti-bacterial vaccine compositions
EP1860117A3 (en) 1999-04-09 2008-09-03 Pharmacia & Upjohn Company LLC Anti-bacterial vaccine compositions
GB9910812D0 (en) * 1999-05-10 1999-07-07 Microscience Ltd Vaccine composition
WO2001002555A1 (en) * 1999-07-06 2001-01-11 Institut Pasteur Method of making and identifying attenuated microorganisms, compositions utilizing the sequences responsible for attenuation, and preparations containing attenuated microorganisms
WO2001034810A2 (en) * 1999-11-09 2001-05-17 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Genes essential for microbial proliferation
WO2001057075A2 (en) * 2000-02-03 2001-08-09 Microscience Limited Virulence genes, proteins, and their use
US6783985B1 (en) 2000-02-18 2004-08-31 Elitra Pharmaceuticals Inc. Gene disruption methodologies for drug target discovery
ATE300949T1 (de) * 2000-03-17 2005-08-15 Pharmacia & Upjohn Co Llc Ssa inaktivierte salmonella impfstoffe
GB0008748D0 (en) * 2000-04-11 2000-05-31 Univ Manchester Mutant bank
GB0011108D0 (en) * 2000-05-08 2000-06-28 Microscience Ltd Virulence gene and protein and their use
US20020076722A1 (en) * 2000-09-13 2002-06-20 Neyfakh Alexander A. Antibiotic hypersusceptibility mutations in bacteria
US20020094536A1 (en) * 2000-12-28 2002-07-18 Cell Therapeutics, Inc. Methods for making polynucleotide libraries, polynucleotide arrays, and cell libraries for high-throughput genomics analysis
US20030180953A1 (en) * 2000-12-29 2003-09-25 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Gene disruption methodologies for drug target discovery
CA2445179A1 (en) * 2001-04-23 2002-10-31 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Identification of essential genes of aspegillus fumigatus and methods of use
DE60216099D1 (de) * 2001-05-17 2006-12-28 Creatogen Ag Methode zum auffinden von abgeschwächten oder virulent-defekten mikroben
CA2450658A1 (en) * 2001-06-15 2002-12-27 Chiron Corporation Essential and important genes of pseudomonas aeruginosa and the use thereof to design or identify antibacterial agents
JP2005504523A (ja) 2001-06-22 2005-02-17 ヘルス プロテクション エージェンシー 低酸素圧下で発現するマイコバクテリア抗原
US7393540B2 (en) 2001-07-04 2008-07-01 Health Protection Agency Mycobacterial antigens expressed during latency
WO2003008631A2 (en) * 2001-07-20 2003-01-30 Health Protection Agency Tagging of microorganisms
US7026123B1 (en) 2001-08-29 2006-04-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. UTR tag assay for gene function discovery
GB0125535D0 (en) 2001-10-24 2001-12-12 Microbiological Res Authority Mycobacterial genes down-regulated during latency
US20040029129A1 (en) * 2001-10-25 2004-02-12 Liangsu Wang Identification of essential genes in microorganisms
EP1443959A1 (en) * 2001-11-12 2004-08-11 Pharmacia &amp; Upjohn Company Salmonella vaccine
US20030170694A1 (en) * 2001-12-21 2003-09-11 Daniel Wall Stabilized nucleic acids in gene and drug discovery and methods of use
US7449178B2 (en) 2002-04-05 2008-11-11 Merial Limited Attenuated gram negative bacteria
ES2320419T3 (es) * 2002-04-05 2009-05-22 Merial Bacterias gram negativas atenuadas.
