MXPA06013502A - Metodo para mejorar la produccion de compuestos isoprenoides. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona metodos para producir un isoprenoide o precursor de isoprenoide en una celula huesped geneticamente modificada. Los metodos generalmente involucran modular el nivel de hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) en la celula, de manera que el nivel de HMG-CoA no sea toxico a la celula y/o no inhibir substancialmente el crecimiento celular, pero se mantenga a un nivel que proporcione una produccion a alto nivel de mevalonato, IPP, y otros productos corriente debajo de un isoprenoide o trayectoria de isoprenoide, por ejemplo, poliprenilo, difosfatos y compuestos isoprenoides. La presente invencion ademas proporciona celulas huesped geneticamente modificadas que son adecuadas para usarse en un metodo del tema. La presente invencion ademas proporciona construcciones de acido nucleico recombinante para usarse en la generacion de una celula huesped geneticamente modificada, incluyendo construcciones de acido nucleico recombinante que comprenden secuencias de nucleotido que codifican una o mas enzimas de trayectoria de mevalonato, y vectores recombinantes (por ejemplo, vectores de expresion recombinantes) que comprenden las mismas. La presente invencion ademas proporciona metodos para identificar acidos nucleicos que codifican variantes de HMG-CoA reductasa (HMGR) que proporcionan un alivio en la toxicidad inducida por la acumulacion de HMG-CoA. La presente invencion ademas proporciona metodos para identificar agentes que reducen la acumulacion intracelular de HMG-CoA.

Description

MÉTODO PARA MEJORAR LA PRODUCCIÓN DE COMPUESTOS ISOPRENOIDES REFERENCIA CRUZADA Esta solicitud reclama beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de E.U.A. No. 60/573,492, presentada el 21 de mayo del 2004, dicha solicitud se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

DECLARACIÓN CON RESPECTO A LA INVESTIGACIÓN FEDERALMENTE PATROCINADA El Gobierno de E.U.A. puede tener ciertos derechos en esta invención, de acuerdo con el No. de otorgamiento BES-9911463 otorgado por la Fundación de Ciencia Nacional (National Science Foundation) y número de otorgamiento FDN00014-99-0182 otorgado por la Oficina de Investigación Naval (Office of Naval Research).

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención está en el campo de la producción de compuestos isoprenoides, y en particular, células huésped que son genéticamente modificadas para producir compuestos isoprenoides.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los isoprenoides constituyen un grupo extremadamente grande y diverso de productos naturales que tienen un origen biosintético común, es decir, un precursor metabólico individual, difosfato de isopentenilo (IPP). Por lo menos 20,000 ¡soprenoides han sido descritos. Por definición, los isoprenoides están hechos de las así llamadas unidades de isopreno (C5). El número de átomos de carbono presentes en los isoprenoides típicamente de puede dividir entre cinco (C5, CIO, C15, C20, C25, C30 y C40), aunque se han reportado isoprenoides irregulares y politerpenos. Los compuestos isoprenoides también son denominados como "terpenos" o "terpenoides". Los miembros importantes de los isoprenoides incluyen los carotenoides, sesquiterpenoides, diterpenoides, y hemiterpenos. Los carotenoides incluyen, por ejemplo, licopeno, ß-caroteno, y similares, muchos de los cuales funcionan como antioxidantes. Los sesquiterpenoides incluyen, por ejemplo, artemisinina, un compuesto que tiene actividad anti-malaria. Los diterpenoides incluyen, por ejemplo, taxol, un agente quimioterapéutico para cáncer. Los isoprenoides comprenden la familia más numerosa y estructuralmente diversa de productos naturales. En esta familia, los terpenoides aislados de plantas y de otras fuentes naturales utilizan como compuestos saborizantes y de fragancias comerciales así como fármacos anti-malaria y anti-cáncer. Una mayor parte de los compuestos terpenoides en uso actualmente son productos naturales o sus derivados. Los organismos fuente (por ejemplo, árboles, invertebrados marinos) de muchos de estos productos naturales ni son susceptibles a cultivo a gran escala necesario para producir cantidades comercialmente disponibles ni a manipulación genética para la producción incrementada o derivatización de estos compuestos. Por lo tanto, los productos naturales deben ser producidos semi-sintéticamente a partir de análogos o sintéticamente utilizando síntesis químicas convencionales. Además, muchos productos naturales tienen estructuras complejas, y, como resultado, actualmente no son económicos o son imposibles de sintetizar. Dichos productos naturales deben ser ya sea extraídos de sus fuentes nativas, tales como árboles, esponjas, corales y microbios marinos; o producidos sintéticamente o semi-sintéticamente a partir de más precursores abundantes. La extracción de un producto natural a partir de una fuente nativa está limitada por la disponibilidad de la fuente nativa; y la producción sintética o semi-sintética de productos naturales puede presentar un bajo rendimiento y/o un alto costo. Dichos problemas de producción y disponibilidad limitada de la fuente natural pueden restringir el desarrollo comercial y clínico de tales productos. La biosíntesis de productos naturales de isoprenoides en microbios diseñados por ingeniería puede interceptar el potencial comercial y terapéutico no realizado de estos recursos natural y producir productos químicos y farmacéuticos menos costos y más ampliamente disponibles. Un obstáculo principal para la biosíntesis de terpenoide de alto nivel es la producción de precursores de terpeno. Estudios previos han mostrado que, cuando se expresa en E.coli, la trayectoria de mevalonato proporciona la producción de pirofosfato de isopentenilo (IPP), el cual puede ser isomerizado y polimerizado en ¡soprenoides y terpenos de valor comercial. La redirección óptima del metabolismo microbiano hacia la producción de isoprenoides requiere que la trayectoria biosintética introducida sea diseñada por ingeniería con propiedad para tanto encausar con eficiencia el carbono al IPP y no permitir el desarrollo de intermediarios, lo cual puede ser tóxico. En realidad, se ha mostrado que la expresión de enzimas que producen mevalonato puede inhibir el crecimiento de célula y limitar la productividad de cultivos microbianos. Se sugirió que la inhibición de crecimiento previamente reportada después de la expresión de la trayectoria de mevalonato en ausencia de una isomerasa de IPP, sintasa de FPP, y sintasa de terpeno, condujo a la acumulación de niveles tóxicos de IPP. Existe la necesidad en la técnica de células huésped de producción de isoprenoides o célula huésped de producción de precursor de isoprenoide que proporcionen tanto un crecimiento de célula huésped robusto como una producción de alto nivel de compuestos isoprenoides, así como los precursores de difosfato de poliprenilo de tales compuestos. La presente invención dirige esta necesidad y proporciona ventajas relacionadas.

Literatura Publicación de Patente de E.U.A No. 2004/005678; Publicación de Patente No. 2003/0148479; Martin et al. (2003) Nat. Biotech. 21(7):796-802; Polakowski et al. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 49:67-71; Wilding et al. (2000) J Bacteriol 182(15):4319-27; Publicación de Patente de E.U.A No. 2004/0194162; Donald et al. (1997) Appl. Env. Microbiol. 63:3341-3344; Jackson et al. (2003) Organ. Lett. 5:1629-1632; Publicación de Patente de E.U.A No. 2004/0072323; Publicación de Patente de E.U.A No. 2004/0029239; Publicación de Patente de E.U.A No. 2004/0110259; Publicación de Patente de E.U.A No. 2004/0063182; Patente de E.U.A No. 5,460,949; Publicación de Patente de E.U.A No. 2004/0077039; Patente de E.U.A No. 6,531,303; Patente de E.U.A No. 6,689,593; Hamano et al. (2001) Biosci. Biotechnol. Biochem. 65:1627-1635; T.

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BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para producir un isoprenoide o un precursor de isoprenoide en una célula huésped genéticamente modificada. Los métodos generalmente involucran modular el nivel de hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) en la célula, de manera que el nivel de HMG-CoA no sea tóxico a la célula y/o no inhiba sustancialmente el crecimiento de célula, pero se mantenga a un nivel que proporcione una producción de alto nivel de mevalonato, IPP, y otros productos corriente abajo de un isoprenoide o trayectoria de isoprenoide, por ejemplo, difosfatos de poliprenilo y compuestos isoprenoides. La presente invención además proporciona células huésped genéticamente modificadas que son adecuadas para utilizarse en un método de la invención. La presente invención además proporciona construcciones de ácido nucleico recombinante para utilizarse en la generación de una célula huésped genéticamente modificada de la invención, incluyendo construcciones de ácido nucleico recombinante que comprenden secuencias de nucleótido que codifican una o más enzimas de trayectoria de mevalonato, y vectores recombinantes (por ejemplo, vectores de expresión recombinantes) que comprenden las mismas. La presente invención además proporciona métodos para identificar ácidos nucleico que codifican variantes de reductasa HMG-CoA (HMGR) que proporcionan el alivio de toxicidad inducida por acumulación de HMG-CoA. La presente invención además proporciona métodos para identificar agentes que reducen la acumulación intracelular de HMGCoA.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una representación esquemática de trayectorias metabólicas de isoprenoides que dan como resultado la producción de los intermediarios de trayectoria biosintética de isoprenoides, difosfatos de poliprenilo, difosfato de geranilo (GPP), difosfato de farnesilo (FPP), y difosfato de geranil-geranilo (GGPPP), a partir de difosfato de isopentenilo (IPP) y difosfato de dimetilalilo (DMAPP). La Figura 2 es una representación esquemática de la trayectoria de mevalonato (MEV) para la producción de IPP. La Figura 3 es una representación esquemática de la trayectoria de DXP para la producción de IPP y pirofosfato de dimetilalilo (DMAPP). La Figura 4 ilustra la producción de amorfadieno en una cepa de E.coli genéticamente modificada para producir IPP a través de la trayectoria de mevalonato, cultivado en un medio suplementado sin mevalonato, 10 mM de mevalonato, o 20 mM de mevalonato. La Figura 5 ilustra el efecto inhibidor de la expresión incrementada del operon MevT en el crecimiento de célula de E.coli genéticamente modificado con el operon MevT. La Figura 6 ilustra el efecto de la expresión incrementada de cada uno de los genes individuales contenidos en el operon MevT y sus combinaciones en el crecimiento de célula. La Figura 7 ilustra el efecto de HMGS catalíticamente inactivo en el crecimiento de célula de E.coli. La Figura 8 ilustra la acumulación intracelular de HMG-CoA en cepas de E.coli que expresan construcciones de trayectoria de mevalonato tóxicas. La Figura 9 ilustra el efecto de la acumulación de HMG-CoA en el crecimiento de célula.

La Figura 10 ilustra el efecto de la expresión incrementada de tHMGR en el crecimiento de célula. La Figura 11 ilustra el efecto de la expresión incrementada de tHMGR en acumulación de HMG-CoA. La Figura 12 ilustra el efecto de la expresión incrementada de tHMGR en la producción de mevalonato. Las Figuras 13A-C ilustran secuencia de nucleótido del plásmido pBAD24MevT (SEC ID NO:1). Las Figuras 14A-C ilustran la secuencia de nucleótido del plásmido pBAD33MevT (SEC ID NO:2). Las Figuras 15A-C ilustran la secuencia de nucleótido del plásmido pMevT (SEC ID NO:3). Las Figuras 16A-D ilustran la secuencia de nucleótido del plásmido pMBIS (SEC ID NO:4). Las Figuras 17A-B ilustran la secuencia de nucleótido del plásmido pADS (SEC ID NO:5). Las Figuras 18A-B ilustran la secuencia de nucleótido del plásmido pAtoB (SEC ID NO:6). Las Figuras 19A-B ilustran la secuencia de nucleótido del plásmido pHMGS (SEC ID NO:7). Las Figuras 20 A-C ilustran la secuencia de nucleótido del plásmido pHMGR (SEQ ID NO: 8) . Las Figuras 21 A-C ilustran la secuencia de nucleótido del plásmido pB AD 18HMGR (SEC ID NO:9). Las Figuras 22A-C ilustran la secuencia de nucleótido del plásmido pHMGSR (SEC ID NO: 10). Las Figuras 23A-C ilustran la secuencia de nucleótido del plásmido pBAD33MevT(C159A) (SEC ID NO: 11). Las Figuras 24A-C ilustran la secuencia de nucleótido del plásmido pHMGS(C159A) (SEC ID NO: 12).

DEFINICIONES Los términos "isoprenoides", "compuesto isoprenoide", "terpeno", "compuesto terpeno", "terpenoides", y "compuesto terpenoide" se utilizan intercambiablemente aquí. Los compuestos isoprenoides están hechos de varios números de las así llamadas unidades de isopreno (C5). El número de átomos de carbono presentes en los isoprenoides típicamente es igualmente divisible entre cinco (por ejemplo, C5, C10, C15, C20, C25, C30 y C40). Se han reportado isoprenoides irregulares y politerpenos, y también se incluyen en la definición de "isoprenoides". Los compuestos isoprenoides incluyen, pero no se limitan a, monoterpenos, sesquiterpenos, triterpenos, politerpenos, y diterpenos. Como se utiliza aquí, el término "difosfato de prenilo" se utiliza intercambiablemente con "pirofosfato de prenilo", e incluye difosfato de monoprenilo que tienen un grupo prenilo individual (por ejemplo, IPP y DMAPP), así como difosfatos de poliprenilo que incluyen 2 o más grupos prenilos. Los Difosfatos de monoprenilo incluyen pirofosfato de isopentenilo (IPP) y su isómero pirofosfato de dimetilalilo (DMAPP).

Como se utiliza aqui, el término "sintasa de terpeno" se refiere a cualquier enzima que enzimáticamente modifica IPP, DMAPP, o un pirofosfato de poliprenilo, de manera que se produce un compuesto terpenoide. El término "sintasa de terpeno" incluye enzimas que catalizan la conversión de un difosfato de prenilo a un isoprenoide. La palabra "pirofosfato" se utiliza intercambiablemente aquí con "difosfato". De esta manera, por ejemplo, los términos "difosfato de prenilo" y "pirofosfato de prenilo" son intercambiables; Los términos "pirofosfato de isopentenilo" y "difosfato de isopentenilo" son intercambiables; Los términos "difosfato de farnesilo" y "pirofosfato de farnesilo" son intercambiables; etc. El término "trayectoria de mevalonato" o "trayectoria de MEV" se utiliza aquí para referirse a la trayectoria biosintética que convierte acetilo-CoA a IPP. La trayectoria de mevalonato comprende enzimas que catalizan los siguientes pasos: (a) condensar dos moléculas de acetilo-CoA a acetoacetilo-CoA; (b) condensar acetoacetilo-CoA con acetilo-CoA para formar HMG-CoA; (c) convertir HMG-CoA a mevalonato; (d) fosforilar mevalonato a 5-fosfato de mevalonato; (e) convertir 5-fosfato de mevalonato a 5-pirofosfato de mevalonato; y (f) convertir 5-pirofosfato de mevalonato a pirofosfato de isopentenilo. La trayectoria de mevalonato se ¡lustra esquemáticamente en la Figura 2. La "mitad superior" de ia trayectoria de mevalonato se refiere a las enzimas sensibles a la conversión de acetilo-CoA a mevalonato a través de un intermediario de la trayectoria de MEV. El término " trayectoria 5-difosfato de 1-desoxi-D-xilulosa" o "trayectoria de DXP" se utiliza aquí para referirse a la trayectoria que comprende gliceraldehído-3-fosfato a piruvato a ÍPP y DMAPP a través de un Intermediario de la trayectoria de DXP, en donde la trayectoria de DXP comprende enzimas que catalizan las reacciones ilustradas esquemáticamente en la Figura 3. Como se utiliza aquí, el término "transferasa de prenilo" se utiliza intercambiablemente con los términos "sintasa de difosfato de isoprenilo" y "sintasa de poliprenilo" (por ejemplo, "GPP sintasa", "FPP sintasa", "OPP sintasa", etc.) para referirse a una enzima que cataliza la 1'-4 condensación consecutiva del difosfato de isopentenilo con substratos iniciadores alilícos, dando como resultado la formación de difosfatos de prenilo de varias longitudes de cadena. Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico", se utilizan intercambiablemente aquí, y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos. De esta manera, este término incluye, pero no se limita a, ADN o ARN de cadena individual, doble o de cadena múltiple, ADN genómico, ADNc, híbridos de ADN-ARN, o un polímero que comprende bases de purina y pirimidina u otras bases de nucleótido naturales, química o bioquímicamente modificadas, no-naturales, o derivatizadas. Como se utiliza aquí, los términos "operon" y "unidad de trascripción individual" se utilizan intercambiablemente para referirse a dos o más regiones de codificación contiguas (secuencias de nucleótido que codifican a producto de gen tal como un ARN o una proteína) que se regulan de manera coordinada por uno o más elementos de control (por ejemplo, un promotor). Como se utiliza aquí, el término "producto de gen" se refiere a ARN codificado por ADN (o viceversa) o proteína que es codificada por un ARN o ADN, en donde un gen típicamente comprenderá una o más secuencias de nucleótido que codifican una proteína, y también pueden incluir intrones y otras secuencias de nucleótido de no codificación. Los términos "péptido", "polipéptido", y "proteína" se utilizan intercambiablemente aquí, y se refieren a una forma polimérica de amino ácidos de cualquier longitud, los cuales pueden incluir amino ácidos codificados y no codificados, amino ácidos química o bioquímicamente modificados o derivatizados, y polipéptidos que tienen estructuras de base de péptido modificadas. El término "de existencia natural" como se utiliza aquí y como se aplica a un ácido nucleico, una célula, o un organismo, se refiere a un ácido nucleico, célula, u organismo que se encuentra por naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede ser aislada de una fuente natural y que no ha sido intencionalmente modificada por un ser humano en el laboratorio, se considera de formación natural. El término "ácido nucleico heterólogo", como se utiliza aquí, se refiere a un ácido nucleico en donde por lo menos uno de lo siguiente es verdadero: (a) el ácido nucleico es extraño ("exógeno") a (es decir, no se encuentra naturalmente en) un microorganismo huésped dado o célula huésped; (b) el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótido que se encuentra naturalmente en (por ejemplo, es "endógena a") un microorganismo huésped dado o célula huésped (por ejemplo, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótido endógena al microorganismo huésped o célula huésped); sin embargo, en el contexto de un ácido nucleico heterólogo, la misma secuencia de nucleótido encontrada endógenamente es producida en una cantidad no natural (por ejemplo, mayor que la esperada o mayor que la naturalmente encontrada) en la célula, o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que difiere en secuencia de la secuencia de nucleótido endógena pero codifica la misma proteína (que tiene la misma secuencia de amino ácido o sustancialmente la misma) como se encuentra endógenamente, se produce en una cantidad no natural (por ejemplo, mayor que la esperada o mayor que la naturalmente encontrada) en la célula; (c) el ácido nucleico comprende dos o más secuencias de nucleótido que no se encuentran en la misma relación entre sí por naturaleza, por ejemplo, el ácido nucleico es recombinante. Un ejemplo de un ácido nucleico heterólogo es una secuencia de nucleótido que codifica HMGR operablemente enlazado a un elemento de control transcripcional (por ejemplo, un promotor) al cual una secuencia de codificación de HMGR endógeno (existencia natural) HMGR no está normal y operablemente enlazada. Otro ejemplo de un ácido nucleico heterólogo es un plásmido de alto número de copia que comprende una secuencia de nucleótido que codifican HMGR. Otro ejemplo de un ácido nucleico heterólogo es una ácido nucleico que codifica HMGR, en donde una célula huésped que normalmente no produce HMGR es genéticamente modificada con el ácido nucleico que codifica HMGR; ya que los ácidos nucleicos que codifican HMGR no se encuentran naturalmente en las células huésped, el ácido nucleico es heterólogo a la célula huésped genéticamente modificada. "Recombinante", como se utiliza aquí, significa que un ácido nucleico particular (ADN o ARN) es el producto de varias combinaciones de los paso de clonación, restricción, y/o ligación que dan como resultado una construcción que tiene una secuencia de codificación o no codificación estructural que se distingue de ácidos nucleicos endógenos encontrados en sistemas naturales. Generalmente, las secuencias de ADN que codifican la secuencia de codificación estructural puede ser ensambladas a partir de fragmentos de ADNc y enlazadores de oligonucleótido cortos, o a partir de una serie de oligonucleótidos sintéticos, para proporcionan un ácido nucleico sintético que es capaz de ser expresado a partir de una unidad transcripcional recombinante contenida en una célula o en un sistema de trascripción y traducción libre de célula. Dichas secuencias pueden ser provistas en la forma de un marco de lectura abierto no interrumpido por secuencias no traducidas internas, o intrones, los cuales típicamente están presentes en genes eucarióticos. También se puede utilizar ADN genómico que comprenden las secuencias relevantes, en la formación de un gen recombinante o unidad de trascripción. Las secuencias de ADN no traducido pueden estar presente en 5' o 3' a partir del marco de lectura abierto, en donde dichas secuencias no interfieren con la manipulación o expresión de la regiones de codificación, y en realidad pueden actuar para modular la producción de un producto deseado a través de varios mecanismos (ver "secuencias reguladoras de ADN", más adelante). De esta manera, por ejemplo, el término polinucleótido o ácido nucleico "recombinante" se refiere a uno que no sea de existencia natural, por ejemplo, se haga a través de la combinación artificial de dos segmentos de otra manera separado de secuencia a través de la intervención del ser humano. Esta combinación artificial por lo regular se logra ya sea a través de medios de síntesis química o a través de la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleico, por ejemplo, a través de técnicas de ingeniería genética. Esto usualmente se realiza para reemplazar un codón con un codón redundante que codifica al mismo amino ácido o a un amino ácido conservador, mientras introduce o remueve típicamente un sitio de reconocimiento de secuencia. Alternativamente, se realiza para unir conjuntamente segmentos de ácido nucleico de funciones deseadas para generar una combinación deseada de funciones. Esta combinación artificial por lo regular se logra ya sea a través de medios de síntesis química, o a través de la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, a través de técnicas de ingeniería genética. Por "construcción" se quiere dar a entender un ácido nucleico recombinante, generalmente ADN recombinante, que ha sido generado con el propósito de expresar una secuencia(s) de nucleótido específica, o que se va a utilizar en la construcción de otras secuencias de nucleótido recombinante. Como se utiliza aquí, el término "ácido nucleico exógeno" se refiere a un ácido nucleico que no se encuentra normal o naturalmente en y/o se produce a través de. una bacteria, organismo o célula dada por naturaleza. Como se utiliza aquí, el término "ácido nucleico endógeno" se refiere a un ácido nucleico que normalmente se encuentra en y/o se produce a través de una bacteria, organismo o célula dada por naturaleza. Un "ácido nucleico endógeno" también se refiere a un "ácido nucleico nativo" o a un ácido nucleico que se ha "nativo" a una bacteria, organismo o célula dada. Por ejemplo, los ácidos nucleico que codifican HMGS, mevalonato cinasa, y fosfomevalonato cinasa en el Exemplo 1 representa ácidos nucleico exógenos para E.coli. Estos ácidos nucleicos de trayectoria de mevalonato se clonaron a partir de Sacchromyces cerevisiae. ln S. cerevisiae, las secuencias del gen que codifican HMGS, MK, y PMK en el cromosoma podrían ser ácidos nucleicos "endógenos". Los términos "secuencias reguladoras de ADN", "elemento de control", y "elementos reguladores", utilizados intercambiablemente aquí, se refieren a secuencias de control transcripcionales y de traducción, tales como promotores, mejoradores, señales de poliadenilación, terminadores, señales de degradación de proteína, y similares, que proporcionan y/o regulan la expresión de una secuencia de codificación y/o la producción de un polipéptido codificado en una célula huésped. El término "transformación" se utiliza intercambiablemente aquí con " modificación genética" y se refiere a un cambio genético permanente o pasajero inducido en una célula después de la introducción de un nuevo ácido nucleico (es decir, ADN exógeno a la célula). El cambio genético ("modificación") puede ser logrado ya sea a través de la incorporación del nuevo ADN en el genoma de la célula huésped, o a través de mantenimiento pasajero o estable del nuevo ADN como un elemento episomal. Cuando la célula es una célula eucariótica, generalmente se obtiene un cambio genético permanente a través de la introducción del ADN en el genoma de la célula. En células procarióticas, se pueden introducir cambios permanentes en el cromosoma o a través de elementos extracromosomales tales como plásmidos y vectores de expresión, que pueden contener uno o más marcadores seleccionables para ayudar en su mantenimiento en la célula huésped recombinante. "Operablemente enlazado(a)" se refiere a una yuxtaposición en donde los compuestos así descritos están en una relación que les permiten funcionar en su forma destinada. Por ejemplo, un promotor está operablemente enlazado a una secuencia de codificación si el promotor afecta su trascripción o expresión. Como se utiliza aquí, los términos "promotor heterólogo" y "regiones de control heterólogas" se refieren a promotores u otras regiones de control que normalmente no están asociadas con a ácido nucleico particular por naturaleza. Por ejemplo, una "región de control transcripcional heteróloga a una región de codificación" es una región de control transcripcional que normalmente no está asociada con la de codificación por naturaleza. Una "célula huésped", como se utiliza aquí, denota una célula eucariótica in vivo o in vitro, una célula procariótica, o una célula de un organismo multicelular (por ejemplo, una línea de célula) cultivada como una entidad unicelular, dichas células eucarióticas o procarióticas pueden ser, o han sido, utilizadas como receptores para un ácido nucleico (por ejemplo, un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótido que codifica uno o más productos de gen de trayectoria biosintética tales como productos de genes de la trayectoria de mevalonato), e incluyen la progenie de la célula original que ha sido genéticamente modificada por el ácido nucleico. Se debe entender que la progenie de una célula individual necesariamente puede no ser completamente idéntica en morfología o en complemento genómico o de ADN total como el origen, debido a mutación natural, accidental o deliberada. Una "célula huésped recombinante" (también denominada como una "célula huésped genéticamente modificada") es una célula huésped en donde se ha introducido un ácido nucleico heterólogo, por ejemplo, un vector de expresión. Por ejemplo, una célula huésped procariótica de la invención es una célula huésped procariótica genéticamente modificada (por ejemplo, una bacteria), en virtud de la introducción a una célula huésped procariótica adecuada a un ácido nucleico heterólogo, por ejemplo, un ácido nucleico exógeno que es extraño a (normalmente no encontrado por naturaleza en) la célula huésped procariótica, o un ácido nucleico recombínante que normalmente no se encuentra en la célula huésped procariótica; y una célula huésped eucariótica de la invención es una célula huésped eucariótica genéticamente modificada, en virtud de la introducción a una célula huésped eucariótica adecuada, de un ácido nucleico heterólogo, por ejemplo, un ácido nucleico exógeno que es extraño a la célula huésped eucariótica, o un ácido nucleico recombinante que no se encuentra normalmente en la célula huésped eucariótica. Como se utiliza aquí el término "aislado" significa un polinucleótido, un polipéptido, o una célula que está en un ambiente diferente de aquel en donde el polinucleótido, el polipéptido, o la célula naturalmente ocurre. Una célula huésped genéticamente modificada aislada puede estar presente en una población mixta de células huésped genéticamente modificadas. Se pueden producir casetes de expresión que comprenden una región(es) de iniciación de trascripción o de control transcripcional (por ejemplo, un promotor), la región de codificación para la proteína de interés, y una región de terminación transcripcional. Las regiones de control transcripcionales incluyen aquellas que proporcionan la sobre-expresión de la proteína de interés en la célula huésped genéticamente modificada; aquellas que proporcionan expresión inducible, de manera que cuando se agrega un agente de inducción al medio de cultivo, la trascripción de ia región de codificación de la proteína de interés es inducida o incrementada a un nivel más alto que antes de la inducción. Un ácido nucleico es "hibridizable" a otro ácido nucleico, tal como un ADNc, AND genómico, o ARN, cuando una forma de estructura de cadena individual del ácido nucleico puede fijarse al otro ácido nucleico bajo las condiciones apropiadas de temperatura y resistencia iónica de la solución. Las condiciones de Hibridación y de lavado con bien con conocidas y se ¡lustran en Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), particularmente capítulo 11 y Cuadro 11.1 aquí; y Sambrook, J. y Russell, W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001). Las condiciones de temperatura y resistencia iónica determinan la "severidad" de la hibridación. Las condiciones de severidad pueden ser ajustadas para clasificar fragmentos moderadamente similares, tales como secuencias homologas de organismos relacionados de manera diferente, a fragmentos altamente similares, tales como genes que duplican enzimas funcionales a partir de organismos estrechamente relacionados. Las condiciones de hibridación y los lavados después de la hibridación son útiles para obtener las condiciones de severidad determinadas deseadas de la hibridación. Un grupo de lavados posteriores a la hibridación ilustrativos es una series de lavados que empiezan con 6x SSC (en donde SSC es 0.15 M de NaCl y 15 mM de regulador de pH de citrato), 0.5% SDS a temperatura ambiente durante 15 minutos, después repetir con 2x SSC, 0.5% SDS a 45°C durante 30 minutos, y después repetir dos veces con 0.2xSSC, 0.5% SDS a 50°C durante 30 minutos. Otras condiciones severas se obtienen utilizando temperaturas más altas, en donde los lavados son idénticos a aquellos anteriores, excepto para la temperatura de los dos lavados finales de 30 minutos en 0.2x SSC, 0.5% SDS, la cual se incremento a 60°C. Otro grupo de condiciones altamente severas utiliza dos lavados finales en O.lxSSC, 0.1% SDS a 65°C. Otro ejemplo de condiciones de hibridación severas es la hibridación a 50°C o más altas y O.lxSSC (15 mM de cloruro de sodio/1.5 mM de citrato de sodio). Otro ejemplo de condiciones de hibridación severas es incubación nocturna a 42°C en una solución: 50% formamida, 5xSSC (150 mM NaCI, 15 mM de citrato trisódico), 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6), 5x de solución de Denhardt, sulfato de dextrana al 10%, y 20 µg/ml de ADN de esperma de salmón cortado, desnaturalizado, seguido por el lavado de los filtros en O.lxSSC a aproximadamente 65°C Las condiciones de hibridación severas y las condiciones de lavado después de la hibridación son condiciones de hibridación y condiciones de lavado después de la hibridación que por lo menos son tan severas como las condiciones representativas anteriores. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la severidad de la hibridación, son posibles desigualdades entre las bases. La severidad apropiada para la hibridación de ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y el grado de compiementación, variables bien conocidas en la técnica. Entre más alto es el grado de similitud u homología entre dos secuencias de nucleótido, mayor es el valor de la temperatura de fusión (Tm) para híbridos de ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. La estabilidad relativa (que corresponde a una Tm mayor) de hibridaciones de ácido nucleico se reduce en el siguiente orden: ARN-.ARN, ADN-.ARN, ADN:ADN. Para híbridos con una longitud mayor que 100 nucleótidos, se han derivado ecuaciones para calcular Tm (ver Sambrook et al., supra, 9.50-9.51). Para hibridaciones con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos, la posición de desigualdades se hace más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su carácter específico (ver Sambrook et al., supra, 11.7-11.8). Típicamente, la longitud para un ácido nucleico hibridizable es por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos. Las solicitudes mínimas ilustrativas para un ácido nucleico hibridizable; por lo menos aproximadamente 15 nucleótidos; por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos; y por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos. Además, los expertos en la técnica reconocerán que la temperatura y la concentración de sal en solución de lavado pueden ser ajustas según sean necesario de acuerdo con factores tales como la longitud de la sonda. El término "sustitución de aminoácido conservadora" se refiere a la capacidad de intercambio en proteínas de residuo de amino ácido que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de amino ácidos que tienen cadenas laterales alifáticas consiste de glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de amino ácidos que tienen cadenas laterales alifáticas-hidroxilo consiste de serina y trionina; un grupo de amino ácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida consiste de asparagina y glutamina; un grupo de amino ácidos que tienen cadenas laterales aromáticas consiste de fenilalanina, tirosina, y triptófano; un grupo de amino ácidos que tienen cadenas laterales básicas que consisten de lisina, arginína, e histidina; y un grupo de amino ácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre que consiste de cisteínas y metíonina. Los grupos de sustitución de amino ácidos conservadores ilustrativos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosína, lisína-arginina, alanina-valina, y asparagina-glutamina. "Ácidos nucleicos sintéticos" pueden ser ensamblados a partir de bloques de construcción de oligonucleótido que químicamente son sintetizados utilizando procedimientos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Estos bloques de construcción están ligados y fijados para formar segmentos de gen que después son enzimáticamente ensamblados para construir al gen total. "Químicamente sintetizados", según relacionado con una secuencia de ADN, significa que los nucleótidos de componente fueron ensamblados in vitro. La síntesis química manual del ADN puede lograrse utilizando procedimientos bien establecidos, o se puede realizar síntesis química automática utilizando una de un número de máquinas comercialmente disponibles. La secuencia de nucleótido de los ácidos nucleicos puede ser modificada para expresión óptima basándose en la optimización de la secuencia de nucleótido para reflejar el codón que se desvía de la célula huésped. El experto en la técnica aprecia la probabilidad de expresión exitosa si el uso del codón es deseado hacia aquellos codones favorecidos por el huésped. La determinación de codones preferidos puede basarse en una supervisión de genes derivados de la célula huésped en donde está disponible la información de secuencia. Un polinucleótido o polipéptido tiene cierto porcentaje de "identidad de secuencia" con otro polinucleótído o polipéptido, significando que, cuando se alinean, este porcentaje de bases o amino ácidos es el mismo, y en la misma posición relativa, cuando se comparan las dos secuencias. La similitud de secuencia puede ser determinada en un número de diferentes formas. Para determinar la identidad de secuencia, las secuencias pueden ser alineadas utilizando los métodos y programas de computadora, que incluyen BLAST, disponible en la gran red mundial en ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Ver, por ejemplo, Altschul et al. (1990), J Mol. Biol. 215:403-10. Otro algoritmo de alineación es FASTA, disponible en el paquete Genetics Computing Group (GCG) package, de Madison, Wisconsin, USA, una subsidiaria totalmente apropiada de Oxford Molecular Gruop, Inc. Otras técnicas para la alineación se describen en Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a división of Harcourt Brace & Co., San Diego, California, USA. De interés particular son los programas de alineación que permiten huecos en las secuencia. El Smith-Waterman es un tipo de algoritmo que permite huecos en alineaciones de secuencia. Ver, Meth. Mol. Biol. 70:173-187 (1997). También, el programa GAP que utiliza el método de alineación de Needleman y Wunsch puede ser utilizado para alinear secuencias. Ver, J Mol. Biol. 48:443-453 (1970). Antes de que se describa más la presente invención, se debe entender que está invención no está limitada a modalidades particulares descritas, y como tal, por supuesto, puede variar. También se debe entender que la terminología utilizada aquí es para el propósito de describir solamente modalidades particulares, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención será limitado solamente por las reivindicaciones anexas. Cuando se proporciona un escala de valores, se debe entender que cada valor de intervención, a la décima de la unidad del límite inferior a menos que el contexto claramente dicte otra cosa, entre el límite superior y el inferior de esa escala y cualquier otro valor establecido o de intervención en esa escala establecida, queda abarcado dentro de la invención. Los límites superiores e inferiores de estas escalas más pequeñas independientemente pueden ser incluidos en las escalas más pequeñas, y también quedan abarcados dentro de la invención, sujeto a cualquier limite específicamente excluido en la escala establecida. Cuando la escala establecida incluye uno o ambos de los límites, también se influyen en la invención las escalas que excluyen cualquiera o ambos de estos limites incluidos. A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismos significando comúnmente entendido por algún experto en la técnica a la cual pertenece está invención. Aunque también se pueden utilizar cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí en la práctica o prueba de la presente invención, ahora se describirán los métodos y materiales preferidos. Todas las publicaciones mencionadas aquí se incorporan aquí por referencia para describir y mostrar los métodos y/o materiales junto con las publicaciones citadas. Se debe observar que como se utiliza aquí y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "uno, una, un", "y", y "el, la" incluyen sus referencias plurales a menos que el contexto claramente dicte otra forma. De esta manera, por ejemplo, una referencia a "una célula huésped genéticamente modificada" incluye una pluralidad de dichas células huésped y se hace referencia a "la reductasa HMG-CoA" incluye referencia a una o más reductasa HMG-CoA y sus equivalentes conocidos por aquellos expertos en la técnica, y así sucesivamente. Además se debe observar que las reivindicaciones pueden ser modificadas para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración pretende servir como base de antecedente para el uso de dicha terminología exclusiva como "solamente", "sólo" y similares junto con la ilustración de elementos reclamados, o el uso de una limitación "negativa". Las publicaciones discutidas aquí son provistas solamente para su descripción antes de la fecha de de presentación de la presente solicitud. Nada aquí debe ser construido como una admisión de que la presente invención no quede intitulada para adelantar dicha publicación en virtud a la invención anterior. Además, las fechas de publicación provistas pueden ser diferentes de las fechas de publicación actuales que pueden necesitar ser independientemente confirmadas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para reducir la acumulación inhibidora de HMG-CoA en células huésped genéticamente modificadas útiles en la producción de isoprenoides o un precursor de isoprenoide, y métodos para incrementar la producción de un isoprenoide o un precursor de isoprenoide en estas células huésped a través de la eliminación de esta toxicidad. Los métodos generalmente involucran modular el nivel de hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) en la célula huésped, de manera que el nivel de HMG-CoA no sea tóxico a la célula huésped, y/o no inhiba sustancialmente el crecimiento de célula de la célula huésped.

