PL202927B1

PL202927B1 - Peptyd i kompozycja farmaceutyczna oraz ich zastosowania medyczne

Info

Publication number: PL202927B1
Application number: PL361364A
Authority: PL
Inventors: Andrzej W. Lipkowski; Daniel R. Carr
Original assignee: Carr Daniel R; Lipkowski Andrzej W
Priority date: 2003-07-20
Filing date: 2003-07-20
Publication date: 2009-08-31
Also published as: WO2005007682A3; WO2005007682A2; PL361364A1

Description

Wynalazek dotyczy nowych peptydów oraz ich zastosowań medycznych. Opisane peptydy wykazują podobieństwo strukturalne do peptydów występujących w białkach budujących kapsyd białkowy lentiwirusów, zwłaszcza wirusa HIV i mogą znaleźć zastosowanie w produkcji nowych preparatów farmaceutycznych.

Celem wynalazku jest dostarczenie nowych związków, które wykazywałyby powinowactwo do receptorów opioidowych. Związki takie mogłyby by być wykorzystane do otrzymywania nowych leków, zwłaszcza preparatów przeciwbólowych. Szczególnie korzystne byłoby pozyskanie substancji, które wykazywałyby również inne właściwości terapeutyczne, np. mogły być wykorzystywane w terapii i profilaktyce zakażeń lentiwirusowych, zwłaszcza zakaż eń wirusem HIV. Wskazane jest także lepsze poznanie przebiegu infekcji wirusami tej grupy, co pozwoliłoby na zaproponowanie nowych metod i celów terapeutycznych.

Nieoczekiwanie tak określony cel został zrealizowany w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku są nowe peptydy zawierające następującą sekwencję aminokwasową w kierunku od N- do C-końca: A1A2A3A4A5A6A7A8A9 gdzie:

A1 jest wyeliminowany albo jest aminokwasem wybranym spośród Glu, Gln, Asp albo Asn,

A2 jest wyeliminowany albo jest aminokwasem wybranym spośród Ile, Leu, Thr albo Val,

A3 jest aminokwasem wybranym spośród Tyr albo nitrofenyloanaliny,

A4 oraz A5 jest takim samym lub różnym aminokwasem wybranym spośród Lys, ornityny albo Arg,

A6 jest aminokwasem wybranym spośród Trp, Phe, 1-naftyloalaniny albo 2-naftyloalaniny, A7, A8 albo A9 jest takim samym lub różnym aminokwasem wybranym spośród Ile, Leu, Thr albo Val, za wyjątkiem peptydu posiadającego sekwencję Glu-Ile-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu.

Określenie „jest wyeliminowany oznacza, że dany aminokwas może zostać pominięty w niektórych peptydach według wynalazku.

Korzystnie N-końcowa grupa aminowa A1 jest zablokowana, zwłaszcza poprzez podstawienie resztą acetylową albo dansylową. Równie korzystnie C-końcowa grupa karboksylowa jest zablokowana, zwłaszcza poprzez podstawienie grupą aminową.

Aminokwasy wchodzące w skład peptydu według wynalazku mogą występować w różnych postaciach odmian chiralnych, w szczególności rozważa się wykorzystanie izomerów R- albo S-aminokwasów na węglu alfa.

Przykładowe struktury peptydów według wynalazku zostały przedstawione na figurze 1.

Korzystnie, peptyd według wynalazku jest peptydem wybranym spośród:

Ac-Glu-Ile-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-LeuNH2

Ac-Gln-Ile-Tyr-Arg-Arg-Trp-Ile-Ile-GlnNH2

Ac-Asp-Ile-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-LeuNH2

DNS-Asn-Ile-Tyr-Arg-Arg-Phe-Ile-Ile-LeuNH2

Ac-Thr-Ile-Tyr-Lys-Lys-Phe-Ile-Ile-LeuNH2

Ac-Gln-Ile-Tyr-Orn-Orn-Npa-LeuNH2

DNS-Leu-Tyr-Arg-Arg-Phe-IleNH2

Ac-Val-Tyr-Lys-Arg-Phe-Ile-LeuNH2

DNS-Tyr-Lys-Lys-Phe-Leu-NH2

Synteza peptydów według wynalazku nie powinna stanowić żadnego problemu dla specjalisty znającego dostępne w stanie techniki metody syntezy peptydów.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie peptydów według wynalazku, jak zdefiniowano powyżej, do wytwarzania leku przeciwbólowego. Nieoczekiwanie odkryto, że peptydy według wynalazku wykazują wysokie powinowactwo do receptorów opioidowych występujących na powierzchni komórek nerwowych.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie związku wykazującego powinowactwo do receptora opioidowego, korzystnie receptora mu, do leczenia lub zapobiegania infekcjom przez lentiwirusy, zwłaszcza wirusa HIV.

