CN103443271A - 用于增加异戊二烯产量的异戊二烯合酶变体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了包含至少一种具有提高的比生产率的异戊二烯合酶的方法和组合物。具体地讲,本发明提供了用于增加宿主细胞中异戊二烯产量的变异植物异戊二烯合酶。
Description
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求提交于2010年10月27日的美国临时专利申请No.61/407,415的优先权,该专利申请的全文内容据此以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明提供了包含异戊二烯合酶变体的方法和组合物。具体地讲,本发明提供了用于增加宿主细胞中异戊二烯产量的变异植物异戊二烯合酶。
背景技术
类异戊二烯是应用于药品、营养药品、风味剂、芳香剂和橡胶制品的异戊二烯聚合物。然而,由于生态问题,天然类异戊二烯供给是有限的。因此,为了提供具有较少杂质和更大均匀度的类异戊二烯组合物,通常通过合成产生类异戊二烯,如橡胶。
异戊二烯(2-甲基-1,3-丁二烯)为不溶于水但可溶于醇的挥发性烃。商业可行量的异戊二烯可以通过从石油C5裂化馏分直接分离或通过C5异烷烃或异烯烃的脱水获得(Weissermel and Arpe,Industrial Organic Chemistry,4thed.,Wiley-VCH,pp.117-122,2003(Weissermel和Arpe,《工业有机化学》,第4版,Wiley-VCH,第177-122页,2003年))。C5也可以用更小的亚单元合成骨架。然而,期望的是具有不依赖于不可再生资源的商业上可行的产生异戊二烯的方法。
异戊二烯的生物合成生产通过两种不同的代谢途径进行(Julsing et al.,Appl Microbiol Biotechnol,75:1377-1384,2007(Julsing等人,《应用微生物学和生物工程》,第75卷,第1377-1384页,2007年))。在真核生物和古细菌中,异戊二烯通过甲羟戊酸(MVA)途径形成,而一些真细菌和高等植物通过甲基赤藓醇磷酸酯(MEP)途径产生异戊二烯。植物的异戊二烯排放依赖光照和温度,其增加与叶片发育有关。已在白杨树中鉴定出一种产异戊二烯的酶,即异戊二烯合酶(Silver and Fall,Plant Physiol,97:1588-1591,1991;and Silver and Fall,J Biol Chem,270:13010-13016,1995(Silver和Fall,《植物生理学》,第97卷,第1588-1591页,1991年;以及Silver和Fall,《生物化学杂志》,第270卷,第13010-13016页,1995年))并且据信这种酶负责整个叶片的异戊二烯体内生成。异戊二烯的细菌产生也有所描述(Kuzma et al.,Curr Microbiol,30:97-103,1995;andWilkins,Chemosphere,32:1427-1434,1996(Kuzma等人,《当代微生物学》,第30卷,第97-103页,1995年;以及Wilkins,《光化层》,第32卷,第1427-1434页,1996年)),并且产生量随细菌生长阶段和培养基的营养成分而变化(授予Fall等人的美国专利No.5,849,970;和Wagneret al.,J Bacteriol,181:4700-4703,1999(Wagner等人,《细菌学杂志》,第181卷,第4700-4703页,1999年))。然而,通过现有技术的细菌系统可获得的异戊二烯含量是不足以用于商业用途的。
因此,本领域需要用高效的、大规模异戊二烯生物生产过程来提供用于制备类异戊二烯的原料。
本文提及的所有专利、专利申请、文章和出版物据此明确地以引用的方式并入本文。
发明内容
本发明提供了包含至少一种异戊二烯合酶多肽变体的组合物以及制备和使用此类变体的方法。变体包含针对亲代异戊二烯合酶多肽的一个或多个氨基酸残基置换,其中亲代异戊二烯合酶可以是野生型或非野生型序列。本发明提供了多肽内特定位置处的氨基酸残基置换,其中置换可以使至少一种性能比其亲代序列有所改善。在一些特别优选的实施例中,所述至少一种改善的性能选自但不限于:比生产率、产率、细胞性能指数、比活性、表达多肽变体的宿主细胞的生长、表达、稳定性和溶解度。具体地讲,本发明提供了用于增加宿主细胞中异戊二烯产量的变异植物异戊二烯合酶。
在一个方面,本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽,其中所述多肽在N-端区域、表面环、表面、活性位点、二聚体界面、底物捕集环或隐埋区中的一个或多个残基处包含一个或多个置换,并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比,所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少30%的提高。在一些实施例中,N-端区域中的置换位于选自X2,X22,X36,X43,和X58的残基处。在一些实施例中,置换位于选自E2,S22,K36,R43,和E58的残基处。在一些实施例中,其中置换选自E2V,S22K,S22R,K36D,K36E,K36H,K36W,R43E,和E58F。在一些实施例中,隐埋区中的置换位于选自X71,X89,X118,X161,X228,X268,X282,X288,X331,X391,X392,X437,X460,X461,X481,X488,和X502的残基处。在一些实施例中,置换位于选自R71,F89,A118,K161,M228,V268,S282,S288,C331,A391,W392,C437,M460,R461,T481,E488,和T502的残基处。在一些实施例中,置换选自R71I,F89D,F89E,A118E,A118P,K161C,M228Y,V268I,S282H,S282W,S288A,S288T,S288Y,C331P,A391G,W392C,W392F,W392M,W392S,W392V,W392Y,C437L,C437M,M460A,R461A,R461Y,T481Y,E488L,T502F和T502M。在一些实施例中,表面环中的置换位于选自X120,X151,X153,X254,X380,和X409的残基处。在一些实施例中,置换位于选自S120,L151,H254,S380,和V409的残基处。在一些实施例中,置换选自S120M,S120Q,L151F,L151Y,G153P,H254C,S380E,和V409T。在一些实施例中,二聚体界面中的置换位于X247处。在一些实施例中,其中置换位于V247处。在一些实施例中,置换为V247M。在一些实施例中,表面上的置换位于选自X348,X376,和X389的残基处。在一些实施例中,置换位于选自K348,L376,和G389的残基处。在一些实施例中,置换选自K348Y,和G389D。在一些实施例中,底物捕集环中的置换位于选自X443,X444,X447和X448的残基处。在一些实施例中,置换位于选自S444,I447和A448的残基处。在一些实施例中,置换选自S444S,I447T和A448V。
在另一方面,本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽,其中所述多肽包含下列具有与SEQ ID NO:1相对应的残基编号的不易突变的残基:X4,X9,X243,X258,X259,X262,X266,X280,X294,X295,X298,X305,X387,X396,X397,X435,X439,X446,X449,X450,X514,和X518,,并且其中多肽在选自下列的残基处还包含一个或多个置换:X2,X22,X36,X43,X58,X71,X89,X118,X120,X151,X153,X161,X228,X234,X247,X254,X268,X282,X288,X331,X348,X376,X380,X389,X391,X392,X409,X437,X443,X444,X447,X448,X460,X461,X481,X488,和X502,,并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比,所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少30%的提高。在一些实施例中,置换位于选自下列的残基处:E2,S22,K36,R43,E58,R71,F89,A118,S120,L151,K161,M228,Q234,V247,H254,V268,S282,S288,C331,K348,L376,S380,G389,A391,W392,V409,C437,S444,I447,A448,M460,R461,T481,E488,和T502。在一些实施例中,置换选自:E2V,S22K,S22R,K36D,K36E,K36H,K36W,R43E,E58F,R71I,F89D,F89E,A118E,A118P,S120M,S120Q,L151F,L151Y,G153P,K161C,M228Y,Q234R,V247I,V247L,V247M,H254C,V268I,S282H,S282W,S288A,S288T,S288Y,C331P,K348Y,S380E,G389D,A391G,W392C,W392F,W392M,W392S,W392V,W392Y,V409T,C437L,C437M,S444D,S444E,I447T,I447V,A448V,M460A,R461A,T481Y,E488L,T502F和T502M。
在另一方面,本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽,其中所述多肽包含下列具有与SEQ ID NO:1相对应的残基编号的不易突变的残基:X4,X9,X243,X258,X259,X262,X266,X280,X294,X295,X298,X305,X387,X396,X397,X435,X439,X446,X449,X450,X514,和X518,,并且其中所述多肽在选自下列的残基处还包含一个或多个置换:X134,X138,X143,X156,X159,X163,X166,X167,X170,X414,X421,和X491,并且其中在类似的生长条件下,与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比,表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少50%。在一些实施例中,置换位于选自K134,K138,L143,I156,E159,F163,S166,H167,E170,K414,和Q421的残基处。在一些实施例中,置换选自K134P,K138C,L143F,L143V,I156G,E159G,E159Q,F163C,F163E,F163Q,F163V,F163Y,S166C,S166D,S166G,S166P,S166V,H167M,E170G,E170H,E170K,E170N,E170R,E170S,E170W,K414F,K414G,K414N,K414P,和Q421R。
在另一方面,本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽,其中所述多肽包含下列具有与SEQ ID NO:1相对应的残基编号的不易突变的残基:X4,X9,X243,X258,X259,X262,X266,X280,X294,X295,X298,X305,X387,X396,X397,X435,X439,X446,X449,X450,X514,和X518,,并且其中所述多肽在选自下列的残基处还包含一个或多个置换:X29,X47,X86,X94,X131,X134,X156,X162,X169,X178,X179,X231,X242,X369,X414,和X421,并且其中在类似的生长条件下,与表达SEQID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比,表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少50%。在一些实施例中,置换位于选自E29,N47,S86,K94,E131,K134,I156,V162,K169,K178,E179,S231,R242,F369,K414,和Q421的残基处。在一些实施例中,置换选自E29N,N47V,S86C,K94A,E131F,K134E,K134P,I156G,V162P,K169C,K178E,E179T,S231D,S231K,S231R,S231T,S231V,R242N,R242I,F369C,K414C,K414F,K414G,K414N,和Q421D。
在另一方面,本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽,其中所述多肽包含下列具有与SEQ ID NO:1相对应的残基编号的不易突变的残基:X4,X9,X243,X258,X259,X262,X266,X280,X294,X295,X298,X305,X387,X396,X397,X435,X439,X446,X449,X450,X514,和X518,,并且其中所述多肽在选自下列的残基处还包含一个或多个置换:X30,X84,X134,X140,X143,X163,X166,X169,X170和X172,并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比,所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少20%的提高,并且在类似的生长条件下,与表达SEQID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比,表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少20%。在一些实施例中,置换位于选自V84,K134,I140,L143,F163,S166,K169,E170和S172的残基处。在一些实施例中,置换选自V30K,V84T,K134C,K134D,K134E,I140S,I140T,L143F,L143I,L143M,L143V,F163I,F163M,S166P,S166V,K169Q,E170H,E170K,和S172V。
在另一方面,本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽,其中所述多肽在以下位置包含一个或多个置换:(i)N-端,(ii)从残基134至179的N-端螺旋区,其中残基编号对应于SEQ ID NO:1(野生型MEA异戊二烯合酶)或(iii)N-端螺旋区外部与N-端螺旋区相互作用的其他残基处,并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比,所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少20%的提高。在一些实施例中,置换位于选自下列的残基处:X30,X84,X134,X140,X143,X163,X166,X169,X170和X172。在一些实施例中,置换位于选自下列的残基处:V84,K134,I140,L143,F163,S166,K169,E170和S172。在一些实施例中,置换选自:V30K,V84T,K134C,K134D,K134E,I140S,I140T,L143F,L143I,L143M,L143V,F163I,F163M,S166P,S166V,K169Q,E170H,E170K,和S172V。
在另一方面,本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X2,X22,X36,X43,X58,X71,X89,X118,X120,X151,X153,X161,X228,X234,X247,X254,X268,X282,X288,X331,X348,X376,X380,X389,X391,X392,X409,X437,X443,X444,X447,X448,X460,X461,X481,X488,和X502,,并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比,所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少30%的提高。在一些实施例中,置换位于选自E2,S22,K36,R43,E58,R71,F89,A118,S120,L151,K161,M228,Q234,V247,H254,V268,S282,S288,C331,K348,L376,S380,G389,A391,W392,V409,C437,S444,I447,A448,M460,R461,T481,E488,和T502的残基处。在一些实施例中,置换选自E2V,S22K,S22R,K36D,K36E,K36H,K36W,R43E,E58F,R71I,F89D,F89E,A118E,A118P,S120M,S120Q,L151F,L151Y,G153P,K161C,M228Y,Q234R,V247I,V247L,V247M,H254C,V268I,S282H,S282W,S288A,S288T,S288Y,C331P,K348Y,S380E,G389D,A391G,W392C,W392F,W392M,W392S,W392V,W392Y,V409T,C437L,C437M,S444D,S444E,I447T,I447V,A448V,M460A,R461A,T481Y,E488L,T502F和T502M。
在另一方面,本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽,其中所述多肽在N-端区域、N-端螺旋区、表面环、表面、活性位点、二聚体界面、底物捕集环或隐埋区中的一个或多个残基处包含一个或多个置换,并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比,所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少40%的提高。在一些实施例中,N-端区域中的置换位于选自下列的残基处:X18,X36,和X82。在一些实施例中,置换位于选自Y18,K36,和R82的残基处。在一些实施例中,置换选自:Y18E,Y18D,Y18S,K36P,和R82Q。在一些实施例中,N-端螺旋区中的置换位于选自下列的残基处:X137,X143,X163,和X170。在一些实施例中,置换位于选自下列的残基处:I137,L143,F163,和E170。在一些实施例中,置换选自:I137C,L143N,F163I,F163Q,和E170G。在一些实施例中,表面环中的置换位于选自下列的残基处:X87,X409,和X542。在一些实施例中,置换位于选自下列的残基处:G87,V409,和F542。在一些实施例中,置换选自:G87S,G87N,G87R,V409S,和F542N。在一些实施例中,表面中的置换位于残基X251处。在一些实施例中,置换位于残基T251处。在一些实施例中,置换为T251E。在一些实施例中,二聚体界面中的置换位于残基X242处。在一些实施例中,置换位于残基R242处。在一些实施例中,置换为R242T。在一些实施例中,隐埋区中的置换位于选自下列的残基处:X437,X460,和X461。在一些实施例中,置换位于选自下列的残基处:C437,M460,和R461。在一些实施例中,置换选自:C437M,C437K,M460Q,M460G,M460A,R461D,R461S,R461T,和R461。在一些实施例中,底物捕集环中的置换位于选自下列的残基处:X443,X444,和X447。在一些实施例中,置换位于选自下列的残基处:S444,和I447。在一些实施例中,置换选自:S444P,I447Q,I447T,I447M,I447E,I447S,和I447R。
在另一方面,本发明提供了分离的多肽,所述多肽具有异戊二烯合酶活性,并且当所述多肽在宿主细胞中表达时,提供改善的生长活性,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X134,X138,X143,X156,X159,X163,X166,X167,X170,X414,X421,和X491,并且其中在类似的生长条件下,与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比,表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少50%。在一些实施例中,置换位于选自K134,K138,L143,I156,E159,F163,S166,H167,E170,K414,和Q421的残基处。在一些实施例中,置换选自K134P,K138C,L143F,L143V,I156G,E159G,E159Q,F163C,F163E,F163Q,F163V,F163Y,S166C,S166D,S166G,S166P,S166V,H167M,E170G,E170H,E170K,E170N,E170R,E170S,E170W,K414F,K414G,K414N,K414P,和Q421R。
在另一方面,本发明提供了分离的多肽,所述多肽具有异戊二烯合酶活性,并且当所述多肽在宿主细胞中表达时,提供改善的生长活性,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X29,X47,X86,X94,X131,X134,X156,X162,X169,X178,X179,X231,X242,X369,X414,和X421,并且其中在类似的生长条件下,与表达SEQID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比,表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少50%。在一些实施例中,置换位于选自E29,N47,S86,K94,E131,K134,I156,V162,K169,K178,E179,S231,R242,F369,K414,和Q421的残基处。在一些实施例中,置换选自E29N,N47V,S86C,K94A,E131F,K134E,K134P,I156G,V162P,K169C,K178E,E179T,S231D,S231K,S231R,S231T,S231V,R242N,R242I,F369C,K414C,K414F,K414G,K414N,和Q421D。
在另一方面,本发明提供了分离的多肽,所述多肽具有异戊二烯合酶活性,并且当所述多肽在宿主细胞中表达时,提供改善的生长活性,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X50,X81,X134,X137,X143,X156,X159,X166,X167,X169,X170,和X414,并且其中在类似的生长条件下,与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比,表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少30%。在一些实施例中,置换位于选自K50,D81,K134,I137,L143,I156,E159,S166,H167,K169,E170,和K414的残基处。在一些实施例中,置换选自K50S,D81F,K134E,K134P,I137N,L143V,I156G,E159D,E159G,E159Q,S166C,S166W,H167M,H167N,K169C,E170H,E170K,E170W,K414C,K414F,K414G,K414N,和K414P。
在另一方面,本发明提供了分离的多肽,所述多肽具有改善的异戊二烯合酶活性,并且当所述多肽在宿主细胞中表达时,提供改善的生长活性,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X30,X84,X134,X140,X143,X163,X166,X169,X170和X172,并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比,所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少20%的提高,并且在类似的生长条件下,与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比,表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少20%。在一些实施例中,置换位于选自V84,K134,I140,L143,F163,S166,K169,E170和S172的残基处。在一些实施例中,置换选自:V30K,V84T,K134C,K134D,K134E,I140S,I140T,L143F,L143I,L143M,L143V,F163I,F163M,S166P,S166V,K169Q,E170H,E170K,和S172V。
在另一方面,本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶性质的分离的多肽,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含两个或更多个置换:X22,X71,X87,X162,X242,X288,X409,X414,X443,X444,X460,和X502,其中所述残基编号对应于SEQ ID NO:1,并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比,所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少160%的提高。在一些实施例中,置换位于选自S22,R71,G87,V162,R242,S288,V409,K414,S444,M460,和T502的残基处。在一些实施例中,置换选自S22R,R71I或R,G87R,V162P,R242N,S288C,V409T,KX414F,S444D,M460A,和T502M。在一些实施例中,置换选自:a)S22R,R71I,S288C,S444D,M460A,和T502M;b)G87R,V162P,R242N,S288C,V409T,K414R,和S444D;或c)G87R,V162P,R242N,S288C,V409T,和K414F。
在另一方面,本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶性质的分离的多肽,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含两个或更多个置换:X47,X87,X156,X162,X170,X231,X242,X288,X409,X414,和X447,其中所述残基编号对应于SEQ ID NO:1,并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比,所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少30%的提高,并且在类似的生长条件下,与SEQ IDNO:1的野生型异戊二烯合酶相比,宿主细胞中表达所述多肽时生长量多至少30%。在一些实施例中,置换位于选自N47,G87,I156,V162,E170,S231,R242,S288,V409,K414,和I447的残基处。在一些实施例中,置换选自N47V,G87R,I156G,V162P,E170H,S231T,R242N,S288C,S288T,V409T,和K414F。在一些实施例中,置换选自N47V,I156G,E170H,S231T,S288T,和K414F。
在另一方面,本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶性质的分离的多肽,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X2,X18,X19,X21,X24,X26,X27,X29,X37,X42,X47,X48,X49,X56,X81,X82,X84,X93,X94,X95,X120,X123,X126,X131,X132,X134,X137,X139,X143,X151,X155,X166,X167,X169,X170,X171,X175,X179,X180,X197,X229,X231,X240,X242,X245,X246,X247,X251,X271,X282,X306,X317,X319,X369,X371,X376,X379,X380,X389,X392,X393,X408,X409,X421,X422,X423,X429,X437,X443,X444,X447,X455,X458,X461,X464,X466,X470,X473,X500,X502,X506,X513,X525和X531,并且其中所述多肽(a)相对于SEQ ID NO:1,比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.9的PI,并且其中相对于SEQ ID NO:1,比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.0的PI;以及(b)相对于SEQ ID NO:1,比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.8的PI,并且其中相对于SEQ IDNO:1,比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.2的PI;以及(c)相对于SEQ ID NO:1,比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.5的PI,并且其中相对于SEQ ID NO:1,比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.5的PI。
在一些实施例中,置换位于选自E2,Y18,L19,S21,T24,E26,S27,E29,K37,V42,N47,N48,E49,L56,D81,R82,V84,T93,K94,T95,S120,K123,N126,E131,N132,K134,I137,A139,L143,L151,N155,S166,H167,K169,E170,L171,K175,E179,L180,Q197,I229,S231,T240,R242,R245,R246,V247,T251,A271,S282,L306,D317,N319,F369,Q371,L376,K379,S380,G389,W392,K393,V408,V409,Q421,K422,Y423,R429,C437,S444,I447,S455,C458,R461,G464,S466,A470,S473,V500,T502,L506,T513,E525和V531的残基处。在一些实施例中,置换选自E2A或K或P、Y18D或E或K或S、L19Y、S21W、T24L或V、E26C、S27D或N、E29N、K37C或D或P或Q或S、V42M、N47D或S、N48D或G或T、E49L或V、L56E或F或G或I或K或T或V或Y、D81Q、R82N或T或V或Y、V84M、T93C或F或R或S、K94G或P、T95D或F或G或I或N或W、S120C或G或M或Q、K123V、N126E、E131H或K或L或M或T或W或Y、N132I或P、K134A、I137T、A139C或Q、L143C或D或E或H或K或M或Q或T或V或Y、L151A或F、N155A或C或G或H或Q或R或S或W、S166N、H167F或I或N或Q或V、K169A或C或H或N或Q或V、E170L或S或W或Y、L171A或N或Q或T或V或Y、K175C或F或I或Q或R、E179D、L180A或I、Q197C或D或N、I229C、S231A、T240C、R242G、R245C或K或M或Q或T或V、R246N、V247L或M、T251D或E或N或P或Q或S、A271T、S282Y、L306C、D317N、N319M、F369C或D或E或G或S、Q371F、L376I或M、K379G或Q、S380E、G389A或D或E或K或N或Q或S或V、W392Y、K393C或I或T或V、V408T、V409T、Q421H、K422D、Y423N或S、R429E或F或Q、C437M、S444D或E、I447T、S455A、C458T、R461A,G464C或M或N或Q或S、S466D、A470I或L、S473I、V500A或C、T502M,L506M,T513C或G或K或N、E525F或R、V531E或H或K或Q或R或S。
在另一方面,本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶性质的分离的多肽,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X2,X6,X18,X20,X22,X23,X24,X25,X26,X27,X28,X29,X30,X31,X32,X36,X37,X42,X44,X47,X48,X49,X50,X53,X54,X55,X56,X58,X59,X68,X71,X74,X77,X78,X79,X81,X82,X83,X84,X86,X87,X91,X93,X94,X95,X97,X98,X99,X109,X115,X116,X117,X118,X120,X123,X125,X126,X127,X128,X130,X131,X132,X133,X134,X136,X137,X138,X139,X140,X143,X151,X153,X155,X156,X159,X160,X161,X162,X163,X164,X166,X167,X169,X170,X171,X172,X175,X176,X177,X178,X179,X180,X181,X182,X190,X194,X197,X204,X211,X215,X217,X219,X221,X228,X229,X231,X232,X235,X241,X242,X245,X246,X247,X251,X254,X271,X272,X278,X279,X282,X296,X302,X317,X319,X320,X327,X331,X348,X351,X357,X361,X364,X365,X368,X369,X370,X371,X373,X377,X380,X383,X386,X389,X392,X393,X407,X408,X409,X410,X411,X414,X422,X423,X424,X428,X429,X432,X436,X437,X440,X443,X444,X447,X448,X457,X460,X461,X462,X463,X464,X465,X466,X468,X470,X471,X472,X473,X475,X480,X490,X491,X492,X494,X496,X500,X501,X502,X503,X510,X513,X515,X519,X525,X531,X536,X537,X540,X541,X542,和X544,并且其中所述多肽(a)相对于SEQ ID NO:1,比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.9的PI,并且其中相对于SEQ IDNO:1,比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.0的PI;以及(b)相对于SEQ ID NO:1,比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.8的PI,并且其中相对于SEQ ID NO:1,比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.2的PI。在一些实施例中,其中置换位于选自E2,S6,Y18,L20,S22,D23,T24,D25,E26,S27,I28,E29,Y31,K32,K36,K37,V42,R44,N47,N48,E49,K50,F53,L54,T55,L56,E58,L59,L68,R71,S74,R77,G78,A79,D81,R82,F83,V84,S86,G87,A91,T93,K94,T95,L97,H98,G99,Q109,S115,Q116,E117,A118,S120,K123,Q125,N126,G127,N128,L130,E131,N132,L133,K134,D136,I137,K138,A139,I140,L143,L151,N155,I156,E159,A160,K161,V162,F163,A164,S166,H167,K169,E170,L171,S172,K175,I176,G177,K178,E179,L180,A181,E182,L190,R194,Q197,S204,K211,N215,V217,L219,L221,M228,I229,S231,V232,R235,S241,R242,R245,R246,V247,T251,H254,A271,F272,D278,C279,S282,I296,T302,D317,N319,A320,Y327,C331,K348,G351,Y357,A361,D364,L365,A368,F369,L370,Q371,A373,Y377,S380,T383,D386,G389,W392,K393,A407,V408,V409,Q410,N411,K414,K422,Y423,H424,S428,R429,H432,L436,C437,L440,S444,I447,A448,S457,M460,R461,T462,K463,G464,I465,S466,E468,A470,T471,E472,S473,M475,E480,L490,G492,L494,A496,V500,E501,T502,A503,S510,T513,H515,A519,E525,V531,T536,E537,L540,P541,F542,和R544的残基处。在一些实施例中,置换位于选自下列的残基处:E2C或D或N或T或V,S6N或T,Y18A或Q或R,L20T,S22Q,D23N,T24C,D25T,E26D或H或K或M或R或S或V,S27A或C或G或H或I或L或M或P或Q,I28D或N,E29Q,V30A或D或E或M或R或T,Y31N,K32E,K36A或C或D或E或M或N或P或Q,K37A或E或G或H或M或N或R或T,V42F或I,R44N或Q,N47A或G或H或M或Q或T或W,N48H或I或K,E49A或C,K50A或D或E或F或H或S或Y,F53E或H或N或P或Q或V,L54M,T55C或D或E,L56C或N,E58N,L59H或T,L68I,R71K或M,S74D或E或N或Y,R77L,G78A或D或F或L或M,A79Q或T,D81A或F或G或M或R或S或T或V,R82A或E或H或I或K或M或Q或S,F83W,V84A,S86A或D或M,G87D或P,A91K或W,T93A或D或E或G或L或N或P或Y,K94A或D或E或H或I或L或M或N或R或S或T,T95A或E或P或Q或S或V或Y,L97F,H98A或D或F或G或I或L或M或N或Q,G99E或F或M,Q109E,S115A,Q116A或C或D或E或I或P,E117C或F或L或M或V,A118M,S120H或T或V,K123L或T,Q125E或I或Y,N126A或C或D或M或T或V,G127C,N128C或D或P或Q,L130E,E131A或C或P或Q或S或V,N132C或D或F或H或L或R或W或Y,L133D,K134E或M或Q或S或T或V,D136E,I137E或H或N,K138I或N,A139N,I140M或W,L143S,L151C或H或I,G153C,N155I或T或V或Y,I156D或N或T,E159M,A160I,K161A或C或N或Q,V162S,F163E或Q,A164T,S166A或D或G,H167A或E或G或K或M或R或S或T或W,K169D或I或M或S或T,E170H或K或M或Q或T或V,L171H或K或R或S,S172A或C,K175S,I176M,G177A或C,K178A或F或R或S或T,E179A或C或L或M或N,L180C或Q或T,A181H或Q或S或V,E182S,L190I或M,R194L,Q197S,S204C,K211A或N或Q,N215C或H,V217I,L219C,L221M,M228F或Y,I229V,S231K或Q或T,V232I,R235K,S241A或M或T,R242A或D或E或H或I或M或N或Q或S或T,R245I或L,R246D或K,V247T,T251A或G或K或R,H254D,A271C或V,F272D或G或P或W,D278A或E或N或Q或S或T或V或W,C279A,S282A或Q,I296V,T302H,D317E或Q,N319F,A320C,Y327M,C331P,K348R或Y,G351D或N,Y357M,A361T,D364E或V,L365C或M,A368N,F369M或N或R或T或V,L370G或Q,Q371C或S,A373G,Y377W,S380A或C或D或Q或T或V,T383S,D386E或N,G389H或I,W392I或S或T或V,K393Q,A407G,V408I,V409H或I,Q410C或D或K或L或M或T,N411G,K414E或G或L或N或P,K422A或N或T,Y423Q,H424E或P或Q或V,S428E或Q,R429I或L或T或W或Y,H432E,L436M或Y,C437K或T,L440I,S444P,I447A或E或M或Q或S,A448E或M或N或P或Q或V,S457N或T,M460Q或R或S,R461D或E或G或Q或S或T,T462Q,K463A或D或E,G464L或R,I465A或C或G或S或T,S466P,E468D,A470M,T471E或H或Q,E472D或S,S473L或V,M475T,E480N,L490A或D或E或F或H或M,G492C,L494D,A496P或T,V500L或M,E501D,T502A或C或R或V,A503I,S510C或V,T513V,H515N,A519S或T,E525A或C或P或Q或S,V531A或M或T,T536A或F或G,E537K或T,L540A或P,P541M,F542P,和R544C。
在另一方面,本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶性质的分离的多肽,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X2,X3,X13,X17,X18,X19,X20,X23,X25,X26,X27,X28,X29,X30,X31,X32,X33,X34,X36,X37,X40,X41,X42,X43,X44,X45,X46,X47,X48,X49,X50,X51,X53,X54,X55,X56,X57,X59,X60,X62,X71,X73,X74,X75,X77,X78,X79,X81,X82,X83,X84,X85,X86,X87,X88,X89,X91,X92,X93,X94,X95,X97,X98,X99,X100,X101,X102,X103,X107,X109,X111,X113,X114,X115,X116,X117,X118,X119,X120,X121,X123,X124,X125,X127,X128,X129,X130,X131,X133,X134,X135,X136,X137,X138,X139,X140,X143,X146,X151,X152,X153,X155,X156,X158,X160,X161,X162,X163,X166,X167,X169,X170,X171,X172,X175,X176,X177,X178,X179,X180,X181,X182,X183,X185,X187,X193,X194,X196,X197,X204,X210,X211,X212,X215,X216,X217,X218,X219,X220,X222,X223,X224,X226,X228,X229,X231,X232,X235,X240,X241,X242,X246,X251,X253,X260,X268,X270,X271,X272,X275,X276,X278,X282,X307,X314,X315,X317,X320,X321,X323,X328,X329,X331,X332,X333,X343,X345,X346,X350,X351,X352,X356,X357,X360,X361,X363,X364,X366,X367,X368,X369,X370,X371,X378,X379,X380,X383,X386,X389,X390,X392,X393,X402,X405,X408,X409,X410,X413,X414,X418,X422,X423,X424,X425,X426,X428,X429,X431,X432,X437,X444,X447,X448,X457,X460,X461,X462,X463,X464,X466,X467,X468,X469,X471,X472,X475,X484,X489,X490,X491,X492,X493,X494,X497,X500,X501,X502,X503,X504,X506,X509,X510,X511,X513,X515,X517,X519,X522,X528,X529,X531,X534,X535,X536,X537,X539,X540,X542,和X544,并且其中所述多肽(a)相对于SEQ ID NO:1,比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.9的PI,并且其中相对于SEQ ID NO:1,比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.0的PI;或者(b)相对于SEQ ID NO:1,比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.8的PI,并且其中相对于SEQ ID NO:1,比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.2的PI;以及(c)相对于SEQ IDNO:1,比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.5的PI,并且其中相对于SEQ ID NO:1,比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.5的PI。在一些实施例中,置换位于选自下列的残基处:E2,A3,S13,D17,Y18,L19,L20,D23,D25,E26,S27,I28,E29,Y31,K32,D33,K34,K36,K37,A40,E41,V42,R43,R44,E45,I46,N47,N48,E49,K50,A51,F53,L54,T55,L56,L57,L59,I60,N62,R71,E73,S74,D75,R77,G78,A79,D81,R82,F83,V84,S85,S86,G87,G88,F89,A91,V92,T93,K94,T95,L97,H98,G99,T100,A101,L102,S103,L107,Q109,G111,E113,V114,S115,Q116,E117,A118,F119,S120,G121,K123,D124,Q125,G127,N128,F129,L130,E131,L133,K134,E135,D136,I137,K138,A139,I140,L143,A146,L151,E152,N155,I156,D158,A160,K161,V162,F163,S166,H167,K169,E170,L171,S172,K175,I176,G177,K178,E179,L180,A181,E182,Q183,N185,A187,H193,R194,T196,Q197,S204,K210,K211,E212,N215,Q216,V217,L218,L219,E220,A222,I223,L224,Y226,M228,I229,S231,V232,R235,T240,S241,R242,R246,T251,L253,L260,V268,V270,A271,F272,Q275,Y276,D278,S282,E307,E314,R315,D317,A320,I321,D323,M328,K329,C331,F332,L333,A343,D345,N346,K350,G351,E352,P356,Y357,K360,A361,A363,D364,C366,N367,A368,F369,L370,Q371,N378,K379,S380,T383,D386,G389,N390,W392,K393,V402,Y405,V408,V409,Q410,K413,K414,E418,K422,Y423,H424,D425,T426,S428,R429,S431,H432,C437,S444,I447,A448,S457,M460,R461,T462,K463,G464,S466,E467,E468,L469,T471,E472,M475,K484,K489,L490,G492,S493,L494,K497,V500,E501,T502,A503,I504,L506,Q509,S510,H511,T513,H515,G517,A519,S522,R528,K529,V531,V534,I535,T536,E537,I539,L540,F542和R544。在一些实施例中,置换选自E2H或I或S、A3E或G或K或N或Q或R或T、S13Q或T、D17E、Y18F或M或N、L19F、L20I或V、D23T、D25A或E或S、E26G或N或Q或T、S27E或F或K或V、I28E或F或M或P、E29D或P或R或T、V30N或Q、Y31Q或W、K32D或G或N或R、D33N、K34D或E或Q或S、K36F或R、K37F或I、A40C或D或E或F或M或N或P或Q或V、E41C或D或F或N或Q或S或V、V42A或S或T、R43I或Q、R44A或D或K或M或Y、E45C或M或N或Q、I46F或V、N47E或I或K或R或V、N48A或C或E或F或L或Q或R或S、E49G或H或I或R或S或W、K50C或G或M或N或P或R、A51E或G或L或Q或T、F53D、L54A或C或E或H或I或Q、T55A或H或N或Q或S或Y、L56H或Q或R或S、L57I、L59F或M或S或V或Y、I60C或V、N62V、R71I、E73D、S74G或M或P、D75E、R77A或N或T或V、G78E或I或K或N或P或Q或V或W、A79M或R或Y、D81C或E或H或L或N、R82C或F或G或L或W、F83G或H或I或L或V、V84F或H或L或N或Q或R或S或T或W或Y、S85C或L或N或R、S86C或N、G87C或E或F或K或L或N或T、G88C或D或I或V或W或Y、F89C或I,A91C或D或E或G或H或L或R或S或T或V或Y、V92A或C或E或F或G或I或L或Q或W、T93H或I或Q或V或W、K94C或V或Y、T95C或H或K或M、L97A或M或P、H98C或S或T或V或W、G99A或C或H或P或Q或T、T100A或I或L或M或V、A101S、L102M、S103A或C或G或L、L107C或F、Q109C或N或S、G111A、E113C或H或V、V114C、S115D或Y、Q116G或H或L或S或T或V、E117A或D或I、A118I或V、F119L或M、S120A或D或E或F或K或N或R或W或Y、G121D或L或V或W、K123I或S或W或Y、D124C或E、Q125A或D或G或H或K或L或N或S或T或V或W、G127D或F或W、N128A、F129L或Y、L130A或C或D或Q或V或Y、E131D或F或G或R、L133E或G或I或P或Q或T或V或Y、K134D或G或H或I或L或N或R或W或Y、E135H或S,D136N、I137A或C或D或G或P或Q或S或V、K138C或D或E或P或R或S或V、A139P或S或T或V、I140N或Q或S或T或V、L143A或F或G或N或R或W、A146M、L151E或G或M或N或Q或R或S或T或V或W、E152A或D或I或M或P、G153D、N155E或K或M、I156E或K或L或R或Y、D158E、A160F或H或S、K161L或R或S或Y、V162D或F或N或P或T、F163C或H或I或M或V或W或Y、S166C或E或H或K或P或Q或V或W、H167C或L或P、K169E或G或R、E170G或I或N或R、L171C或E或G或I或M或W、S172G或N或Q或R、K175A或G或H或N或P或T或V、I176A或C或N或Q或V、G177D或E或H或N或P或T、K178D或E或G或I或L或M或N或P或Q或V或Y、E179G或I或P或Q或S或T或V或W或Y、L180F或H或V或W、A181F或M或N或W、E182H或N、Q183A或L、N185D、A187C或S、H193W、R194I、T196V、Q197G、S204A或F或M或W或Y、K210M、K211D或E或F或G或H或I或M或R或S或T或V、E212A或D或M或P或Q或T、N215D或Y、Q216A或E或N、V217C或E或K或N或P或Q或T、L218V、L219I或M或V、E220D或N、A222S、I223C、L224A或C或T或V、Y226F、M228H或R、I229A、S231D或G或H或R或V、V232Q、R235A或D或N、T240V、S241C、R242K或L、R246H或Q、T251H、L253M、L260M、V268I、V270I,A271S、F272Q、Q275E、Y276F或H或Q、D278L或M或R或Y、S282C、E307Q或R、E314H、R315G或K、D317S、A320N或T、I321L或M、D323I或T、M328L、K329G或Q或R、C331T、F332Y、L333F、A343I或V、D345Y、N346A、K350H或W或Y、G351E或M、E352F或I或M或V、P356M或S、Y357E、K360Q、A361Q或S或V、A363S、D364N或T、C366A、N367D或E或M、A368D或Q、F369H或Q、L370A或D或E或F或H或N或R或S或T或V、Q371G或H或I或N或P或R或T或W或Y、N378D、K379E或R或S、S380K或N、T383Q、D386K或S、G389C或M或P或R或T、N390S、W392F或M、K393H或R、V402F或I或L、Y405F、V408Q或S、V409C或Q或S、Q410E或G或H或I或R、K413P、K414C或H或I或Q、E418N、K422G或H或Q或R、Y423G、H424D或G或I或S或T、D425P、T426A或M或Q、S428V、R429A或C或D或G或H或K或N、S431G、H432A或M、C437N、S444N或Q或T、I447K或R、A448H或S或T、S457D、M460A或E或G、R461N、T462S、K463G或N、G464A或D或E或F或H或V或Y、S466E或G或K或N或T、E467N、E468A或N或P或Q、L469A或N、T471N、E472A或G或N、M475I、K484A、K489R、L490I或Y、G492T或V、S493C或G或K或V、L494G或I或Q或V、K497M或T、V500I或Y、E501N、T502H、A503L或M、I504L、L506I或V、Q509A,S510T、H511I或M、T513S、H515Q、G517P、A519C、S522A或K、R528K、K529A、V531G或N、V534A或S、I535C或S或T、T536M、E537H或N或Q,I539V,L540E或Q或R或V、F542M、和R544G或N或P或Q或S。
在另一方面,本发明提供了具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X22,X36,X43,X58,X87,X89,X118,X151,X234,X247,X254,X282,X288,X391,X392,X437,X443,X447,X481,X488,X502,和X542,并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比,所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少30%的提高。在一些实施例中,置换位于选自下列的残基处:S22,K36,R43,E58,G87,F89,A118,L151,Q234,V247,H254,S282,S288,A391,W392,C437,I447,T481,E488,T502和F542。在一些实施例中,置换选自S22K或R、K36H或W、R43E,E58F,G87S或R、F89D,A118E,L151Y,G153P,Q234R,V247I,H254C,S282H或W、S288A或T或Y、A391G,W392C、C437L,I447V,T481Y,E488L,T502F和F542N。
在另一方面,本发明提供了分离的多肽,所述多肽具有异戊二烯合酶活性,并且当所述多肽在宿主细胞中表达时,提供改善的生长活性,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X30,X134,X143,X156,X159,X172,X414,和X421,,并且其中在类似的生长条件下,与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比,表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少20%。在一些实施例中,置换位于选自K134,L143,I156,E159,S172,K414,和Q421的残基处。在一些实施例中,置换位于选自V30K,K134C或P,L143I,I156G,E159D,S172V,K414F,和Q421R或D的残基处。
在另一方面,本发明提供了包含上文所述和本说明书其余部分所述的多肽中的任何一种的重组宿主细胞。在一些实施例中,宿主细胞选自细菌、海藻、真菌、酵母、蓝细菌或梭菌细胞。在一些实施例中,宿主细胞为细菌细胞。在一些实施例中,细菌细胞为革兰氏阳性细菌细胞或革兰氏阴性细菌细胞。在一些实施例中,细菌细胞选自大肠杆菌(E.coli)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、柠檬泛菌(P.citrea)、枯草茅孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽胞杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽胞杆菌(B.circulans)、灿烂芽胞杆菌(B.lautus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、白色葡萄球菌(S.albus)、变铅青链霉菌(S.lividans)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、灰色链霉菌(S.griseus)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)、产碱假单胞菌(P.alcaligenes)、生孢梭菌(Clostridium sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)和谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)细胞。在一些实施例中,宿主细胞为藻类细胞。在一些实施例中,藻类细胞选自绿藻、红藻、灰藻、藻细胞核(chlorarachniophytes)、眼虫、色菌界或沟鞭藻。在一些实施例中,宿主细胞为真菌细胞。在一些实施例中,真菌细胞为丝状真菌。在一些实施例中,宿主细胞为酵母细胞。在一些实施例中,酵母细胞选自酵母属(Saccharomyces sp.)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces sp.)、毕赤酵母属(Pichia sp.)或假丝酵母属(Candida sp.)。在一些实施例中,酵母细胞为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。
在另一方面,本发明提供了鉴定多肽的方法,当所述多肽在宿主细胞中表达时,具有改善的异戊二烯合酶活性和/或改善的生长特性,所述方法包括从位点评价库或组合库筛选多肽中的一个或多个置换,所述置换使得与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的比活性和生长量相比,表达所述多肽时宿主细胞的比活性和/或生长量有所提高。