La presente invención además proporciona células huésped genéticamente modificadas que son adecuadas para utilizarse en el método de la presente. La presente invención además proporciona construcciones de ácido nucleico recombinante para utilizarse en la generación de una célula huésped genéticamente modificada de la invención. La presente invención además proporciona métodos para identificar polipéptidos HMGR variantes que proporcionan el alivio de toxicidad inducida por acumulación de HMG-CoA. Los métodos generalmente involucran determinar el efecto, si hay alguno, de una variante de HMGR en la toxicidad de célula inducida por HMG-CoA. La presente invención además proporciona métodos para identificar inhibidores de HMGS. Los métodos generalmente involucran determinar el efecto, si hay alguno, de un compuesto de prueba sobre la toxicidad de célula inducida por la acumulación de HMGCoA. La presente invención se basa en parte en la observación no esperada de que HMG-CoA, un intermediario en la trayectoria de mevalonato, es tóxico cuando se acumula en una célula microbiana genéticamente modificada para producir pirofosfato de isoprenilo (IPP) o un precurso de IPP a través de la trayectoria de mevalonato. Esta observación se hizo estudiando la producción incrementada de compuestos isoprenoides (y/o precursores tales como mevalonato, IPP, y difosfatos de poliprenilo) en células huésped (por ejemplo, a microorganismo huésped) que fueron transformados ("genéticamente modificados") con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican una o más enzimas de trayectoria de mevalonato. Las enzimas de trayectoria de mevalonato se ilustran en la Figura 2. La trayectoria de mevalonato comprende las siguientes reacciones enzimáticas: (a) condensación de dos moléculas de acetilo-CoA a acetoacetilo-CoA; (b) la condensación de acetoacetilo-CoA con acetilo-CoA para formar HMGCoA; (c) la conversión de HMG-CoA a mevalonato; (d) fosforilación de mevalonato a 5-fosfato de mevalonato; (e) la conversión de 5-fosfato de mevalonato a 5-pirofosfato de mevalonato; y (f) la conversión de 5-?irofosfato de mevalonato a pirofosfato de isopentenilo. La observación de que el incremento de de nivel de expresión de la trayectoria de mevalonato dio como resultado la inhibición de crecimiento de célula, fue inesperada. Se pueden generar compuestos isoprenoides (para construcciones y métodos adecuados, ver Publicaciones de Patente de E.U.A Nos.. 20030148479, y 20040005678; y Martin et al. (2003) Nature Biotech. 21 (7):796-802) expresando la trayectoria de mevalonato en una bacteria. Las enzimas de trayectoria de mevalonato requeridas para la producción de IPP varían, dependiendo de las condiciones de cultivo. Por ejemplo, en algunas modalidades, una célula huésped que produce isoprenoide o compuestos precursores isoprenoides es una que ha sido genéticamente modificada con dos o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican mevalonato cinasa (MK), fosfomevalonato cinasa (PMK), y mevalonato pirofosfato decarboxilasa (MPD) (y opcionalmente también isopentenil pirofosfato isomerasa); y la célula huésped se cultivo en un medio que incluye mevalonato. En otras modalidades, una célula huésped que produce ¡soprenoide o compuestos precursores isoprenoides es una que ha sido genéticamente modificada con dos o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, hidroximetilglutaril-CoA sintasa (HMGS), hidroximetilglutaril-CoA reductasa (HMGR), MK, PMK, y MPD (y opcionalmente también IPP isomerasa). En un esfuerzo para incrementar los niveles de producción de isoprenoide en huéspedes genéticamente alterados para contener una trayectoria de mevalonato exógeno o en huéspedes que ya contienen una trayectoria de mevalotano nativa (endógena), se puede incrementar el nivel de actividad de las enzimas individuales en la trayectoria dentro de la célula. Una herramienta común utilizada para modular los niveles de actividad de enzimas diseñadas por ingeniería dentro de una célula es modular la velocidad actual de un ARNm que codifica la enzima, es transcrito. Se puede intentar lograr este objetivo cambiando el promotor (secuencia de iniciación de trascripción o secuencia de control de trascripción) a un promotor más fuerte. En células huésped que expresan la trayectoria de mevalonato, generalmente se puede esperar que el cambio de la resistencia de la expresión de control del promotor de toda la trayectoria de mevalonato pueda cambar los niveles de producción de isoprenoides. Por ejemplo, cuando se cambia de un promotor inducible de lactosa modificada, tales como aquel encontrado en pBluescript y los plásmidos pBBRIMCS, a un promotor más fuerte, tal como un promotor inducible de arabinosa o lactosa de consenso, generalmente se podría esperar que la expresión de cada una de las enzimas se incremente, aumentando así los niveles de producción de isoprenoide. Ya que la trayectoria de mevalonato alimenta al precursor celular abundante acetilo-CoA, no se espera que la producción de IPP quede limitada por la producción del precursor. Contrario a lo que podría expresarse, se observó que el incremento del nivel de expresión de la primera mitad de la trayectoria de mevalonato (es decir, el incremento del nivel de expresión de acetoacetilo CoA tiolasa, HMGS, y HMGR) dio como resultado la inhibición del crecimiento celular, aún más no se incremento la cantidad del producto isoprenoide deseado. Cuando se introduce una molécula de ADN recombinante en un organismo para la producción de una enzima, ya sea que la enzima vaya a ser utilizada catalíticamente dentro de la célula o purificada a partir de la célula, se pueden observar efectos tóxicos (B.R. Glick. (1995) Biotech Advances. 13(12):247-261 ). Estos efectos pueden deberse a la utilización de los recursos celulares del huésped, a una actividad inesperada de la enzima o a la acumulación de un intermediario tóxico. El último caso puede se ocasionado por los niveles elevados del producto final de la trayectoria, o ser específico a una enzima individual para la cual la actividad está fuera de equilibrio con aquella de las otras enzimas en la trayectoria, conduciendo la acumulación de un intermediario a niveles que son tóxicos a la célula. Además, es difícil pronosticar con anticipación a que nivel serán tóxicos los metabolitos de una trayectoria introducida, o los niveles a los cuales comenzaran a mostrar efectos tóxicos como los intermediarios químicamente similares pueden tener efectos intracelulares drásticamente diferentes. Por ejemplo, los niveles de acetilo-CoA pueden ser absolutamente altos dentro de una célula, sin presentar ningún efecto tóxico. Se ha mostrado que propionil-CoA puede ser tóxico para Aspirgillus nidulans desarrollado en glucosa (Brock et al. Eur J. Biochem. 271,3227-3241(2004)). E.coli diseñado por ingeniería para la acumulación de PHA utilizando una propionil-CoA no muestra inhibición de crecimiento inducida por propinoil-CoA aparente, y se puede desarrollar a altas densidades de célula (Choi, et al. Appl. Environ. Microbio. 65 43.63-4368(1999)). La sensibilidad para cafeato, p-cumarato, y ferulato se observo en cepas de acinotobacter con un choque de hidroxicinamoil-CoA hidratasa/liasa potencialmente debido a la acumulación de Hidroxicinarnoil-CoA (Parke et al., Appl. Environ. Microbio. 70,2974-2983 (2004)). La misma referencia demostró la sensibilidad a estos tres substratos E.coli después de la sobre-expresión de hcaC, potencialmente debido a la acumulación hidroxicinamoil-CoA. La sobre producción de una cintasa II de proteína portadora ß-cetoacilo (KAS II) in E.coli condujo a la acumulación de malonil-CoA a niveles que inhibe el crecimiento. La expresión de malonyl-CoA:ACP transacilasa, la enzima que cataliza la conversión de malonil-CoA a malonil-ACP, junto con KAS II parcialmente mitigo esta toxicidad (Subrahmuchosam et al. J. Bact. 180 4596-4602 (1998)). La expresión de malonil/metilmalonil-CoA ligasa in E.coli combinada con alimentación de metilmalonato condujo a acumulaciones de metilmalonil-CoA tanto como 90% de la combinación de acil-coA. No se reporto una inhibición del crecimiento en esta cepa (Murli et. al. J ind. Microbiol. Biotechnol. 30500-509(2003)). La trayectoría de los organismos que contienen la trayectoria de mevalonato, por ejemplo Homo sapiens utilizan HMGR como un punto regulador en la producción de isoprenoide. Para limitar la producción de isoprenoide, estos organismos reducen la actividad de HMGR, lo cual naturalmente podría promover un desarrollo de su precursor HMG-CoA. Este desarrollo de HMG-CoA presumiblemente también podría ocurrir en pacientes que toman fármacos para reducir el colesterol [(tales como las estatinas Atorvastatin (Lipitor) Fluvastatin (Lescol) Lovastatin (Altocor, Mevacor) Pravastatin (Pravachol) Rosuvastatin (Crestor), y Simvastatin (Zocor)],)), que inhiben la actividad de HMGR. El amplio uso de fármacos de estatina sin toxicidad sistémica debido a la acumulación de HMG-CoA podría indicar que HMG-CoA es un metabolito no tóxico para Homo sapiens. En el caso de toxicidad debido a la expresión de enzimas de trayectoria de mevalonato, el análisis de metabolito utilizando cromatografía de líquido-espectrometría de masa enlazo el fenotipo de inhibición de crecimiento con la acumulación del intermediario de trayectoria, 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA). Este hallazgo demostró que en células huésped microbianas diseñadas por ingeniería ("genéticamente modificadas"), el intermediario HMGCoA puede acumular y ocasionar la muerte de células o prevenir que la célula tenga un crecimiento adicional y, por lo tanto, impida la producción de IPP limitando el crecimiento de célula y/o indicando un cuello de botella en el flujo de carbono hacia los ¡soprenoides deseados. La acumulación de HMG-CoA implica que existe un desequilibrio entre la producción de HMG-CoA y la conversión de sub-secuencia de HMG-CoA a mevalonato en la trayectoría de mevalonato diseñado por ingeniería. Al incrementar la actividad total de HMG-CoA Reductasa (HMGR), la cual es la enzima que convierte HMG-CoA a mevalonato, esta toxicidad se supera, dando como, resultado un incremento en la producción de mevalonato e isoprenoides sintetizados a partir de mevalonato. Otra forma de reducir la acumulación de HMG-CoA es limitar la producción de HMGCoA reduciendo la actividad total de HMG-CoA sintasa (HMGS), la cual es la enzima que convierte acetoacetil-CoA a HMG-CoA. Otra forma más para reducir la acumulación de HMG-CoA es reducir el nivel y/o actividad de una enzima, tal como acetoacetil-CoA tiolasa, que afecta la producción de acetoacetil-CoA, que es el precursor directo de HMG-CoA. De acuerdo con los métodos de la invención, se pueden sintonizar los niveles de de HMG-CoA con aquellos para eliminar la toxicidad y permitir un crecimiento apropiado de células microbianas, permitiendo así incrementos importantes den la producción de isoprenoide o de precursor de isoprenoide. Es importante observar que mientras se sintoniza HMG-COA, los niveles no pueden ser conducidos a un incremento en el isoprenoides producidos por célula y aún más pueden conducir a una reducción, un incremento en el crecimiento celular puede ser más que un desplazamiento de esas reducciones, dando como resultado la producción de más isoprenoides en un cultivo. Por ejemplo y como ilustración, si se modifican las actividades de HMGS de manera que los niveles de HMG-CoA se reduzcan dentro de la célula y el nivel de isoprenoide por célula se reduzca en un 10% pero el crecimiento celular se duplique, la productividad total del cultivo (la actividad por célula multiplicada por el número de células en el cultivo) en realidad se incrementara. De esta manera, la producción de IPP o de un compuesto isoprenoíde puede ser incrementada reduciendo un nivel de la actividad de HMG-CoA Sintasa y/o incrementando el nivel de la actividad de HMG-CoA Reductasa en la célula. La modulación (incremento o reducción) del nivel de HMGS activo y/o actividad de HMGR en una célula se puede obtener: 1) modulando (incrementando o reduciendo) la trascripción de un ácido nucleico que codifica la enzima; 2) modulando (incrementando o reduciendo) la traducción de un ARNm que codifica la enzima; 3) modulando (incrementando o reduciendo) la estabilidad del ARNm que codifica la enzima; 4) modulando (incrementando o reduciendo) la estabilidad de la misma enzima; y 5) modulando (incrementando o reduciendo) la actividad enzimática de la enzima. Para reducir o eliminar el efecto tóxico de HMG-CoA e incrementar la producción de isoprenoide y/o precursor de isoprenoide, la presente invención también proporciona células, y ácidos nucleicos y vectores de expresión útiles para preparar dichas células, en donde la trayectoria de mevalonato ha sido re-diseñada de manera que los niveles de HMG-CoA no se vuelven tóxicos. Los esfuerzos para lograr una producción más alta de IPP se han enfocado en la sobre-expresión de enzimas limitantes putativamente raras incluyendo HMGR en células que contienen una trayectoria de mevalonato endógeno. Ver, por ejemplo, Polakowski et al. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 49:67-71 (producción del isoprenoide-esqualeno); Donald et al. (1997) Appl. Env. Microbiol. 63:3341-3344 (producción del isoprenoide-esqualeno); y Jackson et al. (2003) Org. Letters 5:1629-1632 (producción del isoprenoide-epi-cedrol). Estos reportes no discuten el alivio de la toxicidad inducida por HMG-CoA- a través de la expresión de HMGR sino que más bien están dirigidos por la observación de que muchos organismos la HMGR es el punto de regulación involucrado para la producción de isoprenoides en un organismo que naturalmente utiliza la trayectoria de mevalonato para producir isoprenoides. En estos casos, la producción del isoprenoide respectivo se incrementado de tres a diez veces después de la sobre-expresión de HMGR. Los siguientes estudios han mirado a las enzimas de trayectoria de mevalonato en £. coli. Hamano et al ((2001) Biosci. Biotechnol. Biochem. 65: 1627-1635) reportaron que los intentos para transformar la cepa de E.coli, DYM1, con una construcción de alta copia pGEM-MEV, conteniendo un grupo de trayectoria de mevalonato a partir de Streptomyces, no tuvieron éxito. Los intentos para transformar la misma cepa con pMW-MEV, una construcción de copia baja conteniendo el mismo grupo de trayectoria de mevalonato, fueron exitosos. Los autores sugirieron que la alta expresión de los genes de la trayectoria de mevalonato de Streptomyces en E.coli pueden ser letal. Wilding et al. (2000) J Bacterio! 182(15):4319-27) reportaron que en presencia de mevalonato, la bacteria gram-positiva, S. pneumoniae, mutantes que carecen tanto de HMG-CoA sintasa y reductasa HMG-CoA fueron viables, mientras que los mutantes que carecen solo de HMG-CoA no fueron viales. Además, la presente invención proporciona métodos de clasificación para identificar un producto de gen que tiene actividad de destoxificación de HMG-CoA. Los métodos generalmente involucran, a) producir una célula de prueba introduciendo a una célula huésped genéticamente modificada, un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótido que codifica un producto de gen candidato, en donde la célula huésped genéticamente modificada produce, en ausencia de dicho ácido nucleico exógeno, HMG-CoA a niveles efectivos para inhibir el crecimiento de la célula huésped genéticamente modificada; y b) determinar el efecto, si hay alguno, de la expresión de producto de gen candidato en el crecimiento de la célula de prueba. Una reducción en la inhibición de crecimiento indica que el ácido nucleico exógeno codifica un producto de gen que tiene una actividad suficiente para aliviar la toxicidad de HMG-CoA. Además, la presente invención proporciona métodos de clasificación para identificar compuestos que inhiben la acumulación de HMG-CoA. Los métodos generalmente involucran, a) poner en contacto una célula de prueba que produce HMG-CoA a niveles efectivos para inhibir su crecimiento con el compuesto de prueba; y b) determinar el efecto en el crecimiento de célula, si hay alguno, de poner en contacto el compuesto de prueba con la célula. Una reducción en la inhibición de crecimiento indica que el compuesto exógeno tiene suficiente actividad para aliviar la toxicidad de HMGCoA. Como se mencionó anteriormente, la trayectoria de los organismos que contienen la trayectoria de mevalonato, Homo sapiens por ejemplo, utilizan HMGR como un punto regulador en la producción de isoprenoides. Para limitar la producción de isoprenoides, estos organismos reducen la actividad de HMGR, lo cual podría ocasionar un desarrollo de su precursor HMG-CoA. Este desarrollo de HMG-CoA también podría ocurrir en pacientes que toman fármacos reductores de colesterol que inhiben la actividad de HMGR. Para ayudar en un entendimiento de la presente invención, se proporcionan las Figuras 1-3, dichas Figuras ilustran esquemáticamente trayectorias biosintéticas que conducen a la producción de isoprenoide o de precursor de isoprenoide. La Figura 1 ilustra trayectorias de isoprenoide que involucran la modificación de difosfato de isopentenilo (IPP) y/o su isómero difosfato de dimetilalilo (DMAPP) a través de prenil transferasa para generar difosfatos de poliprenilo, difosfato de geranilo (GPP), difosfato de farnesilo (FPP), y difosfato de geranil-geranilo (GGPP). Además, GPP y FPP se modifican a través de terpenos sintasa para generar monoterpenos y sesquiterpenos, respectivamente; y GGPP además se modifica a través de terpenos sintasa para generar diterpenos y carotenoides. Se generan IPP y DMAPP a través de una de estas dos trayectorias: La trayectoria de mevalonato (MEV) y la trayectoria de 5-fosfato de 1-desoxi-D-xilulosa (DXP). La Figura 2 ilustra esquemáticamente la trayectoria de MEV, en donde acetilo-CoA se convierte a través de una serie de reacciones para IPP. La Figura 3 ilustra esquemáticamente la trayectoria de DXP, en donde el piruvato y D-gliceraldehído-3-fosfato se convierten a través de una serie de reacciones para IPP y DMAPP. Las células eucarióticas distintas a las células de planta utilizan la trayectoria del isoprenoide MEV exclusivamente para convertir acetil-coenzima A (acetil-CoA) a IPP, que es subsecuentemente isomerizado a DMAPP.

Las plantas utilizan tanto la MEV como el mevalonato-independiente, o trayectorias DXP para síntesis del isoprenoíde. Los procariotes, con algunas excepciones, utilizan la trayectoria de DXP para producir IPP y DMAPP separadamente a través de un punto de ramificación.

MÉTODOS PARA ALIVIAR LA TOXICIDAD DE HMG-CoA Y MEJORAR LA PRODUCCIÓN DE ISOPRENOIDES Y PRECURSORES DE ISOPRENOIDE La presente invención proporciona métodos para producir un isoprenoide o precursor de isoprenoide en una célula huésped que comprende, o está genéticamente modificada para comprenden, ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican una o más enzimas en la trayectoria de mevalonato. Los métodos generalmente involucran modular el nivel de HMG-CoA en la célula, de manera que el nivel de HMG-CoA no sea tóxico a la célula y/o sustancialmente no inhiba el crecimiento de la célula, aunque el nivel de HMG-CoA proporciona la producción mejorada de isoprenoide o precursores de isoprenoide a través de la célula. Los métodos generalmente involucran cultivar una célula huésped genéticamente modificada en un medio adecuado, en donde la célula huésped genéticamente modificada es una que es genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos heterólogos para la célula huésped, en donde el uno o "más ácidos nucleicos comprenden secuencias de nucleótido que codifican uno o más polipéptidos que proporcionan alivio o reducción de la inhibición de crecimiento de célula inducido por acumulación de HMG-CoA o toxicidad. Los polipéptidos que proporcionan alivio o reducción de la inhibición de crecimiento de célula inducido por la acumulación de HMG-CoA o toxicidad incluyen, pero no se limitan a, reductasa HMG-CoA (HMGR), HMG-CoA sintasa (HMGS), y una enzima que afecta el nivel de acetoactil-CoA (el precursor de HMG-CoA) o mevalonato. El nivel de un compuesto isoprenoide (y/o un precursor de ¡soprenoide corriente abajo de HMG-CoA, tal como mevalonato, pirofosfato de isoprenilo (IPP), o un difosfato de poliprenilo) producido en la célula huésped genéticamente modificada es mayor que el nivel del compuesto isoprenoide (y/o un precursor de isoprenoide corriente abajo de HMG-CoA, tal como mevalonato, IPP, o un difosfato de poliprenilo) producido en una célula huésped de control ("padre") que no está genéticamente modificada con uno o más de los ácidos nucleicos que codifican HMGS y/o HMGR. La presente- invención además proporciona células huésped genéticamente modificadas que son adecuadas para utilizarse en un método de la presente. La presente invención además proporciona construcciones de ácido nucleico recombinante para utilizarse en la generación de una célula huésped genéticamente modificada de la invención. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para reducir la toxicidad de HMG-CoA y mejorar la producción de un isoprenoide o precursor de isoprenoíde a través de una trayectoria de mevalonato en una célula huésped, en donde la célula huésped produce el isoprenoide o precursor de isoprenoide a través de una trayectoria de mevalonato. El método generalmente involucra: (a) modificar genéticamente la célula huésped para contener uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican una o más enzimas que, cuando se producen en la célula, reducen la La inhibición de crecimiento inducido por la acumulación de HMG-CoA, según comparado con una célula huésped padre de control que no está genéticamente modificada con dichos ácidos nucleicos heterólogos; y (b) cultivar la célula huésped genéticamente modificada bajo condiciones, de manera que el nivel de isoprenoide o precursor de isoprenoide producido en la célula huésped genéticamente modificada sea mayor que el nivel de isoprenoide o precursor de isoprenoide producido en la célula huésped padre de control. El nivel de HMG-CoA en una célula huésped padre o de origen se modula reduciendo el nivel de la actividad de HMGS y/o incrementado el nivel de la actividad de HMGR en la célula y/o equilibrando el nivel de la actividad de HMGS y la actividad HMGR de manera que se alivia la toxicidad de célula inducida por la acumulación de HMG-CoA. El nivel de HMG-CoA en una célula huésped padre también se modula a través de modificaciones genéticas que promueven el flujo equilibrado de metabolitos a través de la trayectoria de mevalonato, como se describe con mayor detalle más adelante. La presente invención se puede aplicar a células huésped que producen IPP y/o mevalonato a través de la trayectoria de mevalonato. Dichas células huésped son denominadas aquí como células huésped "padre" y comprenden, o se modifican genéticamente para comprender ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican una o más enzimas en la trayectoria de mevalonato (y, por lo tanto, producen IPP y/o mevalonato a través de la trayectoria de mevalonato). Las células huésped padre exhiben toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA, en donde el nivel de HMG-CoA intracelular inhibe el crecimiento de célula, en ausencia de una modificación genética adicional, como se describe aquí; de esta manera, por ejemplo, una célula huésped padre es una que, pero para una modificación genética como se describe aquí, podría acumular HMG-CoA intracelularmente y exhibir toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA. Las células huésped padre son genéticamente modificadas para incluyen uno o más ácidos nucleicos heterólogos a la célula huésped, en donde el uno o más ácidos nucleicos comprenden secuencias de nucleótido que codifican HMGR y/o HMGS y que proporcionan un nivel incrementado de actividad de HMGR y/o un nivel reducido de la actividad de HMGS en la célula. La inhibición de crecimiento inducido por la acumulación de HMG-CoA en la célula huésped genéticamente modificada con uno o más de los ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican HMGR y/o HMGS se reduce, comparado con una célula huésped padre no genéticamente modificada con uno o más de los ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican HMGR y/o HMGS. La modificación genética de una célula huésped con uno o más de los ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican HMGR y/o HMGS, da como resultado: a) un nivel reducido de la actividad de HMGS en la célula; b) un nivel incrementado de la actividad de HMGR en la célula; c) un nivel reducido de la actividad de HMGS y un nivel incrementado de la actividad de HMGR en la célula; o d) un equilibrio entre el nivel de actividad de HMGS y la actividad de HMGR, de manera que se alivia la toxicidad inducida por acumulación de HMG-CoA en la célula. De esta manera, por ejemplo, una célula huésped "padre" (o "de padre") es genéticamente modificada para incluir uno o más ácidos nucleicos heterólogos a la célula huésped, en donde el uno o más ácidos nucleicos comprenden secuencias de nucleótido que codifican HMGR y/o HMGS. La célula huésped padre es una que produce IPP a través de una trayectoria de mevalonato y/o que produce mevalonato a través de una trayectoria de mevalonato. La célula padre comprende, o es genéticamente modificada para comprender ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican una o más enzimas en la trayectoria de mevalonato (y produce IPP a través de la trayectoria de mevalonato y/o produce mevalonato a través de una trayectoria de mevalonato). La célula padre exhibe inhibición de crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA.

Una célula padre que ha genéticamente modificada para incluir uno o más ácidos nucleicos heterólogos a la célula huésped, en donde el uno o más ácidos nucleicos comprenden secuencias de nucleótido que codifican HMGR y/o HMGS, se denomina como una "célula huésped genéticamente modificada". La inhibición de crecimiento inducido por la acumulación de HMG-CoA en la célula huésped padre genéticamente modificada se ve reducida, comparado con una célula huésped padre no genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican HMGR y/o HMGS. Además, la producción de un isoprenoide o un precursor de isoprenoide se incrementa en la célula huésped genéticamente modificada, comparado con la célula huésped padre. De esta manera, por ejemplo, la producción de un isoprenoide o precursor isoprenoide se incrementa en al menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 2-veces, por lo menos aproximadamente 2.5 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 20 veces, por lo menos aproximadamente 30 veces, por lo menos aproximadamente 40 veces, por lo menos aproximadamente 50 veces, por lo menos aproximadamente 75 veces, por lo menos aproximadamente 100 veces, por lo menos aproximadamente 200 veces, por lo menos aproximadamente 300 veces, por lo menos aproximadamente 400 veces, o por lo menos aproximadamente 500 veces, o más, en la célula huésped genéticamente modificada, comparada con la célula huésped padre.

