JP3522285B2 - 遺伝子の同定 - Google Patents

遺伝子の同定

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Description

【発明の詳細な説明】 本願発明は、環境に対する微生物の適用に係る遺伝子
の同定方法、特に病原性微生物の毒性（ビルレンス）の
原因となる遺伝子の同定方法に関する。
発明の背景 細菌および他の病原体における抗生物質耐性は、益々
重要になりつつある。それゆえ、病原性微生物を攻撃す
る新規の治療的アプローチを見出すことが重要である。
病原性微生物は、宿主の防御機構を避ける必要があ
り、少ない栄養環境下で生育して感染を確立することが
できる。そうするためには、微生物の多くの“毒性（ビ
ルレンス）”遺伝子が必要である。
毒性遺伝子が古典遺伝学を用いて検出され、種々のア
プローチが、細菌毒性遺伝子の同定のためのトランスポ
ゾン突然変異を開発するために用いられた。例えば、突
然変異は、例えば鉄制御タンパク質の欠失等の定義され
た生理学上の欠点について選別されるか（Hollandら,19
92）、もしくは上皮細胞の浸透（Finlayら,1988）並び
にマクロファージ内での生存（Fieldsら,1989;Miller
ら,1989a;Groismanら,1989）を調べるアッセイで選別さ
れた。トランスポゾン突然変異は、感染した生きた動物
モデルにおいて変更された毒性についても試験された
（Millerら,1989b）。このアプローチは、感染の種々の
段階で重要な遺伝子が同定される利点を備えているが、
毒性に対する変更について個々に広い範囲の突然変異を
調べる必要性により厳しく限定される。Millerら（1989
b）は、８〜10匹のマウスのグループを用い、種々の突
然変異体で95の別個のグループを経口的に感染させ、76
0〜950匹のマウスを用いた。極端に多くの動物が必要に
なるために、毒性遺伝子について細菌ゲノムの包括的な
選別は不可能である。
最近、感染中に特異的に誘発されるサルモネラ（Salm
onella）遺伝子を積極的に選別する遺伝システム（in v
ivo発現技術［IVET］）が記載された（Mahanら,199
3）。この技術は、感染工程における特定の段階に発現
される遺伝子を同定する。しかしながら、転写後に制御
される毒性遺伝子を同定せず、さらに重要なことに、同
定された遺伝子（類）が実際に感染工程に必要なのか、
あるいは寄与しているのかについての情報を提供しな
い。
LeeとFalkow（1994）Methods Enzymol.236,531−545
は、高進入性（hyperinvasive）突然変異を単離するこ
とによって、in vitroにおいて、Salmonellaの哺乳動物
細胞への進入に影響を与えるファクターを同定する方法
を記載している。
WalshとCepko（1992）Science 255,434−440は、ラッ
トの大脳皮質の発達中における大脳皮質始原細胞の空隙
位置を追跡する方法を記載している。WalshとCepkoの方
法は、独特の核酸配列を含むタグ（tag）とLacZ遺伝子
を使用するが、使用可能な突然変異体もしくは遺伝子
が、これらの方法によって検出されるという示唆はな
い。
国際公開第94/26933およびSmithら（1995）Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 92,6479−6483は、既知の遺伝子、もし
くは、いくつかの配列情報が利用できる少なくとも一つ
のDNA分子の機能的領域の同定に向けられた方法を記載
している。
Groismanら（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,1033
−1037は、Salmonellaに特異的な分子的、機能的および
進化的分析を記載している。
いくつかの毒性遺伝子は、病原性微生物、例えば、Es
cherichia coli,Salmonella typhimurium,Salmonella t
yphi,Vibrio cholerae,Clostridium botulinum,Yersini
a pestis,Shigella flexneriおよびListeria monocytog
enesについて既に知られているが、どの場合にも、全体
の比較的少数しか同定されていない。
Salmonella typhimuriumがマウスに引き起こす疾患
は、腸チフスの良好な実験モデルを提供する（Carterと
Collins,1974）。Salmonella毒素に影響する約42の遺伝
子が、これまでに同定されている（GroismanとOchman,1
994）。これらは、予想された毒性遺伝子の全体数の約1
/3を示す（GroismanとSaier,1990）。
本願発明の目的は、効率よく、環境に対する微生物の
適応に係る遺伝子を同定すること、特に病原性微生物の
さらなる毒性遺伝子を同定することである。さらなる目
的は、毒性遺伝子を同定することに用いられる実験動物
の数を低減することである。本願発明のさらなる目的
は、ワクチン、および毒性を低減する薬剤を選別する方
法を提供することである。
発明の要約 本発明の第一の態様は、特定の環境に対する適応が低
減した微生物を同定する方法を提供することであり、以
下の工程を含む。
（１）それぞれの変異体が異なるマーカー配列を含むよ
うに、独特のマーカー配列を含む核酸を備えた遺伝子を
挿入不活性化することによって、独立に変異した複数の
微生物、もしくはその微生物のクローンを用意し、 （２）工程（１）で調製した各変異体の貯蔵サンプルを
個々に用意し、個々の変異体から独特のマーカー配列を
含む個々に貯蔵された核酸を用意し、 （３）工程（１）で調製した複数の変異体を前記特定の
環境に導入し、生育可能な微生物を前記環境下で生育さ
せ、 （４）前記環境から微生物もしくはその選択された部分
を回収し、回収された微生物から核酸を単離し、 （５）工程（４）で単離された核酸中のあらゆるマーカ
ー配列を、工程（２）で貯蔵した各変異体の独特のマー
カー配列と比較し、かつ、 （６）工程（４）で単離されたいずれのマーカー配列も
含まない個々の変異体を選択する。
しかして、この方法は、環境下で増殖する能力が低減
した微生物を同定するネガティブ選択を用いる。
微生物は多くの種々の環境下で生育することができ、
特定の遺伝子およびそれらの産物が、微生物を特定の環
境に適応させることが知られている。例えば、病原性細
菌もしくは病原性真菌等の病原性微生物が宿主中で生存
していくためには、一つ以上の毒性遺伝子の産物が必要
である。それゆえ、本願発明の好ましい実施態様では、
微生物を特定の環境に適応させる微生物の遺伝子が、毒
性遺伝子である。
都合良く、特定の環境は、植物や動物等の分化した多
細胞生物である。多くの細菌および真菌が植物に感染す
ることが知られており、毒性遺伝子の存在もしくは毒性
遺伝子からの発現により、植物の内部に生存して疾患を
引き起こすことが可能である。特定の環境が植物である
場合の適切な微生物は、特にグループに腫瘍（虫こぶ）
を形成する細菌Agrobacterium tumefaciens;Erwinia am
ylovara;広範囲の植物に枯れ（wilt）を生じるPseudomo
nas solanacearum;豆類に疾患を引き起こすRhizobium l
eguminosarum;柑橘類の果物に癌腫病を引き起こすXanth
omonas campestris p.v.citriを含み、かつ、ライスブ
ラスト病（rice blast disease）を引き起こす真菌Magn
aporthe grisea;種々の植物病を引き起こすFusarium sp
p.;Erisyphe spp.;Colletotrichum gloeosporiodes;穀
類および草類に根および頂点の疾患を引き起こすGaeuma
nnomyces graminis;Glomus spp.,Laccaria spp.;Leptos
phaeria maculans;Phoma tracheiphila;Phytophthora s
pp.,Pyrenophora teres;Verticillium alboatrumおよび
V.dahliae;およびMycosphaerella musicola並びにM.fij
iensisを含む。以下により詳細に記載するように、微生
物が真菌である場合には、そのライフサイクルに単相
（a haploid phase）が必要である。
同様に、細菌、真菌、原生動物亜界およびトリパノソ
ーマ類を含む多くの微生物は、動物、特にヒトを含む哺
乳動物に感染することが知られている。動物内部におけ
る微生物の存在および微生物が疾患を引き起こす能力
は、大部分が毒性遺伝子の存在および毒性遺伝子からの
発現に依存している。適切な細菌は、特にB.pertussis
等のBordetella spp.、特にC.jejuni等のCampylobacter
spp.、特にC.botulinum等のClostridium spp.、特にE.
faecalis等のEnterococcus spp.、特にE.coli等のEsche
richia spp.、特にH.DucreyiおよびH.influenzae等のHa
emophilus spp.、特にH.pylori等のHelicobacter sp
p.、特にK.pneumoniae等のKlebsiella spp.、特にL.pne
umophila等のLegionella spp.、特にL.monocytogenes等
のListeria spp.、特にM.smegmatisやM.tuberculosis等
のMycobacterium、特にN.gonorrhoeaeやN.meningitidis
等のNeisseria spp.、特定のPs.aeruginosa等のPseudom
onas spp.、Salmonella spp.、Shigella spp.、特にS.a
ureus等のStaphylococcus spp.、特にS.pyogenesやpneu
moniae等のStreptococcus spp.、特にY.pestis等のVibr
io spp.やYersinia sppを含む。これらの細菌の全て
が、ヒトに疾患を引き起こし、疾患の動物モデルも存在
する。しかして、これらの細菌を本願発明の方法に用い
た場合には、特定の環境としては、感染することがで
き、そこで疾患を引き起こす動物である。例えば、Salm
onella typhimuriumがマウスを感染するために用いられ
た場合には、マウスは、ヒトで腸チフスのモデルとして
役立つ疾患を生じる。Staphylococcus aureusは、マウ
スに菌血症と腎臓膿瘍形成を引き起こし（Albusら（199
1）Infect.Immun.59,1008−1014）、ウサギに心内膜炎
を引き起こす（PerlmanとFreedman（1971）Yale J.Bio
l.Med.44,206−213）。
真菌もしくは高等真核寄生虫は、その生涯の内の関連
部分（環境下での生育等）で単相体であることが必要で
ある。好ましくは、DNA−仲介組み込み形質転換システ
ム（a DNA−mediated integrative transformation sys
tem）が利用でき、微生物がヒト病原体である場合に
は、都合良くヒトの疾患の動物モデルが利用できるもの
である。ヒトに対して病原性のある適切な真菌は、ある
Aspergillus spp.（例えばA.fumigatus等）、Cryptococ
cus neoformansとHistoplasma capsulatumを含む。明ら
かに上記真菌は単相を備えており、DNA−仲介組み込み
形質転換システムを利用することができる。感染中に単
相を備えた寄生虫であるToxoplasmaも利用することがで
きる。細菌は単相体ゲノムを有する。
ヒト疾患の動物モデルは、動物がマウス、ラット、ウ
サギ、イヌもしくはサルがしばしば利用される。動物が
マウスであると好ましい。ヒト疾患の動物モデルを用い
て本願発明の方法によって検出された毒性遺伝子は、明
らかにヒトにおける微生物の毒性を決定する遺伝子と言
えそうである。
本願発明の方法で使用するのに特に好ましい微生物
は、Salmonella typhimurium,Staphylococcus aureus,S
treptococcus pneumoniae,Enterococcus faecalis,Pseu
domonas aeruginosaおよびAspergillus fumigatusであ
る。
本願発明の好ましい実施態様を以下に記載する。
独特のマーカー配列を含む核酸は、以下のように調製
される。二本鎖DNA配列“タグ（tags）”の複合プール
を、オリゴヌクレオチド合成およびポリメラーゼチェー
ン反応（PCR）を用いて作製する。各DNA“タグ”は、約
20〜80bp、好ましくは約40bpの独特の配列を備え、その
配列には約15〜30bp、好ましくは約20bpの“腕”が隣接
しており、これは全ての“タグ”に共通である。独特の
配列のbpの総数は、大きな数の独特の配列が、ランダム
オリゴヌクレオチド合成によって調製されるのに十分な
ものであるが、PCRと抵触する二次構造を形成するほど
大きくないものである。同様に、腕の長さは、PCRでオ
リゴヌクレオチドの効率的な開始をするに十分なものと
すべきである。
オリゴヌクレオチドの5'末端の配列は、増幅されるべ
き標的配列に適合する必要がないことはよく知られてい
る。
“プライマーダイマー”と称される人為的産物の形成
を促進するかもしれないので、通常、PCRプライマー
は、特にその3'末端において、互いに２塩基より長い相
補的構造を含まない。二つのプライマーの3'末端がハイ
ブリダイズする場合、“プライマー鋳型（primed templ
ate）”複合体を形成してしまい、プライマーの伸長に
より、“プライマーダイマー”と称される短い二重産物
を生じる。
内在性二次構造は、プライマーにおいては避けるべき
である。対称的PCR（symmetric PCR）では、一つの塩基
だけで長い鎖を形成することなく、Ｇ＋Ｃ含量が両方の
プライマーに対して40−60％であることがしばしば推奨
される。DNAプローブハイブリダイゼーションの研究と
関連して用いられる古典的溶解温度計測により、しばし
ば、所定のプライマーが特異的温度でアニールするこ
と、もしくは72℃の伸長温度が早まってプライマー／鋳
型ハイブリッドを分離することが予想される。実際に
は、ハイブリッドは、簡単なTm計測によって一般に予想
されるよりもPCR工程でより効果的である。
最適なアニーリング温度は、経験的に決められ、かつ
予想より高くても良い。Taq DNAポリメラーゼは、37−5
5℃の領域で活性を備えるため、プライマー伸長がアニ
ーリング段階で起こり、ハイブリッドが安定化される。
プライマー濃度は通常の（対称的な）PCRの場合と同じ
であり、典型的には0.1−〜１−μＭの範囲内である。
独特のマーカー配列を含有する核酸を形成するため
に、“タグ”は、トランスポゾンもしくはトランスポゾ
ン様部位にリゲートされる。都合良く、トランスポゾン
は、“ヘルパー”生物体中のプラスミドとして保持され
るが、本願発明の方法の微生物への伝達後には失われる
自殺ベクター（a suicide vector）に保有される。例え
ば、“ヘルパー”生物体があるEscherichia coliの株で
あり、微生物をSalmonellaとすることができ、伝達を接
合伝達（a conjugal transfer）とすることができる。
トランスポゾンは伝達後に失われ得るが、ある割合の細
胞では、例えこの方法で用いられた微生物のゲノムに、
独特のタグを伴ってランダムに組み込まれるとしても、
転位を受ける。トランスポゾンもしくはトランスポゾン
様部位が選択されうることが最も好ましい。例えば、Sa
lmonellaの場合には、カナマイシン耐性遺伝子をトラン
スポゾン中に存在させることができ、未接合体（exconj
ugants）はカナマイシン含有培地で選別される。独特の
マーカーを含む核酸に機能遺伝子を備えた感受性のある
細胞において、栄養素要求性マーカーを補うこともでき
る。この方法は、真菌が用いられる場合に特に便利であ
る。
好ましくは、補足機能的遺伝子は受容個体微生物と同
じ種から誘導されたものではなく、非ランダムな組み込
みが起こっても良い。
また、第一の所定の条件においては、本発明の第一の
態様の方法で用いられる微生物のエピソームに（染色体
の一部としてではなく）維持されたベクターにトランス
ポゾンもしくはトランスポゾン様部位が保有されている
が、第二の所定の条件に変えた時に、エピソームが細胞
の選択が維持できなくなり、トランスポゾンもしくはト
ランスポゾン様部位が転位を受け、それを介して、本発
明の方法で用いられた微生物のゲノムに、独特のタグと
共にランダムに組み込まれることが、特に都合がよい。
一度エピソームベクターを保有する微生物が作製されれ
ば、第一の条件から第二の条件に微生物（もしくはその
クローン）の条件を変えることによって、そのたび毎に
転位が選別もしくは誘導され、トランスポゾンを微生物
のゲノムの異なる部位に組み込むことができるので、こ
の特に便利な実施態様は有利である。しかして、一端、
微生物のマスターコレクションを作製すれば、その各メ
ンバーが、エピソームベクター上に保有されたトランス
ポゾンもしくはトランスポゾン様部位に独特のタグ配列
を含み（第一の所定の条件下において）、ランダム挿入
変異体のプールを生成するために繰り返し用いられ、そ
の各々が異なるタグ配列を含有する（すなわち、プール
内で独特）。この態様は、（ａ）この方法の工程（１）
において、多数（“プール”）の独立に変異した微生物
を生成するのに必要な操作の手数および複雑さを低減で
きること；並びに、（ｂ）種々のタグの総数が、この方
法の工程（１）における多数の微生物中の微生物の総数
と同じであることのみを必要とすることから、特に使用
することができる。ポイント（ａ）は、トランスポゾン
変異を行うことがより困難な生物（例えば、Staphyloco
ccus aureus）おける本発明の使用をより簡単なものと
し、ポイント（ｂ）は、特に良好なハイブリダイゼーシ
ョン特性を備えたタグ配列を選別することができ、その
ため質の調節を容易にすることができることを意味す
る。以下に、より詳細に記載するように、“プール”サ
イズは、都合良く100−200独立変異微生物とすることが
でき、それゆえ、微生物のマスターコレクションは都合
良く１または２枚の96ウェルミクロタイタープレートに
貯蔵される。
特に好ましい実施態様では、第一の所定の条件は、第
一の特定の温度、すなわち25〜32℃の温度範囲であっ
て、約30℃が最も好ましく、第二の所定の条件は、第二
の特定の温度、すなわち35〜45℃の温度範囲であって、
42℃が最も好ましい。さらに好ましい実施態様では、第
一の所定の条件には、ストレプトマイシン等の抗生物質
が存在しかつ第二の所定の条件には前記抗生物質が存在
せず；あるいは、第一の所定の条件には抗生物質が存在
せずに、第二の所定の条件には前記抗生物質が存在す
る。
グラム陰性細菌のゲノムに組み込むのに適したトラン
スポゾンは、Tn5、Tn10およびそれらの誘導体を含む。
グラム陽性細菌のゲノムに組み込むのに適したトランス
ポゾンは、Tn916およびその誘導体もしくはアナログを
含む。Staphylococcus aureusを用いた使用に特に適し
たトランスポゾンは、Tn917（Cheungら（1992）Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 89,6462−6466）およびTn918（Albus
ら（1991）Infect.Immun.59,1008−1014）を含む。
トランスポゾンが、Camilliら（1990）J.Bacteriol.1
72,3738−3744に記載されたTn917誘導体の特性を備え、
かつ、pE194Ts等の熱感受性ベクター（Villafaneら（19
87）J.Bacteriol.169,4822−4829）によって保有されれ
ば、特に好ましい。
トランスポゾンは、遺伝子を挿入的に不活性化するの
に便利であるが、他の何らかの既知の方法、もしくは将
来開発される方法も使用することができると考えること
ができる。特にStreptococcus等のある細菌において、
遺伝子を挿入的に不活性化するさらに便利な方法は、S.