在另一方面,本发明提供了非天然存在的异戊二烯合酶变体,其包含选自下列的氨基酸残基置换:X003C,X003D,X003E,X003F,X003G,X003H,X003I,X003K,X003L,X003M,X003N,X003P,X003Q,X003R,X003S,X003T,X003V,X003W,X003Y,X007C,X007D,X007E,X007F,X007G,X007H,X007I,X007K,X007L,X007M,X007N,X007P,X0070,X007R,X007S,X007T,X007V,X007W,X007Y,X009A,X009C,X009D,X009E,X009F,X009G,X009H,X009I,X009K,X009L,X009M,X009N,X009P,X009Q,X009R,X009S,X009T,X009V,X009W,X012A,X012C,X012D,X012E,X012F,X012G,X012H,X012I,X012K,X012L,X012M,X012P,X012Q,X012R,X012S,X012T,X012V,X012W,X012Y,X013A,X013C,X013D,X013E,X013F,X013G,X013H,X013I,X013K,X013L,X013M,X013N,X01P3,X013Q,X013R,X013T,X013V,X013W,X013Y,X016A,X016C,X016D,X016E,X016F,X016G,X016H,X016I,X016K,X016L,X016M,X016N,X016P,X016Q,X016R,X016S,X016T,X016V,X016W,X018A,X018C,X018D,X0E18,X018F,X018G,X018H,X018I,X018K,X018L,X018M,X018N,X018P,X018Q,X018R,X018S,X018T,X018V,X018W,X020A,X020C,X020D,X020E,X020F,X020G,X020H,X020I,X020K,X020M,X020N,X020P,X020Q,X020R,X020S,X020T,X020V,X020W,X020Y,X023A,X023C,X023E,X023F,X023G,X023H,X023I,X023K,X023L,X023M,X023N,X023P,X023Q,X023R,X023S,X023T,X023V,X023W,X023Y,X025A,X025C,X025E,X025F,X025G,X025H,X025I,X025K,X025L,X025M,X025N,X025P,X025Q,X025R,X025S,X025T,X025V,X025W,X025Y,X026A,X026C,X026D,X026F,X026G,X026H,X026I,X026K,X026L,X026M,X026N,X026P,X026Q,X026R,X026S,X026T,X026V,X026W,X026Y,X027A,X027C,X027D,X027E,X027F,X027G,X027H,X027I,X027K,X027L,X027M,X027N,X027P,X027Q,X0R27,X027V,X027W,X027Y,X033A,X033C,X033E,X033F,X033G,X033H,X033I,X033K,X033L,X033M,X033N,X033P,X033Q,X033R,X033S,X033T,X033V,X033W,X033Y,X036A,X036C,X036D,X036E,X036F,X036G,X036G,X036I,X036L,X036M,X036N,X036P,X036Q,X036R,X036S,X036T,X036V,X036W,X036Y,X044A,X044C,X044D,X044E,X044F,X044G,X044H,X044I,X044K,X044L,X044M,X044N,X044P,X044Q,X044S,X044T,X044V,X044W,X044Y,X050A,X050C,X050D,X050E,X050F,X050G,X050H,X050I,X050L,X050M,X050N,X050P,X050Q,X050R,X050S,X050T,X050V,X050W,X050Y,X053A,X053C,X053D,X053E,X053G,X053H,X053I,X053K,X053L,X053M,X053N,X053P,X053Q,X053R,X053S,X053T,X053V,X053W,X053Y,X059A,X059C,X059D,X059E,X059F,X059G,X059H,X059I,X059K,X059M,X059N,X059P,X059Q,X059R,X059S,X059T,X059V,X059W,X059Y,X069A,X069C,X069D,X069E,X069F,X069H,X069I,X069K,X069L,X069M,X069N,X069P,X069Q,X069R,X069S,X069T,X069V,X069W,X069Y,X074A,X074C,X074D,X074E,X074F,X074G,X074H,X074I,X074K,X074L,X074M,X074N,X074P,X074Q,X074R,X074T,X074V,X074W,X074Y,X078A,X078C,X078D,X078E,X078F,X078H,X078I,X078K,X078L,X078M,X078N,X078P,X078Q,X078R,X078S,X078T,X078V,X078W,X078Y,X081A,X081C,X081E,X081F,X081G,X081H,X081I,X081K,X081L,X081M,X081N,X081P,X081Q,X081R,X081S,X081T,X081V,X081W,X081Y,X087A,X087C,X087D,X087E,X087F,X087H,X087I,X087K,X087L,X087M,X087N,X087P,X087Q,X087R,X087S,X087T,X087V,X087W,X087Y,X099A,X099C,X099D,X099E,X099F,X099H,X099I,X099K,X099L,X099M,X099N,X099P,X099Q,X099R,X099S,X099T,X099V,X099W,X099Y,X116A,X116C,X116D,X116E,X116F,X116G,X116H,X116I,X116K,X116L,X116M,X116N,X116P,X116R,X116S,X116T,X116V,X116W,X116Y,X117A,X117C,X117D,X117F,X117G,X117H,X117I,X117K,X117L,X117M,X117N,X117P,X117Q,X117R,X117S,X117T,X117V,X117W,X117Y,X120A,X120C,X120D,X120E,X120F,X120G,X120H,X120I,X120K,X120L,X120M,X120N,X120P,X120Q,X120R,X120T,X120V,X120W,X120Y,X121A,X121C,X121D,X121E,X121F,X121H,X121I,X121K,X121L,X121M,X121N,X121P,X121Q,X121R,X121S,X121T,X121V,X121W,X121Y,X125A,X125C,X125D,X125E,X125F,X125G,X125H,X125I,X125K,X125L,X125M,X125N,X125P,X125R,X125S,X125T,X125V,X125W,X125Y,X127A,X127C,X127D,X127E,X127F,X127H,X127I,X127K,X127L,X127M,X127N,X127P,X127Q,X127R,X127S,X127T,X127V,X127W,X127Y,X139C,X139D,X139E,X139F,X139G,X139H,X139I,X139K,X139L,X139M,X139N,X139P,X139Q,X139R,X139S,X139T,X139V,X139W,X139Y,X165A,X165C,X165D,X165E,X165F,X165G,X165H,X165K,X165L,X165M,X165N,X165P,X165Q,X165R,X165S,X165T,X165V,X165W,X165Y,X173A,X173C,X173D,X173F,X173G,X173H,X173I,X173K,X173L,X173M,X173N,X173P,X173Q,X173R,X173S,X173T,X173V,X173W,X173Y,X174A,X174C,X174D,X174F,X174G,X174H,X174I,X174K,X174L,X174M,X174N,X174P,X174Q,X174R,X174S,X174T,X174V,X174W,X174Y,X177A,X177C,X177D,X177E,X177F,X177H,X177I,X177K,X177L,X177M,X177N,X177P,X177Q,X177R,X177S,X177T,X177V,X177W,X177Y,X179A,X179C,X179D,X179F,X179G,X179H,X179I,X179K,X179L,X179M,X179N,X179P,X179Q,X179R,X179S,X179T,X179V,X179W,X179Y,X194A,X194C,X194D,X194E,X194F,X194G,X194H,X194I,X194K,X194L,X194M,X194N,X194P,X194Q,X194S,X194T,X194V,X194W,X194Y,X197A,X197C,X197D,X197E,X197F,X197G,X197H,X197I,X197K,X197L,X197M,X197N,X197P,X197R,X197S,X197T,X197V,X197W,X197Y,X202A,X202C,X202D,X202E,X202F,X202G,X202H,X202I,X202K,X202L,X202M,X202N,X202P,X202Q,X202R,X202S,X202T,X202W,X202Y,X216A,X216C,X216D,X216E,X216F,X216G,X216H,X216I,X216K,X216L,X216M,X216N,X216P,X216R,X216S,X216T,X216V,X216W,X216Y,X240A,X240C,X240D,X240E,X240F,X240G,X240H,X240I,X240K,X240L,X240M,X240N,X240P,X240Q,X240R,X240S,X240V,X240W,X240Y,X246A,X246C,X246D,X246E,X246F,X246G,X246H,X246I,X246K,X246L,X246M,X246N,X246P,X246Q,X246S,X246T,X246V,X246W,X246Y,X251A,X251C,X251D,X251E,X251F,X251G,X251H,X251I,X251K,X251L,X251M,X251N,X251P,X251Q,X251R,X251S,X251V,X251W,X251Y,X254A,X254C,X254D,X254E,X254F,X254G,X254I,X254K,X254L,X254M,X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其中X代表任何氨基酸;并且
其中每个氨基酸残基位置的编号与图20所示的银白杨(P.alba)异戊二烯合酶序列中的氨基酸残基位置相对应。
在另一个实施例中,所述变体包含氨基酸残基:N438,E451,和Y514。在另一个实施例中,所述变体包含氨基酸残基:F287,G397,N438,E451,和Y514。在任何实施例中,所述变体包含选自下列的置换:X003H,X003T,X033H,X033I,X033K,X033S,X033T,X033V,X033W,X033Y,X036L,X044F,X044H,X044T,X050I,X050L,X050W,X053I,X053L,X053T,X053V,X053W,X053Y,X059A,X059C,X059F,X059G,X059H,X059I,X059K,X059M,X059R,X069S,X074I,X074K,X074W,X078I,X078L,X078W,X078Y,X087K,X087L,X087T,X099I,X099K,X099L,X099T,X099V,X099Y,X116F,X116I,X116T,X116V,X116W,X116Y,X117F,X117I,X117L,X117W,X120I,X120L,X139T,X165H,X165Y,X173H,X173T,X173V,X173W,X174H,X174I,X177L,X177T,X177V,X179H,X179I,X179K,X179L,X179T,X179V,X179W,X202H,X254K,X376I,X377W,X389K,X421E,X421H,X421R,X448H,X448T,X448V,X462H,X462K,X462V,X476Y,X487T,X489I,X489R,X489T,X489W,X490H,X490I,X490T,X490V,X490W,X491H,X491I,X491K,X491L,X491T,X491V,X491W,X491Y,X492A,X492D,X492E,X492H,X492I,X492K,X492T,X492V,X493E,X493G,X493I,X493K,X493L,X493R,X493T,X493V,X493W,X495H,X495K,X495L,X495M,X495R,X495S,X495T,X495V,X495W,X495Y,X496H,X498H,X509I,X509T,X509V,X539L,X539T,X539V,X540H,X540I,X540K,X540T,X540V,X540Y,X544S,X544T,X544V,和X544W。
在本文的任何实施例中,所述变体包含选自下列的置换:X003T,X016I,X033F,X033H,X033I,X033V,X036I,X044F,X044M,X050H,X050I,X050T,X050W,X053I,X059C,X059E,X059F,X059H,X059I,X059K,X059Q,X059R,X059T,X069S,X069T,X074H,X074I,X074K,X074T,X074V,X074W,X078F,X078H,X078I,X078R,X078T,X078V,X078W,X078Y,X099I,X099K,X099T,X099V,X116F,X116I,X116N,X116P,X116T,X116V,X116W,X117C,X117F,X117I,X117L,X117M,X117W,X125F,X125V,X125W,X127H,X127T,X139T,X165F,X165H,X165K,X165Y,X173F,X173H,X173K,X173R,X173T,X173V,X173W,X174H,X174I,X174T,X179G,X179I,X179S,X216A,X421R,X448R,X448T,X448V,X462H,X462I,X462K,X462V,X462W,X476R,X476V,X487F,X487H,X487T,X487W,X489R,X490F,X490H,X490I,X490V,X490W,X491C,X491H,X491I,X491L,X491T,X491V,X491W,X492A,X492E,X493G,X493I,X493L,X493T,X493V,X493W,X495L,X498C,X540I,X540S,X540T,X540V,和X544K。
在本文的任何实施例中,所述变体包含选自下列的置换:X003T,X033H,X033I,X033V,X044F,X050I,X050W,X053I,X059C,X059F,X059H,X059I,X059K,X059R,X069S,X074I,X074K,X074W,X078I,X099I,X099K,X099T,X099V,X116F,X116I,X116T,X116V,X116W,X117F,X117I,X117L,X117W,X139T,X165H,X165Y,X173H,X173T,X173V,X173W,X174H,X174I,X078W,X078Y,X179I,X421R,X448T,X448V,X462H,X462K,X462V,X487T,X489R,X490H,X490I,X490V,X490W,X491I,X491H,X491L,X491T,X491V,X491W,X492A,X492E,X493G,X493I,X493L,X493T,X493V,X493W,X495L,X540I,X540T,X540V。
在本文的任何实施例中,所述变体包含选自下列的置换:X003F,X003H,X003I,X003K,X003R,X003T,X003Y,X013L,X016I,X016L,X016M,X018C,X018G,X020M,X020S,X020T,X020V,X020Y,X023H,X025H,X025I,X025K,X025L,X025T,X025V,X033F,X033H,X033I,X033K,X033L,X033Q,X033R,X033S,X033T,X033V,X033W,X033Y,X036I,X036L,X036R,X036T,X036V,X036W,X036Y,X044C,X044F,X044H,X044I,X044K,X044T,X044V,X044Y,X050H,X050I,X050L,X050T,X050V,X050W,X050Y,X053G,X053H,X053I,X053K,X053L,X053R,X053S,X053T,X053V,X053W,X053Y,X059A,X059C,X059D,X059E,X059F,X059G,X059H,X059I,X059K,X059M,X059N,X059Q,X059R,X059T,X059V,X059W,X069A,X069H,X069I,X069K,X069L,X069M,X069N,X069Q,X069R,X069S,X069T,X069V,X074H,X074I,X074K,X074L,X074T,X074V,X074W,X074Y,X078F,X078H,X078I,X078K,X078L,X078T,X078V,X078W,X078Y,X087H,X087I,X087K,X087L,X087M,X087R,X087T,X087V,X087W,X087Y,X099F,X099I,X099K,X099L,X099R,X099S,X099T,X099V,X099W,X099Y,X116A,X116F,X116I,X116K,X116L,X116S,X116T,X116V,X116W,X116Y,X117F,X117H,X117I,X117L,X117M,X117W,X120F,X120H,X120I,X120K,X120L,X120T,X120V,X120W,X120Y,X121F,X121H,X121I,X121K,X121L,X121T,X121V,X121W,X121Y,X125H,X125I,X125M,X125T,X125W,X125Y,X127F,X127H,X127I,X127L,X127T,X127V,X127Y,X139C,X139H,X139I,X139P,X139S,X139T,X139V,X165A,X165D,X165F,X165H,X165K,X165L,X165R,X165T,X165Y,X173F,X173G,X173H,X173I,X173K,X173L,X173M,X173R,X173S,X173T,X173V,X173W,X173Y,X174F,X174H,X174I,X174K,X174L,X174R,X174T,X174V,X174W,X174Y,X177A,X177H,X177I,X177K,X177L,X177M,X177P,X177T,X177V,X177Y,X179F,X179G,X179H,X179I,X179K,X179L,X179M,X179S,X179T,X179V,X179W,X179Y,X194H,X197H,X197I,X197M,X197T,X197V,X202F,X202H,X202I,X202K,X202R,X202T,X202Y,X246H,X246K,X246T,X251H,X251K,X251N,X251Y,X254F,X254I,X254K,X254R,X254T,X254V,X254W,X308H,X308I,X308W,X376I,X376Y,X377H,X377I,X377L,X377V,X377W,X379H,X379R,X379T,X379V,X389H,X389I,X389K,X389L,X389M,X389R,X389S,X389T,X389V,X389Y,X403T,X403V,X421E,X421G,X421H,X421I,X421K,X421L,X421R,X421T,X421V,X421W,X426I,X426V,X430S,X430T,X430V,X445H,X448H,X448I,X448R,X448S,X448T,X448V,X457H,X457Q,X457R,X457T,X462F,X462G,X462H,X462I,X462K,X462L,X462S,X462V,X462W,X462Y,X476R,X476T,X476V,X476W,X476Y,X487A,X487C,X487F,X487G,X487H,X487L,X487M,X487R,X487S,X487T,X487V,X487W,X489H,X489I,X489L,X489R,X489T,X489V,X489W,X490F,X490H,X490I,X490M,X490T,X490V,X490W,X491A,X491C,X491F,X491H,X491I,X491K,X491L,X491M,X491N,X491R,X491S,X491T,X491V,X491W,X491Y,X492A,X492C,X492D,X492E,X492H,X492I,X492K,X492L,X492R,X492T,X492V,X492W,X492Y,X493A,X493C,X493E,X493G,X493I,X493K,X493L,X493M,X493R,X493T,X493V,X493W,X493Y,X495A,X495G,X495H,X495I,X495K,X495L,X495M,X495Q,X495R,X495S,X495T,X495V,X495W,X495Y,X496H,X496I,X496K,X496L,X496R,X496T,X496V,X496Y,X497H,X497I,X497L,X497T,X497V,X498F,X498G,X498H,X498I,X498K,X498L,X498R,X498S,X498T,X498V,X498Y,X509I,X509M,X509S,X509T,X509V,X539K,X539L,X539T,X539V,X540E,X540F,X540G,X540H,X540I,X540K,X540M,X540Q,X540R,X540S,X540T,X540V,X540W,X540Y,X544C,X544H,X544I,X544K,X544L,X544S,X544T,X544V,和X544W。
在本文的任何实施例中,所述变体包含选自下列的置换:X003T,X013L,X117I,X165Y,X421R,X495L,X509T,和X540V。在本文的任何实施例中,所述变体包含X003T。在本文的任何实施例中,所述变体包含X495L。在本文的任何实施例中,所述变体包含X509T。
在本文的任何实施例中,表面疏水性氨基酸残基被置换。在本文的任何实施例中,对称接触氨基酸残基被置换。在本文的任何实施例中,保守氨基酸残基被置换。在本文的任何实施例中,N-端环氨基酸残基被置换。在本文的任何实施例中,表面亲水性氨基酸残基被置换。在本文的任何实施例中,表面环氨基酸残基被置换。在本文的任何实施例中,活性位点氨基酸残基被置换。在本文的任何实施例中,柔性环氨基酸残基被置换。在本文的任何实施例中,疏水袋氨基酸残基被置换。在本文的任何实施例中,C-端氨基酸残基被置换。
在本文的任何实施例中,氨基酸残基509具有β-支链碳。在本文的任何实施例中,所述变体具有N-端截短。
在本文的任何实施例中,N-端截短包含与图21A-21B所示的那些相对应的氨基酸残基。
在本文的任何实施例中,所述变体为植物异戊二烯合酶的变体。在本文的任何实施例中,所述变体为白杨变体。在本文的任何实施例中,所述变体为银白杨(P.alba)变体。在本文的任何实施例中,所述变体为美洲山杨(P.tremuloides)变体。在本文的任何实施例中,所述变体为毛果杨(P.trichocharpa)变体。在本文的任何实施例中,所述变体为欧洲黑杨(P.nigra)变体。在本文的任何实施例中,所述变体为银白杨变种美洲山杨(P.alba v.tremuloides)变体。在本文的任何实施例中,所述变体为葛变体。在本文的任何实施例中,所述变体为白杨变体。在本文的任何实施例中,所述变体为英国橡树变体。在本文的任何实施例中,所述变体为柳树变体。
在本文的任何实施例中,所述变体包含与野生型异戊二烯合酶具有至少40%序列同一性的氨基酸序列。在本文的任何实施例中,所述变体包含与野生型异戊二烯合酶具有至少60%序列同一性的氨基酸序列。在本文的任何实施例中,所述变体包含与野生型异戊二烯合酶具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。在本文的任何实施例中,所述变体包含与野生型异戊二烯合酶具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
在本文的任何实施例中,与MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶相比,包含与启动子有效结合的编码所述变体的异源多核苷酸序列的宿主细胞具有至少约0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3或1.4的生长指数。
在另一方面,本发明提供了本文任何实施例的异戊二烯合酶变体,其中与MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶相比,包含与启动子有效结合的编码所述变体的异源多核苷酸序列的宿主细胞具有至少约0.8、0.9、1.0或1.1的性能指数。
在另一方面,本发明提供了本文任何实施例的异戊二烯合酶变体,其中与MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶相比,包含与启动子有效结合的编码所述变体的异源多核苷酸序列的宿主细胞具有下列中的一者或多者:
至少约105%的比生产率,
至少约105%的产率,以及
至少约105%的细胞性能指数。
在另一方面,本发明提供了本文任何实施例的异戊二烯合酶变体,其中与MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶相比,包含与启动子有效结合的编码所述变体的异源多核苷酸序列的宿主细胞具有下列中的一者或多者:
至少约110%的比生产率,
至少约110%的产率,以及
至少约110%的细胞性能指数。
在另一方面,本发明提供了本文任何实施例的异戊二烯合酶变体,其中与MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶相比,包含与启动子有效结合的编码所述变体的异源多核苷酸序列的宿主细胞具有下列中的一者或多者:
至少约120%的比生产率,
至少约120%的产率,以及
至少约120%的细胞性能指数。
在另一方面,本发明提供了本文任何实施例的异戊二烯合酶变体,其中与MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶相比,包含与启动子有效结合的编码所述变体的异源多核苷酸序列的宿主细胞具有下列中的一者或多者:
至少约150%的比生产率,
至少约150%的产率,以及
至少约150%的细胞性能指数。
在另一方面,本发明提供了本文任何实施例的异戊二烯合酶变体,其中与MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶相比,包含与启动子有效结合的编码所述变体的异源多核苷酸序列的宿主细胞具有下列中的一者或多者:
至少约200%的比生产率,
至少约200%的产率,以及
至少约200%的细胞性能指数。
在另一方面,本发明提供了本文任何实施例的异戊二烯合酶变体,其中置换包括X491S。
在另一方面,本发明提供了本文任何实施例的异戊二烯合酶变体,其中所述变体不包含选自表D中所列的那些的置换。
在另一方面,本发明提供了本文任何实施例的异戊二烯合酶变体,其中所述变体未在表E或表F中列出。
在另一方面,本发明提供了包含本文所述的任何异戊二烯合酶变体和载体的组合物。
在另一方面,本发明提供了在容器中包含本文所述的任何异戊二烯合酶变体的试剂盒。
在另一方面,本发明提供了编码本文所述的任何异戊二烯合酶变体的核酸。
在另一方面,本发明提供了包含编码本文所述的任何异戊二烯合酶变体的核酸和载体的组合物。
在另一方面,本发明提供了在容器中包含编码本文所述的任何异戊二烯合酶变体的核酸的试剂盒。
在另一方面,本发明提供了包含与启动子有效结合的编码本文所述的任何异戊二烯合酶变体的异源多核苷酸序列的宿主细胞。在一个实施例中,多核苷酸序列包含在质粒内。在另一个实施例中,多核苷酸序列被整合到宿主细胞的染色体中。在另一个实施例中,宿主细胞选自革兰氏阳性细菌细胞、革兰氏阴性细菌细胞、丝状真菌细胞或酵母细胞。在另一个实施例中,宿主细胞为革兰氏阴性细菌细胞。在另一个实施例中,宿主细胞选自埃希杆菌属(Escherichia sp.)(大肠杆菌(E.coli))、泛菌属(Panteoa sp.)(柠檬泛菌(P.citrea))、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)(枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、耶氏酵母属(Yarrowia sp.)(解脂耶氏酵母(Y.lipolytica))和木霉属(Trichoderma)(瑞氏木霉(T.reesei))。在另一个实施例中,宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)。
在本文的任何实施例中,宿主细胞培养于包含选自葡萄糖、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、酵母提取物、生物质、糖蜜、蔗糖和油的碳源的培养基中。在本文的任何实施例中,宿主细胞培养于包含葡萄糖的培养基中。
在本文的任何实施例中,宿主细胞还包含编码IDI多肽的异源或天然核酸和/或编码DXS多肽的异源或天然核酸,任选地与天然DXP途径结合。
在本文的任何实施例中,宿主细胞包含一个编码异戊二烯合酶变体、IDI多肽和DXS多肽的载体。
在本文的任何实施例中,宿主细胞还包含编码MVA途径多肽的异源核酸,其中MVA途径多肽选自来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的MVA途径多肽。
在本文的任何实施例中,宿主细胞还包含一个或多个编码MVA途径多肽和DXS多肽的核酸,并且其中一个载体编码异戊二烯合酶变体、MVA途径多肽和DXS多肽。
在本文的任何实施例中,宿主细胞还包含一个或多个编码DXS多肽、IDI多肽、其余DXP途径多肽中的一者或多者和/或MVA途径多肽的核酸。
在另一方面,本发明提供了制备能够产生异戊二烯的宿主细胞的方法,所述方法包括将编码本文所述的任何异戊二烯合酶变体的异源多核苷酸序列引入宿主细胞中。
在另一方面,本发明提供了产生异戊二烯的方法,所述方法包括:(a)在适合产生异戊二烯的培养条件下,培养包含编码本文所述的任何异戊二烯合酶变体的异源多核苷酸序列的宿主细胞;以及(b)产生异戊二烯。在一个实施例中,所述方法还包括(c)回收异戊二烯。
在另一方面,本发明提供了产生异戊二烯的方法,所述方法包括:(a)提供:(i)宿主细胞;和(ii)与启动子有效结合的编码本文所述的任何异戊二烯合酶变体的核酸;(b)将核酸引入宿主细胞中,以产生转化的宿主细胞;以及(c)在适合产生异戊二烯的培养条件下培养转化的宿主细胞。在一个实施例中,所述方法还包括(d)回收异戊二烯。
在另一方面,本发明提供了产生异戊二烯合酶变体的方法,所述方法包括:(a)提供:(i)宿主细胞;和(ii)与启动子有效结合的编码本文所述的任何异戊二烯合酶变体的核酸;(b)将核酸引入宿主细胞中,以产生转化的宿主细胞;以及(c)在适合产生异戊二烯合酶变体的培养条件下培养转化的宿主细胞。在一个实施例中,所述方法还包括分离异戊二烯合酶变体。
在另一方面,本发明提供了筛选异戊二烯合酶变体的方法,所述方法包括:(a)让宿主细胞与包含约10μM至约70μM IPTG和约5mM至约20mM甲羟戊酸(MVA)的培养基接触,其中宿主细胞包含与启动子有效结合的编码异戊二烯合酶变体的核酸;以及(b)测量宿主细胞的生长速率;其中生长速率提高表明异戊二烯合酶变体在宿主细胞内将DMAPP转化成异戊二烯的能力有所提高。在一个实施例中,IPTG以约10μM至约60μM的浓度存在于培养基中。在另一个实施例中,IPTG以约20μM至约60μM的浓度存在于培养基中。在另一个实施例中,IPTG以约40μM至约60μM的浓度存在于培养基中。在另一个实施例中,IPTG以约50μM的浓度存在于培养基中。在另一个实施例中,MVA以约5mM至约20mM的浓度存在于培养基中。在另一个实施例中,MVA以约7mM至约15mM的浓度存在于培养基中。在另一个实施例中,MVA以约8mM至约12mM的浓度存在于培养基中。在另一个实施例中,MVA以约10mM的浓度存在于培养基中。在一个实施例中,宿主细胞为MD09-170。
还提供了包含与启动子有效结合的编码异戊二烯合酶变体的多核苷酸序列的表达载体。
还提供了宿主细胞的溶胞产物,其中所述溶胞产物还包含溶菌酶。在一些实施例中,溶胞产物具有中性pH(6.5至7.5),而在其他实施例中,溶胞产物具有碱性pH(高于7.5并低于9.5)。本发明还提供了检测异戊二烯合酶活性的方法,所述方法包括:(a)在适于产生异戊二烯合酶变体的条件下培养包含表达载体的宿主细胞;(b)用包含溶菌酶的裂解缓冲液裂解宿主细胞,以生成细胞溶胞产物;以及(c)通过测量由二甲烯丙基二磷酸(DMAPP)产生的异戊二烯,检测细胞溶胞产物中的异戊二烯合酶活性。
附图说明
图1示出了检定菌株中生长量与DMAPP浓度的关系。DW425在存在多种浓度的甲羟戊酸(实验1中为0、10、20、30、40、50mM甲羟戊酸,实验2中为0、2.5、5、10、20mM甲羟戊酸)和IPTG(0μM IPTG和50μM IPTG)的情况下生长。生长实验结束后,收获并收集细胞进行代谢物分析。
图2示出了在存在不同浓度的IPTG(0、10、20、30、40、50、60和70μM)和甲羟戊酸(0、5、7.5、10、15、20mM)的情况下DW425的生长量。
图3示出了随[IPTG]和[甲羟戊酸]变化的生长量。
图4示出了pCL201的图谱。
图5示出了野生型IspS的视图,图中示出了Phe495相对于Gly491和Leu494的定位,它们均用棍状表示。
图6示出了野生型IspS的视图,图中示出了用棍状表示的Gln509相对于活性位点的定位。根据与PDB1N24的结构比对,对活性位点中的镁离子和(+)-二磷酸冰片酯进行建模。
图7示出了野生型IspS的视图,图中示出了用棍状表示的残基Phe287。根据与PDB1N24的结构比对,布置(+)-二磷酸冰片酯(BP)。
图8示出了野生型IspS的视图,图中示出了用棍状表示的残基Gly397。
图9示出了野生型IspS的活性位点视图,图中示出了用棍状表示的残基Asn438。根据与PDB1N24的结构比对,布置(+)-二磷酸冰片酯(BP)和Mg2+(球状)。
图10示出了野生型IspS的视图,图中示出了用棍状表示的残基Glu451。
图11示出了野生型IspS的活性位点视图,图中示出了用棍状表示的残基Tyr514。根据与PDB1N24的结构比对,布置(+)-二磷酸冰片酯(BP)和Mg2+(球状)。
图12示出了pCHL243的图谱,其包含具有G491S突变的银白杨(P.alba)异戊二烯合酶。
图13示出了排气中异戊二烯浓度(%)与CO2(%)的比率,显示当与整个发酵的重要部分中的呼吸率相比时,表达异戊二烯合酶G491S突变体的菌株DW415具有提高的异戊二烯产生水平。
图14示出了异戊二烯合酶变体G491S的表达,使得在发酵过程中生存能力提高。用DiBAC4(3)染色,根据是否存在膜电位确定发酵液中活细胞和死细胞的比率。
图15为具有G491S的质粒MD09-163的图谱。
图16示出了SDS-PAGE凝胶,图中示出了不同纯化阶段的IspS-G491S。泳道1-分子量标准;泳道2-用TurboTEV消化的IspS-G491S;泳道3-5-第二次过Ni柱后流通液中的IspS-G491S;泳道6-7-第二次过Ni柱所得的IspS-G491S级分。
图17示出了形成二聚体的IspS-G491S。单体A为浅灰色,单体B为深灰色。
图18为在1-σ等值线的残基491处的2FO-2FC电子密度图。A示出了491G,B示出了491S。
图19为包含残基491的环的比对。野生型IspS为浅灰色,IspS-G491S为深灰色。G491S突变产生替代的环结构。
图20A-B示出了序列MEA银白杨(P.alba)。
图21A-B示出了N-端裂解的银白杨(P.alba)IspS序列的比对。
图22示出了异戊二烯的MVA和DXP代谢途径(根据F.Bouvier etal.,Progress in Lipid Res.44:357-429,2005(F.Bouvier等人,《脂类研究进展》,第44卷,第357-429页,2005年))。以下说明包括途径中每种多肽的替代名称以及公开用于测量指定多肽的活性的测定法的参考文献(这些参考文献中的每一个各自据此全文以引用方式并入本文中,特别是关于用于分析MVA和DXP途径中的多肽的多肽活性的测定法的参考文献)。甲羟戊酸途径:AACT;乙酰辅酶A乙酰转移酶,MvaE,EC2.3.1.9。测定法:J.Bacteriol.,184:2116-2122,2002(《细菌学杂志》,第184卷,第2116-2122页,2002年);HMGS;羟甲基戊二酰辅酶A合酶,MvaS,EC2.3.3.10。测定法:J.Bacteriol.,184:4065-4070,2002(《细菌学杂志》,第184卷,第4065-4070页,2002年);HMGR;3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶,MvaE,EC1.1.1.34。测定法:J.Bacteriol.,184:2116-2122,2002(《细菌学杂志》,第184卷,第2116-2122页,2002年);MVK;甲羟戊酸激酶,ERG12,EC2.7.1.36。测定法:Curr Genet19:9-14,1991(《当代遗传学》,第19卷,第9-14页,1991年);PMK;磷酸甲羟戊酸激酶,ERG8,EC2.7.4.2,测定法:Mol Cell Biol.,11:620-631,1991(《分子细胞生物学杂志》,第11卷,第620-631页,1991年);DPMDC;二磷酸甲羟戊酸脱羧酶,MVD1,EC4.1.1.33。测定法:Biochemistry,33:13355-13362,1994(《生物化学》,第33卷,第13355-13362页,1994年);IDI;异戊烯二磷酸δ异构酶,IDI1,EC5.3.3.2。测定法:J.Biol.Chem.264:19169-19175,1989(《生物化学杂志》,第264卷,第19169-19175页,1989年);DXP途径:DXS;1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶,dxs,EC2.2.1.7。测定法:PNAS,94:12857-62,1997(《美国国家科学院院刊》,第94卷,第12857-12862页,1997);DXR;1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶,dxr,EC2.2.1.7。测定法:Eur.J.Biochem.269:4446-4457,2002(《欧洲生物化学杂志》,第269卷,第4446-4457页,2002年);MCT;4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶,IspD,EC2.7.7.60。测定法:PNAS,97:6451-6456,2000(《美国国家科学院院刊》,第97卷,第6451-6456页,2000年);CMK;4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇激酶,IspE,EC2.7.1.148。测定法:PNAS,97:1062-1067,2000(《美国国家科学院院刊》,第97卷,第1062-1067页,2000年);MCS;2C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶,IspF,EC4.6.1.12。测定法:PNAS,96:11758-11763,1999(《美国国家科学院院刊》,第96卷,第11758-11763页,1999年);HDS;1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶,IspG,EC1.17.4.3。测定法:J.Org.Chem.,70:9168-9174,2005(《有机化学杂志》,第70卷,第9168-9174页,2005年);HDR;1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶,IspH,EC1.17.1.2。测定法:JACS,126:12847-12855,2004(《美国化学会志》,第126卷,第12847-12855页,2004年)。
图23示出了野生型IspS的单体视图,图中示出了不容许置换的位点的定位。
图24示出了不容许置换的IspS的活性位点中的残基定位。根据与PDB1N24的结构比对,布置Mg2+(球状)。
图25示出了不容许置换的IspS中的隐埋位点的定位。根据与PDB1N24的结构比对,布置Mg2+(球状)。
图26示出了不容许置换的位于IspS的二聚体界面处的残基。链A为浅灰色,链B为深灰色。
图27示出了不容许置换的位于N-端或与N-端相互作用的IspS位点的定位。根据与PDB1N24的结构比对,对Mg2+(球状)和残基1-50进行建模。
图28示出了不容许置换的位于N-端或与N-端相互作用的IspS位点的定位。根据与PDB1N24的结构比对,布置Mg2+(球状)。
图29示出了所提出的不容许置换的IspS底物捕集环位置。根据与PDB1N24的结构比对,布置Mg2+(球状)。
图30示出了野生型IspS的单体视图,图中示出了变体表现改善的比活性的位点的定位。
图31示出了在IspS的N-端中或与N-端相互作用的隐埋位点的定位,在该定位处变体表现提高的比活性。
图32示出了在IspS的C-端中或与C-端相互作用的隐埋位点的定位,在该定位处变体表现提高的比活性。根据与PDB1N24的结构比对,布置Mg2+(球状)。
图33示出了IspS的二聚体界面,其中链A为浅灰色,链B为深灰色。位置247处的变体表现改善的比活性。
图34示出了IspS的N-端位点的定位,在该定位处变体表现改善的比活性。
图35示出了IspS的表面环位置,在该位置变体表现改善的比活性。根据与PDB1N24的结构比对,布置Mg2+(球状)。
图36示出了IspS的表面位置,在该位置变体表现改善的比活性。根据与PDB1N24的结构比对,布置Mg2+(球状)。
图37示出了提出的IspS的底物捕集环位置,在该位置变体表现改善的比活性。根据与PDB1N24的结构比对,布置Mg2+(球状)。
图38示出了表现改善的活性的IspS位置。根据与PDB1N24的结构比对,布置Mg2+(球状)。
图39示出了表现改善的活性的IspS位置。根据与PDB1N24的结构比对,布置Mg2+(球状)。
图40示出了IspS的单体视图,图中示出了表现改善的生长量的N-端和表面环位置。根据与PDB1N24的结构比对,布置Mg2+(球状)。
图41示出了IspS的单体视图,图中示出了表现改善的生长量的N-端螺旋位置。
图42示出了野生型IspS的单体视图,图中示出了表23(A)中所列位点的定位。根据与PDB1N24的结构比对,布置Mg2+(球状)。B)A中位点的近距离视图。
图43示出了IspS的单体视图,其中具有变体表现改善的生长量的位点的定位,这些定位处为深灰色。根据与PDB1N24的结构比对,布置Mg2+(球状)。
图44示出了IspS的视图,其中具有变体表现改善的生长量的位点的定位,其用棍状表示。A和B相隔180°。
图45示出了N-端截短的银白杨(P.alba)IspS分子的比对。
图46示出了包含银白杨(P.alba)IspS MAR变体的pDW207的质粒图谱。
图47示出了包含银白杨(P.alba)IspS MRR变体的pDW208的质粒图谱。
发明概述
本发明提供了包含至少一种异戊二烯合酶变体酶的方法和组合物。变体包含针对亲代异戊二烯合酶多肽的一个或多个氨基酸残基置换,其中亲代异戊二烯合酶可以是野生型或非野生型序列。本发明提供了在多肽内特定位置处的氨基酸残基置换,其中与亲代序列或参考序列相比,置换可以使至少一种性能有所改善。在一些特别优选的实施例中,至少一种改善的性能选自但不限于:比生产率、产率和细胞性能指数。具体地讲,本发明提供了用于增加宿主细胞中异戊二烯产量的变异植物异戊二烯合酶。本发明的通过生物合成制备的异戊二烯可用于橡胶、聚合物和弹性体的制造。
除非另外指明,本发明的实施将采用本领域技术范围内的常规的蛋白质化学、分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和酶学技术。这些技术在以下文献中有完整解释,例如:Molecular Cloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrook et al.,1989)(《分子克隆:实验室手册(第二版)》(Sambrook等人,1989年))和Molecular Cloning:A Laboratory Manual,third edition(Sambrookand Russel,2001)(《分子克隆:实验室手册(第三版)》(Sambrook和Russel,2001年)),(在本文中共同和单独称为“Sambrook”)。Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)(《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑,1984年));Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.,1987)(《动物细胞培养》(R.I.Freshney编辑,1987年));Handbook ofExperimental Immunology(D.M.Weir&C.C.Blackwell,eds.)(《实验免疫学手册》,D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑);Gene Transfer Vectors forMammalian Cells(J.M.Miller&M.P.Calos,eds.,1987)(《哺乳动物细胞的基因转移载体》(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987年));CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987,includingsupplements through2001)(《现代分子生物学实验技术》(F.M.Ausubel等人编辑,1987年,包括2001年的增刊));PCR:The Polymerase ChainReaction,(Mullis et al.,eds.,1994)(《PCR:聚合酶链反应》(Mullis等人编辑,1994年));Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley&Sons,Inc.,New York,2000)(《现代核酸化学实验技术》(约翰.威利父子出版公司,纽约,2000年));以及Agrawal,ed.,Protocols forOligonucleotides and Analogs,Synthesis and Properties Humana Press Inc.,New Jersey,1993)(《寡核苷酸和类似物实验技术,合成和性质》,Agrawal编辑,胡马纳出版社,新泽西州,1993年)。相应地,接下来定义的术语通过整体参照本说明书来更完整地描述。
此外,本文提供的标题并不是对本发明的各个方面或实施例的限制,这些方面或实施例都可以通过整体参考本说明书而获得。因此,通过整体参考本说明书可更完全地限定下文定义的术语。尽管如此,为了便于理解本发明,将多个术语定义如下。
定义
除非另外定义,否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员所一般理解的含义相同的含义。尽管任何与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料均可用于实践本发明,但在本文中对优选的方法和材料进行了描述。相应地,接下来定义的术语通过整体参照本说明书来更完整地描述。
“X”是指任何氨基酸残基。然而,当在氨基酸置换(如“X003C”)的语境中时,应当理解,“X”是指除由置换产生的氨基酸残基之外的氨基酸残基(如,X为除C之外的氨基酸残基)。在一些实施例中,不包括在残基位置前面的附加的零,因此例如“X003”也可以称为“X3”,表示残基位置3。
“异戊二烯”是指2-甲基-1,3-丁二烯(CAS号78-79-5)。它可以指由3,3-二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)除去焦磷酸所得的直接和最终挥发性C5烃产物。它可不涉及一个或多个异戊烯二磷酸(IPP)分子与一个或多个DMAPP分子的连接或聚合。异戊二烯不受其制造方法的限制。
如本文所用,术语“异戊二烯合酶”、“异戊二烯合酶变体”和“IspS”是指催化从二甲烯丙基二磷酸(DMAPP)中除去焦磷酸以形成异戊二烯的酶。“异戊二烯合酶”可以是野生型序列或异戊二烯合酶变体。
“异戊二烯合酶变体”表示具有异戊二烯合酶活性的非野生型多肽。本领域的技术人员可以用已知的方法测量异戊二烯合酶活性。参见,例如,GC-MS(参见,如,WO2009/132220,实例3)或Silver et al.,J.Biol.Chem.270:13010-13016,1995(Silver等人,《生物化学杂志》,第270卷,第13010-13016页,1995年)。变体可以具有针对野生型异戊二烯合酶序列的置换、添加、缺失和/或截短。变体可以具有针对非野生型异戊二烯合酶序列的置换、添加、缺失和/或截短。本文所述的变体包含至少一个针对亲代异戊二烯合酶多肽的氨基酸残基置换。在一些实施例中,亲代异戊二烯合酶多肽为野生型序列。在一些实施例中,亲代异戊二烯合酶多肽为非野生型序列。在多个实施例中,变体将具有至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约100%、至少约110%、至少约120%、至少约130%、至少约140%、至少约150%、至少约160%、至少约170%、至少约180%、至少约190%、至少约200%的野生型异戊二烯合酶活性。在多个实施例中,变体将与野生型异戊二烯合酶具有至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%的序列同一性。在多个实施例中,变体与野生型之间的不同氨基酸残基的数量可以为一个或多个,如,1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多个氨基酸残基。野生型异戊二烯合酶可以包括任何来自植物的异戊二烯合酶,例如,葛异戊二烯合酶、白杨异戊二烯合酶、英国橡树异戊二烯合酶和柳树异戊二烯合酶。
如本文所用,术语“天然存在的”指自然界中存在的(如还未借助重组或化学方法进行过操纵的)任何物质(如蛋白质、氨基酸或核酸序列)。如本文所用,术语“非天然存在的”是指不存在于自然界中的任何物质(如,在实验室制备的重组产生或化学合成的蛋白质、氨基酸或核酸序列)。
如本文所用,所关注的氨基酸序列的与参考氨基酸序列的氨基酸残基“相对应”的氨基酸残基表示该所关注的序列的该氨基酸残基位于与该参考氨基酸序列中的列举残基同源或等价的定位处。本领域技术人员可确定多肽中特定氨基酸残基位置是否与同源参考序列的位置相对应。例如,可以用已知的技术(如,基本局部比对搜索工具(BLAST)、ClustalW2、基于结构的序列比对程序(STRAP)等)将异戊二烯合酶多肽序列与参考序列(如,SEQ ID NO:1(图20)进行比对。另外,参考序列的晶体结构坐标可以用于帮助确定同源多肽残基的三维结构(参见,例如PCT/US2010/032134(WO2010/124146))。在另一方面,可以通过确定三级结构水平的同源性识别等同的残基。使用此类方法,可以根据参考序列的对应的氨基酸残基位置编号对异戊二烯合酶多肽或异戊二烯合酶变体的氨基酸残基进行编号。例如,SEQ ID NO:1的氨基酸序列(图20)可用于确定所关注的异戊二烯合酶变体的每个氨基酸残基的氨基酸残基位置编号。
在两条核酸或多肽序列的语境中,术语“相同”是指当比对以达到最大匹配程度时两条序列中相同的残基,如使用如下序列比较或分析算法中的一种所测定的。
如本文所用,“同源性”指序列相似性或同一性,其中同一性是优选的。同源性可以使用本领域已知的标准技术测定(参见例如Smith andWaterman,Adv.Appl.Math.2:482[1981](Smith和Waterman,《应用数学进展》,第2卷,第482页,1981年);Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443[1970](Needleman和Wunsch,《分子生物学杂志》,第48卷,第443页,1970年);Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444[1988](Pearson和Lipman,《美国国家科学院院刊》,第85卷,第2444页,1988年);软件程序,如在威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package,得自威斯康星州麦迪逊市遗传学计算机小组(Genetics Computer Group,Madison,WI))中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA;以及Devereux et al.,Nucl.Acid Res.12:387-395[1984](Devereux等人,《核酸研究》,第12卷,第387-395页,1984年))。可用的算法的一个例子是PILEUP。PILEUP使用渐进式逐对比对从一组相关序列产生多个序列对比。其还能够绘制显示聚类关系(用于产生比对)的树形图。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进式比对方法(参见Feng and Doolittle,J.Mol.Evol.35:351-360[1987](Feng和Doolittle,《分子进化杂志》,第35卷,第351-360页,1987年)的简化方法。该方法与Higgins和Sharp描述的方法(参见Higgins and Sharp,CABIOS5:151-153[1989](Higgins和Sharp,《生物科学中的计算机应用》,第5卷,第151-153页,1989年))类似。可用的PILEUP参数包括:默认空位权重3.00、默认空位长度权重0.10,以及加权末端空位。可用的算法的另一个例子是Altschul等人描述的BLAST算法(参见Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410[1990](Altschul等人,《分子生物学杂志》,第215卷,第403-410页,1990年);以及Karlin and Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787[1993](Karlin和Altschul,《美国国家科学院院刊》,第90卷,第5873-5787页,1993年))。特别有用的BLAST程序为WU-BLAST-2程序(参见Altschul et al.,Meth.Enzymol.266:460-480[1996](Altschul等人,《酶学方法》,第266卷,第460-480页,1996年)。WU-BLAST-2使用数种搜索参数,大部分参数设定为默认值。可调参数设定为如下值:重叠跨度(overlap span)=1,重叠分数(overlapfraction)=0.125,字串阈值(word threshold)(T)=11。HSP S和HSP S2参数是动态值,由程序自身根据特定序列的组成和被用来搜索所关注序列的特定数据库的组成来确定。然而,可以调整所述值来增加灵敏度。
参考序列和所关注的测试序列之间的序列同一性百分数可由本领域技术人员容易地测定。多核苷酸或多肽序列共有的同一性百分数通过分子之间序列信息的直接比较测定,所述比较通过序列比对并使用本领域已知的方法确定同一性来进行。适用于确定序列相似性的算法的例子是BLAST算法(参见Altschul,et al.,J.Mol.Biol.,215:403-410[1990](Altschul等人,《分子生物学杂志》,第215卷,第403-410页,1990年))。进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开获得。该算法涉及首先通过在查询序列中确定长度为W的短字串来确定高打分序列对(high scoring sequence pair,HSP),该短字串当与数据库序列中相同长度的字串比对时匹配或满足某取正值的阈值分数T。这些最初的邻近命中字串充当起点来寻找含有它们的更长的HSP。使命中字串沿进行比较的两条序列的每一条朝两个方向扩展至累积比对分数不能增加为止。命中字串的延伸在如下情况会停止:累积比对分数从最大获得值下降达数量X;累积分数达到零或零以下;或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定该算法的灵敏度和速度。BLAST程序使用的默认值是字长(W)为11、BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff and Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915[1992](Henikoff和Henikoff,《美国国家科学院院刊》,第89卷,第10915页,1992年))比对(B)为50,期望值(E)为10,M’5,N’-4,以及对两条链的比较。
BLAST算法然后对两条序列之间的相似性进行统计分析(参见例如Karlin和Altschul,出处同上)。BLAST算法提供的一种相似性量度是最小合计概率(smallest sum probability,P(N)),其指示两条核苷酸或氨基酸序列之间的匹配会偶然发生的概率。例如,如果在试验核酸与异戊二烯合酶核酸的比较中最小合计概率低于约0.1,更优选低于约0.01,最优选低于0.001,则该核酸可视为与本发明的异戊二烯合酶核酸相似。在测试核酸编码异戊二烯合酶多肽的情况中,如果比较得到低于约0.5,更优选低于约0.2的最小合计概率,则其视为与指定的异戊二烯合酶核酸相似。
在两条或更多条核酸或多肽序列的语境中,“相同”或“同一性”百分数是指,当比较和比对以达到最大相似性时,两条或更多条序列是相同的或分别具有指定百分比的相同核酸残基或氨基酸残基,如使用序列比较算法或通过目测所确定的。主题氨基酸序列与参考氨基酸序列的“序列同一性百分数”或“同一性%”或“序列同一性%”或“氨基酸序列同一性%”意指当将序列进行最佳比对时,在比较长度上主题氨基酸序列与参考氨基酸序列相同(即以氨基酸比氨基酸计)达指定的百分数。因此。就两条氨基酸序列而言,80%氨基酸序列同一性或80%同一性意指两条最佳比对的氨基酸序列中80%氨基酸残基是相同的。
主题核酸序列与参照核酸序列的“序列同一性百分数”或“同一性%”或“序列同一性%”意指当将序列进行最佳比对时,在比较长度上主题核酸序列与参考序列相同(即以多核苷酸序列的核苷酸比核苷酸计)达指定的百分数。因此,就两条核酸序列而言,80%核苷酸序列同一性或80%同一性意指两条最佳比对的核酸序列中80%核苷酸残基是相同的。
主题序列与参考序列的“序列同一性百分数”或“序列同一性%”或“同一性%”可通过将两条序列进行最佳比对,并且在比较长度上比较两条最佳比对的序列来计算。确定在最佳比对中相同的残基出现在两条序列中的位置数目,从而提供匹配位置的数目,然后将匹配位置的数目除以比较长度(除非另外指明,否则其为参考序列的长度)的位置总数。所得的数目乘以100而得到主题序列与参考序列的序列同一性百分数。
“最佳比对”或“最佳比对的”指两条(或更多条)序列的给出最高同一性百分比分数的比对。例如,可通过将两条多肽序列进行手动比对使得每条序列中最大数目的相同氨基酸残基被一起比对,或通过使用本文描述的或本领域已知的软件程序或方法,来实现所述序列的最佳比对。可通过将两条核酸序列进行手动比对使得每条序列中最大数目的相同核苷酸残基被一起比对,或通过使用本文描述的或本领域已知的软件程序或方法,来实现所述序列的最佳比对。
当用限定的参数,如限定的氨基酸置换矩阵、空位存在罚分(gapexistence penalty)(也称为空位开放罚分)和空位延伸罚分(gap extensionpenalty)来比对两条序列(如多肽序列),以实现该对序列所可能的最高相似性分数时,这两个序列可认为是“最佳比对的”。在多肽序列比对算法(如BLASTP)中,BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,出处同上)通常用作默认的打分置换矩阵。施加空位存在罚分以在被比对的序列之一者中引入单个氨基酸空位,并为该空位中的每一个残基位置施加空位延伸罚分。所采用的示例性比对参数是:BLOSUM62打分矩阵,空位存在罚分=11,空位延伸罚分=1。比对分数由每条序列的该比对开始和结束的氨基酸位置(如比对窗口),以及任选由一条或两条序列中一个空位或多个空位的插入来限定,以实现可能的最高相似性分数。
两条或更多条序列之间的最佳比对可通过目测手动来确定,或通过使用计算机,例如但不限于如BLASTP程序(用于氨基酸序列)和BLASTN程序(用于核酸序列)(参见例如Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402(1997)(Altschul等人,《核酸研究》,第25卷,第17期,第3389-3402页,1997年);还可参见美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站或CLUSTALW程序。
如果所关注的多肽包含与参考多肽的氨基酸序列具有至少约60%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或至少约99.5%的序列同一性的氨基酸序列,则可称所关注的多肽与参考多肽“基本上相同”。两条这类多肽之间的同一性百分数可通过观察两条经最佳比对的多肽序列来手动确定,或通过使用软件程序或算法(如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)采用标准参数来确定。两条多肽基本上相同的一个指示是第一多肽与第二多肽是免疫交叉反应性的。通常,因保守氨基酸置换而不同的多肽是免疫交叉反应性的。因而,例如在某条多肽与第二多肽仅因保守氨基酸置换或一个或多个保守氨基酸置换而不同的情况中,这两条多肽是基本上相同的。
如果所关注的核酸包含与参考核酸的核苷酸序列具有至少约60%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或至少约99.5%的序列同一性的核苷酸序列,则可称所关注的核酸与参考核酸“基本上相同”。两条这类核酸之间的同一性百分数可通过观察两条经最佳比对的核酸序列来手动确定,或通过使用软件程序或算法(如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)采用标准参数来确定。两条核酸序列基本上相同的一个指示是这两条核酸分子在严格条件(例如,在中等严格性至高严格性的范围内)下彼此杂交。
“核酸”是指单股或双股形式的两个或更多个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。应当理解,包括单核苷酸突变在内的突变可以在如本文所定义的核酸内发生。
“重组核酸”是指这样的所关注核酸,其缺少在该所关注核酸旁侧的、所关注核酸所源自的生物体的天然存在的基因组中的一种或多种核酸(例如基因)。因此,该术语包括(例如)整合到载体中、整合到自主复制型质粒或病毒中或整合到厌氧微生物的基因组DNA中,或者独立于其他序列作为单独的分子(如,cDNA、基因组DNA片段或通过PCR或限制性核酸内切酶消化制备的cDNA片段)存在的重组DNA。可以用本领域已知的分子生物学技术获得重组核酸,或者可以用化学方法合成重组核酸的一部分或全部。
“异源核酸”可以是这样的核酸,其核酸序列来自与宿主细胞不同的另一物种,或相同宿主细胞物种的另一菌株。在一些实施例中,该序列不同于天然存在于相同宿主细胞中的另一核酸的序列。在一些实施例中,异源核酸不同于存在于自然界中的相同宿主细胞内存在的野生型核酸。