Reducción del nivel de la actividad de HMGS y/o incremento del nivel de la actividad de HMGR. En algunas modalidades, un método de la invención para reducir la toxicidad de célula inducida por la acumulación de HMGCoA en una célula huésped comprende reducir el nivel de la actividad de HMGS en la célula y/o incrementar el nivel de la actividad de HMGR en la célula. La reducción del nivel de la actividad de HMGS en una célula incluye reducir la cantidad total del polipéptido de HMGS dentro de la célula; y reducir la actividad específica del polipéptido de HMGS dentro de la célula. De esta manera, en algunas modalidades, el nivel de la actividad de HMGS en una célula se reduce reduciendo la cantidad total de HMGS en la célula. En otras modalidades, el nivel de la actividad de HMGS en una célula se reduce al reducir la actividad específica de HMGS en la célula. Similarmente, al incrementar el nivel de la actividad de HMGR en una célula incluye incrementar la cantidad total del polipéptido de HMGR dentro de la célula; e incrementar la actividad específica del polipéptido HMGR dentro de la célula. De esta manera, en algunas modalidades, el nivel de la actividad de HMGR en una célula se incrementa aumentando la cantidad total de HMGR en la célula. En otras modalidades, el nivel de la actividad de HMGR en una célula se incrementa aumentando la actividad específica de HMGR en la célula. La reducción del nivel de la actividad de HMGS en una célula se logra en un número de formas, que incluyen, pero no se limitan a: 1) reducir la trascripción de un ácido nucleico que codifica HMGS; 2) reducir la traducción de un ARNm que codifica HMGS; 3) reducir la estabilidad del ARNm que codifica HMGS; 4) reducir la estabilidad del polipéptido HMGS; y 5) reducir la actividad enzimática de la enzima HMGS. El incremento del nivel de la actividad de HMGR en una célula se logra en un número de formas, que incluyen, pero no se limitan a: 1) incrementar la trascripción de un ácido nucleico que codifica HMGR; 2) incrementar la traducción de un ARNm que codifica HMGR; 3) incrementar la estabilidad del ARNm que codifica HMGR; 4) incrementar la estabilidad de la enzima HMGR; y 5) incrementar la actividad enzimática de la enzima HMGR. De esta manera, en algunas modalidades de la invención, el nivel no tóxico deseado de HMG-CoA se logra a través de la modulación tanto de HMG-CoA sintasa como de la actividad de HMGCoA reductasa en la célula. En una modalidad, la célula huésped padre es una célula de levadura de existencia natural, o una célula huésped E.coli, que está genéticamente modificada con un vector o vectores que contienen secuencias de codificación de HMGS y HMGR. Las enzimas HMGS y HMGR codificadas se producen en la célula, de manera que no se alcanzan niveles tóxicos de HMG-CoA y se obtiene un flujo óptimo a través de la trayectoria, proporcionando altos rendimientos de los productos deseados (¡soprenoide o compuesto de precursor isoprenoide). En una modalidad, las regiones de codificación de HMGS y HMGR son controladas a través de diferentes promotores. En otra modalidad, las secuencias de codificación de HMGS y HMGR están en diferentes vectores, la secuencia de codificación de HMGS opcionalmente localizada en un vector de número de copia más bajo. En otra modalidad, las secuencia de codificación de HMGS y HMGR están en el mismo operon, pero la secuencia de codificación de HMGR está localizada corriente arriba de la secuencia de codificación de HMGS, y está disposición es diferente a partir de un operon de existencia natural que contiene las secuencia de codificación tanto de HMGS como de HMGR. En algunas modalidades, la reducción del nivel de la actividad de HMGS y/o el aumento del nivel de la actividad de HMGR en una célula reduce el nivel de HMG-CoA en la célula, de manera que la toxicidad y/o la inhibición de crecimiento del nivel de HMG-CoA se reduce. De esta manera, en algunas modalidades, la reducción del nivel de la actividad de HMGS y/o el aumento del nivel de la actividad de HMGR en una célula reduce el nivel de HMG-CoA en al menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 15%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 35%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 45%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, o por lo menos aproximadamente 90%, comparado con una célula padre de control que exhibe inhibición de crecimiento inducido por la acumulación de HMG-CoA. El nivel de HMG-CoA en una célula se fácilmente determinado utilizando cromatografía de líquido-espectrometría de masas, y similares. En algunas modalidades, la reducción del nivel de la actividad de HMGS y/o el incremento del nivel de la actividad de HMGR en una célula reduce la inhibición de crecimiento por la acumulación de HMG-CoA en la célula. De esta manera, en algunas modalidades, \a reducción del nivel de la actividad de HMGS y/o el incremento del nivel de la actividad de HMGR en una célula reduce la inhibición de crecimiento mediada por la acumulación de HMG-CoA en al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 90%, comparado con una célula de control que exhibe inhibición de crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA. El crecimiento de células huésped genéticamente modificadas fácilmente se determinan utilizando métodos bien conocidos, por ejemplo, medición de densidad óptica (OD) a aproximadamente 600 nm (OD60Q) de cultivos líquidos de bacterias; tamaño de colonia; velocidad de crecimiento; y similares. En una modalidad ilustrativa, una célula padre de control es una célula huésped procariótica que ha sido genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, y HMGR, en donde HMG-CoA se produce y se acumula intracelularmente a niveles que son desarrollados inhibiendo o tóxicos a la célula. Como un ejemplo no limitante, una célula padre de control es una célula huésped de E.coli que ha genéticamente modificada con una construcción de expresión que comprende una secuencia de nucleótido que codifica acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, y HMGR en un operon policistrónico individual en el orden recitado en un plásmido o en el cromosoma; y las célula huésped genéticamente modificada es un E.coli genéticamente modificado con una construcción(es) de expresión que comprende que las secuencias de nucleótido que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, HMGR, y HMGS en un operon policistrónico individual en el orden listado ajustado en un plásmido o en el cromosoma. Como un ejemplo no limitante adicional, una célula padre de control es una célula huésped E.coii que ha sido genéticamente modificada con una construcción de expresión que comprenden una secuencia de nucleótido que codifica acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, y HMGR en un operon policistrónico individual en el orden citado en un plásmido de copia media; y la célula huésped genéticamente modificada es E.coli genéticamente modificado con construcción(es) de expresión que comprende una secuencia de nucleótido que codifica acetoacetil- CoA tiolasa y HMGS en el orden citado en un plásmido de copia baja, y una secuencia de nucleótido HMGR en un plásmido de copia alta separado. Como un ejemplo no limitante adicional, una célula padre de control es una célula huésped de E.coli que ha sido genéticamente modificada con una construcción de expresión que comprende una secuencia de nucleótido que codifica acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, y HMGR en un operon policistrónico individual en el orden citado en un plásmido de copia media; y la célula huésped genéticamente modificada es E.coli genéticamente modificado con una construcción(es) de expresión que comprende una secuencia de nucleótido que codifica acetoacetil-CoA tiolasa y HMGS en el orden citado en un plásmido de copia media en donde el sitio de unión de ribosoma ha sido alterado para reducir la traducción, y una secuencia de nucleótido HMGR en un plásmido de copia media separado para el cual el promotor ha sido cambiado a una versión más fuerte. Como un ejemplo no limitante adicional, una célula padre de control es una célula huésped de E.coli que ha sido genéticamente modificada con una construcción de expresión que comprende una secuencia de nucleótido que codifica acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, y HMGR en un operon policistrónico individual en el orden citado en un plásmido de copia media; y la célula huésped genéticamente modificada es E.coli genéticamente modificado con una construcción(es) de expresión que comprende una secuencia de nucleótido que codifica acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS con un sitio de proteasa diseñado por ingeniería, y HMGR al cual una proteína altamente soluble, tal como glutationa-transferasa ha sido fusionada en el orden citado en un plásmido de copia media. La alteración genética que da como resultado cambios a la secuencia de amino ácido de proteína, tales como aquellos listados anteriormente, dará como resultado cambios en la actividad catalítica relativa (según medido a través de Vmax o Vmax/Km) de HMGS y HMGR. De esta manera, en algunas modalidades, la reducción del nivel de la actividad de HMGS y/o el incremento del nivel de la actividad de HMGR da como resultado un incremento de la relación de actividad catalítica de HMGR a actividad catalítica de HMGS en una base por célula de HMGR por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 15%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 35%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 45%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 2.5 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 20 veces, por lo menos aproximadamente 30 veces, por lo menos aproximadamente 40 veces, por io menos aproximadamente 50 veces, por lo menos aproximadamente 75 veces, por lo menos aproximadamente 100 veces, por lo menos aproximadamente 200 veces, por lo menos aproximadamente 300 veces, por lo menos aproximadamente 400 veces, o por lo menos aproximadamente 500 veces, o más, que HMGS en la célula huésped genéticamente modificada, comparado con la célula huésped padre. El crecimiento de células huésped genéticamente modificadas fácilmente se determina utilizando métodos bien conocidos, por ejemplo, medición de densidad óptica (OD) a aproximadamente 600 nm (OD6oo) de cultivos líquidos de bacteria; tamaño de colonia; velocidad de crecimiento; y similares. En otra modalidad, la célula padre de control es una célula eucariótica, por ejemplo, una célula de levadura tal como Saccharomyces cerevisiae. En algunas de estas modalidades, la célula eucariótica padre de control comprende una o más mutaciones en gen de piruvato-descarboxilasa endógeno, de manera que el gen piruvato-descarboxilasa es funcionalmente deshabilitado, y de manera que HMG- CoA se acumula intracelularmente a un nivel que es inhibidor de crecimiento o tóxico a la célula. En la práctica de la invención, la célula padre de control además se modificada con modificaciones al ácido nucleico que codifica HMGR o sus elementos de control que incrementan la trascripción, traducción, o los niveles de actividad específica, creando la célula huésped genéticamente modificada. En una modalidad, la célula padre de control además modifica a través de la introducción de HMGR en un plásmido bajo el control de un promotor de inducción.

Modificaciones que reducen la acumulación de HMG-CoA reduciendo el nivel de actividad de HMG-CoA sintasa Aquellos expertos en la técnica apreciarán, después de contemplar esta descripción, que el nivel de HMG-CoA depende, por lo menos en parte, del nivel de actividad de HMGS en la célula. Las reducciones antes mencionadas en la Inhibición de crecimiento de célula inducida por la acumulación de HMG-CoA y/o las reducciones en los niveles de HMG-CoA intracelular en algunas modalidades se obtienen a través de la modulación de los niveles de la actividad de HMGS en la célula. De esta manera, en algunas modalidades, el alivio de la toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA y/o un nivel no tóxico de HMG-CoA se logra a través de la modulación del nivel de la actividad de HMG-CoA sintasa en la célula. En estas modalidades, una célula huésped padre que comprende, o está genéticamente modificada para comprender, ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican una o más enzimas en la trayectoria de mevalonato (y produce IPP y/o mevalonato a través de la trayectoria de mevalonato) es genéticamente modificada para incluir un ácido nucleico heterólogo a las célula huésped, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótído que codifica HMGS, en donde la inhibición de crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA en la célula huésped genéticamente modificada con el ácido nucleico heterólogo que comprende secuencias de nucleótido que codifican HMGS ser reduce, comparada con una célula huésped padre no genéticamente modificada con el ácido nucleico heterólogo que comprende secuencias de nucleótido que codifican HMGS. En una modalidad, el ácido nucleico que codifica HMGS-heterólogo se utiliza para reemplazar todo o una parte de un gen HMGS endógeno. En otra modalidad, la célula huésped padre es una que ha sido genéticamente modificada para contener un gen HMGS exógeno; y el gen HMGS exógeno de la célula huésped padre se reemplaza por un gen HMGS modificado que proporciona un nivel más bajo de actividad de HMGS, por ejemplo, la cantidad de HMGS y/o la actividad de HMGS es menor en la célula huésped padre. En otra modalidad, el ácido nucleico heterólogo que reduce en nivel de actividad de HMGS codifica un inhibidor de HMGS o un ARN antisentido que reduce la traducción de la transcripción de HMGS. En ambos casos, aunque la velocidad de producción de ¡soprenoide o de precursor de isoprenoide específica de la célula huésped modificada puede reducirse cuando e compara con la cepa de origen, el alivio resultante en la inhibición de crecimiento asociada con HMG-CoA podría conducir a mayores densidades de células, dando como resultado un incremento total en la producción. En algunas modalidades, un ácido nucleico heterólogo es introducido a una célula huésped padre, y el ácido nucleico heterólogo se recombina con un ácido nucleico endógeno que codifica HMGS, modificando así genéticamente la célula huésped padre. En algunas modalidades, el ácido nucleico heterólogo comprende un promotor que tiene una resistencia de promotor reducida, comparado con el promotor endógeno que controla la trascripción del HMGS endógeno, y el evento de recombinación da como resultado la sustitución del promotor endógeno con el promotor heterólogo. En otras modalidades, el ácido nucleico heterólogo comprende una secuencia de nucleótido que codifica un HMGS que exhibe actividad enzimática reducida comparada con el HMGS endógeno, y el evento de recombinación da como resultado la sustitución la secuencia de codificación de HMGS endógeno con la secuencia de codificación de HMGS heteróloga. Una célula huésped genéticamente modificada adecuada para utilizarse en un método de la invención es genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos heterólogos, incluyendo un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica HMGS, de manera que el nivel de la actividad de HMGS en la célula se reduce. El nivel de actividad de HMGS se reduce en la célula en al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 90%, comparado con una célula huésped padre no genéticamente modificada con uno o más de los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótido que codifica HMGS. La célula huésped padre exhibe una inhibición de crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA. En una modalidad ilustrativa, una célula padre de control es una célula huésped procariótica que ha sido genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, y HMGR, en donde HMG-CoA se produce y se acumula intracelularmente a niveles que son inhibidores de crecimiento o tóxicos a la célula. Como un ejemplo no limitante, una célula padre de control es una célula huésped de E.coli que ha sido genéticamente modificada con una construcción de expresión que comprende la secuencia de nucleótido establecida en SEC ID NO:1; y la célula huésped genéticamente modificada es E.coli genéticamente modificado con una construcción(es) de expresión que comprende una versión modificada de la secuencia de nucleótido establecidas en SEC ID NO:1, en donde el sitio de unión de ribosoma corriente arriba de HMGS ha sido alterado, de manera que se reduce la traducción. Como un ejemplo no limitante, una célula padre de control es una célula huésped de E.coli que ha sido genéticamente modificada con una construcción de expresión que comprende la secuencia de nucleótido establecida en SEC ID NO:1; y la célula huésped genéticamente modificada es E.coli genéticamente modificado con una construcción(es) de expresión que comprende una versión modificada de las secuencias de nucleótido establecidas en SEC ID NO: 1 en donde un sitio de RNase ha sido introducido en la región de codificación de HMGS. Como un ejemplo no limitante, una célula padre de control es una célula huésped de E.coli que ha sido genéticamente modificada con una construcción de expresión que comprende la secuencia de nucleótido establecida en SEC ID NO: 1; y la célula huésped genéticamente modificada es E.coli genéticamente modificado con una construcción(es) de expresión que comprende las secuencias de nucleótido establecidas en SEC ID NO:2. Ver, por ejemplo, Figura 5 Y Ejemplo 2. Como un ejemplo no limitante, una célula padre de control es una célula huésped de E.coli que ha sido genéticamente modificada con una construcción de expresión que comprende la secuencia de nucleótido establecida en SEC ID NO:1; y la célula huésped genéticamente modificada es E.coli genéticamente modificado con una construcción(es) de expresión que comprende las secuencias de nucleótido establecidas en SEC ID NO:1 y SEC ID NO:8. En otra modalidad, la célula padre de control es una célula eucariótica, por ejemplo, una célula de levadura tal como Saccharomyces cerevisiae. En algunas de estas modalidades, la célula eucariótica padre de control comprende una o más mutaciones en el gen piruvato-descarboxilasa endógeno, de manera que el gen piruvato-descarboxilasa es funcionalmente deshabilitado, y de manera que HMG-CoA se acumula intracelularmente a un nivel que es inhibidor del crecimiento o tóxico a la célula. El nivel de la actividad de HMGS en la célula huésped genéticamente modificada puede ser reducido en un número de formas, incluyendo, pero no se limitan a, 1) la reducción de la resistencia del promotor del promotor al cual la región de codificación de HMGS está operablemente enlazada; 2) la reducción del número de copia del plásmido que comprende una secuencia de nucleótido que codifica HMGS; 3) la reducción de la estabilidad en un ARNm de HMGS (en donde un "ARNm de HMGS" es un ARNm que comprende una secuencia de nucleótido que codifica HMGS); 4) la modificación de la secuencia del sitio de unión de ribosoma de un ARNm de HMGS, de manera que el nivel de traducción de ARNm de HMGS se reduce; 5) la modificación de la distancia y/o la secuencia entre el sitio de unión de ribosoma del ARNm de HMGS y el codón de inicio de la secuencia de codificación de HMGS, de manera que el nivel de traducción del ARNm de HMGS se reduce; 6) la modificación de toda la región intercistrónica 5' del codón de inicio de la secuencia de codificación de HMGS de manera que el nivel de traducción de ARNm de HMGS se reduce; 7) la modificación del uso del codón de HMGS de manera que el nivel de traducción del ARNm de HMGS se reduce; 8) la reducción de estabilidad de enzima de HMGS; 9) la reducción la actividad específica (unidades de actividad por unidad de proteína) de HMGS; y 10) en donde HMGS se codificada en un operon, cambiando el orden las regiones codificación sobre el ARNm policistrónico. Se pueden hacer dos o más de las modificaciones antes mencionadas, con el fin de reducir el nivel de actividad de HMGS en la célula huésped genéticamente modificada. En algunas modalidades, el nivel de actividad de HMGS se reduce con relación a la actividad de HMGS en una célula padre de control utilizando un plásmido de número de copia bajo, dicho plásmido comprende una secuencia de nucleótido que codifica HMGS. La reducción del número de copia de plásmido de un vector comprende una secuencia de nucleótido que codifica HMGS se logra seleccionando una estructura de base de plásmido que es conocida por ser un plásmido de número de copia bajo. Los plásmidos de número de copia bajo generalmente proporcionan menos de aproximadamente 20 copias de plásmido por célula, por ejemplo, de aproximadamente 5 copias de plásmido por célula a aproximadamente 20 copias de plásmido por célula. Los plásmidos de número de copia bajo adecuados incluyen, pero no se limitan a, pACYC184, pBR332, pBAD33, pBBRIMCS, y pSC101. Por ejemplo, pSC101 generalmente está presente en una célula a aproximadamente 5 copias por célula. En una modalidad de la invención, los niveles de HMGS y HMGR son modulados colocando los dos genes en diferentes vectores de expresión, de manera que la secuencia que codifica HMGS está sobre un vector de copia baja y la secuencia de codificación de HMGR está sobre un vector de copia alta. En otra modalidad de la invención, los genes están sobre el mismo vector pero bajo el control de diferentes promotores, la secuencia de codificación de HMGS estando bajo el control del más débil de los dos promotores.

Modificaciones que reducen la acumulación de HMG-CoA intracelular incrementando el nivel de actividad de HMG-CoA reductasa Aquellos expertos en la técnica apreciarán, después de contestar esta descripción, que el nivel de HMG-CoA depende, por lo menos en parte, del nivel de actividad de HMGR en la célula. Las reducciones antes mencionadas en la inhibición de crecimiento de célula inducida por la acumulación de HMG-CoA y/o las reducciones en los niveles de HMG-CoA intracelular se pueden lograr de acuerdo con los métodos de la invención, modulando los niveles de actividad de HMGR en la célula. De esta manera, en una modalidad de la invención, se logra un nivel no tóxico de HMG-CoA y/o el alivio de la toxicidad inducida por ia acumulación de HMG-CoA, a través de la modulación del nivel de la actividad de HMG-CoA reductasa en la célula. En estas modalidades, una célula huésped padre que comprende, o está genéticamente modificada para comprender, ácidos nucleicos que comprende secuencias de nucleótido que codifican una o más enzimas en la trayectoria de mevalonato, y produce IPP y/o mevalonato a través de la trayectoria de mevalonato, es genéticamente modificada para incluir un ácido nucleico heterólogo a las célula huésped, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótido que codifica HMGR, en donde la inhibición de crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA en la célula huésped genéticamente modificada con el ácido nucleico heterólogo que comprende secuencias de nucleótído que codifican HMGR se reduce, comparado con una célula huésped padre de control no modificada genéticamente con el ácido nucleico heterólogo que comprende secuencias de nucleótido que codifican HMGR. Una célula huésped genéticamente modificada adecuada para utilizarse en un método de la invención es genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos, incluyendo un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica HMGR, de manera que el nivel de actividad de HMGR en la célula se incrementa. El nivel de actividad de HMGR se incrementa en la célula por al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 90%, comparado con una célula padre de control no modificada genéticamente con uno o más de los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótido que codifica HMGR. En una modalidad ilustrativa, una célula padre de control es una célula huésped procariótica que ha sido genéticamente modificada con uno o más de los ácidos nucleicos que comprende secuencias de nucleótido que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, y HMGR, en donde HMG-CoA se produce y acumula intracelularmente a niveles que son inhibidores de crecimiento o tóxicos para la célula. En una modalidad, una célula padre de control es una célula huésped procariótica que naturalmente no contiene una trayectoria de mevalonato y que ha sido genéticamente modificada para producir mevalonato; y la célula huésped genéticamente modificada además se diseña por ingeniería para alterar la actividad de HMGR, de manera que los niveles intracelulares de HMG-CoA no son inhibidores o tóxicos a la célula. En una modalidad ilustrativa, una célula padre de control es una célula huésped de E.coli que ha sido genéticamente modificada para producir mevalonato; y la célula huésped genéticamente modificada es una versión de E.coli genéticamente modificado de la célula padre de control aumentada con construcciones diferentes a aquellas listadas en las siguientes referencias: Kato-Emori et al. Mol Genet Genomics (2001) 265:135-42, Learned RM, et al. PNAS. (1989) 86:2779-83, T. Dairi, et al. Mol Gen Genet (2000) 262: 957-964, Alien, et al. Appl Environ. Microbio. (1997). 63:3341-3344, Hedí, et al. J Bacteriol, (2002), 184:2116-2122aJackson, et al. Org. Lett. (2003) 5:1629-1632, Randolph Y. Hampton, et al. (1994) Cell, 125:299-312, Markus Veen, et al. FEMS Yeast Res (2003) 4:87-95 Beach MJ, et al. J Bacteriol (1989) 171:2994-3001, Bischoff KM, et al. Protein Sci (1997) 6:156-161, Friesen JA, et al. Biochemistry. (1997) 36:2173-7, Frimpong, et al. J Biol Chem. (1994) 269:11478-83, Panda, et al. Appl Microbiol Biotechnol (2004) 66:143-152. Como un ejemplo no limitante, una célula padre de control es una célula huésped de E.coli que ha sido genéticamente modificada con una construcción de expresión que comprende la secuencia de nucleótido establecida en SEC ID NO:1; y la célula huésped genéticamente modificada es E.coli genéticamente modificado con la construcción de expresión que comprende las secuencias de nucleótido establecidas en SEC ID NO:1 y SEC ID NO:8. Ver, por ejemplo, Figuras 6 y 7 y Ejemplos 3 y 4. Como un ejemplo no limitante, una célula padre de control es una célula huésped de E.coli que ha sido genéticamente modificada con una construcción de expresión que comprende la secuencia de nucleótido establecida en SEC ID NO:2; y la célula huésped genéticamente modificada es E.coli genéticamente modificado con la construcción de expresión que comprende las secuencia de nucleótido establecidas en SEC ID NO:2 y SEC ID NO:9. Ver, por ejemplo, Figura 10 y Ejemplo 6. En otra modalidad, la célula padre de control es una célula eucariótica, por ejemplo, una célula de levadura tal como Saccharomyces cerevisiae. En algunas de estas modalidades, la célula eucariótica padre de control comprende una o más mutaciones en el gen piruvato-descarboxilasa endógeno, de manera que el gen piruvato-descarboxilasa está funcionalmente deshabilitado, y de manera que HMG-COA se acumula intracelularmente a un nivel que es inhibidor de crecimiento o tóxico para la célula. El nivel de actividad de HMGR en la célula huésped genéticamente modificada puede ser incrementado en un número de formas, que incluyen, pero no se limitan a, 1) incrementar la resistencia de promotor del promotor al cual la región de codificación de HMGR está operablemente enlazada; 2) incrementar el número de copias del plásmido que comprende una secuencia de nucleótido que codifica HMGR; 3) incrementar la estabilidad de un ARNm de HMGR (en donde un "ARNm de HMGR" es un ARNm que comprende una secuencia de nucleótido que codifica HMGR); 4) modificar la secuencia del sitio de unión de ribosoma de un ARNm de HMGRI, de manera que el nivel de traducción del ARNm de HMGR se incrementa; 5) modificar la secuencia entre el sitio de unión de ribosoma de una ARNm de HMGR y el codón de inicio de la secuencia de codificación de HMGR, de manera que el nivel de traducción del ARNm de HMGR se incrementa; 6) modificar toda la región intercistrónica 5' del codón de inicio de la región de codificación de HMGR, de manera que la traducción del ARNm de HMGR se incrementa; 7) modificar el uso de codón de HMGR, de manera que el nivel de traducción del ARNm de HMGR se incrementa, 8) expresar los ARNts de codón raros utilizados en HMGR, de manera que el nivel de traducción del ARNm de HMGR se incrementa; 9) incrementar la estabilidad de enzima de HMGR; o 10) incrementar la actividad específica (actividad de unidades por proteína de unidad) de HMGR. Se pueden hacer dos o más de las modificaciones anteriores para proporcionar un nivel incrementado de actividad de HMGR. En la secuencia de nucleótido establecida en SEC ID NO:2, la región de codificación de HMGR está bajo el control transcripcional del promotor PBAD- En algunas modalidades, el promotor al cual la región de codificación de HMGR está operablemente enlazada es un promotor más fuerte que el promotor PBAD, por ejemplo, el nivel de ARNm transcrito en por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 15%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 35%, por' lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 45%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces o más, mayor que el nivel de ARNm transcrito utilizando el promotor PBAD- Los promotores adecuados incluyen, pero no se limitan a, un promotor lac de consenso, un promotor trp, un promotor tac, un promotor tre, un promotor lambda, y promotor T7. El incremento del número de copia de plásmido se logra seleccionando una estructura de base de plásmido que es conocida por ser un plásmido de número de copia medio o alto. Los plásmidos de número de copia bajo generalmente proporcionan menos de aproximadamente 20 copias de plásmido por célula. Los plásmidos de número de copias medio generalmente proporcionan de aproximadamente 20 copias de plásmido por célula a aproximadamente 50 copias de plásmido por célula, o de aproximadamente 20 copias de plásmido por célula a aproximadamente 80 copias de plásmido por célula. Los plásmidos de número de copia alto generalmente proporcionan de aproximadamente 80 copias de plásmido por célula a aproximadamente 200 copias de plásmido por célula, o más. En muchas modalidades, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica HMGR es un vector de plásmido de número de copia alto que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica HMGR. Los plásmidos de número de copia alto adecuados incluyen, pero no se limitan a, vectores pUC (por ejemplo, pUC8, pUC18, pUC19, y similares), vectores pBluescript, vectores pGEM, y vectores pTZ. Aquellos expertos en la técnica apreciarán, después de contemplar esta descripción, que el nivel de HMG-CoA en una célula puede ser modificado modulando los niveles relativos de las actividades de HMGS y HMGR en la célula. De esta manera, en una modalidad de la invención, el nivel no tóxico deseado de HMG-CoA se logra a través de modulación de la actividad tanto de HMG-CoA síntasa como de HMG-CoA reductasa en la célula. En una modalidad, la célula huésped padre es una levadura de existencia natural o una célula huésped de E.coli que es genéticamente modificada con un vector o vectores que contienen secuencias de codificación de HMGS y HMGR. Las enzimas HMGS y HMGR codificadas son producidas en la célula, de manera que no se alcanzan niveles tóxicos de HMG-CoA y se logra un flujo óptimo a través de la trayectoria, proporcionando altos rendimientos de los productos deseados (isoprenoide o compuesto precursor de ' isoprenoide). En una modalidad, las regiones de codificación de HMGS y HMGR se controlan a través de diferentes promotores. En otra modalidad, las secuencias de codificación de HMGS y HMGR están en diferentes vectores, las secuencia de codificación de HMGS opcionalmente localizada sobre un vector de número de copia más bajo. En una modalidad, las secuencias de codificación de HMGS y HMGR están en el mismos operon, pero la secuencia de codificación de HMGR está localizada corriente arriba de la secuencia de codificación de HMGS, y está disposición es diferente de un operon de existencia natural que contiene secuencias de codificación tanto de HMGS y HMGR.

Modificaciones que reducen la acumulación de HMG-CoA equilibrando el flujo a través de la trayectoria de mevalonato E? algunas modalidades, la inhibición de crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA o toxicidad se reduce equilibrando el flujo de metabolito a través de la trayectoria. El flujo de metabolito puede ser equilibrado en un número de formas, incluyendo, pero no limitándose a, 1) mutaciones en enzimas corriente arriba (es decir, AtaB, AtaC, AtaA, AtaD) de HMGS que limitan el sustrato (AcetoAcetil-CoA) disponible para la enzima; 2) cambios en expresión de enzimas corriente arriba (por ejemplo, AtaC, AtaA, AtaD, y enzimas involucradas en la biosíntesis de ácido graso) de HMGS que limitan al sustrato (acetoacetil-CoA) disponible para la enzima; 3) cambios en la expresión de enzimas corriente abajo (es decir, MK, PMK, MVD) de HMGR que eliminan el suministro de mevalonato y de esta manera promueven la conversión de HMGCoA a mevalonato; 4) mutaciones que cambian las características catalíticas de la enzima corriente abajo (es decir, MK, PMK, MVD) de HMGR que eliminan el suministro de mevalonato y de esta manera promueven la conversión de HMG-CoA a mevalonato; 5) proteínas de fusión de HMGR con una enzima corriente arriba (es decir, acetoacetíl-CoA tiolasa, HMGS, ) para hacer diferente la expresión de una enzima de producción de HMG a HMGR; 6) proteína de fusión de HMGS con una enzima corriente abajo (es decir, MK) para igualar la expresión de una enzima de producción de HMG-CoA a una enzima sensible al movimiento de metabolito lejos de HMG-CoA.