EP1499732A4 (en) * 2002-04-15 2005-11-16 Chiron Corp ESSENTIAL AND IMPORTANT GENES OF PSEUDOMONAS AEROGINOSA, AND THEIR USE FOR THE DESIGN OR IDENTIFICATION OF ANTIBACTERIAL AGENTS
US8173363B2 (en) * 2002-08-20 2012-05-08 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Random transposon insertion in Staphylococcus aureus and use thereof to identify essential genes
FI116068B (fi) * 2003-09-15 2005-09-15 Fit Biotech Oyj Plc Uusi selektiojärjestelmä, siinä käyttökelpoinen vektori, bakteerisolukantoja sekä menetelmä solujen valikoimiseksi
EP1761590B1 (de) * 2003-11-21 2009-08-05 Merck Patent GmbH Verfahren zur modifikation von chiralen flüssigkristallfilmen mit hilfe von extraktionsmitteln
US20050266447A1 (en) * 2004-04-19 2005-12-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for identifying activators of gene transcription
CA2567547C (en) 2004-05-21 2012-10-23 The Regents Of The University Of California Method for enhancing production of isoprenoid compounds
SG176459A1 (en) 2005-07-05 2011-12-29 Univ California Polynucleotides encoding isoprenoid modifying enzymes and methods of use thereof
EP1752532A1 (en) * 2005-08-09 2007-02-14 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Extracellular polyhydroxyalkanoates produced by genetically engineered microorganisms
KR20120053088A (ko) 2006-05-26 2012-05-24 아미리스 인코퍼레이티드 이소프레노이드의 생산 방법
US20080124355A1 (en) 2006-09-22 2008-05-29 David Gordon Bermudes Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment
WO2008039499A2 (en) 2006-09-26 2008-04-03 The Regents Of The University Of California Production of isoprenoids and isoprenoid precursors
WO2008153772A2 (en) * 2007-05-25 2008-12-18 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Chlamydia vaccine comprising htra polypeptides
US8703153B2 (en) 2008-06-16 2014-04-22 Prokarium Ltd. Salmonella vectored vaccines against Chlamydia and methods of use
US8383345B2 (en) 2008-09-12 2013-02-26 University Of Washington Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads
US9051665B2 (en) * 2008-11-20 2015-06-09 Steven L. Zeichner Method for screening biomolecules
US10369772B2 (en) 2012-07-10 2019-08-06 Textron Innovations Inc. Method of making core-stiffened structure
WO2011123576A2 (en) 2010-03-31 2011-10-06 Codexis, Inc. Production of monoterpenes
CA2798703A1 (en) 2010-05-10 2011-11-17 The Regents Of The University Of California Endoribonuclease compositions and methods of use thereof
US9074251B2 (en) * 2011-02-10 2015-07-07 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
US8829171B2 (en) 2011-02-10 2014-09-09 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
WO2012106546A2 (en) 2011-02-02 2012-08-09 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Massively parallel continguity mapping
US8481052B2 (en) 2011-05-17 2013-07-09 Cj Cheiljedang Corporation Avirulent Salmonella gallinarum variants and pharmaceutical composition using the same
CN107936097A (zh) 2011-12-16 2018-04-20 斯坦福大学托管董事会 视蛋白多肽及其使用方法
US9181343B2 (en) 2012-07-19 2015-11-10 Redwood Bioscience Inc. Antibody specific for CD22 and methods of use thereof
CA2882034C (en) 2012-08-16 2019-10-29 Ipierian, Inc. Methods of treating a tauopathy
CN110818798A (zh) 2012-10-25 2020-02-21 美国比奥维拉迪维股份有限公司 抗补体C1s抗体和其用途
AU2013337638B2 (en) 2012-11-02 2018-10-25 Bioverativ Usa Inc. Anti-complement C1s antibodies and uses thereof
US9683230B2 (en) 2013-01-09 2017-06-20 Illumina Cambridge Limited Sample preparation on a solid support
DK3300745T3 (da) 2013-02-15 2019-11-04 Univ California Kimærisk antigenreceptor og fremgangsmåder til anvendelse deraf
US10557133B2 (en) 2013-03-13 2020-02-11 Illumina, Inc. Methods and compositions for nucleic acid sequencing
EP2981610A1 (en) 2013-04-05 2016-02-10 Université du Luxembourg Biotechnological production of itaconic acid
CA2914768A1 (en) 2013-06-10 2014-12-18 Ipierian, Inc. Methods of treating a tauopathy
CN106414765A (zh) 2013-12-20 2017-02-15 Illumina公司 在片段化的基因组dna样品中保留基因组连接信息
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
WO2016061517A2 (en) 2014-10-17 2016-04-21 Illumina Cambridge Limited Contiguity preserving transposition
WO2016164358A1 (en) 2015-04-06 2016-10-13 True North Therapeutics, Inc. Humanized anti-c1s antibodies and methods of use thereof
KR20180042412A (ko) 2015-09-02 2018-04-25 이뮤텝 에스.에이.에스. 항-lag-3 항체
WO2020047527A2 (en) 2018-09-02 2020-03-05 F1 Bioventures, Llc Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes in blood or in enriched pbmcs
US11111505B2 (en) 2016-03-19 2021-09-07 Exuma Biotech, Corp. Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof
MX2018011345A (es) 2016-03-19 2019-05-27 F1 Oncology Inc Métodos y composiciones para transducir linfocitos y expansión regulada de los mismos.