pneumoniaeについてMorrisonら（1984）J.Bacteriol 15
9,870に記載された挿入複製変異誘発（insertion−dupl
ication mutagenesis）を用いることである。一般的な
方法を、特に細菌等の他の微生物に適用することもでき
る。
真菌では、挿入突然変異は、“タグ”および、好まし
くは例えばヒグロマイシンＢもしくはフレオマイシンに
対する耐性をコードする選択マーカーを備えたDNAフラ
グメントもしくはプラスミドを用いた形質転換によって
作製される（Smithら（1994）Infect.Immunol.62,5427
−5254参照）。制限酵素仲介組み込みを用いた糸状菌の
ゲノムにヒグロマイシンＢ耐性をコードするDNAフラグ
メントをランダム、単一組み込み（REMI;SchiestlとPet
es（1991）;Luら（1994）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,1
2649−12653）が知られている。
真菌の簡単な挿入突然変異技術は、参照としてここに
取り込んだSchiestlとPetes（1994）に記載されてお
り、例えば、酵母のTy部（Ty elements）およびリボソ
ームDNAの使用を含む。
トランスポゾンもしくは他のDNA配列の不規則な組み
込みにより、各突然変異体において異なる遺伝子が挿入
的に不活性化され、かつ各変異体が異なるマーカー配列
を含む、多数の独立に変異した微生物を単離することが
できる。
各ウェルが異なる変異微生物を含むように、挿入変異
体のライブラリーをウェルが形成された（welled）ミク
ロタイター皿に並べる。各変異体微生物の独特のマーカ
ー配列を含むDNA（都合良く、クローンからの全DNAを用
いる）を貯蔵する。都合良く、ミクロタイター皿から微
生物のサンプルを除去し、核酸ハイブリダイゼーション
膜（ニトロセルロースもしくはナイロン膜等）にスポッ
トし、アルカリで微生物を溶解して、膜に核酸を固定化
することによってなされる。しかして、ウェルが形成さ
れたミクロタイター皿の内容のレプリカを作製する。
ウェルが形成されたミクロタイター皿の微生物のプー
ルを作製し、DNAを抽出する。このDNAを、“タグ”に隣
接した共通の“腕”にアニールするプライマーを用いた
PCR用の標的として用い、増幅されたDNAを32P等でラベ
ルする。PCRの産物は、ウェルが形成されたミクロタイ
ター皿のレプリカの参照ハイブリダイゼーションパター
ンを提供する個々の変異体から貯蔵されたDNAをプロー
ブするために用いられる。これは、実際に、個々の微生
物がマーカー配列を含むこと、並びにマーカー配列が効
率的に増幅およびラベルされ得ることをチェックするも
のである。
トランスポゾン変異体のプールを特定の環境に導入す
る。都合良く、96ウェルミクロタイター皿が用いられ、
このプールは96のトランスポゾン変異体を含有する。し
かしながら、プールについての下限は二つの変異体であ
り、プールサイズに対する理論的な上限はないが、以下
に記載するように、上限は変異体が導入される環境に応
じて決定される。
微生物が前記特定の環境に導入されると、可能な微生
物は環境の中で生育する。微生物が環境に残る時間の長
さは、微生物および環境の性質によって決まる。適切な
長さの時間後で、微生物を環境から回収し、DNAを抽出
し、そのDNAを“タグ”に隣接する“腕”にアニールす
るプライマーを用いたPCRの鋳型として用いる。PCR産物
を32P等でラベルし、ウェルが形成されたミクロタイタ
ー皿から複製された個々の変異体から貯蔵されたDNAを
プローブするために用いる。環境から回収された微生物
から単離されたDNAから生成したプローブを用いて、弱
くハイブリダイズする、あるいは全くハイブリダイズし
ない、貯蔵されたDNAを同定する。これらの非ハイブリ
ダイズDNA群は、その特定の環境に対する適応が、トラ
ンスポゾンもしくは他のDNA配列の挿入によって弱めら
れた変異体に対応する。
特に好ましい実施態様では、“腕”は、“タグ”に匹
敵するラベルを、全くあるいはほとんど具備しない。例
えば、PCRプライマーを、Ｇ残基を全く含まないか、あ
るいは一つだけ含むように設計し、32Pラベルヌクレオ
チドをdCTPとした場合、全くあるいは一つのラジオラベ
ルされたＣ残基がそれぞれの“腕”に取り込まれるが、
より多くの数のラジオラベルされたＣ残基が“タグ”に
取り込まれる。“タグ”が、“腕”より、少なくとも10
倍以上、好ましくは20倍以上、さらに好ましくは50倍以
上のラベルを取り込むことが好ましい。都合良く、適切
な制限酵素を用いて“腕”が“タグ”から除去すること
ができ、この部位をプライマー設計の際に取り込んでも
良い。
上述したように、本願発明の特に好ましい実施態様
は、微生物が病原性微生物であり、特定の環境が動物で
ある。この態様では、動物に導入された変異体のプール
のサイズは、（ａ）動物中で生存できそうな変異体の細
胞数（毒性遺伝子が不活性化されていないと仮定する）
と（ｂ）微生物の全接種数によって決まる。（ａ）の数
があまりに低いと、誤った陽性結果を生じ、（ｂ）の数
があまりに高いと、変異体が所望の方法で生育するチャ
ンスを得る前に動物が死んでしまうことがある。（ａ）
の細胞数は、用いられた各微生物について決められる
が、好ましくは50以上、さらに好ましくは100以上であ
る。
単一の動物に導入される種々の変異体の総数は、好ま
しくは50〜500の間であって、約100とするのが都合良
い。全体の接種が106細胞を越えないことが望ましいが
（好ましくは105細胞）、微生物と動物に依存してこの
量の上下で接種のサイズを変えても良い。
特に都合の良い方法では、単一の動物当たり100の異
なる変異体をそれぞれ1000細胞含有する105の接種が用
いられる。この方法では、100の変異体を選別するのに
少なくとも100体の動物を必要とした従来技術の方法と
比較して、一体の動物が100の変異体を選別するために
用いられると考えられる。
しかしながら、少なくとも二つを調べて（一つはこの
方法の信頼性をチェックするするためのレプリカ）、３
番目をバックアップとして確保するように、同じプール
の変異体で３体の動物を接種すると都合がよい。それで
も、この方法は、使用された動物の数において30倍以上
の節約ができる。
プールの変異体を動物に導入してから、微生物を回収
するまでの時間は、使用された微生物と動物で変えても
よい。例えば、動物がマウスであり、微生物がSalmonel
la typhimuriumである場合には、接種から回収までの時
間は約３日である。
本発明の一つの実施態様では、微生物を、工程（４）
の導入部位から離れた部位で工程（５）において環境か
ら回収するので、調べられる毒性遺伝子は、二つの部位
の間に広がった微生物に係るものを含む。
例えば、植物では、茎の傷口もしくは葉の一部に導入
し、疾患状態が示されている葉の別の部位から微生物を
回収しても良い。
動物の場合では、微生物を、経口、腹腔内、静脈内も
しくは鼻腔内に導入し、後に脾臓等の内蔵器官から回収
しても良い。ある遺伝子は、別の経路ではなくある経路
が感染の確立に必要とされるので、経口投与により同定
された毒性遺伝子と腹腔内投与により同定されたものを
比較することは有益であるかもしれない。Salmonellaが
腹腔内に導入されることが好ましい。
毒性遺伝子を同定するために用いられる他の好ましい
環境は、培養の動物細胞（特にマクロファージと表皮細
胞）および培養の植物細胞である。培養の細胞を用いる
ことはそれ自身の範囲において有益であるが、同様に環
境として全体的な動物もしくは植物の使用をも補足する
であろう。
環境が動物の体の一部であることも好ましい。所定の
宿主−寄生虫相互作用の範囲内で、種々の器官および組
織、並びにパイエル板等のその一部を含む多数の種々の
環境が可能である。
環境から回収された個々の微生物（すなわち細胞）の
数は、環境に導入された種々の変異体の数の、少なくと
も２倍、好ましくは少なくとも10倍、さらに好ましくは
100倍であるべきである。例えば、動物が100の異なる変
異体で接種された場合には、約10000の個々の微生物お
よび単離されたマーカーDNAが回収されるべきである。
さらに好ましい実施態様は以下の工程を含む： （1A）工程（１）で生成された複数の変異体から栄養素
要求体を除去する；もしくは、 （6A）工程（６）で選別された変異体が栄養素要求体で
あるか否かを調べる；あるいは、 （1A）と（6A）の両方である。
栄養素要求体（すなわち、野生型もしくは原栄養体に
は必要とされない成長因子を必要とする変異微生物）
と、微生物を特定の環境に適応させる遺伝子が不活性化
された変異微生物を区別することが好ましい。これは、
工程（１）および（２）の間、もしくは工程（６）の後
になされるのが都合が良い。
栄養素要求体は、毒性遺伝子が同定される際に除去さ
れないことが好ましい。
本願発明の第二の態様は、微生物を特定の環境に適応
させる遺伝子を同定する方法を提供し、この方法は、本
発明の第一の態様の方法に続いて、以下の付加的な工
程： （７）工程（６）で選別された個々の変異体から挿入不
活性化遺伝子もしくはその一部を単離する工程 を含む。
独特のマーカーを含む遺伝子の単離方法は、分子生物
学の分野で周知である。
さらに好ましい実施態様は、さらに以下の付加的工
程： （８）工程（７）で単離された挿入不活性化遺伝子もし
くはその一部をプローブとして用いて対応する野生型遺
伝子を野生型微生物から単離する工程 を含む。
遺伝子プロービングの方法は、分子生物学の分野で周
知である。
本願発明の実施における使用に適した分子生物学的方
法は、ここに参照として取り込まれたSambrookら（198
9）に記載されている。
微生物が動物にとって病原性の微生物であり、遺伝子
が毒性遺伝子であり、トランスポゾンが挿入的に遺伝子
を不活性化するために用いられた場合には、トランスポ
ゾンの外側を切断する制限酵素で工程（６）で選択され
た個々の変異体からのゲノムDNAを切断し、プラスミド
にトランスポゾンを含有するサイズ分画DNAをリゲート
し、かつ、プラスミドではなくトランスポゾンによって
授けられた抗生物質耐性に基づいてプラスミド組換え体
を選別することによって、毒性遺伝子がクローン化され
ることが都合がよい。トランスポゾンに隣接する微生物
ゲノムDNAは、トランスポゾンの末端領域にアニールす
る二つのプライマー、および、プラスミドのポリリンカ
ー配列の近くにアニールする二つのプライマーを用いて
配列決定される。トランスポゾンが既知の毒性遺伝子を
中断しているか否かを調べるために、この配列を、DNA
データベース調査にかける。しかして、この方法で得ら
れた配列を、EMBLおよびGenBank等の一般に利用できる
データベースに存在する配列と比較する。最後に、中断
された配列が新規の毒性遺伝子にあることがわかった
ら、この変異を新規の遺伝的バックグラウンドに転移さ
せ（例えば、Salmonellaの場合であればファージP22−
仲介形質導入による）、無毒性の表現型が転位によるも
のであって、二次的な変異によるものではないことを確
かめるために、変異体株のLD50を調べる。
微生物の毒性遺伝子の全てを検出するために選別され
た個々の変異体の数は、微生物のゲノムの遺伝子数に依
存する。例えば、大多数の毒性遺伝子を検出するため
に、3000−5000のSalmonella typhimuriumの変異体が選
別される必要があるが、Salmonellaより大きなゲノムを
有するAspergillus spp.の場合には、約20000変異体が
選別される。約４％の非必須S.typhimurium遺伝子が毒
性に必要であると考えられ（GrossmanとSaier,1990）、
もしそうであれば、S.typhimuriumゲノムは、約150の毒
性遺伝子を含む。しかしながら、本願発明の方法は、よ
り速く、より簡単で、より実用向きの、毒性遺伝子を同
定する経路を提供する。
本願発明の第三の態様は、本願発明の第一の態様の方
法を用いて得られた微生物を提供する。
このような微生物は、特定の環境において生存に適応
しない特性を備えているために、有益である。
好ましい実施態様では、病原性微生物が、宿主生物
（環境）において生存に適応せず、動物、特に哺乳動
物、さらにはヒトに対して病原性である微生物の場合に
は、本願発明の方法で得られた変異体はワクチンに使用
できる。変異体が無毒性であれば、それゆえ患者に投与
するのに適していると推定されるが、抗原性であって防
御的免疫応答を引き起こすことが予想される。
さらに好ましい実施態様では、本発明の方法で得られ
た、宿主生物における生存に適していない病原性微生物
は、好ましくは他の病原の抗原性エピトープを発現する
のに適したDNA配列の導入によって修飾される。この修
飾された微生物は、他の病原のワクチンとして作用する
ことができる。
本願発明の第四の態様は、本願発明の第二の態様の方
法を用いて同定された遺伝子に変異を有する微生物を提
供する。
しかして、本願発明の第三の態様の微生物は有益では
あるけれども、同定された遺伝子に変異が特異的に導入
されることが好ましい。好ましい実施態様では、特に微
生物がワクチンに使用される場合には、遺伝子の変異は
削除もしくはフレームシフト変異、あるいは実質的に復
帰不可能な他の突然変異である。そのような遺伝子特異
的突然変異は、自律性レプリコン（プラスミドもしくは
ウイルスゲノム等の）上の変異遺伝子のコピーを微生物
中に導入すること、並びに、微生物のゲノムの遺伝子の
コピーに変異を導入する相同的組換えに頼ること等の標
準的な方法を用いて作製される。
本願発明の第五および第六の態様は、ワクチンに使用
するのに適した微生物、並びに、適切な微生物および薬
学的に許容されるキャリアーを含むワクチンを提供す
る。
適切な微生物は、上述した無毒性の変異体である。
患者の能動免疫が好ましい。このアプローチでは、一
つ以上の変異微生物を適切なアジュバントおよびキャリ
アーを含む免疫学的製剤に調製し、既知の方法で患者に
投与する。適切なアジュバントは、完全もしくは不完全
フロントアジュバント、ムラミルジペプチド、欧州特許
出願第109942号、180564号および231039号の“Iscom
s"、水酸化アルミニウム、サポニン、DEAE−デキストラ
ン、中性油（ミグリオール（miglyol））、植物油（ピ
ーナツ油）、リポソーム、プルロニックポリオール（Pl
uronic polyols）もしくはリビ（Ribi）アジュバントシ
ステムを含む（例えば、独国特許公開第2189141号公報
参照）。“プルロニック”は、登録商標である。免疫さ
れる患者は、微生物の毒性型によって引き起こされる疾
患から保護される必要のある患者である。
本願発明の上記無毒性微生物もしくはその製剤は、経
口および非経口（例えば皮下もしくは筋肉内）注入を含
む従来の方法で投与することができる。処置は、一回の
投与もしくは一定時間で複数回の投与からなるものでも
よい。
本願発明の無毒性微生物は、単独で投与することもで
きるが、一つ以上の許容できるキャリアーと共に、薬学
的製剤として存在することが好ましい。キャリアー
（類）は、本願発明の無毒性微生物に適合するという意
味で、“許容できる”ものでなければならず、また、宿
主に対して有害であってはならない。典型的に、キャリ
アーは、無菌かつ発熱物質を含まない水または食塩水で
ある。
本願発明のワクチンは、その微生物成分に依存して、
ヒトの医学および獣医学の分野で使用することができる
と考えられる。
微生物によって引き起こされた疾患は、家畜等の多く
の動物において知られている。適切な無毒性微生物、特
に無毒性細菌を含む場合には、本発明のワクチンは、ヒ
トに使用できるばかりでなく、例えば、ウシ、ヒツジ、
ブタ、ウマ、イヌおよびネコ、並びに、ニワトリ、シチ
メンチョウ、アヒルおよびガチョウ等の家禽等にも使用
できる。
本願発明の第七および第八の態様は、本願発明の第二
の態様の方法によって得られた遺伝子、並びにそれらに
コードされたポリペプチドを提供する。
“遺伝子”によって、ポリペプチドをコードするDNA
の領域のみではなく、転写、翻訳、並びにある微生物で
はRNAのスプライシングを制御するDNAの領域等のDNAの
制御領域も含む。しかして、遺伝子は、プロモーター、
転写ターミネーター、リボソーム結合配列、並びにある
生物えはイントロンおよびスプライス認識部位を含む。
典型的に、工程７で得られた不活性化された遺伝子の
配列情報が誘導される。都合良く、トランスポゾンの末
端に近い配列は、シークエンシングプライマーのハイブ
リダイゼーション部位として用いられる。誘導された配
列または不活性化遺伝子そのものに隣接したDNA制限フ
ラグメントは、野生型生物から、対応する野生型遺伝子
を同定および単離するためのハイブリダイゼーションプ
ローブを作製するために用いられる。
関連遺伝子ではなく、遺伝子が確実に得られるよう
に、ハイブリダイゼーションプロービングが厳密な条件
下でなされることが好ましい。“厳密”によって、遺伝
子が膜に固定化され、かつ、プローブ（この場合、長さ
が＞200ヌクレオチド）が溶液の形態をとる場合に、遺
伝子がプローブにハイブリダイズし、かつ固定された遺
伝子／ハイブリダイズしたプローブを65℃で10分間、0.