Incremento de la producción de isoprenoide o precursor de isoprenoide Los métodos antes descritos dan como resultado el alivio de toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA y/o inhibición de crecimiento de célula en una célula; y proporciona la producción incrementada de un compuesto isoprenoíde y/o un compuesto precursor de isoprenoide en la célula. De esta manera, la presente invención proporciona métodos para incrementar la producción de un compuesto isoprenoide o un compuesto precursor de isoprenoide en una célula, en donde los métodos generalmente involucran modular los niveles de HMG-CoA en la célula, de manera que los niveles de HMG-CoA permanecen por debajo de un nivel tóxico o nivel inhibidor de crecimiento, y más aún están a un nivel que es lo suficientemente alto para proporcionar una producción incrementada de un compuesto isoprenoide o un compuesto precursor de isoprenoide. La presente invención proporciona métodos para incrementar la producción de un compuesto de isoprenoide, o un precursor de compuesto de isoprenoide (por ejemplo, mevalonato, IPP, un disfosfato de poliprenilo, etc.) a través de una célula o cultivos de una célula. Los métodos generalmente involucran incrementar el nivel de actividad de HMGR, y/o reducir el nivel de actividad de HMGS, en una célula que exhibe inhibición de crecimiento de célula inducida por la acumulación de HMG-CoA. Una célula que exhibe Inhibición de crecimiento de célula inducida por acumulación de HMG-CoA es, en algunas modalidades una célula huésped padre que normalmente no sintetiza IPP o mevalonato a través de una trayectoria de mevalonato, y que ha sido genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican enzima(s) de trayectoria de mevalonato, dichas enzimas son producidas a niveles que dan como resultado la acumulación de niveles tóxicos o inhibidores de crecimiento de HMGCoA en la célula. Una célula que exhibe una inhibición de crecimiento de célula inducida por acumulación de HMG-CoA es, en algunas modalidades, una célula huésped padre que normalmente sintetiza IPP o mevalonato a través de una trayectoria de mevalonato, pero que genéticamente se modifica, de manera que HMG-CoA intracelular se acumula a niveles inhibidores de crecimiento o tóxicos. En una modalidad, el compuesto es el compuesto precursor de isoprenoide, IPP. En una modalidad, la célula huésped es una célula de E.coli. En otra modalidad, la célula huésped es una célula de levadura. En algunas modalidades, la reducción del nivel de la actividad de HMGS y/o el incremento del nivel de la actividad de HMGR en una célula incrementa la producción de mevalonato a través de la célula huésped genéticamente modificada, o a través de un cultivo de la célula huésped genéticamente modificada. De esta manera, en algunas modalidades, la reducción del nivel de actividad de HMGS y/o el incremento del nivel de la actividad de HMGR en una célula incrementa la producción de mevalonato en al menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 15%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 35%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 45%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 2.5 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 20 veces, por lo menos aproximadamente 30 veces, por lo menos aproximadamente 40 veces, por lo menos aproximadamente 50 veces, por lo menos aproximadamente 75 veces, por lo menos aproximadamente 100 veces, por lo menos aproximadamente 200 veces, por lo menos aproximadamente 300 veces, por lo menos aproximadamente 400 veces, o por lo menos aproximadamente 500 veces, o más, en una célula huésped genéticamente modificada, comparado con la célula huésped padre. La producción de mevalonato fácilmente se determina utilizando métodos bien conocidos, por ejemplo, cromatografía de gas-espectrometría de masas, cromatografía de líquido-espectrometría de masas, cromatografía ¡ónica-espectrometría de masas, cromatografía de capa delgada, detección amperométrica pulsada, espectrometría uv-vis, y similares. En algunas modalidades, la reducción del nivel de actividad de HMGS y/o el incremento del nivel de la actividad de HMGR en una célula incrementa la producción de IPP a través de la célula huésped genéticamente modificada, o a través de un cultivo de la célula huésped genéticamente modificada. De esta manera, en algunas modalidades, la reducción del nivel de la actividad de HMGS y/o el incremento del nivel de la actividad de HMGR en una célula incrementa la producción de IPP en al menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 15%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 35%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 45%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 2.5 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 20 veces, por lo menos aproximadamente 30 veces, por lo menos aproximadamente 40 veces, por lo menos aproximadamente 50 veces, por lo menos aproximadamente 75 veces, por lo menos aproximadamente 100 veces, por lo menos aproximadamente 200 veces, por lo menos aproximadamente 300 veces, por lo menos aproximadamente 400 veces, o por lo menos aproximadamente 500 veces, o más, en la célula huésped genéticamente modificada, comparado con la célula huésped padre. La producción de ÍPP se determina fácilmente utilizando métodos bien conocidos, por ejemplo, cromatografía de líquido-espectrometría de masas, cromatografía de capa delgada, cromatografía iónica-espectrometría de masas, detección amperométrica pulsada, espectrometría uv-vis, y similares.

En algunas modalidades, la reducción del nivel de la actividad de HMGS y/o el incremento del nivel de la actividad de HMGR en una célula incrementa la producción de isoprenoides a través de la célula huésped genéticamente modificada. De esta manera, en algunas modalidades, la reducción del nivel de la actividad de HMGS y/o el incremento del nivel de la actividad de HMGR en una célula incrementa la producción de mevalonato por al menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 15%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 35%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 45%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 2.5 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 20 veces, por lo menos aproximadamente 30 veces, por lo menos aproximadamente 40 veces, por lo menos aproximadamente 50 veces, por lo menos aproximadamente 75 veces, por lo menos aproximadamente 100 veces, por lo menos aproximadamente 200 veces, por lo menos aproximadamente 300 veces, por lo menos aproximadamente 400 veces, o por lo menos aproximadamente 500 veces, o más, en la célula huésped genéticamente modificada, comparada con la célula huésped padre. La producción de isoprenoide fácilmente se determina utilizando métodos bien conocidos, por ejemplo, cromatografía de gas-espectrometría de masas, cromatografía de líquido-espectrometría de masas, cromatografía iónica-espectrometría de masas, detección amperométrica pulsada, espectrometría uv-vis y similares. En algunas modalidades, un método de la presente proporciona la producción mejorada de isoprenoide o un precursor de isoprenoíde por célula, por ejemplo, la cantidad de isoprenoide o compuesto precursor de isoprenoide producido utilizando un método de la presente por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 15%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 35%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 45%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 2.5 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 20 veces, por lo menos aproximadamente 30 veces, por lo menos aproximadamente 40 veces, por lo menos aproximadamente 50 veces, por lo menos aproximadamente 75 veces, por lo menos aproximadamente 100 veces, por lo menos aproximadamente 200 veces, por lo menos aproximadamente 300 veces, por lo menos aproximadamente 400 veces, o por lo menos aproximadamente 500 veces, o más, mayor que la cantidad del isoprenoide o compuesto precursor de isoprenoide producido por una célula padre de control, en una base por célula. La cantidad de células se midió midiendo el peso seco de las células o midiendo la densidad óptica del cultivo de célula. En otras modalidades, un método de la presente proporciona la producción mejorada de isoprenoide o precursor de isoprenoíde por volumen unitario del cultivo de célula, por ejemplo, la cantidad de isoprenoide o compuesto precursor de isoprenoide producido utilizando un método de la presente es por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 15%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 35%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 45%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 2.5 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 20 veces, por lo menos aproximadamente 30 veces, por lo menos aproximadamente 40 veces, por lo menos aproximadamente 50 veces, por lo menos aproximadamente 75 veces, por lo menos aproximadamente 100 veces, por lo menos aproximadamente 200 veces, por lo menos aproximadamente 300 veces, por lo menos aproximadamente 400 veces, o por lo menos aproximadamente 500 veces, o más, mayor que la cantidad del isoprenoide o compuesto precursor de isoprenoide producido a través de una célula padre de control, en un volumen unitario de la base de cultivo de célula. En algunas modalidades, un método de la presente para incrementar producción de un compuesto isoprenoide o un compuesto precursor de isoprenoide comprende modular la composición del medio en donde se cultiva una célula huésped, de manera que el nivel de un intermediario de trayectoria de mevalonato (por ejemplo, acetil-CoA) se incrementa. En algunas modalidades, el medio de cultivo comprende acetato, el cual incrementa el nivel de acetil-CoA, y el cual a su vez incrementa el nivel de HMG-CoA en la célula. Los isoprenoides que puede ser producidos utilizando el método de la invención incluyen, pero no se limitan a, monoterpenos, incluyendo, pero no limitándose a, limoneno, citranelol, geraniol, mentol, alcohol perilíco, linalol, tujenona; sesqulterpenos, incluyendo, pero no limitándose a, periplanona B, gíngkolida B, amorfadieno, artemisínino, ácido artemisinico, valenceno, nootkatona, epi-cedrol, epi-aristolocheno, farnesol, gossypol, sanonln, periplanona, y forskolín; diterpenos, incluyendo, pero no limitándose a, casbeno, eleuterobin, paclitaxil, prostratina, y pseudopterosina; triterpenos, incluyendo pero no limitándose a, arbrusideE, bruceantin, testosterona, progesterona, cortisona, digitoxina. Los isoprenoides también incluyen, pero no se limitan a, carotenoides tales como licopeno, a- y ß-caroteno, a- y ß-criptoxantina, bíxina, zeaxantina, astaxantina, y lutelna. Los isoprenoides también incluyen, pero no se limitan a, triterpenos, compuestos esferoidales, y compuestos que están hechos de isoprenoides modificados por otros grupos químico, tales como terpeno-alcaloides mixtos, y coenzima Q-IO.

CÉLULAS HUÉSPED GENÉTICAMENTE MODIFICADAS La presente1 invención proporciona células huésped genéticamente modificadas; y composiciones que comprenden las células huésped genéticamente modificadas. Las células huésped genéticamente modificadas son útiles para producir un compuesto isoprenoide o un compuesto precursor de isoprenoide, como se discutió anteriormente. Como se discutió anteriormente, un método de la invención para producir un isoprenoide o precursor de isoprenoíde generalmente implica cultivar una célula huésped genéticamente modificada en un medio adecuado. La célula huésped genéticamente modificada es una que ha sido genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican una o más enzimas que, cuando se producen en la célula, alivian la inhibición de crecimiento inducida por acumulación de HMG-Co.A (toxicidad) en la célula. La célula padre (por ejemplo, la célula no genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican una o más enzimas que, cuando se producen en la célula, alivian la inhibición de crecimiento inducida " por la acumulación de HMG-CoA y/o toxicidad en la célula) es una célula que produce, o está genéticamente modificada para producir, IPP a través de una trayectoria de mevalonato. De esta manera, por ejemplo, una célula huésped "padre" (o "de padre") es genéticamente modificada para incluir uno o más ácidos nucleicos heterólogos para la célula huésped, en donde el uno o más ácidos nucleicos comprenden secuencias de nucleótido que codifican HMGR y/o HMGS. Está célula huésped padre produce IPP a través de una trayectoria de mevalonato y/o produce mevalonato a través de una trayectoria de mevalonato. La célula padre comprende, o es genéticamente modificada para comprender ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican una o más enzimas en la trayectoria de mevalonato (y produce IPP a través de la trayectoria de mevalonato y/o produce mevalonato a través de una trayectoria de mevalonato). Una célula padre que ha sido genéticamente modificada para incluir uno o más ácidos nucleicos heterólogos para la célula huésped, en donde el uno o más ácidos nucleicos comprenden secuencias de nucleótido que codifican HMGR y/o HMGS, se denomina como una " célula huésped genéticamente modificada". La inhibición de crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA en la célula huésped padre genéticamente modificada es reducida, comparado con una célula huésped padre no modificada genéticamente con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican HMGR y/o HMGS. Además, la célula huésped genéticamente modificada exhibe niveles incrementados de mevalonato o productos de isoprenoide derivados de una combinación de producción de célula incrementada de mevalonato y/o de habilidad de célula incrementada. Se debe entender que esta invención puede ser iterativamente aplicada para incrementar en aumento la producción de compuestos isoprenoides de manera que en un contexto, una línea de célula particular puede ser una célula huésped genéticamente modificada y después en un contexto posterior, puede ser célula huésped padre utilizada como un punto de partida para una mejora adicional. Alternativamente, esta invención enseña la toxicidad de la acumulación de HMG-CoA y permite la construcción nueva de sistemas genéticos y células huésped asociadas que evitan la toxicidad de HMG-CoA de otra manera asociada con la producción de isoprenoide de alto nivel. De esta manera, si una célula huésped genéticamente modificada además puede ser genéticamente modificada para producir una célula que exhiba viabilidad reducida de célula debido a la acumulación de HMG-CoA, la célula genéticamente modificada adicional en realidad será una célula huésped padre con respecto a la célula huésped genéticamente modificada inicial. En algunas modalidades, la célula padre es una célula que normalmente no produce IPP o mevalonato a través de la trayectoria de mevalonato; por ejemplo, la célula padre es una que ha sido genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprende secuencias de nucleótido que codifican una o más enzimas en la trayectoria de mevalonato. Como un ejemplo, una célula padre es una célula procariótíca que normalmente no produce IPP o mevalonato a través de la trayectoria de mevalonato, y que ha sido genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, y HMGR, en donde los niveles de acetoacetil-CoA tiolasa y la actividad de HMGS son tales que HMG-CoA se acumula intracelularmente a un nivel que es inhibidor de crecimiento o tóxico. Un ejemplo es una célula de E.coli que ha sido genéticamente modificada con una construcción que comprende una secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO:1. Un segundo ejemplo de una célula huésped padre es una célula de E.coli que ha sido genéticamente modificada con una construcción que comprende una secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO:2. En otras modalidades, la célula padre es una célula que normalmente produce ÍPP y/o mevalonato a través de la trayectoria de mevalonato, por ejemplo, la célula padre es una célula que comprende ácidos nucleicos endógenos que codifican una o más enzimas en la trayectoria de mevalonato. En estas modalidades, la célula padre es genéticamente modificada de manera que el nivel de HMG-CoA que se acumula intracelularmente es tóxico o inhibidor de crecimiento para la célula. Como un ejemplo, se introducen una o más mutaciones en un gen de piruvato-descarboxilasa de la célula huésped que normalmente produce IPP y/o mevalonato a través de la trayectoria de mevalonato, de manera que el gen de piruvato-descarboxilasa queda funcionalmente deshabilitado, y de esta manera HMG-CoA se acumula intracelularmente a un nivel que es tóxico a la célula. La célula padre en este case es una célula huésped que normalmente produce IPP y/o mevalonato a través de la trayectoria de mevalonato, y que ha sido genéticamente modificada para introduce una o más mutaciones en el gen piruvato-descarboxílasa endógena de manera que el gen de piruvato-descarboxilasa queda funcionalmente deshabilitado. Para generar una célula huésped genéticamente modificada de la invención, uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican una enzima(s) que alivia la inhibición de crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA se introduce estable o pasajeramente en una célula huésped padre, utilizando técnicas establecidas, que incluyen, pero no se limitan a, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrana, transfección mediada por liposoma, y similares. Para la transformación estable, un ácido nucleico generalmente además incluirá un marcador seleccionable, por ejemplo, cualquiera de los varios marcadores seleccionables conocidos en la técnica tales como resistencia a neomicina, resistencia a ampicilina, resistencia a tetraciclina, resistencia a cloramfenicol, resistencia a canamicina, y similares.

Enzimas de trayectoria de mevalonato Como se observó anteriormente, una célula padre es una célula huésped que produce, o es genéticamente modificada para producir, IPP a través de una trayectoria de mevalonato y/o mevalonato a través de una trayectoria de mevalonato, y que exhibe toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA o inhibición de crecimiento. La trayectoria de mevalonato comprende: (a) condensar dos moléculas de acetil-CoA a acetoacetil-CoA; (b) condensar acetoacetil-CoA con acetil-CoA para formar HMG-CoA; (c) convertir HMG-CoA a mevalonato; (d) fosforilar mevalonato a 5-fosfato de mevalonato; (e) convertir de 5-fosfato de mevalonato a 5-pirofosfato de mevalonato; y (f) convertir 5-pirofosfato de mevalonato a pirofosfato de isopentenilo. Las enzimas de trayectoria de mevalonato requeridas para la producción de IPP varían, dependiendo de la condiciones de cultivo. En algunas modalidades, una célula huésped padre es una que ha sido genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, y HMGR, y la célula huésped padre es una que produce mevalonato. Un ejemplo no limitante de una célula huésped padre es una célula de E.coli que ha sido genéticamente modificada con una construcción que comprende una secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO:1 o una secuencia de nucleótido que codifica enzimas funcionalmente análogas a aquellas enzimas codificadas en SEC ID NO:1. Un ejemplo no limitante adicional de una célula huésped padre es una célula de E.coli que ha sido genéticamente modificada con una construcción que comprende una secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO:2 o una secuencia de nucleótido que codifica enzimas funcionalmente análogas a aquellas enzimas codificadas en SEC ID NO:2. Un ejemplo no limitante adicional de una célula huésped padre es una célula de levadura que ha sido genéticamente modificada con una construcción que comprende una secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO:7 o una secuencia de nucleótido que codifican enzimas funcionalmente análogas a aquellas enzimas codificadas en SEC ID NO:7. Un ejemplo no limitante adicional de una célula huésped padre es una célula de E.coli que ha sido genéticamente modificada con una o más construcciones que comprenden secuencias de nucleótido como se establece en SEC ID NO:1 y SEC ID NO:6 o secuencias de nucleótido que codifican enzimas funcionalmente análogas a aquellas enzimas codificadas en SEC ID NO:1 y SEC ID NO:6. Un ejemplo no limitante adicional de una célula huésped padre es una célula de E.coli que ha sido genéticamente modificada con una o más construcciones que comprenden las secuencias de nucleótido como se establece en SEC ID NO:1 y SEC ID NO: 7 o secuencias de nucleótido que codifican enzimas funcionalmente análogas a aquellas enzimas codificadas en SEC ID NO:1 y SEC ID NO:7. Un ejemplo no limitante adicional de una célula huésped padre es una célula de E.coli que ha sido genéticamente modificada con una o más construcciones que comprenden secuencias de nucleótido como se establece en SEC ID NO:1 y SEC ID NO:11 o secuencias de nucleótido que codifican enzimas funcionalmente análogas a aquellas enzimas codificadas en SEC ID NO:1 y SEC ID NO:11. Un ejemplo no limitante adicional de una célula huésped padre es una célula de levadura que ha sido genéticamente modificada con una construcción que comprende una secuencia de nucleótido que comprende los genes de la trayectoria de mevalonato codificados en SEC ID NO:6 y SEC ID NO:7, o una secuencia de nucleótido que codifica enzimas funcionalmente análogas a aquellas enzimas de trayectoria de mevalonato codificadas en SEC ID NO:6 y SEC ID NO:7. Un ejemplo no limitante adicional de una célula huésped padre es unan célula de levadura que ha sido genéticamente modificada con una construcción que comprende una secuencia de nucleótido que comprende enzimas de trayectoria de mevalonato codificadas en SEC ID NO:11 o una secuencia de nucleótido que codifica enzimas funcionalmente análogas a aquellas enzimas codificadas en SEC ID NO:11. En otras modalidades, una célula huésped padre es una que ha sido genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican acetioacetil-CoA tiolasa, HMGS, HMGR, mevalonato de cinasa (MK), fosfomevalonato cinasa (PMK), y pirofosfato-descarboxilasa de mevalonato (MPD) (y opcionalmente también IPP isomerasa). Un ejemplo de una célula huésped padre es una célula de E.coli que ha sido genéticamente modificada con una construcción que comprende una secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO:2 y SEC ID NO:4. Un ejemplo adicional de una célula huésped padre es una célula de E.coli que ha sido genéticamente modificada con una construcción que comprende una secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO:3 y SEC ID NO:4. En algunas modalidades, una célula huésped padre es una que ha sido genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican mevalonato cinasa (MK), fosfomevalonato cinasa (PMK), y pirofosfato-decarboxilasa de mevalonato (MPD) (y opcionalmente también isopentenil pirofosfato isomerasa); y la célula huésped padre se cultiva en un medio que incluye mevalonato. En otras modalidades, una célula huésped padre es una que ha sido genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, hidroximetilglutaril-CoA sintasa (HMGS), hidroximetilglutaril-CoA reductasa (HMGR), MK, PMK, y MPD (y opcionalmente también. IPP isomerasa). En otras modalidades, una célula huésped padre es una que ha sido genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican MK, PMK, MPD, IPP isomerasa, y prenilo de transferasa. En otras modalidades, una célula huésped padre es una que es genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, HMGR, MK, PMK, MPD, IPP isomerasa, y transferasa de prenilo. Un ejemplo de una célula huésped padre es una célula de E.coli que ha sido genéticamente modificada con una construcción que comprende una secuencia de nucleótído como se establece en SEC ID NO:2, SEC ID NO:4 y SEC ID NO:5. Un ejemplo adicional es una célula de E.coii que ha sido genéticamente modificada con una construcción que comprende una secuencia de nucleótido como se establece en SEC ID NO:1 y SEC ID NO:4 y SEC ID NO:5. En otras modalidades, una célula huésped padre es una que tiene una trayectoria de mevalonato nativa (endógena) y que ha sido genéticamente modificada de manera que el nivel de HMG-CoA se incrementa con relación a una célula huésped no modificada, y de manera que la acumulación de HMG-CoA ocasiona la inhibición del crecimiento. En una modalidad ilustrativa, la cepa de origen es Saccharomyces cerevisiae que ha sido genéticamente modificada para ia producción incrementada de acetil-CoA, introduciendo una o más modificaciones genéticas de manera que una o más de una fosfotransacetilasa, lactato deshidrogenasa, y piruvato-descarboxilasa queda funcionalmente deshabilitada (por ejemplo, a través de choque). Las células huésped (incluyendo células huésped padre y células huésped genéticamente modificadas) son en muchas modalidades organismos unicelulares, o se desarrollan en cultivo como se células individuales, en algunas modalidades, la célula huésped es una célula eucariótica. Las células huésped eucarióticas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células de levaduras, células de insecto, células de plantas, células fúngicas, y células algas. Las células huésped eucarióticas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Neurospora crassa, Chlamydomonas reinhardtii, y similares, En algunas modalidades, la célula huésped es una célula eucariótica diferente a una célula de planta. En otras modalidades, la célula huésped es una célula procariótica. Las células procarióticas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de una variedad de cepas de laboratorio de Escherichia coli, lactobacillus sp., Salmonella sp., Shigella sp., y similares. Ver, por ejemplo, Carríer et al. (1992) J Immunol. 148:1176-1181; Patente de E.U.A No. 6,447,784; y Slzemore et al. (1995) Science 270:299-302. Ejemplos de cepas de Salmonella que se pueden emplear en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, Salmonella typhi and S. typhimurium. Las cepas de Shigela adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Shigella flexneri, Shigella sonnei, y Shigella disenteriae. Típicamente, la cepa de laboratorio es una que no es patogénica. Ejemplos no limitantes de otras bacteria adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Bacillus subtilis, Pseudomonas pudita, Pseudomoncomo unaeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Rhodospirillum rubrum, Rhodococcus sp., y similares. En algunas modalidades, la célula huésped es Escherichia coli. Como se observó anteriormente, en algunas modalidades, una célula huésped padre es una que ha sido genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican enzima(s) de trayectoria de mevalonato. Para modificar genéticamente una célula huésped padre de manera que produzca IPP a través de una trayectoria de mevalonato y/o que produzca mevalonato a través de una trayectoria de mevalonato, uno o más ácidos nucleico que comprenden secuencias de nucleótido que codifican una o más enzimas de trayectoria de mevalonato se introduce estable o pasajeramente en una célula huésped, utilizando técnicas establecidas, incluyendo, pero no limitándose a, electroporacíón, precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrana, transfección mediada por liposoma, y similares. Para transformación estable, un ácido nucleico generalmente además incluirá un marcador seleccionable, por ejemplo, cualquiera de los marcadores seleccíonables bien conocidos tales como resistencia a neomicína, resistencia a ampicilina, resistencia a tetraciclina, resistencia a cloramfenicol, resistencia a canamicina, y similares. En muchas modalidades, el ácido nucleico con el cual la célula huésped está genéticamente modificada de manera que produce IPP y/o mevalonato a través de una trayectoria de mevalonato es un vector de expresión que incluye un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica una enzima(s) de trayectoria de mevalonato. Similarmente, en muchas modalidades, el ácido nucleico con el cual una célula huésped padre es genéticamente modificada, de manera que la toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA y/o la inhibición de crecimiento de célula se reduce, es un vector de expresión que incluye un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica una o más enzimas que proporcionan alivio de toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA y/o inhibición de crecimiento de célula.

Los vectores de expresión adecuados incluyen, pero no se limitan a, vectores de baculovirus, vectores de bacteriófago, plásmidos, fagemidos, cósmidos, fósmidos, cromosomas artificiales bacterianos, vectores virales (por ejemplo vectores virales a base de virus de vacuna, poliovirus, adenovirus, virus adeno-asociado, SV40, virus simple de herpes, y similares), cromosomas artificiales a base de P1, plásmidos de levadura, cromosomas artificiales de levadura, y cualesquiera otros vectores específicos para huéspedes específicos de interés (tales como E.coli y levadura). De esta manera, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un producto(s) de gen de trayectoria de mevalonato es incluido en cualquiera de una variedad de vectores de expresión para expresar el producto(s) de gen de trayectoria de mevalonato. Dichos vectores incluyen secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas. Se conocen números vectores de expresión adecuados por aquellos expertos en la técnica, y muchos están comercialmente disponibles. Los siguientes vectores se proporcionan a manera de ejemplo; para células huésped bacterianas vectores pQE (Qiagen), plásmidos pBluescript, vectores pNH, vectores lambda-ZAP (Stratagene); pTrc99a, pKK223-3, ?DR540, y pRIT2T (Pharmacia); para células huésped eucarióticas; pXTI, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, y pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, se pueden utilizar cualesquiera otros plásmido u otro vector siempre que sean compatibles con la célula huésped. Para la generación una célula huésped padre que comprende uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican secuencias de nucleótido que codifican enzimas de trayectoria de mevalonato, una secuencia de nucleótido que codifica la enzima de trayectoria de mevalonato es insertada en un vector de expresión. La secuencia de nucleótido que codifica la enzima de trayectoria de mevalonato en el vector de expresión está operablemente enlazada a una secuencia(s) de control apropiada (por ejemplo, un promotor) para dirigir la síntesis del producto de gen codificado. Simílarmente, para generar una célula huésped genéticamente modificada a partir de una célula huésped padre, se utilizará un vector de expresión que comprende secuencias de nucleótido que codifican, por ejemplo, HMGS y/o HMGR. Las secuencias de codificación HMGS y/o HMGR están operablemente enlazadas a secuencias de control de expresión apropiadas para dirigir la síntesis del producto de gen codificado. Dependiendo del sistema de huésped/vector utilizado, cualquiera de un número de elementos de control de transcripción y de traducción, incluyendo promotores constitutivos y de inducción, elementos mejorados de retranscripción, terminadores de transcripción, etc. puede ser utilizados en el vector de expresión (ver, por ejemplo, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544). Los promotores adecuados para utilizarse en células huésped procarióticas incluyen, pero no se limitan a, un promotor de polimerasa ARN T7 de bacteriófago; un promotor trp; un promotor de operon lac; un promotor híbrido, por ejemplo, un promotor híbrido de lac/tac promotor, un promotor híbrido de tac/trc, un promotor híbrido de trp/lac, un promotor de T7/lac; un promotor tre; un promotor tac, y similares; un promotor araBAD; promotores regulados in vivo, tales como un promotor ssaG promotor o un promotor relacionado (ver, por ejemplo, Publicación de Patente de E.U.A No. 20040131637), un promotor pagC (Pulkkinen and Miller, J Bacteriol, 1991: 173(1): 86-93; Alpuche-Aranda et al., PNAS, 1992; 89(21): 10079-83), un promotor nirB (Harborne et al. (1992) Mol. Micro. 6:2805-2813), y similares (ver, por ejemplo, Dunstan et al. (1999) Infecí. Immun. 67:5133-5141; McKelvie et al. (2004) Vaccine 22:3243-3255; y Chatfield et al. (1992) Biotechnol. 10:888-892); un promotor sigma70, por ejemplo, un promotor sigma70 de consenso (ver, por ejemplo, GenBank Accession Nos. AX798980, AX798961, y AX798183); un promotor de fase estacionaria, por ejemplo, un promotor dps, un promotor spv, y similares; un promotor derivado de la isla de patogenisidad SPI-2 (ver, por ejemplo, W096/17951); un promotor actA (ver, por ejemplo, Shetron-Rama et al. (2002) Infecí. Immun. 70:1087-1096); un promotor rpsM (ver, por ejemplo, Valdivia and Falkow (1996). Mol. Microbio!. 22:367-378); un promotor tet (ver, por ejemplo, Hillen.W. and Wissmann.A. (1989) In Saenger.W. and Heinemann.U. (eds), Topics in Molecular and Structural Biology, Proteín-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143-162); un promotor SP6 (ver, por ejemplo, Melton et al. (1984) Nucí. Acids Res. 12:7035-7056); y similares. Ejemplos no limitantes de promotores eucarióticos adecuados incluyen CMV inmediato temprano, HSV timidina-cinasa, SV40 temprano y tardío, LTRs de retrovirus, y metalotioneina-l de ratón. La selección del vector y el promotor apropiados están dentro del nivel de la experiencia en la técnica. El vector de expresión también puede contener un sitio de unión de ribosoma para la iniciación de traducción y un terminador de transcripción. El vector de expresión también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Además, los vectores de expresión, en muchas modalidades, contendrán uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células huésped transformadas tales como dihidrofolato-reductasa o resistencia a neomicina para un cultivo de célula eucariótíca, o tal como resistencia a tetraciclina o ampicilina en células huésped procarióticas tales como E.coli. Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de marcadores de replicación y seleccionables que permitan la transformación de la célula huésped, por ejemplo, el gen de resistencia a ampicilina de E.coli, el gen TRPI de S. cerevisiae, etc.; y un promotor derivado de gen altamente expresado para dirigir la transcripción de la secuencia de codificación. Dichos promotores puede ser derivados a parir de operones que codifican enzimas glicolíticas tales como 3-fosfoglicerato-cinase (PGK), a-factor, fosfatasa acida, o proteínas de choque térmico, entre otras. En muchas modalidades, una célula huésped padre comprende una secuencia de nucleótido que codifica una enzima de trayectoria de mevalonato operablemente enlazada a un promotor de inducción. Similarmente, en muchas modalidades, una célula huésped genéticamente modificada comprenderá una secuencia de nucleótido que codifica HMGR y/o una HMGS operablemente enlazada a un promotor de inducción. Los promotores de inducción son bien conocidos en la técnica. Los promotores de inducción adecuados incluyen, pero no se limitan a, el pL del bacteriófago ?; Plac; Ptrp; Ptac (promotor híbrido Ptrp-lac); un promotor de inducción de isopropil-beta-D-tiogalactopiranosida (IPTG), por ejemplo, un promotor lacZ; un promotor de inducción de tetraciclina; un promotor de inducción de arabinosa, por ejemplo, PBAD (ver, por ejemplo, Guzman et al. (1995) J Bacteriol. 177:4121-4130); un promotor de inducción de xilosa, por ejemplo, Pxyl (ver, por ejemplo, Kim et al. (1996) Gen 181:71-76); un promotor GAL1; un promotor de triptófano; un promotor lac; un promotor de inducción de alcohol, por ejemplo, un promotor de inducción de metanol, un promotor de inducción de etanol; un promotor de inducción de rafinosa; un promotor de inducción de calor, por ejemplo, el promotor lambda PL de inducción de calor, un promotor controlado por un represor sensible al calor (por ejemplo, vectores de expresión a base de lambda reprimidos CI857; ver, por ejemplo, Hoffmann et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 177(2):327-34); y similares. En muchas modalidades, una célula huésped padre es generada modificando genéticamente una célula huésped con un ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótido que codifica un producto de gen de trayectoria de mevalonato, en donde la secuencia de nucleótido que codifican un producto de gen de trayectoria de mevalonato está operablemente enlazada a un promotor constitutivo. Similarmente, en algunas modalidades, una secuencia de codificación de HMGS y/o una HMGR está operablemente enlazada a un promotor constitutivo. Los promotores constitutivos adecuados para utilizarse en células procarióticas son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a un promotor sigma70, por ejemplo, un promotor sigma70 de consenso. En levadura, se puede utilizar un número de vectores que contienen promotores constitutivos o de inducción. Para una revisión ver, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988, Ed. Ausubel, et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13; Grant, et al., 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossman, 31987, Acad. Press, N. Y., Vol. 153, pp.516-544; Glover, 1986, ADN Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D. C, Ch. 3; and Bitter, 1987, Heterologous Gen Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N. Y., Vol. 152, pp. 673-684; and The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II. Un promotor de levadura constitutivo tal como ADH o LEU2 o un promotor de inducción tal como GAL pueden ser utilizados (Cloning in Yeast, Ch. 3, R. Rothstein In: DNA Cloning Vol. 11, A Practica! Approach, Ed. DM Glover, 1986, IRL Press, Wash., D.C.). Alternativamente, se pueden utilizar vectores que promuevan la integración de secuencias de ADN extraño en el cromosoma de levadura. Cuando una célula huésped padre ha sido genéticamente modificada para producir dos o más enzimas de trayectoria de mevalonato, las secuencias de nucleótido que codifican dos o más enzimas, en algunas modalidades, cada una estará contenida en vectores de expresión separados. Cuando la célula huésped es genéticamente modificada para expresar una o más enzimas de trayectoria de mevaionato, las secuencias de nucleótido que codifican una o más de las enzimas de trayectoria de mevalonato en algunas modalidades estarán contenidas en un vector de expresión individual. Cuando las secuencias de nucleótido que codifican una o más de las enzimas de trayectoria de mevalonato están contenidas en vector de expresión individual, en algunas modalidades, las secuencias de nucleótido estarán operablemente enlazadas a un elemento de control común (por ejemplo, un promotor), por ejemplo, el elemento de control común controla la expresión de todas las secuencias de nucleótido que codifican la enzima de trayectoria de mevalonato en el vector de expresión individual. Cuando las secuencias de nucleótido que codifican la enzima(s) de trayectoria de mevalonato están contenidas en un vector de expresión individual, en algunas modalidades, las secuencias de nucleótido estarán operablemente enlazadas a diferentes elementos de control (por ejemplo, promotores a), por ejemplo, los diferentes elementos de control controlan la expresión de cada una de las secuencias de nucleótido que codifican la enzima de trayectoria de mevalonato en forma separada en un vector de expresión individual. Cuando una célula huésped padre es genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos que comprende secuencias de nucleótido que codifican enzima(s) que proporcionan alivio de la toxicidad inducida por la acumulación de de HMG-CoA, en algunas modalidades, las enzimas serán codificadas en dos diferentes construcciones de expresión (separadas). Por ejemplo, en algunas modalidades, HMGR será expresada a partir de un de un plásmido de copia alta, mientras que HMGS será expresada a partir de un plásmido de copia baja, bajo el control de un promotor idéntico. En otras modalidades, HMGR y HMGS se expresarán a partir de plásmidos de número de copia similar, HMGR siendo expresada por un promotor más fuerte que en HMGS. Cuando una célula huésped padre es genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican enzima(s) que proporcionan el alivio de la toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA, en algunas modalidades, la enzimas serán codificadas en una construcción de expresión individual. Por ejemplo, en algunas modalidades, HMGR y HMGS se expresarán a partir de un plásmido individual bajo el control de un promotor individual de manera que la estabilidad de trascripción diseñada por ingeniería de HMGR será mayor que aquella de HMGS.

