CN107365758A - 五碳平台化合物合成基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种五碳平台化合物合成基因及其应用，其解决了利用工程菌合成异戊二烯效率不高的技术问题，本发明提供了一种五碳平台化合物合成基因、其表达的蛋白质、含有五碳平台化合物合成基因的原核表达载体及工程菌以及产异戊二烯工程菌的制备方法及应用。本发明可广泛用于异戊二烯制备领域。

Description

五碳平台化合物合成基因及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种五碳平台化合物合成基因及其应用。
背景技术
自然界中,异戊二烯主要是由某些植物叶片排放至大气中的，而工业生产中，目前异戊二烯主要是由石油裂解物C5馏分萃取蒸馏而来。然而随着石油资源日益枯竭及不可再生，天然植物释放的异戊二烯收集又事倍功半，通过微生物工程菌生产异戊二烯成为一种可持续发展的必然趋势。
据报道，每年植物释放到大气中的异戊二烯达到5百万吨，细菌自身又不具有异戊二烯合成酶基因，因此植物是异戊二烯合成酶(ISPS)很好来源。利用基因工程技术开展异戊二烯合成酶基因研究已取得了一些进展，研究人员分离鉴定得到了少量的异戊二烯合成酶基因，但国内尚未有这方面的报道。
2000年，Miller B首次在杨树(白杨×颤杨)中获得了全长IspS基因，并且在大肠杆菌中得到了7.7nmol/mgDCW的异戊二烯(Miller B et al.Planta.2001 213(3):483-7)；2005年,Sasaki克隆得到了白杨的IspS基因(Sasaki K et al.FEBS Lett.2005 579(11):2514-8)；Thomas D.Sharkey于2005年克隆得到蒙大拿葛IspS cDNA全长(Sharkey TD etal.Plant Physiol.2005 137(2):700-12.)，随后又扩充了数个杨柳科IspS基因，并且得到了刺槐的IspS cDNA全长序列(Sharkey TD et al,Evolution 2013 67(4):1026-1040)。
可见国内外目前获得的异戊二烯合成酶大多限于杨柳科和豆科植物，豆科植物关于五碳平台化合物合成基因的研究主要集中在葛根、刺槐上,杨柳科的相关研究主要集中在杨属，而在禾本科芦苇中并无研究报道，基因库中也没有芦苇五碳平台化合物合成基因。
发明内容
本发明就是为了解决利用工程菌合成异戊二烯效率不高的技术问题，提供一种具有较高合成效率的五碳平台化合物合成基因及应用。
为达到上述目的，一种五碳平台化合物合成基因，其是如下(a)或(b)的基因：(a)所述基因cDNA的核苷酸序列如序列表的序列1所示；(b)所述基因是编码如下蛋白质的基因：序列表的序列2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有异戊二烯合成酶活性的由序列表的序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质衍生的蛋白质。
本发明同时提供一种五碳平台化合物合成基因表达的蛋白质，其是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在(a)中的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有异戊二烯合成酶活性的由(a)衍生的蛋白质；序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质是由序列表的序列1所示碱基序列编码。
本发明还提供一种五碳平台化合物合成基因的原核表达载体。
本发明还提供五碳平台化合物合成基因原核表达载体的产异戊二烯工程菌。
本发明同时提供产异戊二烯工程菌在制备异戊二烯中的应用。
本发明的有益效果：根据植物在自然界异戊二烯的释放速率，本发明选择了释放量较高的芦苇五碳平台化合物合成基因进行了分离鉴定和克隆，成功构建异戊二烯生产菌株，为生物法生产异戊二烯寻找到一个高效的异戊二烯合成酶。本发明利用基因工程手段，克隆得到了芦苇基因PaIspS，应用到大肠杆菌中，使用气相色谱进行检测，大肠杆菌具备生产异戊二烯的能力，本发明对于使用微生物进行异戊二烯大规模工业生产提供了一个高效有效的酶。
附图说明
图1是芦苇总RNA的琼脂糖电泳结果；
图2是芦苇PaIspS基因片段的琼脂糖电泳结果；
图3是芦苇PaIspS基因3’-RACE的琼脂糖电泳结果；
图4是芦苇PaIspS基因5’-RACE的琼脂糖电泳结果；
图5是芦苇PAISPS氨基酸序列BlastP分析结果图；
图6是RACE原理图；
图7是芦苇PAISPS蛋白在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE结果；
图8是异戊二烯标准品的气相色谱结果；
图9是芦苇PaIspS基因在大肠杆菌中应用的气相检测结果；
图10是芦苇PAISPS蛋白经过取代突变之后在大肠杆菌中应用的气相检测结果；