US11325948B2 (en) 2016-03-19 2022-05-10 Exuma Biotech Corp. Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes to express polypeptides comprising the intracellular domain of MPL
IL311675A (en) 2016-04-04 2024-05-01 Bioverativ Usa Inc Anti-complement factor BB antibodies and their uses
EP3472318B1 (en) 2016-07-08 2023-09-06 Exuma Biotech Corp. Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof
WO2018013865A1 (en) * 2016-07-13 2018-01-18 uBiome, Inc. Method and system for microbial pharmacogenomics
IL265957B2 (en) 2016-10-12 2024-04-01 Bioverativ Usa Inc Anti-C1S antibodies and methods of using them
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
KR20190130559A (ko) 2017-01-18 2019-11-22 에프1 온콜로지, 인코포레이티드 Axl 또는 ror2에 대한 키메라 항원 수용체 및 이의 사용 방법
SG11201907814SA (en) 2017-03-03 2019-09-27 F1 Oncology Inc Methods and compositions for transducing and expanding lymphocytes and regulating the activity thereof
CA3061718A1 (en) 2017-04-27 2018-11-01 Regents Of The University Of California Microorganisms and methods for producing cannabinoids and cannabinoid derivatives
TWI823868B (zh) 2017-10-11 2023-12-01 美商生物維瑞提夫美國公司 誘導補體活性之方法
US11541105B2 (en) 2018-06-01 2023-01-03 The Research Foundation For The State University Of New York Compositions and methods for disrupting biofilm formation and maintenance
US11471497B1 (en) 2019-03-13 2022-10-18 David Gordon Bermudes Copper chelation therapeutics
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine
WO2022187289A1 (en) 2021-03-01 2022-09-09 Exuma Biotech Corp. Methods and compositions for the delivery of retroviral particles
WO2023168305A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Exuma Biotech Corp. Viral particles with membrane-bound hyaluronidase

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4440859A (en) 1977-05-27 1984-04-03 The Regents Of The University Of California Method for producing recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of higher organisms
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
IN151589B (hu) 1978-12-22 1983-05-28 Biogen Nv
US4530901A (en) 1980-01-08 1985-07-23 Biogen N.V. Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides
US4837151A (en) * 1980-05-19 1989-06-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University, Stanford University Live vaccines comprising two mutations and foreign antigen
US5210035A (en) 1980-05-19 1993-05-11 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Non-reventing live vaccines
US4550081A (en) * 1980-05-19 1985-10-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Non-reverting salmonella
US4766075A (en) 1982-07-14 1988-08-23 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator
US4582800A (en) 1982-07-12 1986-04-15 Hoffmann-La Roche Inc. Novel vectors and method for controlling interferon expression
US4757006A (en) 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
US4677063A (en) 1985-05-02 1987-06-30 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
US5643579A (en) 1984-11-01 1997-07-01 American Home Products Corporation Oral vaccines
US4810648A (en) 1986-01-08 1989-03-07 Rhone Poulenc Agrochimie Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
US5397697A (en) * 1989-01-10 1995-03-14 Ciba-Geigy Corporation Identification of plant-responsive genes of bacteria
FR2664614B1 (fr) 1990-07-11 1992-10-16 Pasteur Institut Sequences nucleiques issues du genome de salmonella typhi, et leurs utilisations notamment pour le diagnostic in vitro de la presence de bacteries du genre salmonella dans les produits alimentaires.