Nieoczekiwanie odkryto, że peptydy według wynalazku wykazują podobieństwo strukturalne do fragmentów białek wchodzących w skład kapsydu białkowego lentiwirusów, w szczególności do białka p24 izolowanego z surowicy chorych zakażonych wirusem HIV. Białko p24 wchodzi w skład kapsydu białkowego opłaszczającego cząsteczkę RNA wirusa HIV. Dlatego, korzystnie jako związek wykazująPL 202 927 B1 cy powinowactwo do receptora opioidowego stosuje się peptyd według wynalazku, zdefiniowany powyżej.

Ujawniono również sposób leczenia lub zapobiegania zakażeniu lentiwirusem, charakteryzujący się tym, że pacjentowi wymagającemu takiej terapii podaje się lek zawierający związek wykazujący powinowactwo do receptora opioidowego, korzystnie receptora mu. Korzystnie, lentiwirusem jest wirus HIV. W szczególnej realizacji tego aspektu wynalazku jako związek wykazujący powinowactwo do receptora opioidowego stosuje się peptyd według wynalazku, jak zdefiniowano powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca czynnik aktywny i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny no ś nik charakteryzują ca się tym, ż e jako czynnik aktywny zawiera peptyd według wynalazku, zdefiniowany powyżej.

Dla lepszego zilustrowania istoty wynalazku oraz umożliwienia jego realizacji opis uzupełniony został figurami.

Na figurze 1 przedstawione zostały przykładowe peptydy według wynalazku.

Na figurze 2 przedstawiony został cykl „życiowy wirusa HIV-1: A. powszechnie znana droga infekcji przez dojrzałą postać wirusa (mature virus) obejmująca jego replikację (replication) w komórce zainfekowanej, B. alternatywny rozwój infekcji według wynalazku, w którym niedojrzała postać wirusa w formie kapsydu białkowego („mature capsid) ulega rozpoznaniu przez błonowy receptor infekowanej komórki, co pozwala na wniknięcie do jej wnętrza („internalisation) i replikację („replication).

Na figurze 3 przedstawiono wyniki eksperymentów polegających na badaniu aktywności peptydów pochodzących z białka p24 wobec receptorów opioidowych obecnych na błonach komórek nerwowych szczura. Szczegółowy opis podano w przykładzie 2.

P r z y k ł a d 1. Badanie powinowactwa do receptorów opioidowych

Badanie powinowactwa do receptorów opioidowych przeprowadzono metodą wypierania znakowanych selektywnych ligandów, która między innymi została opisana przez Aleksandra Misicka, Andrzej W. Lipkowski, Lei Fang, Richard J. Knapp, Peg Davis, Thomas Kramer, Thomas F. Burks, Henry I. Yamamura, Daniel Carr i Victor J. Hruby, artykule p.t. Topographical requirements for delta opioid ligands: Presence of a carboxyl group in position 4 is not critical for deltorphin high delta receptor affinity and analgesic activity opublikowanym w piśmie Biochemical and Biophysical Research Communication, wol. 180, str. 1290-1297, w roku 1991:

Dorosłe szczury szczepu Wistar o wadze w zakresie 250-350 g., były zabijane, a ich mózgi natychmiast wyjmowane i oziębiane na lodzie. Całe mózgi były homogenizowane. Homogenaty były trzymane przez 30 min w temperaturze 25°C, a następnie wirowane dwa razy po 15 min z szybkością 48000xg przed właściwym badaniem wiązania. Zasadnicze badanie prowadzono z zastosowaniem szybkiej metody filtrowania i radioligandów [3H]deltorfiny w badaniu powinowactwa do receptorów delta oraz [3H]naltrexonu w badaniu powinowactwa do receptorów mu. Do badania pobierano 10 mikrolitrów homogenatu, który inkubowano z 0.75 nanomolami odpowiedniego radioliganda, oraz uzupełniano objętość próbki do 1 ml buforem TRIS o pH 7.4 zawierającego 5 mmolarny roztwór MgCl2, albuminę surowicy wołowej (1 mg/mL) oraz fluorek fenylometanosulfonowy (100 mikroL). Do próbki dodawano odpowiednią ilość badanego związku i inkubowano przez trzy godziny w 25°C. Następnie błony komórkowe filtrowano i przemywano roztworem soli. Sączki przenoszono do roztworu scyntylacyjnego i mierzono radioaktywność. Jako wiązanie specyficzne przyjmowano zmianę całkowitej radioaktywności błon komórkowych tylko z radioligandem i tej, która pozostawała po zastosowaniu jako wypierającego związku 10 mikromoli chlorowodorku naltrexonu. Z uzyskanych danych radioaktywności poszczególnych próbek i stężenia badanych próbek, wyznaczano wartości IC50, to znaczy stężenia badanych związków, które zdolne są do wyparcia w 50% radioligand z miejsc wiążących w receptorach. Uzyskane wyniki, porównywalne z wartościami znanymi dla związków opioidowych, przedstawiono w tabeli 1.