“内源性核酸”是核酸序列天然存在于宿主细胞中的核酸。在一些实施例中,内源性核酸与天然存在于宿主细胞中的野生型核酸相同。在一些实施例中,将内源性核酸的一个或多个拷贝引入到宿主细胞中。
本发明的核酸或蛋白质可以是分离的或纯化的形式。如本文所用,“分离的”相对于核酸或蛋白质而言是指与其他组分(例如但不限于细胞或细胞培养物)分离。优选地处于同质状态,但可以在无水溶液或水溶液中。纯度和同质性通常用分析化学技术(如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱)来确定。作为制备物中存在的主要物质的蛋白质或核酸是实质上纯化的。术语“纯化的”意思是核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生基本上一个条带。具体地讲,“纯化的”意指当分离时,以分离物的重量计,分离物含有至少90%、至少95%、至少98%或更优选地至少99%的核酸或蛋白质。
纯化的多肽可以用多种方法获得,包括,例如,实验室合成、色谱法、制备性电泳、凝胶电泳、离心、沉淀、亲和纯化等(通常参见RScopes,Protein Purification,Springer-Verlag,N.Y.(1982)(R Scopes,《蛋白质纯化》,斯普林格出版公司,纽约,1982年),Deutscher,Methods inEnzymology Vol.182:Guide to Protein Purification,Academic Press,Inc.N.Y.(1990)(Deutscher,《酶学方法》,第182卷:蛋白质纯化指南,学术出版公司,纽约,1990年))。
“多肽”包括多肽、蛋白质、肽、多肽片段和融合多肽。还应理解,由于遗传密码的简并性,多肽可由不止一种核苷酸序列编码。
“异源多肽”是异源核酸编码的多肽。在一些实施例中,该序列不同于由天然存在于相同宿主细胞中的核酸编码的另一种多肽的序列。异源蛋白质的例子包括酶,如异戊二烯合酶。在一些实施例中,编码蛋白质的基因是天然存在的基因,而在其他实施例中,使用突变和/或合成基因。
“内源性多肽”为其氨基酸序列天然存在于宿主细胞中的多肽。在一些实施例中,内源性多肽与天然存在于宿主细胞中的野生型多肽相同。
如本文所用,术语“萜类化合物”或“类异戊二烯”是指与萜烯类似的大量且多样类别的天然存在的有机化学物质。萜类化合物衍生自以多种方式组合和改性的五碳异戊二烯单元,并且根据组成员中使用的异戊二烯单元的数量将其归类到不同的组中。半萜类具有一个异戊二烯单元。单萜类具有两个异戊二烯单元。倍半萜类具有三个异戊二烯单元。二萜类具有四个异戊二烯单元。二倍半萜类具有五个异戊二烯单元。三萜类具有六个异戊二烯单元。四萜类具有八个异戊二烯单元。多萜类具有八个以上的异戊二烯单元。
如本文所用,术语“顶空”是指密封容器中的固体或液体样品上聚集的蒸气/空气混合物。
如本文所用,除非上下文另有明确说明,否则单数“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。
除非另外指明,否则核酸从左至右以5’至3’取向写出;氨基酸序列从左至右以氨基至羧基取向写出。
在本说明书通篇中给出的每一个上限值旨在包括每一个下限值,就如同此类下限值在本文中明确地写出一样。在本说明书通篇中给出的每一个下限值将包括每一个上限值,就如同此类上限值在本文中明确地写出一样。在本说明书通篇中给出的每一个数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一个较窄数值范围,就如同此类较窄数值范围在本文中全部明确地写出一样。
对本文中的“约”值或参数的参考还包括(并描述)涉及该值或参数自身的实施例。
应当理解,本文所述的本发明的所有方面和实施例还包括“包含”、“由其组成”和“基本上由其组成”的方面和实施例。应当理解,“基本上由”列举要素“组成”的方法或组合物只包括指定步骤或材料以及不会严重影响那些方法和组合物的基本和新型特性的步骤或材料。
应当理解,本发明不限于所描述的具体方法学、方案和试剂,因为这些方面可根据本领域技术人员使用它们的背景而有所变化。
具体实施方式
异戊二烯单体用于聚异戊二烯和多种共聚物(具有异丁烯、丁二烯、苯乙烯或其他单体)的制造。要构建能够产生商业上可行水平的异戊二烯的菌株(原核或真核),需要对DXP或MVA途径的一部分或全部或者MVA和DXP两者途径进行优化。途径中的关键酶是异戊二烯合酶(IspS),其将前体DMAPP转化成异戊二烯。已鉴定的异戊二烯合酶(IspS)包括来自植物例如白杨、英国橡树和葛藤的那些。鉴定的植物IspS酶中的一些已部分地通过在大肠杆菌(E.coli)中表达进行部分地表征,这些酶的动力参数中的一些已经用纯化蛋白质在体外确定。然而,天然IspS酶的动力参数(Km、速率等)不足以在生物宿主中进行异戊二烯的商业生产。因此,要解决的一个问题是提供异戊二烯合酶变体(如,在特定残基处具有置换的变体),其具有改善的性质,使得可以用生物方法制备更多量的异戊二烯。
要解决本文所述的这个问题,异戊二烯合酶可以在宿主(如,细菌宿主)中表达。另外,通过改造异戊二烯合酶变体使所关注的性质发生改变。通过任何合适的方法或测试并优选地根据所关注性质的评价完成IspS变体的表征。这些变体可用于生物宿主中异戊二烯的商业生产。
所关注的性质包括但不限于:提高的细胞内活性、表达IspS的细胞的比生产率(g/L/OD/hr)(将在下文中更详细描述)、产率(g/g葡萄糖)(如,以下公式2)和细胞性能指数(异戊二烯的克数/细胞干重的克数)。不受理论的约束,可以用IspS的下列任何性质之一或组合获得这些性质:提高细胞活力(如,由于对宿主细胞的底物(如,DMAPP)毒性减轻或异戊二烯合酶酶毒性降低而使宿主细胞更好地生长)、增大kcat、减小Km、提高比活性、提高溶解度、降低不溶性、改善核糖体结合、提高翻译起始速率、提高翻译延伸速率、提高转录起始速率、提高转录延伸速率、减少DNA二级结构、减少RNA二级结构、增加DNA二级结构、增加RNA二级结构、提高折叠速率、提高对细胞内分子伴侣的亲和力、提高稳定性、降低蛋白质周转、减少对细胞内蛋白酶的暴露、降低对细胞内蛋白酶的亲和力、降低对周质的定位、改善对细胞质的定位、减少包涵体形成、减少膜定位、由于更有利的密码子而增加表达、提高DNA稳定性、提高RNA稳定性和降低RNA降解。简而言之,对编码或表达IspS变体的核酸序列(DNA和RNA)的性质或IspS酶本身的生物化学性质具有正面影响的任何突变都可使细胞内具有更大的活性。其他所关注的性质包括最适pH、温度稳定性(如,Tm值)以及对潜在抑制剂(包括底物或产物抑制)的敏感性。氧化和蛋白水解稳定性也是所关注的。此外,由于金属离子效应和离子强度而导致的活化或抑制也是所关注的。
可以通过使用纯化或部分纯化的异戊二烯合酶体外使DMAPP转化为异戊二烯或在表达DXP途径、MVA途径或两者的宿主生物体,例如大肠杆菌(E.coli)的环境下体内使DMAPP转化为异戊二烯,从而评价这些性质和参数。可以设想,在一种或多种测试条件下,具有多种程度的稳定性、溶解度、活性和/或表达水平的酶将可用于在本发明中在多种宿主中产生异戊二烯。
本发明的特征在于用于产生增加量的异戊二烯的组合物和方法。具体地讲,这些组合物和方法可以提高异戊二烯的产生速率并增加产生的异戊二烯总量。本文所述的产生异戊二烯的生物合成方法是使用天然橡胶的理想的替代形式。如下文进一步讨论的,可通过将编码异戊二烯合酶(IspS)变体的异源核酸引入到细胞中,来大大提高细胞产生的异戊二烯量。
另外,可通过提高由包含异源异戊二烯合酶核酸的细胞表达的一种或多种DXP途径多肽(如,1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)多肽)和/或异戊烯二磷酸异构酶(IDI)多肽的量,来提高所述细胞的异戊二烯产量。例如,可以将DXS核酸和/或IDI核酸引入所述细胞中。DXS核酸可以是异源核酸或内源性核酸的副本。相似地,IDI核酸可以是异源核酸或内源性核酸的副本。在一些实施例中,通过用导致DXS和/或IDI核酸更高转录水平的其他启动子和/或调控区替代内源性DXS和/或IDI启动子或调控区来增加DXS和/或IDI多肽的量。在一些实施例中,细胞既包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸(如,植物异戊二烯合酶核酸),也包含编码异戊二烯合酶多肽的内源性核酸的副本。
编码的DXS和IDI多肽是用于生物合成异戊二烯的DXP途径的一部分(图22)。DXS多肽将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。无意受任何具体理论的约束,据信增加DXS多肽的量能增加流向DXP途径的碳流量,从而导致更高的异戊二烯产量。IDI多肽催化异戊烯二磷酸(IPP)与二甲烯丙基二磷酸(DMAPP)之间的相互转化。无意受任何具体理论的约束,据信增加细胞中IDI多肽的量能增加被转化为DMAPP的IPP的量,DMAPP进而被转化为异戊二烯。
如下文所详述,在一些实施例中,可通过增加一种或多种MVA多肽在包含异源异戊二烯合酶核酸的细胞中的表达来提高所述细胞的异戊二烯产量(图22)。示例性的MVA途径多肽包括下列多肽中的任何一种:乙酰辅酶A乙酰转移酶(AA-CoA硫解酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(HMG-CoA合酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)多肽、甲羟戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽、IDI多肽,以及具有两种或更多种MVA途径多肽的活性的多肽(例如,融合多肽)。例如,可将一种或多种MVA途径核酸引入细胞中。在一些实施例中,细胞包含MVA上游途径,所述MVA上游途径包含AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶以及HMG-CoA还原酶核酸。在一些实施例中,细胞包含MVA下游途径,所述MVA下游途径包含MVK、PMK、MVD和IDI核酸。在一些实施例中,细胞包含整个MVA途径,所述整个MVA途径包含AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、MVK、PMK、MVD和IDI核酸。MVA途径核酸可以是异源核酸或内源性核酸的副本。在一些实施例中,通过用导致MVA途径核酸更高转录水平的其他启动子和/或调控区替代MVA途径核酸的内源性启动子或调控区来增加一种或多种MVA途径多肽的量。在一些实施例中,细胞既包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸(如,植物异戊二烯合酶核酸),也包含编码异戊二烯合酶多肽的内源性核酸的副本。
在一些实施例中,细胞的至少一部分使异源异戊二烯合酶、DXS、IDI、其他DXP途径和/或MVA途径核酸在连续培养物(如未稀释的连续培养物)中保持至少约5次、10次、20次、50次、75次、100次、200次、300次或更多次的细胞分裂。在本发明任何方面的一些实施例中,包括异源异戊二烯合酶或内源性异戊二烯合酶的副本、DXS、IDI、其他DXP途径和/或MVA途径核酸的核酸还包含选择标记,例如卡那霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博莱霉素、新霉素或氯霉素抗生素抗性核酸。
异戊二烯合酶多肽将二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转化成异戊二烯。示例性的异戊二烯合酶多肽包括具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。可使用标准的方法,通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将DMAPP转化为异戊二烯的能力,来测定该多肽是否具有异戊二烯合酶多肽活性。细胞提取物中的异戊二烯合酶多肽活性可例如按以下文献所描述进行测量:Silver et al.,J.Biol.Chem.270:13010-13016,1995(Silver等人,《生物化学杂志》,第270卷,第13010-13016页,1995年)以及其中的参考文献。
在一个实施例中,在氮气流下将DMAPP(西格玛公司(Sigma))蒸发至干燥并在pH8.2的100mM磷酸钾缓冲液中将其再水化至100mM的浓度,并保存于-20℃下。为进行该测定,可将5μl的1M MgCl2、1mM(250μg/ml)DMAPP、65μl的植物提取物缓冲液(PEB)(50mM Tris-HCl,pH8.0,20mM MgCl2,5%甘油和2mM DTT)的溶液加入20mL顶空小瓶中的25μl细胞提取物中,并在振动下和37℃下培养15分钟,该小瓶具有金属旋盖和涂特氟龙的硅隔膜(安捷伦科技公司(Agilent Technologies))。通过添加200μl的250mM EDTA或通过热灭活淬灭反应,并通过GC/MS对异戊二烯进行定量。
异戊二烯合酶亲代序列
可以用亲代异戊二烯合酶生成异戊二烯合酶变体,其中亲代异戊二烯合酶可以是如本文所述的异戊二烯合酶,包括野生型和非野生型异戊二烯合酶。示例性的亲代异戊二烯合酶核酸包括编码具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性的亲代异戊二烯合酶多肽和核酸包括来自本文所述的任何来源生物的天然多肽和核酸以及衍自本文所述的任何来源生物的变异多肽和核酸。
在一些实施例中,亲代异戊二烯合酶来自蝶形花科、杨柳科或山毛榉科。在一些实施例中,亲代异戊二烯合酶多肽或核酸为来自葛麻姆(Pueraria montana)(葛)(Sharkey et al.,Plant Physiology137:700-712,2005(Sharkey等人,《植物生理学》,第137卷,第700-712页,2005年)、白杨(例如银白杨x欧洲山杨(Populus alba x tremula CAC35696,Miller et al.,Planta213:483-487,2001(Miller等人,《植物学》,第213卷,第483-487页,2001年))或银白杨(P.alba)、山杨(例如美洲山杨(Populus tremuloides))Silver et al.,JBC270(22):13010-1316,1995(Silver等人,《生物化学杂志》,第270卷,第22期,第13010-1316页,1995年))或英国橡树(夏栎(Quercus robur))(Zimmer等人,WO98/02550)的天然多肽或核酸。合适的亲代异戊二烯合酶包括但不限于由GenBank登录号AY341431、AY316691、AB198180、AJ294819.1、EU693027.1、EF638224.1、AM410988.1、EF147555.1、AY279379、AJ457070和AY182241标识的那些。另外的亲代序列在PCT/US2009/041581(WO2009/132220)和PCT/US2010/032134(WO2010/124146)中有所描述。
在多个实施例中,亲代异戊二烯合酶与MEA银白杨(P.alba)具有至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约92%、至少约94%、至少约96%、至少约98%、至少约99%的序列同一性。在其他实施例中,亲代异戊二烯合酶与全长银白杨(P.alba)或完整的银白杨(P.alba)具有至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约92%、至少约94%、至少约96%、至少约98%、至少约99%的序列同一性(参见,如,图21和21B)。
适于产生本发明酶的变体的若干方法是本领域已知的,包括但不限于点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化以及各种其他重组方法。
异戊二烯合酶变体
多肽,如异戊二烯合酶,具有由主要氨基酸序列和围绕多肽的环境确定的三维结构。该三维结构确立了多肽的活性、稳定性、结合亲和力、结合特异性和其他生化属性。因此,了解蛋白质的三维结构可以在改进其生物活性;例如,更大的催化活性和/或溶解度方面提供更多的指导。多种异戊二烯合酶的晶体结构坐标在W02009/132220和PCT/US2010/032134(WO2010/124146)中有所描述。
发明人已鉴定出残基定位,其在亲代异戊二烯合酶中的突变(如,置换)可以使变体具有一种或多种改善的性质。在本发明的一个方面,突变是在与MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶(SEQ ID NO:1)中的位置相对应的定位处的置换,如下所示。
因此,在一个方面,可以制备在这些定位处具有一个或多个置换的异戊二烯变体(如,实例7-9所述),并筛选出改善的异戊二烯合酶性质,这将在下文中更详细描述。技术人员可用于鉴定目的的示例性性顾包括但不限于与MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶比活性相比,比活性有所增加,以及在类似生长条件下与表达MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶的重组宿主细胞的生长量相比,表达所述异戊二烯合酶变体的重组宿主细胞的生长量有所增加。
MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶的序列如下(并还示于图20中):
MEARRSANYEPNSWDYDYLLSSDTDESIEVYKDKAKKLEAEVRREINNEKAEFLTLLELIDNVQRLGLGYRFESDIRGALDRFVSSGGFDAVTKTSLHGTALSFRLLRQHGFEVSQEAFSGFKDQNGNFLENLKEDIKAILSLYEASFLALEGENILDEAKVFAISHLKELSEEKIGKELAEQVNHALELPLHRRTQRLEAVWSIEAYRKKEDANQVLLELAILDYNMIQSVYQRDLRETSRWWRRVGLATKLHFARDRLIESFYWAVGVAFEPQYSDCRNSVAKMFSFVTIIDDIYDVYGTLDELELFTDAVERWDVNAINDLPDYMKLCFLALYNTINEIAYDNLKDKGENILPYLTKAWADLCNAFLQEAKWLYNKSTPTFDDYFGNAWKSSSGPLQLVFAYFAVVQNIKKEEIENLQKYHDTISRPSHIFRLCNDLASASAEIARGETANSVSCYMRTKGISEELATESVMNLIDETWKKMNKEKLGGSLFAKPFVETAINLARQSHCTYHNGDAHTSPDELTRKRVLSVITEPILPFER(SEQ IDNO:1)。
可以制备本文所述的置换的组合,并筛选出改善的异戊二烯合酶性质。具有一种或多种改善的异戊二烯合酶性质的置换组合的异戊二烯合酶变体的非限制性例子在表25(变体1-27)和表26(变体1-12)中有所描述。
在一个方面,鉴定的用于MEA银白杨(P.alba)突变的残基包括表A中所列的那些。表A中的残基和残基编号对应于SEQ ID NO:1(图20)中所示的MEA银白杨(P.alba)的残基编号。
表A.诱变位点
如表A所用,“表面疏水性”是指存在于蛋白质表面上的疏水性氨基酸残基,“表面亲水性”是指存在于蛋白质表面上的亲水性氨基酸残基,“对称接触”是指与晶体结构中的另一个异戊二烯合酶分子接触的异戊二烯合酶分子表面上的残基,“保守”是指大多数萜烯合酶共有的残基,“N-端环”是指存在于蛋白质的N-端环中的残基,“表面环”是指存在于蛋白质的表面环中的残基,“活性位点”是指存在于蛋白质活性位点中的残基,“柔性环”是指存在于蛋白质的柔性环区域中的残基,“疏水袋”是指存在于蛋白质疏水袋中的残基,“C-端”是指存在于蛋白质C-端区域中的残基。
如下文实例中进一步描述的,多种异戊二烯合酶变体是用在表A中所示的残基定位处的置换制备而成的。本文所述变体中的任何一种(包括表A、B、权利要求书或实例中所述的变体)都可用于本发明的组合物和方法。对MEA银白杨(P.alba)变体产生的特定置换示于表B中。
表B.MEA银白杨(P.alba)的示例性氨基酸置换
A003C | A003D | A003E | A003F | A003G | A003H | A003I | A003K | A003L | A003M |
A003N | A003P | A003Q | A003R | A003S | A003T | A003V | A003W | A003Y | A007C |
A007D | A007E | A007F | A007G | A007H | A007I | A007K | A007L | A007M | A007N |
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N012R | N012S | N012T | N012V | N012W | N012Y | S013A | S013C | S013D | S013E |
S013F | S013G | S013H | S013I | S013K | S013L | S013M | S013N | S01P3 | S013Q |
S013R | S013T | S013V | S013W | S013Y | Y016A | Y016C | Y016D | Y016E | Y016F |
Y016G | Y016H | Y016I | Y016K | Y016L | Y016M | Y016N | Y016P | Y016Q | Y016R |
Y016S | Y016T | Y016V | Y016W | Y018A | Y018C | Y018D | Y0E18 | Y018F | Y018G |
Y018H | Y018I | Y018K | Y018L | Y018M | Y018N | Y018P | Y018Q | Y018R | Y018S |
Y018T | Y018V | Y018W | L020A | L020C | L020D | L020E | L020F | L020G | L020H |
L020I | L020K | L020M | L020N | L020P | L020Q | L020R | L020S | L020T | L020V |
L020W | L020Y | D023A | D023C | D023E | D023F | D023G | D023H | D023I | D023K |
D023L | D023M | D023N | D023P | D023Q | D023R | D023S | D023T | D023V | D023W |
D023Y | D025A | D025C | D025E | D025F | D025G | D025H | D025I | D025K | D025L |
D025M | D025N | D025P | D025Q | D025R | D025S | D025T | D025V | D025W | D025Y |
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L540M | L540N | L540P | L540Q | L540R | L540S | L540T | L540V | L540W | L540Y |
R544A | R544C | R544D | R544E | R544F | R544G | R544H | R544I | R544K | R544L |
R544M | R544N | R544P | R544Q | R544S | R544T | R544V | R544W | R544Y |
表B描述了MEA银白杨(P.alba)中的特定置换。其他亲代异戊二烯合酶中的对应残基可以通过类似的突变生成本发明的异戊二烯合酶变体。表C示出了本发明的示例性置换,其中“X”是指任何氨基酸残基。然而,应当理解,“X”是指除由置换产生的氨基酸残基之外的氨基酸残基(如,对“X3C”而言,X为除C之外的氨基酸残基)。表C中的残基编号对应于MEA银白杨(P.alba)序列中的残基编号。因此,应当理解,不同亲代序列(如野生型美洲山杨(P.tremuloides))的残基“003”是指美洲山杨(P.tremuloides)序列中对应于MEA银白杨(P.alba)的残基003的残基,并且美洲山杨(P.tremuloides)序列的残基“003”不一定是美洲山杨(P.tremuloides)的氨基酸序列中顺序为三的残基。
表C.示例性氨基酸残基置换
X003C | X003D | X003E | X003F | X003G | X003H | X003I | X003K | X003L | X003M |
X003N | X003P | X003Q | X003R | X003S | X003T | X003V | X003W | X003Y | X007C |
X007D | X007E | X007F | X007G | X007H | X007I | X007K | X007L | X007M | X007N |
X007P | X007Q | X007R | X007S | X007T | X007V | X007W | X007Y | X009A | X009C |
X009D | X009E | X009F | X009G | X009H | X009I | X009K | X009L | X009M | X009N |
X009P | X009Q | X009R | X009S | X009T | X009V | X009W | X012A | X012C | X012D |
X012E | X012F | X012G | X012H | X012I | X012K | X012L | X012M | X012P | X012Q |
X012R | X012S | X012T | X012V | X012W | X012Y | X013A | X013C | X013D | X013E |
X013F | X013G | X013H | X013I | X013K | X013L | X013M | X013N | X01P3 | X013Q |
X013R | X013T | X013V | X013W | X013Y | X016A | X016C | X016D | X016E | X016F |
X016G | X016H | X016I | X016K | X016L | X016M | X016N | X016P | X016Q | X016R |
X016S | X016T | X016V | X016W | X018A | X018C | X018D | X0E18 | X018F | X018G |
X018H | X018I | X018K | X018L | X018M | X018N | X018P | X018Q | X018R | X018S |
X018T | X018V | X018W | X020A | X020C | X020D | X020E | X020F | X020G | X020H |
X020I | X020K | X020M | X020N | X020P | X020Q | X020R | X020S | X020T | X020V |
X020W | X020Y | X023A | X023C | X023E | X023F | X023G | X023H | X023I | X023K |
X023L | X023M | X023N | X023P | X023Q | X023R | X023S | X023T | X023V | X023W |
X023Y | X025A | X025C | X025E | X025F | X025G | X025H | X025I | X025K | X025L |
X025M | X025N | X025P | X025Q | X025R | X025S | X025T | X025V | X025W | X025Y |
X026A | X026C | X026D | X026F | X026G | X026H | X026I | X026K | X026L | X026M |
X026N | X026P | X026Q | X026R | X026S | X026T | X026V | X026W | X026Y | X027A |
X027C | X027D | X027E | X027F | X027G | X027H | X027I | X027K | X027L | X027M |
X027N | X027P | X027Q | X0R27 | X027V | X027W | X027Y | X033A | X033C | X033E |
X033F | X033G | X033H | X033I | X033K | X033L | X033M | X033N | X033P | X033Q |
X033R | X033S | X033T | X033V | X033W | X033Y | X036A | X036C | X036D | X036E |
X036F | X036G | X036G | X036I | X036L | X036M | X036N | X036P | X036Q | X036R |
X036S | X036T | X036V | X036W | X036Y | X044A | X044C | X044D | X044E | X044F |
X044G | X044H | X044I | X044K | X044L | X044M | X044N | X044P | X044Q | X044S |
X044T | X044V | X044W | X044Y | X050A | X050C | X050D | X050E | X050F | X050G |
X050H | X050I | X050L | X050M | X050N | X050P | X050Q | X050R | X050S | X050T |
X050V | X050W | X050Y | X053A | X053C | X053D | X053E | X053G | X053H | X053I |
X053K | X053L | X053M | X053N | X053P | X053Q | X053R | X053S | X053T | X053V |
X053W | X053Y | X059A | X059C | X059D | X059E | X059F | X059G | X059H | X059I |
X059K | X059M | X059N | X059P | X059Q | X059R | X059S | X059T | X059V | X059W |
X059Y | X069A | X069C | X069D | X069E | X069F | X069H | X069I | X069K | X069L |
X069M | X069N | X069P | X069Q | X069R | X069S | X069T | X069V | X069W | X069Y |
X074A | X074C | X074D | X074E | X074F | X074G | X074H | X074I | X074K | X074L |
X074M | X074N | X074P | X074Q | X074R | X074T | X074V | X074W | X074Y | X078A |
X078C | X078D | X078E | X078F | X078H | X078I | X078K | X078L | X078M | X078N |
X078P | X078Q | X078R | X078S | X078T | X078V | X078W | X078Y | X081A | X081C |
X081E | X081F | X081G | X081H | X081I | X081K | X081L | X081M | X081N | X081P |
X081Q | X081R | X081S | X081T | X081V | X081W | X081Y | X087A | X087C | X087D |
X087E | X087F | X087H | X087I | X087K | X087L | X087M | X087N | X087P | X087Q |
X087R | X087S | X087T | X087V | X087W | X087Y | X099A | X099C | X099D | X099E |
X099F | X099H | X099I | X099K | X099L | X099M | X099N | X099P | X099Q | X099R |
X099S | X099T | X099V | X099W | X099Y | X116A | X116C | X116D | X116E | X116F |
X116G | X116H | X116I | X116K | X116L | X116M | X116N | X116P | X116R | X116S |
X116T | X116V | X116W | X116Y | X117A | X117C | X117D | X117F | X117G | X117H |
X117I | X117K | X117L | X117M | X117N | X117P | X117Q | X117R | X117S | X117T |
X117V | X117W | X117Y | X120A | X120C | X120D | X120E | X120F | X120G | X120H |
X120I | X120K | X120L | X120M | X120N | X120P | X120Q | X120R | X120T | X120V |
X120W | X120Y | X121A | X121C | X121D | X121E | X121F | X121H | X121I | X121K |
X121L | X121M | X121N | X121P | X121Q | X121R | X121S | X121T | X121V | X121W |
X121Y | X125A | X125C | X125D | X125E | X125F | X125G | X125H | X125I | X125K |
X125L | X125M | X125N | X125P | X125R | X125S | X125T | X125V | X125W | X125Y |
X127A | X127C | X127D | X127E | X127F | X127H | X127I | X127K | X127L | X127M |
X127N | X127P | X127Q | X127R | X127S | X127T | X127V | X127W | X127Y | X139C |
X139D | X139E | X139F | X139G | X139H | X139I | X139K | X139L | X139M | X139N |
X139P | X139Q | X139R | X139S | X139T | X139V | X139W | X139Y | X165A | X165C |
X165D | X165E | X165F | X165G | X165H | X165K | X165L | X165M | X165N | X165P |
X165Q | X165R | X165S | X165T | X165V | X165W | X165Y | X173A | X173C | X173D |
X173F | X173G | X173H | X173I | X173K | X173L | X173M | X173N | X173P | X173Q |
X173R | X173S | X173T | X173V | X173W | X173Y | X174A | X174C | X174D | X174F |
X174G | X174H | X174I | X174K | X174L | X174M | X174N | X174P | X174Q | X174R |
X174S | X174T | X174V | X174W | X174Y | X177A | X177C | X177D | X177E | X177F |
X177H | X177I | X177K | X177L | X177M | X177N | X177P | X177Q | X177R | X177S |
X177T | X177V | X177W | X177Y | X179A | X179C | X179D | X179F | X179G | X179H |
X179I | X179K | X179L | X179M | X179N | X179P | X179Q | X179R | X179S | X179T |
X179V | X179W | X179Y | X194A | X194C | X194D | X194E | X194F | X194G | X194H |
X194I | X194K | X194L | X194M | X194N | X194P | X194Q | X194S | X194T | X194V |
X194W | X194Y | X197A | X197C | X197D | X197E | X197F | X197G | X197H | X197I |
X197K | X197L | X197M | X197N | X197P | X197R | X197S | X197T | X197V | X197W |
X197Y | X202A | X202C | X202D | X202E | X202F | X202G | X202H | X202I | X202K |
X202L | X202M | X202N | X202P | X202Q | X202R | X202S | X202T | X202W | X202Y |
X216A | X216C | X216D | X216E | X216F | X216G | X216H | X216I | X216K | X216L |
X216M | X216N | X216P | X216R | X216S | X216T | X216V | X216W | X216Y | X240A |
X240C | X240D | X240E | X240F | X240G | X240H | X240I | X240K | X240L | X240M |
X240N | X240P | X240Q | X240R | X240S | X240V | X240W | X240Y | X246A | X246C |
X246D | X246E | X246F | X246G | X246H | X246I | X246K | X246L | X246M | X246N |
X246P | X246Q | X246S | X246T | X246V | X246W | X246Y | X251A | X251C | X251D |
X251E | X251F | X251G | X251H | X251I | X251K | X251L | X251M | X251N | X251P |
X251Q | X251R | X251S | X251V | X251W | X251Y | X254A | X254C | X254D | X254E |
X254F | X254G | X254I | X254K | X254L | X254M | X254N | X254P | X254Q | X254R |
X254S | X254T | X254V | X254W | X254Y | X287A | X287C | X287D | X287E | X287G |
X287H | X287I | X287K | X287L | X287M | X287N | X287P | X287Q | X287R | X287S |
X287T | X287V | X287W | X287Y | X290A | X290C | X290D | X290E | X290F | X290G |
X290H | X290I | X290K | X290L | X290M | X290N | X290P | X290Q | X290R | X290S |
X290T | X290W | X290Y | X308A | X308C | X308D | X308E | X308F | X308G | X308H |
X308I | X308K | X308M | X308N | X308P | X308Q | X308R | X308S | X308T | X308V |
X308W | X308Y | X376A | X376C | X376D | X376E | X376F | X376G | X376H | X376I |
X376K | X376M | X376N | X376P | X376Q | X376R | X376S | X376T | X376V | X376W |
X376Y | X377A | X377C | X377D | X377E | X377F | X377G | X377H | X377I | X377K |
X377L | X377M | X377N | X377P | X377Q | X377R | X377S | X377T | X377V | X377W |
X379A | X379C | X379D | X379E | X379F | X379G | X379H | X379I | X379L | X379M |
X379N | X379P | X379Q | X379R | X379S | X379T | X379V | X379W | X379Y | X389A |
X389C | X389D | X389E | X389F | X389H | X389I | X389K | X389L | X389M | X389N |
X389P | X389Q | X389R | X389S | X389T | X389V | X389W | X389Y | X397A | X397C |
X397D | X397E | X397F | X397H | X397I | X397K | X397L | X397M | X397N | X397P |
X397Q | X397R | X397S | X397T | X397V | X397W | X397Y | X400A | X400C | X400D |
X400E | X400F | X400G | X400H | X400I | X400K | X400L | X400M | X400N | X400P |
X400R | X400S | X400T | X400V | X400W | X400Y | X403A | X403C | X403D | X403E |
X403G | X403H | X403I | X403K | X403L | X403M | X403N | X403P | X403Q | X403R |
X403S | X403T | X403V | X403W | X403Y | X421A | X421C | X421D | X421E | X421F |
X421G | X421H | X421I | X421K | X421L | X421M | X421N | X421P | X421R | X421S |
X421T | X421V | X421W | X421Y | X426A | X426C | X426D | X426E | X426F | X426G |
X426H | X426I | X426K | X426L | X426M | X426N | X426P | X426Q | X426R | X426S |
X426V | X426W | X426Y | X430A | X430C | X430D | X430E | X430F | X430G | X430H |
X430I | X430K | X430L | X430M | X430N | X430Q | X430R | X430S | X430T | X430V |
X430W | X430Y | X434A | X434C | X434D | X434E | X434G | X434H | X434I | X434K |
X434L | X434M | X434N | X434P | X434Q | X434R | X434S | X434T | X434V | X434W |
X434Y | X445C | X445D | X445E | X445F | X445G | X445H | X445I | X445K | X445L |
X445M | X445N | X445P | X445Q | X445R | X445S | X445T | X445V | X445W | X445Y |
X448C | X448D | X448E | X448F | X448G | X448H | X448I | X448K | X448L | X448M |
X448N | X448P | X448Q | X448R | X448S | X448T | X448V | X448W | X448Y | X457A |
X457C | X457D | X457E | X457F | X457G | X457H | X457I | X457K | X457L | X457M |
X457N | X457P | X457Q | X457R | X457T | X457V | X457W | X457Y | X462A | X462C |
X462D | X462E | X462F | X462G | X462H | X462I | X462K | X462L | X462M | X462N |
X462P | X462Q | X462R | X462S | X462V | X462W | X462Y | X476A | X476C | X476D |
X476E | X476F | X476G | X476H | X476I | X476K | X476L | X476M | X476P | X476Q |
X476R | X476S | X476T | X476V | X476W | X476Y | X487A | X487C | X487D | X487E |
X487F | X487G | X487H | X487I | X487L | X487M | X487N | X487P | X487Q | X487R |
X487S | X487T | X487V | X487W | X487Y | X488A | X488C | X488D | X488F | X488G |
X488H | X488I | X488K | X488L | X488M | X488N | X488P | X488Q | X488R | X488S |
X488T | X488V | X488W | X488Y | X489A | X489C | X489D | X489E | X489F | X489G |
X489H | X489I | X489L | X489M | X489N | X489P | X489Q | X489R | X489S | X489T |
X489V | X489W | X489Y | X490A | X490C | X490D | X490E | X490F | X490G | X490H |
X490I | X490K | X490M | X490N | X490P | X490Q | X490R | X490S | X490T | X490V |
X490W | X490Y | X491A | X491C | X491D | X491E | X491F | X491H | X491I | X491K |
X491L | X491M | X491N | X491P | X491Q | X491R | X491S | X491T | X491V | X491W |
X491Y | X492A | X492C | X492D | X492E | X492F | X492H | X492I | X492K | X492L |
X492M | X492N | X492P | X492Q | X492R | X492S | X492T | X492V | X492W | X492Y |
X493A | X493C | X493D | X493E | X493F | X493G | X493H | X493I | X493K | X493L |
X493M | X493N | X493P | X493Q | X493R | X493T | X493V | X493W | X493Y | X495A |
X495C | X495D | X495E | X495G | X495H | X495I | X495K | X495L | X495M | X495N |
X495P | X495Q | X495R | X495S | X495T | X495V | X495W | X495Y | X496C | X496D |
X496E | X496F | X496G | X496H | X496I | X496K | X496L | X496M | X496N | X496P |
X496Q | X496R | X496S | X496T | X496V | X496W | X496Y | X497A | X497C | X497D |
X497E | X497F | X497G | X497H | X497I | X497L | X497M | X497N | X497P | X497Q |
X497R | X497S | X497T | X497V | X497W | X497Y | X498A | X498C | X498D | X498E |
X498F | X498G | X498H | X498I | X498K | X498L | X498M | X498N | X498Q | X498R |
X498S | X498T | X498V | X498W | X498Y | X509A | X509C | X509D | X509E | X509F |
X509G | X509H | X509I | X509K | X509L | X509M | X509N | X509P | X509R | X509S |
X509T | X509V | X509W | X509Y | X514A | X514C | X514D | X514E | X514F | X514G |
X514H | X514I | X514K | X514L | X514M | X514N | X514P | X514Q | X514R | X514S |
X514T | X514V | X514W | X521A | X521C | X521D | X521E | X521F | X521G | X521H |
X521I | X521K | X521L | X521M | X521N | X521P | X521Q | X521R | X521S | X521V |
X521W | X521Y | X539A | X539C | X539D | X539E | X539F | X539G | X539H | X539K |
X539L | X539M | X539N | X539P | X539Q | X539R | X539S | X539T | X539V | X539W |
X539Y | X540A | X540C | X540D | X540E | X540F | X540G | X540H | X540I | X540K |
X540M | X540N | X540P | X540Q | X540R | X540S | X540T | X540V | X540W | X540Y |
X544A | X544C | X544D | X544E | X544F | X544G | X544H | X544I | X544K | X544L |
X544M | X544N | X544P | X544Q | X544S | X544T | X544V | X544W | X544Y |
在一些实施例中,变体包含选自下列的置换:X003T,X013L,X165Y,X421R,X495L,X509T,和X540V。在一些实施例中,变体包含X003T。在一些实施例中,变体包含X013L。在一些实施例中,变体包含X165Y。在一些实施例中,变体包含X421R。在一些实施例中,变体包含X495L。在一些实施例中,变体包含X509T。在一些实施例中,变体包含X540V。在一些实施例中,变体包含置换X491S。在一些实施例中,除选自下列的另一个置换外,变体还包含置换X491S:X003C,X003D,X003E,X003F,X003G,X003H,X003I,X003K,X003L,X003M,X003N,X003P,X0030,X003R,X003S,X003T,X003V,X003W,X003Y,X007C,X007D,X007E,X007F,X007G,X007H,X007I,X007K,X007L,X007M,X007N,X007P,X007Q,X007R,X007S,X007T,X007V,X007W,X007Y,X009A,X009C,X009D,X009E,X009F,X009G,X009H,X009I,X009K,X009L,X009M,X009N,X009P,X009Q,X009R,X009S,X009T,X009V,X009W,X012A,X012C,X012D,X012E,X012F,X012G,X012H,X012I,X012K,X012L,X012M,X012P,X012Q,X012R,X012S,X012T,X012V,X012W,X012Y,X013A,X013C,X013D,X013E,X013F,X013G,X013H,X013I,X013K,X013L,X013M,X013N,X01P3,X013Q,X013R,X013T,X013V,X013W,X013Y,X016A,X016C,X016D,X016E,X016F,X016G,X016H,X016I,X016K,X016L,X016M,X016N,X016P,X016Q,X016R,X016S,X016T,X016V,X016W,X018A,X018C,X018D,X0E18,X018F,X018G,X018H,X018I,X018K,X018L,X018M,X018N,X018P,X018Q,X018R,X018S,X018T,X018V,X018W,X020A,X020C,X020D,X020E,X020F,X020G,X020H,X020I,X020K,X020M,X020N,X020P,X020Q,X020R,X020S,X020T,X020V,X020W,X020Y,X023A,X023C,X023E,X023F,X023G,X023H,X023I,X023K,X023L,X023M,X023N,X023P,X023Q,X023R,X023S,X023T,X023V,X023W,X023Y,X025A,X025C,X025E,X025F,X025G,X025H,X025I,X025K,X025L,X025M,X025N,X025P,X025Q,X025R,X025S,X025T,X025V,X025W,X025Y,X026A,X026C,X026D,X026F,X026G,X026H,X026I,X026K,X026L,X026M,X026N,X026P,X026Q,X026R,X026S,X026T,X026V,X026W,X026Y,X027A,X027C,X027D,X027E,X027F,X027G,X027H,X027I,X027K,X027L,X027M,X027N,X027P,X027Q,X0R27,X027V,X027W,X027Y,X033A,X033C,X033E,X033F,X033G,X033H,X033I,X033K,X033L,X033M,X033N,X033P,X033Q,X033R,X033S,X033T,X033V,X033W,X033Y,X036A,X036C,X036D,X036E,X036F,X036G,X036G,X036I,X036L,X036M,X036N,X036P,X036Q,X036R,X036S,X036T,X036V,X036W,X036Y,X044A,X044C,X044D,X044E,X044F,X044G,X044H,X044I,X044K,X044L,X044M,X044N,X044P,X044Q,X044S,X044T,X044V,X044W,X044Y,X050A,X050C,X050D,X050E,X050F,X050G,X050H,X050I,X050L,X050M,X050N,X050P,X050Q,X050R,X050S,X050T,X050V,X050W,X050Y,X053A,X053C,X053D,X053E,X053G,X053H,X053I,X053K,X053L,X053M,X053N,X053P,X053Q,X053R,X053S,X053T,X053V,X053W,X053Y,X059A,X059C,X059D,X059E,X059F,X059G,X059H,X059I,X059K,X059M,X059N,X059P,X059Q,X059R,X059S,X059T,X059V,X059W,X059Y,X069A,X069C,X069D,X069E,X069F,X069H,X069I,X069K,X069L,X069M,X069N,X069P,X069Q,X069R,X069S,X069T,X069V,X069W,X069Y,X074A,X074C,X074D,X074E,X074F,X074G,X074H,X074I,X074K,X074L,X074M,X074N,X074P,X074Q,X074R,X074T,X074V,X074W,X074Y,X078A,X078C,X078D,X078E,X078F,X078H,X078I,X078K,X078L,X078M,X078N,X078P,X078Q,X078R,X078S,X078T,X078V,X078W,X078Y,X081A,X081C,X081E,X081F,X081G,X081H,X081I,X081K,X081L,X081M,X081N,X081P,X081Q,X081R,X081S,X081T,X081V,X081W,X081Y,X087A,X087C,X087D,X087E,X087F,X087H,X087I,X087K,X087L,X087M,X087N,X087P,X087Q,X087R,X087S,X087T,X087V,X087W,X087Y,X099A,X099C,X099D,X099E,X099F,X099H,X099I,X099K,X099L,X099M,X099N,X099P,X099Q,X099R,X099S,X099T,X099V,X099W,X099Y,X116A,X116C,X116D,X116E,X116F,X116G,X116H,X116I,X116K,X116L,X116M,X116N,X116P,X116R,X116S,X116T,X116V,X116W,X116Y,X117A,X117C,X117D,X117F,X117G,X117H,X117I,X117K,X117L,X117M,X117N,X117P,X117Q,X117R,X117S,X117T,X117V,X117W,X117Y,X120A,X120C,X120D,X120E,X120F,X120G,X120H,X120I,X120K,X120L,X120M,X120N,X120P,X120Q,X120R,X120T,X120V,X120W,X120Y,X121A,X121C,X121D,X121E,X121F,X121H,X121I,X121K,X121L,X121M,X121N,X121P,X121Q,X121R,X121S,X121T,X121V,X121W,X121Y,X125A,X125C,X125D,X125E,X125F,X125G,X125H,X125I,X125K,X125L,X125M,X125N,X125P,X125R,X125S,X125T,X125V,X125W,X125Y,X127A,X127C,X127D,X127E,X127F,X127H,X127I,X127K,X127L,X127M,X127N,X127P,X127Q,X127R,X127S,X127T,X127V,X127W,X127Y,X139C,X139D,X139E,X139F,X139G,X139H,X139I,X139K,X139L,X139M,X139N,X139P,X139Q,X139R,X139S,X139T,X139V,X139W,X139Y,X165A,X165C,X165D,X165E,X165F,X165G,X165H,X165K,X165L,X165M,X165N,X165P,X165Q,X165R,X165S,X165T,X165V,X165W,X165Y,X173A,X173C,X173D,X173F,X173G,X173H,X173I,X173K,X173L,X173M,X173N,X173P,X173Q,X173R,X173S,X173T,X173V,X173W,X173Y,X174A,X174C,X174D,X174F,X174G,X174H,X174I,X174K,X174L,X174M,X174N,X174P,X174Q,X174R,X174S,X174T,X174V,X174W,X174Y,X177A,X177C,X177D,X177E,X177F,X177H,X177I,X177K,X177L,X177M,X177N,X177P,X177Q,X177R,X177S,X177T,X177V,X177W,X177Y,X179A,X179C,X179D,X179F,X179G,X179H,X179I,X179K,X179L,X179M,X179N,X179P,X179Q,X179R,X179S,X179T,X179V,X179W,X179Y,X194A,X194C,X194D,X194E,X194F,X194G,X194H,X194I,X194K,X194L,X194M,X194N,X194P,X194Q,X194S,X194T,X194V,X194W,X194Y,X197A,X197C,X197D,X197E,X197F,X197G,X197H,X197I,X197K,X197L,X197M,X197N,X197P,X197R,X197S,X197T,X197V,X197W,X197Y,X202A,X202C,X202D,X202E,X202F,X202G,X202H,X202I,X202K,X202L,X202M,X202N,X202P,X202Q,X202R,X202S,X202T,X202W,X202Y,X216A,X216C,X216D,X216E,X216F,X216G,X216H,X216I,X216K,X216L,X216M,X216N,X216P,X216R,X216S,X216T,X216V,X216W,X216Y,X240A,X240C,X240D,X240E,X240F,X240G,X240H,X240I,X240K,X240L,X240M,X240N,X240P,X240Q,X240R,X240S,X240V,X240W,X240Y,X246A,X246C,X246D,X246E,X246F,X246G,X246H,X246I,X246K,X246L,X246M,X246N,X246P,X246Q,X246S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在一些实施例中,变体包含氨基酸残基:N438,E451,和Y514。