1xSSCで洗浄することを意味する。SSCは、0.15M NaCl/
0.015Mクエン酸ナトリウムである。
Salmonella毒性遺伝子をクローニングするのに好まし
いプローブ配列は、図５および６に示され、かつ、実施
例２に記載されている。
特に好ましい実施態様では、Salmonella毒性遺伝子
が、図５および６に示され、実施例２に記載された配列
を含む。
さらに好ましくは、遺伝子は、図11および12に示され
た配列に含まれる配列、またはその少なくとも一部であ
り、本願発明の第二の態様の方法で同定されたものであ
る。図11および12に示された配列は、毒性遺伝子クラス
ター２（VGC2）と称されるSalmonella typhimuriumの遺
伝子クラスターの一部である。トランスポゾン挿入の位
置は配列内部に示唆されており、これらのトランスポゾ
ン挿入は、生物の毒性決定因子を不活性化する。以下、
特に実施例４により完全に開示するように、本願発明の
第二の態様の方法がSalmonella typhimuriumの遺伝子の
毒性を同定するのに用いられる場合には、多くの核酸挿
入（それゆえ、同定された遺伝子）がゲノムの比較的小
さい部分に密集される。この領域、VGC2は、以下に記載
するように、本願発明の一部を形成する他の毒性遺伝子
を含む。
本願発明の方法で単離される遺伝子は、適切な宿主細
胞中で発現される。しかして、遺伝子（DNA）は、本願
発明のポリペプチドの発現および産生用の適切な宿主細
胞を形質転換するために用いられる発現ベクターを作製
するための、ここに含まれた教示の観点で修飾された既
知の技術に従って用いられる。このような技術は、Rutt
erらに1984年４月３日に交付された米国特許第4440859
号、Weissmanに1985年７月23日に交付された米国特許第
4530901、Crowlに1986年４月15日に交付された米国特許
第4582800号、Markらに1987年12月１日に交付された米
国特許第4677063号、Goeddelに1987年７月７日に交付さ
れた米国特許第4678751号、Itakura等に1987年11月３日
に交付された米国特許第4704362号、Murrayに1987年12
月１日に交付された米国特許第4710463号、Toole,Jrら
に1988年７月12日に交付された米国特許第4757006号、G
oeddelに1988年８月23日に交付された米国特許第476607
5号、およびStalkerに1989年３月７日に交付された米国
特許第4810648号に開示されたものを含み、これらの全
てを参照としてここに取り込む。
本願発明の化合物を構成するポリペプチドをコードす
るDNAは、適切な宿主に導入するために広い範囲の種々
の他のDNA配列に連結されても良い。伴うDNAは、宿主の
性質、宿主へのDNAの導入方法、並びにエピソームの維
持または組み込みが望まれるか否かに依存する。
一般的に、DNAは、発現に適した方向および正しい読
み枠でプラスミド等の発現ベクター中に挿入される。必
要であれば、DNAは所望の宿主に認識される適切な転写
および翻訳制御ヌクレオチド配列に連結されても良い
が、このような制御は一般的に発現ベクター中で利用で
きる。ベクターは、標準的な技術で宿主に導入される。
一般的に、宿主の全てがベクターによって形質転換され
るわけではない。それゆえ、形質転換した宿主細胞を選
別する必要がある。一つの選別技術は、抗生物質耐性等
の形質転換細胞における選択的特徴をコードする、何ら
かの必須制御部を備えたDNA配列を発現ベクター中に導
入することを含む。あるいは、このような選択的特徴の
遺伝子が別のベクターに存在してもよく、所望の宿主細
胞を共形質転換（co−transform）するのに用いられ
る。
本願発明の組換えDNAで形質転換された宿主細胞を、
ポリペプチドを発現させるために、ここに記載された技
術の観点で当業者に既知の十分な時間かつ適切な条件下
で培養し、ポリペプチドを回収する。
細菌（例えばE.coliおよびBacillus subtilis）、酵
母（例えばSaccharomyces cerevisiae）、糸状菌（例え
ばAspergillus）、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞
を含む多くの発現系が知られている。
ベクターが他の非原核細胞タイプにおける発現のため
に用いられる場合であっても、ベクターは、原核生物に
おける繁殖のためにCoIE1 ori等の原核レプリコンを含
む。また、ベクターは、それで形質転換された、E.coli
等の細菌宿主細胞における遺伝子の発現（転写および翻
訳）に方向付け得る真核プロモーター等の適切なプロモ
ーターを含むこともできる。
プロモーターは、RNAポリメラーゼを結合させ、転写
を引き起こすDNA配列によって形成された発現制御部で
ある。模範的細菌宿主に適合するプロモーター配列は、
本願発明のDNAセグメントの挿入に都合の良い制限部位
を含むプラスミドベクターに典型的に与えられる。
典型的な原核ベクタープラスミドは、Biorad Laborat
ories（Richmond,CA,USA）から利用できるpUC18、pUC1
9、pBR322およびpBR329、並びに、Pharmacia,Piscatawa
y,NJ,USAから利用できるpTrc99AおよびpKK223−３であ
る。
典型的な哺乳動物細胞ベクタープラスミドは、Pharma
cia,Piscataway,NJ,USAから利用できるpSVLである。こ
のベクターは、クローン化された遺伝子の発現を誘導す
るSV40後期プロモーターを用い、最も高いレベルの発現
は、COS−１細胞等のＴ抗原産生細胞に見出される。
誘導哺乳動物発現ベクターの例はpMSGであり、これも
Pharmaciaから利用できる。このベクターは、クローン
化遺伝子の発現を誘導するために、マウス乳房腫瘍ウイ
ルス長末端重複（the mouse mammary tumour virus lon
g terminal repeat）のグルココルチコイド誘導プロモ
ーターを利用する。
使用できる酵母プラスミドベクターは、pRS403−406
並びにpRS413−416であり、一般的に、Stratagene Clon
ing Systems,La Jolla,CA 92037,USAから利用できる。
プラスミドpRS403、pRS404、pRS405およびpRS406は酵母
組み込みプラスミド類（YIps（Yeast Integrating plas
mids））であり、酵母選択マーカーHIS3、TRP1、LEU2お
よびURA3を取り込む。プラスミドpRS413−416は酵母セ
ントロメアプラスミド類（YCps（Yeast Centromere pla
smids））である。
相補的付着末端を介してベクターにDNAを操作的に連
結するために、種々の方法が開発された。例えば、相補
的ホモポリマー管（complementary homopolymer tract
s）は、ベクターDNAに挿入されるようにDNAセグメント
に付加されうる。ベクターおよびDNAセグメントは、相
補的ホモポリマーテイル間の水素結合によって連結さ
れ、組換えDNA分子を形成する。
一つ以上の制限部位を含む合成リンカーは、DNAセグ
メントをベクターに連結する方法を提供する。前述した
エンドヌクレアーゼ制限切断により生成されたDNAセグ
メントは、バクテリオファージT4DNAポリメラーゼもし
くはE.coliDNAポリメラーゼＩで処置され、この酵素
は、その3'−5'エキソヌクレアーゼ活性で突き出した3'
一本鎖末端を除去し、その重合活性でへこんだ3'末端を
満たす。
それゆえ、これらの活性の組み合わせにより、平滑末
端DNAセグメントが生成される。平滑末端セグメント
は、バクテリオファージT4DNAリガーゼ等の平滑末端DNA
分子のリゲーションを触媒することができる酵素の存在
下で、大過剰のモル数のリンカー分子と共にインキュベ
ートされる。しかして、この反応の産物は、その末端に
重合リンカー配列を有するDNAセグメントである。これ
らのDNAセグメントは適当な制限酵素で切断され、このD
NAセグメントと適合する末端を生じる酵素で切断された
発現ベクターにリゲートされる。
種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を備えた合成リン
カーは、International Biotechnologies Inc,New Have
n,CN,USAを含む多数の源から商業的に利用することがで
きる。
本発明のポリペプチドをコードするDNAを修飾する望
ましい方法は、Saikiら（1988）Science 239,487−491
に記載されたポリメラーゼチェーン反応を使用すること
である。
この方法では、酵素によって増幅されるDNAには、そ
れ自身増幅DNAに取り込まれる二つの特異的オリゴヌク
レオチドプライマーが隣接する。前記の特異的プライマ
ーは、当該技術分野で知られた方法を用いて、発現ベク
ターにクローニングするために用いられる制限エンドヌ
クレアーゼ認識部位を含んでも良い。
遺伝子の変異形も、本願発明の一部を形成する。この
変異形が、本発明の方法で単離された遺伝子と少なくと
も70％の配列同一性、好ましくは少なくとも85％の配列
同一性、最も好ましくは少なくとも95％の配列同一性を
備えていることが好ましい。もちろん、置換、欠失およ
び挿入も許容されてもよい。一つの核酸配列と他との類
似性の程度は、the University of Wisconsin Computer
GroupのGAPプログラムを用いて調べることができる。
同様に、遺伝子にコードされたタンパク質の変異形が
含まれる。
“変異形”は、挿入、欠失および置換を含み、保存的
であっても非保存的であってもよいが、そのような変化
によりタンパク質の正常な機能は実質的に変更されない
ものである。
“保存的置換”とは、Gly,Ala;Val,Ile,Lue;Asp,Glu;
Asn,Gln;Ser,Thr;Lys,Arg;およびPhe,Tyr等の組み合わ
せを意味する。
このような変異形は、タンパク質工学および部位特異
的変異誘発の周知の方法を用いて作製することができ
る。
本願発明の第九の態様は、（１）本願発明の第二の態
様の方法で得られた遺伝子もしくは（２）この様な遺伝
子にコードされたポリペプチドの機能と抵触する化合物
を選別する工程を含む、特定の環境に適応する微生物の
能力を低減する化合物を同定する方法を提供する。
野生型細胞だけでなく本発明の方法で単離された遺伝
子を過剰産生する細胞にも影響する化合物の組ごとの選
別（Pairwise screens）は、本発明のこの態様の一部を
なす。
例えば、ある実施態様では、第一の細胞が野生型細胞
で、第二の細胞が、本願発明の方法で単離された遺伝子
を過剰発現するように作製されたSalmonellaである。ど
の化合物が野生型細胞だけでなく前記遺伝子を過剰発現
する細胞の生存能力もしくは生育を低減するのかを同定
するために、特定の環境における各細胞の生存能力およ
び／または生育を、試験される化合物の存在下で調べ
る。
遺伝子が毒性遺伝子であると好ましい。
例えば、一つの実施態様では、微生物（例えばS.typh
imurium）は、本願発明の第一の態様の方法によって同
定された毒性遺伝子を過剰発現するように作製される。
（ａ）“過剰発現”微生物と（ｂ）等価微生物（毒性遺
伝子を過剰発現しない）のいずれかを、培養の細胞を感
染するために用いられる。特定の試験化合物が毒性遺伝
子機能を選択的に阻害するか否かは、（ａ）過剰発現微
生物と（ｂ）等価微生物による宿主細胞の感染を妨げる
のに必要とされる試験化合物の量を評価することによっ
て決定される（少なくともある毒性遺伝子産物では、毒
性遺伝子産物に結合することによって、試験化合物がそ
れらを不活性化し、それ自身が不活性化されることが予
想される）。（ｂ）よりも（ａ）による感染を妨げるの
により多くの化合物が必要であれば、化合物が選択的で
あることを示唆する。微生物（例えば、Salmonella）が
ゲンタマイシン（宿主細胞を浸透しない）等の穏やかな
抗生物質によって細胞外に破壊され、かつ、微生物によ
る細胞の感染を妨げることにおける試験化合物の効果
を、前記細胞を溶解して、どれくらい多くの微生物が存
在するかを調べる（例えば寒天上にプレーティングす
る）と好ましい。
組ごとの選別および化合物の他の選別は、一般的にKi
rschとDi Domenico（1993）“治療能力を備えた天然産
物の発見（The Discovery of Natural Products with a
Therapeutic Potential）”（Ed,V.P.Gallo）、第６
章、177−221頁、Butterworths,V.K.（参照としてここ
に取り込む）に記載されている。
組ごとの選別は、遺伝的に関連した二つの株を用いて
化合物に対する相対的感受性を比較する多数の関連形式
で設計することができる。もし株が単一の座で異なるの
であれば、その標的に特異的な化合物は阻害剤に対する
各株の感受性を比較することによって同定することがで
きる。例えば、標的に特異的な阻害剤は、別の同質遺伝
子姉妹株（isogenic sister strain）と比較した場合
に、超感受性試験株（a super−sensitive test strai
n）に対してより活性である。寒天拡散形式では、化合
物を有する皿もしくはウェルを取り巻く阻害ゾーンの大
きさを測定することによって決定される。拡散のため
に、化合物の連続的な濃度勾配が形成され、阻害剤に対
する株の感受性は、皿もしくはウェルからゾーンの縁ま
での距離に比例する。通常の抗菌剤、もしくは所望以外
の活性の形式を備えた抗菌剤が、二つの株に対して同様
の活性を備えているように一般的に観察される。
組みの株を含む、他のタイプの分子遺伝学的選別は、
クローン化された遺伝子産物が対称株と比べて一つの株
に過剰発現される。この種のアッセイの原理は、通常量
の標的タンパク質を含む、同質遺伝子株よりクローン化
された遺伝子産物に特異的な阻害剤に対して、標的タン
パク質の向上した質を含む株が、より耐性であるべきで
ある。寒天拡散アッセイでは、特異的化合物を取り巻く
ゾーンサイズが、他の同質遺伝子株と比べて標的タンパ
ク質を過剰発現する株においてより小さいことが期待さ
れる。
化合物のさらなるあるいは別の選別は、以下の工程で
達成される： 1. 本願発明の第一の態様の方法を用いて得られた変異
体微生物を対照として用いる（例えば無毒性等の所定の
表現型を供えている）。
2. 試験されるべき化合物を野生型微生物と混合する。
3. 野生型微生物を環境に導入する（試験化合物を伴う
もしくは伴わない）。
4. 野生型微生物が環境に適応できないならば（化合物
処置後、もしくは化合物存在下）、その化合物は、特定
の環境に適応もしくは生存する、微生物の能力を低減す
るものである。
環境が動物の体であり、微生物が病原性微生物である
場合には、この方法で同定された化合物は、微生物との
感染を防止もしくは改良する薬剤に使用することができ
る。
本願発明の第十の態様は、第九の態様の方法で同定さ
れる化合物を提供する。
第十の態様の化合物の使用は、それが同定される方
法、特に病原性微生物の宿主に関連すると考えられる。
例えば、化合物が、哺乳動物に感染する細菌の毒性遺伝
子もしくはそれにコードされるポリペプチドを使用する
方法によって同定される場合には、その化合物を、細菌
による哺乳動物の感染を処置することに使用することが
できる。
同様に、化合物が、植物に感染する真菌の毒性遺伝子
もしくはそれにコードされるポリペプチドを用いる方法
によって同定される場合には、その化合物を、その真菌
による植物の感染を処置することに使用することができ
る。
本願発明の第十一の態様は、本願発明の第七の態様の
遺伝子もしくはその核酸産物と選択的に相互作用し、か
つ実質的にその機能を阻害する分子を提供する。
“その核酸産物”とは、あらゆるRNA、特に遺伝子か
ら転写されたmRNAを含む。
好ましくは、前記遺伝子もしくは前記核酸産物と選択
的に相互作用し、かつ実質的にその機能を阻害する分子
は、アンチセンス核酸もしくは核酸誘導体である。
さらに好ましくは、前記分子がアンチセンスオリゴヌ
クレオチドである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的核酸配列
に特異的に結合することができる一本鎖核酸である。適
切な標的配列に結合することにより、RNA−RNA、DNA−D
NA、もしくはRNA−DNA二重鎖が形成される。これらが遺
伝子のセンスもしくはコード鎖に相補的であるから、こ
れらの核酸はしばしば“アンチセンス”と称される。最
近になって、オリゴヌクレオチドがDNA二重鎖に結合す
る、トリプルへリックス形成の可能性が示された。オリ
ゴヌクレオチドが、DNAダブルへリックスの主要な溝の
配列を認識しうることを見出した。トリプルへリックス
は、それによって形成される。これは、主要な溝の水素
結合部位の認識を介して二本鎖DNAを特異的に結合する
配列特異的分子を合成することができることを示唆す
る。
明らかに、アンチセンス核酸もしくはオリゴヌクレオ
チドの配列は、問題の遺伝子のヌクレオチド配列との関
係によって容易に決定することができる。例えば、アン
チセンス核酸もしくはオリゴヌクレオチドを、図11また
は12に示された配列の一部、特に毒性遺伝子の一部を形
成する配列に相補的となるように設計することができ
る。
オリゴヌクレオチドは、細胞内在性ヌクレアーゼによ
って分解もしくは不活性化される。この問題に対抗する
ために、例えば変更された内部ヌクレオチド結合を備え
たものであって、自然に生じたホスホジエステル結合が
別の結合に置換されているもの等の、修飾されたオリゴ
ヌクレオチドを用いることができる。例えば、Agrawal
ら（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,7079−7083は、
オリゴヌクレオチドホスホラミダート類およびホスホロ
チオアート類を用いたHIV−１の組織培養の阻害が増大
することを示した。Sarinら（1988）Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 85,7448−7151は、オリゴヌクレオチドメチルホ
スホナート類を用いたHIV−１の阻害が増大したことを