T a b e l a 1.

Nr	Związek	Powinowactwo, IC50 (stężenie mikromolarne)
Receptory mu	Receptory delta
1	2	3	4
1	Ac-Glu-Ile-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-LeuNH₂	1,2	>50
2	Ac-Gln-Ile-Tyr-Arg-Arg-Trp-Ile-Ile-GlnNH₂	0.7	>50

PL 202 927 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4
3	Ac-Asp-Ile-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-LeuNH₂	0,8	>50
4	DNS-Asn-Ile-Tyr-Arg-Arg-Phe-Ile-Ile-LeuNH2	0,6	>50
5	Ac-Thr-Ile-Tyr-Lys-Lys-Phe-Ile-Ile-LeuNH2	1,5	>50
6	Ac-Gln-Ile-Tyr-Orn-Orn-Npa-LeuNH2	0,5	>50
7	DNS-Leu-Tyr-Arg-Arg-Phe-IleNH2	0.8	2,0
8	Ac-Val-Tyr-Lys-Arg-Phe-Ile-LeuNH2	0,9	2,5
9	DNS-Tyr-Lys-Lys-Phe-Leu-NH₂	>50	0,13
	morfina	0,025	0,01

Npa - skrót reszty L-2-naftyloalaniny

P r z y k ł a d 2.

Powszechnie uznaje się [1], że wirus HIV wnika do ludzkich komórek (np. limfocytów T) poprzez oddziaływanie z receptorem CD4 i dodatkowym koreceptorem powierzchniowym (Figura 2 A). Mechanizm ten nie tłumaczy jednak infekowania komórek nie posiadających takich receptorów powierzchniowych (np. neurony). Nieoczekiwanie okazało się, że peptydy według wynalazku występują w białkach kapsydowych wielu lentiwirusów. W oparciu o badania porównawcze znanych sekwencji białkowych zidentyfikowano motyw strukturalny o ogólnym wzorze -AA-Tyr-AA2-Arg/Lys-Trp/Phe- który występuje w peptydach według wynalazku oraz w białkach kapsydowych lentiwirusów (tabela 2).

T a b e l a 2.

Motyw opioidowy zidentyfikowany w białku p24 wirusów HIV-1, HIV-2 i SIV (zlokalizowany w białku Gag ok. 255 pozycji aminokwasowej)

Peptydowy motyw strukturalny	Szczep wirusa
GEIYKRWIILG	GAG HV1A2; HV1BI; HV1B5; HV1BR; HV1C4; HV1H2; HV1J3; HV1JR; HV1LW; HV1N5; HV1ND; HV10Y; HV1PV; HV1RH; HV1W2; HV1Y2
GEIYKRWIIVG	GAG_HV1EL
GDIYKRWIILG	GAG_HV1MA
GDIYRRWIILG	GAG_HV1U4
GNIYRRWIQIG	GAG HV2BE; HV2CA; HV2D1; HV2G1; HV2KR; HV2SB; HV2RO; HV2NZ
GNIYRRWIQLG	GAG_HV2D2; SIVM1; SIVMS; SIVS4; SIVSP
GSIYRRWIQIG	GAG_HV2ST;
GAIYRRWIILG	GAG_SIVA1; SIVAG; SIVAT
GDVYRRWVILG	GAG_SIVCZ
GNIYRRWIQLR	GAG_SIVMK
GTIYKSWIILG	GAG_SIVGB