在一些实施例中,变体包含氨基酸残基:F287,G397,N438,E451,和Y514。在一些实施例中,变体包含S491。在一些实施例中,除选自下列的置换外,变体还包含S491:X003C,X003D,X003E,X003F,X003G,X003H,X003I,X003K,X003L,X003M,X003N,X003P,X003Q,X003R,X003S,X003T,X003V,X003W,X003Y,X007C,X007D,X007E,X007F,X007G,X007H,X007I,X007K,X007L,X007M,X007N,X007P,X007Q,X007R,X007S,X007T,X007V,X007W,X007Y,X009A,X009C,X009D,X009E,X009F,X009G,X009H,X009I,X009K,X009L,X009M,X009N,X009P,X009Q,X009R,X009S,X009T,X009V,X009W,X012A,X012C,X012D,X012E,X012F,X012G,X012H,X012I,X012K,X012L,X012M,X012P,X012Q,X012R,X012S,X012T,X012V,X012W,X012Y,X013A,X013C,X013D,X013E,X013F,X013G,X013H,X013I,X013K,X013L,X013M,X013N,X01P3,X013Q,X013R,X013T,X013V,X013W,X013Y,X016A,X016C,X016D,X016E,X016F,X016G,X016H,X016I,X016K,X016L,X016M,X016N,X016P,X016Q,X016R,X016S,X016T,X016V,X016W,X018A,X018C,X018D,X0E18,X018F,X018G,X018H,X018I,X018K,X018L,X018M,X018N,X018P,X018Q,X018R,X018S,X018T,X018V,X018W,X020A,X020C,X020D,X020E,X020F,X020G,X020H,X020I,X020K,X020M,X020N,X020P,X020Q,X020R,X020S,X020T,X020V,X020W,X020Y,X023A,X023C,X023E,X023F,X023G,X023H,X023I,X023K,X023L,X023M,X023N,X023P,X023Q,X023R,X023S,X023T,X023V,X023W,X023Y,X025A,X025C,X025E,X025F,X025G,X025H,X025I,X025K,X025L,X025M,X025N,X025P,X025Q,X025R,X025S,X025T,X025V,X025W,X025Y,X026A,X026C,X026D,X026F,X026G,X026H,X026I,X026K,X026L,X026M,X026N,X026P,X026Q,X026R,X026S,X026T,X026V,X026W,X026Y,X027A,X027C,X027D,X027E,X027F,X027G,X027H,X027I,X027K,X027L,X027M,X027N,X027P,X027Q,X0R27,X027V,X027W,X027Y,X033A,X033C,X033E,X033F,X033G,X033H,X033I,X033K,X033L,X033M,X033N,X033P,X033Q,X033R,X033S,X033T,X033V,X033W,X033Y,X036A,X036C,X036D,X036E,X036F,X036G,X036G,X036I,X036L,X036M,X036N,X036P,X036Q,X036R,X036S,X036T,X036V,X036W,X036Y,X044A,X044C,X044D,X044E,X044F,X044G,X044H,X044I,X044K,X044L,X044M,X044N,X044P,X044Q,X044S,X044T,X044V,X044W,X044Y,X050A,X050C,X050D,X050E,X050F,X050G,X050H,X050I,X050L,X050M,X050N,X050P,X050Q,X050R,X050S,X050T,X050V,X050W,X050Y,X053A,X053C,X053D,X053E,X053G,X053H,X053I,X053K,X053L,X053M,X053N,X053P,X053Q,X053R,X053S,X053T,X053V,X053W,X053Y,X059A,X059C,X059D,X059E,X059F,X059G,X059H,X059I,X059K,X059M,X059N,X059P,X059Q,X059R,X059S,X059T,X059V,X059W,X059Y,X069A,X069C,X069D,X069E,X069F,X069H,X069I,X069K,X069L,X069M,X069N,X069P,X069Q,X069R,X069S,X069T,X069V,X069W,X069Y,X074A,X074C,X074D,X074E,X074F,X074G,X074H,X074I,X074K,X074L,X074M,X074N,X074P,X074Q,X074R,X074T,X074V,X074W,X074Y,X078A,X078C,X078D,X078E,X078F,X078H,X078I,X078K,X078L,X078M,X078N,X078P,X078Q,X078R,X078S,X078T,X078V,X078W,X078Y,X081A,X081C,X081E,X081F,X081G,X081H,X081I,X081K,X081L,X081M,X081N,X081P,X081Q,X081R,X081S,X081T,X081V,X081W,X081Y,X087A,X087C,X087D,X087E,X087F,X087H,X087I,X087K,X087L,X087M,X087N,X087P,X087Q,X087R,X087S,X087T,X087V,X087W,X087Y,X099A,X099C,X099D,X099E,X099F,X099H,X099I,X099K,X099L,X099M,X099N,X099P,X099Q,X099R,X099S,X099T,X099V,X099W,X099Y,X116A,X116C,X116D,X116E,X116F,X116G,X116H,X116I,X116K,X116L,X116M,X116N,X116P,X116R,X116S,X116T,X116V,X116W,X116Y,X117A,X117C,X117D,X117F,X117G,X117H,X117I,X117K,X117L,X117M,X117N,X117P,X117Q,X117R,X117S,X117T,X117V,X117W,X117Y,X120A,X120C,X120D,X120E,X120F,X120G,X120H,X120I,X120K,X120L,X120M,X120N,X120P,X120Q,X120R,X120T,X120V,X120W,X120Y,X121A,X121C,X121D,X121E,X121F,X121H,X121I,X121K,X121L,X121M,X121N,X121P,X121Q,X121R,X121S,X121T,X121V,X121W,X121Y,X125A,X125C,X125D,X125E,X125F,X125G,X125H,X125I,X125K,X125L,X125M,X125N,X125P,X125R,X125S,X125T,X125V,X125W,X125Y,X127A,X127C,X127D,X127E,X127F,X127H,X127I,X127K,X127L,X127M,X127N,X127P,X127Q,X127R,X127S,X127T,X127V,X127W,X127Y,X139C,X139D,X139E,X139F,X139G,X139H,X139I,X139K,X139L,X139M,X139N,X139P,X139Q,X139R,X139S,X139T,X139V,X139W,X139Y,X165A,X165C,X165D,X165E,X165F,X165G,X165H,X165K,X165L,X165M,X165N,X165P,X165Q,X165R,X165S,X165T,X165V,X165W,X165Y,X173A,X173C,X173D,X173F,X173G,X173H,X173I,X173K,X173L,X173M,X173N,X173P,X173Q,X173R,X173S,X173T,X173V,X173W,X173Y,X174A,X174C,X174D,X174F,X174G,X174H,X174I,X174K,X174L,X174M,X174N,X174P,X174Q,X174R,X174S,X174T,X174V,X174W,X174Y,X177A,X177C,X177D,X177E,X177F,X177H,X177I,X177K,X177L,X177M,X177N,X177P,X177Q,X177R,X177S,X177T,X177V,X177W,X177Y,X179A,X179C,X179D,X179F,X179G,X179H,X179I,X179K,X179L,X179M,X179N,X179P,X179Q,X179R,X179S,X179T,X179V,X179W,X179Y,X194A,X194C,X194D,X194E,X194F,X194G,X194H,X194I,X194K,X194L,X194M,X194N,X194P,X194Q,X194S,X194T,X194V,X194W,X194Y,X197A,X197C,X197D,X197E,X197F,X197G,X197H,X197I,X197K,X197L,X197M,X197N,X197P,X197R,X197S,X197T,X197V,X197W,X197Y,X202A,X202C,X202D,X202E,X202F,X202G,X202H,X202I,X202K,X202L,X202M,X202N,X202P,X202Q,X202R,X202S,X202T,X202W,X202Y,X216A,X216C,X216D,X216E,X216F,X216G,X216H,X216I,X216K,X216L,X216M,X216N,X216P,X216R,X216S,X216T,X216V,X216W,X216Y,X240A,X240C,X240D,X240E,X240F,X240G,X240H,X240I,X240K,X240L,X240M,X240N,X240P,X240Q,X240R,X240S,X240V,X240W,X240Y,X246A,X246C,X246D,X246E,X246F,X246G,X246H,X246I,X246K,X246L,X246M,X246N,X246P,X246Q,X246S,X246T,X246V,X246W,X246Y,X251A,X251C,X251D,X251E,X251F,X251G,X251H,X251I,X251K,X251L,X251M,X251N,X251P,X251Q,X251R,X251S,X251V,X251W,X251Y,X254A,X254C,X254D,X254E,X254F,X254G,X254I,X254K,X254L,X254M,X254N,X254P,X254Q,X254R,X254S,X254T,X254V,X254W,X254Y,X287A,X287C,X287D,X287E,X287G,X287H,X287I,X287K,X287L,X287M,X287N,X287P,X287Q,X287R,X287S,X287T,X287V,X287W,X287Y,X290A,X290C,X290D,X290E,X290F,X290G,X290H,X290I,X290K,X290L,X290M,X290N,X290P,X290Q,X290R,X290S,X290T,X290W,X290Y,X308A,X308C,X308D,X308E,X308F,X308G,X308H,X308I,X308K,X308M,X308N,X308P,X308Q,X308R,X308S,X308T,X308V,X308W,X308Y,X376A,X376C,X376D,X376E,X376F,X376G,X376H,X376I,X376K,X376M,X376N,X376P,X376Q,X376R,X376S,X376T,X376V,X376W,X376Y,X377A,X377C,X377D,X377E,X377F,X377G,X377H,X377I,X377K,X377L,X377M,X377N,X377P,X377Q,X377R,X377S,X377T,X377V,X377W,X379A,X379C,X379D,X379E,X379F,X379G,X379H,X379I,X379L,X379M,X379N,X379P,X379Q,X379R,X379S,X379T,X379V,X379W,X379Y,X389A,X389C,X389D,X389E,X389F,X389H,X389I,X389K,X389L,X389M,X389N,X389P,X389Q,X389R,X389S,X389T,X389V,X389W,X389Y,X397A,X397C,X397D,X397E,X397F,X397H,X397I,X397K,X397L,X397M,X397N,X397P,X397Q,X397R,X397S,X397T,X397V,X397W,X397Y,X400A,X400C,X400D,X400E,X400F,X400G,X400H,X400I,X400K,X400L,X400M,X400N,X400P,X400R,X400S,X400T,X400V,X400W,X400Y,X403A,X403C,X403D,X403E,X403G,X403H,X403I,X403K,X403L,X403M,X403N,X403P,X403Q,X403R,X403S,X403T,X403V,X403W,X403Y,X421A,X421C,X421D,X421E,X421F,X421G,X421H,X421I,X421K,X421L,X421M,X421N,X421P,X421R,X421S,X421T,X421V,X421W,X421Y,X426A,X426C,X426D,X426E,X426F,X426G,X426H,X426I,X426K,X426L,X426M,X426N,X426P,X426Q,X426R,X426S,X426V,X426W,X426Y,X430A,X430C,X430D,X430E,X430F,X430G,X430H,X430I,X430K,X430L,X430M,X430N,X430Q,X430R,X430S,X430T,X430V,X430W,X430Y,X434A,X434C,X434D,X434E,X434G,X434H,X434I,X434K,X434L,X434M,X434N,X434P,X434Q,X434R,X434S,X434T,X434V,X434W,X434Y,X445C,X445D,X445E,X445F,X445G,X445H,X445I,X445K,X445L,X445M,X445N,X445P,X445Q,X445R,X445S,X445T,X445V,X445W,X445Y,X448C,X448D,X448E,X448F,X448G,X448H,X448I,X448K,X448L,X448M,X448N,X448P,X448Q,X448R,X448S,X448T,X448V,X448W,X448Y,X457A,X457C,X457D,X457E,X457F,X457G,X457H,X457I,X457K,X457L,X457M,X457N,X457P,X457Q,X457R,X457T,X457V,X457W,X457Y,X462A,X462C,X462D,X462E,X462F,X462G,X462H,X462I,X462K,X462L,X462M,X462N,X462P,X462Q,X462R,X462S,X462V,X462W,X462Y,X476A,X476C,X476D,X476E,X476F,X476G,X476H,X476I,X476K,X476L,X476M,X476P,X476Q,X476R,X476S,X476T,X476V,X476W,X476Y,X487A,X487C,X487D,X487E,X487F,X487G,X487H,X487I,X487L,X487M,X487N,X487P,X487Q,X487R,X487S,X487T,X487V,X487W,X487Y,X488A,X488C,X488D,X488F,X488G,X488H,X488I,X488K,X488L,X488M,X488N,X488P,X488Q,X488R,X488S,X488T,X488V,X488W,X488Y,X489A,X489C,X489D,X489E,X489F,X489G,X489H,X489I,X489L,X489M,X489N,X489P,X489Q,X489R,X489S,X489T,X489V,X489W,X489Y,X490A,X490C,X490D,X490E,X490F,X490G,X490H,X490I,X490K,X490M,X490N,X490P,X490Q,X490R,X490S,X490T,X490V,X490W,X490Y,X491A,X491C,X491D,X491E,X491F,X491H,X491I,X491K,X491L,X491M,X491N,X491P,X491Q,X491R,X491S,X491T,X491V,X491W,X491Y,X492A,X492C,X492D,X492E,X492F,X492H,X492I,X492K,X492L,X492M,X492N,X492P,X492Q,X492R,X492S,X492T,X492V,X492W,X492Y,X493A,X493C,X493D,X493E,X493F,X493G,X493H,X493I,X493K,X493L,X493M,X493N,X493P,X493Q,X493R,X493T,X493V,X493W,X493Y,X495A,X495C,X495D,X495E,X495G,X495H,X495I,X495K,X495L,X495M,X495N,X495P,X495Q,X495R,X495S,X495T,X495V,X495W,X495Y,X496C,X496D,X496E,X496F,X496G,X496H,X496I,X496K,X496L,X496M,X496N,X496P,X496Q,X496R,X496S,X496T,X496V,X496W,X496Y,X497A,X497C,X497D,X497E,X497F,X497G,X497H,X497I,X497L,X497M,X497N,X497P,X497Q,X497R,X497S,X497T,X497V,X497W,X497Y,X498A,X498C,X498D,X498E,X498F,X498G,X498H,X498I,X498K,X498L,X498M,X498N,X498Q,X498R,X498S,X498T,X498V,X498W,X498Y,X509A,X509C,X509D,X509E,X509F,X509G,X509H,X509I,X509K,X509L,X509M,X509N,X509P,X509R,X509S,X509T,X509V,X509W,X509Y,X514A,X514C,X514D,X514E,X514F,X514G,X514H,X514I,X514K,X514L,X514M,X514N,X514P,X514Q,X514R,X514S,X514T,X514V,X514W,X521A,X521C,X521D,X521E,X521F,X521G,X521H,X521I,X521K,X521L,X521M,X521N,X521P,X521Q,X521R,X521S,X521V,X521W,X521Y,X539A,X539C,X539D,X539E,X539F,X539G,X539H,X539K,X539L,X539M,X539N,X539P,X539Q,X539R,X539S,X539T,X539V,X539W,X539Y,X540A,X540C,X540D,X540E,X540F,X540G,X540H,X540I,X540K,X540M,X540N,X540P,X540Q,X540R,X540S,X540T,X540V,X540W,X540Y,X544A,X544C,X544D,X544E,X544F,X544G,X544H,X544I,X544K,X544L,X544M,X544N,X544P,X544Q,X544S,X544T,X544V,X544W,和X544Y;其中X代表任何氨基酸;并且其中每个氨基酸残基位置的编号与图20中所示的银白杨(P.alba)异戊二烯合酶序列中的氨基酸残基位置相对应。
在一些实施例中,异戊二烯合酶变体不是野生型异戊二烯合酶序列。在一些实施例中,异戊二烯合酶变体不是PCT/US2009/041581(WO2009/132220)或PCT/US2010/032134(WO2010/124146)中所述的序列。
在一些实施例中,异戊二烯合酶变体不包含PCT/US2009/041581(WO2009/132220)中所公开的氨基酸残基置换。
在一些实施例中,异戊二烯合酶变体不包含表D中的氨基酸残基置换。
在一些实施例中,异戊二烯合酶变体不包含表E中的序列。在一些实施例中,表E和F中所示的序列可以具有选自那些表中所示的那些置换的一个或多个置换。
在一些实施例中,异戊二烯合酶变体不包含表F中的序列。
正如指出的,表4-6中的序列和置换的残基编号在PCT/US2009/041581(WO2009/132220)或PCT/US2010/032134(WO2010/124146)中有所定义。本领域的技术人员能够确定表4-6中的残基如何与参考序列的残基相对应,所述参考序列例如MEA银白杨(P.alba)(图20)(SEQ ID NO:1)。
N-端截短
在一些实施例中,变体包含N-端区域截短,其包含N-端区域的一个或多个氨基酸残基的截短。参见例如实例10。N-端截短的例子在PCT/US2009/041581(WO2009/132220)中有所描述。在一些实施例中,包含N-端截短的异戊二烯合酶变体具有与全长异戊二烯合酶相比有所提高的比活性。N-端截短的例子包括例如与银白杨(P.alba)异戊二烯合酶的N-端截短的残基相对应的残基:MEA变体、MSV变体、MVS变体、MTE变体、MNV变体、TRC(-3)变体、TRC(-4)变体、TRC(-5)变体、TRC(-6)变体和TRC(-7)变体;美洲山杨(P.tremuloides)异戊二烯合酶:MET变体;以及毛果杨(P.trichocharpa)异戊二烯合酶:MET变体,其中所述序列在PCT/US2009/041581(WO2009/132220)中有所描述。在一些实施例中,变体中截短的残基对应银白杨(P.alba)异戊二烯合酶MEA变体中截短的残基(参见图21A-21B)。
异戊二烯合酶变体性质
在一些实施例中,变体具有至少一种相比参考序列有所改善的性质。在一些实施例中,参考序列为亲代序列。在一些实施例中,参考序列为野生型异戊二烯合酶。在一些实施例中,参考序列为MEA银白杨(P.alba)(SEQ ID NO:1),也如图20中所示。
所关注的性质包括但不限于:提高的细胞内活性、比生产率、产率和细胞性能指数。在一些实施例中,比生产率提高了至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多倍。在一个实施例中,比生产率为约20mg/L/OD/hr。在其他实施例中,产率提高了至少约2、3、4、5倍或更多倍。在其他实施例中,细胞性能指数增大了至少约2、3、4、5倍或更多倍。在其他实施例中,细胞内活性提高了至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多倍。
不受理论的约束,可以用IspS的下列任何性质之一或组合获得这些性质:提高细胞活力、增大kcat、减小Km、提高比活性、提高溶解度、降低不溶性、改善核糖体结合、提高翻译起始速率、提高翻译延伸速率、提高转录起始速率、提高转录延伸速率、减少DNA二级结构、减少RNA二级结构、增加DNA二级结构、增加RNA二级结构、提高折叠速率、提高对细胞内分子伴侣的亲和力、提高稳定性、降低蛋白质周转、减少对细胞内蛋白酶的暴露、降低对细胞内蛋白酶的亲和力、降低对周质的定位、改善对细胞质的定位、减少包涵体形成、减少膜定位、由于更有利的密码子而增加表达、提高DNA稳定性、提高RNA稳定性和降低RNA降解。简而言之,对编码或表达IspS变体的核酸序列(DNA和RNA)的性质或IspS酶本身的生物化学性质具有正面影响的任何突变都可使细胞内具有更大的活性。其他所关注的性质包括最适pH、温度稳定性(如,Tm值)以及对潜在抑制剂(包括底物或产物抑制)的敏感性。氧化和蛋白水解稳定性也是所关注的。此外,由于金属离子效应和离子强度而导致的活化或抑制也是所关注的。
在一个实施例中,可以通过用给定时间内生成的异戊二烯的摩尔量除以每个样品中的蛋白质的特定量,来计算整组SEL中每个变体的比活性值。可以通过用任何给定变体的比活性除以用相同微量滴定板测得的若干WT比活性测量值的平均值,来计算性能指数(PI)。例如,比活性PI值为1.5的变体将比WT提高50%。也可以用相同的方式计算蛋白质浓度和产生的异戊二烯的PI。使用这些测量值进行详细的数据分析,如实例中所示。
也可以用包含编码异戊二烯合酶变体的核酸的宿主细胞的生长指数或性能指数指示特定变体是否具有所关注的性质。可以根据本领域技术人员已知的方法和/或如本文所教导确定生长指数和性能指数。可以通过与参考序列比较来确定特定变体的生长和性能指数。在一些实施例中,参考序列为变体的亲代序列。在一些实施例中,参考序列为野生型序列。在一些实施例中,参考序列为MEA银白杨(P.alba)。在一些实施例中,根据实例2中的方法确定生长指数。在一些实施例中,根据实例4中的方法确定生长指数。在多个实施例中,与参考序列相比,变体的生长指数为至少约0.8、至少约0.9、至少约1.0、至少约1.1、至少约1.2、至少约1.3。在多个实施例中,与参考序列相比,变体的性能指数为至少约0.7、至少约0.8、至少约0.9、至少约1.0、至少约1.1、至少约1.2。
确定所关注性质的方法是本领域技术人员已知的。某些方法还在本文实例中有所描述。可以根据得到改善的所需结果或性质来评价变体。例如,对于为了提高比活性而改造的变体异戊二烯合酶而言,可以用纯化或部分纯化的变体异戊二烯合酶体外测试DMAPP向异戊二烯的转化或在宿主生物体,例如大肠杆菌(E.coli.)的环境中体内测试DMAPP向异戊二烯的转化。在一些情况下,大肠杆菌(E.coli)也可以表达DXP途径、MVA途径或两者。可以通过与其他异戊二烯合酶比较来评价改善的活性;例如,野生型异戊二烯合酶、亲代异戊二烯合酶或其他参考多肽。可以设想,在一种或多种测试条件下,具有多种程度的如稳定性、溶解度、活性水平和/或表达水平的酶将可用于在本发明中在多种宿主中产生异戊二烯。通过高通量方法可以经济的方式研究这些性质。
提高的细胞内DMAPP水平与大肠杆菌(E.coli)的生长抑制之间具有很强的相关性,通过银白杨(P.alba)异戊二烯合酶(IspS)的表达可以减弱这种相关性。不受理论的约束,由于DMAPP更快速地转化成异戊二烯,因此提高的IspS活性水平应允许更佳的生长。通过在这些条件下监测表达IspS变体的大肠杆菌(E.coli)的生长速率,发明人已鉴定出突变型IspS酶,其表现出增强了细胞内将DMAPP转化为异戊二烯的能力。
本发明还设想出筛选异戊二烯合酶变体的方法,该方法包括:(a)让宿主细胞与包含约10μM至约70μM IPTG和约5mM至约20mM甲羟戊酸(MVA)的培养基接触,其中宿主细胞包含与启动子有效结合的编码异戊二烯合酶变体的核酸;以及(b)测量宿主细胞的生长速率。可以将变体生长速率与参考异戊二烯合酶(如,亲代异戊二烯合酶、野生型异戊二烯合酶或MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶)的生长速率进行比较。所述方法可用于筛选具有所关注的特定性质,例如本文所述性质中的一者或多者的变体。在一些实施例中,生长速率提高表明异戊二烯合酶变体在宿主细胞内将DMAPP转化成异戊二烯的能力有所提高。例如,可以根据本领域已知的方法或如下文实例中所举例说明,来分析生长速率。在一些实施例中,所述方法还包括确定变体的生长指数。在一些实施例中,所述方法还包括确定变体的性能指数。可以将指数期中的细胞生长速率和/或细胞的最终密度作为选择变体时的考虑因素。如下所示,对于实例中所示的变体而言,指数期中的细胞生长速率是一项考虑因素。另外,如本文所述选择变体时,还将生长速率和最终密度纳入考虑。
在一些实施例中,IPTG以约10μM至约60μM的浓度存在于培养基中。在一些实施例中,IPTG以约10μM至约200μM的浓度存在于培养基中。在一些实施例中,IPTG以约20μM至约60μM的浓度存在于培养基中。在一些实施例中,IPTG以约20μM至约120μM的浓度存在于培养基中。在一些实施例中,IPTG以约40μM至约60μM的浓度存在于培养基中。在一些实施例中,IPTG以约40μM至约100μM的浓度存在于培养基中。在一些实施例中,IPTG以约40μM的浓度存在于培养基中。在一些实施例中,IPTG以约50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、110μM、120μM、130μM、140μM、150μM、160μM、170μM、180μM、190μM、或200μM的浓度存在于培养基中。
在一些实施例中,MVA以约5mM至约20mM的浓度存在于培养基中。在一些实施例中,MVA以约7mM至约15mM的浓度存在于培养基中。在一些实施例中,MVA以约8mM至约12mM的浓度存在于培养基中。在一些实施例中,MVA以约10mM的浓度存在于培养基中。在一些实施例中,宿主细胞为MD09-170。
在另一方面,如下文进一步所述和实例中举例说明的,可以通过分析高产位置观察到一种或多种改善的性质。高产位置可被描述为分子(如,酶,例如异戊二烯合酶)中最适用于形成具有改善的特性的组合变体的那些位置,其中所述位置本身允许至少一种可组合突变。可组合突变可被描述为分子中可用于形成选定的组合变体的那些置换。可组合突变不会显著降低表达、比活性或生长量,而同时能改善分子的至少一种所需的特性,如生长量或比活性。可以用由DMAPP分析得到的比活性性能指数(PI)值、表达指定IspS变体的MEA银白杨(P.alba)的生长曲线和蛋白质测定来确定IspS中包含所有可组合突变的位置,如实例1和实例2中举例说明的。高产位置可以是这样的位置,其显示出对多个置换的一定程度的容许,而同时符合下文所述的一组可组合标准。
评价数据集时,采用以下标准确定最高产的位置。对于包含这样的置换的位置:其中相对于野生型IspS,比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.9的PI,并且其中相对于野生型IspS,比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.0的PI,这些位置被归类为A组。对于包含这样的置换的位置:其中相对于野生型IspS,比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.8的PI,并且其中相对于野生型IspS,比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.2的PI,这些位置被归类为B组。对于包含这样的置换的位置:其中相对于野生型IspS,比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.5的PI,并且其中相对于野生型IspS,比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.5的PI,这些位置被归类为C组。
A、B和C组还可以包含对多个置换具有不同容许程度的位置。要测量这种容许置换的程度,可以对每个位置分配等级。可以根据属于A、B或C组的每个位置内的置换的百分比分配等级。示例性的可组合位置和置换示于表31。
确定高产位置等级的标准如下:当给定位置处小于15%但大于0%的置换属于A、B或C组时,将位置定为等级“1”。当给定位置处小于30%但大于或等于15%的置换属于A、B或C组时,将位置定为等级“2”。当给定位置处小于50%但大于或等于30%的置换属于A、B或C组时,将位置定为等级“3”。当给定位置处大于或等于50%的置换属于A、B或C组时,将位置定为等级“4”。
还可以根据置换为其成员的组,对置换分配适宜性得分,其中较高的得分代表置换更适用于制备组合变体。表30中表示和描述了示例性的适宜性得分。表31中举例说明了适合上述标准的IspS的各个置换的适宜性得分和等级。
表30.所定义组的适宜性得分。
因此,在本发明的一个方面,异戊二烯合酶变体可以是具有如实例中所举例说明的得分为+++++的改善的异戊二烯合酶性质的多肽(如,分离的多肽)。这些多肽可以具有在编号对应于SEQ ID NO:1(MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶)的残基位置处的一个或多个置换,即如实例中所举例说明的标为+++++的列中所示。一些非限制性例子为具有改善的异戊二烯合酶性质的分离的多肽,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X2,X18,X19,X21,X24,X26,X27,X29,X37,X42,X47,X48,X49,X56,X81,X82,X84,X93,X94,X95,X120,X123,X126,X131,X132,X134,X137,X139,X143,X151,X155,X166,X167,X169,X170,X171,X175,X179,X180,X197,X229,X231,X240,X242,X245,X246,X247,X251,X271,X282,X306,X317,X319,X369,X371,X376,X379,X380,X389,X392,X393,X408,X409,X421,X422,X423,X429,X437,X443,X444,X447,X455,X458,X461,X464,X466,X470,X473,X500,X502,X506,X513,X525和X531。在一些实施例中,这些置换可以位于选自下列的残基处:E2,Y18,L19,S21,T24,E26,S27,E29,K37,V42,N47,N48,E49,L56,D81,R82,V84,T93,K94,T95,S120,K123,N126,E131,N132,K134,I137,A139,L143,L151,N155,S166,H167,K169,E170,L171,K175,E179,L180,Q197,I229,S231,T240,R242,R245,R246,V247,T251,A271,S282,L306,D317,N319,F369,Q371,L376,K379,S380,G389,W392,K393,V408,V409,Q421,K422,Y423,R429,C437,A443,S444,I447,S455,C458,R461,G464,S466,A470,S473,V500,T502,L506,T513,E525和V531。在一些实施例中,置换选自E2A或K或P、Y18D或E或K或S、L19Y、S21W、T24L或V、E26C、S27D或N、E29N、K37C或D或P或Q或S、V42M、N47D或S、N48D或G或T、E49L或V、L56E或F或G或I或K或T或V或Y、D81Q、R82N或T或V或Y、V84M、T93C或F或R或S、K94G或P、T95D或F或G或I或N或W、S120C或G或M或Q、K123V、N126E、E131H或K或L或M或T或W或Y、N132I或P、K134A、I137T、A139C或Q、L143C或D或E或H或K或M或Q或T或V或Y、L151A或F、N155A或C或G或H或Q或R或S或W、S166N、H167F或I或N或Q或V、K169A或C或H或N或Q或V、E170L或S或W或Y、L171A或N或Q或T或V或Y、K175C或F或I或Q或R、E179D、L180A或I、Q197C或D或N、I229C、S231A、T240C、R242G、R245C或K或M或Q或T或V、R246N、V247L或M、T251D或E或N或P或Q或S、A271T、S282Y、L306C、D317N、N319M、F369C或D或E或G或S、Q371F、L376I或M、K379G或Q、S380E、G389A或D或E或K或N或Q或S或V、W392Y、K393C或I或T或V、V408T、V409T、Q421H、K422D、Y423N或S、R429E或F或Q、C437M、A443Q,S444D或E、I447T、S455A、C458T、R461A,G464C或M或N或Q或S、S466D、A470I或L、S473I、V500A或C、T502M,L506M,T513C或G或K或N、E525F或R、V531E或H或K或Q或R或S。
在本发明的另一方面,异戊二烯合酶变体可以是具有如实例中所举例说明的得分为++++的改善的异戊二烯合酶性质的多肽(如,分离的多肽)。这些多肽可以具有在编号对应于SEQ ID NO:1(MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶)的残基位置处的一个或多个置换,即如实例中所举例说明的标为++++的列中所示。一些非限制性例子为具有改善的异戊二烯合酶性质的分离的多肽,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X2,X6,X18,X20,X22,X23,X24,X25,X26,X27,X28,X29,X30,X31,X32,X36,X37,X42,X44,X47,X48,X49,X50,X53,X54,X55,X56,X58,X59,X68,X71,X74,X77,X78,X79,X81,X82,X83,X84,X86,X87,X91,X93,X94,X95,X97,X98,X99,X109,X115,X116,X117,X118,X120,X123,X125,X126,X127,X128,X130,X131,X132,X133,X134,X136,X137,X138,X139,X140,X143,X151,X153,X155,X156,X159,X160,X161,X162,X163,X164,X166,X167,X169,X170,X171,X172,X175,X176,X177,X178,X179,X180,X181,X182,X190,X194,X197,X204,X211,X215,X217,X219,X221,X228,X229,X231,X232,X235,X241,X242,X245,X246,X247,X251,X254,X271,X272,X278,X279,X282,X296,X302,X317,X319,X320,X327,X331,X348,X351,X357,X361,X364,X365,X368,X369,X370,X371,X373,X377,X380,X383,X386,X389,X392,X393,X407,X408,X409,X410,X411,X414,X422,X423,X424,X428,X429,X432,X436,X437,X440,X443,X444,X447,X448,X457,X460,X461,X462,X463,X464,X465,X466,X468,X470,X471,X472,X473,X475,X480,X490,X491,X492,X494,X496,X500,X501,X502,X503,X510,X513,X515,X519,X525,X531,X536,X537,X540,X541,X542,和X544。
在一些实施例中,这些置换可以位于选自下列的残基处:E2,S6,Y18,L20,S22,D23,T24,D25,E26,S27,I28,E29,V30,Y31,K32,K36,K37,V42,R44,N47,N48,E49,K50,F53,L54,T55,L56,E58,L59,L68,R71,S74,R77,G78,A79,D81,R82,F83,V84,S86,G87,A91,T93,K94,T95,L97,H98,G99,Q109,S115,Q116,E117,A118,S120,K123,Q125,N126,G127,N128,L130,E131,N132,L133,K134,D136,I137,K138,A139,I140,L143,L151,G153,N155,I156,E159,A160,K161,V162,F163,A164,S166,H167,K169,E170,L171,S172,K175,I176,G177,K178,E179,L180,A181,E182,L190,R194,Q197,S204,K211,N215,V217,L219,L221,M228,I229,S231,V232,R235,S241,R242,R245,R246,V247,T251,H254,A271,F272,D278,C279,S282,I296,T302,D317,N319,A320,Y327,C331,K348,G351,Y357,A361,D364,L365,A368,F369,L370,Q371,A373,Y377,S380,T383,D386,G389,W392,K393,A407,V408,V409,Q410,N411,K414,K422,Y423,H424,S428,R429,H432,L436,C437,L440,A443,S444,I447,A448,S457,M460,R461,T462,K463,G464,I465,S466,E468,A470,T471,E472,S473,M475,E480,L490,G491,G492,L494,A496,V500,E501,T502,A503,S510,T513,H515,A519,E525,V531,T536,E537,L540,P541,F542,和R544。
在其他实施例中,置换位于选自下列的残基处:E2C或D或N或T或V、S6N或T、Y18A或Q或R、L20T,S22Q,D23N,T24C,D25T,E26D或H或K或M或R或S或V、S27A或C或G或H或I或L或M或P或Q、I28D或N、E29Q,V30A或D或E或M或R或T、Y31N,K32E,K36A或C或D或E或M或N或P或Q、K37A或E或G或H或M或N或R或T、V42F或I、R44N或Q、N47A或G或H或M或Q或T或W、N48H或I或K、E49A或C、K50A或D或E或F或H或S或Y、F53E或H或N或P或Q或V、L54M,T55C或D或E、L56C或N、E58N,L59H或T、L68I,R71K或M、S74D或E或N或Y、R77L,G78A或D或F或L或M、A79Q或T、D81A或F或G或M或R或S或T或V、R82A或E或H或I或K或M或Q或S、F83W,V84A,S86A或D或M、G87D或P、A91K或W、T93A或D或E或G或L或N或P或Y、K94A或D或E或H或I或L或M或N或R或S或T、T95A或E或P或Q或S或V或Y、L97F,H98A或D或F或G或I或L或M或N或Q、G99E或F或M、Q109E,S115A,Q116A或C或D或E或I或P、E117C或F或L或M或V、A118M,S120H或T或V、K123L或T、Q125E或I或Y、N126A或C或D或M或T或V、G127C,N128C或D或P或Q、L130E,E131A或C或P或Q或S或V、N132C或D或F或H或L或R或W或Y、L133D,K134E或M或Q或S或T或V、D136E,I137E或H或N、K138I或N、A139N,I140M或W、L143S,L151C或H或I、G153C,N155I或T或V或Y、I156D或N或T、E159M,A160I,K161A或C或N或Q、V162S,F163E或Q、A164T,S166A或D或G、H167A或E或G或K或M或R或S或T或W、K169D或I或M或S或T、E170H或K或M或Q或T或V、L171H或K或R或S、S172A或C、K175S,I176M,G177A或C、K178A或F或R或S或T、E179A或C或L或M或N、L180C或Q或T、A181H或Q或S或V、E182S,L190I或M、R194L,Q197S,S204C,K211A或N或Q、N215C或H、V217I,L219C,L221M,M228F或Y、I229V,S231K或Q或T、V232I,R235K,S241A或M或T、R242A或D或E或H或I或M或N或Q或S或T、R245I或L、R246D或K、V247T,T251A或G或K或R、H254D,A271C或V、F272D或G或P或W、D278A或E或N或Q或S或T或V或W、C279A,S282A或Q、I296V,T302H,D317E或Q、N319F,A320C,Y327M,C331P,K348R或Y、G351D或N、Y357M,A361T,D364E或V、L365C或M、A368N,F369M或N或R或T或V、L370G或Q、Q371C或S、A373G,Y377W,S380A或C或D或Q或T或V、T383S,D386E或N、G389H或I、W392I或S或T或V、K393Q,A407G,V408I,V409H或I、Q410C或D或K或L或M或T、N411G,K414E或G或L或N或P、K422A或N或T、Y423Q,H424E或P或Q或V、S428E或Q、R429I或L或T或W或Y、H432E,L436M或Y、C437K或T、L440I,A443R,S444P,I447A或E或M或Q或S、A448E或M或N或P或Q或V、S457N或T、M460Q或R或S、R461D或E或G或Q或S或T、T462Q,K463A或D或E、G464L或R、I465A或C或G或S或T、S466P,E468D,A470M,T471E或H或Q、E472D或S、S473L或V、M475T,E480N,L490A或D或E或F或H或M、G491E或K或S或T或V或Y、G492C,L494D,A496P或T、V500L或M、E501D,T502A或C或R或V、A503I,S510C或V、T513V,H515N,A519S或T、E525A或C或P或Q或S、V531A或M或T、T536A或F或G、E537K或T、L540A或P P541M,F542P,和R544C。
在本发明的另一方面,异戊二烯合酶变体可以是具有如实例中所举例说明的得分为+++的改善的异戊二烯合酶性质的多肽(如,分离的多肽)。这些多肽可以具有在编号对应于SEQ ID NO:1(MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶)的残基位置处的一个或多个置换,即如实例中所举例说明的标为+++的列中所示。一些非限制性例子为具有改善的异戊二烯合酶性质的分离的多肽,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X2,X3,X13,X17,X18,X19,X20,X23,X25,X26,X27,X28,X29,X30,X31,X32,X33,X34,X36,X37,X40,X41,X42,X43,X44,X45,X46,X47,X48,X49,X50,X51,X53,X54,X55,X56,X57,X59,X60,X62,X71,X73,X74,X75,X77,X78,X79,X81,X82,X83,X84,X85,X86,X87,X88,X89,X91,X92,X93,X94,X95,X97,X98,X99,X100,X101,X102,X103,X107,X109,X111,X113,X114,X115,X116,X117,X118,X119,X120,X121,X123,X124,X125,X127,X128,X129,X130,X131,X133,X134,X135,X136,X137,X138,X139,X140,X143,X146,X151,X152,X153,X155,X156,X158,X160,X161,X162,X163,X166,X167,X169,X170,X171,X172,X175,X176,X177,X178,X179,X180,X181,X182,X183,X185,X187,X193,X194,X196,X197,X204,X210,X211,X212,X215,X216,X217,X218,X219,X220,X222,X223,X224,X226,X228,X229,X231,X232,X235,X240,X241,X242,X246,X251,X253,X260,X268,X270,X271,X272,X275,X276,X278,X282,X307,X314,X315,X317,X320,X321,X323,X328,X329,X331,X332,X333,X343,X345,X346,X350,X351,X352,X356,X357,X360,X361,X363,X364,X366,X367,X368,X369,X370,X371,X378,X379,X380,X383,X386,X389,X390,X392,X393,X402,X405,X408,X409,X410,X413,X414,X418,X422,X423,X424,X425,X426,X428,X429,X431,X432,X437,X444,X447,X448,X457,X460,X461,X462,X463,X464,X466,X467,X468,X469,X471,X472,X475,X484,X489,X490,X491,X492,X493,X494,X497,X500,X501,X502,X503,X504,X506,X509,X510,X511,X513,X515,X517,X519,X522,X528,X529,X531,X534,X535,X536,X537,X539,X540,X542,和X544。
在一些实施例中,这些置换可以位于选自下列的残基处:E2,A3,S13,D17,Y18,L19,L20,D23,D25,E26,S27,I28,E29,V30,Y31,K32,D33,K34,K36,K37,A40,E41,V42,R43,R44,E45,I46,N47,N48,E49,K50,A51,F53,L54,T55,L56,L57,L59,I60,N62,R71,E73,S74,D75,R77,G78,A79,D81,R82,F83,V84,S85,S86,G87,G88,F89,A91,V92,T93,K94,T95,L97,H98,G99,T100,A101,L102,S103,L107,Q109,G111,E113,V114,S115,Q116,E117,A118,F119,S120,G121,K123,D124,Q125,G127,N128,F129,L130,E131,L133,K134,E135,D136,I137,K138,A139,I140,L143,A146,L151,E152,G153,N155,I156,D158,A160,K161,V162,F163,S166,H167,K169,E170,L171,S172,K175,1176,G177,K178,E179,L180,A181,E182,Q183,N185,A187,H193,R194,T196,Q197,S204,K210,K211,E212,N215,Q216,V217,L218,L219,E220,A222,I223,L224,Y226,M228,I229,S231,V232,R235,T240,S241,R242,R246,T251,L253,L260,V268,V270,A271,F272,Q275,Y276,D278,S282,E307,E314,R315,D317,A320,I321,D323,M328,K329,C331,F332,L333,A343,D345,N346,K350,G351,E352,P356,Y357,K360,A361,A363,D364,C366,N367,A368,F369,L370,Q371,N378,K379,S380,T383,D386,G389,N390,W392,K393,V402,Y405,V408,V409,Q410,K413,K414,E418,K422,Y423,H424,D425,T426,S428,R429,S431,H432,C437,S444,I447,A448,S457,M460,R461,T462,K463,G464,S466,E467,E468,L469,T471,E472,M475,K484,K489,L490,G491,G492,S493,L494,K497,V500,E501,T502,A503,I504,L506,Q509,S510,H511,T513,H515,G517,A519,S522,R528,K529,V531,V534,I535,T536,E537,I539,L540,F542,和R544。
在其他实施例中,置换位于选自下列的残基处:E2H或I或S、A3E或G或K或N或Q或R或T、S13Q或T、D17E、Y18F或M或N、L19F、L20I或V、D23T、D25A或E或S、E26G或N或Q或T、S27E或F或K或V、I28E或F或M或P、E29D或P或R或T、V30N或Q、Y31Q或W、K32D或G或N或R、D33N、K34D或E或Q或S、K36F或R、K37F或I、A40C或D或E或F或M或N或P或Q或V、E41C或D或F或N或Q或S或V、V42A或S或T、R43I或Q、R44A或D或K或M或Y、E45C或M或N或Q、I46F或V、N47E或I或K或R或V、N48A或C或E或F或L或Q或R或S、E49G或H或I或R或S或W、K50C或G或M或N或P或R、A51E或G或L或Q或T、F53D、L54A或C或E或H或I或Q、T55A或H或N或Q或S或Y、L56H或Q或R或S、L57I、L59F或M或S或V或Y、I60C或V、N62V、R71I、E73D、S74G或M或P、D75E、R77A或N或T或V、G78E或I或K或N或P或Q或V或W、A79M或R或Y、D81C或E或H或L或N、R82C或F或G或L或W、F83G或H或I或L或V、V84F或H或L或N或Q或R或S或T或W或Y、S85C或L或N或R、S86C或N、G87C或E或F或K或L或N或T、G88C或D或I或V或W或Y、F89C或I、A91C或D或E或G或H或L或R或S或T或V或Y、V92A或C或E或F或G或I或L或Q或W、T93H或I或Q或V或W、K94C或V或Y、T95C或H或K或M、L97A或M或P、H98C或S或T或V或W、G99A或C或H或P或Q或T、T100A或I或L或M或V、A101S、L102M、S103A或C或G或L、L107C或F、Q109C或N或S、G111A、E113C或H或V、V114C、S115D或Y、Q116G或H或L或S或T或V、E117A或D或I、A118I或V、F119L或M、S120A或D或E或F或K或N或R或W或Y、G121D或L或V或W、K123I或S或W或Y、D124C或E、Q125A或D或G或H或K或L或N或S或T或V或W、G127D或F或W、N128A、F129L或Y、L130A或C或D或Q或V或Y、E131D或F或G或R、L133E或G或I或P或Q或T或V或Y、K134D或G或H或I或L或N或R或W或Y、E135H或S、D136N、I137A或C或D或G或P或Q或S或V、K138C或D或E或P或R或S或V、A139P或S或T或V、I140N或Q或S或T或V、L143A或F或G或N或R或W、A146M、L151E或G或M或N或Q或R或S或T或V或W、E152A或D或I或M或P、G153D、N155E或K或M、I156E或K或L或R或Y、D158E、A160F或H或S、K161L或R或S或Y、V162D或F或N或P或T、F163C或H或I或M或V或W或Y、S166C或E或H或K或P或Q或V或W、H167C或L或P、K169E或G或R、E170G或I或N或R、L171C或E或G或I或M或W、S172G或N或Q或R、K175A或G或H或N或P或T或V、I176A或C或N或Q或V、G177D或E或H或N或P或T、K178D或E或G或I或L或M或N或P或Q或V或Y、E179G或I或P或Q或S或T或V或W或Y、L180F或H或V或W、A181F或M或N或W、E182H或N、Q183A或L、N185D、A187C或S、H193W、R194I、T196V、Q197G、S204A或F或M或W或Y、K210M、K211D或E或F或G或H或I或M或R或S或T或V、E212A或D或M或P或Q或T、N215D或Y、Q216A或E或N、V217C或E或K或N或P或Q或T、L218V、L219I或M或V、E220D或N、A222S、I223C、L224A或C或T或V、Y226F、M228H或R、I229A、S231D或G或H或R或V、V232Q、R235A或D或N、T240V、S241C、R242K或L、R246H或Q、T251H、L253M、L260M、V268I、V270I,A271S、F272Q、Q275E、Y276F或H或Q、D278L或M或R或Y、S282C、E307Q或R、E314H、R315G或K、D317S、A320N或T、I321L或M、D323I或T、M328L、K329G或Q或R、C331T、F332Y、L333F、A343I或V、D345Y、N346A、K350H或W或Y、G351E或M、E352F或I或M或V、P356M或S、Y357E、K360Q、A361Q或S或V、A363S、D364N或T、C366A、N367D或E或M、A368D或Q、F369H或Q、L370A或D或E或F或H或N或R或S或T或V、Q371G或H或I或N或P或R或T或W或Y、N378D、K379E或R或S、S380K或N、T383Q、D386K或S、G389C或M或P或R或T、N390S、W392F或M、K393H或R、V402F或I或L、Y405F、V408Q或S、V409C或Q或S、Q410E或G或H或I或R、K413P、K414C或H或I或Q、E418N、K422G或H或Q或R、Y423G、H424D或G或I或S或T、D425P、T426A或M或Q、S428V、R429A或C或D或G或H或K或N、S431G、H432A或M、C437N、S444N或Q或T、I447K或R、A448H或S或T、S457D、M460A或E或G、R461N、T462S、K463G或N、G464A或D或E或F或H或V或Y、S466E或G或K或N,或T、E467N、E468A或N或P或Q、L469A或N、T471N、E472A或G或N、M475I、K484A、K489R、L490I或Y、G491A或C或M或N或Q、G492T或V、S493C或G或K或V、L494G或I或Q或V、K497M或T、V500I或Y、E501N、T502H、A503L或M、I504L、L506I或V、Q509A、S510T、H511I或M、T513S、H515Q、G517P、A519C、S522A或K、R528K、K529A、V531G或N、V534A或S、I535C或S或T、T536M、E537H或N或Q、I539V,L540E或Q或R或V、F542M、和R544G或N或P或Q或S。
在本发明的另一方面,异戊二烯合酶变体可以是具有如实例中所举例说明的得分为++的改善的异戊二烯合酶性质的多肽(如,分离的多肽)。这些多肽可以具有在编号对应于SEQ ID NO:1(MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶)的残基位置处的一个或多个置换,即如实例中所举例说明的标为++的列中所示。在本发明的另一方面,异戊二烯合酶变体可以是具有如实例中所举例说明的得分为+的改善的异戊二烯合酶性质的多肽(如,分离的多肽)。这些多肽可以具有在编号对应于SEQ ID NO:1(MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶)的残基位置处的一个或多个置换,即如实例中所举例说明的标为+的列中所示。
在本发明的另一方面,异戊二烯合酶变体可以是具有改善的异戊二烯合酶性质的多肽(如,分离的多肽),其在编号对应于SEQ ID NO:1(MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶)的残基位置处具有一个或多个置换,所述置换在实例11的表31中所示的等级为4。在另一方面,异戊二烯合酶变体可以是具有改善的异戊二烯合酶性质的多肽(如,分离的多肽),其在编号对应于SEQ ID NO:1(MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶)的残基位置处具有一个或多个置换,所述置换在实例11的表31中所示的等级为3。在另一方面,异戊二烯合酶变体可以是具有改善的异戊二烯合酶性质的多肽(如,分离的多肽),其在编号对应于SEQ ID NO:1(MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶)的残基位置处具有一个或多个置换,所述置换在实例11的表31中所示的等级为2。在另一方面,异戊二烯合酶变体可以是具有改善的异戊二烯合酶性质的多肽(如,分离的多肽),其在编号对应于SEQ ID NO:1(MEA银白杨(P.alba)异戊二烯合酶)的残基位置处具有一个或多个置换,所述置换在实例11的表31中所示的等级为1。
示例性的核酸
在本发明范围内提供和设想了编码本发明异戊二烯合酶变体的核酸。在多个实施例中,核酸为重组核酸。例如,在一些实施例中,异戊二烯合酶变体核酸有效连接到编码另一个多肽的全部或一部分的另一个核酸上,使得重组核酸编码包括异戊二烯合酶变体和另一个多肽(如,有利于融合多肽的纯化或检测的肽,例如组氨酸标签)的全部或一部分的融合多肽。在一些实施例中,重组核酸的一部分或全部是化学合成的。在一些方面,核酸为异源核酸。所谓“异源核酸”,是指其核酸序列与天然存在于相同宿主细胞中的另一种核酸不同的核酸。
在一些实施例中,核酸包括至少或约50、100、150、200、300、400、500、600、700、800或更多的来自天然存在的异戊二烯合酶核酸的邻接核苷酸。在一些方面,与野生型(即,天然存在的序列)异戊二烯合酶核酸的序列相比,核酸具有一个或多个突变。在一些实施例中,核酸具有一个或多个增加异戊二烯合酶核酸的转录或翻译的突变(如,沉默突变)。在一些实施例中,核酸为编码异戊二烯合酶多肽的任何核酸的简并变体。
可以用本领域技术人员已知的标准技术将异戊二烯合酶核酸整合到载体,例如表达载体中。用于连接包含所关注核酸(例如异戊二烯合酶)、启动子、终止子和其他序列的DNA构建体并将它们插入到合适的载体中的方法是本领域熟知的。另外,可用已知的重组技术构建载体(例如,英杰生命技术公司(Invitrogen Life Technologies)的Gateway技术)。