Cuando las secuencias de nucleótido que codifican la enzima(s) que proporcionan alivio de la toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA están contenidas en una construcción de expresión individual, en algunas modalidades, las secuencias de nucleótido estarán operablemente enlazadas a diferentes elementos de control (por ejemplo, promotores), por ejemplo, los diferentes elementos de control controlan la expresión de cada una de las enzima(s) que proporcionan el alivio de la toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA en forma separada en una construcción de expresión individual. Por ejemplo, en algunas modalidades, HMGR y HMGS se expresarán a partir de un plásmido individual, HMGR siendo expresada por un promotor más fuerte que para HMGS.

Secuencias de nucleótido que codifican enzimas de trayectoria de mevalonato Las secuencias de nucleótido que codifican productos de gen de la trayectoria MEV son conocidas en la técnica, y cualquier secuencia de nucleótido que codifica un producto de gen de trayectoria de MEV conocida puede ser utilizada para generar una célula huésped genéticamente modificada de la invención. Por ejemplo, las secuencias de nucleótido que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, HMGR, MK, PMK, MPD, y IDI son conocidas en la técnicas. Los siguientes son ejemplos no limitantes de secuencias de nucleótido conocidas que codifican productos de gen de trayectoria de MEV, con números de acceso de GenBank y el organismo después de cada enzima de trayectoria de MEV, entre paréntesis: acetoacetil- CoA tiolasa: (NC_000913 REGIÓN: 232413..2325315; E.coli), (D49362; Paracoccus denitriflcans), y (L20428; Saccharomyces cerevisiae); HMGS: (NC_001145. complemento 19061..20536; Saccharomyces cerevisiae), (X96617; Saccharomyces cerevisiae), (X83882; Arabidopsis thaliana), (AB037907; Kitasatospora griseola), y (BT007302; Homo sapiens); HMGR: (NM_206548; Drosophila melanogaster), (NM_204485; Gallus gallus), (AB015627; Streptomyces sp. KO-3988), (AF542543; Nicotíana attenuata), (AB037907; Kitasatospora griseola), (AX128213, proporcionando la la secuencia que codifica una HMGR truncada; Saccharomyces cerevisiae), y (NC_001145: complemento (115734..118898; Saccharomyces cerevisiae)); MK: (L77688; Arabidopsis thaliana), y (X55875; Saccharomyces cerevisiae); PMK: (AF429385; Hevea brasiliensis), (NM_006556; Homo sapiens), (NC_001145. complemento 712315..713670; Saccharomyces cerevisiae); MPD: (X97557; Saccharomyces cerevisiae), (AF290095; Enterococcus faecium), y (U49260; Homo sapiens); y IDI: (NC_000913, 3031087..3031635; E.coli), y (AF082326; Haematococcus pluvialis). En algunas modalidades, la región de codificación de HMGR se establece para SEC ID NO: 13, que codifica una forma truncada de HMGR ("tHMGR") que carece del dominio de transmembrana de HMGR de tipo silvestre. El dominio de transmembrana de HMGR contiene las porciones reguladoras de la enzima y no tiene ninguna actividad catalítica. La secuencia de codificación de cualquier enzima de trayectoria de MEV conocida puede ser altera en varias formas conocidas en la técnica para generar cambios activados en la secuencia de aminoácido de la enzima codificada. El amino ácido de una enzima de trayectoria de MEV variante usualmente será sustancialmente similar a la secuencia de amino ácido de cualquier enzima de trayectoria de MEV cocida, es decir, diferirá en al menos un amino ácido, y puede diferir en al menos dos, por lo menos 5, por lo menos 10, o por lo menos 20 amino ácidos, peor típicamente no más de aproximadamente cincuenta amino ácidos. Los cambios de secuencia pueden ser substituciones, inserciones o eliminaciones. Por ejemplo, como se describe más adelante, la secuencia de nucleótido puede ser alterada para la desviación de codón de una célula huésped particular. Además, una o más diferencias de secuencias de nucleótido pueden ser introducidas dando como resultado cambios de amino ácido conservadores en la proteína. En una modalidad, los niveles relativos deseados de HMGS y HMGR y los niveles no tóxicos de HMG-CoA se obtienen expresando una proteína de HMGS o HMGR, altera, o ambas.

Prenil Transferasas En algunas modalidades, una célula huésped genéticamente modificada de la invención es genéticamente modificada para incluir uno o más ácidos nucleicos que comprenden una secuencia(s) de nucleótido codifican una o más enzimas de trayectoria de mevalonato, como se describe anteriormente; y un ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótido que codifica a prenil transferasa. Las prenil transferasas constituyen un amplio grupo de enzimas que catalizan la condensación consecutiva de IPP dando como resultado la formación de prenil difosfato de varias longitudes de cadena. Las prenil transferasas adecuadas incluyen enzimas que catalizan la condensación de IPP con sustratos de iniciador alílícos para formare compuestos isoprenoídes con aproximadamente 2 unidades de isopreno a aproximadamente 6000 unidades de isopreno o más, por ejemplo, 2 unidades de isopreno (Geranil Pirofosfato sintasa), 3 unidades de isopreno (Farnesil pirofosfato sintasa), 4 unidades de isopreno (geranio geranil pirofosfato sintasa), 5 unidades de isopreno, 6 unidades de isopreno (hexadecilpirofosfato sintasa), 7 unidades de isopreno, 8 unidades de isopreno (fitoen sintasa, octaprenilpirofosfato sintasa), 9 unidades isopreno (nonaprenilpirofosfato sintasa), 10 unidades de isopreno (decaprenilpirofosfato sintasa), de aproximadamente 10 unidades de isopreno a aproximadamente 15 unidades de isopreno, de aproximadamente 15 unidades de isopreno a aproximadamente 20 unidades de isopreno, de aproximadamente 20 unidades de isopreno a aproximadamente 25 unidades de isopreno, de aproximadamente 25 unidades de isopreno a aproximadamente 30 unidades de isopreno, de aproximadamente 30 unidades de isopreno a aproximadamente 40 unidades de isopreno, de aproximadamente 40 unidades de isopreno a aproximadamente 50 unidades de isopreno, de aproximadamente 50 unidades de isopreno a aproximadamente 100 unidades de isopreno, de aproximadamente 100 unidades de isopreno a aproximadamente 250 unidades de ¡sopreno, de aproximadamente 250 unidades de isopreno a aproximadamente 500 unidades de isopreno, de aproximadamente 500 unidades de ¡sopreno a aproximadamente 1000 unidades de ¡sopreno, de aproximadamente 1000 unidades de isopreno a aproximadamente 2000 unidades de isopreno, de aproximadamente 2000 unidades de isopreno a aproximadamente 3000 unidades de isopreno, de aproximadamente 3000 unidades de isopreno a aproximadamente 4000 unidades de isopreno, de aproximadamente 4000 unidades de isopreno a aproximadamente 5000 unidades de isopreno, o de aproximadamente 5000 unidades de ¡sopreno a aproximadamente 6000 unidades de ¡sopreno o más. Las preniltransferasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, una E-isopren¡l difosfato sintasa, incluyendo, pero no limitándose a, difosfato de geranílo (GPP) sintasa, difosfato de farnesilo (FPP) sintasa, difosfato de geranil-geranilo (GGPP) sintasa, hexadifosfato de prenilo (HexPP) sintasa, heptadifosfato de prenilo (HepPP) sintasa, octaprenilo (OPP) difosfatosintasa, solanesilo difosfato (SPP) sintasa, decadifosfato de prenilo (DPP) sintasa, chicle sintasa, y gutta-percha sintasa; y a Z-isoprenil difosfato sintasa, incluyendo, pero no limitándose a, difosfato de nonapreniio (NPP) sintasa, difosfato de undecaprenilo (UPP) sintasa, difosfato de deshidrodolichil sintasa, difosfato de eicosaprenilo sintasa, sintasa de hule natural, y otros Z-difosfato de isoprenilo sintasas. Las secuencias de nucleótido de prenil transferasas numerosas a partir de una variedad de especies son conocidas, y se pueden utilizar o modificarse para utilizarse en la generación de una célula huésped genéticamente modificada de la invención. Las secuencias de nucleótido que codifican preniltransferasas son conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, ARNm de farnesil pirofosfato sintasa humana (GenBank No. acceso J05262; Homo sapiens); gen de farnesil difosfato sintasa (FPP) (GenBank No. acceso J05091; Saccharomyces cerevisiae); gen de isopentenildifosfato: dim etrlali I difosfato ¡somerasa (J05090; Saccharomyces cerevisiae); Wang y Ohnuma (2000) Biochim. Biophys. Acia 1529:33-48; Patente de E.U.A No. 6,645,747; Arabidopsis ihalíana farnesil pirofosfato sintasa 2 (FPS2) / FPP sintasa 2 / farnesil difosfato sintasa 2 (At4g17190) ARNm (GenBank No. acceso NM_202836); Ginkgo biloba geranil-geranil difosfato sintasa (ggpps) ARNm (GenBank No. acceso AY371321); Arabidopsis ihaliana geranilgeranil pirofosfato sintasa (GGPS1)/GGPP sintasa/farnesiltranstransferase (At4g36810) ARNm (GenBank No. acceso NM_119845); Synechococcus elongatus gen para farnesll, geranilgeranil, geranilfarnesil, hexaprenil, heptaprenil, disfosfato sintasa (SelF-HepPS) (GenBank No. acceso AB016095); etc. so de codón En algunas modalidades, la secuencia de nucleótido que codifica una encima de trayectoria de mevalonato se modifica de manera que la secuencia de nucleótido refleja la preferencia de codón para la célula huésped particular. Por ejemplo, la secuencia de nucleótido en algunas modalidades será modificada para preferencia de codón de levadura. Ver, por ejemplo, Bennetzen and Hall (1982) J. Biol. Chem. 257(6): 3026-3031. Como otro ejemplo no limitante, la secuencia de nucleótido en otras modalidades será modificada para la preferencia de codón de E.coli. Ver, por ejemplo, Gouy and Gautier (1982) Nucleic Acids Res. 10(22):7055-7074; Eyre-Walker (1996) Mol. Biol. Evo!. 13(6):864-872. Ver también Nakamura et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):292. Como se observó anteriormente, en algunas modalidades, el uso de codón para una secuencia que codifica HMGS es modificado de manera que el nivel de traducción del ARNm de HMGS se reduce. La reducción del nivel de traducción de ARNm de HMGS modificando el uso del codón se logra modificando la secuencia para incluir codones que son raros o que no se utilizan comúnmente por la célula huésped. Están disponibles tablas de uso de codón para muchos organismos, las cuales resumen el porcentaje de tiempo que un organismo específico utiliza un codón especifico para codificar un amino ácido. Ciertos codones se utilizan más regularmente que otros codones "raros". El uso de codones "raros" en una secuencia generalmente reduce su velocidad de traducción. De esta manera, por ejemplo, la secuencia de codificación se modificada introduciendo uno o más codones raros, los cuales afectan la velocidad de traducción, pero no la secuencia de amino ácido de la encima traducida. Por ejemplo, existen are 6 codones que codifican para arginina: CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, y AGG. En E.coli los codones CGT y CGC se utilizan más comúnmente (codificando aproximadamente 40% de las argininas en E.coli) que el codón AGG (codificando aproximadamente 2% de las argininas en E.coli). La modificación de un codón CGT dentro de la secuencia de un gen a un codón AGG no podría cambiar la secuencia de la encima, sino que más bien podría reducir la velocidad de traducción del gen.

Modificaciones genéticas adicionales En algunas modalidades, una célula huésped genéticamente modificada de la invención es una que es genéticamente modificada para incluir uno o más ácidos nucleico que comprenden una secuencia(s) de nucleótido que codifica enzimas que alivian la toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA; y que se modifica genéticamente aún más para obtener la producción mejorada de un intermediario de trayectoria biosintética de terpeno, y/o que genéticamente se modificada aún más para mejorar la producción de un isoprenoide o precursor de isoprenoide, y/o que se modifica genéticamente aún más de manera que un gen de trayectoria biosintética de terpeno endógeno es funcionalmente deshabilitada. El término "funcionalmente deshabilítada", como se utiliza aquí, se refiere a una modificación genética de un ácido nucleico, dicha modificación da como resulta la producción de un producto de gen codificado por el ácido nucleico que es producidos por debajo de niveles normales, y/o es no funcional. Dichas modificaciones genéticas pueden reducir la productividad específica de IPP o mevalonato de una cepa (producción por célula) según comparado con una cepa de origen, pero el alivio en la toxicidad inducida por HMG-CoA podrá incrementar la densidad de célula de manera que la productividad total del cultivo (productividad específica multiplicada por la densidad de célula del cultivo) podría aumentar. Las modificaciones genéticas que mejoran la producción de un intermediario de trayectoria biosintética de terpeno endógeno incluyen, pero no se limitan a, modificaciones genéticas que dan como resultado un nivel y/o actividad reducida de una fosfotransacetilasa en la célula huésped. La concentración intracelular de un intermediario de trayectoria biosintétíca de isoprenoide se mejora incrementando la concentración intracelular de acetil-CoA. E.coli secreta una fracción importante de acetil-CoA intracelular en la forma de acetato hacia el medio. La eliminación del gen que codifica fosfotransacetilasa, pta, la primera encima responsable de la transformación de acetil-CoA a acetato, reduce la secreción de acetato. Las modificaciones genéticas que reducen el nivel y/o actividad de fosfotransacetilasa en una célula huésped procariótica son particularmente útiles cuando la célula huésped padre es una que es genéticamente modificada con un ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótido que codifican uno o más productos de gen de trayectoria de MEV. Ya que acetil-CoA es un reactivo utilizado tanto para acetoacetil-CoA tiolasa como para HMGS en la síntesis de HMG-CoA, y en algunas células huésped, los incrementos en la combinación intracelular de acetil-CoA pueden conducir a incrementos en la combinación intracelular de HMG-CoA, lo cual a su vez puede conducir a un efecto de toxicidad. Por lo tanto, las modificaciones genéticas que reducen la actividad total de fosfotransacetllasa pueden conducir a una reducción en la velocidad de crecimiento o densidad final de la célula debido a la acumulación de HMG-CoA, generando una cepa de origen que puede ser modificada utilizando el método de la inve'nción. Alternativamente, las modificaciones genéticas que incrementan la actividad total de fosfotransacetilasa pueden ser utilizadas para superar un efecto de toxicidad causado por la acumulación de HMG-CoA. En algunas modalidades, una modificación genética que da como resultado un nivel reducido de fosfotransacetilasa en una célula huésped procariótica es una mutación genética que funcionalmente deshabilita al gen pta endógeno de la célula huésped procariótica que codifica la fosfotransacetilasa. El gen pta puede ser funcionalmente deshabilitado en cualquiera de una variedad de formas, incluyendo la inserción de un elemento genético móvil (por ejemplo, un transposon, etc.); la eliminación de todo o parte del gen, de manera que el producto de gen no se forma, o queda truncado y es no funcional para convertir acetil-CoA a acetato; la mutación del gen de manera que el producto de gen no se hace, o se trunca y es no funcional para convertir acetil-CoA a acetato; la eliminación o mutación de uno o más elementos de control que controlan la expresión del gen pta de manera que el producto de gen no se hace; y similares. El gen pta endógeno de una célula huésped genéticamente modificada es eliminado. Se puede utilizar cualquier método para eliminar un gen. Un ejemplo no limitante de un método para eliminar un gen pta es a través del uso del sistema de recombinacíón ?Red. Datsenko and Wanner (2000) Proc Nati Acad Sci USA 97(12): p.6640-5. El gen pta, en algunas modalidades, será eliminado a partir de una célula huésped (por ejemplo, E.coli) que es genéticamente modificada con un ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótido que codifican MK, PMK, MPD, e IDI. El gen pta en algunas modalidades será eliminado de una célula huésped (por ejemplo, E.coli) que es genéticamente modificada con un ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótido que codifican MK, PMK, MPD, e ÍPP. El gen pta en algunas modalidades, será eliminado a partir de una célula huésped (por ejemplo, E.coli) que es genéticamente modificada con un ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótido que codifican MK, PMK, MPD, IPP, y una prenil transferasa. Otras Modificaciones que pudieran incrementar los niveles de acetil-CoA intracelular incluyen, pero no se limitan a, modificaciones que podrían reducir la actividad total de lactato deshidrogenasa dentro de la célula, modificaciones que podrían reducir la actividad total de acetato cinasa dentro de la célula, modificaciones que podrían reducir la actividad total de alcohol deshidrogenasa dentro de la célula, modificaciones que podrían interrumpir el ciclo de ácido tricarboxílico, tal como aquel que pudiera reducir la actividad total de 2-cetoglutarato deshidrogenasa, o modificaciones que podrían interrumpir la fosforilación oxidante, tales como aquellas que pudieran reducir la actividad total de las (F1F0)H + -ATP sintasa, o sus combinaciones. Otras modificaciones que pudieran reducir los niveles de acetil-CoA intracelular incluyen, pero no se limitan a, modificaciones que pudieran incrementar la actividad total de lactato deshidrogenasa dentro de la célula, modificaciones que pudieran incrementar la actividad total de acetato cinasa dentro de la célula, y modificaciones que pudieran incrementar la actividad total de alcohol deshidrogenasa dentro de la célula, o combinaciones de las mismas.

En algunas modalidades, una célula huésped padre es una que es genéticamente modificada, como se describe anteriormente, para incrementar los niveles de HMG-CoA; y además es genéticamente modificada de manera que un gen de trayectoria biosintética de DXP endógeno queda funcionalmente deshabilitado. Dichas célula huésped genéticamente modificada es útil para clasificar enzimas que convierten HMG-CoA a mevalonato, como se describe con mayor detalle más adelante, ya que la toxicidad de HMG-CoA podría ser exacerbada por la seguridad de la célula en la trayectoria de mevalonato para la producción de isoprenoides requeridos. En otras modalidades, una célula huésped genéticamente modificada de la invención es una que es genéticamente modificada para incluir uno o más ácidos nucleicos que comprenden una secuencia(s) de nucleótido que codifica un producto(s) de gen de trayectoria biosintética de DXP; y que además es genéticamente modificada de manera que un gen de trayectoria biosintética de MEV endógeno queda funcionalmente deshabilitado. Dicha célula huésped podría ser útil en el caso en donde por razones técnicas, la clasificación de encimas asociadas con la toxicidad de HMG-CoA no se realizará fácilmente en un organismo que naturalmente utiliza la trayectoria de mevalonato para la producción de isoprenoides. En algunas modalidades, cuando la célula huésped genéticamente modificada de la invención es una célula huésped procariótíca que ha sido genéticamente modificada con ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican uno o más productos de gen de la trayectoria de MEV, la célula huésped además puede ser modificada genéticamente de manera que uno o más genes de trayectoria de .DXP endógeno queda funcionalmente deshabllitado. Los genes de la trayectoria de DXP que puede ser funcionalmente deshabilitados incluyen uno o más de los genes que codifican cualquiera de los siguientes productos de gen de DXP: 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa, 1-desoxi-D-xi lulos a- 5 -fosf ato reducto iso m erasa, 4-dif osf ocitid i I -2-C-metil-D-eritritol sintasa, 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol cinasa, 2C-metil- D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintasa, y 1 -hidroxi-2-metil-2-(ii)-butenil 4-dífosfato sintasa. Un gen de trayectoria de DXP endógeno puede ser funcionalmente deshabilitado en cualquiera de una variedad de formas, incluyendo la inserción de un elemento genético móvil (por ejemplo, un transposon, etc.); la eliminación de todo o parte del gen, de manera que el producto de gen no se hace, o queda truncado y es enzimáticamente inactivo; la mutación del gen de manera que el producto de gen no se hace, o queda truncado y es enzimáticamente no funcional; la eliminación o mutación de uno o más elementos de control que controlan la expresión del gen de manera que el producto de gen no se hace; y similares.

Composiciones que comprenden una célula huésped genéticamente modificada de la invención La presente invención además proporciona composiciones que comprenden una célula huésped genéticamente modificada de la invención. Una composición de la invención comprende una célula huésped genéticamente modificada de la invención; y en algunas modalidades, comprenderá uno o más de otros componentes, dichos componentes se seleccionan basándose en parte del uso pretendido de la célula huésped genéticamente modificada. Los componentes adecuados incluyen, pero no se limitan a, sales; reguladores de pH; estabilizadores; agentes inhibidores de proteasa; compuestos conservadores de pared y/o membrana de célula, por ejemplo, glicerol, sulfóxido de dimetilo, etc.;medios nutritivos apropiados para la célula; y similares. ÁCIDOS NUCLEICOS La presente invención proporciona ácidos nucleicos que comprende secuencias de nucleótido que codifican HMGS y/o HMGR, en donde los ácidos nucleicos, cuando se introducen en una célula huésped padre que incluye o está genéticamente modificada para incluir, mitigan la toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA o inhibición de crecimiento. De esta manera, un ácido nucleico de la invención, cuando se introduce en una célula huésped que exhibe toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA, alivia la toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA o la inhibición de crecimiento, en otras modalidades, un ácido nucleico de la invención comprende una secuencia de nucleótido que codifica HMGR operablemente enlazada a un promotor fuerte. En algunas modalidades, un ácido nucleico de la invención es una construcción de expresión que comprenda una secuencia de nucleótido que codifique HMGR. En algunas modalidades, la construcción de expresión es una que proporciona síntesis de la HMGR codificada en una célula procariótica. En algunas modalidades, la construcción de expresión es una que proporciona la síntesis de la HMGR codificada en una célula eucariótica. En algunas modalidades, un ácido nucleico de la invención comprende una secuencia de nucleótido que codifica HMGR, en donde el ácido nucleico es un plásmido de número de copia medio. En algunas modalidades, un ácido nucleico de la invención comprende una secuencia de nucleótido que codifica HMGR, en donde el ácido nucleico es un plásmido de número de copia alto. En algunas modalidades, un ácido nucleico de la invención comprende una secuencia de nucleótido que codifica HMGR operablemente enlazada a un promotor fuerte, en donde el ácido nucleico es un plásmido de número de copia alto. En algunas modalidades, un ácido nucleico de la invención comprende una secuencia de nucleótido que codifica HMGR operablemente enlazado a un promotor fuerte, en donde el ácido nucleico es un plásmido de número de copia medio. En algunas • modalidades, un ácido nucleico de la invención comprende una secuencia de nucleótido que codifica HMGR operablemente enlazado a un promotor débil en un plásmido de copia media. En algunas modalidades, un ácido nucleico de la invención comprende una secuencia de nucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende acetoacetil-CoA tiolasa operablemente enlazada a HMGR. En algunas modalidades, un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión acetoacetil-CoA/HMGR se genera enlazando las secuencias de codificación de acetoacetil-CoA tiolasa y HMGR. En algunas modalidades, la proteína de fusión es una que se encuentra por naturaleza. En otras modalidades, la proteína de fusión es aquella que se encuentra por naturaleza, y es diferente de la proteína de fusión discutida por Hedí et al. ((2002) J. Bacteriol. 184:2116-2122). En algunas modalidades, un ácido nucleico de la invención comprende una secuencia de nucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende acetoacetil-CoA tiolasa y HMGS. En algunas modalidades, un ácido nucleico de la invención comprende una secuencia de nucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, y HMGR. En algunas modalidades, un ácido nucleico de la presente comprende una secuencia de nucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende HMGS y HMGR. En algunas modalidades, un ácido nucleico de la invención es una construcción de expresión que comprende una secuencia de nucleótido que codifica HMGR, en donde la construcción de expresión es diferente a una construcción de expresión descrita en cualquiera de las siguientes referencias: Kato-Emori et al. Mol Genet Genomics (2001) 265:135-42, Learned RM, et al. PNAS. (1989) 86:2779-83, T. Dairi, et al. Mol Gen Genet (2000) 262:957-964, Alien, et al. Appl Environ. Microbio. (1997). 63:3341-3344, Hedí, et al. J Bacteriol, (2002), 184:2116-2122aJackson, et al. Org. Leu. (2003) 5:1629-1632, Randolph Y. Hampton, et al. (1994) Cell, 125:299-312, Markus Veen, et al. FEMS Yeast Res (2003) 4:87-95, Beach MJ, et al. J Bacteriol (1989) 171:2994-3001, BischoffKM, et al. Protein Sci (1997) 6:156-161a Friesen JA, et al. Biochemistry. (1997) 36:2173-7, Frimpong, et al. J Biol Chem. (1994) 269:11478-83, Panda, et al. Appl Microbiol Biotechnol (2004) 66:143-152.

MÉTODOS DE CLASIFICACIÓN La presente invención proporciona métodos de clasificación para identificar un producto de gen que tiene actividad de destoxificación de HMG-CoA; y métodos para identificar un agente que inhibe la acumulación de HMG-CoA. En una modalidad el producto de gen identificado es uno que codifica una HMGR, por ejemplo, una variante de HMGR. En una modalidad, el producto de gen identificado es uno que codifica una HMGR variante, en donde la HMGR variante proporciona un incremento en la actividad total de HMGR en la célula. En otra modalidad, el producto de gen identificado produce un producto que reduce la actividad de HMGS. En otra modalidad, el producto de gen identificado produce un producto que utiliza mevalonato como un substrato. En otra modalidad, el gen Identificado produce un producto que codifica una MK. En otro ejemplo, el producto de gen identificado proporciona el transporte de mevalonato a partir de la célula. En otra modalidad, el producto de gen identificado es una HMG-CoA liasa o codifica una HMG-CoA liasa. En otra modalidad, el producto de gen identificado codifica un succinato-hidroximetilglutarato-CoA-transferasa, o es una s u cci nato-hidroxi metí lg I utarato-CoA-transf erasa. Para identificar un producto de gen que reduce la toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA, los métodos generalmente involucran producir una célula de prueba introduciendo a una célula huésped, un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótido que codifica un producto de gen candidato, en donde la célula huésped produce HMG-CoA a niveles efectivos para inhibir crecimiento de la célula huésped; y b) determinar el efecto, si hay alguno, de la expresión del producto de gen candidato sobre el crecimiento de la célula de prueba. Para identificar un agente que reduzca la acumulación de HMG-CoA intracelular, y/o que reduzca el nivel de la actividad de HMGS en una célula, los métodos generalmente involucran a) poner en contacto una célula de prueba con un agente de prueba, en donde la célula de prueba sintetiza mevalonato a través de una trayectoria de mevalonato, y en donde la célula de prueba exhibe inhibición de crecimiento inducido por la acumulación de HMG-CoA; y b) determinar el efecto, si hay alguno, de del agente de prueba sobre la inhibición de crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA. Como se utiliza aquí, el término "determinar" se refiere a determinaciones tanto cuantitativas como cualitativas y como tales, el término "determinar" se utiliza intercambiablemente aquí con "ensayar", "medir", y similares. Los métodos de clasificación de la invención son ensayos a base de células in vitro. Se puede utilizar cualquiera de una variedad de células. Las células utilizadas en el ensayo, en algunas modalidades, son células eucarióticas, como se describe anteriormente. En otras modalidades, las células utilizadas en el ensayo son células procarióticas, como se describe anteriormente.