W celu eksperymentalnego zweryfikowania hipotezy, że również motywy strukturalne występujące w białkach kapsydowych lentiwirusów mogą oddziaływać z receptorem opioidowym, stosując powszechnie znane techniki zsyntetyzowano peptydy zaprezentowane w tabeli 2. Dla symulowania wewnątrzbiałkowej lokalizacji tych peptydów Gly(1) i Gly(11) zostały zastąpione odpowiednio grupą acetylową i amidową. Przeprowadzono testy powinowactwa syntetycznych peptydów do receptorów

PL 202 927 B1 opioidowych występujących w homogenatach mózgu szczura (metodyka - patrz przykład 1). Stwierdzono, że wszystkie syntetyczne peptydy wykazują wysokie powinowactwo do receptora mu na poziomie od 0,5 do 1,5 mikromola, nie wykazując wysokiego powinowactwa do receptorów delta (powyżej 50 mikromoli).

Badano także efektywność funkcjonalną oddziaływania peptydów według wynalazku z receptorami opioidowymi poprzez pomiar stymulacji do wiązania [³⁵S]GTP. Eksperymenty przeprowadzono dla dwóch wybranych peptydów AC-AIYRRWIILK-NH2 (I) oraz Ac-SYRRWIIL-NH2 (II). Obydwa peptydy wykazywały aktywność potwierdzającą ich zdolność do występowania w roli agonisty (figura 3). Peptyd I oraz peptyd II podawany w ilościach odpowiadających 5 mg białka wykazywały znaczącą aktywość przeciwnocyceptywną po dooponowym podawaniu szczurom eksperymentalnym. Związki podawano w postaci kompleksów z cyklodektranem ze względu na ich niską rozpuszczalność w roztworach wodnych. Nieoczekiwanie, ich działanie stymulacyjne nie było blokowane poprzez podawanie naloksanu (fig. 3B), co może sugerować dodatkowego receptora oddziałującego z peptydami, innego receptor opioidowy.

Reasumując, można uznać, że peptydy według wynalazku mogą znaleźć zastosowanie nie tylko jako środki przeciwbólowe, lecz również leki do leczenia zakażeń letiwirusowych, zwłaszcza HIV. Znane w stanie techniki dane nie pozwalały wytłumaczyć zakażeń wirusem HIV obserwowanych dla komórek nie posiadających CD4 i/lub koreceptora (np. komórki nerwowe). Dopiero dane zaprezentowane w niniejszym wynalazku pozwalają zaproponować istnienie alternatywnej drogi zakażeń wirusem HIV. Nieoczekiwanie stwierdzono, że niektóre motywy białkowe występujące w białku p24 mogą skutecznie oddziaływać z opioidowymi i innymi powierzchniowymi receptorami komórek nerwowych. Białko p24 jest identyfikowane w surowicy pacjentów zakażonych wirusem HIV. Często poziom tego białka jest lepiej skorelowany z postępem choroby [5] niż obserwowany poziom wirusów HIV (oceniany w oparciu o poziom białek otoczki lipidowej). Wcześniejsze badania [6] dowodzą, że białko p24 może indywidualnie tworzyć kapsydy z RNA. Wykrycie oddziaływania pomiędzy białkiem p24, a receptorem opioidowym i ewentualnie innym, nie zidentyfikowanym dotychczas receptorem powierzchniowym pozwala zaproponować alternatywną drogę przenikania RNA wirusa HIV do infekowanych komórek (Figura 2B) i wytłumaczyć opisane powyżej zjawiska towarzyszące rozwojowi infekcji. Zaprezentowane wyniki pozwalają uznać, że kapsyd p24 nieopłaszczony otoczką lipidowo-białkową jest również czynnikiem wirulentnym, zwłaszcza w ciele osobnika zakażonego (otoczka lipidowa dojrzałego wirusa powinna zwiększać jego stabilność w środowisku). Ponieważ białko p24 prezentuje inne elementy strukturalne na powierzchni kapsydu, niż elementy obecne na powierzchni dojrzałego wirusa, należy przypuszczać, że umożliwi ono oddziaływanie z innymi receptorami błonowymi (np. receptor opioidowy), a przez to nowe drogi infekcji. Ponieważ kapsyd p24 jest dużo mniejszy niż dojrzały wirus prosty mechanizm pinocytozy kompleksu receptor powierzchniowy - kapsyd może być wykorzystany do przenikania do wnętrza infekowanej komórki.