在一些实施例中,可能有利的是以远高于目前在天然存在的细胞中发现的水平过表达异戊二烯合酶核酸。可以通过将编码这些多肽的核酸选择性克隆到多拷贝质粒中或将这些核酸置于强诱导型或组成型启动子下获得这种结果。过表达所需多肽的方法是分子生物学领域常见和熟知的,例子可参见Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor,2001(Sambrook等人,《分子克隆:实验室手册(第2版)》,冷泉港实验室出版社,2001年)。
示例性的途径多肽
如上所述,可以用来自DXP途径和/或MVA途径的一种或多种多肽,结合使用本文所述的异戊二烯合酶变体,来提高异戊二烯的产量。因此,在某些方面,编码一个或多个MVA途径多肽的一个或多个核酸为异源核酸。在其他方面,编码一个或多个MVA途径多肽的一个或多个核酸为内源性核酸的副本。在本文的任何方面,一个或多个MVA途径多肽可以选自(a)使两分子的乙酰辅酶A缩合形成乙酰乙酰辅酶A的酶:(b)使乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合形成HMG-CoA的酶(如,HMG合酶);(c)使HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶;(d)使甲羟戊酸磷酸化成甲羟戊酸5-磷酸的酶;(e)使甲羟戊酸5-磷酸转化成甲羟戊酸5-焦磷酸的酶;(f)使甲羟戊酸5-焦磷酸转化成异戊烯焦磷酸的酶;以及(g)使异戊烯焦磷酸转化成二甲烯丙基二磷酸的酶。在本文的任何方面,一个或多个MVA途径多肽选自(a)使乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合形成HMG-CoA的酶(如,HMG合酶);(b)使HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶;(c)使甲羟戊酸磷酸化成甲羟戊酸5-磷酸的酶;(d)使甲羟戊酸5-磷酸转化成甲羟戊酸5-焦磷酸的酶;以及(e)使甲羟戊酸5-焦磷酸转化成异戊烯焦磷酸的酶。
在本文的任何方面,使甲羟戊酸磷酸化成甲羟戊酸5-磷酸的酶可以选自马氏甲烷八叠球菌(M.mazei)甲羟戊酸激酶、乳酸杆菌(Lactobacillus)甲羟戊酸激酶多肽、沙克乳酸杆菌(Lactobacillus sakei)甲羟戊酸激酶多肽、酵母(yeast)甲羟戊酸激酶多肽、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)甲羟戊酸激酶多肽、链球菌(Streptococcus)甲羟戊酸激酶多肽、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)甲羟戊酸激酶多肽,以及链霉菌(Streptomyces)甲羟戊酸激酶多肽或链霉菌CL190(Streptomyces CL190)甲羟戊酸激酶多肽。在本文的任何方面,使甲羟戊酸磷酸化成甲羟戊酸5-磷酸的酶为马氏甲烷八叠球菌(M.mazei)甲羟戊酸激酶。
MVA上游途径多肽
MVA途径的上游部分使用在细胞代谢过程中产生的乙酰辅酶A作为初始底物,通过具有下列任一活性的多肽的作用转化成甲羟戊酸:(a)(i)硫解酶活性或(ii)乙酰乙酰辅酶A合酶活性,(b)HMG-CoA还原酶,以及(c)HMG-CoA合酶酶活性。首先,通过硫解酶或乙酰乙酰辅酶A合酶(其使用乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A)的作用将乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶。接下来,通过HMG-CoA合酶的酶促作用将乙酰乙酰辅酶A转化成3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)。用HMG-CoA还原酶将该辅酶A衍生物还原成甲羟戊酸,这是制备类异戊二烯的甲羟戊酸途径的限速步骤。
MVA上游途径多肽的非限制性例子包括乙酰辅酶A乙酰转移酶(AA-CoA硫解酶)多肽、乙酰乙酰辅酶A合酶多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(HMG-CoA合酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)多肽。MVA上游途径多肽可以包括具有MVA上游途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的MVA上游途径核酸包括编码具有MVA上游途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性的MVA途径多肽和核酸包括来自本文所述任何来源生物的天然多肽和核酸。因此,本文设想编码MVA上游途径多肽的任何基因都可用于本发明。
在某些实施例中,设想单独来自格氏李斯特菌(L.grayi)、屎肠球菌(E.faecium)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)、酪黄肠球菌(E.casseliflavus)和/或粪肠球菌(E.faecalis)的mvaE和mvaS基因,或所述基因与一个或多个编码来自MVA上游途径的蛋白质的其他mvaE和mvaS基因相结合的多种选择在本发明范围内。在其他实施例中,设想与编码下列多肽的一个或多个其他基因相结合的乙酰乙酰辅酶A合酶基因在本发明范围内:(i)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(HMG-CoA合酶)多肽和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)多肽。因此,在某些方面,可以用本文所述的任何方式在重组细胞中表达设想的任何基因组合。
本文可以使用的MVA上游途径多肽的其他非限制性例子在国际专利申请公布No.WO2009/076676;WO2010/003007和WO2010/148150中有所描述。
编码mvaE和mvaS多肽的基因
在某些实施例中,设想单独来自格氏李斯特菌(L.grayi)、屎肠球菌(E.faecium)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)、酪黄肠球菌(E.casseliflavus)和/或粪肠球菌(E.faecalis)的mvaE和mvaS基因,或所述基因与编码来自MVA上游途径的蛋白质的一个或多个其他mvaE和mvaS基因相结合的多种选择在本发明范围内。在格氏李斯特菌(L.grayi)、屎肠球菌(E.faecium)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)、酪黄肠球菌(E.casseliflavus)和粪肠球菌(E.faecalis)中,mvaE基因编码同时具有硫解酶和HMG-CoA还原酶活性的多肽。事实上,mvaE基因产物代表存在于真细菌中的IPP生物合成的第一双功能酶和融合到另一种天然蛋白质上的HMG-CoA还原酶的第一例子(Hedl,et al.,JBacteriol.2002April;184(8):2116-2122(Hedl等人,《细菌学杂志》,2002年4月,第184卷,第8期,第2116-2122页))。另一方面,mvaS基因编码具有HMG-CoA合酶活性的多肽。
因此,可将重组细胞(如,大肠杆菌(E.coli))改造为表达来自格氏李斯特菌(L.grayi)、屎肠球菌(E.faecium)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)、酪黄肠球菌(E.casseliflavus)和/或粪肠球菌(E.faecalis)的一个或多个mvaE和mvaS基因,以产生甲羟戊酸。可以在多拷贝质粒上表达一个或多个mvaE和mvaS基因。质粒可以是高拷贝质粒、低拷贝质粒或中拷贝质粒。或者,可以将一个或多个mvaE和mvaS基因整合到宿主细胞的染色体中。对于一个或多个mvaE和mvaS基因在质粒上或作为宿主细胞染色体的整合部分的两种异源表达而言,可以用诱导型启动子或组成型表达启动子驱使基因的表达。启动子可以是一个或多个mvaE和mvaS基因的表达的强驱动子,可以是表达的弱驱动子,或可以是表达的中驱动子。
在本文的任何方面,重组宿主细胞还可以包含编码一个或多个1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DXP)途径多肽的一个或多个核酸。在一个方面,编码一个或多个DXP途径多肽的一个或多个核酸为异源核酸。在另一方面,编码一个或多个DXP途径多肽的一个或多个核酸为内源性核酸的副本。在另一方面,一个或多个DXP途径多肽选自(a)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、(b)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)、(c)4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶(MCT)、(d)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(CMK)、(e)2C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸合酶(MCS)、(f)1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶(HDS)和(g)1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶(HDR)。在另一方面,DXP途径多肽为DXS。
在另一方面,本领域的技术人员可以使用替代的代谢方法,该方法可以使用不依赖木扬达尔途径酶的途径,用一分子的葡萄糖可能生成三分子的乙酰辅酶A。相反,可以使用存在于某些生物体,特别是双歧杆菌中的磷酸乙酮醇酶[参见,例如,Biology of the Prokaryotes(ed.Lengeler,Drewsand Schlegel);Blackwell Science,New York,1999,p.299-301(《原核生物的生物学》,Lengeler、Drews和Schlegel编辑,布莱克韦尔科学出版社,纽约,1999年,第299-301页);Meile et al.,J.of Bacteriology,2001,183:9,2929-36(Meile等人,《细菌学杂志》,2001年,第183卷,第9期,第2929-2936页);Jeong et al.,J.Microbiol.Biotechnol.,2007,17:5,822-829(Jeong等人,《微生物学与生物技术杂志》,2007年,第17卷,第5期,第822-829页)]。磷酸乙酮醇酶允许用木酮糖5-磷酸或果糖6-磷酸(经由乙酰基-磷酸)形成乙酰辅酶A,而不是通过典型代谢中的丙酮酸氧化形成乙酰辅酶A。通过使用磷酸乙酮醇酶多肽提高乙酰辅酶A的生物合成可以使依赖甲羟戊酸的上游生物合成途径的生产率提高,这可以显著提高甲羟戊酸的生物合成,并因此提高下游类异戊二烯前体分子(如DMAPP和IPP)的生物合成。可以用标准方法通过测量肽将D-果糖6-磷酸或D-木酮糖5-磷酸转化成乙酰基-P的能力来确定多肽是否具有磷酸乙酮醇酶肽活性。然后可以将乙酰基-P转化成二茂铁乙酰基氧肟酸(ferryl acetylhydroxamate),可以用分光光度法对其进行检测(Meile et al.,J.Bact.183:2929-2936,2001(Meile等人,《细菌学杂志》,第183卷,第2929-2936页,2001年))。被鉴定为具有磷酸乙酮醇酶肽活性的任何多肽都适用于本发明。示例性的磷酸乙酮醇酶核酸包括但不限于从罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、交替单胞菌(Ferrimonas balearica)、Pedobactor saltans、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)和/或达松维尔类诺卡菌(Nocardiopsis dassonvillei)中分离的磷酸乙酮醇酶。
乙酰乙酰辅酶A合酶基因
在另一方面,可以使用乙酰乙酰辅酶A合酶基因(aka nphT7)。乙酰乙酰辅酶A合酶基因为编码具有下列活性的酶的基因:具有由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶的活性并具有由两个乙酰辅酶A分子合成乙酰乙酰辅酶A的最小活性(如,没有活性)。参见,如,Okamura et al.,PNAS Vol 107,No.25,pp.11265-11270(2010)(Okamura等人,《美国国家科学院院刊》,第107卷,第25期,第11265-11270页,2010年),其内容作为关于nphT7的教导内容明确地并入本文中。来自链霉菌属(Streptomyces)CL190菌株的放线菌的乙酰乙酰辅酶A合酶基因在日本专利公布(Kokai)No.2008-61506 A和US2010/0285549中有所描述。乙酰乙酰辅酶A合酶还可被称为乙酰辅酶A:丙二酰辅酶A酰基转移酶。可以使用的代表性的乙酰乙酰辅酶A合酶(或乙酰辅酶A:丙二酰辅酶A酰基转移酶)为Genbank AB540131.1。
在本文所述任何方面或实施例中,可以使用具有由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的能力的酶。在本文所述的某些实施例中,可以使用来源于链霉菌属(Streptomyces)的放线菌、具有由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的能力的乙酰乙酰辅酶A合酶基因。
示例性的宿主细胞
可以用多种宿主细胞产生可以表达异戊二烯合酶变体的重组宿主细胞以及以受权利要求书保护的本发明的方法制备异戊二烯。宿主细胞可以是天然产生异戊二烯的细胞或非天然产生异戊二烯的细胞。在一些实施例中,宿主细胞采用DXP途径天然产生异戊二烯,并增添异戊二烯合酶变体、DXP途径多肽(如,DXS)和/或IDI核酸来提高采用该途径产生异戊二烯的产量。在一些实施例中,宿主细胞采用MVA途径来天然产生异戊二烯,并增添异戊二烯合酶变体和/或一种或多种MVA途径核酸来提高采用该途径产生异戊二烯的产量。在一些实施例中,宿主细胞采用DXP途径来天然产生异戊二烯,并增添一种或多种MVA途径核酸以利用MVA途径以及DXP途径的部分或全部来产生异戊二烯。在一些实施例中,宿主细胞采用DXP和MVA途径二者来天然产生异戊二烯,并增添一种或多种异戊二烯合酶变体、DXS、IDI或MVA途径核酸以提高通过这些途径中的一者或二者产生异戊二烯的产量。
在一些实施例中,宿主细胞是酵母,如酵母菌属(Saccharomyces sp.)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces sp.)、毕赤酵母属(Pichia sp.)、假丝酵母属(Candida sp.)或解脂耶氏酵母属(Y.lipolytica)。
在一些实施例中,宿主细胞是细菌,如芽孢杆菌属(Bacillus)的菌株,如地衣芽孢杆菌(B.lichenformis)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis),泛菌属(Pantoea)的菌株,如柠檬泛菌(P.citrea),假单胞菌属(Pseudomonas)的菌株,如产碱假单胞菌(P.alcaligenes),链霉菌属(Streptomyces)的菌株,如变铅青链霉菌(S.lividans)或锈赤链霉菌(S.rubiginosus),埃希杆菌属(Escherichia)的菌株,如大肠杆菌(E.coli),肠杆菌属(Enterobacter)的菌株,链球菌属(Streptococcus)的菌株,古细菌(Archaea)的菌株,如马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)或棒状杆菌属(Corynebacterium)的菌株,如谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)。
如本文所用,“芽孢杆菌属”包括本领域技术人员已知的“芽孢杆菌属”内的所有种,包括但不限于例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。应该认识到,还在继续对芽孢杆菌属进行分类学整理。因此,意在使该属包括已经重新分类的种,包括但不限于诸如现在命名为“嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”的嗜热脂肪芽孢杆菌之类的生物体。在存在氧气的情况下抗性内生孢子的产生被视为芽孢杆菌属的定义性特征,但该特性还适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线芽孢杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、嗜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
在一些实施例中,宿主细胞是革兰氏阳性细菌。非限制性例子包括链霉菌属的菌株(例如变铅青链霉菌(S.lividans)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)或灰色链霉菌(S.griseus)和芽孢杆菌(Bacillus)。在一些实施例中,来源生物是革兰氏阴性细菌如大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。
在一些实施例中,宿主细胞是植物,例如豆科(Fabaceae)如蝶形花亚科(Faboideae)的植物。在一些实施例中,来源生物是葛、白杨(如银白杨x欧洲山杨(Populus alba x tremula CAC35696))、山杨(如美洲山杨(Populus tremuloides))或夏栎(Quercus robur)。
在一些实施例中,宿主细胞是藻类,如绿藻、红藻、灰藻、藻细胞核(chlorarachniophytes)、眼虫、色菌界或沟鞭藻。
在一些实施例中,宿主细胞是蓝细菌,如根据形态学分类为以下任何一组的蓝细菌:色球藻目(Chroococcales)、宽球藻目(Pleurocapsales)、颤藻目(Oscillatoriales)、念珠藻目(Nostocales)或真枝藻目(Stigonematales)。
在一些实施例中,宿主细胞是厌氧生物。“厌氧生物”为不需要氧气就能生长的生物体。厌氧生物可以是专性厌氧生物、兼性厌氧生物或耐氧生物体。此类生物体可以是上文所列生物体、细菌、酵母等中的任何一种。“专性厌氧生物”为大气中的氧气含量可致死的厌氧生物。专性厌氧生物的例子包括但不限于梭菌属(Clostridium)、真杆菌(Eurobacterium)、类杆菌属(Bacteroides)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、丁酸杆菌属(B utyribacterium)、韦荣球菌属(Veillonella)和放线菌属(Actinomyces)。在一个实施例中,专性厌氧生物可以是选自以下细菌的任一者或组合:扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、粘液真杆菌(Eurobacterium limosum)、嗜一氧化碳梭菌(Clostridiumcarboxydivorans)、产生消化链球菌(Peptostreptococcus productus)和食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)。“兼性厌氧生物”为能够在氧气存在下进行有氧呼吸并能够在微氧或无氧条件下进行无氧发酵的厌氧生物。兼性厌氧生物的例子包括但不限于埃希杆菌属、泛菌属、酵母和耶氏酵母。
在一些实施例中,宿主细胞是光合作用细胞。在其他实施例中,宿主细胞是非光合作用细胞。
可以使用的其他示例性宿主细胞在美国专利公布2009/0203102、WO2009/076676、WO2010/003007、WO2009/132220、WO2010/031062、WO2010/031068、WO2010/031076、WO2010/031077和WO2010/031079中有所描述。
示例性的转化方法
可以使用标准技术将异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸或包含它们的载体插入宿主细胞(如,细菌细胞)中,以表达编码的异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽。可以用例如转化、电穿孔、细胞核显微注射、转导、转染(如,脂质转染介导或DEAE-葡聚糖介导的转染或使用重组噬菌体病毒的转染)、与磷酸钙DNA沉淀孵育、用DNA包被的微粒子弹进行高速轰击以及原生质体融合等技术将DNA构建体或载体引入宿主细胞中。通用的转化技术是本领域已知的(参见例如CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.(eds)Chapter9,1987(《现代分子生物学实验技术》(F.M.Ausubel等人编辑,第9章,1987年));Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring Harbor,2001(Sambrook等人,《分子克隆:实验室指南(第3版)》,冷泉港实验室出版社,2001年);以及Campbellet al.,CurrGenet,16:53-56,1989(Campbell等人,《当代遗传学》,第16卷,第53-56页,1989年),所述文献全文据此各自以引用方式并入,特别是与转化方法相关的内容)。引入的核酸可整合进染色体DNA内或维持为染色体外复制型序列。
可以使用的其他示例性转化方法在美国专利公布2009/0203102、WO2009/076676、WO2010/003007、WO2009/132220、WO2010/031062、WO2010/031068、WO2010/031076、WO2010/031077和WO2010/031079中有所描述。
示例性的细胞培养基
任何碳源均可用于培养宿主细胞。术语“碳源”是指一种或多种能够被宿主细胞或生物体代谢的含碳化合物。例如,用于培养宿主细胞的细胞培养基可包含任何适于维持生活力或使宿主细胞生长的碳源。
在一些实施例中,碳源为碳水化合物(如单糖、二糖、低聚糖或多糖)、转化糖(如,酶处理的蔗糖糖浆)、丙三醇、甘油(如,生物柴油或肥皂制造工艺的甘油副产品)、二羟基丙酮、一碳源、脂肪酸(如,饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸)、类脂、磷脂、甘油脂、单甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、多肽(如,微生物或植物蛋白或肽)、可再生的碳源(如,生物质碳源,例如水解生物质碳源;甜菜糖或蔗糖糖蜜)、酵母提取物、酵母提取物的组分、聚合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、琥珀酸盐、乳酸盐、醋酸盐、乙醇,或上述两种或更多种的任何组合。在一些实施例中,碳源为光合作用的产物,包括但不限于葡萄糖。
示例性的单糖包括葡萄糖和果糖;示例性的低聚糖包括乳糖和蔗糖,以及示例性的多糖包括淀粉和纤维素。示例性的碳水化合物包括C6糖(如,果糖、甘露糖、半乳糖或葡萄糖)和C5糖(如,木糖或阿拉伯糖)。在一些实施例中,细胞培养基包含碳水化合物以及除碳水化合物之外的碳源(如,丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、脂肪酸、类脂、磷脂、甘油脂、单甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源或酵母提取物的组分)。在一些实施例中,细胞培养基包含碳水化合物以及多肽(如,微生物或植物蛋白或肽)。在一些实施例中,微生物多肽为来自酵母或细菌的多肽。在一些实施例中,植物多肽为来自大豆、玉米、低芥酸菜籽、麻风树、棕榈树、花生、向日葵、椰子、芥菜、油菜籽、棉籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻或亚麻籽的多肽。
在一些实施例中,碳水化合物的浓度为至少或约5克/升发酵液(g/L,其中发酵液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积),例如至少或约10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400g/L或更大。在一些实施例中,碳水化合物的浓度介于约50和约400g/L之间,例如介于约100和约360g/L之间,介于约120和约360g/L之间,或介于约200和约300g/L之间。在一些实施例中,碳水化合物的该浓度包括在宿主细胞培养之前和/或期间加入的碳水化合物的总量。
示例性的类脂为包含为C4的一种或多种脂肪酸以及饱和、不饱和或支链的上述脂肪酸的任何物质。
示例性的脂肪酸包括式R-COOH的化合物,其中“R”为烃类。示例性的不饱和脂肪酸包括其中“R”包括至少一个碳-碳双键的化合物。示例性的不饱和脂肪酸包括但不限于油酸、异油酸、亚油酸、棕榈烯酸和花生四烯酸。示例性的多不饱和脂肪酸包括其中“R”包括多个碳-碳双键的化合物。示例性的饱和脂肪酸包括其中“R”为饱和脂族基团的化合物。在一些实施例中,碳源包括一种或多种C12-C22脂肪酸,例如C12饱和脂肪酸、C14饱和脂肪酸、C16饱和脂肪酸、C18饱和脂肪酸、C20饱和脂肪酸或C22饱和脂肪酸。在示例性的实施例中,脂肪酸为棕榈酸。在一些实施例中,碳源为脂肪酸(如,不饱和脂肪酸)的盐、脂肪酸(如,不饱和脂肪酸)的衍生物、或脂肪酸(如,不饱和脂肪酸)的衍生物的盐。合适的盐包括但不限于锂盐、钾盐、钠盐等。二甘油和三甘油为甘油的脂肪酸酯。
在一些实施例中,类脂、脂肪酸、单甘油酯、甘油二酯或甘油三酯的浓度为至少或约1克/升发酵液(g/L,其中发酵液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积),例如至少或约5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400g/L或更高。在一些实施例中,类脂、脂肪酸、单甘油酯、甘油二酯或甘油三酯的浓度介于约10和约400g/L之间,例如介于约25和约300g/L之间,介于约60和约180g/L之间,或介于约75和约150g/L之间。在一些实施例中,该浓度包括在宿主细胞培养之前和/或期间加入的类脂、脂肪酸、单甘油酯、甘油二酯或甘油三酯的总量。在一些实施例中,碳源不仅包括(i)类脂、脂肪酸、单甘油酯、甘油二酯或甘油三酯,还包括(ii)碳水化合物,例如葡萄糖。在一些实施例中,类脂、脂肪酸、单甘油酯、甘油二酯或甘油三酯与碳水化合物的基于碳的比率为约1∶1(即,每个碳水化合物碳对应类脂、脂肪酸、单甘油酯、甘油二酯或甘油三酯中的一个碳)。在特定实施例中,类脂、脂肪酸、单甘油酯、甘油二酯或甘油三酯的量介于约60和180g/L之间,碳水化合物的量介于约120和360g/L之间。
示例性的微生物多肽碳源包括来自酵母或细菌的一种或多种多肽。示例性的植物多肽碳源包括来自大豆、玉米、低芥酸菜籽、麻风树、棕榈树、花生、向日葵、椰子、芥菜、油菜籽、棉籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻或亚麻籽的一种或多种多肽。
示例性的可再生碳源包括干酪乳清透过液、玉米浆、糖用甜菜糖蜜、大麦麦芽以及来自前述任一者的组分。示例性的可再生碳源还包括生物质(如玉米、柳枝稷、甘蔗)中存在的葡萄糖、己糖、戊糖和木糖,发酵过程的细胞废物以及研磨大豆、玉米或小麦产生的蛋白质副产物。在一些实施例中,生物质碳源为木质纤维素、半纤维素或纤维素材料,例如但不限于草、小麦、小麦秸秆、蔗渣、甘蔗渣、软木浆、玉米、玉米芯或壳、玉米籽粒、玉米籽粒纤维、玉米秸秆、软枝草、稻壳产物或湿磨或干磨谷物(如,玉米、高粱、裸麦、黑小麦、大麦、小麦和/或酒糟)的副产物。示例性纤维质材料包括木材、纸材和纸浆废物、草本植物和果肉。在一些实施例中,碳源包括任何植物部分,例如茎、谷粒、根或块茎。在一些实施例中,以下任一植物的全部或部分用作碳源:玉米、小麦、裸麦、高粱、黑小麦、大米、小米、大麦、木薯、豆类(例如黄豆和豌豆)、马铃薯、红薯、香蕉、甘蔗和/或木薯。在一些实施例中,碳源为生物质水解产物,例如包括木糖和葡萄糖或包括蔗糖和葡萄糖的生物质水解产物。
在一些实施例中,在将可再生碳源(例如生物质)加入细胞培养基中之前对其进行预处理。在一些实施例中,预处理包括酶预处理、化学预处理或酶和化学预处理的组合(参见,例如,Farzaneh et al.,BioresourceTechnology96(18):2014-2018,2005(Farzaneh等人,《生物资源技术》,第96卷,第18期,第2014-2018页,2005年);美国专利No.6,176,176;美国专利No.6,106,888)。在一些实施例中,可再生碳源在被加入细胞培养基中之前被部分或完全水解。
在一些实施例中,可再生碳源(例如玉米秸秆)在被加入细胞培养基中之前经受氨纤维膨胀(AFEX)预处理(参见,例如,Farzaneh et al.,Bioresource Technology96(18):2014-2018,2005(Farzaneh等人,《生物资源技术》,第96卷,第18期,第2014-2018页,2005年))。在AFEX预处理过程中,用液态无水氨在适度温度(例如约60至约100℃)和高压(例如约250至约300psi)下将可再生碳源处理约5分钟。然后,迅速释放压力。在该处理中,木质素溶解作用、半纤维素水解、纤维素去晶作用和增大的表面积的组合化学和物理效应能够使纤维素和半纤维素几乎完全酶转化成可发酵糖。AFEX预处理的优点是几乎所有的氨都可以回收和再利用,同时仍然在下游处理中充当微生物的氮源。另外,AFEX预处理不需要洗涤流。因此,AFEX处理之后的干物质回收为基本上100%。AFEX基本上为干-干处理。处理过的可再生碳源长期稳定,并可以在酶水解或发酵处理中以非常高的固相含量进料。纤维素和半纤维素在AFEX处理中保存完好,只有极少降解或没有降解。在经过AFEX预处理的可再生碳源的酶水解之前不需要进行中和。AFEX处理过的碳源的酶水解产生供后续发酵使用的清洁糖流。
在一些实施例中,碳源(如,可再生碳源)的浓度相当于至少或约0.1、0.5、1、1.5、2、3、4、5、10、15、20、30、40或50%葡萄糖(重量体积比)。可以通过使用标准HPLC方法用葡萄糖作为基准测量碳源产生的葡萄糖量来确定等量的葡萄糖。在一些实施例中,碳源(如,可再生碳源)的浓度相当于介于约0.1和约20%葡萄糖之间,例如介于约0.1和约10%葡萄糖之间,介于约0.5和约10%葡萄糖之间,介于约1和约10%葡萄糖之间,介于约1和约5%葡萄糖之间,或介于约1和约2%葡萄糖之间。
在一些实施例中,碳源包括酵母提取物或酵母提取物的一种或多种组分。在一些实施例中,酵母提取物的浓度为至少1克酵母提取物/升发酵液(g/L,其中发酵液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积),如至少或约5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300g/L或更高。在一些实施例中,酵母提取物的浓度介于约1和约300g/L之间,例如介于约1和约200g/L之间,介于约5和约200g/L之间,介于约5和约100g/L之间,或介于约5和约60g/L之间。在一些实施例中,该浓度包括在宿主细胞培养之前和/或期间加入的酵母提取物的总量。在一些实施例中,碳源包括酵母提取物(或它的一种或多种组分)和另一种碳源,例如葡萄糖。在一些实施例中,酵母提取物与其他碳源的比率为约1∶5、约1∶10或约1∶20(重量比)。
另外,碳源也可以是一碳底物,例如二氧化碳或甲醇。据报告,在甲醇营养型酵母中(Yamada et al.,Agric.Biol.Chem.,53(2)541-543,1989(Yamada等人,《农业生物与化学》,第53卷,第2期,第541-543页,1989年))和细菌中(Hunter et.al.,Biochemistry,24,4148-4155,1985(Hunter等人,《生物化学》,第24卷,第4148-4155页,1985年))可由单碳源(如,甲醇、甲醛或甲酸盐)产生甘油。这些生物体可以同化从甲烷到甲酸盐以不同氧化状态存在的单碳化合物,并产生甘油。碳同化途径可以是通过核酮糖单磷酸、通过丝氨酸或通过木酮糖-单磷酸(Gottschalk,Bacterial Metabolism,Second Edition,Springer-Verlag:NewYork,1986(Gottschalk,《细菌代谢(第二版)》,斯普林格出版公司,纽约,1986年))进行,其全文据此以引用方式并入,特别是与碳源有关的内容)。核酮糖单磷酸途径涉及使甲酸盐与核酮糖-5-磷酸缩合形成六碳糖,其变成果糖,并最终变成三碳产物甘油醛-3-磷酸。同样,丝氨酸途径通过亚甲基四氢叶酸将一碳化合物同化到糖酵解途径中。
除了一碳和二碳底物,还已知甲醇营养型生物体利用多种其他含碳化合物例如甲胺、葡糖胺和多种氨基酸进行代谢活动。例如,已知甲醇营养型酵母利用来自甲胺的碳形成海藻糖或甘油(Bellion et al.,Microb.GrowthCl Compd.,Int.Symp.,7th ed.,415-32.Editors:Murrell et al.,Publisher:Intercept,Andover,UK,1993(Bellion等人,依赖Cl化合物的微生物生长,国际研讨会,第7版,第415-432页,编辑:Murrell等人,出版社:Intercept,英国安多弗,1993年))。相似地,多种假丝酵母菌种代谢丙氨酸或油酸(Sulter et al.,Arch.Microbiol.153(5),485-9,1990(Sulter等人,《微生物学档案》,第153卷,第5期,第485-489页,1990年))。
在一些实施例中,在包含生理盐和营养物质的标准培养基中培养细胞(参见,如,Pourquie,J.et al.,Biochemistry and Genetics of CelluloseDegradation,eds.Aubert et al.,Academic Press,pp.71-86,1988(Pourquie,J.等人,《纤维素降解的生物化学和遗传学》,Aubert等人编辑,学术出版社,第71-86页,1988年);和Ilmen et al.,Appl.Environ.Microbiol.63:1298-1306,1997(Ilmen等人,《应用与环境微生物学》,第63卷,第1298-1306页,1997年))。示例性的生长培养基是常规的市售成品培养基,如Luria Bertani(LB)肉汤、沙氏葡萄糖(SD)肉汤或酵母培养基(YM)肉汤。微生物学或发酵科学领域的技术人员将会知道也可使用的其他成分确定的或合成的生长培养基,以及适于特定宿主细胞生长的合适培养基。
除了适当的碳源外,细胞培养基有利地含有合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲剂以及本领域技术人员已知的适于培养物生长或增强异戊二烯产量的其他组分(参见例如WO2004/033646和其中所引用的参考文献以及WO96/35796和其中所引用的参考文献)。在一些实施例中,在异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸受诱导型启动子控制的情况下,有利地是将诱导剂(如,糖、金属盐或抗微生物剂)以可有效地诱导异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽的表达的浓度加至培养基中。在一些实施例中,细胞培养基具有抗生素(如卡那霉素),该抗生素对应于具有一条或多条异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸的载体上的抗生素抗性核酸(如卡那霉素抗性核酸)。
其他可以使用的示例性细胞培养基在美国专利公布2009/0203102、WO2009/076676、WO2010/003007、WO2009/132220、WO2010/031062、WO2010/031068、WO2010/031076、WO2010/031077和WO2010/031079中有所描述。
异戊二烯的示例性的制备
在一些实施例中,将细胞在培养基中在允许细胞生产异戊二烯的条件下进行培养。在一些实施例中,培养物中的细胞产生大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000纳摩尔或更高纳摩尔的异戊二烯/克细胞湿重/小时(nmole/gwcm/hr)。在一些实施例中,异戊二烯的量介于约2至约5,000nmole/gwcm/hr之间,例如介于约2至约100nmole/gwcm/hr之间,约100至约500nmole/gwcm/hr之间,约150至约500nmole/gwcm/hr之间,约500至约1,000nmole/gwcm/hr之间,约1,000至约2,000nmole/gwcm/hr之间,或约2,000至约5,000nmole/gwcm/hr之间。可以如美国专利No.5,849,970中所公开测量以nmole/gwcm/hr为单位的异戊二烯的量。例如,使用标准的气相色谱系统,如具有正辛烷/多孔硅胶珠C柱(伊利诺伊州迪尔菲尔德的亚泰克联合公司(Alltech Associates,Inc.,Deerfield,IL))并连接到RGD2氧化汞还原气体检测器(加州门洛帕克的痕量分析公司(Trace Analytical,Menlo Park,CA))的等温下(85℃)操作的系统,分析2mL的顶空(例如来自在密封小瓶中于32℃、200rpm下振动培养大约3小时的培养物(如2mL培养物)的顶空)中的异戊二烯(参见,如Greenberg et al,Atmos.Environ.27A:2689-2692,1993(Greenberg等人,《大气环境》,第27A卷,第2689-2692页,1993年);Silver et al.,Plant Physiol.97:1588-1591,1991(Silver等人,《植物生理学》,第97卷,第1588-1591页,1991年))。通过标准的异戊二烯浓度校准曲线将气相色谱面积单位换算为纳摩尔异戊二烯。在一些实施例中,通过获得细胞培养物样品的A600值,然后将该A600值根据具有已知A600值的细胞培养物的湿重的校准曲线换算为细胞克数,来计算细胞湿重克数值。在一些实施例中,通过假定A600值为1的一升发酵液(包括细胞培养基和细胞)具有1克的细胞湿重来估计细胞克数。还将该值除以该培养物已温育的小时数,如三小时。
在一些实施例中,培养物中的细胞产生大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、100,000或更多纳克的异戊二烯/克细胞湿重/小时(ng/gwcm/h)。在一些实施例中,异戊二烯的量介于约2至约5,000ng/gwcm/h之间,例如介于约2至约100ng/gwcm/h之间,约100至约500ng/gwcm/h之间,约500至约1,000ng/gwcm/h之间,约1,000至约2,000ng/gwcm/h之间,或约2,000至约5,000ng/gwcm/h之间。可以用上文所讨论的以nmole/gwcm/hr为单位的异戊二烯产量数值乘以68.1,来计算以ng/gwcm/h为单位的异戊二烯的量(如以下公式5所述)。
在一些实施例中,培养物中的细胞产生的异戊二烯的累计滴度(总量)大于或为约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000或更多毫克异戊二烯/升发酵液(mg/L发酵液,其中发酵液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)。在一些实施例中,异戊二烯的量介于约2至约5,000mg/L发酵液之间,例如介于约2至约100mg/L发酵液之间,约100至约500mg/L发酵液之间,约500至约1,000mg/L发酵液之间,约1,000至约2,000mg/L发酵液之间,或约2,000至约5,000mg/L发酵液之间。摇瓶或类似培养物的以mg异戊二烯/L顶空为单位的异戊二烯比生产率可以用以下方法测量:从OD600值为大约1.0的细胞培养物中取出1ml样品,将其放入20mL小瓶中培养30分钟,然后测量顶空中异戊二烯的量。如果OD600值不是1.0,那么可以通过除以OD600值将测量值归一化为1.0的OD600值。可以通过乘以系数38将mg异戊二烯/L顶空的值换算成mg/L发酵液/hr/培养物发酵液OD600。可以将以mg/L发酵液/hr/OD600为单位的值乘以小时数和OD600值,获得以mg异戊二烯/L发酵液为单位的累计滴度。
可以通过以下方法测量发酵罐中以mg/L发酵液/hr为单位的瞬时异戊二烯生产速率:取出发酵罐排气的样品,分析它的异戊二烯量(例如以mg异戊二烯/L气体为单位),并将该值乘以排气穿过每升发酵液的速率(如,1vvm(空气体积/发酵液体积/分钟),这里是60L气体/小时)。因此,在1vvm的空气流下,1mg/L气体的排气含量对应于60mg/L发酵液/hr的瞬时生产速率。如果需要,可以用以mg/L发酵液/hr为单位的值除以OD600值获得以mg/L发酵液/hr/OD为单位的比速率。可以通过将该平均排气异戊二烯浓度乘以发酵期间每升发酵液鼓泡的排气总量,将mg异戊二烯/L气体的平均值换算成总产物生产率(异戊二烯克数/升发酵液,mg/L发酵液)。因此,1vvm下10小时内为0.5mg/L发酵液/hr的平均排气异戊二烯浓度对应于300mg异戊二烯/L发酵液的总产物浓度。
在一些实施例中,培养物中的细胞将细胞培养基中大于或约0.0015、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、0.14、0.16、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4或1.6%的碳转化为异戊二烯。在一些实施例中,碳转化为异戊二烯的转化百分比介于约0.002至约1.6%之间,例如约0.002至约0.005%、约0.005至约0.01%、约0.01至约0.05%、约0.05至约0.15%、0.15至约0.2%、约0.2至约0.3%、约0.3至约0.5%、约0.5至约0.8%、约0.8至约1.0%或约1.0至约1.6%。可以通过将产生的异戊二烯中的碳摩尔数除以碳源中的碳摩尔数(例如分批补料的葡萄糖和酵母提取物中的碳摩尔数)来测量碳转化成异戊二烯的转化百分比(也称为“碳产率%”)。将该数值乘以100%,得到百分比值(如公式1所示)。
公式1
碳产率%=(产生的异戊二烯中的碳摩尔数)/(碳源中的碳摩尔数)*100
对于该计算而言,可以假定酵母提取物包含50%重量比的碳。
公式2
碳产率%=(39.1g异戊二烯*1/68.1mol/g*5C/mol)/[(181221g葡萄糖*1/180mol/g*6C/mol)+(17780g酵母提取物*0.5*1/12mol/g)]*100=0.042%
本领域的技术人员可以容易地将异戊二烯生产速率或产生的异戊二烯量换算为任何其他单位。下面列出了用于单位之间相互换的示例性公式。
异戊二烯生产速率单位(总速率和比速率)
公式3
1g异戊二烯/L发酵液/hr=14.7mmol异戊二烯/L发酵液/hr(总容积率)
公式4
1nmol异戊二烯/gwcm/hr=1nmol异戊二烯/L发酵液/hr/OD600(该换算假定OD600值为1的1升发酵液具有1克的细胞湿重)。
公式5
1nmol异戊二烯/gwcm/hr=68.1ng异戊二烯/gwcm/hr(给定异戊二烯的分子量)
公式6
1nmol异戊二烯/L气体O2/hr=90nmol异戊二烯/L发酵液/hr(在90L/hr/L培养发酵液的O2流速下)
公式7
1μg异戊二烯/L气体排气中的异戊二烯=60μg异戊二烯/L发酵液/hr,流速为60L气体/L发酵液(1vvm)
滴度单位(总滴度和比滴度)
公式8
1nmol异戊二烯/mg细胞蛋白质=150nmol异戊二烯/L发酵液/0D600(该换算假设OD600值为1的1升发酵液具有大约150mg的总蛋白质)(比生产率)
公式9
1g异戊二烯/L发酵液=14.7mmol异戊二烯/L发酵液(总滴度)
如果需要,公式10可用于将包括细胞湿重的任何单位换算为包括细胞干重的对应单位。
公式10
细胞干重=(细胞湿重)/3.3
在本发明所包括的一些实施例中,包含编码异戊二烯合酶变体多肽的异源核酸的细胞产生的异戊二烯量为在大致相同的条件下生长的没有编码异戊二烯合酶变体多肽的异源核酸的对应细胞所产生的异戊二烯量的至少或约2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍或更大。
在本发明所包括的一些实施例中,包含编码异戊二烯合酶变体多肽的异源核酸和一种或多种编码DXS、IDI和/或MVA途径多肽的异源核酸的细胞产生的异戊二烯量为在大致相同的条件下生长的没有异源核酸的对应细胞所产生的异戊二烯量的至少或约2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍或更大。
示例性的异戊二烯纯化方法
在一些实施例中,本文所述的任何方法还包括回收异戊二烯。例如,可以用标准技术回收用本发明组合物和方法生成的异戊二烯,例如气提、分馏、吸附/解吸、全蒸发、从固相热解吸或真空解吸异戊二烯,或用溶剂萃取被固定或吸收至固相的异戊二烯(参见,例如,美国专利No.4,703,007和4,570,029)。在一些实施例中,异戊二烯的回收涉及分离液体形式的异戊二烯(例如异戊二烯纯溶液或溶剂中的异戊二烯溶液)。气提涉及以连续方式从发酵排气流中除去异戊二烯蒸气。此类除去可通过若干种不同方式实现,包括但不限于吸附到固相上、分离到液相中或直接冷凝。在一些实施例中,在高于蒸汽露点的条件下对稀释异戊二烯蒸汽流进行薄膜富集会造成液体异戊二烯的冷凝。在一些实施例中,如提交于2009年12月18日的美国临时专利申请No.61/288,142中所述进行回收。
异戊二烯的回收可以包括一个步骤或多个步骤。在一些实施例中,从发酵排气中除去异戊二烯蒸气和将异戊二烯转化为液相是同时进行的。例如,可以使异戊二烯从排气流中直接冷凝,形成液体。在一些实施例中,从发酵排气中除去异戊二烯蒸气和将异戊二烯转化为液相是按顺序进行的。例如,可以将异戊二烯吸附到固相上,然后用溶剂从固相中萃取。
在一些实施例中,本文所述的任何方法还包括纯化异戊二烯。例如,可以用标准技术纯化用本发明组合物和方法制备的异戊二烯。纯化是指从制备异戊二烯时存在的一种或多种组分中分离异戊二烯的过程。在一些实施例中,获得的异戊二烯为基本上纯的液体。纯化方法的例子包括(i)在液体提取剂中从溶液蒸馏,和(ii)色谱法。如本文所用,“纯化的异戊二烯”是指已从制备异戊二烯时存在的一种或多种组分中分离的异戊二烯。参见,如美国专利申请公布No.2009/0203102、PCT公布WO2009/076676和美国专利申请序列号12/496,573。在一些实施例中,异戊二烯为至少约20重量%,不含有制备异戊二烯时存在的其他组分。在多个实施例中,异戊二烯的纯度按重量计为至少或约25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%或99%。可以用任何合适的方法分析纯度,如,柱层析、HPLC分析或GC-MS分析。
上述说明书中提及的所有出版物和专利均以引用的方式并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的前提下,所述的本发明方法和系统的各种修改形式和变型形式对于本领域技术人员将显而易见。虽然已结合具体实施例描述了本发明,但应认识到,受权利要求书保护的本发明不应不适当地限于这些具体实施例。还应当了解,可以将本文所述的多个实施例的性质中的一种、一些或全部进行组合,形成本发明的其他实施例。本发明的这些和其他方面对于本领域技术人员将显而易见。
实验
为了展示和进一步说明本发明的某些优选实施例和方面,提供了以下实例,并且这些实例不应理解为对本发明的范围构成限制。
在以下实验公开内容中,将应用以下缩写:℃(摄氏度);rpm(每分钟转数);H2O(水);diH2O(去离子水);aa和AA(氨基酸);bp(碱基对);kb(千碱基对);kD(千道尔顿);gm(克);μg和ug(微克);mg(毫克);ng(纳克);μl和ul(微升);ml(毫升);mm(毫米);qs(足量);nm(纳米);μm和um(微米);M(摩尔浓度);mM(毫摩尔浓度);μM和uM(微摩尔浓度);pM(皮摩尔浓度);U(单位);MW(分子量);sec(秒);min(分钟);hr(小时);OD600(600nm处的光密度);BSA(牛血清白蛋白);DMAPP(二甲烯丙基二磷酸);DTT(二硫苏糖醇);EtOH(乙醇);IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷);异戊二烯(2-甲基-1,3-丁二烯);IspS(异戊二烯合酶);PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳);PBS(磷酸盐缓冲盐水[150mM NaCl,10mM磷酸钠缓冲液,pH7.2]);以及SDS(十二烷基硫酸钠)。
下列缩写适用于在实验实例中提到其产品或服务的公司:Agilent(加利福尼亚州圣克拉拉的安捷伦科技公司(Agilent Technologies,Santa Clara,CA));Becton Coulter(加利福尼亚州富勒顿的Becton Coulter公司(BectonCoulter,Inc.,Fullerton,CA));Bio-Rad(加利福尼亚州赫尔克里的Bio-Rad实验室(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA));Cayman Chemical(密歇根州安阿伯的开曼化工有限公司(Cayman Chemical Co.,Ann Arbor,MI));CTC Analytics(瑞士Zwingen的CTC分析仪器股份公司(CTC AnalyticsA.G.,Zwingen,Switzerland));EMS(宾夕法尼亚州哈特菲尔德的电子显微镜供应公司(Electron Microscopy Supply,Hatfield,PA));Epicentre(威斯康星麦迪逊的Epicentre生物技术公司(Epicentre Biotechnologies,Madison,WI));Integrated DNA Technologies(爱荷华州科勒尔维尔的集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies,Coralville,IA));Invitrogen(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Integrated DNA Technologies,Coralville,IA));Molecular Dynamics(加利福尼亚州桑尼维尔的分子动力学公司(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA));Novagen(威斯康星麦迪逊的Novagen公司(Novagen,Inc.,Madison,WI));Perkin Elmer(麻萨诸塞州沃尔瑟姆的珀金埃尔默公司(Perkin Elmer,Waltham,MA));Roche(印地安那州印第安纳波利斯的罗氏应用科学公司(Roche Applied Science,Indianopolis,IN));Sigma(密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO));Stratagene(加利福尼亚州拉荷雅的Stratagene克隆系统公司(Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA));Qiagen(加利福尼亚瓦伦西亚的凯杰公司(Qiagen,Inc.,Valencia,CA));Takara(威斯康星麦迪逊的宝生物美国公司(Takara Bio USA,Madison,WI));Thomson Instrument(加利福尼亚州奥欣赛德的汤姆森仪器有限公司(Thomson Instrument Co.,Oceanside,CA));V&P Scientific(加利福尼亚州圣迭戈的V&P科学有限公司(V&P Scientific,Inc.,San Diego,CA));以及Zinsser(加利福尼亚州北岭的Zinsser北美公司(Zinsser North America,Northridge,CA))。
实例
以下实例是为了进行示意性的说明而提供的,并不旨在以任何方式限制本发明。
实例1:异戊二烯合酶生长筛选:验证、优化和限制
该实例描述了通过构建体内筛选来选择异戊二烯合酶的改善变体。发明人发现,可以用体内筛选来选择异戊二烯合酶活性小于对照(在我们的例子中,为最佳验证的异戊二烯合酶MEA-银白杨)的细胞。另外,可以用体内筛选来选择异戊二烯合酶活性大于对照(在我们的例子中,为最佳验证的异戊二烯合酶MEA-银白杨)的细胞。
方法
菌株:筛选菌株包含组成型表达的下游途径和由pET质粒表达的异戊二烯合酶的变体。筛选菌株为DW425阳性对照。
分析条件:菌株在34℃下在包含50uM卡那霉素的LB培养基中生长过夜。在包含1%葡萄糖、0.1%酵母提取物、8mM MgSO4和以下浓度之一的IPTG的TM3培养基中将过夜培养物稀释至大约0.2OD600:0、10、20、30、40、50、60或70uM。细胞在诱导后生长大约2小时,然后将其转移到包含不同浓度的甲羟戊酸(0、5、7.5、10、15、20mM)和白天培养物中所用的相同培养基的96孔透明底微量滴定板上,稀释至0.2-0.3的最终OD600。在Spectramax UV-Vis分光光度计上监测板的动力学模式。在34℃下对实验监测3小时,每次测量(每5分钟取一次)之前摇动1分钟。
数据分析:将所有数据都转移到Excel表中。将吸光度测量值换算成它们的自然对数。然后用函数“LINEST”对该系列进行直线拟合,得出指数生长常数(生长速率)。
使用下列方案对代谢物的甲醇/水提取进行小规模的代谢物分析(MVA,DXP):
1.淬灭小规模实验的样品;通常对1ml样品进行瞬时离心,弃去上清液,将100μl纯甲醇上样到沉淀物上,并将样品在-80℃下保存,直到代谢物提取和分析的时候为止。
2.从-80℃贮藏室中取出样品;重悬沉淀物(推荐用玻璃毛细管将沉淀物搅散)。
3.在冷冻微型离心机中以14000g(rfc)对样品进行4分钟的瞬时离心。
4.将上清液放入干净的1.5mL埃彭道夫(Eppendorf)管中。
5.将沉淀物重悬于pH8.0的100μl6∶1MeOH/5mM NH4OAc中。以14000g(rfc)离心4分钟。如果所关注的代谢物在pH8.0下不稳定(例如,DXP代谢物或含CoA的代谢物),可以在pH7.0的6∶1MeOH/5mM NH4OAc中提取样品。
6.将该上清液与步骤4的上清液混合。
7.重复步骤5-6,用pH8.0(或pH7.0,参见上文)的100μl1∶1MeOH/5mM NH4OAc提取。抽取上清液后丢弃样品沉淀物。将包含累积上清液部分的1.5ml埃彭道夫(Eppendorf)管盖上,并通过涡流混合提取物。
8.为了移除悬浮的碎片,以14000g(rfc)对1.5ml埃彭道夫(Eppendorf)管离心4分钟。
9.将约200μl提取物置于包含锥体内衬管的LC/MS小瓶中。在-20℃下保存剩余的提取物。
不受理论的约束,建议使用重复移液器分配2%的甲酸(以便快速移液并保持一致的体积)。与标准移液器相比,重复移液器显著提高了时间效率,并且因为它们实际上是正位移移液器,所以它们非常精确(和准确,如果良好校正和正确维护的话)。另外的建议包括但不限于:尽可能将埃彭道夫(Eppendorf)管存放在冰(0℃)上,微型离心机应设置在-9℃;让离心机冷却20分钟,以使沉淀物重悬,建议使用玻璃毛细管。通常只用很少物理辅助就可以非常快地对细胞沉淀物进行机械破碎。不建议对重悬沉淀物进行涡旋,因为细胞群非常容易最终贴在管的侧面,由于样品量较低,有可能引起显著的实验误差。
不受理论的约束,对LC/MS分析提供以下建议:
1.分析期间应将LC/MS小瓶保持在4℃的托盘上。柱应在室温下。在Xcalibur中启动序列之后将自动设置托盘/柱温度,但提前设置托盘温度更好。
2.使用所附电子表格中制定的标准进行校正。记录每个管上所标的标准制备日期。
3.类异戊二烯和MVA途径代谢物的LC/MS方法(目前在新型TSQQuantum Access三重四极质谱仪上)-方法文件:IPS_BioBasic100_090316(或类似,参见最近日期扩展);HPLC柱:Macherey-Nagel Nucleodex beta-OH EC2mM×100mM(粒度5μM,孔尺寸)、C/N720351.20;保护柱:721460.40(2mM保护柱目前不可用)。DXP途径代谢物的LC/MS方法:方法开发C18-离子对\代谢物_C18_TBAip_11,其中三丁基乙酸胺用作离子对试剂;HPLC柱:C18Phenomenex Synergi4μHydro-RP80A150×2.0mM,C/N00F-4375-B0;保护柱:Security GuardCartridges AQ C18 4×2.0mm,C/N AJ0-7510。对于检测包含CoA的代谢物的LC/MS方法而言,参见“Protocol for acidic extractionof metabolites at small-scale(CoAs,etc.)”(对代谢物进行小规模酸提取的方案(CoAs等))。
4.分析之后,应在-20℃下保存样品;标准物应保存在-80℃C下。
5.用LCQuan软件包可以很容易地确定代谢物的量。对所有稀释物(包括初始甲醇淬灭)进行反算之后,应将浓度归一化为OD,并利用200OD的1L发酵液的细胞内体积为约50mL的假设将其换算成细胞内浓度。
结果
此前已经开发出利用来自表达未知蛋白质的质粒库的酶选择DMAPP的系统(Appl Environ Microbiol.2007October;73(19):6277-6283(《应用与环境微生物》,2007年10月,第73卷,第19期,第6277-6283页))。发明人改进和优化了筛选程序,从而能够选择包含异戊二烯合酶活性的细胞。筛选依据这样的实验结果,其推断出大肠杆菌(E.coli)中的DMAPP浓度与细胞生长速率相关联(图1)。因此,不受理论的约束,这些细胞的生长速率可被认为是细胞内DMAPP浓度的生物传感器。不受理论的约束,该筛选的基本原理是可以通过提高消耗DMAPP的酶(异戊二烯合酶)的酶活性来降低细胞中的DMAPP浓度,从而提高生长速率。
为了测试该假设,让DW425细胞在包含IPTG和甲羟戊酸浓度基质的培养基中生长(图2和图3)。在不添加甲羟戊酸的情况下,在60uM和更大浓度的IPTG存在下生长的细胞,结果生长受到影响(与非诱导的细胞相比)。在0-50μM IPTG的IPTG浓度下,与非诱导细胞相比,生长未受到影响。在非诱导细胞中用所有浓度的甲羟戊酸抑制了细胞生长。对于筛选的任何给定甲羟戊酸浓度而言,增大IPTG的浓度导致生长速率提高(图2和图3)。在进行的早期研究中已确定细胞中表达的酶的浓度与存在的IPTG的浓度相关联。因此,提高这些菌株中的异戊二烯合酶表达/活性导致生长速率提高。
实例2通过减轻DMAPP毒性分析银白杨(P.alba)异戊二烯合酶SEL
提高的细胞内DMAPP水平与大肠杆菌(E.coli)的生长抑制之间具有很强的相关性,通过银白杨(P.alba)异戊二烯合酶(IspS)的表达可以减弱这种相关性。不受理论的约束,由于DMAPP更快速地转化成异戊二烯,因此提高的IspS活性水平应允许更佳的生长。通过这些条件下监测表达IspS变体的大肠杆菌(E.coli)的生长速率,发明人可鉴定出突变型IspS酶,其表现出增强了细胞内将DMAPP转化为异戊二烯的能力。
方法:
1)质粒和菌株构建:
SEL质粒骨架-通过QuikChange(Stratagene)PCR在模板pDu39上构建用于生成SEL的质粒骨架(引物序列参见表1)。用1μl DpnI(罗氏公司(Roche))将PCR产物处理3小时,然后根据制造商的建议方案将1μl的全部反应物转化进化学感受态大肠杆菌(E.coli)Top10细胞(英杰公司(Invitrogen))。使细胞恢复并将其置于包含50μg/ml卡那霉素的LB培养基上。第二天,选择阳性菌落,用于生长、质粒纯化(凯杰公司(Qiagen))和测序(Quintara生物科学公司(Quintara Biosciences))。选择具有正确碱基变化的质粒,对整个开放读框进行测序,以确认编码序列的完整性。选择这些质粒中的一者pCL201(参见图4)作为构建SEL的骨架(采用Verdezyne和DNA2.0)。
表1.QuikChange和测序引物
PCR和循环参数:
QuikChange PCR:
1ul pDu39
5ul10X PfuUltra HF缓冲液
1ul dNTPs
1ul(50uM)MEA发夹阻断(pET)F
1ul(50uM)MEA发夹阻断(pET)R
2ul DMSO
39ul diH2O
1ul PfuUltra HF聚合酶(Stratagene)
QuikChange的PCR循环参数:
1.95℃1分钟
2.95℃50秒
3.60℃50秒
4.68℃7分钟
5.转到步骤2,循环18次
6.68℃7分钟
pCL201的序列:
tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaattaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggggccgccatgccggcgataatggcctgcttctcgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggcacctgtcctacgagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatatccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactata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银白杨(P.alba)IspS的氨基酸序列:
MEARRSANYEPNSWDYDYLLSSDTDESIEVYKDKAKKLEAEVRREINNEKAEFLTLLELIDNVQRLGLGYRFESDIRGALDRFVSSGGFDAVTKTSLHGTALSFRLLRQHGFEVSQEAFSGFKDQNGNFLENLKEDIKAILSLYEASFLALEGENILDEAKVFAISHLKELSEEKIGKELAEQVNHALELPLHRRTQRLEAVWSIEAYRKKEDANQVLLELAILDYNMIQSVYQRDLRETSRWWRRVGLATKLHFARDRLIESFYWAVGVAFEPQYSDCRNSVAKMFSFVTIIDDIYDVYGTLDELELFTDAVERWDVNAINDLPDYMKLCFLALYNTINEIAYDNLKDKGENILPYLTKAWADLCNAFLQEAKWLYNKSTPTFDDYFGNAWKSSSGPLQLVFAYFAVVQNIKKEEIENLQKYHDTISRPSHIFRLCNDLASASAEIARGETANSVSCYMRTKGISEELATESVMNLIDEFWKKMNKEKLGGSLFAKPFVETAINLARQSHCTYHNGDAHTSPDELTRKRVLSVITEPILPFER