Métodos para identificar un producto de gen que tiene actividad de destoxificación de HMG-CoA La presente invención proporciona métodos de clasificación in vitro para identificar un producto de gen que tiene actividad de destoxificación de HMG-CoA. Los productos de gen a ser identificados son útiles para aliviar la toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA, y, por lo tanto, son útiles en métodos para producir compuestos isoprenoides o precursores isoprenoides. Los métodos generalmente involucran a) producir una célula de prueba introduciendo a una célula huésped, un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótído que codifica un producto de gen candidato, en donde la célula huésped produce HMG-CoA a niveles efectivos para inhibir el crecimiento de la célula huésped; y b) determinar el efecto, si hay alguno, de la expresión del producto de gen candidato sobre el crecimiento de la célula de prueba, comparado con la célula huésped. La habilidad del producto de gen candidato para reducir la acumulación de HMG-CoA y. aliviar la toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA se determina por la habilidad del producto de gen candidato para reducir la inhibición de crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA. Una reducción en la inhibición de crecimiento en la célula de prueba, comparada con la célula huésped, indica que el ácido nucleico exógeno codifica un producto de gen que tiene suficiente actividad para aliviar la toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA. La célula huésped es una que produce una o más enzimas en la trayectoria de mevalonato, de manera que se produce HMG-CoA. En algunas modalidades, la célula huésped es una que normalmente no produce mevalonato a través de una trayectoria de mevalonato, y que ha sido genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican una o más enzimas de trayectoria de mevalonato, de manera que se produce HMG-CoA y se acumula intracelularmente a niveles de inhibición de crecimiento. En otras modalidades, la célula huésped es una que naturalmente produce HMG-CoA a niveles inhibidores de crecimiento o que ha sido genéticamente modificada, más bien a través de la introducción de uno o más genes de trayectoria de MEV exógenos, para hacer esto. HMG-CoA se produce en la célula huésped en una cantidad que inhibe el crecimiento de la célula huésped, por ejemplo, la concentración intracelular de HMG-CoA inhibe el crecimiento de la célula huésped. Típicamente, HMG-CoA se acumula en la célula huésped en una cantidad que inhibe el crecimiento de la célula huésped en al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 90%, o más, comparado con la velocidad de crecimiento de una célula huésped de control que no produce HMG-CoA, o comparado con la velocidad de crecimiento de la célula huésped que es cultivada bajo condiciones que no conducen a la síntesis de cantidades inhibidoras de crecimiento de HMG-CoA. En algunas modalidades, HMG-CoA se acumula intracelularmente en la célula huésped en una cantidad que es letal a la célula huésped, por ejemplo, induce la muerte de la célula huésped. En algunas modalidades, una célula huésped que exhibe Inhibición de crecimiento de célula inducida por acumulación de HMG-CoA es una célula que normalmente no sintetiza mevalonato o IPP a través de una trayectoria de mevalonato, y que ha sido genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican enzimas de trayectoria de mevalonato. Por ejemplo, en algunas modalidades, una célula huésped que exhibe inhibición de crecimiento de célula inducida por la acumulación de HMG-CoA es una célula procariótica que ha sido genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, y HMGR, en donde la acetoacetil-CoA tiolasa, HMGS, y HMGR se producen en la célula en cantidades que dan como resultado la inhibición de crecimiento de célula inducida por la acumulación de HMG-CoA. En otras modalidades, una célula huésped que exhibe inhibición de crecimiento de célula inducida por la acumulación de HMG-CoA es una célula que normalmente produce mevalonato o IPP a través de una trayectoria de mevaionato, y que ha sido genéticamente modifica de manera que los niveles de HMG-CoA ¡ntracelular se incrementan, dando como resultado la inhibición de crecimiento de célula inducida por la acumulación de HMG-CoA. La célula de prueba se cultiva in vitro bajo condiciones de manera que HMG-CoA se acumula intracelularmente en una cantidad que es inhibidora de crecimiento y/o inductora de muerte. En algunas modalidades, la célula de prueba se cultivado en presencia de un inductor que induce la expresión de una secuencia de nucleótido que codifica HMGS o HMGR, en donde la secuencia de nucleótido está bajo ei control de un promotor de inducción. Si la HMG-CoA está presente en la célula de prueba en una cantidad que inhibe el crecimiento de la célula de prueba se puede determinar utilizando cualquier método estándar para detectar la inhibición de crecimiento de una célula. Por ejemplo, el crecimiento frecuentemente es medido como un incremento en la densidad óptica cuando la célula se desarrolla en un cultivo líquido; y la inhibición de crecimiento puede ser detectada comparando la densidad óptica (por ejemplo, a 600 nm) de un cultivo líquido de células huésped que producen una cantidad inhibidora de crecimiento de HMG-CoA, con la densidad óptica de un cultivo líquido de las mismas células huésped que no producen una cantidad inhibidora de crecimiento del intermediario. La inhibición de crecimiento también puede ser detectada inspeccionando visualmente el tamaño de la colonia de células colocada en placas sobre agar conteniendo medios de crecimiento adecuados. Un método de clasificación de la invención involucra introducir un ácido nucleico exógeno a una célula huésped, produciendo una célula de prueba, en donde la célula huésped es una que exhibe inhibición de crecimiento cuando se produce HMG-CoA en una cantidad inhibidora de crecimiento. Cuando un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótido que codifica HMGR es introducido en la célula huésped, se alivia la inhibición de crecimiento de la célula de prueba. De esta manera, una reducción en la inhibición de crecimiento indica que el ácido nucleico exógeno codifica HMGR, en donde la HMGR codificada es producida a un nivel y/o tiene una actividad que alivia la inhibición de crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA. Una reducción en la inhibición de crecimiento incluye una reducción de por menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90%, o más, en la inhibición de crecimiento. En algunas modalidades, la HMGR codificada por el ácido nucleico exógeno reduce la inhibición de crecimiento de manera que la velocidad del crecimiento de célula se restaura a la velocidad de crecimiento de célula de la célula huésped cuando se desarrolla bajo condiciones de manera que HMG-CoA no se produce en cantidades inhibidoras de crecimiento. En algunas modalidades, por ejemplo, cuando el ácido nucleico exógeno es una pluralidad de ácidos nucleicos exógenos (por ejemplo, una colección de ADNc, una colección genómica, una población de ácidos nucleicos, cada uno codificando una HMGR con una secuencia de amino ácido diferente, etc.), el ácido nucleico exógeno se introduce a una pluralidad de células huésped, forman una pluralidad de células de prueba. Las células de prueba, en algunas modalidades, se desarrollan en un cultivo líquido bajo condiciones de manera que HMG-CoA se acumula intracelularmente en una cantidad inhibidora de crecimiento y/o de inducción de muerte; aquellas células de prueba que comprenden un ácido nucleico exógeno que comprende secuencias de nucleótido que codifican HMGR se desarrollarán más rápido que células de prueba que no comprenden un ácido nucleico exógeno que comprenda secuencias de nucleótido que codifican HMGR, o aquellas células de prueba que comprenden un ácido nucleico exógeno que comprende secuencias de nucleótido que codifican HMGR que darán vida, aunque las células de prueba que no comprendan un ácido nucleico exógeno que comprende secuencias de nucleótido de codificación de HMGR morirán. En algunas modalidades, el método además involucra aislar un ácido nucleico exógeno de una célula de prueba, en donde el ácido nucleico exógeno es uno que alivia la inhibición de crecimiento en un método dé clasificación de la invención. Los métodos para inflar el ácido nucleico exógeno de una célula de prueba son bien conocidos en la técnica. Los métodos adecuados incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de un número de métodos de lisis alcalina que son estándares en la técnica. En algunas modalidades, un método de clasificación de la invención además comprenderá caracterizar adicionalmente un producto de gen candidato. En estas modalidades, el ácido nucleico exógeno que comprende secuencias de nucleótido que codifican HMGR se aislan de una célula de prueba; el producto de gen se expresa en una célula y/o en un sistema de transcripción/traducción libre de célula in vitro. En algunas modalidades, el ácido nucleico exógeno es sometido a análisis de secuencia de nucleótido, y la secuencia de amino ácido del producto de gen se deduce de la secuencia de nucleótido. En algunas modalidades, la secuencia de amino ácido del producto de gen se compara con otras secuencias de amino ácido en una base de datos pública de secuencias de amino ácido, para determinar si existe cualquier identidad de secuencia de amino ácido importante con una secuencia de amino ácido de una proteína conocida. Además, el producto(s) de gen se expresa en una célula y/o en un sistema de trascripción/traducción libre de célula in viíro; y se analiza el efecto del producto(s) de gen en un intermediario de trayectoria metabólica u otra metabolito. Los ácidos nucleicos exógenos que son adecuados para introducirse en una célula huésped, para producir una célula de prueba, incluyen, pero no se limitan a, ácidos nucleicos de existencia natural aislados de una célula; ácidos nucleicos de existencia natural que han sido modificados (por ejemplo, a través de mutación) antes o después del aislamiento a partir de una célula; ácidos nucleicos sintéticos, por ejemplo, ácidos nucleicos sintetizados en un laboratorio utilizando métodos estándares de síntesis química de ácidos nucleicos, o generados a través de métodos recombinantes; ácidos nucleicos sintéticos o de existencia natural que han sido amplificados in vitro, ya sea dentro de una célula o en un sistema libre de célula; y similares. Los ácidos nucleicos exógenos que son adecuados para introducirse en una célula huésped incluyen, pero no se limitan a, ADN genómico; ARN; una copia de ADN complementario (ADNc) de ARNm aislado a partir de una célula; ADN recombinante; y ADN sintetizado in vitro, por ejemplo, utilizando métodos in vitro libres de célula estándares para la síntesis de ADN. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos exógenos son una colección de ADNc hecha a partir de células, ya sea células procarióticas o células eucarióticas. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos exógenos son una colección de ADN genómico hecha a partir de células, ya sea células procarióticas o célula eucarióticas. Los ácidos nucleico, en algunas modalidades, serán mutados antes de ser introducidos a una célula huésped. Los métodos de mutación de un ácido nucleico son bien conocidos en la técnica e incluyen métodos de mutación química bien establecidos, mutagénesis inducida por radiación y métodos de mutación de un ácido nucleico durante síntesis. Los métodos químicos de mutación de ADN incluyen exponer el ADN a un mutágeno químico, por ejemplo, metansulfonato de etilo (EMS), metansulfonato de metilo (MMS), N-nitrosourea (ENU), N-metil-N-nitro-N'-nitrosoguanidina, N-óxido de 4-nitroquinolina, dietilsulfato, benzopireno, ciclofosfamida, bleomicina, trietilmelamina, monómero de acrilamida, mostaza de nitrógeno, vincristina, diepoxialcanos (por ejemplo, diepoxibutano), ICR-170, formaldehído, clorhidrato de procarbazina, óxido de etileno, dimetilnitrosamina, 7,12 dimetilbenz(a)antraceno, clorambucilo, hexametilfosforamida, bisulfan, y similares. Los agentes de inducción de mutación por radiación incluyen radiación ultravioleta, irradiación y-, rayos X, bombardeo rápido de neutrones. Las mutaciones también pueden ser introducidas a un ácido nucleico utilizando, por ejemplo, trimetilpesoralen con luz ultravioleta. La inserción aleatoria o de objetivo de un elemento de ADN móvil, por ejemplo, un elemento de transposon, es otro de los métodos adecuados para generar mutaciones. Las mutaciones puede ser introducidas a un ácido nucleico durante la amplificación en un sistema in viíro libre de célula, por ejemplo, utilizando una técnica de reacción de cadena de polimerasa (PCR) tal como PCR propensa a error. Las mutaciones puede ser introducidas a un ácido nucleico in vitro utilizando técnicas de entremezclado (por ejemplo, entremezclado de exón, barrido de dominio, y similares). También se pueden introducir mutaciones a un ácido nucleico como resultado de una deficiencia en una encima de de reparación de ADN en una célula, por ejemplo, la presencia en una célula de un gen mutante que codifica una encima de reparación de ADN mutante se espera que genere una alta frecuencia de mutaciones (es decir, aproximadamente 1 mutación /100 genes-1 mutación/10,000 genes) en el genoma de la célula.

Ejemplos de genes que codifican enzimas de reparación de ADN incluyen, pero no se limitan a Mut H, Mut S, Mut L, y Mut U, y sus homólogos en otras especies (por ejemplo, MSH 1-6, PMS 1-2, MLH 1, GTBP, ERCC-1, y similares). Los métodos para la mutación de ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica, y cualquier método conocido es adecuado para utilizarse. Ver, por ejemplo, Stemple (2004) Nature 5:1-6; Chiang et al. (1993) PCR Methods Appl 2(3):210-217; Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sel USA 91:10747-51; y Patente de E.U.A Nos. 6,033,861, y 6,773,900. En muchas modalidades, el ácido nucleico exógeno es insertado en un vector de expresión. Los vectores de expresión que son adecuados para utilizarse en células huésped procarióticas y eucarióticas son conocidos en la técnica, y se puede utilizar cualquier vector de expresión adecuado. Los vectores de expresión adecuados son como se describieron anteriormente. Como se observó anteriormente, un ácido nucleico exógeno en. algunas modalidades será aislado de una célula o un organismo en su natural ambiente. En algunas modalidades, el ácido nucleico de la célula u organismo será mutado antes de que el ácido nucleico se aislado de la célula u organismo. En otras modalidades, el ácido nucleico exógeno es sintetizado en un sistema libre de célula in vitro. Los ácidos nucleicos exógenos que son adecuados para introducirse en una célula huésped incluyen ácidos nucleicos aislados de células u organismos de una especie diferente del de la célula huésped. Fuentes adecuadas de ácidos nucleicos exógenos incluyen, pero no se limitan a, una célula u organismo de cualquiera de los seis reinos, por ejemplo, Bacteria (por ejemplo, Eubacteria); Archaebacteria; Protista; Hongos; Plantas; y Animales. Las fuentes adecuadas de ácidos nucleicos exógenos incluyen miembros de tipo planta del reino Protista, que incluyen, pero no se limitan a, algas (por ejemplo, algas verdes, algas rojas, glaucofitos, cianobacteria); miembros de Protista de tipo hongo, por ejemplo, hongos de caliza, hongos de. agua, etc.; miembros de Protista de tipo animal, por ejemplo, flagelos (por ejemplo, Euglena), amoeboids (por ejemplo, amoeba), sporozoans (por ejemplo, Apicomplexa, Myxozoa, Microsporidia), y ciliatos (por ejemplo, Paramecium). Las fuentes adecuadas de ácidos nucleicos exógenos incluyen miembros del reino de hongos, incluyendo, pero no se limitan a, miembros de cualquiera de filum: Basidiomicota (hongos de palo; por ejemplo, miembros de Agaricus, Amanita, Boletus, Canterelus, etc.); Ascomicota (hongos de saco, incluyendo, por ejemplo, Saccaromices); Micoficofita (liqúenes); Zígomicota (hongos de conjugación); y Deuteromicota. Las fuentes adecuadas para ácidos nucleicos exógenos incluyen miembros del reino de plantas, incluyendo, pero no se limitan a, miembros de cualquiera de las siguientes divisiones: Briofita (por ejemplo, musgos), Antocerotofita (por ejemplo, ceratófilos), Hepaticofita (por ejemplo, hepáticas), Licofita (por ejemplo, musgos de palo), Sfenofita (por ejemplo, colas de caballo), Psilofita (por ejemplo, heléchos ), Ofíoglosofíta, Pterofita (por ejemplo, heléchos), Cicadofita, Gingkofita, Pinofita, Genetofita, y Magnoliofita (por ejemplo, plantas con flores). Las fuentes adecuadas de ácidos nucleicos exógenos incluyen miembros del reino de animales, incluyendo, pero no se limitan a, miembros de cualquiera de los siguientes filums: Poriferas (esponjas); Plocozoa; Ortonectida (parásitos de invertebrados marinos); Rhombozoa; Cnidaria (corales, anemonas, medusas, cisnes de mar, primitarias marinas, avispas marinas); Ctenoforas (medusas de cepillo); Platihelmintos (gusanos planos); Nemertina (gusanos de listón); Ngathostomulida (gusanos con fauces), Gastrotricha; Rotifera; Priapulida; Kinorhincha; Loricifera; Acantocefala; Entoprocta; Nemotoda; Nematomorfa; Cillofora; Molusca (moluscos); Sipuncula (gusanos de cacahuate); Annelida (gusanos segmentados); Tardigrada (osos de agua); Onicofora (gusanos aterciopelados); Artrópodos (incluyendo el sub-filum: Celicerata, Míriapodos, Hexapodos, y Crustáceos, en donde los Celiceratas incluyen, por ejemplo, arácnidos, merostomata, y Picnogonida, en donde las miriapodas incluyen, por ejemplo, Chilopodos (centípedos), Diplopodos (milípedos), Paropodos, y Simfilums, en donde los Hexapodos incluyen insectos, y en donde los Crustáceos incluyen camarones, crustáceos marinos, bercedes, etc.; Foronida; Ectoprocta (animales de musgo); Brachiopoda; Echinodermata (por ejemplo, pez estrella, margaritas de mar, espigas, erizos de mar, pepinillos de mar, estrellas quebradizas, canastas quebradizas, etc.); Chaetognata (gusanos de flecha); Hemichordata (gusanos de bellotas); y Chordata. Los miembros adecuado de Chordata incluyen un miembro de los siguientes sub-filum: Urochordata (ceciles; incluyendo Ascidiacea, Taliacea, y Larvacea); Cefalocordata (pez espada); Myxlnoi (pez espada); y Vertebrata, en donde los miembros de Vertebrata incluyen, por ejemplo, miembros de Petromizontida (lamprea), Condrichtices (pez cartilaginoso), Actinopterigii (pez de aleta de rayo), Actinista (coelocants), Dipnoi (pez de cuerpo alargado), Reptilia (reptiles, por ejemplo, serpientes, lagartos, cocodrilos, lagartijas, etc.), Aves (pájaros); y Mammalian (mamíferos). Las plantas adecuadas incluyen cualquiera de monocotiledónias y dicotiledónias. De esta manera, por ejemplo, las células adecuadas incluyen células de organismos que incluyen, pero no se limitan a, un protozoapo, una planta, un hongo, una célula de alga, una levadura, un reptil, un anfibio, un mamífero, un microorganismo marino, un invertebrado marino, un artrópodo, un isópodo, un insecto, un arácnido, una arqueobacteria, y una eubacteria. En algunas modalidades, el ácido nucleico exógeno será aislado de tejido tomado de un organismo de una célula particular o grupo de células aisladas de un organismo; etc. Por ejemplo, cuando el organismo es una planta, el ácido nucleico exógeno en algunas modalidades será aislado a partir del xilema, floema, la capa de cambio, hojas, raíces, etc. Cuando el organismo es un animal, el ácido nucleico exógeno, en algunas modalidades, será aislado de tejido particular (por ejemplo, de pulmón, de hígado de corazón, de riñon, de cerebro, de vaso, de piel, de tejido fetal, etc.), o un tipo de célula particular (por ejemplo, células neuronales, células epiteliales, células endoteliales, astrocitos, macrófagos, células ileales, células de ¡sleta, linfocitos T, linfocitos B, etc.). En algunas modalidades, el ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico sintético. En algunas modalidades, un ácido nucleico sintético comprende una secuencia de nucleótido que codifica una HMGR variante, por ejemplo, una HMGR que difiere en la secuencia de amino ácido por uno o más amino ácidos a partir de una HMGR de existencia natural u otra HMGR de origen. En algunas modalidades, la HMGR variante difiere en secuencia de amino ácido por un amino ácido, dos amino ácidos, tres amino ácidos, cuatro amino ácidos, cinco amino ácidos, seis amino ácidos, siete amino ácidos, ocho amino ácidos, nueve amino ácidos, o amino ácidos, o más, comparado con la secuencia de amino ácido de una HMGR de origen de existencia natural. En algunas modalidades, una HMGR variante difiere en secuencia de amino ácido de aproximadamente 10 amino ácidos a aproximadamente 15 amino ácidos, de aproximadamente 15 amino ácidos a aproximadamente 20 amino ácidos, de aproximadamente 20 amino ácidos a aproximadamente 25 amino ácidos, de aproximadamente 25 amino ácidos a aproximadamente 30 amino ácidos, de aproximadamente 30 amino ácidos a aproximadamente 35 amino ácidos, de aproximadamente 35 amino ácidos a aproximadamente 40 amino ácidos, de aproximadamente 40 amino ácidos a aproximadamente 50 amino ácidos, o de aproximadamente 50 amino ácidos a aproximadamente 60 amino ácidos, o más, comparado con la secuencia de amino ácido de una HMGR de existencia natural de origen. En algunas modalidades, una HMGR variante es codificada por un ácido nucleico que hibridiza bajo condiciones de hibridación severas a un ácido nucleico que codifica una HMGR conocida. En otras modalidades, una HMGR variante es codificada por un ácido nucleico que hibridiza bajo condiciones de hibridación moderadas a un ácido nucleico que codifica HMGR conocida. En otras modalidades, una HMGR variante es codificada por un ácido nucleico que hibridiza bajo condiciones de hibridación de severidad menor a un ácido nucleico que codifica una HMGR conocida. En algunas modalidades, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótído que codifica una HMGR de existencia natural, es mutado, utilizando cualquiera de una variedad de métodos bien establecidos, dando surgimiento a un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica una HMGR variante. Los métodos de mutagénesis adecuados incluyen, pero no se limitan a, métodos de mutación química, mutagénesis inducida por radiación, y métodos para mutación de un ácido nucleico durante síntesis, como se describe anteriormente. De esta manera, por ejemplo, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que comprende una HMGR de existencia natural es expuesto a un mutágeno químico, como se describió anteriormente, o sometido a mutación por radiación, o sometido a una PCR propensa a error, y el ácido nucleico mutagenizado es introducido a una célula(s) huésped genéticamente modificada como se describe anteriormente. Los métodos para mutagénesis aleatoria utilizando una cepa "mutadora" de bacteria también son bien conocidas en la técnica y se puede utilizar para generar una HMGR variante. Ver, por ejemplo, Greener et al., "An Efficient Random Mutagénesis Technique Using an E.coli Mutator Strain", Methods in Molecular Biology, 57:375-385 (1995). También son conocidas y se pueden utilizar técnicas de mutagénesis de saturación que emplean una reacción de cadena de polimerasa (PCR). Ver, por ejemplo, Patente de E.U.A No. 6,171,820. Los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótido que codifica una HMGR variante son identificados por la habilidad para mejorar la inhibición de crecimiento causada por la acumulación de HMG-CoA. Las secuencias de nucleótido que codifican HMGR son conocidas en la técnica, y cualquier secuencia de nucleótido que codifica HMGR conocida puede ser alterada para generar ácido nucleico sintético para utilizarse en un método de la presente. De interés particular, en algunas modalidades, es la identificación de HMGR variante que exhibe actividad enzimática incrementada, que, por lo tanto, reduce la inhibición de crecimiento e célula inducida por acumulación de HMG-CoA. Una HMGR variante que exhibe actividad enzimática incrementada exhibe por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90%, a por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 2.5 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, o por lo menos aproximadamente 25 veces, o más, mayor actividad enzimática comparado con una HMGR de origen.

Méíodos para ideníificar un agenfe que reduce la acumulación de HMG-CoA La presente invención además proporciona métodos de clasificación in vitro para identificar un agente que inhibe o reduce la acumulación de HMG-CoA; métodos para identificar agentes que reducen el nivel de la actividad de HMGS en una célula; métodos para identificar un agente que inhibe la producción de HMG-CoA; y métodos para identificar un agente que convierte o acelera la conversión de HMG-CoA a otro compuesto. Los métodos generalmente involucran, a) poner en contacto una célula de prueba con un agente de prueba, en donde la célula de prueba sintetiza al mevalonato a través de una trayectoria de mevalonato, y en donde la célula de prueba exhibe una inhibición de crecimiento inducido por la acumulación de HMG-CoA; y b) determinar el efecto, si hay alguno, del agente de prueba sobre la inhibición de crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA. Una reducción en la inhibición de crecimiento indica que el agente reduce la acumulación intracelular de niveles inhibidores de crecimiento de HMG-CoA. Los agentes que inhiben o reducen la acumulación de HMGCoA en una célula y promueven el crecimiento de célula son útiles para incrementar la producción de un compuesto isoprenoide, como se describe aquí. Los agentes que inhiben o reducen la acumulación de HMG-CoA en una célula, y que reducen el nivel de la actividad de HMGS en ia célula, también son útiles para reducir la biosíntesis de colesterol, y de esta manera son útiles para tratar una variedad de trastornos asociados con altos niveles de colesterol en la sangre. Los términos "agente candidato", "agente de prueba", "agente", "substancia" y "compuesto" se usan intercambiablemente aquí. Los agentes candidato abarcan numerosas clases químicas, típicamente moléculas inorgánicas u orgánicas, sintéticas, semi-sintéticas, o de existencia natural. Los agentes candidato Incluyen aquellos encontrados en grandes colecciones de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, las colecciones de compuestos sintético están comercialmente disponibles de Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), ComGenex (South San Francisco, CA), y MicroFuente (New Milford, CT). Una colección química rara está disponible de Aldrich (Milwaukee, Wis.) y también puede ser utiliza.

Alternativamente, las colecciones de compuestos naturales en la forma de exactos bacterianos, fúngicos, de plantas y de animales están disponibles de Pan Labs (Bothell, WA) o son fácilmente producibles. Los agentes candidato puede ser compuestos orgánicos o inorgánicos pequeños que tienen un peso molecular de más de 50 y menos de aproximadamente 2,500 daltons. Los agentes candidato pueden comprender grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente enlace de hidrogeno, y pueden incluir por lo menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, y pueden contener por lo menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidato pueden comprenden estructuras cíclicas de carbono o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los agentes candidato también se pueden encontrar entre biomoléculas incluyendo péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o sus combinaciones. Los ensayos de la invención incluyen controles, en' donde los controles adecuados incluyen una célula que exhibe inhibición de crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA en ausencia del agente de prueba. Generalmente se corre una pluralidad de mezclas de ensayo en paralelo con diferentes concentraciones de agente para obtener una respuesta diferencial a las varías concentraciones. Típicamente, una de estas concentraciones sirve como un control negativo, es decir, a una concentración de cero o por abajo del nivel de detección. Un período de tiempo adecuado para poner en contacto el agente con la célula puede ser determinado en forma empírica, y generalmente es un tiempo suficiente para permitir la entrada del agente a la célula y para permitir que el agente tenga un efecto medible sobre la inhibición de crecimiento de célula inducida por acumulación de HMG-CoA. Generalmente, un tiempo adecuado de entre 10 minutos y 24 horas, o de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 8 horas. Los métodos de clasificación pueden ser diseñados en un número de diferentes formas, en donde se puede emplear una variedad de configuraciones y protocolos de ensayo, como es conocido en la técnica. Por ejemplo, las células de prueba (células que exhibe inhibición de crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA) puede ser colocada sobre placas en cavidades de una placa de cavidades múltiples (por ejemplo, una placa de 96 cavidades, una placa de 384 cavidades, etc.) y varios agentes de prueba se agregan individualmente a las cavidades de la placa. El método de clasificación puede ser automatizado. Un agente candidato* es analizado para cualquier actividad citotóxica que pueda exhibir hacia la célula utilizada en el ensayo, utilizando ensayos bien conocidos, tales como exclusión de colorante azul de tripan, un ensayo MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2 , 5-d if en i I-2 H-tetrazolo), y similares. Los agentes que no exhibe actividad citotóxica se consideran agentes candidato. Un agente de prueba de interés es uno que reduce la inhibición de crecimiento de célula inducida por acumulación de HMG-CoA por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 35%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 45%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 55%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 65%, por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90%, o más, cuando se compara con un control en ausencia del agente de prueba. Si el agente de prueba tiene un efecto sobe la inhibición de crecimiento de célula, se determina fácilmente utilizando métodos estándares, como se describe anteriormente. En algunas modalidades, el agente de prueba es uno que reduce el nivel de actividad de HMGS en la célula. Un agente de prueba de interés es uno que reduce el nivel de actividad de HMGS por al menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 35%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 45%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 55%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 65%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90%, o más, cuando se compara con un control en ausencia del agente de prueba. Si el agente de prueba reduce el nivel de actividad de HMGS en la célula esto es fácilmente determinado utilizando una variedad de métodos de ensayo. Como un ejemplo no limitante, la actividad enzimática de HMGS se inhibe en un lisato de célula a partir de muestras de célula en donde un agente de prueba reduce la inhibición de crecimiento de célula inducida por acumulación de. HMG-CoA. La HMGS puede ser analizada agregando un exceso de acetil-CoA y acetoacetil-CoA a una solución regulada en su pH (Por ejemplo, 100 mM Tris-HC1) conteniendo extracto de célula o encima purificada. Después de cinco minutos, la reacción puede ser detenida (por ejemplo, congelando la muestra) y la HMG-CoA creada puede ser medida a través de LC-MS. Como otro ejemplo, los niveles de ARNm de HMGS en una célula se miden. Un número de métodos esta disponible para analizar ácidos nucleicos para la presencia y/o nivel de un ARNm específico en una célula. El ARNm puede ser analizado directamente o trascrito en forma inversa a ADNc para análisis. El ácido nucleico puede ser amplificado a través e técnicas convencionales, tales como la reacción de cadena de polimerasa (PCR), para proporcionar cantidades suficientes para análisis. El use de la reacción de cadena de polimerasa se describe por Saiki, er al. (1985), Science 239:487; una revisión de las técnicas se puede encontrar en Sambrook, er al.

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, pp.14.2- 14.33; y varios protocolos de PCR se describen ampliamente en un número de libros de texto, que incluyen, por ejemplo, PCR Protocoís J. Bartlett and D. Stirling, eds. (2003) Humana Press. Una etiqueta detectable puede ser incluida en una reacción de amplificación. Las etiquetas adecuadas incluyen fluorocromos, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceina (FITC), rodaminae, Rojo Texas, ficoeritrina, aloficocianina, 6-carboxifluoresceina (6-FAM), 2', 7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxifiuoresceina (JOE), 6-carboxí-X-rodamina (ROX), 6-carboxi-2',4',7',4,7-hexaclorofluoresceina (HEX), 5-carboxifluorescelna (5-FAM) o N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), etiquetas radioactivas, por ejemplo, 32P, 35S, 3H; etc. La etiqueta puede ser un sistema de dos etapas, en donde el ADN amplificado es conjugado a biotina, haptenos, etc. teniendo un alto patrón de unión de actividad, por ejemplo, avidina, anticuerpos específicos, etc., en donde el patrón de unión es conjugado a una etiqueta detectable. La etiqueta puede ser conjugada a uno o ambos de los iniciadores. Alternativamente, la combinación de nucleótidos utilizados en la amplificación es marcada, con el fin de incorporar la etiqueta en el producto de amplificación Una variedad de diferentes métodos para determinar la abundancia de ácido nucleico en una muestra en conocida por aquellos expertos en la técnica, en donde los métodos particulares de interés incluyen aquellos descritos en: Pietu et al., Genome Res.

(June 1996) 6:492-503; Zhao et al., Gen (April 24, 1995) 156:207- 213; Soares, Curr. Opin. Biotechnol. (October 1997) 8:542-546; Raval, J. Pharmacol Toxícol Methods (November 1994) 32:125-127; Chalifour et al., Anal. Biochem (February 1, 1994) 216:299-304; Stolz & Tuan, Mol. Biotechnol. (December 19960 6:225- 230; Hong et al., Bioscience Reports (1982) 2:907; y McGraw, Anal. Biochem. (1984) 143:298. También de interés son los métodos descritos en WO 97/27317, la descripción de los cuales se incorpora aquí por referencia. Un número de métodos está disponible para determinar el nivel de expresión de una proteína en una muestra particular. Por ejemplo, la detección puede utilizar la tinción de células o secciones histológicas con anticuerpos marcados específicos para la proteína, realizándose de acuerdo con métodos convencionales. Las células son permeabilizadas para teñir moléculas citoplásmicas. Los anticuerpos de interés se agregan a la muestra de célula y se incuban durante un período suficiente de tiempo para permitir la unión al epítopo, usualmente por lo menos alrededor de 10 minutos. El anticuerpo puede ser marcado con radioisótopos, enzimas, agentes de fluorescencia, quimioluminiscentes, u otras etiquetas para detección directa. Alternativamente, un anticuerpo de segunda etapa o reactivo se utiliza para amplificar la señal. Dichos reactivos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo primario puede ser conjugad a biotina, con avidita conjugada con peroxidasa de rábano agregada como un reactivo de segunda etapa. La detección final utiliza un sustrato que experimenta un cambio de color en presencia de la peroxidasa. Alternativamente, el anticuerpo secundario es conjugado a un compuesto fluorescente, por ejemplo, fluoresceína, rodamina, rojo Texas. La ausencia o presencia de unión de anticuerpo puede ser determinada a través de varios métodos, incluyendo citometría de flujo de células disociadas, microscopia, radiografía, conteo de cintilación, etc.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se establecen para proporcionar a aquellos expertos en la técnica una completa descripción de cómo hacer y utilizar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni pretenden representar que los experimentos que se presentan a continuación, todos o algunos solamente se han realizado. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo cantidades, temperatura, etc.) pero algunos errores y desviaciones experimentales deben ser representados. A menos que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, la temperatura está en grados Celsius, y la presión está en o cerca de atmosférica. Se utilizan abreviaturas estándares, por ejemplo bp, pares de base; kb, kilobases; p¡, picolitros; s o seg, segundos; min, minutos; h o hr, horas; aa, aminoácidos; kb, kiiobases; bp, pares de base; nt, nucleótidos; i.m. intramuscular(mente); i.p., intraperitoneal(mente); s.c, subcutánea(mente); y similares.

Ejemplo 1: Producción in vivo de mevalonato limita la producción de amorfadieno Se utilizaron las siguientes cepas, vectores, condiciones de crecimiento y métodos analíticos en los siguientes ejemplos. Cepas, Construcción de plásmido y medios de crecimiento Cepas Se utilizaron cepas de E. coli TOP10 y DH10B, ambas de Invitrogen, para clonar y para la construcción de plásmido. Se utilizó E. coli DH10B para la producción de isoprenoide, crecimiento y ensayos de metabolito.