Zaproponowany nowy mechanizm rozwoju zakażeń powodowanych przez lentiwirusy udostępnia nowe możliwości rozwoju terapii zakażeń takimi wirusami. Może to być terapia AIDS, ale również leczenie innych chorób towarzyszących zakażeniom lentiwirusowym np. leczenie nowotworów. Wszystkie z elementów uczestniczących w zaproponowanym mechanizmie są potencjalnymi celami terapeutycznymi, które mogą być wykorzystane do projektowania nowych leków.

Jednak przede wszystkim, zaprezentowany wynalazek wskazuje na nowe zastosowanie ligandów opioidopodobnych w zapobieganiu i terapii chorób wywoływanych przez zakażenia lentiwirusami, takich jak AIDS. Poniższe publikacje stanowią uzupełnienie opisu:

1. Kilby J.M., Eron, J.J., N. Engl. J. Med. 348, 2228-2238 (2003).

2. Tang, J.L., Lipkowski, A.W., Specter, S., Int. J. Immunopharmacol. 20, 457-466 (1998).

3. Peterson, P.K., Gekker, G., Lokensgoral, J.R., Bidlack, J.M., Chang, A.C., Fang, X., Portoghese, P.S., Biochem Pharmacol. 61, 1145-1151 (2001).

4. Misicka, A., Lachwa, M., Carr, D.B., Hruby, V.J., Yoshikawa, M., Lipkowski, A.W., Proc. Opioid Mimetic Analgesics 2002 (Y. Okada, L.H. Lazarus, eds.), Kobe 2002, pp. 53-54.

5. Ofori, H., Prokop, J., Jagodziński, P.P., Biomed. Pharmacother. 57, 15-19 (2003).

6. Gross, I., Hohenberger, H., Wilk, T., Wiegers, K., Grattinger, M., Muller, B., Fuller, S., Krausslich, H.G., EMBO J. 19, 103-113 (2000).

Claims

1. Peptyd zawierający sekwencję: A1A2A3A4A5A6A7A8A9, gdzie:

A3 jest aminokwasem wybranym spośród Tyr albo nitrofenyloanaliny,

A4 oraz A5 jest takim samym lub różnym aminokwasem wybranym spośród Lys, ornityny albo Arg, A6 jest aminokwasem wybranym spośród Trp, Phe, 1-naftyloalaniny albo 2-naftyloalaniny,

A7, A8 albo A9 jest takim samym lub różnym aminokwasem wybranym spośród Ile, Leu, Thr albo Val,

Za wyjątkiem peptydu posiadającego sekwencję Glu-Ile-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-Leu.

2. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że N-końcowa grupa aminowa Al jest zablokowana, zwłaszcza poprzez podstawienie resztą acetylową albo dansylową.

3. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że C-końcowa grupa karboksylową jest zablokowana, zwłaszcza poprzez podstawienie grupą amidową.

4. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że posiada strukturę przedstawioną naturze 1.

5. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest peptydem wybranym spośród:

Ac-Gln-Ile-Tyr-Arg-Arg-Trp-Ile-Ile-GlnNH2

Ac-Asp-Ile-Tyr-Lys-Arg-Trp-Ile-Ile-LeuNH2

DNS-Asn-Ile-Tyr-Arg-Arg-Phe-Ile-Ile-LeuNH2

Ac-Thr-Ile-Tyr-Lys-Lys-Phe-Ile-Ile-LeuNH2

DNS-Gln-Ile-Tyr-Orn-Orn-Npa-LeuNH2

Ac-Leu-Tyr-Arg-Arg-Phe-IleNH2

Ac-Val-Tyr-Lys-Arg-Phe-Ile-LeuNH2

DNS-Tyr-Lys-Lys-Phe-Leu-NH2.

6. Zastosowanie peptydu określonego w zastrz. 1 - 5 do wytwarzania leku przeciwbólowego.

7. Zastosowanie peptydu określonego w zastrz. 1 - 5 wykazującego powinowactwo do receptora opioidowego do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania iniekcji lentiwirusem.

8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że receptorem opioidowym jest receptor mu.

9. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że lentiwirusem jest wirus HIV.

10. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca czynnik aktywny i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako czynnik aktywny zawiera peptyd określonego w 1 - 5.

11. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia lub zapobiegania zakażeniu lentiwirusem albo chorób z nim związanych zawierająca czynnik aktywny i ewentualnie farmaceutycznie rozpuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako czynnik aktywny zawiera wykazujący powinowactwo do receptora opioidowego peptyd określonego w zastrz. 1 - 5.