根据标准分子生物技术(Miller,A Short Course in Bacterial Genetics(Miller,《细菌遗传学精简课程》)制备MCM521(本文所述)的SEL表达宿主-P1溶胞产物,并将其转导进BL21(DE3)。在包含20μg/ml卡那霉素的LB培养基平板上选择转导子。通过PCR进一步验证阳性菌落,以确认BL21DE3菌株中存在PL.2-mKKDyI。然后将1μl的pCP20质粒转化进该菌株,在包含50μg/ml羧苄青霉素的LB上选择阳性菌落并在30℃下孵育过夜。将阳性转化株划线于LB平板上,在37℃下孵育,以诱导pCP20质粒丢失。为了确认新霉素(卡那霉素)抗性标记的丢失,将在37℃下生长的菌落影印到包含20μg/ml卡那霉素、50μg/ml羧苄青霉素或不含抗生素的LB培养基上。具有整合的PL.2mKKDyI、没有卡那霉素抗性标记、丢失pCP20的菌株应对卡那霉素和羧苄青霉素敏感。用PCR检查对卡那霉素和羧苄青霉素敏感的四个菌落的BL21(DE3)中是否存在mKKDyI,用亲代BL21(DE3)菌株作为对照。在下文所述的对SEL的生长量分析中,用所得的菌株MD09-170表达IspS变体。用于生长量分析的对照菌株包含空pET24a+载体或pCL201,其分别用作IspS表达的阴性和阳性对照(参见表2)。
表2.菌株
2)SEL的构建:
此前分析了IspS的25个位点评价库(SEL)的比活性。表3列出了这些库中包括的残基。为了进行生长量分析,对这些库中包含变体IspS酶的质粒进行纯化并转化进表达宿主MD09-170:直接从甘油储存液复制原始库,并在30℃下在96深孔板(VWR)中包含50μg/ml卡那霉素的LB中生长过夜。通过离心(Eppendorf5804R)收获过夜生长的细胞并弃去上清液。使用Hamilton Microlab STAR自动液体处理工作站和Nucleospin Multi-96Plus质粒纯化试剂盒(Macherey Nagel)根据制造商的建议方案对细胞沉淀物进行质粒纯化。在平底96孔聚苯乙烯板(Falcon)中使用设置为42℃的Eppendorf Thermomixer R将3μl每个变体所得的质粒DNA转化进化学感受态MD09-170细胞。在LB培养基中恢复细胞2小时,然后在包含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中稀释并孵育过夜。制备包含具有来自全部25个原始库的变体的MD09-170细胞的平板的甘油储存液并在生长量分析之前保存在-80℃下。
用DNA2.0对第二组80个SEL排序并加工。将这些库直接转化进筛选宿主MD09-170。表4列出了为该组选择的所有80个残基。主要根据它们在最近解析的银白杨(P.alba)IspS晶体结构中的定位挑选位点。将菌株DW425和DW424(参见表2)重新接种到96孔板中,分别用作野生型和阴性对照。
表3.为25个SEL选择的位点
表4.为80个SEL选择的位点
3)提高的IspS活性的生长量分析
对于生长量分析而言,将SEL的甘油储存液接种到平底微量滴定板(Cellstar)中包含50μg/ml卡那霉素的200μl LB培养基中,并在30℃下使用System Duetz(Enzyscreen BV)生长过夜。为了进行预先诱导,将来自每个孔的7μl过夜培养物接种到包含50μM IPTG和50μg/ml卡那霉素的100μlTM3培养基中,并让平板在30℃下生长2小时。然后将预先诱导的培养物以1∶10稀释至玻璃底96方孔微量滴定板(Matrical)中包含11mM甲羟戊酸、50μM IPTG和50μg/ml卡那霉素的TM3培养基中。培养物在34℃下生长,并在Growth Profiler1152(Enzyscreen)中以225rpm摇动大约10小时。根据制造商的建议方案制作每个IspS变体的生长曲线。阴性对照为包含空pET24a+载体(DW424)的菌株,阳性对照为在具有或没有MVA的情况下生长的表达野生型银白杨(P.alba)IspS(DW425)的菌株。
对于数据分析而言,测量与野生型对照相比每个变体在给定时间内的相对生长速率。具体地讲,就是使用Microsoft Excel中的“LINEST”函数对该系列进行直线拟合,以得出指数生长常数(生长速率)。然后将这些值除以来自阳性对照的4个(大多数情况下)生长常数的平均值,得出每个变体的“生长指数”数值。表5中列出了所有105个SEL库中的变体的生长指数值。在一些情况下,特定变体要么不存在于甘油储存液中,要么在过夜LB培养物中未生长,要么未转移到最终平板上进行生长分析。这些特定孔的值列为ND(未确定)。在某些情况下,当特定变体未在银白杨(P.alba)IspS的初始诱变中生成时,野生型残基被置换。
表5.平板001的生长指数排序。
表5.平板002的生长指数排序。
表5.平板003的生长指数排序。
表5.平板004的生长指数排序。
表5.平板005的生长指数排序。
表5.平板006的生长指数排序。
表5.平板007的生长指数排序。
变体 | GI |
T536L | 0.62 |
T536T | 0.59 |
T536Y | 0.58 |
T536I | 0.49 |
T536H | 0.46 |
T536F | 0.45 |
T536G | 0.42 |
T536T | 0.40 |
T536V | 0.38 |
T536S | 0.36 |
T536K | 0.31 |
T536T | 0.30 |
T536M | 0.29 |
T536N | 0.29 |
T536C | 0.27 |
T536A | 0.26 |
T536D | 0.18 |
T536R | 0.15 |
T536E | 0.14 |
T536P | 0.01 |
表5.平板008的生长指数排序。
表5.平板009的生长指数排序。
表5.平板010的生长指数排序。
表5.平板011的生长指数排序。
表5.平板012的生长指数排序。
表5.平板013的生长指数排序。
表5.平板014的生长指数排序。
表5.平板015的生长指数排序。
表5.平板016的生长指数排序。
表5.平板017的生长指数排序。
表5.平板018的生长指数排序。
表5.平板019的生长指数排序。
表5.平板020的生长指数排序。
表5.平板021的生长指数排序。
表5.平板022的生长指数排序。
表5.平板023的生长指数排序。
表5.平板024的生长指数排序。
表5.平板025的生长指数排序。
表5.平板026的生长指数排序。
表5.平板027的生长指数排序。
结果/讨论
表6列出了鉴定的显示具有1.2或更高的生长指数的所有变体。不受理论的约束,在这些位置处的突变可以若干不同的方式导致IspS的细胞内活性提高。不受理论的约束,提高的细胞内活性可能是IspS的任何下列性质之一或组合的结果:提高细胞活力、增大kcat、减小Km、提高比活性、提高溶解度、降低不溶性、改善核糖体结合、提高翻译起始速率、提高翻译延伸速率、提高转录起始速率、提高转录延伸速率、减少DNA二级结构、减少RNA二级结构、增加DNA二级结构、增加RNA二级结构、提高折叠速率、提高对细胞内分子伴侣的亲和力、提高稳定性、降低蛋白质周转、减少对细胞内蛋白酶的暴露、降低对细胞内蛋白酶的亲和力、降低对周质的定位、改善对细胞质的定位、减少包涵体形成、减少膜定位、由于更有利的密码子而增加表达、提高DNA稳定性、提高RNA稳定性和降低RNA降解。
不受理论的约束,对编码或表达IspS的核酸序列(DNA和RNA)的性质或IspS酶本身的生物化学性质具有正面影响的任何突变都可使细胞内具有更大的活性。在甲羟戊酸和IPTG基质中对生长指数为1.2或更高的所有变体进行第二次生长量分析。还将这些变体汇集在一起,在IPTG诱导和甲羟戊酸途径通量下进行若干轮富集,以确定哪些酶在竞争实验中提供最佳生长。还要检测最有前景的变体是否对在产异戊二烯菌株中的比生产率有益。
所关注的一些变体包括但不限于A3T,S13L,I165Y,Q421R,F495L,Q509T,和L540V。在利用IPTG/甲羟戊酸基质的第二次分析中,所有这些变体都显示出优于野生型的生长优势。A3T变体是特别关注的,因为该位置中的苏氨酸存在于来自相关物种欧洲黑杨(P.nigra)、美洲山杨(P.tremuloides)和毛果杨(P.trichocharpa)的同源异戊二烯合酶中。对来自白杨种的IspS的共有序列的改变可以获得更具活性的酶。
F495L变体是特别关注的,因为它在暴露的表面环中的定位跨越残基K487至K497。图5显示,该变体邻近G491S和L494P,,它们分别显示对体内细胞活力和体外IspS比活性具有正面影响。另外,在该表面环中具有若干显示出高生长指数的其他变体。总之,该环中的变体的有益效果可以表明它在细胞内酶活性方面起着关键作用。Q509T变体是特别关注的,因为Q509I和Q509V变体也显示出生长有益效果,并且它们是在β碳处支化的仅有的氨基酸残基。图6显示,Q509位于IspS的活性位点附近但不在其中。该特定氨基酸的β碳处的支化结构的存在可以为酶活性带来有益效果。
表7中所列的残基是在高DMAPP压力下生长所必需的,因此在一个实施例中可将其视为不易突变的残基。在生长速率分析条件下,用任何其他残基置换野生型氨基酸导致最低限度的生长至没有生长。表7中示出了每个位置的生长指数值。苯基丙氨酸287(F287)位于活性位点中,并限定活性位点腔体的底部(图7)。根据与其他萜烯合酶的结构比对,F287确定可容纳到活性位点中的底物的长度,从而防止具有超过5个碳的类异戊二烯触及活性位点。
甘氨酸397(G397)位于活性位点腔体的侧面(图8)。该残基出现在α-螺旋的扭结处,表明该位置处可能需要甘氨酸(和其他小氨基酸)的构象柔性,以允许螺旋弯曲。螺旋中的弯曲邻近活性位点中的假定底物结合位置。
天冬酰胺438(N438)位于活性位点的顶部(图9)。与其他萜烯合酶的结构比对表明,N428可以直接参与镁离子的配位,以及与底物具有可能的相互作用。
谷氨酸451(E451)在位于活性位点上方的底物进出环上(图10)。根据同源建模和与其他萜烯合酶的基于结构的比对,这些环可以具有用于底物捕集的打开位置,然后一旦结合底物就封闭活性位点。在该过程中,残基E451被认为具有与一个或多个镁离子配位的作用。
酪氨酸514(Y514)在活性位点中,在N438下面(图11)。Y514可以参与底物结合,或者它可以直接起到催化作用。
表6.生长指数值等于或大于1.2的变体。
变体 | GI |
L59H | 1.96 |
F495L | 1.84 |
L540V | 1.73 |
V30L | 1.61 |
L540T | 1.58 |
G491I | 1.57 |
F495T | 1.56 |
S493T | 1.53 |
V30K | 1.52 |
L490I | 1.52 |
D33T | 1.49 |
Q509T | 1.49 |
L59K | 1.49 |
G492A | 1.48 |
Q116V | 1.47 |
L59I | 1.46 |
E179L | 1.46 |
L490H | 1.46 |
I28T | 1.46 |
D33V | 1.46 |
I165Y | 1.46 |
F495Y | 1.45 |
F495K | 1.45 |
V30Y | 1.45 |
F53L | 1.44 |
F495W | 1.44 |
G99T | 1.43 |
T462T | 1.43 |
E117I | 1.42 |
G491H | 1.41 |
L59R | 1.41 |
L490V | 1.41 |
S493V | 1.40 |
E179I | 1.40 |
I539V | 1.40 |
F495S | 1.40 |
D33Y | 1.39 |
Q421R | 1.39 |
V30W | 1.39 |
A3T | 1.39 |
K487T | 1.39 |
G492T | 1.38 |
F495V | 1.38 |
G492H | 1.38 |
I28S | 1.38 |
G492V | 1.37 |
A443A | 1.36 |
Q116W | 1.36 |
G491V | 1.36 |
Q116T | 1.36 |
G491L | 1.36 |
A448T | 1.35 |
S493R | 1.35 |
K489W | 1.35 |
E179K | 1.35 |
G153W | 1.34 |
L490W | 1.34 |
L540H | 1.34 |
G87K | 1.34 |
S120L | 1.34 |
F53T | 1.34 |
Q509V | 1.34 |
G78L | 1.33 |
K50I | 1.33 |
K50L | 1.33 |
R544T | 1.33 |
E179H | 1.33 |
G491W | 1.33 |
G491T | 1.33 |
Q116Y | 1.32 |
G99V | 1.32 |
F495H | 1.31 |
G491Y | 1.31 |
G78Y | 1.31 |
T462V | 1.31 |
L540I | 1.31 |
I28R | 1.31 |
G492K | 130 |
Q509I | 1.30 |
D33W | 1.30 |
R44H | 1.30 |
G491K | 1.29 |
A139T | 1.29 |
L130Y | 1.29 |
E117L | 1.29 |
S493W | 1.29 |
F495R | 1.28 |
R544W | 1.28 |
L540K | 1.28 |
L59G | 1.28 |
A519W | 1.27 |
S493E | 1.27 |
F53W | 1.27 |
E117W | 1.27 |
G99I | 1.27 |
G78W | 1.27 |
R44T | 1.27 |
E179W | 1.26 |
A448H | 1.26 |
F53V | 1.26 |
Y377W | 1.26 |
F53I | 1.26 |
G492I | 1.26 |
T462K | 1.26 |
T462H | 1.26 |
S493L | 1.26 |
G177V | 1.26 |
G78I | 1.26 |
P498H | 1.26 |
L59F | 1.26 |
D33H | 1.26 |
V30S | 1.26 |
Q421H | 1.26 |
I539T | 1.26 |
R544V | 1.26 |
F495M | 1.25 |
E173H | 1.25 |
G492E | 1.25 |
L59A | 1.25 |
G177T | 1.25 |
G87T | 1.24 |
G99K | 1.24 |
V202H | 1.24 |
S74K | 1.24 |
G389K | 1.24 |
G87L | 1.24 |
G492D | 1.24 |
Q421E | 1.24 |
N476Y | 1.24 |
I165H | 1.24 |
F53Y | 1.24 |
K489R | 1.24 |
K36L | 1.23 |
D33I | 1.23 |
R544S | 1.23 |
E179T | 1.23 |
A448V | 1.23 |
G99Y | 1.23 |
E173W | 1.23 |
S493K | 1.23 |
G99L | 1.23 |
E174I | 1.23 |
E173T | 1.23 |
D33S | 1.22 |
G177L | 1.22 |
V30F | 1.22 |
K50W | 1.22 |
Q116I | 1.22 |
E179V | 1.22 |
S74W | 1.22 |
L59M | 1.22 |
D33K | 1.21 |
L490T | 1.21 |
A3H | 1.21 |
K489I | 1.21 |
I539L | 1.21 |
R44F | 1.21 |
E117F | 1.21 |
L59C | 1.21 |
S493G | 1.21 |
G69S | 1.21 |
E173V | 1.20 |
L540Y | 1.20 |
S493I | 1.20 |
S120I | 1.20 |
Q116F | 1.20 |
A496H | 1.20 |
H254K | 1.20 |
S74I | 1.20 |
K489T | 1.20 |
L376I | 1.20 |
E174H | 1.20 |
表7.不易突变位点的生长指数值。
实例3生长指数的位置分析
该实例示出了按位置显示的SEL数据的分析结果。对应于特定突变的生长指数如以下表8中所示。
表8
实例4表达异戊二烯合酶的单一位点突变体的大肠杆菌(E.Coli)克隆
的生长数据分析
该实例说明了用性能指数而不是生长指数对生长数据进行的分析。使用Enzyscreen Growth Profiler1152以规则的时间间隔确定G-值。用Excel通过线性回归计算每个样品的生长速率。这是由G-值相对于时间的增值(ΔG/Δt)给出的。该值称为“比降”。用最终G-值减去初始G-值估算每个样品的最终细胞密度。该数值称为“δ”。
对于每个96-孔板而言,通过将每个“比降”和“δ”值除以包含野生型对照的孔的平均值进行归一化。进行该计算时去掉若干明显的野生型异常值。归一化的值称为“性能指数”或“P.I.”。
“比降PI”和“δPI”高度相关,所以用它们计算另一个PI,即“平均PI”。这只是两个PI值的平均值。表9示出了在所有分析位置处的所有变体的多个PI值,表10示出了具有最高归一化平均PI值的前150个变体。
表9.
表10.归一化平均PI的前150个变体
实例5G491S异戊二烯合酶突变体的提高的活力
以下实例显示,当与表达野生型异戊二烯合酶的细胞相比时,表达异戊二烯合酶的G491S变体的产异戊二烯大肠杆菌(Escherichia coli)在发酵过程中具有提高的活力。该实验以14L分批补料规模进行。
菌株构建
BL21(Novagen)中柠檬酸合酶基因(gltA)前面的启动子已被组成型低表达启动子,即GI1.2替换(美国专利7,371,558)。gltA的两种野生型启动子已有所描述(Wilde,R,and J.Guest.1986.J.Gen.Microbiol.132:3239-3251(Wilde,R和J.Guest.,1986年,《普通微生物学杂志》,第132卷,第3239-3251页),并且合成启动子恰好插在远侧启动子的-35区之后。使用引物UpgltACm-F和DngltA1.xgiCm-R(参见表11)并将得自德国海德堡的基因桥公司(Gene Bridges(Heidelberg,Germany))的质粒FRT-gb2-Cm-FRT作为模板,来获得PCR产物。如制造商(德国海德堡的基因桥公司(Gene Bridges,Heidelberg,Germany))所述将PCR产物纯化并将其用于lambda red介导的重组。选择若干菌落进行进一步的表征。使用引物gltAPromSeqF和gltApromSeqR(参见表11)和所提取的DNA扩增启动子区,所述DNA通过在30uL H2O,中重悬菌落,在95℃下加热4分钟,瞬时离心来提取,并且在50uL反应物中使用2uL该材料作为模板。观察获得的PCR产物的测序结果之后,保存包含三种不同启动子GI1.2、GI1.5和GI1.6(美国专利7,371,558)中的每一种的菌落,供进一步使用(表11)。
通过用来自菌株MCM521的P1溶胞产物转导CMP258并在包含20ug/ml卡那霉素的Luria-Bertani平板上对菌落进行选择来构建菌株MD09-313。可以如下所述制备CMP258和MCM521。P1溶胞产物根据Ausubel,et al.,Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley and Sons,Inc.(Ausubel等人,《现代分子生物学实验技术》,约翰.威利父子出版公司)中所述的方法制备而得。用制造商(德国海德堡的基因桥公司(GeneBridges,Heidelberg,Germany))建议的方案移除卡那霉素标记,形成菌株MD09-314。
P1溶胞产物由菌株CMP141、CMP142和CMP143制成,并用于转导菌株MD09-314,以分别形成CMP440、CMP441和CMP442(表11)。用制造商(德国海德堡基因桥公司(Gene Bridges,Heidelberg,Germany))建议的方案移除氯霉素标记,分别形成菌株CMP451、CMP452和CMP453(表11)。
对于异戊二烯生产菌株的构建而言,通过电穿孔将MVA上游途径质粒和pDW34(包含野生型异戊二烯合酶)或pCHL243(包含异戊二烯合酶的G491S变体,参见下文)转化进菌株CMP451。在37℃下在液体LB培养基中恢复菌株1小时,并将其置于包含50μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml壮观霉素的选择性固体琼脂培养基平板上,在37℃下孵育过夜。选择对这些抗生素有抵抗力并具有包含野生型IspS(菌株CMP457,基因型参见表12)或G491SIspS(菌株DW415,基因型参见表12)的质粒的分离株供进一步研究。
菌株MCM518-521和528-531的构建:驱动整合的mKKDyI的λ启动
子
P1转导使得多达100kb的DNA能在细菌菌株之间移动(Thomason等人,2007年)。通过使用P1转导,将来自大肠杆菌(E.coli)K12MG1655的一段细菌染色体移动至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)来置换大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中的17,257bp缺失。
采用使用不同的可选标记的两种策略来鉴定含有重组细菌染色体的菌落。首先,我们将抗生素标记插入接近待转移的17,257bp序列的基因中,该序列的缺失不会对菌株不利。含有该抗生素标记的菌株将可能具有与所述标记同时转导的17,257bp的一段细菌染色体。在这种情况下,我们将编码卡那霉素抗性(“kanR”)的基因插入编码未知功能的有126个氨基酸的蛋白质的ybgS基因内。其次,因为已知的是,在利用半乳糖的过程中涉及的多种基因靠近待转导至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中的17,257bp片段中的pgl,所以用得自大肠杆菌(E.coli)K12MG1655(其含有大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中缺失的17,257bp序列)的P1溶胞产物转导且在含有0.4%(重量体积比)半乳糖的M9培养基(6g/L Na2HPO4、3g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、0.5g/L NH4Cl、0.1mM CaCl2、2mM MgSO4)中分离的菌落将可能包含17,257bp的一段细菌染色体。
使用Stratagene HerculaseTMII融合试剂盒(加利福尼亚州拉荷亚市的安捷伦科技有限公司的Stratagene产品部(Agilent Technologies,StratageneProducts Division,La Jolla,California))根据制造商的方案,将引物MCM120和MCM224用于扩增来自基因桥公司(GeneBridges)FRT-gb2-Cm-FRT模板的氯霉素抗性(“CmR”)盒。对四次50μL PCR反应进行如下循环:95℃/2分钟、95℃/20秒、55℃/20秒、72℃/1分钟,循环30次;以及72℃/3分钟。然后将反应物冷却至4℃。根据制造商的方案将四种反应物合并,上样至凯杰公司(Qiagen)PCR柱上,然后用60μL55℃的洗脱缓冲液(“EB”)洗脱。
使用标准程序,将质粒pRedET-carbenicillinR(德国海德堡的基因桥公司(GeneBridges,Heidelberg,Germany))电穿孔进大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)菌株MCM446(CmR,gi1.6mKKDyI A1-3)中。通过在30℃的SOC培养基中振荡一小时来使转化株恢复,然后在LB+50μg/mL羧苄青霉素(“LB/carb50”)平板上于30℃下培养过夜,选择出转化株。将羧苄青霉素抗性菌落冷冻为菌株MCM508。
使来自新划线的菌株MCM508在30℃下的5mL LB/carb50中生长至OD600为约0.5。此时,加入40mM L-阿拉伯糖,然后将培养物在37℃下孵育1.5小时。然后通过离心收集细胞,如上所述用3μL纯化的扩增子电穿孔,然后使细胞在500μL37℃的SOC培养基中恢复1.5至3小时。在37℃的LB+10μg/mL卡那霉素(LB/kan10)平板上挑选转化株。
通过使用引物GB-DW和MCM208的PCR来确认在目标基因座处的扩增子重组。对所得的扩增子测序,以鉴定具有以下所列的序列的四种克隆。将四种对羧苄青霉素敏感的克隆冷冻为菌株MCM518-MCM521。
将菌株MCM518-MCM521再次划线接种到LB/kan10上并在37℃下生长过夜。挑选菌株MCM518-MCM521的菌落,在37℃下的LB/kan10中培养并使用质粒pCP20电转化,所述质粒编码酵母Flp重组酶、氯霉素和氨苄青霉素抗性基因并赋予宿主细胞温度敏感性复制体(Cherepanov,P.P.etal.,Gene158(1):9-14(1995)(Cherepanov,P.P.等人,《基因》,第158卷,第1期,第9-14页,1995年))。通过使细胞在500μL SOC培养基中在30℃下振荡14、时而使细胞恢复。通过在LB/carb50平板上于30℃下培养过夜而选择出转化株。次日早晨,使来自各个平板的菌落在30℃下的LB/carb50培养基中生长直至明显浑浊。然后将培养物转移至37℃并维持至少3小时。将细胞从该培养物划线到LB平板上,并在37℃下生长过夜。
次日,将菌落影印到LB、LB/carb50和LB/kan10上。将对羧苄青霉素和卡那霉素均敏感(即,不会在carb50和kan10上生长)的克隆在液体LB中培养,并冷冻为菌株MCM528-MCM531。
大肠杆菌(E.coli)菌株
菌株 | 描述 | 亲本 |
MCM508 | BL21gi1.6-mKKDyI+predet.-carb | MCM446 |
MCM518 | BL21neo-PL.6-mKKDyI,克隆10 | MCM508 |
MCM519 | BL21neo-PL.0-mKKDyI,克隆11 | MCM508 |
MCM520 | BL21neo-PL.0-mKKDyI(mMVK前面的坏RBS),克隆13 | MCM508 |
MCM521 | BL21neo-PL.2-mKKDyI,克隆15 | MCM508 |
MCM528 | BL21PL.6-mKKDyI,neoR环出 | MCM518 |
MCM529 | BL21PL.0-mKKDyI,neoR环出 | MCM519 |
MCM530 | BL21PL.0-mKKDyI(mMVK前面的坏RBS),neoR环出 | MCM520 |
MCM531 | BL21PL.2-mKKDyI,neoR环出 | MCM521 |
引物序列
整合进菌株MCM518-MCM521的染色体的装配物包括源自噬菌体λ的新PL启动子以及mMVK ORF的起点,其中来自基因桥公司(GeneBridges)FRT-gb2-Cm-FRT盒的序列整合在启动子/mMVK装配物的上游,并且mMVK ORF的其余部分随后是来自菌株MCM508的MVA下游途径整合子的其余部分。
整合进MCM518的启动子/mMVK序列
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整合进MCM519的启动子/mMVK序列
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整合进MCM520的启动子/mMVK序列
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整合进MCM521的启动子/mMVK序列
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pTrc-MEA-Alba(G491S)-mMVK的构建:
通过QuikChange(Stratagene)诱变将G491S突变引入pDW34(pTrc-MEA-Alba-mMVK)(PCR循环参数参见下文)。然后用1μl的DpnI(罗氏公司(Roche))处理PCR产物并在37℃下孵育,以消化亲代DNA模板。然后使用标准分子生物技术通过电穿孔将1μl该溶液转化进MCM531。在液体LB培养基中恢复转化的细胞1小时,然后将其涂布于包含50μg/ml羧苄青霉素和5mM甲羟戊酸的LB固体琼脂板上。从分离的菌落中纯化质粒,并进行完全测序(Quintara生物科学公司(Quintara Biosciences)),以验证G491S突变的存在(pCHL243中,参见图12)。
用于QuikChange反应的PCR混合物
OuikChange反应的PCR循环参数:
95℃-1分钟
(95℃50秒,60℃50秒,68℃3分钟)18轮
68℃-10分钟
表11.引物
表12:大肠杆菌(E.coli)菌株
pCHL243的序列
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发酵编号20100307和20100436的发酵条件
发酵:
发酵20100307:CMP437
发酵20100437:DW415
培养基配方(每升发酵培养基):
K2HPO47.5g、MgSO4*7H2O2g、一水柠檬酸2g、柠檬酸铁铵0.3g、酵母提取物0.5g、1000X改良痕量金属溶液1ml。将所有组分一起加入并溶解于Di H2O中。将该溶液加热灭菌(123℃,20分钟)。用氢氧化铵(28%)将pH调节至7.0,然后定容。灭菌和pH调节后加入葡萄糖10g、维生素溶液8mL和抗生素。
1000X改良痕量金属溶液(每升):
柠檬酸*H2O40g、MnSO4*H2O30g、NaCl10g、FeSO4*7H2O1g、CoCl2*6H2O1g、ZnSO*7H2O1g、CuSO4*5H2O100mg、H3BO3100mg、NaMoO4*2H2O100mg。以每次一种的方式将每种组分溶解于DiH2O,中,用HCl/NaOH将pH调节至3.0,然后将溶液定容,并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
维生素溶液(每升):
盐酸硫胺1.0g、D-(+)-生物素1.0g、烟酸1.0g、D-泛酸4.8g、盐酸吡哆醇4.0g。以每次一种的方式将每种组分溶解于Di H2O,中,用HCl/NaOH将pH调节至3.0,然后将溶液定容,并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
进料溶液(每千克):
葡萄糖0.57kg、Di H2O0.38kg、K2HPO47.5g以及100%Foamblast10g。将所有组分混合在一起并进行高压灭菌。溶液冷却至25℃后,加入3.4mL Macro盐溶液、0.8mL1000X改良痕量金属溶液以及6.7mL维生素溶液。
Macro盐溶液(每升):
MgSO4*7H2O296g、一水柠檬酸296g、柠檬酸铁铵49.6g。将所有组分溶解于水中,定容,并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
在15-L生物反应器中在pH7.0和34℃的温度下进行两个菌株的发酵。将大肠杆菌(E.coli)菌株的冷冻小瓶融化并接种到胰蛋白胨-酵母提取物培养基(LB)中供生物反应器使用。种菌生长到在550nm处测得为1.0的光密度(OD550)之后,500mL用于接种15-L生物反应器并将初始储罐容积定容至5L。以指数级速率(最高4.5g/min)送入进料溶液10h,然后开始脉冲给料。脉冲持续30分钟,pH超过7.04会触发脉冲。脉冲进料速率是可调节的并等于TCER/300。给定脉冲的最大速率不超过13.5g/min。发酵期间递送至生物反应器的葡萄糖总量在7.4和7.5kg之间。当细胞具有等于6的OD550时,通过向储罐中加入IPTG使浓度达到200uM完成诱导。
用iSCAN(汉胜公司(Hamilton Sundstrand))质谱仪测定来自生物反应器的排气中的异戊二烯含量。
膜电位和活力测定的实验步骤
用膜电位评估发酵期间细菌的活力。收集来自发酵罐的发酵液并立即倒入PBS缓冲液中稀释150倍。然后将细胞置于包含1μM双-(1,3-二丁基巴比妥酸)三次甲基氧杂菁(DiBAC4(3)(英杰公司(Invitrogen),目录号B-438)的PBS缓冲液中再稀释150倍。让样品染色10分钟,然后用流式细胞仪(FACSCalibur,碧迪医疗公司(Becton Dickinson))以单细胞水平进行绿色荧光定量。使用488nm的激发波长和530nm的发射波长。
首先,用DiBAC4(3)将大肠杆菌(E.coli)BL21的指数生长培养物和热灭活培养物染色,以分别确定健康和死亡细胞的绿色荧光水平。用该信息创建用于分析流式细胞仪数据的门控,以确定膜电位保持不变的细胞比率和没有膜电位的细胞比率。同样针对合适细胞尺寸对数据进行门控(前向散射与侧向散射在488nm处测得),以便只鉴别完好的细菌。然后用通过这些标准的细胞发出的绿色荧光水平确定发酵样品中具有良好膜电位的细胞比率和没有膜电位的细胞比率。膜电位保持不变的细胞被认为是活的和代谢活跃的,而没有膜电位的细胞被认为是死亡的和代谢惰性的。
结果:
分析通过甲羟戊酸途径产生异戊二烯的两种菌株(CMP437和DW415)在分批补料条件下的活力。这两种菌株是同基因的,不同的是由DW415菌株编码的异戊二烯合酶中存在G491S突变。这两种菌株在发酵期间显示出类似的生长量并产生大量的异戊二烯。排气中的异戊二烯(%)与CO2(%)的浓度比率显示,与发酵过程的重要部分中的呼吸率相比,表达异戊二烯合酶G491S突变体的菌株DM415具有提高的异戊二烯生产速率,如图13所示。此外,通过用DiBAC4(3)染料将细菌染色并用流式细胞仪分析所得的绿色荧光水平来确定发酵期间各个细菌的膜电位。DiBAC4(3)染料会渗入已丧失膜电位的细菌中。没有膜电位的细菌通常被认为是死的。表达异戊二烯合酶G491S等位基因的菌株DW415在大部分发酵过程中具有显著提高的活力,如图14所示。
实例6用于结晶的银白杨(P.alba)异戊二烯合酶的带6X组氨酸标签的
G491S变体的构建
该实例描述了用于结晶的银白杨(P.alba)异戊二烯合酶的G491S变体的构建。
通过对暴露于大肠杆菌(E.coli)宿主细胞内的高MVA途径通量具有更佳耐受力的变体的富集来鉴定包含G491S突变(此前在非截短IspS序列中称为G507S)的银白杨(P.alba)异戊二烯合酶(IspS)酶。为了更准确地确定G491S,的有益性质,对变体酶进行纯化并对其晶体结构进行分辨率的解析,然后与未改性的亲代野生型酶的结构进行比较。
方法
在载体骨架MD09-163(编码野生型酶,参见图1)中构建G491S变体,其包含TEV蛋白酶位点和IspS的C-端处的6X组氨酸标签。根据制造商的建议方案使用QuikChange诱变试剂盒(Stratagene)生成G491S变体(PCR反应和循环参数参见下文)。根据制造商的建议方案将QuikChange反应物转化进化学感受态大肠杆菌(E.coli)TOP10细胞(英杰公司(Invitrogen))并涂布于LB Kan50选择性培养基平板上。通过PCR直接筛选耐受卡那霉素的菌落,并使用引物QB1493和T7反向引物(Quintara生物科学公司(Quintara Biosciences))测序进行验证。TOP10细胞在选择性培养基中生长,在表达IspS变体之前,将质粒纯化(凯杰公司(Qiagen)),然后根据制造商的建议方案将其转化进化学感受态BL21DE3pLysS(英杰公司(Invitrogen))。
QuikChange诱变
35μl H2O
5μl10X Pfu Ultra II rxn缓冲液
6μl2.5mM dNTPs(罗氏公司(Roche))
1μl20μM G507S QC2正向
1μl20μM G507S QC2反向
1μl Pfu Ultra II HS聚合酶(Stratagene)
1μl DNA模板(MD09-163)
QuikChange诱变-循环参数
1)95℃-4分钟
2)95℃-20秒
3)52℃-20秒
4)68℃-7分钟
5)转到步骤2-循环5次
6)95℃-20秒
7)55℃-20秒
8)68℃-7分钟
9)转到步骤2-循环20次
10)68℃-10分钟
11)4℃-无限长
表13.QuikChange和测序引物
G507S QC2正向 | gaaaaactgagtggtagcctgttcgcgaaac |
G507S QC2反向 | aggctaccactcagtttttccttgttcatct |
T7正向引物 | taatacgactcactataggg |
T7反向引物 | gctagttattgctcagcgg |
EL-1000 | gcactgtctttccgtctgctgc |
A-rev | ctcgtacaggctcaggatag |
A-rev-2 | ttacgtcccaacgctcaact |
QB1493 | cttcggcaacgcatggaaat |
表14.质粒:
MD09-163 | pET24a-银白杨(P.alba)TRC(MEAWT)C-端(+)TEV,组氨酸标签 |
pDW100 | pET24a-银白杨(P.alba)TRC(MEA G491S)C-端(+)TEV,组氨酸标签 |
表15.菌株:
MD09-167 | BL21(DE3)pLysS,MD09-163(WT) |
DW398 | BL21(DE3)pLysS,pDW100(G491S) |
1)银白杨(P.alba)MEA(+)TEV-MD09-163(WT)的氨基酸序列
MEARRSANYEPNSWDYDYLLS SDTDESIEVYKDKAKKLEAEVRREINNEKAEFLTLLELIDNVQRLGLGYRFESDIRGALDRFVSSGGFDAVTKTSLHGTALSFRLLRQHGFEVS QEAFS GFKDQNGNFLENLKEDIKAILSLYEASFLALEGENILDEAKVFAISHLKELSEEKIGKELAEQVNHALELPLHRRTQRLEAVWSIEAYRKKEDANQVLLELAILDYNMIQSVYQRDLRETSRWWRRVGLATKLHFARDRLIESFYWAVGVAFEPQYSDCRNSVAKMFSFVTIIDDIYDVYGTLDELELFTDAVERWDVNAINDLPDYMKLCFLALYNTINEIAYDNLKDKGENILPYLTKAWADLCNAFLQEAKWLYNKSTPTFDDYFGNAWKSSSGPLQLVFAYFAVVQNIKKEEIENLQKYHDTISRPSHIFRLCNDLASASAEIARGETANSVSCYMRTKGISEELATESVMNLIDETWKKMNKEKLGGSLFAKPFVETAINLARQSHCTYHNGDAHTSPDELTRKRVLSVITEPILPFERENLYFQGLEHHHHHH
MD09-163的DNA序列
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3)银白杨(P.alba)MEA G491S(+)TEV-pDW100(G491S)的氨基酸序列
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pDW100的DNA序列
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IspS-G491S的表达和纯化
带6X组氨酸标签的IspS-G491S的表达
从菌株DW398表达N-端带6X组氨酸标签的IspS并纯化。该生长步骤适用于在BL21(λDE3)pLysS细胞中表达的带组氨酸标签的酶。为每个1L的计划生长制备10ml过夜培养物。将合适的抗生素(50mg/ml卡那霉素,25mg/ml氯霉素)加入25ml烧瓶中的10ml LB培养基中并用来自新鲜细胞平板或直接来自甘油冷冻细胞储备液的1种菌落接种。培养物在30℃下生长过夜,同时以约220rpm的速度摇动。在1升LB培养基中制备白天培养物,其中培养基中具有适用于每种培养物的抗生素。用10ml过夜培养物接种每种1L白天培养物,并在30-37G下生长,同时以约220rpm的速度摇动,直到OD600达到约0.4-0.6。然后用400μM IPTG诱导白天培养物并允许其在30℃下和220rpm的摇动下继续生长约5-64、时。然后在4℃下通过以10,000×g离心10分钟收获细胞。收获之后,直接使用细胞或将其保存在-80℃下直至准备处理为止。
带6X组氨酸标签的IspS的纯化
为了纯化来自BL21(λDE3)pLysS细胞的带组氨酸标签的酶,将细胞轻轻地重悬于新鲜裂解缓冲液(裂解缓冲液:Ni洗涤缓冲液+0.5mMPMST,0.01%吐温-20,1mg/ml溶菌酶,0.2mg/ml DNaseI;Ni洗涤缓冲液:50mM NaH2PO4,300mM NaCl,20mM咪唑,pH8.0)中。每1L细胞沉淀物使用大约40-50ml裂解缓冲液。然后在冰上将细胞孵育大约30分钟。然后让细胞悬浮液通过弗氏细胞压碎器(设置为1200psi/高的大型弗氏细胞压碎器)2-3次使其完全裂解,直到溶胞产物开始看起来澄清。保存溶胞产物的样品,用于活性分析和凝胶分析(约100μl)。然后在4℃下通过在Sorvall Discovery90SE超高速离心机中将溶胞产物以30,000×g离心30分钟使溶胞产物澄清。取出上清液并保留。保存“澄清的溶胞产物”样品,用于活性分析和凝胶分析(约100μl)。
使用0-100%梯度的Ni缓冲液B让澄清的溶胞产物通过HisTrap HP柱(通用电气医疗集团(GE healthcare))。将溶胞产物上样到柱上后,用Ni洗涤缓冲液(50mM NaH2PO4,300mM NaCl,20mM咪唑,pH8.0)洗涤柱。然后使用0-100%梯度的Ni洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4,300mMNaCl,500mM咪唑,pH8.0)从柱上洗脱带组氨酸标签的IspS,并收集包含带组氨酸标签的IspS的级分。然后用Ni剥离缓冲液(20mMNaH2PO4,0.5m NaCl,50mM EDTA,pH7.4)洗涤柱。然后用SDS-PAGE凝胶(4-12%凝胶NUPAGE,英杰公司(Invitrogen))根据制造商的指示分析样品。在离心过滤管(Vivaspin-20,赛多利斯公司(Sartoris))上将所需的级分浓缩,然后在填充有Sephadex G25树脂的Hi Prep26/10脱盐柱(通用电气医疗集团(GE healthcare))上脱盐。G-25缓冲液由50mMHEPES、50mM NaCl和1mM DTT组成,pH为7.4。然后对级分进行分析和浓缩。然后将样品保存在-80℃下。
TEV裂解(来自菌株DW398的IspS-G491S)
菌株DW398在上文有所描述。用得自Eton生物科学公司(EtonBioscience Inc)的TurboTEV蛋白酶进行消化。每10μg纯化蛋白使用1单位的TurboTEV。在4℃下进行过夜消化。让样品通过另一个Ni柱(已在Ni缓冲液中平衡),以移除未裂解的酶、标签、TurboTEV蛋白酶(也带有标签)和杂质。采用SDS-PAGE凝胶(NUPAGE,英杰公司(Invitrogen);图16)和DMAPP活性测定,来分析Ni柱通过液和洗涤液。将包含纯酶的样品合并,在包含1mM DTT的50mM NaCl pH7.4缓冲液中脱盐,并保存在-80℃下。
晶体结构测定
如上所述纯化构建体DW398,然后制备浓缩蛋白质溶液,用于研究可能的结晶条件。独立地纯化构建体,并如下所述进行研究。用悬滴气相扩散法建立所有内部结晶筛选。至少,使用以下商业筛选研究构建体:得自加利福尼亚州亚里索维耶荷的汉普顿研究公司(Hampton Research(AlisoViejo,CA))的晶体筛选(Crystal Screen)和得自加利福尼亚州瓦伦西亚的凯杰公司(Qiagen(Valencia,CA))的JCSG+Suite。
使用得自汉普顿研究公司(Hampton Research)的晶体筛选(CrystalScreen)和得自凯杰公司(Qiagen)的JCSG+Suite设置初始结晶筛选。在多种条件下观察该构建体的晶体;优化包括pH、沉淀剂、浓度和抑制剂的100种变化。通过优化实验,内部筛选10种不同的DW398晶体用于衍射。获得由IspS-G491S蛋白质构成的晶体,其在内部衍射到大的棒状晶体属于四方晶系空间群P43212,并具有单胞尺寸a=154.75,b=154.75,c=142.20。通过将2.5μL蛋白质(10mg/ml蛋白)与2.5μL沉淀剂溶液[0.1M丙二酸钠pH7.0,18%(重量体积比)聚乙二醇3350,0.2M硫氰酸钠]混合使晶体生长,并对500μL沉淀剂平衡。在液氮中速冻晶体之前,通过快速通过0.1M丙二酸钠pH7.0、18%(重量体积比)聚乙二醇3350、0.2M硫氰酸钠和25%(重量体积比)乙二醇对晶体进行冷冻保护。
将晶体送至斯坦福同步辐射实验室(Stanford Synchrotron RadiationLaboratory),收集光束线7-1处的数据,到达分辨率。使用Mosflm(Leslie,A.(1998)J.of Appl.Crystallography30,1036-1040(Leslie,A.,1998年,《应用结晶学杂志》,第30卷,第1036-1040页))对数据进行综合并用SCALA(Collaborative Computational Project,N.(1994)ActaCrystallographica Section D50,760-763(协作计算计划N.,1994年,《结晶学报D辑》,第50卷,第760-763页))进行缩放。用MOLREP(Vagin,A.,and Teplyakov,A.(1997)J.of Appl.Crystallography30,1022-1025(Vagin,A.和Teplyakov,A.,1997年,《应用结晶学杂志》,第30卷,第1022-1025页))对数据分阶段,使用此前确定的来自银白杨(P.alba)的IspS的结构作为起始模型,如WO2009/132220中所述。晶体在不对称单元中包含一个二聚体,溶剂含量为63%。
用Refmac5(Collaborative Computational Project,N.(1994)ActaCrystallographica Section D50,760-763(协作计算计划N.,1994年,《结晶学报D辑》,第50卷,第760-763页))进行精修,其中迭代手动重建步骤使用可视化程序Coot(Emsley,P.,et al.(2010)Acta CrystallographicaSection D66,486-501(Emsley,P.等人,2010年,《结晶学报D辑》,第66卷,第486-501页))。精修过程中,用Molprobity(Davis,I.W.,et al.(2007)Nucl.Acids Res.,35:W375-W383(Davis,I.W.等人,2007年,《核酸研究》,第35卷,第W375-W383页))检查蛋白质的几何形状。当前模型具有23.5%的RWork值和28.6%的RFree值。
该结构由二聚体组成(图17)。每个单体由两个螺旋域、一个包含活性位点的C-端域和具有未知功能的N-端域构成。电子密度明确支持菌株DW398中位置491处丝氨酸的存在(图18)。野生型IspS和IspS-G491S的结构比对显示,全部折叠都未改变,然而包含残基490-497的环的构象在野生型与变体蛋白质之间有所不同(图19)。附录1提供了坐标。
实例7:对银白杨(P.alba)IspS完整位点评估库(SEL)的主要比活性分
析
在亲本载体pCL201(图4)中构建整个银白杨(P.alba)异戊二烯合酶(MEA银白杨(P.alba))骨架(544氨基酸)的位点评估库(SEL),并对比活性进行筛选,以鉴定具有改善特性的异戊二烯合酶(IspS)分子。在大多数情况下,给定位置处的SEL包含包括野生型在内的所有20个可能的氨基酸置换。每个库的编号对应于MEA银白杨(P.alba)的ORF(图20),其中起始甲硫氨酸在位置1。将在MD09-170背景中构建的包含用于表达的变体的各个菌株点样到微量滴定板中,使得每个孔对应于MEA银白杨(P.alba)中给定位置处的特定氨基酸置换。微量滴定板包含四种SEL或MEA银白杨(P.alba)中具有所有可能置换的四个位置。剩余的孔用于对照菌株。让板生长、诱导和裂解,以便测量每种样品中特定量的IspS蛋白质所产生的异戊二烯的量。计算整组SEL中所有变体的比活性值。
方法
细胞生长和裂解
将MEA银白杨(P.alba)IspS库的甘油储备液短暂融化并接种到包含液体LB培养基的微量滴定板(Cellstar)中,培养基中加有浓度为20ug/ml的卡那霉素。在摇床培养箱中使用Enzyscreen夹紧系统(Enzyscreen)在30℃下以250rpm让培养物生长过夜。第二天,取出培养物并用Liquidator96移液器(锐宁仪器公司(Rainin Instruments))以1∶10的比率接种到包含50ug/ml卡那霉素和50M IPTG的TM3-葡萄糖培养基中。野生型对照单独生长,并将其接种到包含TM3-葡萄糖的每个微量滴定板中,各个孔采用30uM至65uM IPTG浓度的滴度。将板放回250rpm、30℃的摇床培养箱,并诱导五小时。然后从培养箱中将板取出,通过在台式离心机中以3700rpm在4℃下离心20分钟将培养物收获到聚丙烯微量滴定板(Nunc)中。移除上清液,并在裂解、DMAPP分析和蛋白测定之前将沉淀物储存在-80℃下。
细胞裂解之前,将板从-80℃冷冻箱中取出并在工作台上融化10分钟。用Biomek自动化工作站(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))将沉淀物彻底重悬于200ul裂解缓冲液(100mM Tris,100mM NaCl pH7.6缓冲液,1mg/ml BSA,50U/ul Epicentre readylyse溶菌酶,0.1mg/ml DNase,0.5mM PMSF/AEBSF,5mM MgCl2)中,取出,并在室温下以450rpm摇动30分钟。然后以3200rpm在4℃下将溶胞产物离心10分钟,用Biomek将150ul上清液转移到新的微量滴定板上,进行DMAPP和斑点印迹分析。
DMAPP分析
对于DMAPP分析,使用Liquidator96移液器(锐宁仪器公司(RaininInstruments))将25ul溶胞产物加入96-孔玻璃室(Zinser)中的75ul DMAPP分析缓冲液(100mM Tris/100mM NaCl pH7.6,1mg/ml BSA,50mM MgCl2,1mM DMAPP)中。用铝箔密封件(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))将玻璃室密封,并在室温下以450rpm孵育1分钟。然后在水浴中在34℃下将玻璃室孵育30分钟,通过在70℃下孵育2分钟终止反应。装载到GC-MS上之前让玻璃室短暂冷却。
将密封的玻璃室装载到配备有火焰离子化检测器(FID)和CTCCombiPAL自动进样器的Agilent7890a气相色谱(GC)系统上。GC FID方法参数如下所述:
柱:ZB-5ms
尺寸:15m×0.25mm×0.25μm
烘箱:
总运行时间: | 28分钟 |
前进样口温度: | 110℃ |
分流比: | 50∶1 |
流速: | 3.4mL/min |
进样体积: | 100μL |
顶空注射器体积: | 1mL |
检测器温度 | 160℃ |
氢流速: | 40mL/min |
空气流速: | 400mL/min |
尾吹流速: | 0.1mL/min |
尾吹气类型: | 氦气 |
用Chemstation软件(版本E.02.00.493)控制GC,用Cycle Composer软件(版本1.5.2)控制CTC自动进样器。Cycle Composer软件被编程为使得一个接一个的按顺序连续注射样品,共进样48次。将得自液化空气公司(Air Liquide)的氮气平衡的0.2%体积比异戊二烯用作确定校正响应因子的标准物。将三个单独的2mL小瓶装满校正气体并用上文所述的方法进行分析,以确定平均响应因子。计算的响应因子允许用Microsoft Excel将各个样品峰面积计数换算成异戊二烯浓度。
蛋白质测定
蛋白质测定分析之前,用GC-MS分析来自每个板的若干野生型样品的异戊二烯,用已知的MEA银白杨(P.alba)比活性反算蛋白质浓度,以确定微量滴定板中的所有样品的IspS的平均量。对于斑点印迹分析,将硝化纤维膜(英杰公司(Invitrogen))浸在1X PBS缓冲液(10mM磷酸钠、150mM NaCl、PH7.8+/-0.2)中,平衡至少5分钟。然后使用HamiltonMicroLab STAR液体处理工作站在1X PBS中稀释溶胞产物,获得介于0.025-0.5ug之间的银白杨(P.alba)IspS上样浓度。添加浓度介于0.025-1ug之间的纯化标准物。根据制造商的建议方案组装印迹装置(Minifold-1,沃特曼公司(Whatman))。短暂施加真空,以移除过量的1X PBS缓冲液。将样品(每种大约200ul)转移至Minifold-1,并施加20kPa的真空。样品完全过滤后,用200ul的1X PBS缓冲液将孔洗涤一次。洗涤缓冲液完全通过膜后,移除真空,用镊子小心地将膜取出,做标记,并在干净的滤纸上干燥。
用得自英杰公司(Invitrogen)的WesternBreeze试剂盒对硝化纤维膜上每个位置处的银白杨(P.alba)IspS分子进行免疫检测。在封闭溶液中对单克隆或多克隆一抗(纯化银白杨(P.alba)IspS的抗小鼠抗体,普赛生物公司(Prosci Incorporated))进行1∶5000稀释,在封闭溶液中将二抗(AlexaFluor488山羊抗小鼠IgG(H+L),英杰公司(Invitrogen))稀释至2ug/ml的浓度。使用Storm860分子成像仪(GMI公司(GMI,Inc.))和ImageQuant软件(通用电气医疗集团(GE healthcare)),根据制造商的建议方案定量荧光斑点,通过使用Microsoft Excel与已知标准物进行比较确定每种样品的特定蛋白质浓度。
结果
通过用给定时间内生成的异戊二烯的摩尔量除以每种样品中的蛋白质的特定量,来计算整组SEL中每个变体的比活性值。通过用任何给定变体的比活性除以用相同微量滴定板测得的若干WT比活性测量值的平均值,来计算性能指数(PI)。比活性PI值为1.5的变体比WT改善了例如50%。还用相同的方式计算蛋白质浓度和产生的异戊二烯的PI,用这些测量值进行详细数据分析。
表16提供了表17和18中所列残基定位的精确定义。例如,在表17或18中列为“N-端”的残基在参考序列MEA银白杨(P.alba)IspS(SEQ IDNO:1)的残基1和215之间。
表16.MEA银白杨(P.alba)IspS氨基酸位置的定位的定义
表17和18中还列出了MEA银白杨(P.alba)结构中所关注的氨基酸的表面可接触性和推定功能。用程序MOE计算表面可接触性,该程序由化学计算集团公司(Chemical Computing Group,Inc)编写和支持。用具有指定半径的探针测定每个残基的水可接触表面积的估计值。然后将估计值与肽库进行比较,将它们的比率记录为表面可接触性百分比。表17和18还列出了每个残基的推定功能。例如,功能包括但不限于金属结合(活性位点中)、底物捕集、改变的环形状、袋中的替代的相互作用和二聚体形成。
从原始数据,鉴定出MEA银白杨(P.alba)中不容许从野生型残基改变的位置(参见17,图23-29)。在这些位置处具有非野生型的氨基酸置换的MEA银白杨(P.alba)变体显示出的比活性不高于WT值的30%(PI≤0.3),因此在功能上是惰性的。这些位置处的野生型残基代表需要用MEA银白杨(P.alba)将DMAPP高效转化为异戊二烯的最少组。这些位置中的多个位置标绘在MEA银白杨(P.alba)的活性位点或接近所述活性位点(参见图24),并被推定为涉及但不限于金属结合(底物方向)、底物捕集、底物结合和催化作用。例如,图25示出了在酶功能方面具有未知作用的位置。图26示出了可能涉及IspS二聚体形成的位置,图27和28示出了N-端中或与N-端相互作用并可能涉及环闭合或活性位点功能的位置。图29示出了位于底物捕集环中不容许置换的位置。
选择初级体外分析中比活性高于WT的变体,进行重复测试。按照上文所述的方法测试变体,不同的是除单克隆抗体之外,还根据标准生化操作用多克隆抗体进行免疫检测。表18列出了显示具有高于WT的比活性(PI>1.3)的一组重复测试的变体。图30示出了变体在重复测试时显示比活性提高的IspS晶体结构中的所有位置。与野生型酶相比,这些变体通过改变/增强表18中所列的推定功能赋予IspS比活性有益效果。图31示出了IspS的N-端中或与N-端相互作用并且变体显示具有提高的比活性的隐埋位置。图32示出了IspS的C-端中或与C-端相互作用并且变体显示具有提高的比活性的隐埋位置。图33示出了位置247,在该位置处改善的变体可以正面影响IspS的二聚化,图34示出了N-端处的其他位置,在这些位置处变体显示出明确的比活性有益效果。图35示出了变体显示高比活性的表面环上的位置的定位,图36示出了不在环中的酶的表面上的位置,在这些位置处,变体显示出提高的比活性。图37示出了所提出的底物捕集环中的位置,在这些位置处,变体显示具有相对于野生型有所提高的比活性。该区域中的特定位置具有活性有所提高的变体,而相邻位置是不易突变的(参见表17和图29)。这表明,IspS中所提出的“底物捕集环”在DMAPP向异戊二烯的酶转化中非常关键,并对扰动高度敏感,这会导致对活性的负面或正面影响。表18中所列和图30至37中所示的所有变体或它们的任何组合代表IspS中允许酶更有效地将DMAPP转化为异戊二烯的突变。
表17.MEA银白杨(P.alba)中所有非WT氨基酸置换显示PI比活性值
≤0.3的位置
表18.显示PI比活性值>1.3的MEA银白杨(P.alba)的重复测试的变 体。
实例8:对从初级筛选选择的1024个变体进行生长量分析
通过初级体外比活性筛选鉴定了使酶催化DMAPP向异戊二烯转化的能力有所提高的MEA银白杨(P.alba)的变体。由于IspS必须在活细胞的内部发挥作用,所以还需要测量在体内酶将DMAPP转化为异戊二烯的能力。实例1和2描述了测定IspS的体内效力的方法。基本上,通过DMAPP向异戊二烯的转化,IspS减轻了DMAPP对大肠杆菌(E.coli)生长的毒性作用。在生长曲线过程中,异戊二烯合酶的性能比野生型有所提高,这表明异戊二烯合酶在给定菌株内具有改善的功能。显示出改善的比活性和最佳生长性能的IspS变体表示酶最适于提高发酵过程中异戊二烯产量。
方法
生长量分析和比活性测量
从初级比活性筛选选择1024个变体进行生长量研究,并确认提高的比活性是否比野生型MEA银白杨(P.alba)酶有所提高。选择显示高突变性(对突变的耐受性)以及提高的比活性和表达性能不显著低于野生型的位置处的变体进行该研究。将各个变体从它们的初始甘油储备液板分离,并重新点样,以便进行生长量分析。在低和高含量IPTG条件下诱导变体,并在甲羟戊酸(MVA)存在下确定它们的生长曲线。在这些菌株中,吸附了MVA,MVA驱动通过甲羟戊酸途径流向DMAPP,这对细胞生长是有毒性的。官能化银白杨(P.alba)IspS分子的表达允许DMAPP向异戊二烯转化,并减轻生长抑制。在这些分析中,表现较佳的IspS分子更有效地使DMAPP向异戊二烯转化并改善生长量。
将MEA银白杨(P.alba)IspS库的甘油储备液短暂融化并接种到包含液体LB的微量滴定板中,液体LB中加有浓度为20μg/ml的卡那霉素。培养物在摇床培养箱中在250rpm、30℃下过夜生长至饱和。第二天,取出培养物,并以1∶10的比率接种到包含50ug/ml卡那霉素和40或100uM IPTG(西格玛公司(Sigma))的TM3-葡萄糖培养基中。野生型对照单独生长,并将其接种到包含TM3-葡萄糖的每个微量滴定板中,各个孔具有30uM至65μM(对于以40μM诱导的培养物而言)或40至200μM(对于以100μM诱导的培养物而言)的IPTG浓度的滴度。将板再放回250rpm、30℃的摇床培养箱,预先诱导2小时。然后将培养物放入微量滴定板(Matrical)中包含50μg/ml卡那霉素、40或100μM IPTG和20mM MVA的TM3-葡萄糖培养基中,以1∶10的比率稀释。包括含或不含MVA的WT对照,以及用各种滴度IPTG的合适对照。将板转移至Growth Profiler1152(Enzyscreen)并根据制造商的建议确定10小时时程内的生长曲线和光密度(OD)。通过与在40或100μM IPTG条件下诱导的四个重复WT菌株的比较,确定每个菌株的生长性能指数(PI)。计算300分钟处OD的PI值、最大OD以及曲线下的面积。还根据先前实例中所述的方法确定该研究中以40μM IPTG含量诱导的所有变体的比活性。将样品从与生长量分析中所用样品相同的预先诱导板分离。
结果
表16提供了表19至23中所列残基的定位的定义。表19列出了显示比活性PI值大于1.4的所有变体。还列出了定位、表面可接触性和推定功能。表19列出了单独地或组合地提高IspS的酶效率的若干变体。图38和39示出了变体显示出改善的比活性的位置的定位。具有改善的比活性的变体可以允许DMAPP更高效地向异戊二烯转化,并提高发酵过程中细胞的异戊二烯产量。
表20和21列出了分别在40uM和100uM诱导水平下具有改善的生长量的变体。尽管测得若干不同的生长参数,但所有参数彼此都具有良好的相关性,所以只检查表20和21中所列变体的最大OD的PI值(OD Max)。所列的变体显示,在给定诱导水平下,OD Max值优于WT50%(PI为1.5或更大)。表22中列出了并在图40和41示出了在40uM和100uM IPTG诱导条件下显示出改善的生长量(OD Max的PI值大于1.3)的变体。这些变体代表允许在表达IspS的细胞中获得最高总体生长性能和DMAPP向异戊二烯的转化的突变体。这些变体中的若干个变体标绘在MEA银白杨(P.alba)的特定N-端螺旋区域附近或之内,跨越残基134至179。该定位(表16、20至23中的“N-端螺旋”)处或附近的若干变化显示在任一种或两种生长条件下具有生长有益效果。不仅多个变体标绘在MEA银白杨(P.alba)中的该定位处,而且显示对生长最有益的变体从螺旋面向外并位于酶的表面上(参见图41、43和44)。
表23列出了对全部三个参数,即比活性、40uM和100uM IPTG条件下的OD Max而言性能有所改善(PI大于1.2)的变体。表22中列出了这些变体中的若干个,它们中的大多数也位于上文所述的N-端螺旋中或附近,但V30K和V84T除外(参见图42)。这表明,跨越残基150至172的螺旋处的变化不仅对宿主细胞生长量的改善很重要,对酶活性的改善也很重要。由于对N-端螺旋(参见图43)没有明显的催化作用,所以这些变体可以在分子内通过酶结构的构象变化影响IspS活性,或在分子间通过上文提到的与未鉴定的酶、细胞过程或结构的相互作用影响IspS活性。在该特定定位处包含变体的MEA银白杨(P.alba)酶单独地或与赋予有益性质(例如改善的催化速率)的其他变体结合可能会改善宿主菌株的生长速率并改善发酵过程中的异戊二烯产量。
表19.显示比活性PI值>1.4的MEA银白杨(P.alba)的重新测试的变 体。
表20.显示40mM IPTG条件下OD Max的PI值>1.5的MEA银白杨(P.