Medios de Crecimiento Para la clonación y propagación de cepas de E. coli que alojan los varios vectores recombinantes descritos aquí, se utilizó el caldo de Luria con modificación de Miller (Sigma-Aldrich) con antibióticos apropiados para la selección de plásmido. Para la producción, crecimiento y ensayos de metabolito se diseñaron cepas de E. coli diseñadas por ingeniería ("genéticamente modificada" o "recombinantes") en caldo de Luria con modificación de Miller (LB), 1% (p/vol) de glicerol y antibióticos apropiados. El. DL-mevalonato utilizado para el suplemento de medios se preparó mezclando 1 volumen de 2 M de lactona de ácido DL-mevalónico (Sigma-Aldrich) con 1.02 volúmenes de 2 M KOH e incubando a 37°C durante 30 minutos (Campos et al. (2001) Biochem. J. 353:59-67). Para mantener los plásmidos, se agregaron antibióticos requeridos, según fue apropiado, al medio de crecimiento. Se utilizaron isopropil-Beta- D-tiogalactosida (IPTG), de Roche, y L-arabinosa de Sigma-Aldrich, para la inducción de sistemas promotores.

Consfrucc/ón de Plásmidos / Operones Se ensamblaron operones de genes múltiples de trayectoria de mevalonato heteróloga como se describe en ia Solicitud de Patente de EUA números de publicación 20030148479 y 20040005678, y Martin et al. (2003) Nat. Biotech. 21 (7):796-802. El operon MevT codifica los genes atoB de E. coli, HMGS a partir de S. cerevisiae, y una forma truncada de HMGR1 a partir de S. cerevisiae denominada "tHMGR.". El operon MevT codifica las enzimas sensibles para la conversión de acetil-CoA a mevalonato (Figura 2). El operon ensamblado se clonó al vector pCR4 TOPO utilizando el sistema de clonación TOPO TA de Invitrogen (Carlsbad, CA) para propósitos de secuenciación. La ligación al vector pCR4 TOPO vector y la transformación de células de Escherichia coli TOP10 se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ya que la expresión de trayectorias bioquímicas por lo regular es óptima a un nivel de expresión específico, el operon MevT se clonó en una variedad de vectores de expresión para determinar el efecto del número de copia de plásmido y la resistencia de promotor sobre la resistencia de trayectoria clonada. El operon MevT se clonó en el sitio Salí de pBAD24 (Guzman et al. (1995) J. Bacteriology 177:4121-4130), M. Ehrmann et al., (1997) Proc. Nati. Acad Sci. USA 94: 13111-13115), número de copia media, plásmido de inducción de arabinosa, digiriendo tanto el vector vacío como el operon MevT en pCR4 TOPO con la enzima de restricción Sa/I y ligando con ligasa de ADN T4. El plásmido resultante se nombró pBAD24MevT (SEC ID NO:1) (Solicitud de Patente de EUA, números de publicación 20030148479, 20040005678). El operon MevT también se clonó en los sitios mal-Psfl de pBAD33 (Guzman et ai. (1995) J. Bacteriology 177:4121-4130); Hiszczynska-Sawicka. (1997) PLASMID 38: 174-179), de copia baja, plásmido de inducción de arabinosa, digiriendo tanto el vector vacío como el operon MevT en pCR4 TOPO con enzimas de restricción Xma\ y Psfl y ligando con ligasa de ADN T4. El plásmido resultante, se denominó pBAD33MevT (SEC ID NO:2), ver Martin et al. (2003) supra. Para colocar el operon MevT bajo el control de un promotor PLAC modificado (promotor más débil), el fragmento araC-PBAD ?/s/l-Xma\ de pBAD33MevT se reemplazó con el fragmento Nsi\-Xma\ de pBBRIMCS (Kovach et al. (1995) Gen 166:175-176) conteniendo el promotor PLAC modificado. La digestión de pBAD33MevT y pBBRIMCS se condujo utilizando enzimas de restricción ?/s/l y Xmal y se ligó utilizando ligasa de ADN T4. El plásmido resultante se nombró pMevT (SEC ID N0:3), ver Solicitud de Patente de EUA número de publicación 20040005678 y Martin et al. (2003) supra. Para generar el control de plásmido vacío para pMevT, el operon MevT se extirpo de pMevT utilizando la enzima de restricción Sa/l. El plásmido resultante conteniendo solamente el prom-otor PLAC se denomino pLac33 (Martin et al. (2003) supra). Para producir FPP, IPP, y DMAPP a partir de mevalonato, el operon denominado MBIS se construyó como se describe en la Solicitud de Patente de EUA números de publicación 20030148479, 20040005678, y Martin et al. (2003) supra. MBIS contiene los genes MK, PMK y MPD a partir de S. cerevisiea y idi, y ispA de E. coli (Figura 2). Como se describió, el operon MBIS se ensambló en el plásmido pBBRIMCS-3 (Kovach et al. (1995) supra) bajo el control de un promotor PLAC modificado. El plásmido de inducción IPTG se denominó pMBIS (SEC ID NO 4). Para producir amorfa-4,11-dieno a partir de FPP, se creó un gen de amorfadin sintasa sintético como se describe en la Solicitud de Patente de EUA número de publicación 20040005678 y Martin et al. (2003) supra. El gen sintético se clonó en el vector pTrc99A (Amann et al. (1988) Gen 69:301-315), como se describió, y el plásmido de inducción IPTG se denominó pADS (SEC ID NO 5). Con el fin de determinar la fuente de toxicidad causada por la expresión elevada del operon MevT, los genes individuales del operon MevT y sus combinaciones se amplificaron y se clonaron en vectores de expresión.

AtoB se modificó a partir de pBAD24MevT utilizando protocolos de PCR estándares e iniciadores complementarios a los extremos 5' y 3' del gen. Se clonó AtoB en los sitios Xma\-Sal\ de pBAD33, plásmido de inducción de arabinosa de copia baja, mediante la digestión tanto del vector vacío como del producto de PCR con las enzimas de restricción Xmal y Sa/l y ligando con ligasa de ADN T4.

El plásmido resultante se denominó pAtoB (SEC ID NO 6). HMGS se amplificó a partir de pBAD24MevT utilizando protocolos de PCR estándares e iniciadores complementarios a los extremos 5' y 3' del gen. HMGS se clonó en los sitios Xmal-Sall de pBAD33, un plásmido de inducción arabinosa de baja copia, mediante la digestión tanto del vector vacío como del producto de PCR con las enzimas de restricción Xmal y Sa/l y ligando con ligasa de ADN T4. El plásmido resultante se denomino pHMGS (SEC ID NO 7). La HMGR truncada se amplificó a partir de pBAD24MevT utilizando protocolos de reacción de cadena de polimerasa estándar (PCR) e iniciadores complementarios a los extremos 5' y 3' de gen. La HMGR truncada (tHMGR) se clonó en ios sitios Xmal-Sa/I de pBAD33, un plásmido de inducción de arabinosa de baja copia, y pBAD18 (Guzman et al. (1995) J. Bacteriology 177:4121- 4130), un plásmido de inducción de arabinosa de copia media, a través de la digestión tanto de los vectores vacíos como del producto de PCR con las enzimas de restricción Xmal y Sa/l y ligando con ligasa de ADN T4. El plásmido de número de copia resultante se denominó pHMGR (SEC ID NO 8) y el plásmído de número de copia media resultante se denominó pBAD18HMGR (SEC ID NO 9). Un operon conteniendo solamente HMGS y la HMGR truncada se creo amplificando los dos segmentos de gen a partir de pBAD24MevT, utilizando protocolos de PCR estándares e iniciadores complementarios al extremo 5' de HMGS y el extremo 3' de HMGR. El fragmento de HMGS y HMGR se clonó en el sitio Sa/l de pBAD33, un plásmido de inducción de arabinosa de copia baja, a través de la digestión tanto del vector vacío como del producto de PCR con la enzima de restricción Sa/l y ligando con ligasa de ADN T4. El plásmido resultante se denominó pHMGSR (SEC ID NO 10). Las secuencias de nucleótido de las construcciones de plásmido discutidas en los Ejemplos se ilustran en la Figura 13A-C a la Figura 24A-C; y se resaltan varias características. La secuencias de codificación, terminadores y orígenes se ilustran con el texto en negritas, o texto en negritas y subrayado. Las secuencias de promotor están en cajas. El "origen pBR322 modificado" ilustrado en la Figura 13A-C y Figura 21 A-C incluye un gen rop truncado, y de esta manera proporciona un plásmido de número de copia más alto que el origen pBR322 (no modificado); el número de copia de plásmldo de los plásmidos que contienen el origen pBR322 modificado se estimó que es de aproximadamente 30 copias por célula a aproximadamente 50 copias por célula. Ver, por ejemplo Guzman et al. ((1995) J. Bacteriol. 177:4121-4130; y Ehrmann et al. ((1997) Proc. Nati. Acad. Sel USA 94:13111-13115).

Medición de crecimiento de célula El crecimiento de célula de cultivos de E. coli se midió analizando la densidad óptica de los cultivos a 600 nm (OD60o). La OD60o de las muestras tomadas de los cultivos en matraces de deflexión se midió utilizando un Espectrofotómetro UV (Beckman), mientras que la OD600 de los cultivos en placas de microtitulación de 96 cavidades se midió utilizando un vector de placa de microtitulación (SpectraMax, Molecular Devices).

Medición de amorfa-4,11 -dieno La concentración de amorfa-4,11 -dieno se determine extrayendo muestras de.7 mL con 0.7 ml de acetato de etilo (Sigma-Aldrích) en frascos de cromatografía de gas de vidrio (GC). Las muestras después se agitaron a una velocidad máxima en un mezclador Fisher Vortex Genie 2 (Fischer Scientifíc) durante tres minutos. Las muestras se dejaron sedimentar con el fin de separar las emulsiones de acetato de etilo-agua. Se analizaron los extractos de cultivo de acetato de etilo en una cromatografía de gas/espectro de masas de Hewlett-Packard 6890 (GC/MS). El auto-inyector de tecnología LEAP se programó para extender la aguja de muestreo hacia la capa de acetato de etilo de la mezcla de dos fases. Se separó una muestra de 1 µL en la GC utilizando una columna de DB-5 (disponible de, por ejemplo, Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, Calif.) y gas portador de helio. El ciclo del horno para cada muestra fue de 80°C durante dos minutos, incrementando la temperatura a 30°C/minuto a una temperatura de 160°C, incrementando la temperatura a 3°C/min a 170°C, incrementando la temperatura a 50°C/minuto a 300°C, y un mantenimiento a 300°C durante dos minutos. Las muestras resueltas se analizaron a través de un detector selectivo masivo modelo 5973 de Hewlett-Packard que verificó los iones 189 y 204 m/z. Los espectros de masas previos demostraron que el producto amorfa- 4,11-dieno-sintasa fue amorfadieno y que el amorfadieno tuvo un tiempo de retención de 7.9 minutos utilizando este protocolo GC. Ya que no estuvieron disponibles estándares puros de amorfa-4, 11 -dieno, las concentraciones deben ser cuantificadas en términos de equivalencia de cariofileno. Una curva estándar para el cariofileno fue determinada previamente, basándose en un estándar puro de Sigma (St. Louis, Mo,). La concentración de amorfa-4,11-dieno se basó en la abundancia relativa de 189 y 204 m/z iones a la abundancia del total de iones en el espectro de masas de los dos compuestos.

Medición de 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) Los niveles de 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) intracelular se determinaron separando células E. coli del medio de crecimiento, deteniendo el metabolismo celular y extrayendo HMGCoA de células con ácido tricloroacético (TCA), y midiendo las concentraciones de HMG-CoA a través de Cromatografía de Líquido/Espectrómetro de Masas (LC/MS). Con el fin de detener rápidamente el metabolismo celular y separar las células del medio de cultivo, se empleo la extracción de TCA en capas. Antes de muestrear el cultivo de célula, se preparó un tubo de ensayo con TCA en capas y aceite de silicón. En un tubo de Falcón de 15 ml (Fischer Scientific), se agregaron 500 µl de ácido tricloroacético al 10% en óxido de deuterio (ambos de Sigma-Adrich) al fondo del tubo seguido por una capa de 2 ml de aceite de silicón (AR200 por Fluka).

Los tubos de ensayo preparados se fijaron en un baño de hielo/agua para permitir que ia capa de aceite de silicón se hiciera más viscosa con el fin de evitar la inversión de la capa cuando se hiciera el muestreo. Se agregaron cuidadosamente 10 ml del cultivo de células a un tubo de ensayo de 15 ml por arriba de la capa de aceite de silicón. Los tubos de ensayo se centrifugaron rápidamente a 4°C a una velocidad superior utilizando una centrifuga Alegra durante 3 minutos. Durante este tiempo, la fuerza centrifuga movió las células a través de la capa de aceite de silicón y hacia la capa de TCA, separando así las células del medio de cultivo y simultáneamente Usando las células y deteniendo el metabolismo. Después de la rotación de las células, la capa del medio de cultivo se removió a través de aspiración. Después, la capa de TCA se transfirió a un tubo de centrifuga de 2 ml y se neutralizó con 1 ml de 0.5 M de tri-n-octil-amina en 1 ,1 ,2-tricloro-1 ,2,2-trifluoroetano (ambos de Aldrich). La capa acuosa se removió, se filtro y se analizó a través de LC/MS.

El extracto de TCA acuoso se analizó en una LC/MS de Hewlett-Packard 1100. Se separó una muestra de 50 µL en una columna de HPLC de fase inversa C-18 (Varian) utilizando un sistema de solvente de gradiente de dos componentes. El solvente A fue 100 mM de regulador de pH de acetato de amonio a un pH de 6 y el solvente B fue 70% de 100 mM de regulador de pH de acetato de amonio y 30% de acetonitrilo. La columna de HPLC se equilibró en cada operación con 8% del solvente B (92% del solvente A) durante 10 minutos. El perfil del gradiente fue 8% del solvente B en el tiempo de 0 minutos a 100% del solvente B en el tiempo de 15 minutos e isocrática a 100% del solvente B hasta 28 minutos. Las muestras de HMG-CoA resueltas se analizaron a través de un detector selectivo masivo que verificó iones 912 m/z. El tiempo de retención y el espectro de masas de HMG-CoA extraído se confirmó utilizando HMG-CoA comercial (Sigma).

Medición de mevalonato (ácido mevalónico) La concentración de mevalonato (ácido mevalónico) en cultivos de E. coli diseñados por ingeniería se determinó a través de análisis de GC/MS. Se mezclaron 560 µL de cultivo de E. coli con 140 µL de 300 mM de HCl en un frasco de vidrio de GC para convertir el mevalonato de la forma acida a lactona, de ácido mevalóníco a lactona de ácido mevalónico. Se agregaron 700 µL de acetato de etilo a cada frasco y después las muestras se agitaron a una velocidad máxima en un mezclador de Fisher Vortex Genie 2 (Fischer Scientific) durante tres minutos. Se analizaron los extractos de acetato de etilo del cultivo acidificado en una cromatografía de gas/espectrómetro de masas (GC/MS) de Hewlett-Packard 6890. El auto-inyector de tecnología LEAP se programó para extender la aguja de muestreo hacía la capa de acetato de etilo de la mezcla de dos fases. Se separo una muestra de 1 µL en la GC utilizando una columna de DB-5 (disponible de, por ejemplo, Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, Calif.) y gas portador de helio. El ciclo de horno de cada muestra se modificó a partir de la versión del método de B. H. Woollen et al. (B .H. Woollen et al. J Chromatogr. B. 760 (2001) 179-184). El ciclo de horno para cada muestra fue de 75°C durante dos minutos, incrementando la temperatura a 20°C/minuto a una temperatura de 150°C, incrementando la temperatura a 15°C/minuto a 250°C, incrementando la temperatura a 50°C/minuto a 300°C, y un mantenimiento a 300°C durante dos minutos. Las muestras resueltas se analizaron a través de un detector selectivo masivo de Hewlett-Packard modelo 5973 que verificó el ion 71 m/z. El tiempo de retención y el espectro de masas de lactona de ácido mevalónico extraída se confirmó utilizando DL-lactona de ácido mevalónico (Sigma).

RESULTADOS La producción de isoprenoide en E. coli diseñado por ingeniería para contener una trayectoria de mevalonato exógeno por lo regular se limita por la producción de mevalonato. Los incrementos en la producción de mevalonato pueden conducir a incrementos en el ¡soprenoide que la célula huésped está diseñada por ingeniería para producir. El alivio de toxicidad de HMG-CoA que conduce a la producción incrementada de mevalonato por lo tanto conduce a la producción incrementada de isoprenoide. Para mejorar la producción de isoprenoide a partir de la trayectoria de mevalonato en E. coli, los pasos limitantes de la trayectoria heteróloga tuvieron que ser determinados. Para hacer esto, se transformaron los plásmidos pMevT, pMBIS, y pADS, como se describe anteriormente, a una cepa individual de E. coli DH10B a través de métodos estándares. Los transformantes se seleccionaron en placas de agar LB conteniendo 50 µg/ml de carbenicilina, 5 µg/ml tetraciclina, y 25 µg/ml cloranfenicol. Una colonia individual de la cepa se transfirió de la placa de agar LB a 5 ml de medio líquido LB conteniendo los mismos antibióticos. Este cultivo de semilla se incubo agitando a 37°C hasta que el crecimiento alcanzó una fase estacionaria. La inducción de la expresión de ambos operones y ADS con IPTG permitió la producción de amorfadieno a partir de un suministro de E. coli de acetil-CoA. Para determinar que operon limitó la producción de amorfadieno, se incubó E. coii conteniendo los tres plásmidos en matraces de agitación múltiples de medios líquidos consistiendo del medio LB y 1% (p/vol) de glicerol y antibióticos apropiados. Los matraces de agitación se inocularon a partir del cultivo de semilla de 5 ml. Los cultivos se incubaron a 37°C con agitación continua. Dos horas después de la inoculación, se agregaron 0.5 mM IPTG a cada cultivo para inducir la expresión de los operones. Además, se agregaron, 10 mM y 20 mM de mevalonato a diferentes cultivos dos horas después de la inoculación. Los cultivos se incubaron a 37°C con agitación continua. En múltiples puntos del tiempo, se analizaron el crecimiento de célula de la cepa y la producción de amorfadieno. Como se ilustra en la Figura 4, el incremento en la cantidad de mevalonato agregado a los cultivos aumento la producción de amorfadieno a partir de cepas de E. coli expresando los tres operones. Este resultado demuestra que la producción in vivo de mevalonato a través del operon MevT limita la producción del sesquiterpeno, amorfadieno en estos sistemas de prueba. Figura 4. Comparación de producción de amorfadieno en la cepa de E. coli utilizando la trayectoria de mevalonato diseñada por ingeniería [pMevT, pMBIS, pADS] a partir de cultivos con concentraciones variables de mevalonato exógeno. El medio LB con 1% de glicerol se suplemento sin nada de mevalonato (0 mM), 10 mM de mevalonato o 20 mM de mevalonato.

Ejemplo 2: Expresión incrementada del operon MevT a partir de sistemas promotores más fuertes y vectores de plásmido de número de copia más alto da como resultado la inhibición de crecimiento. El siguiente ejemplo demuestra que la sobre-expresión incrementada de la "meta superior" (acetoacetil tiolasa, HMGS, y HMGR) de la trayectoria de mevalonato puede conducir a la inhibición de crecimiento de ia célula huésped modificada. Para incrementar la producción in vivo del mevalonato en E. coli, el operon MevT fue transferido a sistemas de expresión que podrían dar una expresión incrementada de los genes MevT. La E. coli DH10B se transformó con los siguientes plásmidos MevT, listados en orden de expresión en incremento: pMevT y pTrc99A (en donde pMevT y pTrc99A fueron transformados a la misma célula huésped), pBAD33MevT, y pBAD24MevT. Además, los plásmidos de control vacíos correspondientes fueron transformados a E. coli DH10B: pLac33 y pTrc99A (dos plásmidos en el mismo huésped), pBAD33, y pBAD24. pMevT y pLac33 fueron co-transformados con pTrc99A para controlar control pMevT y pLac33 y el promotor PLAC modificado con la copia de LaclQ en pTrc99A. Los transformantes de las cepas que contienen pMevT & pTrc99A, o pLac33 & pTrc99A se seleccionaron en placas de agar LB conteniendo 50 µg/ml de carbenicilina y 50 µg/ml cloranfenicol. Los transformantes de las cepas restantes fueron seleccionados sobre placas de agar LB conteniendo 50 µg/ml de cloranfenicol. Una colonia individual de cada cepa fue transferida de la placa de agar LB a 5 ml del medio líquido LB conteniendo los mismos antibióticos. Este cultivo de semillas se incubó agitando a 37°C hasta que el crecimiento alcanzó una fase estacionaria. Los seis cultivos de semilla se utilizaron para inocular las placas de titulación de 96 cavidades conteniendo el medio LB más 1% (p/vol) de glicerol con antibióticos. Después de 2 horas de agitación continua a 37°C en un lector de placa de microtitulación, las cepas se indujeron ya sea con 0.5 mM de IPTG (para la inducción de pMevT y pLac3%3) o 2 mM arabinosa (para la inducción de pBA.D33MevT, pBAD24MevT, pBAD33, y pBAD24). Después de la inducción, los cultivos se continuaron incubando con agitación continua a 37°C. El crecimiento de célula de cada cultivo de 0.2 mL se midió cada diez minutos a través de un lector de placa de microtitulación. Como se muestra en la Figura 5, la inducción de MevT a partir del promotor PLAc modificado, débil, contenido en pMevT, no ocasionó ningún cambio sustancial en el crecimiento de células, en comparación con los controles de plásmidos vacíos (pLac33/pTrc99A, pBAD33, y pBAD24). Sin embargo, la expresión incrementada del operon MevT a partir del sistema promotor araC-pBAD de pBAD33MevT ocasionó la inhibición de crecimiento. La retención del sistema promotor araC-PBAD pero el incremento del número de copia de plásmido, se incrementó así la expresión total de MevT, como ocurre en pBAD24MevT, y solamente exarcebó el problema de inhibición de crecimiento. Cornos estos datos demuestran, el incremento de la expresión del operon MevT a partir de un plásmido de copia media con un sistema promotor PLAC modificado para un plásmldo de copia media con un sistema promotor araC-PBAD y finalmente a un plásmido de copia alta con un sistema promotor araC-PßAD ocasionó el incremento de toxicidad a las cepas diseñadas por ingeniería.

Figura 5. Efecto del incremento de la expresión del operon MevT en el crecimiento de célula de E. coli. La comparación de E.coli que aloja los plásmidos vacíos pLac33 + pTrc99A, pBad33, y pBAD24 con E. coli que aloja operones MevT, pMevT + pTrc99A, pBAD33MevT, y pBAD24MevT (listados en orden de expresión de incremento).

Ejemplo 3: La expresión incrementada de HMGS ocasiona la inhibición de crecimiento, pero la expresión incrementada de HMGS y HMGR juntas no lo hace. Ei siguiente ejemplo muestra que la inhibición de crecimiento causada por la expresión incrementada de la mitad superior de la trayectoria de mevalonato, como se discute en el Ejemplo 2, se debe a la expresión de HMGS, que cataliza la producción de HMG-CoA. La expresión de HMGR, que cataliza una reacción en donde HMG-CoA es un reactivo, junto con HMGS, según provisto por los métodos de la presente invención evita esta toxicidad. Con el fin de determinar la fuente de toxicidad causada por la expresión incrementada del operon MevT, los genes individuales del operon MevT y sus combinaciones fueron amplificadas y clonadas a vectores de expresión. AtoB se amplificó a partir de pBAD24MevT utilizando protocolos de PCR estándares e iniciadores complementarios a los extremos 5' y 3' del gen. AtoB se clonó en los sitios Xmal-Sa/l de pBAD33, un plásmido de inducción de arabinosa de baja copia, a través de la digestión tanto del vector vacío como del producto de PCR con enzimas de restricción Xmal y Sa/l y ligando con ligasa de ADN T4. El plásmido resultante se denominó pAtoB (SEC ID NO 6). La HMGS se amplificó a partir de pBAD24MevT utilizando protocolos de PCR estándares e iniciadores complementarios a los extremos 5' y 3' del gen. La HMGS se clono en los sitios Xma\-Sal\ de pBAD33, un plásmido de inducción de arabinosa de baja copia, a través de la digestión tanto del vector vacío como del producto de PCR con enzimas de restricción Xmal y Sa/l y ligando con ligasa ADN T4. El plásmido resultante se denomino pHMGS (SEC ID NO 7). La HMGR truncada se amplificó a partir de pBAD24MevT utilizando protocolos de reacción de cadena de polimerasa estándares (PCR) e iniciadores complementarios de los extremos 5' y 3' del gen. La HMGR truncada (tHMGR) se clono en los sitios Xmal-Sa/l de pBAD33, un plásmido de inducción de arabinosa de copia baja y pBAD18 (Guzman et al. (1995) J. Bacteriology 177:4121-4130), un plásmido de inducción de arabinosa de copia media, mediante la digestión tanto de los vectores vacíos como del producto de PCR con las enzimas de restricción Xmal y Sa/l y ligando con ligasa ADN T4. El plásmido de número de copia bajo resultante se denomino pHMGR (SEC ID NO 8), y el plásmido de número de copia medio resultante se denomino pBAD18HMGR (SEC ID NO 9). Un operon conteniendo solamente HMGS y la HMGR truncada se creo amplificando el segmento de dos genes a partir de pBAD24MevT utilizando protocolos de PCR estándares e iniciadores complementarios del extremo 5' de HMGS y el extremo 3' de HMGR.

El fragmento de HMGS y HMGR se clono en el sitio Sa/l de pBAD33, un plásmido de inducción de arabinosa de copia baja, a través de la digestión tanto del vector vacío como del producto de PCR con la enzima de restricción Sa/l y ligando con una ligasa ADN T4. El plásmido resultante se denominó pHMGSR (SEC ID NO 10). Para determinar la causa de inhibición de crecimiento asociada con expresión incrementada del operon MevT, el operon se dividió en componentes individuales. Los plásmidos pAtoB, pHMGS, y pHMGR, expresando cada uno de los genes individuales, y pHMGSR, expresando la combinación de HMGS y HMGR se construyeron como se describió anteriormente. Estos cuatro plásmidos, junto con pBAD33 (control de plásmido vacío) y pBAD33MevT se transfirieron a E. coli DH10B utilizando procedimientos estándares. Los transformantes fueron seleccionados en placas de agar LB conteniendo 50 µg/ml de cloranfenicol. Una colonia individual de cada cepa se transfirió a partir de la placa de agar de LB a 5 ml del medio líquido LB conteniendo el mismo antibiótico. Este cultivo de semilla se incubó agitando a 37°C hasta que el crecimiento alcanzó una fase estacionaría. Los seis cultivos de semilla se utilizaron para inocular placas de microtitulación de 96 cavidades contiendo 0.2 ml de volúmenes del medio LB, 1% (p/vol) de glicerol, y antibióticos. Los cultivos de la placa de 96 cavidades se agitaron continuamente a 37°C en un lector de placa de microtitulación y se indujeron con 2 mM de arabinosa 2 horas después de la inoculación. El crecimiento de célula de cada cultivo se ilustra en la Figura 6. Como se muestra en la Figura 6, en comparación al control del plásmido vacío, la expresión incrementada de afoß y HMGR en E. coli (en cepas que alojan los plásmidos pAtoB y pHMGR, respectivamente), no tienen ningún efecto importante en el crecimiento de célula. Sin embargo, la expresión incrementada de HMGS (en una cepa que aloja pHMGS) ocasiona la inhibición sustancial de crecimiento. De manera interesante, con la co-expresión incrementada tanto de HMGS como de HMGR (como en la cepa que aloja pHMGSR), el crecimiento de células se restableció a aquel del control de plásmido vacío. Este alivio de toxicidad se hace como una hipótesis debido a la habilidad de HMGR para convertir la HMG-CoA que es producida mediante HMGS (y no degradarse a través de ninguna enzima conocida en E. coli) a mevalonato. El mevalonato después se hace pasar a través de la membrana de célula hacia el medio, como se describe en (Campos et al. (2001) Biochem. J. 353:59-67; y Martin et al. (2003) Nature Biotech. 21(7):796-802). Sin embargo, la expresión incrementada de los tres genes en el operon MevT (como en la cepa que aloja pBAD33MevT), otra vez inhibe el crecimiento de célula. Ya que los datos muestran que la expresión incrementada de atoB sola no ocasiona inhibición de crecimiento, la toxicidad causada por la co-expresión incrementada de aroß con HMGS y HMGR probablemente se debe a la producción incrementada de acetoacetil-CoA por atoB. La producción incrementada de acetoacetil-CoA por la expresión incrementada de E. coli ceto tiolasa (atoB) proporciona HMGS con sustrato adicional y dramáticamente incrementa la producción de mevalonato (T. Kuzuyama. (2004) Biosci. Biotechnol. Biochem. 68(4): 931-934). Sin embargo, si la actividad total de HMGS es mayor que aquella de HMGR, HMG-CoA se acumulará y probablemente ocasionará la inhibición de crecimiento. Para verificar estas hipótesis, los intermediarios de la trayectoria de Acyl-CoA fueron medidos en las cepas diseñadas por ingeniería. Figura 6. La comparación de crecimiento, de célula de E. coli expresando genes MevT individuales y sus combinaciones a altos niveles. Crecimiento de célula de E. coli que aloja plásmidos pBad33 (control de plásmido vacío), pAtoB, pHMGR, pHMGS, pHMGSR, y pBAD33MevT.

Ejemplo 4: La toxicidad ocasionada por la expresión incrementada de HMGS se debe a la actividad enzimática incrementada de la proteína y no simplemente a la producción incrementada de la misma proteína. El siguiente ejemplo demuestra que la toxicidad observada en la expresión de HMGS no se debe a la expresión de la enzima, sino que más bien se debe a su actividad, la producción de HMG-CoA a partir de acetoacetil-CoA y acetil-CoA. Es decir, la inhibición de crecimiento observada no se debe al ataque metabólico incurrido a través de la producción de enzima adicional, sino que más bien a través de la acción de la enzima en la célula.

Creación de una HMGS de longitud completa pero catalíticamente inactiva La toxicidad causada por la alta expresión de HMGS de S. cerevisiae sola en E. coli podría deberse a la toxicidad causada por la producción de alto nivel de una proteína heteróloga (B.R. Glíck. (1995) Biotech Advances. 13(12):247-261 ) según opuesto a la actividad metabólica de HMGS. Para diferenciar entre las dos posibilidades, se creo HMGS de longitud completa pero catalíticamente inactiva. El sitio activo de la proteína HMGS de S. cerevisiae de tipo silvestre se determino comparando la secuencia de proteína de HMGS de levadura a la secuencia de sitio activo de varias proteínas de HMGS de mamífero listadas por L.L. Rokosz et al. ((1994) Arch. Biochem. Biophysics. 312(1 ), 1-13). Los residuos de sitio activo de HMGS de S. cerevisiae fueron idénticos a los residuos de aminoácido de sitio activo de las HMG-CoA sintasas de mamífero.