SE9101433D0 (sv) 1991-05-13 1991-05-13 Marianne Hansson Recombinant dna sequence and its use
EP0669989A1 (en) * 1991-08-22 1995-09-06 Washington University Polynucleotide probes for salmonella
AU2778992A (en) * 1991-10-07 1993-05-03 Idaho Research Foundation Inc., The Genetic construct for selection of homologous recombinants on a single selective medium
US5356797A (en) 1991-11-15 1994-10-18 Board Of Regents, The University Of Texas Membrane expression of heterologous genes
WO1993010246A1 (en) 1991-11-15 1993-05-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Membrane expression of heterologous genes
EP0668779A4 (en) 1992-11-06 1996-08-21 Univ Minnesota Vaccine to protect against pasteurellosis - infection by P.multocida.
WO1994026933A1 (en) * 1993-05-13 1994-11-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Genetic footprinting: insertional mutagenesis and genetic selection
US5700638A (en) 1993-08-26 1997-12-23 Washington University Cell death regulator
DE4405652A1 (de) * 1994-02-22 1995-09-07 Hoechst Ag Verfahren zur Herstellung von nichtoxidischer Keramik mit definierter Wärmeleitfähigkeit
WO1996011708A1 (en) 1994-10-18 1996-04-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Membrane expression of heterologous genes
WO1996017951A2 (en) * 1994-12-09 1996-06-13 Rpms Technology Limited Identification of genes responsible for in vivo survival of microorganisms
US5700683A (en) * 1995-02-17 1997-12-23 Pathogenesis Corporation Virulence-attenuating genetic deletions deleted from mycobacterium BCG
EP0857214A1 (en) * 1995-10-16 1998-08-12 Smithkline Beecham Plc Novel saliva binding protein
AU7738396A (en) 1995-11-14 1997-06-05 General Hospital Corporation, The Salmonella secreted proteins and uses thereof
AU4070097A (en) 1996-08-16 1998-03-06 Uab Research Foundation, The Mucosal immunogens for novel vaccines
GB9621091D0 (en) 1996-10-09 1996-11-27 Fondation Pour Le Perfectionem Attenuated microorganisms strains and their uses
AU722326B2 (en) 1997-02-14 2000-07-27 Merck & Co., Inc. Polynucleotide vaccine formulations
US6455323B1 (en) 1997-07-03 2002-09-24 Pharmacia & Upjohn Company Anti-bacterial methods and materials
GB9804809D0 (en) 1998-03-06 1998-04-29 Wallis Timothy S Attenuated salmonella:materials and methods relating thereto
US6585975B1 (en) 1998-04-30 2003-07-01 Acambis, Inc. Use of Salmonella vectors for vaccination against helicobacter infection
DK1108034T3 (da) 1998-09-04 2008-11-10 Emergent Product Dev Uk Ltd Svækkede salmonella SPI2-mutanter som antigenbærere
NZ527279A (en) 1998-11-09 2005-05-27 Microscience Ltd Virulence genes and proteins, and their use
GB9910812D0 (en) 1999-05-10 1999-07-07 Microscience Ltd Vaccine composition
WO2001032697A2 (en) 1999-11-05 2001-05-10 L'unite De Recherche En Biologie Moleculaire (Urbm) Des Facultes Universitaires Notre Dame De La Paix (Fundp) Virulence genes and proteins from brucella melitensis, and their use
WO2001048208A2 (en) 1999-12-23 2001-07-05 Vmax Limited Streptococcus pyogenes virulence genes and proteins and their use
GB0011108D0 (en) 2000-05-08 2000-06-28 Microscience Ltd Virulence gene and protein and their use
US6548368B1 (en) * 2000-08-23 2003-04-15 Applied Materials, Inc. Method of forming a MIS capacitor
GB0127657D0 (en) 2001-11-19 2002-01-09 Microscience Ltd Virulence genes and proteins and their use