alba)的变体
表21.显示100mM IPTG条件下OD Max的PI值>1.5的MEA银白杨
(P.alba)的变体
表22.显示40和100mM IPTG条件下OD Max的PI值>1.3的MEA银
白杨(P.alba)的变体
表23.显示比活性、40μM IPTG和100μM IPTG条件下的OD Max的
PI值>1.2的MEA银白杨(P.alba)的变体
实例9:对组合库的比活性和生长量分析
选择比活性、生长量有所提高或两种特性都有所提高的MEA银白杨(P.alba)IspS的单种变体,将它们组合成具有7个成员的库。
方法
在pCL201载体中构建库并转化进MD09-170筛选菌株(DNA2.0)。按照先前实例中所述的方法对占每个库中128个可能组合的大约80至90%的160个单独的变体的比活性和生长量进行筛选。表24列出了为组合库选择的变体、它们在晶体结构中的定位、表面可接触性和选择标准(比活性、生长量或两者)。实例7和8已列出了这些位置处的氨基酸的推定功能。
表24.为组合库选择的变体
残基 | 位置 | 突变 | 库 | 定位 | 表面可接触性% | 选择标准 |
S | 288 | C | 1/2 | C-端 | 0 | 生长量(溶解度) |
S | 22 | R | 1 | N-端 | 54 | 比活性 |
R | 71 | I | 1 | N-端 | 3 | 比活性 |
S | 444 | D | 1/2 | 子环 | 56 | 比活性 |
M | 460 | A | 1 | 子环 | 21 | 比活性 |
A | 443 | G | 1 | 子环 | 4 | 比活性 |
T | 502 | M | 1 | 隐埋 | 1 | 比活性 |
V | 409 | T | 2 | 表面环 | 14 | 生长/比活性 |
R | 242 | N | 2 | 二聚体界面 | 35 | 生长/比活性 |
K | 414 | F | 2 | 表面环 | 70 | 生长量 |
V | 162 | P | 2 | N-端螺旋 | 60 | 生长量 |
G | 87 | R | 2 | 表面环 | 35 | 生长/比活性 |
S | 288 | T | 3 | C-端 | 0 | 生长/比活性 |
N | 47 | V | 3 | 表面环 | 16 | 生长量 |
I | 447 | T | 3 | 子环 | 23 | 比活性 |
E | 170 | H | 3 | N-端螺旋 | 79 | 生长量 |
S | 231 | T | 3 | 铰链区 | 33 | 生长量 |
K | 414 | N | 3 | 表面环 | 70 | 生长量 |
I | 156 | G | 3 | N-端螺旋 | 13 | 生长量 |
结果
鉴定出显示比活性和/或生长性能显著改善的组合变体。表25包含显示比活性性能指数(PI)值大于2.6的组合变体列表。左列中列出了变体编号,后续的列中列出了该库中7个不同位置的基因型。比活性有所改善的变体可能通过改善的动力学参数允许获得更高效的DMAPP向异戊二烯的酶转化。表26包含显示比活性、40uM下的OD Max和100uM下的ODMax的PI值大于1.3的组合变体列表。比活性和生长参数均有所改善的IspS变体还比WT酶更有效地将DMAPP转化为异戊二烯,并可能通过调解宿主内IspS的有害作用而有利于宿主菌株的生长。
由于每个库成员包含七种可能突变体的任何组合,所以在不同的构形中多次观察了变体的作用。这提供了稳健的内参,以帮助鉴定每个库中存在的最有效的组合。例如,S444D突变体存在于最高比活性组合变体中,表明该变体与其他改善的变体结合特别有利于体外活性。M460A,A443G,和I447T也显示出这种作用。相似地,V162P突变体存在于比活性和生长量性质均有所改善的所有组合变体中,表明V162P与其他变体结合效果很好,并可能是使宿主细胞内DMAPP向异戊二烯更高效转化的理想突变体,原因如前面段落所述。I156G和E170H也显示出该作用。变体G087R,R242N,和S288T与其他变体结合也显示具有改善的比活性,但在体外分析中不总是属于最高表现者。表25和26中所列的组合变体可以代表在宿主细胞发酵过程中允许获得DMAPP向异戊二烯的最佳转化的显著改善的IspS酶。这些特定的组合变体中存在或不存在各个突变体还可预示能够结合到IspS的未来变体中的最佳总体突变,这对通过微生物发酵进行的异戊二烯生产的优化是关键性的。
表25.显示PI比活性值>2.6的MEA银白杨(P.alba)的组合变体。
变体 | 位置1 | 位置2 | 位置3 | 位置4 | 位置5 | 位置6 | 位置7 |
1 | 022R | 071I | 288C | 443A | 444D | 460A | 502M |
2 | 022R | 071I | 288C | 443G | 444D | 460A | 502M |
3 | 022S | 071I | 288C | 443A | 444S | 460A | 502T |
4 | 022S | 071R | 288C | 443A | 444D | 460A | 502T |
5 | 087G | 162P | 242N | 288S | 409T | 414F | 444D |
6 | 087G | 162P | 242N | 288S | 409T | 414K | 444D |
7 | 087G | 162P | 242R | 288C | 409T | 414F | 444D |
8 | 087G | 162V | 242N | 288C | 409V | 414F | 444D |
9 | 087G | 162V | 242R | 288C | 409T | 414F | 444D |
10 | 087G | 162V | 242R | 288C | 409V | 414K | 444D |
11 | 087R | 162P | 242N | 288C | 409T | 414F | 444D |
12 | 087R | 162P | 242N | 288C | 409T | 414K | 444D |
13 | 087R | 162P | 242N | 288S | 409T | 414K | 444D |
14 | 087R | 162P | 242N | 288S | 409V | 414F | 444D |
15 | 087R | 162P | 242N | 288S | 409V | 414K | 444D |
16 | 087R | 162P | 242R | 288C | 409T | 414F | 444D |
17 | 087R | 162P | 242R | 288C | 409V | 414F | 444D |
18 | 087R | 162P | 242R | 288C | 409V | 414K | 444D |
19 | 087R | 162P | 242R | 288S | 409T | 414F | 444D |
20 | 087R | 162P | 242R | 288S | 409V | 414K | 444D |
21 | 087R | 162V | 242N | 288C | 409V | 414F | 444D |
22 | 087R | 162V | 242N | 288S | 409T | 414F | 444D |
23 | 087R | 162V | 242N | 288S | 409T | 414K | 444D |
24 | 087R | 162V | 242N | 288S | 409V | 414F | 444D |
25 | 087R | 162V | 242R | 288C | 409T | 414K | 444D |
26 | 087R | 162V | 242R | 288C | 409V | 414K | 444D |
27 | 087R | 162V | 242R | 288S | 409V | 414F | 444D |
表26.显示比活性、40μM IPTG条件下的OD Max和100μM IPTG条 件下的OD Max的PI值>1.3的MEA银白杨(P.alba)的组合变体。
变体 | 位置1 | 位置2 | 位置3 | 位置4 | 位置5 | 位置6 | 位置7 |
1 | 047N | 156G | 170H | 231S | 288T | 414K | 447I |
2 | 047V | 156G | 170H | 231S | 288T | 414K | 447I |
3 | 047V | 156I | 170H | 231S | 288T | 414F | 447I |
4 | 047V | 156I | 170H | 231T | 288T | 414K | 447I |
5 | 087G | 162P | 242N | 288C | 409T | 414F | 444S |
6 | 087G | 162P | 242N | 288C | 409V | 414K | 444S |
7 | 087G | 162P | 242N | 288S | 409T | 414F | 444S |
8 | 087G | 162P | 242R | 288C | 409T | 414K | 444S |
9 | 087G | 162P | 242R | 288S | 409T | 414K | 444S |
10 | 087R | 162P | 242N | 288C | 409T | 414F | 444S |
11 | 087R | 162P | 242N | 288C | 409V | 414K | 444S |
12 | 087R | 162P | 242R | 288C | 409V | 414K | 444S |
实例10:MEA银白杨(P.alba)IspS的N-端截短的比活性测定
异戊二烯合酶在N-端处包含DMAPP向异戊二烯的适当酶转化所必需的串联精氨酸残基。作为截短的变体,MEA银白杨(P.alba)与具有较长N-端区域的酶相比具有高比活性,可媲美天然存在的叶绿体靶向肽。MEA银白杨(P.alba)酶在串联精氨酸残基上游只有两个残基(参见图45),但这些残基与酶活性有关的功能没有报告。因此产生MEA银白杨(P.alba)酶的N-端截短,对其进行分析以确定是否另外的截短赋予IspS比活性有益效果。
方法
如此前所述按照制造商的建议方案在模板pCL201(引物序列参见表27)上用QuikChange(Stratagene)PCR构建MEA银白杨(P.alba)的两个截短。用1μl DpnI(罗氏公司(Roche))将PCR产物处理3小时,然后根据制造商的建议方案将1μl的全部反应物转化进化学感受态大肠杆菌(E.coli)Top10细胞(英杰公司(Invitrogen))。使细胞恢复并将其置于包含50μg/ml卡那霉素的LB培养基上。第二天,选择阳性菌落,用于生长、质粒纯化(凯杰公司(Qiagen))和测序(Quintara生物科学公司(QuintaraBiosciences))。选择包含正确截短的质粒,对整个开放读框进行测序,以确认编码序列的完整性。通过电穿孔将这些质粒pDW207(参见图46)和pDW208(参见图47)转化进表达菌株MD09-170,用于比活性测定(参见表28)。如此前所述测定比活性。与MEA银白杨(P.alba)相比,分析每个截短的至少30个重复。
表27.用于QuikChange诱变的引物
HgS MRR正向引物 | TATACATATGCGTCGCTCTGCGAACTACGA |
HgS MRR反向引物 | CAGAGCGACGCATATGTATATCTCCTTCTT |
HgS MAR正向引物 | TATACATATGGCACGTCGCTCTGCGAACTA |
HgS MAR反向引物 | AGCGACGTGCCATATGTATATCTCCTTCTT |
表28.具有N-端截短的菌株
结果
在菌株DW618(MAR)或DW619(MRR)中表达的银白杨(P.alba)IspS的截短分子的比活性与亲本MEA银白杨(P.alba)酶相比分别未改善或稍降低。表29示出了银白杨(P.alba)IspS的MAR和MRR截短的性能指数值。MAR截短显示比活性大约等于对照MEA银白杨(P.alba)分子,MRR截短显示比活性为对照的大约81%。尽管这些截短与MEA银白杨(P.alba)相比比活性没有提高,但它们保留了足够的活性,可以在未来在发酵菌株中用于通过IspS酶将DMAPP转化为异戊二烯,其中需要完全移除N-端直至但不包括串联精氨酸残基。
表29.银白杨(P.alba)IspS的截短变体的性能指数值
菌株 | 变体 | PI比活性 | 标准偏差 |
DW618 | MAR | 0.983189 | 0.091889 |
DW619 | MRR | 0.813857 | 0.072938 |
银白杨(P.alba)IspS MAR的氨基酸序列
MARRSANYEPNSWDYDYLLSSDTDESIEVYKDKAKKLEAEVRREINNEKAEFLTLLELIDNVQRLGLGYRFESDIRGALDRFVSSGGFDAVTKTSLHGTALSFRLLRQHGFEVSQEAFSGFKDQNGNFLENLKEDIKAILSLYEASFLALEGENILDEAKVFAISHLKELSEEKIGKELAEQVNHALELPLHRRTQRLEAVWSIEAYRKKEDANQVLLELAILDYNMIQSVYQRDLRETSRWWRRVGLATKLHFARDRLIESFYWAVGVAFEPQYSDCRNSVAKMFSFVTIIDDIYDVYGTLDELELFTDAVERWDVNAINDLPDYMKLCFLALYNTINEIAYDNLKDKGENILPYLTKAWADLCNAFLQEAKWLYNKSTPTFDDYFGNAWKSSSGPLQLVFAYFAVVQNIKKEEIENLQKYHDTISRPSHIFRLCNDLASASAEIARGETANSVSCYMRTKGISEELATESVMNLIDETWKKMNKEKLGGSLFAKPFVETAINLARQSHCTYHNGDAHTSPDELTRKRVLSVITEPILPFER
质粒pDW207的DNA序列
tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaattaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggggccgccatgccggcgataatggcctgcttctcgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggcacctgtcctacgagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatatccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatggcacgtcgctctgcgaactacgaacctaacagctgggactatgattacctgctgtcctccgacacggacgagtccatcgaagtatacaaagacaaagcgaaaaagctggaagccgaagttcgtcgcgagattaataacgaaaaagcagaatttctgaccctgctggaactgattgacaacgtccagcgcctgggcctgggttaccgtttcgagtctgatatccgtggtgcgctggatcgcttcgtttcctccggcggcttcgatgcggtaaccaagacttccctgcacggtacggcactgtctttccgtctgctgcgtcaacacggttttgaggtttctcaggaagcgttcagcggcttcaaagaccaaaacggcaacttcctggagaacctgaaggaagatatcaaagctatcctgagcctgtacgaggccagcttcctggctctggaaggcgaaaacatcctggacgaggcgaaggttttcgcaatctctcatctgaaagaactgtctgaagaaaagatcggtaaagagctggcagaacaggtgaaccatgcactggaactgccactgcatcgccgtactcagcgtctggaagcagtatggtctatcgaggcctaccgtaaaaaggaggacgcgaatcaggttctgctggagctggcaattctggattacaacatgatccagtctgtataccagcgtgatctgcgtgaaacgtcccgttggtggcgtcgtgtgggtctggcgaccaaactgcactttgctcgtgaccgcctgattgagagcttctactgggccgtgggtgtagcattcgaaccgcaatactccgactgccgtaactccgtcgcaaaaatgttttctttcgtaaccattatcgacgatatctacgatgtatacggcaccctggacgaactggagctgtttactgatgcagttgagcgttgggacgtaaacgccatcaacgacctgccggattacatgaaactgtgctttctggctctgtataacactattaacgaaatcgcctacgacaacctgaaagataaaggtgagaacatcctgccgtatctgaccaaagcctgggctgacctgtgcaacgctttcctgcaagaagccaagtggctgtacaacaaatctactccgacctttgacgactacttcggcaacgcatggaaatcctcttctggcccgctgcaactggtgttcgcttacttcgctgtcgtgcagaacattaaaaaggaagagatcgaaaacctgcaaaaataccatgacaccatctctcgtccttcccatatcttccgtctgtgcaatgacctggctagcgcgtctgcggaaattgcgcgtggtgaaaccgcaaatagcgtttcttgttacatgcgcactaaaggtatctccgaagaactggctaccgaaagcgtgatgaatctgatcgatgaaacctggaaaaagatgaacaaggaaaaactgggtggtagcctgttcgcgaaaccgttcgtggaaaccgcgatcaacctggcacgtcaatctcactgcacttatcataacggcgacgcgcatacctctccggatgagctgacccgcaaacgcgttctgtctgtaatcactgaaccgattctgccgtttgaacgctaaggatccgaattcgagctccgtcgacaagcttgcggccgcactcgagcaccaccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggat
银白杨(P.alba)IspS MRR的氨基酸序列
MRRSANYEPNSWDYDYLLSSDTDESIEVYKDKAKKLEAEVRREINNEKAEFLTLLELIDNVQRLGLGYRFESDIRGALDRFVS S GGFDAVTKTSLHGTALSFRLLRQHGFEVSQEAFSGFKDQNGNFLENLKEDIKAILSLYEASFLALEGENILDEAKVFAISHLKELSEEKIGKELAEQVNHALELPLHRRTQRLEAVWSIEAYRKKEDANQVLLELAILDYNMIQSVYQRDLRETSRWWRRVGLATKLHFARDRLIESFYWAVGVAFEPQYSDCRNSVAKMFSFVTIIDDIYDVYGTLDELELFTDAVERWDVNAINDLPDYMKLCFLALYNTINEIAYDNLKDKGENILPYLTKAWADLCNAFLQEAKWLYNKSTPTFDDYFGNAWKSSSGPLQLVFAYFAVVQNIKKEEIENLQKYHDTISRPSHIFRLCNDLASASAEIARGETANSVSCYMRTKGISEELATESVMNLIDETWKKMNKEKLGGSLFAKPFVETAINLARQSHCTYHNGDAHTSPDELTRKRVLSVITEPILPFER
质粒pDW208的序列
tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaattaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggggccgccatgccggcgataatggcctgcttctcgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggcacctgtcctacgagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatatccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgcgtcgctctgcgaactacgaacctaacagctgggactatgattacctgctgtcctccgacacggacgagtccatcgaagtatacaaagacaaagcgaaaaagctggaagccgaagttcgtcgcgagattaataacgaaaaagcagaatttctgaccctgctggaactgattgacaacgtccagcgcctgggcctgggttaccgtttcgagtctgatatccgtggtgcgctggatcgcttcgtttcctccggcggcttcgatgcggtaaccaagacttccctgcacggtacggcactgtctttccgtctgctgcgtcaacacggttttgaggtttctcaggaagcgttcagcggcttcaaagaccaaaacggcaacttcctggagaacctgaaggaagatatcaaagctatcctgagcctgtacgaggccagcttcctggctctggaaggcgaaaacatcctggacgaggcgaaggttttcgcaatctctcatctgaaagaactgtctgaagaaaagatcggtaaagagctggcagaacaggtgaaccatgcactggaactgccactgcatcgccgtactcagcgtctggaagcagtatggtctatcgaggcctaccgtaaaaaggaggacgcgaatcaggttctgctggagctggcaattctggattacaacatgatccagtctgtataccagcgtgatctgcgtgaaacgtcccgttggtggcgtcgtgtgggtctggcgaccaaactgcactttgctcgtgaccgcctgattgagagcttctactgggccgtgggtgtagcattcgaaccgcaatactccgactgccgtaactccgtcgcaaaaatgttttctttcgtaaccattatcgacgatatctacgatgtatacggcaccctggacgaactggagctgtttactgatgcagttgagcgttgggacgtaaacgccatcaacgacctgccggattacatgaaactgtgctttctggctctgtataacactattaacgaaatcgcctacgacaacctgaaagataaaggtgagaacatcctgccgtatctgaccaaagcctgggctgacctgtgcaacgctttcctgcaagaagccaagtggctgtacaacaaatctactccgacctttgacgactacttcggcaacgcatggaaatcctcttctggcccgctgcaactggtgttcgcttacttcgctgtcgtgcagaacattaaaaaggaagagatcgaaaacctgcaaaaataccatgacaccatctctcgtccttcccatatcttccgtctgtgcaatgacctggctagcgcgtctgcggaaattgcgcgtggtgaaaccgcaaatagcgtttcttgttacatgcgcactaaaggtatctccgaagaactggctaccgaaagcgtgatgaatctgatcgatgaaacctggaaaaagatgaacaaggaaaaactgggtggtagcctgttcgcgaaaccgttcgtggaaaccgcgatcaacctggcacgtcaatctcactgcacttatcataacggcgacgcgcatacctctccggatgagctgacccgcaaacgcgttctgtctgtaatcactgaaccgattctgccgtttgaacgctaaggatccgaattcgagctccgtcgacaagcttgcggccgcactcgagcaccaccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggat
实例11:高产突变、可组合突变和适宜性得分
高产位置被描述为分子内最适用于形成显示具有改善的特性的组合变体的那些位置,其中所述位置本身允许至少一种可组合突变。可组合突变可被描述为分子中可用于形成选定的组合变体的那些置换。可组合突变不会显著降低表达、比活性或生长量,而同时改善分子的至少一种所需的特性,如生长量或比活性。如实例7所述,用对比活性和蛋白质测定进行的DMAPP分析所获得的性能指数(PI)值确定包含所有可组合突变的IspS中的位置。高产位置是这样的位置,其显示出对多个置换的一定程度的容许,而同时符合下文所述的一组可组合标准。
评价数据集时,采用以下标准确定最高产的位置:
包含具有以下特点的置换的位置:其中相对于野生型IspS,比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.9的PI,并且其中相对于野生型IspS,比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.0的PI(A组)。
包含具有以下特点的置换的位置:其中相对于野生型IspS,比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.8的PI,并且其中相对于野生型IspS,比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.2的PI(B组)。
包含具有以下特点的置换的位置:相对于野生型IspS,比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.5的PI,并且其中相对于野生型IspS,比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.5的PI(C组)。
A、B和C组还包含对多个置换具有不同容许程度的位置。要测量这种容许置换的程度,为每个位置分配等级。根据属于A、B和C组的每个位置内的置换的百分比分配等级。可组合位置和置换示于表31中。
确定高产位置等级的标准如下:
将给定位置处小于15%但大于0%的置换属于A、B或C组的位置定为等级“1”。
将给定位置处小于30%但大于或等于15%的置换属于A、B或C组的位置定为等级“2”。
将给定位置处小于50%但大于或等于30%的置换属于A、B或C组的位置定为等级“3”。
将给定位置处大于或等于50%的置换属于A、B或C组的位置定为等级“4”。
还根据置换为其成员的组,对置换分配适宜性得分,其中较高的得分代表置换更适用于制备组合变体。表30中示出和定义了适宜性得分。表31中示出了符合上述标准的IspS的各个置换的适宜性得分和等级。
表30.所定义组的适宜性得分。
在如下组中出现置换: | 适宜性得分 |
A、B和C | +++++ |
A和B | ++++ |
A或(B和C) | +++ |
B | ++ |
C | + |
表31.在可组合位置内具有置换的IspS中的位置的适宜性得分和等 级。
实例12:具有提高的比活性或生长活性的可组合性较小的改善变体
表32列出了属于适宜性组B或C,或者表31中未列出的变体。这些“可组合性较小的”变体不符合上述可组合性标准,但在重新测试时显示比活性或生长性能有所改善。
表32.MEA银白杨(P.alba)中具有显示PI比活性值>1.3的可组合性较
小的改善突变的位置
表33.MEA银白杨(P.alba)中具有显示40uM和100uM IPTG条件下的
OD Max的PI值>1.3的可组合性较小的改善突变的位置
在不背离本发明的范围和精神的前提下,所述的本发明方法和系统的各种修改形式和变型形式对于本领域技术人员将显而易见。虽然已结合具体优选的实施例描述了本发明,但应认识到,请求保护的本发明不应不适当地限于这些具体实施例。实际上,对相关领域内技术人员显而易见的实施本发明的所述模式的各种修改形式旨在涵盖于以下权利要求书的范围内。
附录1
Claims (124)
1.一种具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽,其中所述多肽在N-端区域、表面环、表面、活性位点、二聚体界面、底物捕集环或隐埋区域中的一个或多个残基处包含一个或多个置换,并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比,所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少30%的提高。
2.根据权利要求1所述的多肽,其中所述N-端区域中的所述置换位于选自X2,X22,X36,X43,和X58的残基处。
3.根据权利要求2所述的多肽,其中所述置换位于选自E2,S22,K36,R43,和E58的残基处。
4.根据权利要求3所述的多肽,其中所述置换选自E2V,S22K,S22R,K36D,K36E,K36H,K36W,R43E,和E58F。
5.根据权利要求1所述的多肽,其中所述隐埋区域中的所述置换位于选自X71,X89,X118,X161,X228,X268,X282,X288,X331,X391,X392,X437,X460,X461,X481,X488,和X502的残基处。
6.根据权利要求5所述的多肽,其中所述置换位于选自R71,F89,A118,K161,M228,V268,S282,S288,C331,A391,W392,C437,M460,R461,T481,E488,和T502的残基处。
7.根据权利要求6所述的多肽,其中所述置换选自R71I,F89D,F89E,A118E,A118P,K161C,M228Y,V268I,S282H,S282W,S288A,S288T,S288Y,C331P,A391G,W392C,W392F,W392M,W392S,W392V,W392Y,C437L,C437M,M460A,R461A,R461Y,T481Y,E488L,T502F和T502M。
8.根据权利要求1所述的多肽,其中所述表面环中的所述置换位于选自X120,X151,X153,X254,X380,和X409的残基处。
9.根据权利要求8所述的多肽,其中所述置换位于选自S120,L151,H254,S380,和V409的残基处。
10.根据权利要求9所述的多肽,其中所述置换选自S120M,S120Q,L151F,L151Y,G153P,H254C,S380E,和V409T。
11.根据权利要求1所述的多肽,其中所述二聚体界面中的所述置换位于X247处。
12.根据权利要求11所述的多肽,其中所述置换位于V247处。
13.根据权利要求12所述的多肽,其中所述置换为V247M。
14.根据权利要求1所述的多肽,其中所述表面上的所述置换位于选自X348,X376,和X389的残基处。
15.根据权利要求14所述的多肽,其中所述置换位于选自K348,L376,和G389的残基处。
16.根据权利要求15所述的多肽,其中所述置换选自K348Y,和G389D。
17.根据权利要求1所述的多肽,其中所述底物捕集环中的所述置换位于选自X443,X444,X447和X448的残基处。
18.根据权利要求17所述的多肽,其中所述置换位于选自S444,I447和A448的残基处。
19.根据权利要求18所述的多肽,其中所述置换选自S444S,I447T和A448V。
20.一种具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽,其中所述多肽包含下列具有与SEQ ID NO:1相对应的残基编号的不易突变的残基:X4,X9,X243,X258,X259,X262,X266,X280,X294,X295,X298,X305,X387,X396,X397,X435,X439,X446,X449,X450,X514,和X518,,并且其中所述多肽在选自下列的残基处还包含一个或多个置换:X2,X22,X36,X43,X58,X71,X89,X118,X120,X151,X153,X161,X228,X234,X247,X254,X268,X282,X288,X331,X348,X376,X380,X389,X391,X392,X409,X437,X443,X444,X447,X448,X460,X461,X481,X488,和X502,,并且其中与SEQID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比,所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少30%的提高。
21.根据权利要求20所述的多肽,其中所述置换位于选自下列的残基处:E2,S22,K36,R43,E58,R71,F89,A118,S120,L151,K161,M228,Q234,V247,H254,V268,S282,S288,C331,K348,L376,S380,G389,A391,W392,V409,C437,S444,I447,A448,M460,R461,T481,E488,和T502。
22.根据权利要求21所述的多肽,其中所述置换选自:E2V,S22K,S22R,K36D,K36E,K36H,K36W,R43E,E58F,R71I,F89D,F89E,A118E,A118P,S120M,S120Q,L151F,L151Y,G153P,K161C,M228Y,Q234R,V247I,V247L,V247M,H254C,V268I,S282H,S282W,S288A,S288T,S288Y,C331P,K348Y,S380E,G389D,A391G,W392C,W392F,W392M,W392S,W392V,W392Y,V409T,C437L,C437M,S444D,S444E,I447T,I447V,A448V,M460A,R461A,T481Y,E488L,T502F和T502M。
23.一种具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽,其中所述多肽包含下列具有与SEQ ID NO:1相对应的残基编号的不易突变的残基:X4,X9,X243,X258,X259,X262,X266,X280,X294,X295,X298,X305,X387,X396,X397,X435,X439,X446,X449,X450,X514,和X518,,并且其中所述多肽在选自下列的残基处还包含一个或多个置换:X134,X138,X143,X156,X159,X163,X166,X167,X170,X414,X421,和X491,并且其中在类似的生长条件下,与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比,表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少50%。
24.根据权利要求23所述的多肽,其中所述置换位于选自K134,K138,L143,I156,E159,F163,S166,H167,E170,K414,和Q421的残基处。
25.根据权利要求24所述的多肽,其中所述置换选自K134P,K138C,L143F,L143V,I156G,E159G,E159Q,F163C,F163E,F163Q,F163V,F163Y,S166C,S166D,S166G,S166P,S166V,H167M,E170G,E170H,E170K,E170N,E170R,E170S,E170W,K414F,K414G,K414N,K414P,和Q421R。
26.一种具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽,其中所述多肽包含下列具有与SEQ ID NO:1相对应的残基编号的不易突变的残基:X4,X9,X243,X258,X259,X262,X266,X280,X294,X295,X29S,X305,X3S7,X396,X397,X435,X439,X446,X449,X450,X514,和X518,,并且其中所述多肽在选自下列的残基处还包含一个或多个置换:X29,X47,X86,X94,X131,X134,X156,X162,X169,X178,X179,X231,X242,X369,X414,和X421,并且其中在类似的生长条件下,与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比,表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少50%。
27.根据权利要求26所述的多肽,其中所述置换位于选自E29,N47,S86,K94,E131,K134,I156,V162,K169,K178,E179,S231,R242,F369,K414,和Q421的残基处。
28.根据权利要求27所述的多肽,其中所述置换选自E29N,N47V,S86C,K94A,E131F,K134E,K134P,I156G,V162P,K169C,K178E,E179T,S231D,S231K,S231R,S231T,S231V,R242N,R242I,F369C,K414C,K414F,K414G,K414N,和Q421D。
29.一种具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽,其中所述多肽包含下列具有与SEQ ID NO:1相对应的残基编号的不易突变的残基:X4,X9,X243,X258,X259,X262,X266,X280,X294,X295,X298,X305,X387,X396,X397,X435,X439,X446,X449,X450,X514,和X518,,并且其中所述多肽在选自下列的残基处还包含一个或多个置换:X30,X84,X134,X140,X143,X163,X166,X169,X170和X172,并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比,所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少20%的提高,并且在类似的生长条件下,与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比,表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少20%。
30.根据权利要求29所述的多肽,其中所述置换位于选自V84,K134,I140,L143,F163,S166,K169,E170和S172的残基处。
31.根据权利要求30所述的多肽,其中所述置换选自V30K,V84T,K134C,K134D,K134E,I140S,I140T,L143F,L143I,L143M,L143V,F163I,F163M,S166P,S166V,K169Q,E170H,E170K,和S172V。
32.一种具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽,其中所述多肽在以下位置处包含一个或多个置换:(i)N-端,(ii)从残基134至179的N-端螺旋区,其中所述残基编号对应于SEQ ID NO:1(野生型MEA异戊二烯合酶)或(iii)所述N-端螺旋区外部与所述N-端螺旋区相互作用的其他残基处,并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比,所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少20%的提高。
33.根据权利要求32所述的多肽,其中所述置换位于选自下列的残基处:X30,X84,X134,X140,X143,X163,X166,X169,X170和X172。
34.根据权利要求33所述的多肽,其中所述置换位于选自下列的残基处:V84,K134,I140,L143,F163,S166,K169,E170和S172。
35.根据权利要求34所述的多肽,其中所述置换选自:V30K,V84T,K134C,K134D,K134E,I140S,I140T,L143F,L143I,L143M,L143V,F163I,F163M,S166P,S166V,K169Q,E170H,E170K,和S172V。
36.一种具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X2,X22,X36,X43,X58,X71,X89,X118,X120,X151,X153,X161,X228,X234,X247,X254,X268,X282,X288,X331,X348,X376,X380,X389,X391,X392,X409,X437,X443,X444,X447,X448,X460,X461,X481,X488,和X502,,并且其中与SEQ IDNO:1的野生型异戊二烯合酶相比,所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少30%的提高。
37.根据权利要求36所述的多肽,其中所述置换位于选自E2,S22,K36,R43,E58,R71,F89,A118,S120,L151,K161,M228,Q234,V247,H254,V268,S282,S288,C331,K348,L376,S380,G389,A391,W392,V409,C437,S444,I447,A448,M460,R461,T481,E488,和T502的残基处。
38.根据权利要求37所述的多肽,其中所述置换选自E2V,S22K,S22R,K36D,K36E,K36H,K36W,R43E,E58F,R71I,F89D,F89E,A118E,A118P,S120M,S120Q,L151F,L151Y,G153P,K161C,M228Y,Q234R,V247I,V247L,V247M,H254C,V268I,S282H,S282W,S288A,S288T,S288Y,C331P,K348Y,S380E,G389D,A391G,W392C,W392F,W392M,W392S,W392V,W392Y,V409T,C437L,C437M,S444D,S444E,I447T,I447V,A448V,M460A,R461A,T481Y,E488L,T502F和T502M。
39.一种具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽,其中所述多肽在N-端区域、N-端螺旋区、表面环、表面、活性位点、二聚体界面、底物捕集环或隐埋区中的一个或多个残基处包含一个或多个置换,并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比,所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少40%的提高。
40.根据权利要求39所述的多肽,其中所述N-端区域中的所述置换位于选自下列的残基处:X18,X36,和X82。
41.根据权利要求40所述的多肽,其中所述置换位于选自Y18,K36,和R82的残基处。
42.根据权利要求41所述的多肽,其中所述置换选自:Y18E,Y18D,Y18S,K36P,和R82Q。
43.根据权利要求39所述的多肽,其中所述N-端螺旋区域中的所述置换位于选自下列的残基处:X137,X143,X163,和X170。
44.根据权利要求43所述的多肽,其中所述置换位于选自下列的残基处:I137,L143,F163,和E170。
45.根据权利要求44所述的多肽,其中所述置换选自:I137C,L143N,F163I,F163Q,和E170G。
46.根据权利要求39所述的多肽,其中所述表面环中的所述置换位于选自下列的残基处:X87,X409,和X542。
47.根据权利要求46所述的多肽,其中所述置换位于选自下列的残基处:G87,V409,和F542。
48.根据权利要求47所述的多肽,其中所述置换选自:G87S,G87N,G87R,V409S,和F542N。
49.根据权利要求39所述的多肽,其中所述表面中的所述置换位于残基X251处。
50.根据权利要求49所述的多肽,其中所述置换位于残基T251处。
51.根据权利要求49所述的多肽,其中所述置换为T251E。
52.根据权利要求39所述的多肽,其中所述二聚体界面中的所述置换位于残基X242处。
53.根据权利要求52所述的多肽,其中所述置换位于残基R242处。
54.根据权利要求53所述的多肽,其中所述置换为R242T。
55.根据权利要求39所述的多肽,其中所述隐埋区域中的所述置换位于选自下列的残基处:X437,X460,和X461。
56.根据权利要求55所述的多肽,其中所述置换位于选自下列的残基处:C437,M460,和R461。
57.根据权利要求56所述的多肽,其中所述置换选自:C437M,C437K,M460Q,M460G,M460A,R461D,R461S,R461T,和R461。
58.根据权利要求39所述的多肽,其中所述底物捕集环中的所述置换位于选自下列的残基处:X443,X444,和X447。
59.根据权利要求58所述的多肽,其中所述置换位于选自下列的残基处:S444,和I447。
60.根据权利要求56所述的多肽,其中所述置换选自:S444P,I447Q,I447T,I447M,I447E,I447S,和I447R。
61.一种分离的多肽,所述多肽具有异戊二烯合酶活性,并且当所述多肽在宿主细胞中表达时,提供改善的生长活性,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X134,X138,X143,X156,X159,X163,X166,X167,X170,X414,X421,和X491,并且其中在类似的生长条件下,与表达SEQ IDNO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比,表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少50%。
62.根据权利要求61所述的多肽,其中所述置换位于选自K134,K138,L143,I156,E159,F163,S166,H167,E170,K414,和Q421的残基处。
63.根据权利要求62所述的多肽,其中所述置换选自K134P,K138C,L143F,L143V,I156G,E159G,E159Q,F163C,F163E,F163Q,F163V,F163Y,S166C,S166D,S166G,S166P,S166V,H167M,E170G,E170H,E170K,E170N,E170R,E170S,E170W,K414F,K414G,K414N,K414P,和Q421R。
64.一种分离的多肽,所述多肽具有异戊二烯合酶活性,并且当所述多肽在宿主细胞中表达时,提供改善的生长活性,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X29,X47,X86,X94,X131,X134,X156,X162,X169,X178,X179,X231,X242,X369,X414,和X421,并且其中在类似的生长条件下,与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比,表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少50%。
65.根据权利要求64所述的多肽,其中所述置换位于选自E29,N47,S86,K94,E131,K134,I156,V162,K169,K178,E179,S231,R242,F369,K414,和Q421的残基处。
66.根据权利要求65所述的多肽,其中所述置换选自:E29N,N47V,S86C,K94A,E131F,K134E,K134P,I156G,V162P,K169C,K178E,E179T,S231D,S231K,S231R,S231T,S231V,R242N,R242I,F369C,K414C,K414F,K414G,K414N,和Q421D。
67.一种分离的多肽,所述多肽具有异戊二烯合酶活性,并且当所述多肽在宿主细胞中表达时,提供改善的生长活性,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X50,X81,X134,X137,X143,X156,X159,X166,X167,X169,X170,和X414,并且其中在类似的生长条件下,与表达SEQ IDNO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比,表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少30%。
68.根据权利要求67所述的多肽,其中所述置换位于选自K50,D81,K134,I137,L143,I156,E159,S166,H167,K169,E170,和K414的残基处。
69.根据权利要求68所述的多肽,其中所述置换选自:K50S,D81F,K134E,K134P,I137N,L143V,I156G,E159D,E159G,E159Q,S166C,S166W,H167M,H167N,K169C,E170H,E170K,E170W,K414C,K414F,K414G,K414N,和K414P。
70.一种分离的多肽,所述多肽具有改善的异戊二烯合酶活性,并且当所述多肽在宿主细胞中表达时,提供改善的生长活性,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X30,X84,X134,X140,X143,X163,X166,X169,X170和X172,并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比,所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少20%的提高,并且在类似的生长条件下,与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比,表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少20%。
71.根据权利要求70所述的多肽,其中所述置换位于选自V84,K134,I140,L143,F163,S166,K169,E170和S172的残基处。
72.根据权利要求71所述的多肽,其中所述置换选自:V30K,V84T,K134C,K134D,K134E,I140S,I140T,L143F,L143I,L143M,L143V,F163I,F163M,S166P,S166V,K169Q,E170H,E170K,和S172V。
73.一种具有改善的异戊二烯合酶性质的分离的多肽,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含两个或更多个置换:X22,X71,X87,X162,X242,X288,X409,X414,X443,X444,X460,和X502,其中所述残基编号对应于SEQ ID NO:1,并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比,所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少160%的提高。
74.根据权利要求73所述的多肽,其中所述置换位于选自S22,R71,G87,V162,R242,S288,V409,K414,S444,M460,和T502的残基处。
75.根据权利要求74所述的多肽,其中所述置换选自:S22R,R71I或R,G87R,V162P,R242N,S288C,V409T,KX414F,S444D,M460A,和T502M。
76.根据权利要求73所述的多肽,其中所述置换选自:
a)S22R,R71I,S288C,S444D,M460A,和T502M;
b)G87R,V162P,R242N,S288C,V409T,K414R,和S444D;或者
c)G87R,V162P,R242N,S288C,V409T,和K414F。
77.一种具有改善的异戊二烯合酶性质的分离的多肽,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含两个或更多个置换:X47,X87,X156,X162,X170,X231,X242,X288,X409,X414,和X447,其中所述残基编号对应于SEQ ID NO:1,并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比,所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少30%的提高,并且在类似的生长条件下,与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比,宿主细胞中表达所述多肽时生长量多至少30%。
78.根据权利要求77所述的多肽,其中所述置换位于选自N47,G87,I156,V162,E170,S231,R242,S288,V409,K414,和I447的残基处。
79.根据权利要求78所述的多肽,其中所述置换选自N47V,G87R,I156G,V162P,E170H,S231T,R242N,S288C,S288T,V409T,和K414F。
80.根据权利要求77所述的多肽,其中所述置换选自N47V,I156G,E170H,S231T,S288T,和K414F。
81.一种具有改善的异戊二烯合酶性质的分离的多肽,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X2,X18,X19,X21,X24,X26,X27,X29,X37,X42,X47,X48,X49,X56,X81,X82,X84,X93,X94,X95,X120,X123,X126,X131,X132,X134,X137,X139,X143,X151,X155,X166,X167,X169,X170,X171,X175,X179,X180,X197,X229,X231,X240,X242,X245,X246,X247,X251,X271,X282,X306,X317,X319,X369,X371,X376,X379,X380,X389,X392,X393,X408,X409,X421,X422,X423,X429,X437,X443,X444,X447,X455,X458,X461,X464,X466,X470,X473,X500,X502,X506,X513,X525和X531,并且其中所述多肽(a)相对于SEQ ID NO:1,比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.9的PI,并且其中相对于SEQ ID NO:1,比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.0的PI;以及(b)相对于SEQ ID NO:1,比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.8的PI,并且其中相对于SEQ ID NO:1,比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.2的PI;以及(c)相对于SEQ ID NO:1,比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.5的PI,并且其中相对于SEQID NO:1,比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.5的PI。
82.根据权利要求81所述的多肽,其中所述置换位于选自E2,Y18,L19,S21,T24,E26,S27,E29,K37,V42,N47,N48,E49,L56,D81,R82,V84,T93,K94,T95,S120,K123,N126,E131,N132,K134,I137,A139,L143,L151,N155,S166,H167,K169,E170,L171,K175,E179,L180,Q197,I229,S231,T240,R242,R245,R246,V247,T251,A271,S282,L306,D317,N319,F369,Q371,L376,K379,S380,G389,W392,K393,V408,V409,Q421,K422,Y423,R429,C437,S444,I447,S455,C458,R461,G464,S466,A470,S473,V500,T502,L506,T513,E525和V531的残基处。
83.根据权利要求82所述的多肽,其中置换选自E2A或K或P、Y18D或E或K或S、L19Y、S21W、T24L或V、E26C、S27D或N、E29N、K37C或D或P或Q或S、V42M、N47D或S、N48D或G或T、E49L或V、L56E或F或G或I或K或T或V或Y、D81Q、R82N或T或V或Y、V84M、T93C或F或R或S、K94G或P、T95D或F或G或I或N或W、S120C或G或M或Q、K123V、N126E、E131H或K或L或M或T或W或Y、N132I或P、K134A、I137T、A139C或Q、L143C或D或E或H或K或M或Q或T或V或Y、L151A或F、N155A或C或G或H或Q或R或S或W、S166N、H167F或I或N或Q或V、K169A或C或H或N或Q或V、E170L或S或W或Y、L171A或N或Q或T或V或Y、K175C或F或I或Q或R、E179D、L180A或I、Q197C或D或N、I229C、S231A、T240C、R242G、R245C或K或M或Q或T或V、R246N、V247L或M、T251D或E或N或P或Q或S、A271T、S282Y、L306C、D317N、N319M、F369C或D或E或G或S、Q371F、L376I或M、K379G或Q、S380E、G389A或D或E或K或N或Q或S或V、W392Y、K393C或I或T或V、V408T、V409T、Q421H、K422D、Y423N或S、R429E或F或Q、C437M、S444D或E、I447T、S455A、C458T、R461A,G464C或M或N或Q或S、S466D、A470I或L、S473I、V500A或C、T502M,L506M,T513C或G或K或N、E525F或R、V531E或H或K或Q或R或S。
84.一种具有改善的异戊二烯合酶性质的分离的多肽,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X2,X6,X18,X20,X22,X23,X24,X25,X26,X27,X28,X29,X30,X31,X32,X36,X37,X42,X44,X47,X48,X49,X50,X53,X54,X55,X56,X58,X59,X68,X71,X74,X77,X78,X79,X81,X82,X83,X84,X86,X87,X91,X93,X94,X95,X97,X98,X99,X109,X115,X116,X117,X118,X120,X123,X125,X126,X127,X128,X130,X131,X132,X133,X134,X136,X137,X138,X139,X140,X143,X151,X153,X155,X156,X159,X160,X161,X162,X163,X164,X166,X167,X169,X170,X171,X172,X175,X176,X177,X178,X179,X180,X181,X182,X190,X194,X197,X204,X211,X215,X217,X219,X221,X228,X229,X231,X232,X235,X241,X242,X245,X246,X247,X251,X254,X271,X272,X278,X279,X282,X296,X302,X317,X319,X320,X327,X331,X348,X351,X357,X361,X364,X365,X368,X369,X370,X371,X373,X377,X380,X383,X386,X389,X392,X393,X407,X408,X409,X410,X411,X414,X422,X423,X424,X428,X429,X432,X436,X437,X440,X443,X444,X447,X448,X457,X460,X461,X462,X463,X464,X465,X466,X468,X470,X471,X472,X473,X475,X480,X490,X491,X492,X494,X496,X500,X501,X502,X503,X510,X513,X515,X519,X525,X531,X536,X537,X540,X541,X542,和X544,并且其中所述多肽(a)相对于SEQ ID NO:1,比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.9的PI,并且其中相对于SEQ IDNO:1,比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.0的PI;以及(b)相对于SEQ ID NO:1,比活性和表达的最小性能指数(PI)大于或等于0.8的PI,并且其中相对于SEQ ID NO:1,比活性或生长量的至少一个PI大于或等于1.2的PI。
85.根据权利要求84所述的多肽,其中所述置换位于选自E2,S6,Y18,L20,S22,D23,T24,D25,E26,S27,I28,E29,Y31,K32,K36,K37,V42,R44,N47,N48,E49,K50,F53,L54,T55,L56,E58,L59,L68,R71,S74,R77,G78,A79,D81,R82,F83,V84,S86,G87,A91,T93,K94,T95,L97,H98,G99,Q109,S115,Q116,E117,A118,S120,K123,Q125,N126,G127,N128,L130,E131,N132,L133,K134,D136,I137,K138,A139,I140,L143,L151,N155,I156,E159,A160,K161,V162,F163,A164,S166,H167,K169,E170,L171,S172,K175,I176,G177,K178,E179,L180,A181,E182,L190,R194,Q197,S204,K211,N215,V217,L219,L221,M228,I229,S231,V232,R235,S241,R242,R245,R246,V247,T251,H254,A271,F272,D278,C279,S282,I296,T302,D317,N319,A320,Y327,C331,K348,G351,Y357,A361,D364,L365,A368,F369,L370,Q371,A373,Y377,S380,T383,D386,G389,W392,K393,A407,V408,V409,Q410,N411,K414,K422,Y423,H424,S428,R429,H432,L436,C437,L440,S444,I447,A448,S457,M460,R461,T462,K463,G464,I465,S466,E468,A470,T471,E472,S473,M475,E480,L490,G492,L494,A496,V500,E501,T502,A503,S510,T513,H515,A519,E525,V531,T536,E537,L540,P541,F542,和R544的残基处。