示した。Agrawalら（1989）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
6,7790−7794は、ヌクレオチド配列特異的オリゴヌクレ
オチドホスホロチオアートを用いた、早期感染および慢
性的に感染した細胞培養の両方においてHIV−１複製の
阻害を示した。Leitherら（1990）Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 87,3430−3434は、オリゴヌクレオチドホスホロチ
オアートによるインフルエンザウイルス複製の組織培養
における阻害を報告している。
人工的な結合を備えたオリゴヌクレオチドは、in viv
oにおける分解に耐性があることが示された。例えば、S
hawら（1991）Nucleic Acids Res.19,747−750は、ほか
に修飾されていないオリゴヌクレオチドが、あるキャッ
プ構造で3'末端がブロックされると、in vivoでヌクレ
アーゼに対してより耐性が強まること、並びに、キャッ
プが付加されていないオリゴヌクレオチドホスホロチオ
アートはin vivoで切断されないことを報告している。
オリゴヌクレオシドホスホロチオアートを合成するＨ
−ホスホナートアプローチの詳細な説明は、AgrawalとT
ang（1990）Tetrahedron Letters 31,7541−7544に与え
られており、その教示するところを参照としてここに取
り込む。オリゴヌクレオシドメチルホスホナート類、ホ
スホロジチオアート類、ホスホラミダート類、ホスファ
ートエステル類、架橋ホスホラミダート類および架橋ホ
スホロチオアート類が、当該技術分野で知られている。
例えば、AgrawalとGoodchild（1987）Tetrahedron Lett
ers 28,3539;Nielsenら（1988）Tetrahedron Letters 2
9,2911;Jagerら（1988）Biochemistry 27,7237;Uznansk
iら（1987）Tetrahedron Letters 28,3401;Bannwarth
（1988）Helv.Chim.Acta.71,1517;CrosstickとVyle（19
89）Tetrahedron Letters 30,4693;Agrawalら（1990）P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 87,1410−1405を参照。これら
の教示するところを参照としてここに取り込む。別の合
成もしくは産生方法も可能である。好ましい実施態様で
は、オリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸（DNA）で
あるが、リボ核酸（RNA）も合成および適用することが
できる。
本願発明で使用できるオリゴヌクレオチドは、内在性
ヌクレオリティック酵素による分解に対抗するように設
計されることが好ましい。オリゴヌクレオチドのin viv
o分解によって、長さが短くなったオリゴヌクレオチド
分解産物が生じる。このような分解産物は、対応する全
長と比べて、非特異的ハイブリダイゼーションに従事し
そうであり、効果が弱そうである。しかして、体内での
分解に耐性であり、標的細胞に到達することができるオ
リゴヌクレオチドを用いることが望ましい。本願発明の
オリゴヌクレオチドは、例えば結合のリン酸をイオウで
置換することにより、天然のホスホジエステル結合の一
つ以上の内部人工インターヌクレオチド結合（internuc
leotide linkages）を置換することによってin vivoで
の分解に対して耐性にすることができる。用いられる結
合の例は、ホスホロチオアート類、メチルホスホナート
類、スルホン、スルファート、ケチル（ketyl）、ホス
ホロジチオアート類、種々のホスホラミダート類、ホス
ファートエステル類、架橋ホスホロチオアート類および
架橋ホスホラミダート類を含む。他のインターヌクレオ
チド結合は当該技術分野で周知であるため、この様な例
は限定的と言うよりむしろ例証的である。例えば、Cohe
n,（1990）Trends in Biotechnology参照。ホスホジエ
ステルインターヌクレオチド結合に代えて置換された一
つ以上のこれらの結合を備えたオリゴヌクレオチドの合
成は、当該技術分野でよく知られており、混合インター
ヌクレオチド結合を備えたオリゴヌクレオチドを産生す
る合成経路を含む。
5'もしくは3'末端ヌクレオチドに類似した基を“キャ
ッピング（capping）”もしくは取り込むことによって
内因性酵素による伸長に対して耐性とすることができ
る。キャッピング用試薬は、Applied BioSystems Inc,F
oster City,CAのAmino−Link IITM等、商業的に利用す
ることができる。キャッピング方法は、例えばShawら
（1991）Nucleic Acids Res.19,747−750およびAgrawal
ら（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88（17）,7595−75
99に記載されており、その教示するところを参照として
ここに取り込む。
ヌクレアーゼ攻撃に対するオリゴヌクレオチドを作成
するさらなる方法は、ここに参照として取り込むTangら
（1993）Nucl.Acids Res.21,2729−2735に記載されてい
るように、それらが“自己安定化”されることである。
自己安定化されたオリゴヌクレオチドは、3'末端にヘア
ピンループ構造を備え、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ、
DNAポリメラーゼＩおよび胎児性ウシ血清による分解に
対して耐性の増大を示す。オリゴヌクレオチドの自己安
定化領域は、相補的核酸とのハイブリダイゼーションを
妨害することなく、マウスにおける薬力学および安定性
の研究により、それらの直線状部に関して自己安定化オ
リゴヌクレオチドのin vivoにおける持続性が増大する
ことが示された。
本発明によれば、塩基対形成のアンチセンスオリゴヌ
クレオチド特性の固有の結合特異性は、in vivoの意図
した座にアンチセンス化合物の有効性を限定することに
よって増強され、使用される用量をより低くし、全身的
な影響を最小にする。しかして、オリゴヌクレオチド
は、所望の効果を達成するために局在的に用いられる。
所望の座におけるオリゴヌクレオチドの濃度は、オリゴ
ヌクレオチドを全身的に投与した場合よりずっと高く、
その治療効果は、顕著に低い全体量を用いて達成するこ
とができる。局在的高濃度のオリゴヌクレオチドは、標
的細胞の浸透を増強し、標的核酸配列の翻訳を効果的に
ブロックする。
オリゴヌクレオチドは、薬剤の局在化投与に適したあ
らゆる手段によって座に運ばれる。例えば、オリゴヌク
レオチド溶液は、部位に直接注入することができ、ま
た、注射器を用いて注入することによって輸送されても
よい。また、オリゴヌクレオチドを、所望の部位に配さ
れた場合に、周りの座にオリゴヌクレオチドが放出され
る移植器に取り込むこともできる。
オリゴヌクレオチドは、ヒドロゲル材を介して投与さ
れるのが最も好ましい。ヒドロゲルは、非炎症性かつ生
分解性である。現在のところ、この様な材料の多くが知
られており、天然および合成ポリマーからなるものも含
まれる。好ましい実施態様では、この方法は、体温以下
では液状であるが、体温付近では形状維持半固形ヒドロ
ゲルを形成するヒドロゲルを利用する。好ましいヒドロ
ゲルは、エチレンオキシド−プロピレンオキシド繰り返
し単位のポリマーである。ポリマーの特性は、ポリマー
の分子量、並びに、ポリマーにおけるポリエチレンオキ
シドとポリプロピレンオキシドの相対的割合に依存す
る。好ましいヒドロゲルは、約10〜約80重量％のエチレ
ンオキシドと、約20〜約90重量％のプロピレンオキシド
を含む。特に好ましいヒドロゲルは、約70重量％のポリ
エチレンオキシドと、約30重量％のポリプロピレンオキ
シドを含む。用いられるヒドロゲルは、例えば、BASF C
orp.,Parsippany,NJの、商品名PluronicRを利用するこ
とができる。
この実施態様では、ヒドロゲルを液体状態まで冷却
し、この液体に、ヒドロゲルのグラム当たり約1mgのオ
リゴヌクレオチドの濃度となるまでオリゴヌクレオチド
を混合する。得られた混合物を、例えば診察中にスプレ
ーもしくは塗布することによって、あるいはカテーテル
もしくは内科的方法を用いて、処置されるべき表面上に
適用する。ポリマーが温められるにつれ、固化してゲル
が形成され、ゲルの正確な組成物によって決められた時
間をかけて、オリゴヌクレオチドがゲルから周辺細胞へ
と拡散する。
オリゴヌクレオチドを、リポソーム、ミクロカプセ
ル、および移植可能な装置を含む、商業的に利用可能あ
るいは科学文献に記載された他の移植手段によって投与
することができる。例えば、移植は、ポリアンヒドリド
類、ポリオルトエステル類、ポリ乳酸およびポリグリコ
ール酸並びにこれらのコポリマー類、コラーゲン、およ
びタンパク質ポリマー類等の生分解材料、もしくはエチ
レンビニルアセタート（EVAc）、ポリビニルアセター
ト、エチレンビニルアルコール、およびその誘導体等の
非生分解材料を、オリゴヌクレオチドを局所的に輸送す
るために用いることができる。融解もしくは溶剤蒸発技
術を用いて、この材料が重合もしくは固化されるとき、
もしくは、この材料と共に機械的に混合して、オリゴヌ
クレオチドを材料中に取り込むことができる。ある実施
態様では、オリゴヌクレオチドは、デキストラン被覆さ
れたシリカビーズ、ステント、カテーテル等の移植可能
な装置のための被覆に混合もしくは適用される。
オリゴヌクレオチドの用量は、オリゴヌクレオチドの
大きさと、投与の目的に依存する。一般的に、その範囲
は、処置される組織の表面積に基づいて計算される。有
効量のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長
さおよび化学的組成に幾分依存するが、一般的には、組
織表面積の平方センチメートル当たり約30〜3000μｇの
範囲である。
オリゴヌクレオチドは、治療および予防の両方の目的
のために患者に全身的に投与しても良い。オリゴヌクレ
オチドは、非経口的（例えば静脈内、皮下、筋肉内）も
しくは経口的、鼻腔内、もしくはオリゴヌクレオチドが
患者の血流に到達して循環できる他の手段等の有効な方
法によって投与することができる。全身的に投与された
オリゴヌクレオチドは、局在的に投与されたオリゴヌク
レオチドに付加されることが好ましいが、局所的投与無
しでも利用できる。この目的には、成人に対して投薬当
たり約0.1〜約10グラムの範囲の用量が一般的に有効で
ある。
本願発明のこの態様の分子は、遺伝子が単離された微
生物、もしくは前記微生物の近縁によって引き起こされ
たあらゆる感染を処置もしくは予防することに使用でき
ると考えられる。しかして、前記分子は抗生物質であ
る。
しかして、本願発明の第十二の態様は、薬剤に使用す
るための、本願発明の第十一の態様の分子を提供する。
本願発明の第十三の態様は、微生物に感染した、ある
いは感染の疑いのある宿主を処置する方法を提供し、こ
の方法は、本願発明の第十一の態様に係る有効量の分子
を投与することを含み、遺伝子が前記微生物、もしくは
前記微生物の近縁中に存在する。
“有効量”とは、感染を実質的に防止もしくは改善す
る量を示す。“宿主”とは、微生物に感染されうるあら
ゆる動物もしくは植物を含む。
本願発明の第十一の態様の分子の薬学的製剤は、本願
発明の一部をなすと考えられる。この様な薬学的製剤
は、一つ以上の許容できるキャリアーと共に前記分子を
含む。キャリアー（類）は、本願発明の前記分子と適合
しかつその受容側にとって有毒でないという意味におい
て“許容可能”でなくてはならない。キャリアーは、典
型的に、無菌および発熱性物質を含まない水もしくは生
理食塩水である。
上述したように、以下の実施例４に詳細に記載するよ
うに、ある毒性遺伝子が、VGC2と称するクロモソームの
領域で、Salmonella typhimuriumに凝集していることを
見出した。DNA−DNAハイブリダイゼーション実験によ
り、VGC2の少なくとも一部に相同な配列が、Salmonella
の多くの種および株に見出されるが、試験したE.coliお
よびShigella株には存在しないことが調べられた（実施
例４参照）。これらの配列は、少なくともSalmonellaに
おいて、保存された遺伝子、および毒性遺伝子の少なく
ともいくつかにほぼ確実に対応している。他のSalmonel
la種の等価遺伝子、並びに、もし存在するならば、他の
腸もしくは別の細菌の等価遺伝子も毒性遺伝子であると
信じられる。
VGC2領域内の遺伝子が毒性遺伝子であるか否かは、容
易に調べられる。例えば、本願発明の第二の態様の方法
で同定されたVGC2内の遺伝子（Salmonella typhimurium
に適用され、かつ環境がマウス等の動物である場合）
は、毒性遺伝子である。また、毒性遺伝子も、遺伝子に
変異を起こし（好ましくは非極性変異）、変異株が無毒
であるか否かを調べることにより同定される。選択され
た遺伝子に変異体を作成する方法は、周知であり、以下
に記載する。
本願発明の第十四の態様は、Salmonella typhimurium
のVGC2 DNAもしくはその一部、あるいは前記DNAの変異
形もしくはその一部の変異形を提供する。
Salmonella typhimuriumのVGC2 DNAは、図８に図式的
に描写され、実施例４に与えられた情報を用いてSalmon
ella typhimurium ATCC 14028（アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション、12301 Parklawn Drive,Roc
kville,Maryland 20852,USAから利用できる；またNCTC,
Public Health Laboratory Service,Colindale,UK受託
番号NCTC12021にも受託されている）から容易に得られ
る。例えば、図11および12に示された配列から得られる
プローブは、Salmonella typhimuriumゲノムライブラリ
ーからλクローンを同定するのに用いることができる。
標準的なゲノム歩行法は、全てのVGC2 DNAを得るために
用いることができる。図８に示された制限地図は、VGC2
のDNAフラグメントを同定および局在化するために用い
ることができる。
“Salmonella typhimuriumのVGC2 DNAの一部”とは、
少なくとも10ヌクレオチド、好ましくは少なくとも20ヌ
クレオチド、さらに好ましくは少なくとも50ヌクレオチ
ド、さらに好ましくは少なくとも100ヌクレオチド、そ
して最も好ましくは少なくとも500ヌクレオチドのVGC2
を含むあらゆるDNA配列を意味する。VGC2 DNAの特に好
ましい一部は、図11に示された配列、もしくはその一部
である。VGC2 DNAの他の特に好ましい一部は、図12に示
された配列もしくはその一部である。
有利に、VGC2 DNAの一部は遺伝子もしくはその一部で
ある。
遺伝子は、当該技術分野で知られたコンピュータープ
ログラムを用いた読み取り枠の統計学的解析によって、
VGC2領域内に同定することができる。読み取り枠が約10
0コドン以上であれば、それは遺伝子であろう（しか
し、これより短い遺伝子が知られている）。読み取り枠
が遺伝子のポリペプチドコード領域に対応するか否か
は、実験的に調べることができる。例えば、読み取り枠
に対応するDNAの一部を、前記DNAにハイブリダイズす
る、mRNAが発現されるか否かを調べるために、ノーザン
（RNA）ブロットのプローブとして使用することがで
き、もしくは、さらに、変異を読み取り枠に導入しても
よく、微生物の表現型に与える変異の効果を調べること
ができる。もし表現型が変更されれば、読み取り枠は遺
伝子に対応する。DNA配列内の遺伝子の同定方法は当該
技術分野で周知である。
“前記DNAの変異形もしくはその一部の変異形”と
は、本願発明の第七の態様の用語“変異形”によって定
義されたあらゆる変異形を含む。
しかして、Salmonella typhimuriumのVGC2 DNAの変異
形は、Salmonella typhiおよびSalmonella enterica等
の他のSalmonella種の等価遺伝子もしくはその一部、並
びに、他の腸内細菌等の他の細菌の等価遺伝子もしくは
その一部を含む。
“等価遺伝子”とは、機能的に等価な遺伝子、並び
に、変異が類似した表現型（無毒性等）へと導く遺伝子
を含む。本願発明の以前には、VGC2もしくはそれに含ま
れた遺伝子は同定されておらず、毒性決定因子に関連づ
けられなかったと考えられる。
しかして、本願発明のさらなる態様は、細菌がVGC2の
遺伝子と同じもしくは等価の遺伝子を正常に含む場合に
は、前記遺伝子が変異もしくは欠失した変異細菌；細菌
がVGC2の遺伝子と同じもしくは等価の遺伝子を正常に含
む場合には、前記遺伝子が変異もしくは欠失した変異細
菌を作製する方法を提供する。以下は、VGC2遺伝子を不
活性化するのに好ましい方法である。最初に、ハイブリ
ダイゼーションのプローブとしてVGC2のフラグメントを
用いて、Salmonella λDNAライブラリーもしくは他のDN
Aライブラリーから、DNAフラグメントの遺伝子をサブク
ローニングし、制限酵素部位について遺伝子をマッピン
グし、Escherichia coliにおいてDNAシークエンシング
を行って遺伝子を調べる。できれば制限酵素によってク
ローン化遺伝子のコード領域の一部を削除した後に、制
限酵素を用いて、遺伝子のコード領域に抗生物質（例え
ばカナマイシン）耐性をコードするDNAセグメントを導
入する。方法および抗生物質耐性マーカーを含むDNA構
築物を利用して、関心の向けられた遺伝子の不活性化
が、好ましくは非極性であること、すなわち、関心の向
けられた遺伝子の下流の遺伝子の発現に影響しないこと
を確実にすることができる。次いで、遺伝子の変異形
を、ファージP22形質導入を用いてE.coliからSalmonell
a typhimuriumに転移させ、クロモソームへの変異遺伝
子の相同的組換えについてサザンハイブリダイゼーショ
ンによって形質導入体をチェックする。
このアプローチは、一般にSalmonellaで用いられ（S.