US7449178B2 (en) 2002-04-05 2008-11-11 Merial Limited Attenuated gram negative bacteria

Also Published As

Publication number Publication date
US7842290B2 (en) 2010-11-30
DE889120T1 (de) 2001-01-11
DK0889120T3 (da) 2002-07-22
AU711524C (en) 2004-03-18
EP0796341B1 (en) 1998-09-23
US20110229515A1 (en) 2011-09-22
EP0796341A2 (en) 1997-09-24
DE69526377D1 (de) 2002-05-16
WO1996017951A3 (en) 1996-10-17
NZ296581A (en) 2000-02-28
SG119177A1 (en) 2006-02-28
NO972468D0 (no) 1997-05-30
US20080175866A1 (en) 2008-07-24
KR20040023806A (ko) 2004-03-19
EP1285960A3 (en) 2003-05-07
CA2206515A1 (en) 1996-06-13
DE69505011T2 (de) 1999-05-06
CN1176662A (zh) 1998-03-18
NO320492B1 (no) 2005-12-12
NZ511170A (en) 2005-02-25
NO327361B1 (no) 2009-06-15
ES2178101T3 (es) 2002-12-16
CZ175597A3 (en) 1997-10-15
FI121601B (fi) 2011-01-31
US6984490B1 (en) 2006-01-10
CA2623339C (en) 2012-05-08
US6015669A (en) 2000-01-18
JPH10509872A (ja) 1998-09-29
NO20042249L (no) 1997-08-08
EP1285960A2 (en) 2003-02-26
PT889120E (pt) 2002-09-30
DE69526377T2 (de) 2002-11-07
CZ296981B6 (cs) 2006-08-16
KR100445103B1 (ko) 2004-12-04
SG173213A1 (en) 2011-08-29
EP0889120B1 (en) 2002-04-10
KR20050052665A (ko) 2005-06-03
JP2003144180A (ja) 2003-05-20
ES2126332T3 (es) 1999-03-16
FI972424A0 (fi) 1997-06-06
CN1912141A (zh) 2007-02-14
DK0796341T3 (da) 1999-06-14
US6342215B1 (en) 2002-01-29
US5876931A (en) 1999-03-02
AU4121996A (en) 1996-06-26
NO972468L (no) 1997-08-08
ATE215986T1 (de) 2002-04-15
CA2623339A1 (en) 1996-06-13
JP2009005688A (ja) 2009-01-15
CA2206515C (en) 2009-11-17
JP4220195B2 (ja) 2009-02-04
US20060216309A1 (en) 2006-09-28
RU2003135645A (ru) 2005-05-27
KR100551104B1 (ko) 2006-02-09
NZ502020A (en) 2001-06-29
HK1100782A1 (en) 2007-09-28
KR20060099543A (ko) 2006-09-19
AU711524B2 (en) 1999-10-14
SG165157A1 (en) 2010-10-28
CN1510137A (zh) 2004-07-07
EP0889120A1 (en) 1999-01-07
CN1912141B (zh) 2010-10-27
SG56084A1 (en) 2003-03-18
FI972424A (fi) 1997-08-06
HK1009833A1 (en) 1999-06-11
DE69505011D1 (de) 1998-10-29
ATE171477T1 (de) 1998-10-15
CN1160469C (zh) 2004-08-04
JP3522285B2 (ja) 2004-04-26
WO1996017951A2 (en) 1996-06-13
RU2370541C2 (ru) 2009-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT76975A (hu) Eljárás gének azonosítására
TWI328035B (en) Anti-bacterial vaccine compositions
Iteman et al. Relationship between loss of pigmentation and deletion of the chromosomal iron-regulated irp2 gene in Yersinia pestis: evidence for separate but related events
US20060115497A1 (en) Mycobacterium strains with modified erp gene and vaccine composition containing same
US6290966B1 (en) Dim mutants of mycobacteria and use thereof
RU2241758C2 (ru) Способ определения микроорганизма с пониженной адаптацией к конкретной окружающей среде, днк (варианты), ген вирулентности, полипептид, способ определения соединения, антисмысловая нуклеиновая кислота, способ лечения хозяина и фармацевтическая композиция
AU758791B2 (en) Identification of genes

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: IMPERIAL COLLEGE INNOVATIONS LIMITED, GB

DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: MICROSCIENCE LIMITED, UK

DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: MICROSCIENCE LIMITED, GB

Owner name: IMPERIAL COLLEGE INNOVATIONS LIMITED, GB

FC4A Lapse of provisional application due to refusal