86.根据权利要求85所述的多肽,其中所述置换位于选自下列的残基处:E2C或D或N或T或V,S6N或T,Y18A或Q或R,L20T,S22Q,D23N,T24C,D25T,E26D或H或K或M或R或S或V,S27A或C或G或H或I或L或M或P或Q,I28D或N,E29Q,V30A或D或E或M或R或T,Y31N,K32E,K36A或C或D或E或M或N或P或Q,K37A或E或G或H或M或N或R或T,V42F或I,R44N或Q,N47A或G或H或M或Q或T或W,N48H或I或K,E49A或C,K50A或D或E或F或H或S或Y,F53E或H或N或P或Q或V,L54M,T55C或D或E,L56C或N,E58N,L59H或T,L68I,R71K或M,S74D或E或N或Y,R77L,G78A或D或F或L或M,A79Q或T,D81A或F或G或M或R或S或T或V,R82A或E或H或I或K或M或Q或S,F83W,V84A,S86A或D或M,G87D或P,A91K或W,T93A或D或E或G或L或N或P或Y,K94A或D或E或H或I或L或M或N或R或S或T,T95A或E或P或Q或S或V或Y,L97F,H98A或D或F或G或I或L或M或N或Q,G99E或F或M,Q109E,S115A,Q116A或C或D或E或I或P,E117C或F或L或M或V,A118M,S120H或T或V,K123L或T,Q125E或I或Y,N126A或C或D或M或T或V,G127C,N128C或D或P或Q,L130E,E131A或C或P或Q或S或V,N132C或D或F或H或L或R或W或Y,L133D,K134E或M或Q或S或T或V,D136E,I137E或H或N,K138I或N,A139N,I140M或W,L143S,L151C或H或I,G153C,N155I或T或V或Y,I156D或N或T,E159M,A160I,K161A或C或N或Q,V162S,F163E或Q,A164T,S166A或D或G,H167A或E或G或K或M或R或S或T或W,K169D或I或M或S或T,E170H或K或M或Q或T或V,L171H或K或R或S,S172A或C,K175S,I176M,G177A或C,K178A或F或R或S或T,E179A或C或L或M或N,L180C或Q或T,A181H或Q或S或V,E182S,L190I或M,R194L,Q197S,S204C,K211A或N或Q,N215C或H,V217I,L219C,L221M,M228F或Y,I229V,S231K或Q或T,V232I,R235K,S241A或M或T,R242A或D或E或H或I或M或N或Q或S或T,R245I或L,R246D或K,V247T,T251A或G或K或R,H254D,A271C或V,F272D或G或P或W,D278A或E或N或Q或S或T或V或W,C279A,S282A或Q,I296V,T302H,D317E或Q,N319F,A320C,Y327M,C331P,K348R或Y,G351D或N,Y357M,A361T,D364E或V,L365C或M,A368N,F369M或N或R或T或V,L370G或Q,Q371C或S,A373G,Y377W,S380A或C或D或Q或T或V,T383S,D386E或N,G389H或I,W392I或S或T或V,K393Q,A407G,V408I,V409H或I,Q410C或D或K或L或M或T,N411G,K414E或G或L或N或P,K422A或N或T,Y423Q,H424E或P或Q或V,S428E或Q,R429I或L或T或W或Y,H432E,L436M或Y,C437K或T,L440I,S444P,I447A或E或M或Q或S,A448E或M或N或P或Q或V,S457N或T,M460Q或R或S,R461D或E或G或Q或S或T,T462Q,K463A或D或E,G464L或R,I465A或C或G或S或T,S466P,E468D,A470M,T471E或H或Q,E472D或S,S473L或V,M475T,E480N,L490A或D或E或F或H或M,G492C,L494D,A496P或T,V500L或M,E501D,T502A或C或R或V,A503I,S510C或V,T513V,H515N,A519S或T,E525A或C或P或Q或S,V531A或M或T,T536A或F或G,E537K或T,L540A或P P541M,F542P,和R544C。
87.一种具有改善的异戊二烯合酶性质的分离的多肽,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X2,X3,X13,X17,X18,X19,X20,X23,X25,X26,X27,X28,X29,X30,X31,X32,X33,X34,X36,X37,X40,X41,X42,X43,X44,X45,X46,X47,X48,X49,X50,X51,X53,X54,X55,X56,X57,X59,X60,X62,X71,X73,X74,X75,X77,X78,X79,X81,X82,X83,X84,X85,X86,X87,X88,X89,X91,X92,X93,X94,X95,X97,X98,X99,X100,X101,X102,X103,X107,X109,X111,X113,X114,X115,X116,X117,X118,X119,X120,X121,X123,X124,X125,X127,X128,X129,X130,X131,X133,X134,X135,X136,X137,X138,X139,X140,X143,X146,X151,X152,X153,X155,X156,X158,X160,X161,X162,X163,X166,X167,X169,X170,X171,X172,X175,X176,X177,X178,X179,X180,X181,X182,X183,X185,X187,X193,X194,X196,X197,X204,X210,X211,X212,X215,X216,X217,X218,X219,X220,X222,X223,X224,X226,X228,X229,X231,X232,X235,X240,X241,X242,X246,X251,X253,X260,X268,X270,X271,X272,X275,X276,X278,X282,X307,X314,X315,X317,X320,X321,X323,X328,X329,X331,X332,X333,X343,X345,X346,X350,X351,X352,X356,X357,X360,X361,X363,X364,X366,X367,X368,X369,X370,X371,X378,X379,X380,X383,X386,X389,X390,X392,X393,X402,X405,X408,X409,X410,X413,X414,X418,X422,X423,X424,X425,X426,X428,X429,X431,X432,X437,X444,X447,X448,X457,X460,X461,X462,X463,X464,X466,X467,X468,X469,X471,X472,X475,X484,X489,X490,X491,X492,X493,X494,X497,X500,X501,X502,X503,X504,X506,X509,X510,X511,X513,X515,X517,X519,X522,X528,X529,X531,X534,X535,X536,X537,X539,X540,X542,和X544,并且其中所述多肽具有(a)相对于SEQ ID NO:1,对于比活性和表达而言,最小性能指数(PI)大于或等于0.9的PI,并且其中相对于SEQ ID NO:1,对于比活性或生长而言,至少一个PI大于或等于1.0的PI;或者
(b)相对于SEQ ID NO:1,对于比活性和表达而言,最小性能指数(PI)大于或等于0.8的PI,并且其中相对于SEQ ID NO:1,对于比活性或生长而言,至少一个PI大于或等于1.2的PI;以及(c)相对于SEQ ID NO:1,对于比活性和表达而言,最小性能指数(PI)大于或等于0.5的PI,并且其中相对于SEQ ID NO:1,对于比活性或生长而言,至少一个PI大于或等于1.5的PI。
88.根据权利要求87所述的多肽,其中所述置换位于选自下列的残基处:E2,A3,S13,D17,Y18,L19,L20,D23,D25,E26,S27,I28,E29,Y31,K32,D33,K34,K36,K37,A40,E41,V42,R43,R44,E45,I46,N47,N48,E49,K50,A51,F53,L54,T55,L56,L57,L59,I60,N62,R71,E73,S74,D75,R77,G78,A79,D81,R82,F83,V84,S85,S86,G87,G88,F89,A91,V92,T93,K94,T95,L97,H98,G99,T100,A101,L102,S103,L107,Q109,G111,E113,V114,S115,Q116,E117,A118,F119,S120,G121,K123,D124,Q125,G127,N128,F129,L130,E131,L133,K134,E135,D136,I137,K138,A139,I140,L143,A146,L151,E152,N155,I156,D158,A160,K161,V162,F163,S166,H167,K169,E170,L171,S172,K175,I176,G177,K178,E179,L180,A181,E182,Q183,N185,A187,H193,R194,T196,Q197,S204,K210,K211,E212,N215,Q216,V217,L218,L219,E220,A222,I223,L224,Y226,M228,I229,S231,V232,R235,T240,S241,R242,R246,T251,L253,L260,V268,V270,A271,F272,Q275,Y276,D278,S282,E307,E314,R315,D317,A320,I321,D323,M328,K329,C331,F332,L333,A343,D345,N346,K350,G351,E352,P356,Y357,K360,A361,A363,D364,C366,N367,A368,F369,L370,Q371,N378,K379,S380,T383,D386,G389,N390,W392,K393,V402,Y405,V408,V409,Q410,K413,K414,E418,K422,Y423,H424,D425,T426,S428,R429,S431,H432,C437,S444,I447,A448,S457,M460,R461,T462,K463,G464,S466,E467,E468,L469,T471,E472,M475,K484,K489,L490,G492,S493,L494,K497,V500,E501,T502,A503,I504,L506,Q509,S510,H511,T513,H515,G517,A519,S522,R528,K529,V531,V534,I535,T536,E537,I539,L540,F542和R544。
89.根据权利要求88所述的多肽,其中所述置换选自E2H或I或S、A3E或G或K或N或Q或R或T、S13Q或T、D17E、Y18F或M或N、L19F、L20I或V、D23T、D25A或E或S、E26G或N或Q或T、S27E或F或K或V、I28E或F或M或P、E29D或P或R或T、V30N或Q、Y31Q或W、K32D或G或N或R、D33N、K34D或E或Q或S、K36F或R、K37F或I、A40C或D或E或F或M或N或P或Q或V、E41C或D或F或N或Q或S或V、V42A或S或T、R43I或Q、R44A或D或K或M或Y、E45C或M或N或Q、I46F或V、N47E或I或K或R或V、N48A或C或E或F或L或Q或R或S、E49G或H或I或R或S或W、K50C或G或M或N或P或R、A51E或G或L或Q或T、F53D、L54A或C或E或H或I或Q、T55A或H或N或Q或S或Y、L56H或Q或R或S、L57I、L59F或M或S或V或Y、I60C或V、N62V、R71I、E73D、S74G或M或P、D75E、R77A或N或T或V、G78E或I或K或N或P或Q或V或W、A79M或R或Y、D81C或E或H或L或N、R82C或F或G或L或W、F83G或H或I或L或V、V84F或H或L或N或Q或R或S或T或W或Y、S85C或L或N或R、S86C或N、G87C或E或F或K或L或N或T、G88C或D或I或V或W或Y、F89C或I,A91C或D或E或G或H或L或R或S或T或V或Y、V92A或C或E或F或G或I或L或Q或W、T93H或I或Q或V或W、K94C或V或Y、T95C或H或K或M、L97A或M或P、H98C或S或T或V或W、G99A或C或H或P或Q或T、T100A或I或L或M或V、A101S、L102M、S103A或C或G或L、L107C或F、Q109C或N或S、G111A、E113C或H或V、V114C、S115D或Y、Q116G或H或L或S或T或V、E117A或D或I、A118I或V、F119L或M、S120A或D或E或F或K或N或R或W或Y、G121D或L或V或W、K123I或S或W或Y、D124C或E、Q125A或D或G或H或K或L或N或S或T或V或W、G127D或F或W、N128A、F129L或Y、L130A或C或D或Q或V或Y、E131D或F或G或R、L133E或G或I或P或Q或T或V或Y、K134D或G或H或I或L或N或R或W或Y、E135H或S,D136N、I137A或C或D或G或P或Q或S或V、K138C或D或E或P或R或S或V、A139P或S或T或V、I140N或Q或S或T或V、L143A或F或G或N或R或W、A146M、L151E或G或M或N或Q或R或S或T或V或W、E152A或D或I或M或P、G153D、N155E或K或M、I156E或K或L或R或Y、D158E、A160F或H或S、K161L或R或S或Y、V162D或F或N或P或T、F163C或H或I或M或V或W或Y、S166C或E或H或K或P或Q或V或W、H167C或L或P、K169E或G或R、E170G或I或N或R、L171C或E或G或I或M或W、S172G或N或Q或R、K175A或G或H或N或P或T或V、I176A或C或N或Q或V、G177D或E或H或N或P或T、K178D或E或G或I或L或M或N或P或Q或V或Y、E179G或I或P或Q或S或T或V或W或Y、L180F或H或V或W、A181F或M或N或W、E182H或N、Q183A或L、N185D、A187C或S、H193W、R194I、T196V、Q197G、S204A或F或M或W或Y、K210M、K211D或E或F或G或H或I或M或R或S或T或V、E212A或D或M或P或Q或T、N215D或Y、Q216A或E或N、V217C或E或K或N或P或Q或T、L218V、L219I或M或V、E220D或N、A222S、I223C、L224A或C或T或V、Y226F、M228H或R、I229A、S231D或G或H或R或V、V232Q、R235A或D或N、T240V、S241C、R242K或L、R246H或Q、T251H、L253M、L260M、V268I,V270I,A271S、F272Q、Q275E、Y276F或H或Q、D278L或M或R或Y、S282C、E307Q或R、E314H、R315G或K、D317S、A320N或T、I321L或M、D323I或T、M328L、K329G或Q或R、C331T、F332Y、L333F、A343I或V、D345Y、N346A、K350H或W或Y、G351E或M、E352F或I或M或V、P356M或S、Y357E、K360Q、A361Q或S或V、A363S、D364N或T、C366A、N367D或E或M、A368D或Q、F369H或Q、L370A或D或E或F或H或N或R或S或T或V、Q371G或H或I或N或P或R或T或W或Y、N378D、K379E或R或S、S380K或N、T383Q、D386K或S、G389C或M或P或R或T、N390S、W392F或M、K393H或R、V402F或I或L、Y405F、V408Q或S、V409C或Q或S、Q410E或G或H或I或R、K413P、K414C或H或I或Q、E418N、K422G或H或Q或R、Y423G、H424D或G或I或S或T、D425P、T426A或M或Q、S428V、R429A或C或D或G或H或K或N、S431G、H432A或M、C437N、S444N或Q或T、I447K或R、A448H或S或T、S457D、M460A或E或G、R461N、T462S、K463G或N、G464A或D或E或F或H或V或Y、S466E或G或K或N或T、E467N、E468A或N或P或Q、L469A或N、T471N、E472A或G或N、M475I、K484A、K489R、L490I或Y、G492T或V、S493C或G或K或V、L494G或I或Q或V、K497M或T、V500I或Y、E501N、T502H、A503L或M、I504L、L506I或V、Q509A,S510T、H511I或M、T513S、H515Q、G517P、A519C、S522A或K、R528K、K529A、V531G或N、V534A或S、I535C或S或T、T536M、E537H或N或Q,I539V,L540E或Q或R或V、F542M,和R544G或N或P或Q或S。
90.一种具有改善的异戊二烯合酶活性的分离的多肽,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X22,X36,X43,X58,X87,X89,X118,X151,X234,X247,X254,X282,X288,X391,X392,X437,X443,X447,X481,X488,X502,和X542,并且其中与SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶相比,所述多肽在异戊二烯合酶的比活性方面具有至少30%的提高。
91.根据权利要求90所述的多肽,其中所述置换位于选自S22,K36,R43,E58,G87,F89,A118,L151,Q234,V247,H254,S282,S288,A391,W392,C437,I447,T481,E488,T502和F542的残基处。
92.根据权利要求91所述的多肽,其中所述置换选自:S22K或R、K36H或W、R43E,E58F,G87S或R、F89D,A118E,L151Y,G153P,Q234R,V247I,H254C,S282H或W、S288A或T或Y、A391G,W392C、C437L,I447V,T481Y,E488L,T502F和F542N。
93.一种分离的多肽,所述多肽具有异戊二烯合酶活性,并且当所述多肽在宿主细胞中表达时,提供改善的生长活性,其中所述多肽在选自下列的与SEQ ID NO:1相对应的残基处包含一个或多个置换:X30,X134,X143,X156,X159,X172,X414,和X421,,并且其中在类似的生长条件下,与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的生长量相比,表达所述多肽的宿主细胞的生长量多至少20%。
94.根据权利要求93所述的多肽,其中所述置换位于选自K134,L143,I156,E159,S172,K414,和Q421的残基处。
95.根据权利要求94所述的多肽,其中所述置换位于选自V30K,K134C或P,L143I,I156G,E159D,S172V,K414F,和Q421R或D的残基处。
96.一种包含根据权利要求4所述的多肽的重组宿主细胞。
97.一种包含根据权利要求7所述的多肽的重组宿主细胞。
98.一种包含根据权利要求10所述的多肽的重组宿主细胞。
99.一种包含根据权利要求15所述的多肽的重组宿主细胞。
100.一种包含根据权利要求19所述的多肽的重组宿主细胞。
101.一种包含根据权利要求22所述的多肽的重组宿主细胞。
102.一种包含根据权利要求31所述的多肽的重组宿主细胞。
103.一种包含根据权利要求35所述的多肽的重组宿主细胞。
104.一种包含根据权利要求63所述的多肽的重组宿主细胞。
105.一种包含根据权利要求66所述的多肽的重组宿主细胞。
106.一种包含根据权利要求69所述的多肽的重组宿主细胞。
107.一种包含根据权利要求72所述的多肽的重组宿主细胞。
108.一种包含根据权利要求79所述的多肽的重组宿主细胞。
109.一种包含根据权利要求83所述的多肽的重组宿主细胞。
110.一种包含根据权利要求86所述的多肽的重组宿主细胞。
111.一种包含根据权利要求92所述的多肽的重组宿主细胞。
112.一种包含根据权利要求95所述的多肽的重组宿主细胞。
113.根据权利要求96-112中任一项所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞选自细菌、藻类、真菌、酵母、蓝细菌或梭菌细胞。
114.根据权利要求113所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞为细菌细胞。
115.根据权利要求114所述的宿主细胞,其中所述细菌细胞为革兰氏阳性细菌细胞或革兰氏阴性细菌细胞。
116.根据权利要求115所述的宿主细胞,其中所述细菌细胞选自大肠杆菌、嗜酸乳杆菌、柠檬泛菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐嗜碱芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽胞杆菌、灿烂芽胞杆菌、苏云金芽孢杆菌、白色葡萄球菌、变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌、假单胞菌属、产碱假单胞菌、生孢梭菌、棒状杆菌属和谷氨酸棒杆菌细胞。
117.根据权利要求113所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞为藻类细胞。
118.根据权利要求117所述的宿主细胞,其中所述藻类细胞选自绿藻、红藻、灰藻、藻细胞核、眼虫、色菌界或沟鞭藻。
119.根据权利要求118所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞为真菌细胞。
120.根据权利要求119所述的宿主细胞,其中所述真菌细胞为丝状真菌。
121.根据权利要求113所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞为酵母细胞。
122.根据权利要求121所述的宿主细胞,其中所述酵母细胞选自酵母属、裂殖酵母属、毕赤酵母属或假丝酵母属。
123.根据权利要求122所述的宿主细胞,其中所述酵母细胞为酿酒酵母细胞。
124.一种鉴定多肽的方法,当所述多肽在宿主细胞中表达时,所述多肽具有改善的异戊二烯合酶活性和/或改善的生长特性,所述方法包括从位点评价库或组合库筛选多肽中的一个或多个置换,所述置换使得与表达SEQ ID NO:1的野生型异戊二烯合酶的宿主细胞的比活性和生长量相比,表达所述多肽时所述宿主细胞的比活性和/或生长量有所提高。
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Cited By (7)
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CN105985976A (zh) * | 2015-02-10 | 2016-10-05 | 中国科学院微生物研究所 | 异戊二烯合成酶基因及其应用 |
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Families Citing this family (20)
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SG191235A1 (en) | 2010-12-22 | 2013-07-31 | Danisco Us Inc | Compositions and methods for improved isoprene production using two types of ispg enzymes |
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SG2014007991A (en) | 2011-08-04 | 2014-03-28 | Danisco Us Inc | Production of isoprene, isoprenoid precursors, and isoprenoids using acetoacetyl-coa synthase |
BR112014008278A2 (pt) | 2011-10-07 | 2017-04-18 | Danisco Us Inc | utilização de fosfocetolase na produção de mevalonato, precursores isoprenoides e isopreno |
JP6101275B2 (ja) * | 2011-10-27 | 2017-03-22 | ダニスコ・ユーエス・インク | イソプレン産生時の溶解度が向上されたイソプレン合成酵素変異体 |
EP2794863A1 (en) | 2011-12-23 | 2014-10-29 | Danisco US Inc. | Enhanced production of isoprene using host cells having decreased ispa activity |
US8895277B2 (en) * | 2012-05-02 | 2014-11-25 | Danisco Us Inc. | Legume isoprene synthase for production of isoprene |
US9163263B2 (en) * | 2012-05-02 | 2015-10-20 | The Goodyear Tire & Rubber Company | Identification of isoprene synthase variants with improved properties for the production of isoprene |
WO2013181647A2 (en) | 2012-06-01 | 2013-12-05 | Danisco Us Inc. | Compositions and methods of producing isoprene and/or industrrial bio-products using anaerobic microorganisms |
EP2913392B1 (en) * | 2012-10-23 | 2023-06-07 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Recombinant cell and production method for isoprene |
US9850512B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-12-26 | The Research Foundation For The State University Of New York | Hydrolysis of cellulosic fines in primary clarified sludge of paper mills and the addition of a surfactant to increase the yield |
SG11201508186XA (en) | 2013-04-10 | 2015-11-27 | Danisco Us Inc | Phosphoketolases for improved production of acetyl coenzyme a-derived metabolites, isoprene, isoprenoid precursors, and isoprenoids |
JPWO2015076392A1 (ja) | 2013-11-22 | 2017-03-16 | 味の素株式会社 | 改変イソプレンシンターゼ |
US9951363B2 (en) | 2014-03-14 | 2018-04-24 | The Research Foundation for the State University of New York College of Environmental Science and Forestry | Enzymatic hydrolysis of old corrugated cardboard (OCC) fines from recycled linerboard mill waste rejects |
CN104531855A (zh) * | 2014-12-18 | 2015-04-22 | 宁波检验检疫科学技术研究院 | 一种细菌ⅰ型整合子的荧光定量pcr检测试剂 |
WO2017142993A1 (en) * | 2016-02-16 | 2017-08-24 | Manus Biosynthesis, Inc. | Secondary metabolite screening system |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008003078A2 (en) * | 2006-06-29 | 2008-01-03 | The Regents Of The University Of California | Short chain volatile hydrocarbon production using genetically engineered microalgae, cyanobacteria or bacteria |
Family Cites Families (98)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US1344713A (en) | 1915-12-02 | 1920-06-29 | Westinghouse Electric & Mfg Co | Reactance-coil |
DE1793254A1 (de) | 1968-08-23 | 1971-12-16 | Bayer Ag | Verfahren zur Gewinnung von Cyclopenten,Isopren und einem Diolefinstrom aus C?-Crackbenzinschnitten |
US5380831A (en) | 1986-04-04 | 1995-01-10 | Mycogen Plant Science, Inc. | Synthetic insecticidal crystal protein gene |
DE3338269A1 (de) | 1983-10-21 | 1985-05-02 | Basf Ag, 6700 Ludwigshafen | Verfahren zur gewinnung von isopren aus einem c(pfeil abwaerts)5(pfeil abwaerts)-kohlenwasserstoffgemisch |
GB8407828D0 (en) | 1984-03-27 | 1984-05-02 | Ontario Research Foundation | In situ preparation |
US4570029A (en) | 1985-03-04 | 1986-02-11 | Uop Inc. | Process for separating isoprene |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
ATE117020T1 (de) | 1985-08-29 | 1995-01-15 | Genencor Int | Expression von heterologen polypeptiden in filamentösen pilzen, verfahren zu deren herstellung und vektoren zu deren herstellung. |
DK122686D0 (da) | 1986-03-17 | 1986-03-17 | Novo Industri As | Fremstilling af proteiner |
GB8610600D0 (en) | 1986-04-30 | 1986-06-04 | Novo Industri As | Transformation of trichoderma |
US4846872A (en) | 1986-08-11 | 1989-07-11 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Herbicide |
US5322770A (en) | 1989-12-22 | 1994-06-21 | Hoffman-Laroche Inc. | Reverse transcription with thermostable DNA polymerases - high temperature reverse transcription |
US5545816A (en) | 1990-03-02 | 1996-08-13 | Amoco Corporation | Phytoene biosynthesis in genetically engineered hosts |
US5306862A (en) | 1990-10-12 | 1994-04-26 | Amoco Corporation | Method and composition for increasing sterol accumulation in higher plants |
JPH06503960A (ja) | 1990-12-10 | 1994-05-12 | ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド | TRICHODERMA REESEIのβ−グルコシダーゼ遺伝子のクローニングおよび増幅によるセルロースの改良糖化 |
RU2027760C1 (ru) | 1991-02-01 | 1995-01-27 | Казанский институт биологии | Способ получения жидких углеводородов |
TW261517B (zh) | 1991-11-29 | 1995-11-01 | Mitsubishi Shozi Kk | |
WO1995004134A1 (en) | 1993-08-02 | 1995-02-09 | Genencor International, Inc. | Method of reducing complex carbohydrates in fermentation products |
CA2118071C (en) | 1993-10-28 | 2004-09-14 | Rodney B. Croteau | Dna encoding limonene synthase from mentha spicata |
US5861271A (en) | 1993-12-17 | 1999-01-19 | Fowler; Timothy | Cellulase enzymes and systems for their expressions |
US5686276A (en) | 1995-05-12 | 1997-11-11 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Bioconversion of a fermentable carbon source to 1,3-propanediol by a single microorganism |
US5849970A (en) | 1995-06-23 | 1998-12-15 | The Regents Of The University Of Colorado | Materials and methods for the bacterial production of isoprene |
US8106260B2 (en) | 1996-04-12 | 2012-01-31 | The Board Of Trustees Of The University Of Kentucky | Chimeric isoprenoid synthases and uses thereof |
DE19629568C1 (de) | 1996-07-15 | 1998-01-08 | Fraunhofer Ges Forschung | Verfahren zur Herstellung von Isopren |
US6156517A (en) | 1997-01-17 | 2000-12-05 | The Scripps Research Institute | RNA binding protein and binding site useful for expression of recombinant molecules |
CA2736981A1 (en) | 1998-04-14 | 1999-10-21 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Process for producing isoprenoid compounds by microorganisms |
US6176176B1 (en) | 1998-04-30 | 2001-01-23 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Apparatus for treating cellulosic materials |
AR022383A1 (es) | 1998-09-18 | 2002-09-04 | Univ Kentucky Res Found | Sintasas |
US6268328B1 (en) | 1998-12-18 | 2001-07-31 | Genencor International, Inc. | Variant EGIII-like cellulase compositions |
US6442536B1 (en) | 2000-01-18 | 2002-08-27 | Praxair Technology, Inc. | Method for predicting flammability limits of complex mixtures |
WO2001058839A1 (en) | 2000-02-07 | 2001-08-16 | Eastman Chemical Company | Process to recover condensable gases from oxygen containing mixtures |
KR20010084864A (ko) | 2000-02-29 | 2001-09-06 | 김수언 | 개똥쑥의 아모파-4,11-디엔 합성효소, 이를 코딩하는유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터 및, 이발현벡터로 형질전환된 대장균 및 식물체 |
US6270739B1 (en) | 2000-06-16 | 2001-08-07 | Eastman Chemical Company | Process for the removal of carbon dioxide from 3,4-epoxy-1-butene process recycle streams |
EP2281890A1 (en) | 2000-07-31 | 2011-02-09 | Danisco US Inc. | Manipulation of genes of the mevalonate and isoprenoid pathways to create novel traits in transgenic organisms |
US6553689B2 (en) | 2000-09-24 | 2003-04-29 | 3M Innovative Properties Company | Vapor collection method and apparatus |
US6582914B1 (en) | 2000-10-26 | 2003-06-24 | Genencor International, Inc. | Method for generating a library of oligonucleotides comprising a controlled distribution of mutations |
CA2441594A1 (en) | 2001-03-22 | 2002-10-03 | Scentgene Pollination Ltd. | Method of enhancing entomophilous |
ATE513036T1 (de) | 2001-04-04 | 2011-07-15 | Danisco Us Inc | Entkoppelte anabole und katabole stoffwechselwege in wirtszellen |
RU2197461C2 (ru) | 2001-04-05 | 2003-01-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Еврохим-СПб-Трейдинг" | Способ получения изопрена |
EP1392824B1 (en) | 2001-06-06 | 2008-08-20 | DSM IP Assets B.V. | Improved isoprenoid production |
US6998471B2 (en) | 2001-07-25 | 2006-02-14 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Polynucleotides encoding an acetyl-CoA acetyltransferase from Hevea brasiliensis, related products, and methods |
US7172886B2 (en) | 2001-12-06 | 2007-02-06 | The Regents Of The University Of California | Biosynthesis of isopentenyl pyrophosphate |
US7192751B2 (en) | 2001-12-06 | 2007-03-20 | The Regents Of The University Of California | Biosynthesis of amorpha-4,11-diene |
JP2005523020A (ja) | 2002-04-22 | 2005-08-04 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 遺伝子工学のためのプロモーターおよびプラスミドシステム |
US20050287655A1 (en) | 2002-05-10 | 2005-12-29 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing mevalonic acid |
DE60335574D1 (de) | 2002-10-04 | 2011-02-10 | Du Pont | Verfahren zur biologischen herstellung von 1,3-propandiol mit hoher ausbeute |
US20040219629A1 (en) | 2002-12-19 | 2004-11-04 | Qiong Cheng | Increasing carotenoid production in bacteria via chromosomal integration |
FR2850101B1 (fr) | 2003-01-22 | 2007-03-02 | Michelin Soc Tech | Procede d'obtention d'une coupe c5 "fcc" enrichie en isoprene et polymerisation selective de l'isoprene a partir de cette coupe |
EP1862540B1 (en) | 2003-05-29 | 2011-09-14 | Genencor International, Inc. | Novel trichoderma genes |
ATE426662T1 (de) | 2003-06-12 | 2009-04-15 | Dsm Ip Assets Bv | Feedback resistante mevalonate kinase |
PL202927B1 (pl) | 2003-07-20 | 2009-08-31 | Carr Daniel R | Peptyd i kompozycja farmaceutyczna oraz ich zastosowania medyczne |
AU2004293789B2 (en) | 2003-11-21 | 2009-07-23 | Genencor International, Inc. | Expression of granular starch hydrolyzing enzymes in trichoderma and process for producing glucose from granular starch substrates |
WO2005078074A2 (en) | 2004-02-13 | 2005-08-25 | Novozymes A/S | Protease variants |
MXPA06013502A (es) | 2004-05-21 | 2007-03-01 | Univ California | Metodo para mejorar la produccion de compuestos isoprenoides. |
US7479565B2 (en) | 2004-06-18 | 2009-01-20 | Shell Oil Company | Process for the production of an olefin oxide, a 1,2-diol, a 1,2-diol ether, or an alkanolamine |
RU2004124226A (ru) | 2004-08-10 | 2006-01-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Использование фосфокетолазы для продукции полезных метаболитов |
JP4841562B2 (ja) | 2004-12-14 | 2011-12-21 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー.ブイ. | 改良型メバロネートキナーゼ |
JP4117350B2 (ja) | 2005-03-03 | 2008-07-16 | 富山県 | 機能改変フェニルアラニン脱水素酵素、およびこの酵素を用いた生体試料中のアミノ酸の分析方法 |
JP4446482B2 (ja) | 2005-08-10 | 2010-04-07 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | ユーカリ・モノテルペン合成酵素遺伝子 |
CN101384719B (zh) | 2006-02-14 | 2012-10-03 | 弗门尼舍有限公司 | 用于生成萜的方法和用于该方法的mep转化后的微生物 |
US8114645B2 (en) | 2006-05-19 | 2012-02-14 | The Regents Of The University Of California | Methods for increasing isoprenoid and isoprenoid precursor production by modulating fatty acid levels |
DK2024504T4 (da) | 2006-05-26 | 2023-02-27 | Amyris Inc | Fremstilling af isoprenoider |
KR101486087B1 (ko) | 2006-06-23 | 2015-01-26 | 다니스코 유에스 인크. | 다수의 특성들을 조작하는 부위 평가 라이브러리를 사용한 서열 및 활성 관계에 대한 체계적 평가 |
JP2008035831A (ja) | 2006-08-09 | 2008-02-21 | Nitta Ind Corp | 有用部分の生産性が高められた植物及びその作製方法 |
JP4986547B2 (ja) | 2006-09-04 | 2012-07-25 | 株式会社Adeka | 新規なアセトアセチルCoA合成酵素、それをコードするDNA配列、当該酵素の製造方法および当該酵素を利用したメバロン酸の製造方法 |
JP2008182950A (ja) | 2007-01-30 | 2008-08-14 | Hamamatsu Kagaku Gijutsu Kenkyu Shinkokai | 柑橘類酵素遺伝子調製方法 |
EP2152854A2 (en) * | 2007-05-01 | 2010-02-17 | Acidophil LLC | Methods for the direct conversion of carbon dioxide into a hydrocarbon using a metabolically engineered photosynthetic microorganism |
CN101784662B (zh) | 2007-06-06 | 2014-11-05 | 丹尼斯科美国公司 | 用于改善蛋白质特性的方法 |
US8025481B2 (en) | 2007-08-07 | 2011-09-27 | Foxworth Amy M Rodgers | Kit for decorating ceiling fan blades |
CN101896607A (zh) * | 2007-09-11 | 2010-11-24 | 蓝宝石能源公司 | 通过光合生物产生分子 |
US8309323B2 (en) * | 2007-11-13 | 2012-11-13 | Synthetic Genomics, Inc. | Dimethyloctane as an advanced biofuel |
CN102027124B (zh) | 2007-12-13 | 2015-11-25 | 丹尼斯科美国公司 | 用于生产异戊二烯的组合物和方法 |
WO2009100231A2 (en) | 2008-02-06 | 2009-08-13 | The Regents Of The University Of California | Short chain volatile isoprene hydrocarbon production using the mevalonic acid pathway in genetically engineered yeast and fungi |
JP2009207402A (ja) | 2008-03-04 | 2009-09-17 | Shizuokaken Koritsu Daigaku Hojin | 組換えサビネン合成酵素及びその利用 |
EP2279251A2 (en) | 2008-04-23 | 2011-02-02 | Danisco US Inc. | Isoprene synthase variants for improved microbial production of isoprene |
US7632995B2 (en) | 2008-05-09 | 2009-12-15 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of hybrid corn variety CH852179 |
JP5624980B2 (ja) | 2008-06-30 | 2014-11-12 | ザ・グッドイヤー・タイヤ・アンド・ラバー・カンパニーThe Goodyeartire & Rubber Company | 再生資源に由来するイソプレンの重合体 |
ES2716231T3 (es) | 2008-07-02 | 2019-06-11 | Danisco Us Inc | Procedimientos para producir isopreno |
CN201263286Y (zh) | 2008-08-08 | 2009-06-24 | 鸿富锦精密工业(深圳)有限公司 | 散热器固定组合 |
US20100184178A1 (en) | 2008-09-15 | 2010-07-22 | Zachary Quinn Beck | Increased isoprene production using mevalonate kinase and isoprene synthase |
MY156562A (en) | 2008-09-15 | 2016-02-26 | Danisco Us Inc | Increased isoprene production using the archaeal lower mevalonate pathway |
EP2337844A1 (en) | 2008-09-15 | 2011-06-29 | Danisco US Inc. | Reduction of carbon dioxide emission during isoprene production by fermentation |
ZA201102109B (en) | 2008-09-15 | 2013-10-30 | Goodyear Tire & Rubber | Conversion of prenyl derivatives to isoprene |
MY156588A (en) | 2008-09-15 | 2016-03-15 | Danisco Us Inc | Systems using cell culture for production of isoprene |
EP2382312A2 (en) | 2008-12-30 | 2011-11-02 | Danisco US Inc. | Methods of producing isoprene and a co-product |
US20100297749A1 (en) | 2009-04-21 | 2010-11-25 | Sapphire Energy, Inc. | Methods and systems for biofuel production |
US8518686B2 (en) | 2009-04-23 | 2013-08-27 | Danisco Us Inc. | Three-dimensional structure of isoprene synthase and its use thereof for generating variants |
JP4760951B2 (ja) | 2009-05-08 | 2011-08-31 | トヨタ自動車株式会社 | ブタノール生産能を有する組換え微生物及びブタノールの製造方法 |
TWI427149B (zh) | 2009-06-17 | 2014-02-21 | Danisco Us Inc | 使用dxp及mva途徑之改良之異戊二烯製造 |
TWI434921B (zh) | 2009-06-17 | 2014-04-21 | Danisco Us Inc | 從生物異戊二烯組合物製造燃料成分之方法及系統 |
BRPI1014137A2 (pt) | 2009-06-29 | 2015-08-25 | Univ Western Australia | Terpeno sintases de sândalo. |
IN2012DN01694A (zh) | 2009-09-15 | 2015-06-05 | Sapphire Energy Inc | |
SG181605A1 (en) | 2009-12-18 | 2012-07-30 | Danisco Us Inc | Purification of isoprene from renewable resources |
SG196782A1 (en) | 2009-12-23 | 2014-02-13 | Danisco Us Inc | Compositions and methods for the increased production of isoprene and other products with 6 - phosphogluconolactonase (pgl) |
US8871488B2 (en) | 2010-06-18 | 2014-10-28 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Recombinant host cells comprising phosphoketolases |
US9163263B2 (en) | 2012-05-02 | 2015-10-20 | The Goodyear Tire & Rubber Company | Identification of isoprene synthase variants with improved properties for the production of isoprene |
-
2011
- 2011-10-27 CN CN2011800628994A patent/CN103443271A/zh active Pending
- 2011-10-27 WO PCT/US2011/058188 patent/WO2012058494A2/en active Application Filing
- 2011-10-27 EP EP11802178.1A patent/EP2633043A2/en not_active Withdrawn
- 2011-10-27 CA CA2816306A patent/CA2816306A1/en not_active Abandoned
- 2011-10-27 US US13/283,564 patent/US9273298B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-10-27 BR BR112013010551A patent/BR112013010551A8/pt not_active IP Right Cessation
- 2011-10-27 JP JP2013536854A patent/JP2014502148A/ja active Pending
- 2011-10-27 SG SG2013032479A patent/SG190043A1/en unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008003078A2 (en) * | 2006-06-29 | 2008-01-03 | The Regents Of The University Of California | Short chain volatile hydrocarbon production using genetically engineered microalgae, cyanobacteria or bacteria |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105985972A (zh) * | 2015-02-10 | 2016-10-05 | 中国科学院微生物研究所 | 异戊二烯合成酶基因及其应用 |
CN105985975A (zh) * | 2015-02-10 | 2016-10-05 | 中国科学院微生物研究所 | 异戊二烯合成酶基因及其应用 |
CN105985977A (zh) * | 2015-02-10 | 2016-10-05 | 中国科学院微生物研究所 | 异戊二烯合成酶基因及其应用 |
CN105985976A (zh) * | 2015-02-10 | 2016-10-05 | 中国科学院微生物研究所 | 异戊二烯合成酶基因及其应用 |
CN105985974A (zh) * | 2015-02-10 | 2016-10-05 | 中国科学院微生物研究所 | 异戊二烯合成酶基因及其应用 |
CN105985973A (zh) * | 2015-02-10 | 2016-10-05 | 中国科学院微生物研究所 | 异戊二烯合成酶基因及其应用 |
CN105985977B (zh) * | 2015-02-10 | 2020-12-25 | 中国科学院微生物研究所 | 异戊二烯合成酶基因及其应用 |
CN107365758A (zh) * | 2016-05-12 | 2017-11-21 | 山东常青藤生物科技有限公司 | 五碳平台化合物合成基因及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
SG190043A1 (en) | 2013-06-28 |
BR112013010551A8 (pt) | 2018-07-03 |
WO2012058494A2 (en) | 2012-05-03 |
US20130045891A1 (en) | 2013-02-21 |
US9273298B2 (en) | 2016-03-01 |
JP2014502148A (ja) | 2014-01-30 |
CA2816306A1 (en) | 2012-05-03 |
WO2012058494A3 (en) | 2012-09-20 |
EP2633043A2 (en) | 2013-09-04 |
BR112013010551A2 (pt) | 2016-07-19 |
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Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103443271A (zh) | 用于增加异戊二烯产量的异戊二烯合酶变体 | |
US8173410B2 (en) | Isoprene synthase variants for improved microbial production of isoprene | |
Yang et al. | Bio-isoprene production using exogenous MVA pathway and isoprene synthase in Escherichia coli | |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20131211 |