typhiで用いることもできる）、さらに詳しいことは、G
alanら（1992）174,4338−4349を含む多くの文献に見ら
れる。
さらなる態様は、ワクチンにおける変異細菌の使用；
前記細菌および薬学的に許容できるキャリアーを含む薬
学的組成物;Salmonella typhimuriumのVGC2 DNAもしく
はその一部にコードされたポリペプチド、もしくはその
一部の変異形；宿主に感染もしくは疾患を引き起こす細
菌の能力を低減する化合物を同定する方法；前記方法に
よって同定されうる化合物;VGC2の遺伝子と選択的に相
互作用し、かつ実質的に機能を阻害する分子もしくはそ
の核酸産物；並びにその医療的使用および薬学的組成物
を提供する。
VGC DNAは、本発明の第一および第二の態様の方法で
同定された遺伝子、並びにその局在によって同定された
遺伝子（しかし、本願発明の第一および第二の態様の方
法で同定されうる）を含む。本願発明のこれらのさらな
る態様は、本願発明の第四、五、六、七、八、九、十、
十一、十二および十三の態様に密接に関連しており、従
って、これらの態様について与えられた情報、並びにこ
れらの態様に関連して示された選択を、これらのさらな
る態様に適用する。
遺伝子が、VGC2に由来し、S.typhi等のSalmonellaの
別の種に由来する等価遺伝子であることが好ましい。変
異細菌が、S.typhimurium変異体、もしくはS.typhi等の
Salmonellaの別の種の変異体であると好ましい。
少なくともいくつかのVGC2の遺伝子が、S.typhimuriu
m等の細菌が細胞に侵入する能力を与えると信じられ
る。
本願発明を、以下の実施例および図面を参照しながら
記載する。
図１は、本願発明の特に好ましい方法を図式的に例証
する。
図２は、EcoR Vで切断した後の、12のS.typhimurium
の接合個体（exconjugants）に由来するDNAのサザンハ
イブリダイゼーション解析を示す。フィルターを、小型
Tn5トランスポゾン（mini−Tn5 transposon）のカナマ
イシン耐性遺伝子でプローブした。
図３は、半分のミクロタイター皿からの、48のS.typh
imurium接合個体（A1−H6）に由来するDNAのコロニーブ
ロットハイブリダイゼーション解析を示す。フィルター
を、最初の24コロニー（A1−D6）のプールから単離され
たDNAからのラベルされ増幅されたタグを含むプローブ
とハイブリダイズした。
図４は、マウスに注入された、ミクロタイター皿の95
のS.typhimurium接合個体（A1−H11）のDNAコロニーブ
ロットハイブリダイゼーション解析を示す。複製フィル
ターを、プールからの標識され増幅されたタグとハイブ
リダイズし（接種パターン）、もしくは、感染した動物
の脾臓から回収された10000以上のプールされたコロニ
ーから単離されたDNAからのラベルされ増幅されたタグ
とハイブリダイズした（脾臓パターン）。コロニーB6、
A11およびC8は、両方のフィルターに弱いハイブリダイ
ゼーションシグナルを生じた。コロニーA3、C5、G3（ar
oA）およびF10からのハイブリダイゼーションシグナル
は、接種パターンには存在するが、脾臓パターンには存
在しない。
図５は、本願発明の方法を用いて単離されたSalmonel
la遺伝子の配列と、Escherichia coli clpプロテアーゼ
ゲノムとの比較を示す。
図６は、本願発明の方法を用いて単離されたさらなる
Salmonella遺伝子の部分的配列を示す（SEQ ID NO:8〜3
6）。
図７は、S.typhimuriumクロモソームのVGC2のマッピ
ングを示す。（Ａ）VGC2の３つの領域からのDNAプロー
ブは、Mud−P22プロファージにロックされたものを含む
一組のS.typhimurium株からの溶解物のサザンハイブリ
ダイゼーション解析に用いられた。7.5kbのPst Iフラグ
メント（図８のプローブＡ）にハイブリダイズした溶解
物が示されている。使用された他の二つのプローブが、
同じ溶解物にハイブリダイズした。（Ｂ）ファージの挿
入ポイントおよびパッケージング方向は、分単位でマッ
プ位置と共に示されている（edition VIII,実施例４の
参考文献22）。ファージの名称は、以下の株に対応す
る:18P、TT15242;18Q、15241;19P、TT15244;19Q、TT152
43;20P、TT15246および20Q、TT15245（実施例４の参考
文献）。マッピングされた遺伝子の局在箇所が水平な棒
で示され、他の遺伝子のおよその位置が示されている。
図８は、VGC2の物質的かつ遺伝学的なマップを示す。
（Ａ）16のトランスポゾン挿入の位置が線の上に示され
ている。VGC2の範囲は、太線で示されている。産物が、
種々の二つの成分制御システムの、それぞれセンサーお
よび制御成分に類似するORF12および13を除いて、類似
した遺伝子の名称と共に、実施例４の説明で記載された
ORF群の転写の位置および方向が、線の下の矢印で示さ
れている。（Ｂ）重複クローンの局在箇所およびMud−P
22プロファージ株TT15244からのEcoR I/Xba I制限フラ
グメントが塗りつぶされた棒として示されている。マッ
ピングされたλクローンの部位のみが示されており、ク
ローンはこれらの限度を超えて伸長しても良い。（Ｃ）
制限部位の位置がマークされている:B,BamH I;E,EcoR
I;V,EcoR V;H,Hind III;P,Pst IおよびX,Xba I。図７で
プローブとして用いられた7.5kbのPst Iフラグメント
（プローブＡ）の位置、および図10でプローブとして用
いられた2.2kbのPst I/Hind IIIフラグメント（プロー
ブＢ）の位置が、制限地図の下に示されている。配列１
（図11に記載）および配列２（図12に記載）の位置が、
細い矢印で示されている（ラベルされた配列１および配
列２）。
図９は、VGC2の境界をマッピングを記載する。（Ａ）
E.coli K12クロモソームの37〜38分にマップされた遺伝
子の位置は、S.typhimurium LT2クロモソームの対応す
る領域と共に並んでいる（30〜31分）。VGC2領域の拡大
されたマップは、プローブとして用いられた11のS.typh
imurium（S.t.）DNAフラグメント（太い棒）と、それら
を作製するために用いられた制限部位:B,BamH I;C,Cla
I;H,Hind III;K,Kpn I;P,Pst I;N,Nsi IおよびS,Sai I
と共に示されている。E.coli K12（E.c.）ゲノムDNAに
ハイブリダイズしたプローブは＋で示され、ハイブリダ
イズしなかったプローブは−で示されている。
図10は、VGC2がSalmonellae間で保存され、かつ特異
的であることを示している。Salmonella血液型亜型（se
rovars）と他の病原性細菌のゲノムDNAを、Pst I
（Ａ）、Hind IIIもしくはEcoR V（Ｂ）で制限し、プロ
ーブとしてλクローン７からの2,2kbのPst I/Hind III
フラグメントを用いて、サザンハイブリダイゼーション
解析にかける（プローブＢ図２）。フィルターを、厳密
（Ａ）もしくは非厳密（Ｂ）な条件下でハイブリダイズ
し、洗浄する。
図11は、VGC2の“配列1"のDNA配列を、中心から左端
まで示す（図２の矢印が付された配列１を参照）。DNA
は６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始お
よび終結位置、並びにSTMに同定された種々の変異体の
トランスポゾン挿入位置が示唆されている（SEQ ID NO:
37）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオ
チドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられてい
る。
図12は、VGC2の“配列2"のDNA配列を示す（クラスタ
ーＣ）（図２の矢印が付された配列２を参照）。DNAは
６つの読み枠で翻訳され、推定される遺伝子の開始およ
び終結位置、並びにSTMで同定された種々の変異体のト
ランスポゾン挿入位置が示唆されている（SEQ ID NO:3
8）。
習慣的に、＊は停止コドンを示し、標準的なヌクレオ
チドのあいまいさのコードが、必要箇所に用いられてい
る。
図７〜12は、実施例４に最も関連する。
実施例1:Salmonella typhimuriumの毒性遺伝子の同定 材料および方法 細菌株とプラスミド Salmonella typhimurium株12023（アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（ATCC）株14028と等
価）を、ナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カ
ルチャー（NCTC）,Public Health Laboratory Service,
Colindale,London,UKから得た。この株の自発的ナリジ
キシン酸耐性変異体（12023Nalr）研究室で選別した。
株12023の別の誘導体、CL1509（aroA::Tn10）をFred He
ffronから入手した。Escherichia coli株CC118λpir
（△［ara−leu］、araD、△lacX74、galE、galK、phoA
20、thi−１、rpsE、rpoB、argE（Am）、recA1、λpir
ファージ溶原（lysogen））およびS17−１λpir（Tpr、
Smr、recA、thi、pro、hsdR-M+、RP4:2−Tc:Mu:KmTn7、
λpir）をKenneth Timmisから入手した。E.coli DH5α
を、S.typhimurium DNAを含有するpUC18（Gibco−BRL）
とBluescript（Stratagene）プラスミドを繁殖させるた
めに用いた。プラスミドpUT小型Tn5Km2（de Lorenzoら,
1990）は、Kenneth Timmisから入手した。
半ランダム配列タグの構築とリゲーション を、オリゴヌクレオチド合成装置（Applied Biosystem
s,model 380B）で合成した。1.5mM MgCl2、50mM KCl、
および標的として200pgのRT1を含んだ10mM Tris−Cl（p
H8.0）;250μＭの各dATP、dCTP、dGTP、dTTP;100pMのプ
ライマーP3およびP5;並びに2.5UのAmplitaq（Perkin−E
lmer Cetus）を含んだ100μｌのPCRで、PT1から二本鎖D
NAタグを調製した。温度循環条件は、95℃で30秒、50℃
で45秒、72℃で10秒を30サイクルであった。PCR産物を
ゲル精製し（Sambrookら,1989）、エルチップＤ（eluti
pD）カラムを通し（SchleicherとSchullのものを利用で
きる）、pUC18もしくはpUT小型Tn5Km2にリゲーションす
る前にKpn Iで切断した。リゲーションでは、プラスミ
ドをKpn Iで切断し、小ウシ腸アルカリホスファターゼ
（Gibco−BRL）で脱リン酸化した。切断されたプラスミ
ドDNAから未切断のものを除去するために、リゲーショ
ンの前に、直線状になったプラスミド分子をゲル精製し
た（Sambrookら,1989）。リゲーション反応溶液は、約5
0ngの各プラスミドと二本鎖タグDNAを、酵素を添加した
バッファーに１ユニットのT4DNAリガーゼ（Gibco−BR
L）を含有した25μｌに含む。
リゲーションは24℃で２時間行った。プラスミドDNA
の自己リゲーションもしくは未切断プラスミドDNAのい
ずれかから生じる細菌コロニー比率を調べるために、二
本鎖タグDNAをリゲーション反応から省略した対照反応
を行った。二本鎖タグDNAを含有するリゲーション反応
から185コロニーが生じたのと比較して、これは、E.col
i CC118（Sambrookら,1989）の形質転換後にアンピシリ
ン耐性細菌コロニーを産生しなかった。
細菌性形質転換および交配 pUT小型Tn5Km2と二本鎖タグDNAとの間のいくつかのリ
ゲーションの産物を、E.coli CC118（Sambrookら,198
9）を形質転換するために用いた。全体で約10300の形質
転換体をプールし、そのプールから抽出されたプラスミ
ドDNAをE.coli S−17λpir（de Lorenzo ＆ Timmis,199
4）を形質転換するために用いた。交配実験では、約400
00のアンピシリン耐性E.coli S−17λpir形質転換体の
プールと、S.typhimurium 12023 Nalrを、光学密度（O
D）580が1.0となるまで分けて培養した。各培養の分注
量（0.4ml）を5ml 10mMのMgSO4に混合し、Millipore膜
（0.45μｍ径）で濾過した。このフィルターを、M9塩
（de Lorenzo ＆ Timmis,1994）を含有する寒天の表面
に置き、37℃で16時間インキュベートした。この細菌
を、37℃で40分間液体LB培地にフィルターを振り混ぜる
ことによって回収し、100μgml-1ナリジキシン酸（ドナ
ー株に対する選別）および50μgml-1カナマイシン（受
容個体株の選別）を含むLB培地上に前記懸濁液をプレー
トすることによって接合個体を選別した。ナリジキシン
酸耐性（nalr）、カナマイシン耐性（kanr）コロニー
を、MacConkeyラクトース指示培地（E.coliとS.typhimu
riumとを区別するため）およびアンピシリン含有LB培地
に移すことによって各接合個体をチェックした。約90％
のnalr、kanrコロニーがアンピシリンに敏感であり、こ
れらが確実な転位から得られたことを示している（de L
orenzo ＆ Timmis,1994）。個々のアンピシリン感受性
接合個体を、LB培地を含む96ウェルのミクロタイター皿
に貯蔵した。−80℃で長期間貯蔵するために、７％DMSO
もしくは15％グリセロールのいずれかをこの培地に添加
した。
変異体の表現型の特徴決定 栄養素要求体を同定するために、M9塩類と0.4％グル
コース（Sambrookら,1989）を含む固相培地上に、変異
体をミクロタイター皿からレプリカプレーティングし
た。寒天プレート上のコロニーを低倍率の顕微鏡で調べ
ることによって、荒れたコロニー形態の変異体を検出し
た。
コロニーブロット、DNA抽出、PCR、DNAラベリングおよ
びハイブリダイゼーション コロニーブロットハイブリダイゼーションでは、48ウ
ェルの金属レプリケーター（Sigma）を用いて、50μgml
-1のカナマイシンを含有するLB寒天の表面上に置かれた
Hybond Nナイロンフィルター（Amersham,UK）にミクロ
タイター皿から接合個体を移した。37℃で夜通しインキ
ュベートした後、細菌コロニーを支持するフィルターを
除去し、室温で10分間乾燥させた。細菌を0.4N NaOHで
溶解し、フィルターを、フィルター製造元の指示通りに
0.5N Tris−Cl pH7.0で洗浄した。細菌性DNAをStratali
nker（Stratagene）のUV光にあててフィルターに固定し
た。32Pラベルプローブへのハイブリダイズを、先に記
載されたように厳密な条件下で行った（Holdenら,198
9）。DNA抽出のために、S.typhimuriumトランスポゾン
変異株を、ミクロタイター皿で液状LB培地に生育する
か、固体培地で生育させた後にLB培地に再懸濁した。全
DNAを、Ausubelら（1987）のヘキサデシルトリメチルア
ンモニウムブロミド（CTAB）法で調製した。簡単に言え
ば、150〜1000μｌの細胞を遠心して沈降させ、576μｌ
のTEに再懸濁した。これに、15μｌの20％SDSおよび３
μｌの20mgml-1のプロテイナーゼＫを添加した。37℃で
１時間インキュベートした後、166μｌの3M NaClを添加
し、徹底的に混合し、次いで、80μｌの10％（w/v）CTA
Bと0.7M NaClを添加した。徹底的に混合した後、この溶
液を65℃で10分間インキュベートした。フェノールとフ
ェノール−クロロホルムで抽出した後、DNAをイソプロ
パノールの添加によって沈降させ、70％エタノールで洗
浄し、約１μg μl-1の濃度になるようにTEに再懸濁し
た。
ラベルされたプローブを生成するために、DNAサンプ
ルを２回のPCRにかけた。最初のPCRは、20mM Tris−Cl
pH8.3;50mM KCl:2mM MgCl2;0.01％Tween80;各々200μＭ
のdATP,dCTP,dGTP,dTTP;2.5ユニットのAmplitaqポリメ
ラーゼ（Perkin−Elmer Cetus）；各々770ngのプライマ
ーP2およびP4;および５μｇの標的DNAを含む100μｌの
反応液で行った。95℃で４分間の最初の変性後、温度サ
イクルは、50℃で45秒、72℃で10秒、および95℃で30秒
を20サイクルからなる。PCR産物を、クロロホルム／イ
ソアミルアルコール（24/1）で抽出し、エタノールで沈
降させた。DNAを10μｌのTEに再懸濁し、PCR産物を、TA
Eバッファー中の1.6％Seaplaque（FMC Bioproducts）を
電気泳動することによって精製した。約80bpのフラグメ
ントを含むゲルスライスを切り出し、第二のPCRに用い
た。この反応は、20mM Tris−Cl pH8.3;50mM KCl;2mM M
gCl2;0.01％Tween80;各々50μＭのdATP,dTTP,dGTP;10μ
l32P−dCTP（3000Ci/mmol、Amersham）；各々150ngのプ
ライマーP2およびP4;約10ngの標的DNA（最初のPCR産物
を含有する１−２μｌの1.6％Seaplaqueアガロース）;
0.5ユニットのAmplitaqポリメラーゼを含む20μｌの反
応液で行った。この反応液に20μｌのミネラルオイルを
載せ、温度サイクルを上述の通りに行った。放射活性ラ
ベルの取り込みを、Whatman DE 81ペーパーへの吸収に
よって定量した（Sambrookら,1989）。
感染の研究 タグが付されたトランスポゾンを含有する各々のSalm
onella接合個体を、37℃で夜通し、ミクロタイタープレ
ートで、２％トリプトン、１％イースト抽出物、0.92％
v/vグリセロール、0.5％Na2PO4、１％KNO3（TYGPN培
地）（Ausubelら,1987）で生育させた。金属レプリケー
ターを用いて、少量のオーバーナイト培養物を新鮮なミ
クロタイタープレートに移し、その培養物をOD580（Tit
ertek Multiscanミクロタイタープレートリーダーを用
いて測定）が各ウェルとも約0.2となるまで37℃で培養
した。個々のウェルの培養をプールし、OD550を分光光
度計を用いて調べた。培養物を、約5x105cfuml-1となる
まで無菌食塩水で希釈した。さらに、希釈物を、ナリジ
キシン酸（100mg ml-1）およびカナマイシン（50mg ml
-1）を含むTYGPN上にプレートして、接種物にcfuが存在
することを確認した。
３匹のメスのBALB/cマウス（20−25g）のグループ
に、約1x105cfu ml-1を含む0.2mlの細菌懸濁液を腹腔内
に注入した。接種後３日でマウスをと殺し、細菌を回収
するために脾臓を取りだした。それぞれの脾臓の半分
を、ミクロフュージチューブ（a microfuge tube）の1m
lの無菌食塩水にホモジェナイズした。細胞片を沈殿さ
せ、懸濁液の状態にある細胞を含有する1mlの食塩水を
新鮮なチューブに移し、ミクロフュージで２分間遠心し
た。上清を吸引し、ペレットを1mlの無菌蒸留水に再懸
濁した。一連の希釈を無菌蒸留水に作製し、100mlの各
希釈物を、ナリジキシン酸（100ug ml-1）およびカナマ
イシン（50μg ml-1）を含むTYGPN寒天上にプレートし
た。細菌を、1000〜4000コロニーを含むプレートから回
収し、各脾臓から回収された全部で10000以上のコロニ
ーをプールし、コロニーブロットを選別するプローブの
PCR生成用DNAを調製するために用いた。
毒性遺伝子クローニングおよびDNAシークエンシング 全DNAをS.typhimurium接合個体から単離し、それぞれ
Sst I、Sal I、Pst I、Sph Iで切断した。分解物をアガ
ロースゲルで分画し、Hybond N+膜（Amersham）に移
し、プローブとしてpUT小型Tn5Km2のカナマイシン耐性
遺伝子を用いてはサザンハイブリダイゼーション解析を
行った。このプローブは、ジゴキシゲニン（Boehringer
−Mannheim）でラベルされ、化学発光検出を製造元の指
示に従って行った。ハイブリダイゼーションと洗浄の条
件は、上述の通りである。３−5kbの範囲のハブリダイ
ズしたフラグメントを生じる制限酵素を用いて、調製用
アガロースゲル用のDNAを切断し、ハイブリダイゼーシ
ョンシグナルのサイズに対応するDNAフラグメントをこ
れから切り出し、精製して、pUC18にリゲートした。リ
ゲーション反応は、E.coli DH5aをカナマイシン耐性に
形質転換するために用いられた。カナマイシン耐性形質
転換体のプラスミドを、エルチップＤカラムを通過させ
て精製し、制限酵素切断でチェックした。プラスミド挿
入物を、−40プライマーと逆シークエンシングプライマ
ー（United States Biochemical Corporation）、並び
にそれぞれTn5のＩおよびＯ末端にアニールするプライ
マー６（5'−CCTAGGCGGCCAGATCTGAT−3'）（SEQ ID No
6）およびP7（5'−GCACTTGTGTATAGAGTCAG−3'）（SEQ I
D No7）を用いてジデオキシ法（Sangerら,1977）で部分
的に配列決定した。ヌクレオチド配列と推定されるアミ
ノ酸配列を、Macintosh SE/30コンピューターでMacvect
or 3.5ソフトウェアパッケージを用いて作製した。配列
を、ヒトゲノム地図作製計画資源センター（the Human
Genome Mapping Project Resource Gentre,Harrow,UK）
のUNIX/SUNコンピューターシステムを用いて、EMBLおよ
びGenbank DNAデータベースと比較した。
結果 タグ設計 DNAタグの構造は、図1aに示されている。それぞれの
タグは、不変配列の“腕”が隣接した可変中心領域から
なる。この中心領域配列（［NK］20）は、一般に用いら
れる6bp認識制限酵素のための部位の発生を妨げるよう
に設計されるが、統計学的に、同じ配列が2x1011分子に
一度だけ生じることを確実にするのに十分変更可能であ
る（12の不規則に選択されたタグのDNA配列は、種々の
領域にわたって、どれも50％以上の同一性を持たないこ
とを示した）。（Ｎはあらゆる塩基（A,G,CまたはＴ）
を意味し、ＫはＧまたはＴを意味する。）この腕は、最
初のクローニング段階を容易にするために末端の近くに
Kpn I部位を備え、ハイブリダイゼーション解析の前に
腕からラジオラベルされた可変領域を解離するために、
可変領域に隣接するHind III部位が用いられた。また、
プライマーP2およびP4が、それぞれグアニン残基を一つ
だけ含むように腕を設計した。それゆえ、これらのプラ
イマーを用いたPCRでは、独特配列では平均10であるの
に対し、新規に合成された各々の腕には、たった一つの
シトシンが取り込まれる。PCRにラジオラベルされたdCT
Pを取り込んだ場合には、各々の腕と比べて、平均して1