Rokosz et al. ((1994) supra) demostraron que el cambio del aminoácido de cisteína catalítica de HMG-CoA sintasa humana a una alanina creo una proteína HMG-CoA sintasa de longitud completa que fue catalíticamente inactiva. Por consiguiente, el aminoácido cisterna catalítica del sitio activo de HMGS de S. cervisiae en pBAD33MevT se reemplazó con un aminoácido alanita utilizando mutagénesis dirigida al sitio (QuickChange Site-directed mutagénesis kit, Stratagene). La cisteína en la posición 159 del aminoácido al mutante alanina de HMGS de levadura, denominado HMGS(C159A), se verificó a través de secuencia de ADN en el operon completo. El plásmido pBad33MevT conteniendo el mutante HMGS(C159A) se denominó pBAD33MevT(C159A) (SEC ID NO 11). La alta expresión de pBAD33MevT(C159A) en E. coli DH10B no produjo ningún mevalonato detectable según medido a través de MS en grupo de LC (espectrometría de masas en grupo con cromatografía de líquido), o MHG-CoA, según medido a través de cromatografía de líquido-espectometría de masas. Este resultado permite que el mutante HMGS(C159A) también sea catalíticamente inactivo. Para construir un plásmido que exprese HMG-CoA sintasa mutante sola, se amplificó HMGS(C159A) a partir de pBAD33MevT(C159A) utilizando protocolos de PCR estándares e iniciadores complementarios a los extremos 5' y 3' del gen. El gen HMGS(C159A) se clonó en los sitios Xmal-Sa/l de pBAD33, un plásmido de inducción de arabinosa de número de copia bajo, a través de la digestión tanto del vector vacío como del producto de PCR con enzimas de restricción Xmal y Sa/l y ligando con ligasa ADN T4. El plásmido resultante se denominó pHMGS(C159A) (SEC ID NO 12).

Determinación de la causa de la inhibición de crecimiento Para determinar por qué la alta expresión de HMGS en E. coli ocasiona la inhibición de crecimiento, el efecto de la alta expresión de la HMGS de tipo silvestre se comparó con el efecto de la alta expresión de HMGS de longitud completa, catalíticamente inactiva, HMGS(C159A). Los plásmidos pBAD33 (el control de plásmido vacío), pHMGS, pHMGS(C159A), pBAD33MevT y pBAD33MevT(C159A) se transformaron a E. coli DH10B utilizando procedimientos estándares. Los transformantes fueron seleccionados en placas de agar LB conteniendo 50 µg/ml de cloranfenicol. Una colonia individual de cada cepa fue transferida de la placa de agar LB a 5 ml del medio líquido LB conteniendo el mismo antibiótico. Este cultivo de semillas se incubó con agitación a 37°C hasta que el crecimiento alcanzo una fase estacionaría. Los cinco diferentes cultivos de semillas se utilizaron para inocular placas de microtitulación de 96 cavidades conteniendo 0.2 ml de volúmenes de medio LB, 1% (p/vol) de glicerol, y antibióticos. Los cultivos de placa de 96 cavidades se agitaron continuamente a 37°C en un lector de placa de microtitulación y se indujeron con 2 mM de arabinosa 2 horas después de la inoculación. El crecimiento de célula de cada cultivo se ilustra en la Figura 7. Como se ve en la Figura 7, en comparación con el control (cepa que aloja pBAD33), la alta expresión de HMGS en E. coli (en una cepa que aloja pHMGS) ocasionó la inhibición de crecimiento, mientras que la alta expresión del mutante HMGS(C159A) en E. coli (en cepas que alojan pHMGS(C159A)) no lo hace. Ya que la única diferencia entre pHMGS y pHMGS(C159A) es la conversión de la cisteína catalítica a una analina, este resultado demuestra que la toxicidad causada por la alta expresión de HMGS de tipo silvestre se debe a la actividad enzimática de la proteína y no meramente de la inhibición de crecimiento que puede ser causada por la alta expresión de proteínas heterólogas (B.R. Glick. (1995) Biotech Advances. 13(12): 247- 261). Además, E. coli que expresa el operon MevT inactivo a altos niveles (en cepas que alojan pBAD33MevT(C159A)) delinea el mismo perfil de crecimiento como el control, mientras que la alta expresión del operon MevT funcional (en la cepa que aloja pBAD33MevT) inhibe el crecimiento de célula. Este resultado demuestra que la inhibición de crecimiento causada por la alta expresión de todos los genes en el operon MevT no se debe a la inhibición de crecimiento causada por la alta expresión de proteínas heterólogas. Además, la Figura 7 demuestra que la toxicidad a partir de la alta expresión del operon MevT, causada por la acumulación intracelular de HMG-CoA (ver Ejemplos 5 y 6, anteriores), puede ser aliviada reduciendo la actividad de HMGS. Aunque la actividad de HMGS se reduce a cero en este ejemplo, existen niveles reducidos de actividad de HMGS que aliviarán la inhibición de crecimiento mientras siguen permitiendo la producción de mevalonato. La alta expresión de una trayectoria equilibrada en actividad enzimática da como resultado la producción incrementada de mevalonato por volumen de cultivo de célula. Figura 7. Efecto de alta expresión de HMGS catalíticamente inactiva en crecimiento de células de E. coli. Comparación de crecimiento de célula de E. coli que aloja plásmidos pBad33 (control de plásmido vacío), pBAD33MevT, pBAD33MevT(C159A) (contiene HMGS inactivo), pHMGS, y pHMGS(C159A) (contiene HMGS inactivo).

Ejemplo 5: Inhibición de crecimiento de E. coli sobre-expresando el operon MevT se debe a la acumulación intracelular de HMG-CoA. Los siguientes ejemplos demuestran que la inhibición de crecimiento vista después de expresar el operon MevT se debe a la acumulación de HMG-CoA. Las cepas de E. coli DH10B que alojan plásmidos pBAD33 (el control de plásmido vacío), pHMGS, pHMGSR, y pBAD33MevT se desarrollaron durante la noche a 37°C en 5 ml del medio LB y antibióticos bajo condiciones de no inducción. Los cultivos nocturnos se utilizaron para inocular matraces de agitación defeccionados conteniendo 100 ml del medio LB, 1% (p/vol) de glicerol, y antibióticos. Los cultivos se agitaron continuamente a 37°C y se indujeron con 2 mM arabinosa 2 horas después de la inoculación. Los niveles intracelulares de HMG-CoA en cada cepa y el crecimiento de célula de cada cultivo se midieron, y los resultados se muestran en la Figura 8 y Figura 9, respectivamente. Como se muestra en las Figuras 8 y 9, en comparación al control de vector vacío (la cepa que aloja pBAD33), la alta expresión de HMGS (en la cepa que aloja pHMGS) ocasiona la acumulación de HMG-CoA y la inhibición de crecimiento. De manera interesante, la expresión de alto nivel tanto de HMGS y HMGR en conjunto (en la cepa que aloja pHMGSR) no ocasionó ninguna inhibición de crecimiento y no acumuló ningún nivel detectable de HMG-CoA, y generalmente fue similar al control en estos aspectos. Sin embargo, la alta expresión de atoB, HMGS y HMGR junto con el operon MevT en E. coli (en la cepa que aloja pBAD33MevT) ocasionó una inhibición de crecimiento y la acumulación de HMG-CoA posteriormente. E. coli naturalmente produce acetoacetíl-CoA a un nivel bajo a partir de la expresión nativa de atoB y la degradación de ácidos grasos de cadena corta. Los resultados mostrados en las Figuras 8 y 9 demuestran que la alta expresión de HMGS sola en E. coli produce HMG-CoA a partir del suministro nativo de acetoacetil-CoA. Ya que HMG-CoA no es nativo para E. coli, no se sabe que se ha accionado por alguna enzima en E. coli y no cruzará la membrana de célula; por lo tanto, HMG-CoA se acumula en la célula. A cierto nivel, HMG-CoA inhibe los procesos celulares. Sin embargo, la alta expresión de HMGS y HMGR en conjunto permite que HMG-CoA sea producida a partir del suministro nativo de acetoacetil-CoA mediante HMGS que será convertido a mevaionato. El mevalonato pasará a través de la membrana celular y se acumulará en el medio. Además, las altas concentraciones extracelulares de mevalonato parecen no tener ningún efecto importante sobre el crecimiento de E. coli (Martin et al. (2003) supra. Figura 8. Niveles de HMG-CoA intracelular de cepas de E. coli que expresan construcciones de trayectoria de mevalonato.

Acumulación de HMG-CoA en E. coli que aloja pBad33 (control de plásmido vacío), pHMGS, pHMGSR, y pBAD33MevT. Figura 9. Crecimiento de célula en cepas de E. coli expresan construcciones de trayectoria de mevalonato. Comparación del crecimiento de célula de E. coli que aloja plásmidos pBad33 (control de plásmido vacío), pHMGS, pHMGSR, y pBAD33MevT. La alta expresión de atoB, junto con HMGS y HMGR, proporciona un sustrato incrementado para HMGS y sustancialmente eleva la producción de mevalonato (T. Kuzuyama. (2004) Biosci. Biotechnol. Biochem. 68(4): 931-934); sin embargo, sin actividad total de HMGS es mayor que aquella de HMGR, el intermediario HMG-CoA otra vez se acumulará y ocasionará la inhibición de crecimiento. De esta manera, en una modalidad, la presente invención proporciona un método para aliviar la toxicidad de inhibición de crecimiento de la acumulación de HMG CoA en una célula, dicho método comprende modificar la célula para incrementar la expresión de HMGR, con relación a HMGS. En una modalidad, la actividad de HMGR se incrementa a un nivel aproximadamente igual a la actividad de HMGS. En otras modalidades, la actividad de HMGR se incrementó a niveles de 1.5, 2, 5, y 10 veces la actividad de HMGS.

Ejemplo 6: La expresión incrementada de HMGR alivia la inhibición de crecimiento causada por la alta expresión de MevT, reduce la acumulación de HMG-CoA, e incrementa la producción de mevalonato. El siguiente ejemplo muestra como se puede incrementar la producción de mevalonato y superar el problema de toxicidad causado por la acumulación de HMG-CoA debido a la sobre-expresión de HMGR. Para demostrar que la acumulación intracelular de HMG-CoA fue tóxica para E. coli y comienza a optimizar la trayectoria para corregir este problema, la actividad de HMGR se incrementó en cepas que expresan el operon MevT a altos niveles. E. coli DH10B se transformó con las siguientes combinaciones de dos plásmidos para crear tres sistemas de plásmido doble: pBAD33 & pBAD18 (cepa de control de plásmido vacío), pBAD33MevT & pBAD18, y pBAD33MevT & pBAD18HMGR. Los transformantes se seleccionaron en placas de agar LB conteniendo 50 µg/ml de carbenicilina y 50 µg/ml de cloranfenicol. Una capa individual de cada cepa se transfirió de la capa de agar LB a 5 ml del medio líquido LB conteniendo el mismo antibiótico. Este cultivo de semilla se incubó agitando a 37°C hasta que el crecimiento alcanzó una fase estacionaría. Los tres diferentes cultivos de semilla se utilizaron para inocular matraces de agitación reflexionados conteniendo 100 ml del medio LB, 1% (p/vol) de glicerol, y antibióticos. Los cultivos se agitaron continuamente a 37°C y se indujeron con 2 mM de arabínosa 2 horas después de la inoculación. El crecimiento de célula de cada cultivo, los niveles intracelulares de HMG-CoA en cada cepa y el mevalonato producido en cada cultivo se midieron a través de los métodos descritos en el Ejemplo 1. Los resultados para los tres sistemas de plásmido doble se ilustran en las Figuras 10, 11 y 12, respectivamente. Como se muestra en las Figuras 10 y 11, en comparación con la cepa de control (la cepa que aloja pBAD33 y pBAD18), la alta expresión de MevT en la cepa que aloja pBAD33MevT y pBAD18 otra vez ocasionó la inhibición de crecimiento y la acumulación de HMGCoA. Sin embargo, la expresión incrementada de HMGR en una cepa que expresa MevT a un alto nivel (la cepa que aloja pBAD33MevT y pBAD18HMGR), alivia la inhibición de crecimiento en parte y reduce la acumulación de HMG-CoA. Además, como se muestra en la Figura 12, la expresión incrementada de HMGR conduce a la producción incrementada de mevalonato. El incremento de la expresión de HMGR es solamente un método ilustrativo de la invención para incrementar la actividad de HMGR en células E. coli. Otros métodos de la invención para incrementar la actividad de HMGR podrían conducir a resultados similares. La expresión de MBIS y ADS en la cepa con actividad incrementada de HMGR y la alta expresión de MevT, pueden dar como resultado la producción incrementada de amorfadieno. Además, el incremento de la actividad de HMGR y el alivio de la toxicidad causada por la alta expresión de MevT pueden incrementar la producción de cualquier isoprenoide dado de que una trayectoria enzimática a partir de mevalonato hacía el ¡soprenoide de interés es co-expresada.

Figura 10. Efecto de expresión incrementada de HMGR sobre el crecimiento de célula de E. coli que expresa el operon MevT. El crecimiento de células de E. coli que aloja los plásmidos pBad33 + pBad18 (control de vector vacío), pBad33MevT + pBad18, y pBad33MevT+pBad18HMGR. Figura 11. Efecto de expresión incrementada de HMGR sobre los niveles de HMG-CoA de E. coli que expresa el operon MevT.

Niveles de HMG-CoA intracelulares de E. coli que alojan los plásmidos pBad33 + pBad18 (control de vector vacío), pBad33MevT + pBad18, y pBad33MevT + pBa18HMGR. Figura 12. Efecto de la expresión incrementada de HMGR sobre la producción de mevalonato de E. coli que expresa el operon MevT. Niveles de mevalonato en cultivos de E. coli que aloja plásmidos pBad33 + pBad18 (control de vector de vacío), pBad33MevT+pBad18, y pBad33MevT + pBad18HMGR.

Ejemplo 7: Aplicación de un método de la invención a una célula huésped que produce mevalonato El ejemplo de la presente ilustra cómo los métodos de la invención pueden ser aplicados a cualquier cepa huésped de producción de mevalonato en donde los niveles de HMG-CoA se acumulan a niveles tóxicos. En general, una célula huésped es modificada en cierta forma en un intento para obtener niveles más altos de ¡soprenoide o precursor de isoprenoide (por ejemplo mevalonato, IPP, un poliprenil difosfato, y similares), para generar una célula "padre". Las modificaciones adecuadas incluyen, por ejemplo, modificaciones que incrementan la modificación intracelular de acetil-CoA, modificaciones que incrementan el nivel de la actividad de acetoacetil-CoA tiolasa, y modificaciones que incrementan el nivel de actividad de HMGS. Estas modificaciones podrían ser efectuadas a través de alteraciones genéticas o químicas o tratamientos destinados a modificar niveles de transcripción, niveles de enzima, o actividad específica de enzima. Las características de crecimiento de la célula huésped de origen se observan, y se comparan con características de crecimiento de la célula huésped no modificada. Si las células huésped de origen se desarrollan significativamente más lento que la célula huésped no modificada, entonces la inhibición de crecimiento observada puede ser debida a la toxicidad por HMG-CoA, y los niveles resultantes de mevalonato o producción de isoprenoide podrían ser sub-óptimos. Los niveles de HMG-CoA en la célula huésped y la célula padre se determinar a través de extracción establecida y técnicas de LC-MS (ver Ejemplo 1) para verificar la razón pronosticada para la inhibición de crecimiento. Si el nivel de HMG-CoA por biomasa unitaria (biomasa medida como peso seco de célula o midiendo la densidad óptica a, por ejemplo 600 nm) es mayor en la célula huésped modificada, entonces esas mediciones soportan la medición de que la toxicidad es debida a la acumulación de HMG-CoA, y si es así, la reducción de los niveles dentro de la célula servirán para aliviar esta toxicidad e incrementar el mevalonato total, IPP, o producción de ¡soprenoide. Aunque la medición de niveles de HMGCoA en una célula de producción de HMG-CoA que está inhibida en su crecimiento no es un paso requerido en un método de la invención para aliviar la toxicidad inducida por la acumulación de HMG-CoA, dichas mediciones pueden ser conducidas de vez en cuando en ciertas modalidades. La toxicidad por HMG-CoA y la producción mejorada de ¡soprenoide o precursor de isoprenoide pueden ser aliviadas a través de la práctica de la presente invención. Por ejemplo, la célula huésped de origen puede ser genéticamente modificada en un número de formas, dando como resultado una célula huésped genéticamente modificada que produce un nivel incrementado de HMGR comparado con la célula huésped de origen. Por ejemplo, el número de copia de un vector que comprende una secuencia de nucleótido que codifica HMGR se incrementa dentro de la célula huésped de origen, por ejemplo, modificando genéticamente la célula huésped de origen con un plásmído de número de copia alto que expresa HMGR bajo el control de un promotor. Como otro ejemplo, el nivel de ARNm de HMGR en la célula padre se incrementa, por ejemplo, modificando genéticamente la célula padre con una construcción que comprende una secuencia de nucleótido que codifica HMGR que está bajo el control de un promotor más fuerte. Como otro ejemplo, el sitio de unión del ribosoma corriente arriba de hmgR en la célula huésped de origen se modifica para generar una célula huésped genéticamente modificada que produce un nivel incrementado de HMGR. Al observar las características de crecimiento de la célula huésped genéticamente modificada y al compararlas con las características de crecimiento de la célula huésped de origen, se puede determinar que el método ha sido exitoso cuando la célula huésped genéticamente modificada muestra menos o ninguna de la inhibición de crecimiento del origen. El alivio de la toxicidad por HMG-CoA será observado como un incremento en la velocidad de crecimiento y/o incremento en la densidad de célula final del cultivo. Como otro ejemplo, una célula huésped de origen es generada incrementando ei nivel de HMG-CoA en una célula que tiene una trayectoria de mevalonato endógena. Por ejemplo, el nivel de acetil-CoA ¡ntracelular dentro de una célula de levadura, tal como Saccharomyces cerevisiae, al introducir mutaciones en (modificando genéticamente) la célula de levadura, creando una célula huésped de origen o "padre". Por ejemplo, el nivel de acetil-CoA intracelular se incrementa introduciendo una mutación dentro del gen piruvato-decarboxilasa en el cromosoma. Esto se logra utilizando una interrupción de gen de un solo paso (Rothstein, RJ. (1983) Methods Enzymol. 101 202-211 One-step gen dísruption en yeast) para romper el piruvato-decarboxilasa. Similarmente, se generan alelos inactivos o parcialmente activos de piruvato-decarboxilasa a través de transformación de ADN integrativo en levadura (Rothstein, R. (1991) Methods Enzymol. 194 281-301). La interrupción a base de PCR de piruvato-decarboxilasa se logra utilizando un ataque fuerte anterior en una cepa diferente de Saccharomyces cerevisiae, tal como la cepa S288C (Reid et al. Yeast. 2002 Mar 15; 19(4):319-28., Mehdi, K.

Yeast 2002 Jun 30; 19(9):803). Dichas alteraciones reducen el flujo de piruvato a etanol a través de acetaldehído e indirectamente se incrementan los niveles de acetil-coA. El incremento en el nivel de acetil-CoA intracelular puede, a su vez, dar como resultado un incremento en los niveles de acetilacetil-CoA, los cuales a su vez, pueden conducir a un incremento en los niveles de HMG-CoA intracelular. Para lograr niveles incrementados de HMG-CoA, una célula huésped puede ser genéticamente modificada en forma adicional para incrementar el nivel de la actividad de acetoacetil CoA tiolasa y/o el nivel de la actividad de HMGS dentro de la célula para incrementar la conversión de acetil-CoA dentro de HMG-CoA, generando una célula huésped de levadura de origen que exhibe altos niveles intracelulares de HMG-CoA. Cualquier vector diseñado para replicación y selección en levadura y que incorpora un promotor activo en levadura, típicamente también incluyendo un termínador de levadura correspondiente abajo del promotor, será utilizado para expresar genes en levadura. Ejemplos de replicones de levadura incluyen los replicones 2µ o CEN tales como CEN6/ARSH4; ejemplos de marcadores seleccionables incluyen los marcadores HIS3, TRP1, LEU2 o URA3; ejemplos de promotores de levadura incluyen los promotores CYC1, ADH, TEF o GPD; un ejemplo de un terminador de levadura es el terminador CYC1 de levadura. Ejemplos de vectores de expresión se proporcionan en Mumberg D, Muller R, Funk M., Gen. 1995 Apr 14;156(1 ): 119-22. Una variedad de vectores de levadura está disponible para la expresión controlada de proteínas heterólogas en diferentes fondos genéticos. Otro ejemplo de un vector de expresión de levadura es pYES2 (Invitrogen Corporation). Las características de crecimiento de la célula de levadura huésped de origen para la célula de levadura huésped no modificada se comparan desarrollando cada célula en forma separada bajo condiciones estándares en un medio de crecimiento estándar con selección para el plásmido que expresa el gen de interés. Los ejemplos de medios de levadura incluyen peptona-dextrosa de extracto de levadura (YPD), medio mínimo de dextrosa sintética (SD), medio mínimo suplementado (SMM) y medio completo sintético (SC o CM) (Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A laboratory manual. ISBN 0-87969-577-3). Si la velocidad de crecimiento de la célula huésped de origen es significativamente más lenta que la velocidad de crecimiento de la célula de levadura huésped no modificada, la acumulación de HMG-CoA puede ser la causa de esta toxicidad/inhibición de crecimiento. Para superar la inhibición de crecimiento de célula inducida por la acumulación de HMG-CoA, la célula de levadura de origen es genéticamente modificada, de acuerdo con los métodos de la invención. Por ejemplo, una célula huésped de levadura de origen es genéticamente modificada reemplazando el gen HMGR endógeno en el cromosoma de S. cerevisiae con un ácido nucleico que codifica HMGR que carece de la región reguladora N-terminal de la enzima (Donald et al. Appl Environ Microbiol. 1997 Sep;63(9):3341-4.

Polakowski et al. Appl Microbiol Biotechnol. 1998 Jan;49(1 ):66-71 ), incrementando así el nivel de actividad de HMG-CoA dentro de la célula. Si una comparación de las características de crecimiento de la célula de levadura huésped genéticamente modificada con aquellas de la célula de levadura huésped de origen muestra un incremento importante en la velocidad de crecimiento, el incremento en la velocidad de crecimiento puede ser atribuido a una reducción en los niveles de HMG-CoA intracelulares tóxicos. Como resultado, los niveles totales de isoprenoide o precursor de isoprenoide reproducido por la cepa huésped genéticamente modificada se incrementarán, comparado con los niveles producidos por la cepa huésped de origen. Por ejemplo, las S. cerevisiae de origen y genéticamente modifica son diseñadas por ingeniería para expresar amorfadieno-sintasa. Por ejemplo, el gen para amorfadieno-sintasa (ya sea el gen nativo Artemisia annua, el gen optimizado del codón de E.coii (Martin et al, 2003) o un gen optimizado de codón de levadura) se clonó en el sitio de clonación múltiple de pYES2 de manera que el gen amorfadieno-sintasa es transcrito bajo el control del promotor GAL1. Una célula de levadura huésped es transformada con el plásmido recombinante, seleccionando para auxotrofía de uracilo. Después del crecimiento en un medio carente de uracilo y glucosa, la expresión de amorfadieno-sintasa se indujo a través de la inducción de galactosa. El nivel de HMG-CoA intracelular se incrementó en una célula de levadura de producción de amorfadíeno-sintasa introduciendo una o más mutaciones, como se describe anteriormente, generando una célula de levadura huésped de origen.

La célula de levadura huésped de origen es genéticamente modificada, como se describe antes, por ejemplo para incrementar el nivel de HMGR en la célula. La producción del amorfadieno en cultivos de célula de levadura huésped de origen y la célula de levadura huésped genéticamente modificada se compararon; ei nivel de amorfadieno producido por la célula huésped genéticamente modificada es mayor que el nivel de amorfadieno producido por la célula huésped de origen. Los niveles de amorfadieno son fácilmente medidos utilizando el análisis de GC-MS. Como otro ejemplo, la toxicidad de HMG-CoA se observó en una célula de E. coli de origen diseñada por ingeniería para expresar la trayectoria de mevalonato. La toxicidad de HMG-CoA se alivió modificando genéticamente la célula de origen, por ejemplo, para incrementar el nivel de HMGR en la célula. Este ejemplo es resaltado en los ejemplos 1-6, anteriores. Un experto en la técnica apreciará que el método puede ser realizado con cualquier célula huésped o con cualquier construcción ahora en vista de la presente descripción.

Aunque la presente invención ha sido descrita con referencia a sus modalidades específicas, se debe entender por aquellos expertos en la técnica que se pueden hacer varios cambios y se pueden sustituir equivalentes sin apartarse del espíritu verdadero y alcance de la invención. Además, se pueden hacer muchas modificaciones para adaptar una situación particular, material, composición de materia, procedimiento, paso o pasos de procedimiento, al objetivo, espíritu y alcance de la presente invención. Todas estas modificaciones pretenden estar dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para reducir la toxicidad de HMG-CoA y mejorar la producción de un isoprenoide o precursor de isoprenoide a través de una trayectoria de mevalonato en una célula huésped, en donde dicha célula huésped produce el isoprenoide o precursor de isoprenoide a través de una trayectoria de mevalonato, el método comprende: (a) modificar genéticamente dicha célula huésped para contener uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican una o más enzimas que, cuando se producen en la célula, reducen la inhibición de crecimiento inducida por acumulación de HMG-CoA, según comparado con una célula huésped de origen de control que no es genéticamente modificada con dichos ácidos nucleicos heterólogos; y (b) cultivar dicha célula huésped genéticamente modificada bajo condiciones de manera que el nivel de isoprenoide o precursor de isoprenoide producido en la célula huésped genéticamente modificada es mayor que el nivel de isoprenoide o precursor de isoprenoide producido en la célula huésped de origen de control. 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la una o más enzimas comprenden una enzima con actividad de HMGCoA reductasa (HMGR). 3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el nivel de HMGR producido en la célula huésped genéticamente modificada es por lo menos aproximadamente 10% mayor que en la célula huésped de control. 4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la secuencia de control que codifica HMGR está operablemente enlazada a un promotor fuerte. 5. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido que codifica HMGR es un plásmido de número de copia alto. 6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la una o más enzimas comprenden HMG-CoA sintasa (HMGS). 7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el nivel de HMGS producido en la célula huésped genéticamente modificada es de por lo menos aproximadamente 10% menor que en la célula huésped de control. 8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido que codifica HMGS es un plásmido de número de copia bajo. 9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la célula huésped de origen es una célula que normalmente produce el ¡soprenoide o precursor de isoprenoide a través de una trayectoria de mevalonato. 10. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la célula huésped de origen es una célula que normalmente no produce el isoprenoide o precursor de ¡soprenoide a través de una trayectoria de mevalonato, y en donde la célula huésped de origen ha sido genéticamente modificada para producir el ¡soprenoide o precursor de isoprenoide a través de una trayectoria de mevalonato. 11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la célula huésped de origen ha sido genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos qué comprenden secuencias de nucleótido que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, hidroximetiglutaril- CoA sintasa, hidroximetilgutaril-CoA reductasa, mevalonato cinasa, fosfomevalonato cinasa, mevalonato pirofosfato decarboxilasa, ¡sopentenil pirofosfato isomerasa, y un prenil transferasa. 12. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el precursor de isoprenoide es difosfato de isopentenilo (IPP), y el nivel de IPP producido en la célula huésped genéticamente modificada es por lo menos aproximadamente 10% mayor que el nivel de IPP producido en la célula huésped de origen de control. 1.3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el precursor de isoprenoide es mevalonato, y el nivel de mevalonato producido en la célula huésped genéticamente modificada es por lo menos aproximadamente 10% mayor que el nivel de mevalonato producido en la célula huésped de origen de control. 14. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto isoprenoide es un poüterpeno. 15. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto isoprenoide es un diterpeno. 16. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto isoprenoide es un monoterpeno. 17. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto isoprenoide es un triterpeno. 18. El método de acuerdo con la reivindicación, en donde el compuesto isoprenoide es un sesquiterpeno. 19. Un método para sintetizar pirosfofato de isopentenilo (IPP) a través de una trayectoria de mevalonato en una célula huésped, el método comprende cultivar una célula huésped genéticamente modificada en un medio estable, en donde la célula huésped genéticamente modificada produce IPP a través de una trayectoria de mevalonato, en donde la célula huésped genéticamente modificada comprende una o más mutaciones en un ácido nucleico endógeno que comprende una secuencia de nucleótido que codifica una o más enzimas, que cuando se producen en la célula, reducen la inhibición de crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA comparado con una célula huésped de origen de control que no está genéticamente modificada para comprender la una o más mutaciones y que exhibe inhibición de crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA, y en donde el nivel de IPP producido en la célula huésped genéticamente modificada es mayor que el nivel de IPP producido en la célula huésped de origen de control. 20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde el ácido nucleico endógeno comprende una secuencia de nucleótido que codifica HMG-CoA sintasa (HMGS). 21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el nivel de HMGS producido en la célula huésped genéticamente modificada es por lo menos aproximadamente 10% menor que en la célula huésped de origen de control. 22. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde ia mutación está en la región de codificación de HMGS, y en donde la mutación da como resultado una HMGS con una actividad enzimática reducida. 23. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde la mutación está en un promotor que controla la transcripción de la secuencia de codificación de HMGS. 24. Un método para mejorar la producción de un isoprenoide o precursor de isoprenoíde a través de una trayectoría de mevalonato en una célula huésped, el método comprende cultivar una célula huésped genéticamente modificada en un medio adecuado, en donde la célula huésped genéticamente modificada produce el isoprenoíde o precursor de isoprenoide a través de una trayectoria de mevalonato, en donde la célula huésped genéticamente modificada comprende uno o más ácidos nucleicos heterólogos que comprenden secuencias de nucleótido que codifican una o más enzimas que, cuando se producen en la célula, reducen la inhibición de crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA, comparado con una célula huésped de origen de control que no está genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos heterólogos que exhibe inhibiciones de crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA, y en donde el nivel de isoprenoide o precursor de isoprenoide producido en la célula huésped genéticamente modificada es mayor que el nivel del isoprenoide o precursor de isoprenoide producido en la célula huésped de origen de control. 25. Un método para identificar un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica una HMG-CoA reductasa (HMGR) variante que reduce la acumulación de HMG-CoA ¡ntracelular, el método comprende: a) producir una célula huésped introduciendo en una célula huésped un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de nucleótido que codifica un producto de gen candidato, en donde la célula huésped produce mevalonato a través de una trayectoria de mevalonato y exhibe inhibición de crecimiento inducida por la acumulación de HMG-CoA; y b) determinar el efecto, si hay alguno, de la expresión de producto de gen candidato sobre el crecimiento de la célula de prueba, en donde una reducción en la inhibición de crecimiento indica que el producto de gen candidato codifica una HMGR variante que reduce la acumulación de HMG-CoA intracelular. 26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el ácido nucleico exógeno es sintético. 27. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el ácido nucleico exógeno se aisla de una célula de una especie que es diferente de la célula huésped. 28. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el ácido nucleico exógeno se aisla de una célula eucariótica o una célula procariótica. 29. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el ácido nucleico exógeno es una colección de ADNc. 30. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde la célula huésped es una célula procariótica. 31. El método de acuerdo con la reivindicación 30, en donde la célula huésped ha sido genéticamente modificada para producir mevalonato a través de una trayectoria de mevalonato. 32. El método de acuerdo con la reivindicación 31, en donde la célula huésped ha sido genéticamente modificada con uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican acetoacetil-CoA tiolasa, hidroximetilgutaril-CoA sintasa, hidroximetilglutaril-CoA reductasa, mevalonato cinasa, fosfomevalonato cinasa, y mevalonato pirofosfato descarboxilasa. 33. El método de acuerdo con la reivindicación 25, que comprende además aislar el ácido nucleico exógeno a partir de la célula de prueba. 34. Un método para identificar un agente que reduce la acumulación de HMG-CoA en una célula, el método comprende: a) poner en contacto una célula de prueba con un agente de prueba, en donde la célula de prueba sintetiza mevalonato a través de una trayectoria de mevalonato, y en donde la célula de prueba exhibe inhibición de crecimiento inducida por acumulación de HMGCoA; y b) determinar el efecto, si hay alguno, del agente de prueba en la inhibición de crecimiento inducida por la acumulación de HMG- CoA, en donde una reducción en la inhibición de crecimiento indica que el agente candidato reduce los niveles de la acumulación de HMG-CoA en la célula.