0倍以上のラベルが独特配列に存在する。これは、Hind
IIIで切断して独特配列から解離された後に、腕からの
バックグラウンドハイブリダイゼーションシグナルを最
小にすることを意図している。二本鎖タグを、プラスミ
ドpUTに保有された小型Tn5トランスポゾンKm2のKpn I部
位にリゲートする（de Lorenzo ＆ Timmis,1994）。こ
のプラスミドの複製は、pir遺伝子のR6K特異的π産物に
依存する。これは、種々の細菌種に転移させるRP4プラ
スミドのoriT配列（Miller ＆ Mekalanos,1988）、並び
に、小型Tn5部の転位に必要なtnp＊遺伝子を保有してい
る。タグが付された小型Tn5トランスポゾンを、接合す
ることによってS.typhimuriumに転移し、転位によって
生じた288の接合個体をミクロタイター皿のウェルに貯
蔵した。これらの内の12から単離された全DNAをEcoR V
で切断し、プローブとして小型Tn5トランスポゾンのカ
ナマイシン耐性遺伝子を用いてサザンハイブリダイゼー
ション解析を行った。どの場合も、接合個体は、細菌ゲ
ノムの異なる部位に一回のトランスポゾンの組み込みの
結果として生じた（図２）。
特異性および感受性の研究 次いで、反応の標的として接合個体DNAのプールに係
るPCRにおけるDNAタグの増幅の効率および単一性を調べ
た。PCRにおけるタグの不等価な増幅を最小にする試み
では、アガロースゲルのエチジウムブロミド染色によっ
て視覚化されうる産物を生じる、100μｌの反応に用い
られるDNA標的の最大量と、PCRサイクルの最小数を調べ
た。（それぞれ、５μｇのDNAと20サイクル）。
ミクロタイター皿で定常期に達したS.typhimurium接
合個体をあわせて、DNA抽出に用いた。これにプライマ
ーP2およびP4を用いたPCRを行った。80bpのPCR産物をゲ
ル精製し、32PラベルされたCTPを備えた同じプライマー
を用いた第二のPCRの標的として用いた。これにより、P
CR産物中に60％以上のラジオラベルされたdCTPが取り込
まれる結果となった。ラジオラベルされた産物を、Hind
IIIで切断し、対応するミクロタイター皿からのコロニ
ーブロットDNAをプローブするために用いた。この方法
で試験された1510変異体の内、358は、コロニーブロッ
トの夜通し曝した後のオートラジオグラムで明瞭なシグ
ナルを引き起こさなかった。この可能な説明が３つあ
る。まず第一に、ある割合のトランスポゾンがタグを保
有しない可能性がある。しかしながら、タグの存在下も
しくは非存在下におけるトランスポゾンに係るリゲーシ
ョン反応から得られた形質転換頻度を比較することによ
り、タグの付されていないトランスポゾンが、全体の約
0.5％以上になることを説明できそうにない（材料と方
法を参照）。より可能性のある原因は、可変配列がいく
つかのタグにおいて末端切除されていること、および／
またはいくつかの配列が二次構造を形成することであ
り、これらの両方が増幅を妨げたかもしれない。明確な
シグナルを与えられなかった変異体は、さらなる研究に
は含なかった。効率的に増幅されるタグの特異性を、ミ
クロタイター皿の24コロニーからプローブを生成し、プ
ローブを生成するために用いられた24コロニーを含む48
コロニーのコロニーブロットをプローブするために使用
することによって証明した。プローブ生成に用いられな
かった24コロニーからのあらゆるハイブリダイゼーショ
ンシグナルの欠如は（図３）、用いられたハイブリダイ
ゼーション条件がラベルされたタグ間のクロスハイブリ
ダイゼーションを妨げるのに十分厳密であることを示
し、各接合個体がミクロタイター皿の内部で反復しない
ことを示唆している。
動物実験で接種として用いられる最大プールサイズを
決定することを、さらなに考察した。各トランスポゾン
のラベルされたタグの量は、タグプールの複雑さに反比
例するので、ハイブリダイゼーションシグナルがあまり
に弱く、オートラジオグラムの夜通し曝した後に検出さ
れない以上のプールサイズまで限定する。より重要なこ
とは、プールの複雑さが増大するにつれ、感染した動物
の脾臓で、プールの毒性の代表が十分にラベルされたプ
ローブを産生するのに十分な数で存在しないことであ
る。用いたサルモネラ症のマウスモデルにおけるプール
サイズに対する上限を決定していないが、96以上に違い
ない。
トランスポゾン変異の毒性試験 全部で1152の独特にタグが付された挿入変異（二つの
ミクロタイター皿に由来）を、12プールのBALB/cマウス
における毒性について試験し、それぞれ96のミクロタイ
ター皿を示す。動物に、ミクロタイター皿の96ウェルの
トランスポゾン変異体のそれぞれ約103細胞（全部で105
生物体）を、腹腔内投与した。注入から３日後、マウス
をと殺し、実験培地上に脾臓ホモジェナートをプレーテ
ィングすることによって、細菌を回収した。それぞれの
マウスから回収された約10000コロニーをプールし、DNA
を抽出した。このDNAサンプルに存在するタグを増幅
し、PCRでラベルし、コロニーブロットをプローブし、
接種から増幅されたタグを用いて得られたハイブリダイ
ゼーションパターンと比較した（図３）。対称として、
S.typhimuriumのaroA変異体にタグを付し、接種におけ
る96変異体の一つとして用いた。毒性が強く弱められて
いるので、この株は脾臓で回収されることは予想されな
い（Buchmeierら,1993）。DNAが、接種からのラベルさ
れたタグにハイブリダイズするが、脾臓から回収された
細菌からのラベルされたタグにハイブリダイズしない41
の変異体を同定した。この実験を繰り返し、同じ41変異
体を再び同定した。これらの二つは、予想通り、aroA変
異体であった（プール当たり一つ）。他は栄養素要求体
変異であった（最少培地上で生育できない）。全ての変
異体が、正常なコロニー形態学を備えていた。
実施例2:トランスポゾンに隣接する配列のクローニング
および部分的特徴決定 実施例１に記載された変異体の一つ（プール１、F1
0）からDNAを抽出し、Sst Iで切断して、カナマイシン
耐性に基づいてサブクローン化した。トランスポゾンの
一端に隣接した450bpの配列を、プライマーP7を用いて
調べた。この配列は、熱制御プロテアーゼをコードする
E.coli clp（lon）遺伝子に80％の同一性を示す（図
５）。知る限りにおいて、以前に、この遺伝子が毒性決
定因子に関係があるとは考えられなかった。
さらに13のSalmonella typhimurium毒性遺伝子の部分
的配列が、図６に示されている（配列A2〜A9およびB1〜
B5）。P2D6、S4C3、P3F4、P7G2およびP9B7の推定される
アミノ酸配列は、動物および植物の細菌性病原体を通じ
て保存された分泌関連タンパク質のファミリーに類似し
ており、Salmonellaではinvファミリーとして知られて
いる。S.typhimuriumでは、inv遺伝子が、腸組織に細菌
侵入するのに必要である。inv変異体の毒性は、経口経
路で接種された場合には弱められるが、腹腔内投与され
た場合には弱められない。腹腔内接種後の毒性に必要と
されるinv関連遺伝子の発見は、脾臓および他の器官の
非食細胞（non−phagocytic cells）の侵入に必要とさ
れる新しい分泌機構を示唆している。これらの新規遺伝
子の産物は、確立された感染の処置におけるinvタンパ
ク質より優れた薬剤標的を示し得る。
この実施例で同定された遺伝子のさらなる特徴決定
を、実施例４に記載する。
実施例3:LD50定量およびマウスの予防接種の研究 本願発明の方法で同定された変異は毒性を弱める。
以前には毒性に関係するとされていなかった遺伝子の
５つの変異を、P22−介在形質導入でS.typhimurium 120
28のナリジキシン酸感受性親株に転移させた。形質導入
体を制限マッピングでチェックし、腹腔内径路でBALB/c
マウスのグループに注入して、50％致死量（LD50）を調
べた。変異体S4C3、P7G2、P3F4およびP9B7のLD50の値
は、どれも野生株より高い大きさであった。変異体P1F1
0では、LD50の差異は全く検出されなかった。しかしな
がら、P1F10株と野生株とを同じ比率で含む接種物を注
入したマウスの脾臓から回収されたP1F10細胞の比率に
は統計学的に顕著な減少が見られた。このことは、この
変異体が、毒性を弱めるものの、LD50で検出されない程
度までであることを示している。
変異体P3F4とP9B7も、107細胞／マウスの接種レベル
で経口経路で投与した。どのマウスも病気にならず、こ
のことは、これらの変異体の経口LD50レベルが、少なく
とも野生株よりは高いことを示している。
マウス予防接種研究では、質量が20−25gの５匹のメ
スのBALB/cマウスに、Salmonella typhimurium変異株P3
F4およびP9B7の連続する10倍希釈を経口（p.o.）もしく
は腹腔内（i.p.）に最初に接種した。４週間後、マウス
に、500c.f.uの親の野生株を接種した。死亡を４週間に
わたって記録した。
また、変異株を接種したマウスと同じ加齢およびバッ
チの二匹のマウスに、陽性の対照として500c.f.uの野生
株をi.p.接種した。予防接種されていない両方のマウス
が、予想通り４週間以内に死亡した。
結果は以下の表に示されている。
これらの実験から、変異体P3P4は、次の野生型のチャ
レンジに対してある程度の防御を与えそうである。この
防御は、i.p.で免疫されたマウスで大きいようである。
実施例4:Salmonella typhimuriumの第二型III分泌シス
テムをコードする毒性座の同定 この実施例で用いられた略号は、VGC1,毒性遺伝子ク
ラスター1;VGC2,毒性遺伝子クラスター２である。
記載された実験の背景 Salmonella typhimuriumは、ヒトの胃腸炎の主要な試
薬であり、ヒト腸チフスのモデルとして与えるマウスの
全身的な病気を引き起こす（１）。マウスにS.typhimur
iumを経口接種した後で、細菌は、腸の細胞もしくはパ
イアー斑小胞を介して、小腸のルーメンから腸の粘膜を
通る（２）。この細菌がマクロファージや好中球に侵入
し、細網内皮系に入り、脾臓や肝臓を含む他の器官に広
がり、さらに繁殖して、圧倒的かつ致死的菌血症を生じ
る（３）。宿主細胞に侵入するため、生理学的にストレ
スのかかる種々の細胞内および細胞外の環境において生
存および複製するため、並びに、免疫系の特異的抗菌活
性を回避するために、S.typhimuriumは、洗練されたレ
パートリーの毒性因子を用いる。
S.typhimuriumと他の病原体の毒性メカニズムのさら
に包括的な理解を得るために、便利に“サインが付され
た変異誘発（signature−tagged mutagenesis）”（ST
M）と称され、単一の動物の多数の種々の変異体の結末
を同時に追跡することができる能力を備えた変異解析の
強度を組み合わせた、トランスポゾン変異誘発システム
が実施例１に記載されている（５および実施例1;参考文
献５は、本願発明の優先日以降に公開された）。このア
プローチを用いて、選別した全部で1152の変異体から、
毒性の弱められた43の変異体を同定した。これらの変異
体の５つのトランスポゾンの挿入ポイントに隣接するDN
Aのヌクレオチド配列は、これらが、種々の細菌性病原
体のタイプIII分泌システムをコードする遺伝子に関連
することを示した（６、７）。S.typhimuriumのinv/spa
遺伝子クラスターの産物（８、９）は、表皮細胞に入る
ことを仲介する表面付属物の集合に要求されるタイプII
I分泌システムを形成するタンパク質である（10）。ゆ
えに、inv/spaクラスターに変異を有する株の毒性は、
腹腔内に投与された場合ではなく、接種物が経口投与さ
れた時にのみ弱められる（８）。対称的に、STMで同定
された５つの変異体は、腹腔内接種後に無毒である
（５）。
この例では、これらの５つの変異体のトランスポゾン
挿入ポイントとSTMで同定されたさらなる11の変異体の
全てが、S.typhimuriumクロモソームの同じ領域にマッ
プされることを示す。さらに、この領域を解析すること
により、推定される産物がタイプIII分泌システムの他
の成分に配列類似性を備えたさらなる遺伝子が明らかに
される。毒性遺伝子クラスター２（VGC2）と称されるこ
の染色体領域は、多数の他の腸内細菌には存在せず、S.
typhimurium毒性に重要な座を示す。
材料および方法 細菌株、形質導入および生育培地。Salmonella enteric
a血清型5791（aberdeen）、423180（gallinarum）、710
1（cubana）および12416（typhimurium LT2）を、ナシ
ョナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャー（th
e National Collections of Type Cultures,Public Hea
lth Laboratory Service,UK）から入手した。Salmonell
a typhi BRD123ゲノムDNAをG.Douganから入手し、腸病
原性（enteropathogenic）Escherichia coli（EPEC）、
腸出血性（enterohemorrhagic）E.coli（EHEC）、Vibri
o choleraバイオタイプEl Tor、Shigella flexneri血清
型２およびStaphylococcus aureusは、the Department
of Infectious Diseases and Bacteriology,Royal Post
graduate Medical School,UKから入手された臨床的単離
物である。Yersinia pestisのゲノムDNAは、J.Heeseman
nから入手した。しかしながら、ゲノムDNAは、標準的な
方法を用いて単離することができる。S.typhimurium NC
TC株12023のサインが付された小型Tn5トランスポゾン変
異体を生成するために用いられた細菌株および方法は、
以前に記載されている（５、11）。プラスミドの機械的
な繁殖は、E.coli DH5α内であった。細菌を、適切な抗
生物質を添加したLBブイヨン（12）で生育させた。個々
の変異体株の毒性レベルを評価する前に、ファージP22
仲介形質導入によって（12）、変異を、S.typhimurium
12023のナリジキシン酸感受性親株に最初に転移した。
形質転換体を接種物として使用する前に制限分解および
サザンハイブリダイゼーションによって解析した。
ラムダライブラリースクリーニング。VGC2をカバーする
重複挿入DNAを備えたラムダ（λ）クローンを、S.typhi
murium LT2ゲノムDNAの部分的なSau3A切断からの挿入物
を含むλ1059ライブラリー（14）から、標準的な方法
（13）で得た。このライブラリーは、Salmonella Genet
ic Stock Centre（SGSC）,Calgary,CanadaからK.Sander
sonを介して得られた。
Mud−P22溶原。ラジオラベルされたDNAプローブを、S.t
yphimuriumゲノムの既知の位置にMud−P22プロファージ
を有する一組のS.typhimurium株の溶解物から調製され
たDNAを有するHybond N（Amersham）にハイブリダイズ
した。マイトマイシン誘導Mud−P22溶解物の調製が記載
されている（12、15）。この組のMud−P22プロファージ
は、元来BensonとGoldmanによって組み立てられ（1
6）、SGSCから得られた。
ゲル電気泳動とサザンハイブリダイゼーション。ゲル電
気泳動を、0.5xTBEで行った１％もしくは0.6％アガロー
スゲルで行った。ゲル濾過されたDNAを、Hybond Nまた
はＮ＋膜（Amersham）に移し、厳密なハイブリダイゼー
ションと洗浄工程（10％以下のミスマッチを備えたヌク
レオチド配列間のハイブリダイゼーションは許容する）
を、Heldenらが記載したようにして行った（17）。非厳
密的条件（50％のミスマッチを備えた配列間のハイブリ
ダイゼーションは許容する）では、フィルターを10％ホ
ルムアミド/0.25M Na2HPO4/7％SDSで夜通し42℃でハイ
ブリダイズさせ、最も厳密な段階は、42℃で20mM Na2HP
O4/1％SDSを備える。プローブとして用いられたDNAフラ
グメントを、“Radprime"システム（Gibco−BRL）を用
いて［32P］dCTPもしくは［ジゴキシゲニン−11］dUTP
でラベルし、放射活性ラベルされたプローブに用いられ
るのと同じ溶液でハイブリダイゼーションを行ったこと
以外は、製造者の指示に従ってジゴキシゲニンシステム
（Boehringer Mannheim）を用いて検出した。ゲノムDNA
を、以前に記載されたようにして（13）、サザンハイブ
リダイゼーション用に調製した。
分子クローニングとヌクレオチドシークエンシング。制
限エンドヌクレアーゼとT4 DNAリガーゼを、Gibco−BRL
から得た。一般的な分子生物学的技術は、Sambrookら
（18）に記載されている。ヌクレオチド配列決定をT7シ
ークエンシングキット（Pharmacia）を用いたジデオキ
シ鎖終結法（19）によって行った。配列を、MacVector
3.5ソフトウェアもしくはAssemblyLIGNパッケージで構
築した。ヌクレオチドと誘導されたアミノ酸配列を、ヒ
トゲノム地図作製計画資源センター（the Human Genome
Mapping Project Resource Centre,Hinxton,UK）のネ
ットワークサービスで、ウィスコンシン大学のGCGパッ
ケージのBLASTおよびFASTAプログラム（バージョン８）
（20）を用いて、欧州分子生物学研究所（the European
Molecular Biology Laboratory）（EMBL）およびSwiss
Protデータベースのものと比較した。
毒性試験。５つのメスのBALB/cマウス（20−25g）のグ
ループに、生理食塩水に懸濁された10倍希釈の細菌を経
口（p.o.）もしくは腹腔内（i.p.）接種した。接種物の
調製のために、振り動かしながら（50rpm）LBブイヨン
中で37℃で夜通し細菌を生育させ、560nmにおける光学
密度（OD）が0.4〜0.6になるまで、種々の長さの時間、
新鮮な培地を接種するために用いた。細胞密度がml当た
り5x108コロニー形成ユニット（cfu）以上になるよう
に、培養物を遠心して濃縮し、食塩水に再懸濁した。cf
u/mlの濃度を、LB寒天プレート上に一連の希釈された接
種物をプレーティングすることによってチェックした。
マウスに、0.2mlをi.p.で接種し、かつ、同じ量の接種
物を含む栄養をp.o.で接種した。LD50の値を、ReedとMe
unch（21）の方法で28日後に計測した。
結果 トランスポゾン挿入の局在。Salmonella typhimurium小
型Tn5トランスポゾン変異体のバンクの発生（generatio
n）および弱毒化された43の変異体を同定するために用
いられた選別は、以前に記載されている（５）。トラン
スポゾンと隣接DNA領域は、カナマイシン耐性の選別も
しくは逆PCRにより、接合個体からクローン化される。
トランスポゾンに隣接するDNAのヌクレオチド配列300−
600bpを、33変異体について得た。これらの配列とDNAお
よびタンパク質データベースの配列とを比較することに
より、14の変異体が既知の毒性遺伝子にトランスポゾン
が挿入されたことによって生じ、７つが腸細菌の既知の
遺伝子に類似した新規遺伝子に挿入されたことによって
生じ、12がDNAおよびタンパク質データベースにエント
リーされたものと類似しない配列に挿入された子のによ
って生じたことを示した（参考文献5,実施例１および本
実施例）。
３つの証拠により、最初にＡ、ＢおよびＣと称した、
ゲノムの３つの領域に新規配列への19の内の16のトラン
スポゾンが集まっていることが示唆された。第一に、ト
ランスポゾン挿入ポイントに隣接する領域のヌクレオチ
ド配列を、互いにかつデータベースの配列と比較するこ
とにより、ある配列が互いに重複するかもしくは、同じ
遺伝子の異なる領域に強力に類似することが示された。
第二に、いくつかの制限酵素で切断され、かつ、トラン
スポゾン挿入ポイントに隣接する制限フラグメントでプ
ローブされたゲノムDNAのサザン解析により、あるトラ
ンスポゾン挿入が同じ制限フラグメント上に局在するこ
とが示唆された。第三に、同じDNAプローブがS.typhimu
riumλDNAライブラリーのプラークにハイブリダイズし
た場合、先の二つの段階が関連すると示唆した変異体か
らのプローブが同じλDNAクローンにハイブリダイズす
ることが見いだされた。しかして、２つの変異体（P9B7
およびP12F5）をクラスターＡとし、５つの変異体（P2D
6、P9B6、P11C3、P11D10およびP11H10）をクラスターＢ
とし、９つの変異体（P3F4、P4F8、P7A3、P7B8、P7G2、
P8G12、P9G4、P10E11およびP11B9）をクラスターＣとし
た（図８）。
これら３つのクラスターからのDNAプローブの、Mud−
P22プロファージにロックされた一連のS.typhimurium株
の溶解物へのハイブリダイゼーションは（15,16）、３
つの座が30〜31分の領域に全て局在することを示し（エ
ディションVIII、参考文献22）（図７）、このことは、
これら３つの座が密接に関連するかもしくは、一つの大
きな毒性座を構成することを示唆している。クラスター
Ａ、ＢおよびＣをカバーするあらゆるλクローンが重複
DNA挿入物を含有するか否かを調べるために、各クロー
ンの末端領域のDNAフラグメントを、他のλクローンの
サザンハイブリダイゼーション解析のプローブとして用
いた。ハイブリダイズするDNAフラグメントは、いくつ
かのλクローンが重複し、かつ、クラスターＡ、Ｂおよ
びＣが一つの連続領域を含有することを示した（図
８）。この領域の末端からのDNAフラグメントを、隣接
領域を示す挿入物を含むさらなるクローンを同定するた
めのλライブラリーをプローブするために使用した。こ
の座の最右端をカバーするλクローンは一つも同定され
ず、この領域は、Mud−P22プロファージ株TT15244の溶
解物からの6.5kbのEcoR I/Xba Iフラグメントをクロー
ニングすることによって得られた（16）。
制限地図およびサザンハイブリダイゼーション解析を
用いてこの座の物理的地図を作成した（図８）。よく調
べられた63分のinv/spa遺伝子クラスターからこの座を
区別するために（エディションVIII、参考文献22）（8,
9,23,24,25,26）、前者を毒性遺伝子クラスターＩ（VGC
1）と呼び、後者を新規の毒性座VGC2と称した。図２
は、ヌクレオチド配列が調べられたDNAの二つの部分の
位置を示す（“配列1"および“配列2"）。ヌクレオチド
配列は図11と図12に示されている。
S.typhimuriumクロモソーム上のVGC2の境界のマッピン
グ。VGC2の左側のλクローン７のヌクレオチド配列は、
推定されるアミノ酸配列がE.coliのydhE++遺伝子のセグ
メントの誘導産物に90％以上同一な読み枠（an open re
ading frame:ORF）の存在を示し、VGC2の右側の6.5kb E
coR I/Xba Iクローン化フラグメントの配列は、推定さ
れるアミノ酸配列がpykF遺伝子によってコードされたE.
coliのピルビン酸キナーゼＩに90％以上同一なORFの存
在を示した（27）。E.coliでは、37〜38分のところに、
クロモソームydhEとpykFが互いに密接に局在している
（28）。VGC2の長さに沿って分散した11の非重複DNAフ
ラグメントを、E.coliとS.typhimuriumゲノムDNAの非厳
密サザンハイブリダイゼーション解析においてプローブ
として使用した。ハイブリダイズするDNAフラグメント
は、VGC2を含む約40kbの領域がE.coliゲノムから欠失
し、1kb以内にVGC2の境界が局在することを示した（図
９）。VGC2の右側末端に近いXba I部位の局在を（図
８）、クロモソームの30分の領域（22）の既知のXba I
部位（29）のマップと比較することにより、30.7分のマ
ップ位置がVGC2に推定される。
VGC2の構造。VGC2の一部のヌクレオチド配列決定によ
り、19のORFの存在が明らかになった（図８）。VGC2の
約26kbのヌクレオチド配列のＧ＋Ｃ容量は44.6％であ
り、VGC1では47％（９）、完全なSalmonellaゲノムでは
51−53％と予想される（30）。
ORF1−11の完全に推定されたアミノ酸配列は、タイプ
III分泌システムのタンパク質の配列に類似しており
（6,7）、植物および動物の種々の細菌性病原における
毒性決定因子の輸出に必要とされることが知られている
（７）。ORF1−８の推定されたタンパク質（図８）は、
構成および配列の点で、Yersinia pseudotuberculosis
のyscN−Ｕ遺伝子の産物（31）、Salmonella typhimuri
umのVGC1のinv/spaクラスターのincV/spaS（8,9）およ
びShigella flexneriのspa/mxiのspa47/spa40に類似し
ている（32,33,34,35）。例えば、ORF3の推定されたア
ミノ酸配列（図８）は、Y.pseudotuberculosisのYscSに
50％同一であり（31）、S.flexneriのSpa9に34％同一で
あり（35）、S.typhimuriumのVGC1のSpaQに37％同一で
ある（９）。ORF9の推定されたタンパク質産物は、Y.en
terocoliticaのLcrDに43％の同一性（36）、S.flexneri
のMxiAに39％の同一性（32）並びにVGC1のInvAに40％の
同一性（23）を備えたタンパク質のLcrDファミリーに密
接に関連する。図８に示された残りのORFの部分的ヌク
レオチド配列は、ORF10から推定されるタンパク質が、
Y.enterocolitica YscJ（37）細菌の外膜に局在するリ
ポタンパク質に最も類似しており、ORF11がS.typhimuri
um InvG、トランスロカーゼに類似すること（38）を示
している。ORF12とORF13はそれぞれ、二成分制御システ
ムを含む種々のタンパク質の、センサーおよび制御サブ
ユニットに重要な類似性を示す（39）。ORF9と10、ORF1
0と11、ORF19とVGC2の右側末端との間にさらなる遺伝子
の十分なコード容量がある。
VGC2はSalmonellaeの間で保存され、かつ、これらに特
異的である。DNAおよびタンパク質データベースにエン
トリーされたものに類似した配列を欠くVGC2の中心に局
在する2.2kbのPst I/Hind III（プローブＢ、図８）
を、Salmonella血液型亜型と他の病原性細菌のゲノムDN
Aのサザンハイブリダイゼーション解析におけるプロー
ブとして用いた（図10A）。非厳密条件下でハイブリダ
イズしたDNAフラグメントは、VGC2がS.aberdeen、S.gal
linarum、S.cubana、S.typhiに存在し、EPEC、EHEC、Y.
pestis、S.flexneri、V.cholera、S.aureusに存在しな
いことを示した。しかして、VGC2はSalmonellaeに保存
され、これらに特異的なのであろう。
座の構成が試験したSalmonella serovarsに保存され
ているか否かを調べるために、二つのさらなる制限酵素
で切断したゲノムDNAを用いて厳密なサザンハイブリダ
イゼーションを行った。ハイブリダイズするDNAフラグ
メントは、S.typhimurium LT2とS.gallinarum、S.cuban
aとS.typhiとの間に制限部位の再構成に何らかの不均一
性があることを示した（図10B）。さらに、S.gallinari
umとS.typhiは、調べた他のSalmonellaeに存在するもの
にさらにハイブリダイズするフラグメントを含み、VGC2
の領域がこれらの種で二重になっていることを示してい
る。
VGC2はマウスにおける毒性に必須である。先の実験は、
トランスポゾン変異体P3F4,P7G2,P9B7およびP11C3のi.
p.接種のLD50の値が、野生型株より少なくとも100倍優
れていることを示した（５）。感染工程におけるVGC2の
重要性を明確にするために、変異体P3F4とP9B7のp.oお
よびi.p.LD50値を調べた（表１）。両方の変異体が、親
株と比較して各接種経路により少なくとも５オーダーの
大きさの毒性の低減を示した。接種の両方の経路による
毒性の低減は、BALB/cマウスにおける上皮細胞浸透後の
感染に必要である。
論考 弱毒化された一つのグループのシグナルが付されたト
ランスポゾン変異体の挿入ポイントをマッピングするこ
とにより、クロモソーム上の30.7分に局在した約40kbの
S.typhimuriumのこれまで未知であった毒性座が同定さ
れた（５）。この座は、VGC1と改名することを提案した
63分のinv/spa毒性遺伝子（エディションVIII、参考文
献22）から区別するために毒性遺伝子クラスター２（VG
C2）と称される。VGC1およびVGC2の両方は、タイプIII
分泌システムの成分をコードする。しかしながら、これ
らの分泌システムは機能的に区別される。
新しい遺伝子への挿入によって生じた19の変異体の内
（参考文献５およびこの例）、16がクロモソームの同じ
領域にマップされた。優先的に小型Tn5挿入がVGC2に起
こる可能性がある。あるいは、弱毒化した変異体を同定
するために用いられたネガティブ選別（５）が非常に厳
密なので（VGC2変異体の高いLD50値に反映される）、先
に未知の遺伝子の中では、VGC2の変異のみが選別で回収
されるに十分な弱毒化の程度を生じることが可能であ
る。S.typhimurium毒性決定因子の先の調査がVGC2を同
定できなかったのは、感染した生きた動物モデルよりも
むしろ細胞培養アッセイに対する信頼から生じる。Salm
onellaeに独特なS.typhimurium LT2クロモソームの領域
を同定した先の研究（40）は、30.5−32分にこのような
領域（RF333）を局在化した。それゆえ、RF333は、VGC2
に対応する、しかしながら、RF333が毒性決定因子に関
連することはわからなかった。
YersiniaとShigellaの毒性プラスミドにコードされた
タイプIII分泌システム、並びにSalmonellaのVGC1との
比較により、VGC2が分泌装置の基本的な構成成分をコー
ドすることが示された。さらに、VGC2のORF1−８のオー
ダーは、相同性において、Yersinia、ShigellaおよびS.
typhimuriumのVGC1の遺伝子オーダーと同じである。VGC
2分泌システムの構成および構造は、VGC2の低いＧ＋Ｃ
含量と共に、Yersiniaの対応する遺伝子よりもVGC1に密
接に関連していないという事実は、VGC2が、VGC1のよう
に（40,41,42）、水平伝播を介してS.typhimuriumによ
って独立に獲得されることを示唆している。ORF12と13
にコードされたタンパク質は、細菌性の二成分制御因子
に強力に類似しており（39）、ORF1−11および／または
このシステムの分泌されたタンパク質を制御することが
できる。
VGC1の多くの遺伝子が、上皮細胞へのS.typhimurium
の進入に重要であることが示された。この工程は細菌の
接触を必要とし（２）、局在化した膜の乱れを生じる細
胞骨格の再構成を引き起こす（43,44）。VGC1の役割と
この段階の感染への制限は、VGC1変異体をp.o.接種した
BALB/cマウスにおいて約50倍の弱毒化が生じたこと、並
びに、i.p.投与した場合にはVGC1変異体が毒性の欠如を
示さないという事実に反映される（８）。第二の観察
は、VGC1変異体が我々の選別で得られなかった理由を説
明する（５）。対照的に、VGC2の変異体は、p.o.および
i.p.接種の両方で大いに弱毒化される。このことは、VG
C1とは違って、VGC2が上皮細胞浸透後にマウスにおいて
毒性を必要とすることを示すが、これらの知見は感染の
初期段階でVGC1の役割を除外しない。
しかして、要約すると、Salmonella typhimuriumクロ
モソーム上の16のシグナルが付されたトランスポゾン変
異体の挿入ポイントをマッピングすることにより、30.7
のところに40kbの毒性遺伝子クラスターを同定した。こ
の座は、調べた他の全てのSalmonella種に保存されてい
るが、他の種々の病原性細菌もしくはEscherichia coli
K12には存在しない。この座の一部のヌクレオチド配列
決定により、推定されるタンパク質がタイプIII分泌シ
ステムの成分をコードする11の読み枠が示された。これ
とinv/spa進入座にコードされたタイプIII分泌システム
とを区別するために、inv/spa座を毒性遺伝子クラスタ
ー１（VGC1）と称し、新規の座をVGC2と称した。VGC2
は、Salmonellaゲノムよりも低いＧ＋Ｃ含量を備え、産
物がE.coli ydhEおよびpykF遺伝子と90％以上の同一性
を備えた遺伝子に隣接している。しかしてVGC2は、おそ
らくE.coliのydhEおよびpykF遺伝子の間の領域に対応す
る領域に挿入することによって水平（horizontally）に
得られた。VGC2変異体の毒性の研究により、経口もしく
は腹腔内接種した野生株と比較して少なくとも５倍のオ
ーダーの弱毒化を受けることが示された。
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2）Mol.Microbiol.6,3077−3087. 実施例5:Streptococcus pneumoniaeの毒性遺伝子の同定 （ａ）変異誘発 便利なトランスポゾンシステムがない場合、Streptoc
occus pneumoniaeのタグが付された変異体を作成する最
も効率的な方法は、挿入二重変異誘発（insertion−dup
lication mutagenesis）を用いることである（Morrison
ら（1984）J.Bacteriol.159,870）。200−400bpの不規
則なS.pneumoniaeDNAフラグメントは、制限酵素を用い
たゲノムDNA切断によって、あるいは、音波処理で物理
的にせん断して、ゲル濾過し、T4 DNAポリメラーゼを用
いてDNA末端を修復することによって生成される。この
フラグメントを、予めポリリンカークローニング部位の
一つにDNA配列タグを取り込むことによって修飾され
た、プラスミドpJDC9（Pearceら（1993）Mol.Microbio
l.9,1037、E.coliとS.pneumoniaeにおけるエリスロマイ
シン選別用のerm遺伝子を保有する）にリゲートする。
クローン化されたS.pneumoniae DNAのサイズは、相同な
組み替えを確実にするのに十分であり、E.coliにおいて
非代理的なライブラリーを生成する可能性が低い（S.pn
eumoniaeタンパク質の発現は、E.coliに対して毒性とな
りうる）。異なる選択バーカーを保有する他のベクター
を利用することができ、pJDC9の代わりに用いることが
できる。DNAフラグメントを保有するタグが付されたプ
ラスミドは、肺炎球菌性肺炎（pneumococcal penumoni
a）のマウスモデルにおける血清型および毒性に基づい
て選択された適切なS.pneumoniae株に導入される。S.pn
eumoniaeにおける遺伝的形質転換の能力の制御は能力因
子、シカゴのイリノイ大学のDon Morrisonのグループに
よって最近特徴決定され、Havarstein,CoomaraswamyとM
orrison（1995）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,11140−11
144に記載された17アミノ酸のペプチドによって制御さ
れる。形質転換実験におけるこのペプチドの精密な取り
込みにより、あるカプセルに収容された臨床的なS.pneu
moniaeの単離物において非常に効率的な形質転換頻度が
導かれる。これは、pneumococcalの分子遺伝学の主要な
ハードルを克服し、ペプチドの有効性が、S.pneumoniae
変異体バンクの作成を容易にし、変異される株の選択に
柔軟性を与える。形質転換体の比率を解析してプラスミ
ド配列の相同的組み込みを確認し、安定性をチェックし
た。挿入重複（insertion−duplication）によって生成
された変異体に係る非常に低レベルの復帰は、重複領域
を短くする（200−400bp）ことによって最小化される。
しかしながら、復帰レベルが許容以上に高いと、培養に
おける形質転換体の生育および動物での成育の間に、抗
生物質選択が維持される。
（ｂ）動物モデル S.pneumoniae変異体バンクを、Swissおよび／またはC
57B1/6マウスに接種するためのプールに編成した。予備
実験を行って、プールの最適な複合体と最適な接種レベ
ルを調べた。一つの魅力的なモデルは、気管に口から輸
送される105cfuの接種を利用する（Veberら（1993）J.A
ntimicrobial Chemotherapy 32,473）。Swissマウスは
３−４日以内に急性肺炎を引き起こし、C57B1/6マウス
は８−10日以内に準急性肺炎を起こした。これらの肺の
感染モデルは、死亡時に108cfu/肺の収率であった（Veb
erら（1993）J.Antimicrobial Chemotherapy 32,47
3）。必要であれば、血流感染に必要な遺伝子の同定の
ために腹腔内にも注入する（Sullivanら（1993）Antimi
crobial Agents and Chemotherapy 37,234）。
（ｃ）毒性遺伝子同定 感染モデルのパラメーターが最適化されたら、数千株
からなる変異体バンクを毒性試験にかける。弱毒化され
た変異体を、プローブとして“インプット”と“回収”
プールからの標識されたタグを用いて、ハイブリダイゼ
ーション解析によって同定する。S.pneumoniaeDNAが容
易にコロニーブロットされなければ、染色体DNAを、ド
ットブロット装置を用いてナイロン膜上に移す前にミク
ロタイター皿のウェルの中で化学的もしくは酵素的に遊
離させる。組み込まれたプラスミドに隣接するDNAを、
E.coliにおけるプラスミドレスキューによってクローン
化し（Morrisonら（1984）J.Bacteriol.159,870）、配
列決定する。ゲノムDNAライブラリーを、E.coliもしく
はグラム陽性宿主株のいずれかに維持された適切なベク
ターに構築し、組み込まれたプラスミドに隣接する制限
フラグメントでプローブして、クローン化された毒性遺
伝子を単離し、完全に配列決定して、詳細な機能解析を
行う。
実施例6:Enterococcus faecalisの毒性遺伝子の同定 （ａ）変異誘発 E.faecalisの変異誘発を、この目的のために開発され
たpAT112またはその誘導体を用いて行う。pAT112は、グ
ラム陰性およびグラム陽性細菌の両方において選別を行
うための遺伝子、Tn1545のatt部位を保有する。それゆ
え、宿主株に転位のためのインテグラーゼが存在する必
要があり、宿主が切除酵素遺伝子（an excisionase gen
e）を含まなければ安定な単一のコピーの挿入が得られ
る（Trieu−Cuotら（1991）Gene 106,21）。組み込まれ
たプラスミドに隣接するDNAの回収は、ゲノムDNAの制限
切断、分子内リゲーションおよびE.coliの形質転換によ
って行われる。pAT112の制限酵素の単一な部位およびそ
の変異体の存在（Trieu−Cuotら（1991）Gene 106,21）
により、接合、エレクトロポレーションもしくは形質転
換のいずれかによって、プラスミドpAT145を保有するE.
faecalisの毒性株に移す（インテグラーゼ機能を付与す
るため）前にDNA配列タグの取り込みができる（Trieu−
Cuotら（1991）Gene 106,21;Wirthら（1986）J.Bacteri
ol.165,831）。
（ｂ）動物モデル 多数の挿入変異体を、トランスシピエント（transcip
ients）からのDNAの単離、制限酵素分解およびサザンハ
イブリダイゼーションによってプラスミドのランダムな
組み込みについて解析した。個々の変異体をミクロタイ
ター皿にウェルに貯蔵し、プールされた接種物の形態
（complexity）とサイズを、変異バンクの選別の前に最
適化する。E.faecalisによって引き起こされた感染の二
つの異なるモデルを用いた。最初はよく調べられた心内
膜炎（endocarditis）のラットモデルであり、カテーテ
ルが大動脈弁（the arotic valve）を横切って挿入され
た動物に108cfuまでのE.faecalisを尾の静脈注入するこ
とを含む（Whitmanら（1993）Antimicrobial Agents an
d Chemotherapy 37,1069）。接種後種々の時間に動物を
死亡させ、大静脈弁の細菌のゆう形成（vegetations）
を切り取り、ホモジェナイズし、培養培地にプレートし
て、細菌コロニーを回収した。毒性細菌を、接種後種々
の時間で血液から回収した。第二のモデルは、109cfuの
E.faecalisの腹腔内注入後のマウス腹膜炎である（Chen
owethら（1990）Antimicrobial Agents and Chemothera
py 34,1800）。S.pneumoniaeモデルを用いた場合のよう
に、予備的実験を行って、変異体バンクをスクリーニン
グする前に、プールの最適な形態と最適な接種レベルを
確立した。
（ｃ）毒性遺伝子同定 複製のそのE.coliオリジンを用いたpAT112の組み込み
部位に隣接するDNAの単離は、一般的に用いられたベク
ターの6bp認識制限酵素のほとんどの部位を欠くことに
よって簡単にされる。それゆえ、関心の株のDNAを、こ
れらの酵素の一つで切断し、自己リゲートし、E.coliに
形質転換され、プラスミドのatt部位に隣接する配列に
基づくプライマーを用いて配列決定した。E.faecalisの
ゲノムDNAライブラリーを関心のある配列でプローブ
し、毒性遺伝子の完全なコピーを同定し、配列決定し
た。
実施例7:Pseudomonas aeruginosaの毒性遺伝子の同定 （ａ）変異誘発 トランスポゾンTn5は、Pseudomonas aeruginosaを変
異誘発するために他によって用いられ、Salmonella typ
himurium毒性遺伝子の同定のために用いられた小型Tn5
誘導体（実施例１）は、いくつかのシュードモナス（ps
eudomonads）を含むグラム陰性細菌の間で広く利用でき
ることが報告されているので（DeLorenzoとTimaris（19
94）Methods Enzymol.264,386）、一つ以上の毒性（あ
るいはムコイド）受容個体株に自殺ベクターを接合転移
することによって、P.aeruginosa変異体バンクは、シグ
ナルが付与された小型Tn5トランスポゾンの現存するプ
ールを用いて構築された。特異的にP.aeruginosa変異体
と称されるTn5の他の誘導体（Rellaら（1985）Gene 33,
293）は、小型Tn5トランスポゾンと共に用いられる。
（ｂ）動物モデルと毒性遺伝子の同定 P.aeruginosa挿入変異体のバンクを、ラットの慢性的
肺感染モデルにおける弱毒化を選別する。P.aeruginosa
細胞の懸濁液を、気管切開後の気管支に接種し、30日後
に疾患が生じた（Woodsら（1982）Infect.Immun.36,122
3）。研究培地に肺のホモジェナートをプレートするこ
とによって細菌を回収し、これらの配列タグを、接種物
として用いられた細菌のDNAコロニーブロットをプロー
ブするために用いた。変異体バンクを内在性菌血症（Hi
rakataら（1992）Antimicrobial Agents and Chemother
apy 36,1198）およびマウスののう胞性繊維症（Davidso
nら（1995）Nature Genetics 9,351）のモデルにおける
毒性試験にかけることもできる。トランスポゾンに隣接
するDNAのクローニングおよび配列決定を、実施例１に
記載されているようにして行った。遺伝子の完全なコピ
ーを単離および配列決定するためのゲノムDNAライブラ
リーを、標準的な方法で研究室で作成した。
実施例8:Aspergillus fumigatusの毒性遺伝子の同定 （ａ）変異誘発 真菌のトランスポゾン変異の機能的等価物は、形質転
換DNAの制限酵素仲介組み込み（restriction enzyme me
diated integration:REMI）である（SchiestlとPetes
（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.88,7585）。この方法で
は、真菌細胞を制限酵素の存在下で選択可能なマーカー
を保有するDNAフラグメントで形質転換し、単一コピー
の組み込みが異なるゲノム部位に生じ、制限酵素の標的
配列によって定義される。REMIはコクリオボルス（Coch
liobolus）（Luら（1994）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,
12649）とウスティラゴ（Ustilago）（Bolkerら（199
5）Mol.Gen.Genet.248,547）の毒性遺伝子の単離に用い
られており、ヒグロマイシン耐性をコードするプラスミ
ドと共に活性な制限酵素の取り込みにより、A.fumigatu
sゲノムに直線上プラスミドの一回かつ明らかに不規則
な組み込みを生じる。配列タグは、ヒグロマイシン耐性
の二つのベクターの一方の便利な部位に取り込まれ、A.
fumigatusの臨床的単離物を形質転換するのに用いられ
る。
（ｂ）動物モデルと毒性遺伝子同定 好中球減少マウス（neutropenic mice）のアスペルギ
ルス症の低用量モデルは、人の肺の疾患のコースに特に
密接に適合する（Smithら（1994）Infect.Immun.62,524
7）。マウスに1000000コニジオスポア（conidiospore
s）／マウスまでを鼻腔内に接種し、肺のホモジェナー
トを用いて毒性真菌変異体を７−10日後に回収し、液体
培地に接種した。菌糸を数時間後に回収し、そのDNAを
増幅し、接種物を含む形質転換体のプールからのDNAの
コロニーブロットをプローブするためのタグをラベルす
るために抽出した。REMI挿入ポイントに隣接する領域の
DNAを、REMIベクターの外側を切断する制限酵素で形質
転換DNAを切断し、自己リゲートし、かつE.coliを形質
転換することによってクローン化した。プラスミドの既
知の配列に基づくプライマーを用いて、隣接するA.fumi
gatus DNA配列を調べた。ベクターの挿入が無毒表現形
の原因であることを調べるために、回収されたプラスミ
ドをクローニングに用いたのと同じ制限酵素で再度切断
し、野生型A.fumigatus親株に戻した。相同的組み換え
により生じた形質転換体に毒性試験を行った。
参考文献（実施例４以外） Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Sei
dman,J.G.,Smith,J.A.and Struhl,K.（1987）Current P
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DNA fragments by illegitimate recombination in Sa
ccharomyces cerevisiae.Proc.Natl.Acad.Sci USA.88,7
585−7589.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｑ 1/04 1/68 Ａ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ９５０９２３９．１ (32)優先日 平成７年５月５日(1995．5．5) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (73)特許権者 999999999 マイクロサイエンス リミテッド イギリス国 アールジー41 ５ティーユ ー バークシャイアー、ウォッキンガ ム、ウィナーシュ トライアングル、エ スクデール ロード 545 (74)上記１名の代理人 999999999 弁理士 志賀 正武 (72)発明者 ホールデン，デイヴィッド ウィリアム イギリス国 Ｗ12 ０ＮＮ ロンドン デュ ケイン ロード （番地なし） ハマースミス ホスピタル ロイヤル ポストグラデュエイト メディカル ス クール デプト オブ インフェクシャ ス ディズィーズィズ アンド バクテ リオロジー (72)発明者 シーア，ジャクリーヌ エリザベス イギリス国 ＨＰ13 ６ＤＨ バッキン ガムシャー ハイ ウィコーム トッタ リッジ ザ バーチズ ２ (72)発明者 ヘンゼル，ミハエル ドイツ Ｄ−80336 ミュンヘン マッ クス フォン ペテンコファー−インス ティテュト ラールステュル フューア バクテリオロジー （番地なし) (56)参考文献 Ｊａｍｅｓ Ｍ．Ｓｌａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｅｘｐｒｅ ｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆ ｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａ ｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｓ Ｓｐｅｃ ｉｆｉｃａｌｌｙ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｉ ｎ Ｈｏｓｔ Ｔｉｓｓｕｅｓ，Ｍｅｔ ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ ｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ, 1994年，Ｖｏｌ．235，ｐ．481−492 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/01 C12N 1/15 C12N 1/21 C12Q 1/04 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (43)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（１）それぞれの変異体が異なるマーカー
    配列を含むように、独特のマーカー配列を含む核酸を用
    いて遺伝子を挿入不活性化することによって、独立に変
    異した複数の微生物、もしくはその微生物のクローンを
    用意する工程、 （２）工程（１）で調製した各変異体の貯蔵サンプルを
    個々に用意し、個々の変異体から独特のマーカー配列を
    含む個々に貯蔵された核酸を用意する工程、 （３）工程（１）で調製した複数の変異体を特定の環境
    に導入し、生育可能な微生物を前記環境下で生育させる
    工程、 （４）前記環境もしくはその選択された一部から微生物
    を回収し、回収された微生物から核酸を単離する工程、 （５）工程（４）で単離された核酸中のあらゆるマーカ
    ー配列を、工程（２）で貯蔵した各変異体の独特のマー
    カー配列と比較する工程、および、 （６）工程（４）で単離されたいずれのマーカー配列も
    含まない個々の変異体を選択する工程を含み、前記特定
    の環境が人体ではない、特定の環境に対する適応が低減
    した微生物を同定する方法。
  2. 【請求項２】（１）それぞれの変異体が異なるマーカー
    配列を含むように、独特のマーカー配列を含む核酸を用
    いて遺伝子を挿入不活性化することによって、独立に変
    異した複数の微生物、もしくはその微生物のクローンを
    用意する工程、 （２）工程（１）で調製した各変異体の貯蔵サンプルを
    個々に用意し、個々の変異体から独特のマーカー配列を
    含む個々に貯蔵された核酸を用意する工程、 （３）工程（１）で調製した複数の変異体を特定の環境
    に導入し、生育可能な微生物を前記環境下で生育させる
    工程、 （４）前記環境もしくはその選択された一部から微生物
    を回収し、回収された微生物から核酸を単離する工程、 （５）工程（４）で単離された核酸中のあらゆるマーカ
    ー配列を、工程（２）で貯蔵した各変異体の独特のマー
    カー配列と比較する工程、および、 （６）工程（４）で単離されたいずれのマーカー配列も
    含まない個々の変異体を選択する工程を含み、前記特定
    の環境が分化した多細胞生物である場合には、当該生物
    がヒト以外の動物または植物である、特定の環境に対す
    る適応が低減した微生物を同定する方法。
  3. 【請求項３】それぞれ独特のマーカー配列を含む核酸を
    含む工程（１）に定義された複数の微生物が、第一の所
    定の条件から第二の所定の条件に条件を変えることによ
    って複数の微生物から生成され、（ａ）第一の所定の条
    件では、独特のマーカーを含む前記核酸がエピソームに
    維持され、（ｂ）第二の所定の条件では、独特のマーカ
    ー配列を含む前記核酸が挿入的に遺伝子を不活性化す
    る、請求項１または２記載の方法。
  4. 【請求項４】（1A）工程（１）で生成された複数の変異
    体から栄養素要求体を除去する工程；もしくは、 （6A）工程（６）で選別された変異体が栄養素要求体で
    あるか否かを調べる工程；あるいは、 （1A）と（6A）の両方をさらに含む、請求項１ないし３
    のいずれか一項に記載の方法。
  5. 【請求項５】請求項１ないし４のいずれか一項の方法に
    続いて、 （７）工程（６）で選別された個々の変異体から挿入不
    活性化遺伝子を単離する工程 を含む、特定の環境に微生物を適応させる遺伝子の同定
    方法。
  6. 【請求項６】以下の工程、すなわち （８）工程（７）で単離された挿入不活性化遺伝子をプ
    ローブとして用いて対応する野生型遺伝子を野生型微生
    物から単離する工程 をさらに含む、請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】特定の環境が分化した多細胞生物である、
    請求項１ないし６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 【請求項８】多細胞生物が植物である、請求項７記載の
    方法。
  9. 【請求項９】多細胞生物がヒト以外の動物である、請求
    項７記載の方法。
  10. 【請求項１０】動物がマウス、ラット、ウサギ、イヌま
    たはサルである請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】動物がマウスである、請求項10記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】工程（４）において、工程（３）の導入
    部位から離れた部位で前記環境から微生物を回収する、
    請求項７ないし11のいずれか一項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】工程（３）において、経口もしくは腹腔
    内に微生物が導入される、請求項９ないし11のいずれか
    一項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】工程（４）において、微生物が脾臓から
    回収される請求項13記載の方法。
  15. 【請求項１５】微生物が細菌である、請求項１ないし14
    のいずれか一項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】微生物が真菌である、請求項１ないし14
    のいずれか一項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】微生物が植物に対して病原性の細菌であ
    る、請求項８に記載の方法。
  18. 【請求項１８】微生物が植物に対して病原性の真菌であ
    る、請求項８に記載の方法。
  19. 【請求項１９】微生物が動物に対して病原性の細菌であ
    る、請求項９ないし11のいずれか一項に記載の方法。
  20. 【請求項２０】微生物が動物に対して病原性の真菌であ
    る、請求項９ないし11のいずれか一項に記載の方法。
  21. 【請求項２１】細菌が、Bordetella pertussis、Campyl
    obacter jejuni、Clostridium botulinum、Escherichia
    coli、Haemophilus ducreyi、Haemophilus influenza
    e、Helicobacter pylori、Klebsiella pneumoniae、Leg
    ionella pneumophila、Listeria spp.、Neisseria gono
    rrhoeae、Neisseria meningitidis、Pseudomonas sp
    p.、Salmonella spp.、Shigella spp.、Staphylococcus
    aureus、Streptococcus pyogenes、Streptococcus pne
    umoniae、Vibrio spp.およびYersinia pestisのいずれ
    か一つである、請求項19記載の方法。
  22. 【請求項２２】真菌が、Aspergillus spp.、Cryptococc
    us neoformansおよびHistoplasma capsulatumのいずれ
    か一つである、請求項20に記載の方法。
  23. 【請求項２３】工程（１）において、遺伝子が、独特の
    マーカー配列を有するトランスポゾンもしくはトランス
    ポゾン様成分もしくは他のDNA配列を用いて挿入的に不
    活性化される、請求項１ないし22のいずれか一項記載の
    方法。
  24. 【請求項２４】工程（１）において、それぞれ異なるマ
    ーカー配列の両側に、前記核酸に共通な配列が隣接して
    いる、請求項１ないし23のいずれか一項に記載の方法。
  25. 【請求項２５】工程（２）において、独特のマーカーを
    含む核酸が、DNA増幅技術および前記共通配列にハイブ
    リダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを用いて単
    離される、請求項24記載の方法。
  26. 【請求項２６】工程（４）において、複数の前記マーカ
    ー配列を含む核酸が、DNA増幅技術および前記共通配列
    にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを
    用いて単離される、請求項24または25記載の方法。
  27. 【請求項２７】（ａ）請求項５記載の工程を用いて微生
    物を特定の環境に適応させる遺伝子を同定する工程、お
    よび （ｂ）微生物の対応する野生型遺伝子に変異を特異的に
    導入して変異微生物を産生する工程 を実施することを含む、変異微生物を作製する方法。
  28. 【請求項２８】遺伝子の変異が、欠失またはフレームシ
    フト変異または実質的に不可逆的な他のあらゆる変異で
    ある、請求項27記載の方法。
  29. 【請求項２９】対応する野生型遺伝子が、工程（７）の
    単離された挿入不活性化遺伝子またはその一部に、スト
    リンジェントな条件下でハイブリダイズする、請求項27
    記載の方法。
  30. 【請求項３０】微生物が病原性微生物であり、その微生
    物を特定の環境に適応させる遺伝子がビルレンス遺伝子
    である、請求項27ないし29のいずれか一項に記載の方
    法。
  31. 【請求項３１】微生物が動物に対して病原性である、請
    求項27ないし30のいずれか一項に記載の方法。
  32. 【請求項３２】微生物が植物に対して病原性である、請
    求項27ないし30のいずれか一項に記載の方法。
  33. 【請求項３３】微生物が、特にB.pertussis等のBordete
    lla spp.、特にC.jejuni等のCampylobacter spp.、特に
    C.botulinum等のClostridium spp.、特にE.faecalis等
    のEnterococcus spp.、特にE.coli等のEscherichia sp
    p.、特にH.ducreyiおよびH.influenzae等のHaemophilus
    spp.、特にH.pylori等のHelicobacter spp.、特にK.pn
    eumoniae等のKlebsiella spp.、特にL.pneumophila等の
    Legionella spp.、特にL.monocytogenes等のListeria s
    pp.、特にM.smegmatisおよびM.tuberculosis等のMycoba
    cterium spp.、特にN.gonorrhoeaeおよびN.meningitidi
    s等のNeisseria spp.、特にPs.aeruginosa等のPseudomo
    nas spp.、Salmonella spp.、Shigella spp.、特にS.au
    reus等のStaphylococcus spp.、特にS.pyogenesおよびp
    neumoniae等のStreptococcus spp.、Vibrio spp、特に
    Y.pestis等のYersinia spp.、Aspergillus spp.,特にA.
    fumigatus、Cryptococcus neoformans、Histoplasma ca
    psulatum、およびToxoplasmaのいずれかである、請求項
    31記載の方法。
  34. 【請求項３４】微生物が、Agrobacterium tumefaciens;
    Erwinia amylovara;Pseudomonas solanacearum;Rhizobi
    um leguminosarum;Xanthomonas campestris p.v.citri;
    Magnaporthe grisea;Fusarium spp.;Erisyphe spp.;Col
    letotrichum gloeosporiodes;Gaeumannomyces gramini
    s;Glomus spp.,Laccaria spp.;Leptosphaeria maculan
    s;Phoma tracheiphila;Phytophthora spp.,Pyrenophora
    teres;Verticillium alboatrumおよびV.dahliae;およ
    びMycosphaerella musicola並びにM.fijiensisのいずれ
    かである、請求項32記載の方法。
  35. 【請求項３５】工程（１）の複数の微生物がサルモネラ
    属（Salmonellae）であり、請求項27記載の工程（ｂ）
    で作製された変異微生物が変異サルモネラ菌である、請
    求項27記載の方法。
  36. 【請求項３６】別の病原のワクチンとして作用しうる変
    異微生物を作製する方法であって、前記別の病原からの
    抗原性エピトープを発現する請求項31記載の変異微生物
    を作製する工程を含む方法。
  37. 【請求項３７】請求項31または36記載の変異微生物を作
    製し、かつ、免疫原性製剤へと調合することを含む、ワ
    クチンの作製方法。
  38. 【請求項３８】免疫原性製剤がアジュバントを含む、請
    求項37記載の方法。
  39. 【請求項３９】変異微生物の薬学的製剤を作製する方法
    であって、請求項31または36記載の変異微生物を一以上
    の薬学的に許容できるキャリアーと混合することを含む
    方法。
  40. 【請求項４０】特定の環境に適応できる微生物の能力を
    低減する化合物を同定する方法であって、以下の工程： （ａ）請求項５記載の方法により微生物を特定の環境に
    適応させる遺伝子を同定する工程、および （ｂ）前記遺伝子または微生物の対応する野生型遺伝子
    の機能を妨げる化合物、または係る遺伝子にコードされ
    るポリペプチドを妨げる化合物を選択する工程 を含む方法。
  41. 【請求項４１】対応する野生型遺伝子が、請求項５記載
    の方法の工程（７）で単離された挿入不活性化遺伝子ま
    たはその一部に、ストリンジェントな条件下でハイブリ
    ダイズする、請求項40記載の方法。
  42. 【請求項４２】特定の環境に適応でき、動物に対して病
    原性である微生物の能力を低減する化合物の薬学的組成
    物を作製する方法であって、 （ａ）請求項40または41に記載の方法を用いて化合物を
    同定する工程、および （ｂ）薬学的に許容できるキャリアーと組み合わせる工
    程 を含む方法。
  43. 【請求項４３】動物に対して病原性である微生物による
    感染を予防または改善する医薬を作製する方法であっ
    て、請求項40または41に記載の方法を用いて化合物を同
    定し、かつ前記医薬へと調合することを含む方法。
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