图11是芦苇PAISPS蛋白经过添加突变之后在大肠杆菌中应用的气相检测结果；
图12是芦苇PAISPS蛋白经过缺失突变之后在大肠杆菌中应用的气相检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，大肠杆菌BW25113(Baba T et al.Mol Syst Biol.2006；2:2006.0008.)是一株非病原菌，遗传背景清楚，世代时间短、容易培养且培养基原料低廉。大肠杆菌BW25113公众可从中国科学院微生物研究所获得，以上所述生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1：基因片段的获得
1.提取芦苇叶片总RNA
采集芦苇叶片，使用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen公司)提取杨树叶片总RNA，按照试剂盒说明方法进行，进行电泳(图1)验证RNA提取质量，可见RNA完整性良好，可以进行后续实验。
2.RT-PCR
以Oligo(dT)20做为反转录引物，按照反转录试剂盒SuperScript.III First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen公司)说明将核酸反转录为cDNA；
反应体系如下：
RNA 1μg
10mM dNTP 1μl
Oligo(dT)20(0.5μg/μl) 1μl
65℃5min，置于冰上1min，加入下面的10μl的mix
50℃50min，85℃15min加入1μl RNase H，37℃20min
反应完毕，加入100μl水稀释cDNA，得到cDNA第一链。
3.简并引物设计
根据杨柳科及豆科植物的已知氨基酸序列的保守区，并且参考所有已知IspS的核酸序列及单萜合成酶的核酸序列设计的简并引物PAF1及PAR1：
PAF1：5'TAYAACACNATCAAYGARAT 3'
PAR1：5'YTGRTANGTGCARTGNGA 3'
4.简并PCR反应
反应体系
反应条件：
扩增出672bp左右的片段(图2)，扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶上电泳，产物单一明亮。
备注：所示明亮单一条带为PAF1和PAR1引物组扩增产物，Marker为TAKARA 100bpDNA Ladder。
5.连接T载体，Sanger测序
将单一明亮的条带回收，连接PMD18-T(TAKARA公司)载体，转化至trans5α(TransGen公司)感受态细胞，第二天选择白斑进行验证，选取阳性克隆，送至生工Sanger测序。
6.测序及序列分析，
测序结果氨基酸序列经过Blast，与高粱(Sorghum bicolor)的假想蛋白有达到62％的同源性，与二穗短柄草(Brachypodium distachyon)的月桂烯合成酶有64％的同源性：可以证明此序列为禾本科IspS基因,此片段命名为PaIspS基因片段，序列如SEQ IDNo.3所示。
核酸序列进行翻译后氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
实施例2：PaIspS基因编码区全长的获得
获得cDNA全长的方法为SMARTer-RACE，使用PCR cDNA Synthesis Kit(Clontech公司)进行，以下使用的引物及试剂除GSP均为PCR cDNA SynthesisKit内提供，按照试剂盒说明方法进行。
1.RACE-Ready cDNA的制备
RACE-Ready cDNA第一链的反转录体系如下：
2.基因特异性引物的设计：
根据已经获得的PaIspS片段的序列设计基因特异性引物(GSP)，RACE-Ready cDNA做模版，GSP及通用引物(Universal Primer Mix，UPM)做引物进行扩增，可以得到3’-RACEcDNA片段及5’-RACE cDNA片段。引物位置如图6所示,中间黑色部分为简并PCR获得序列，两侧黑色部分为通用引物序列，白色部分为需要得到的未知序列部分。
共8个GSP序列，如下表：
3.3’-RACE cDNA末端序列的获得
使用芦苇的3’-RACE-Ready cDNA为模版，UPM与GSP为引物进行扩增
反应体系：
反应条件：
3’-RACE的琼脂糖凝胶检测结果如图(图3)：
得到一个单一明亮的芦苇DNA扩增条带，连接T载体，转化感受态细胞，挑选阳性克隆Sanger测序，得到3’端cDNA序列。
4.5’-RACE cDNA末端序列的获得
使用芦苇的5’-RACE-Ready cDNA为模版，UPM与GSP为引物进行扩增.
反应体系：
反应条件：
5’-RACE的琼脂糖凝胶检测结果如图(图4)：
由图可见得到单一明亮的扩增条带，选择其一连接T载体，转化感受态细胞，挑选阳性克隆Sanger测序，得到5’端cDNA序列。
5.全长序列的获得
根据3’-RACE及5’-RACE测序结果，进行序列比对，得到该基因cDNA全长序列(SEQID No.1所示序列)，对DNA、氨基酸序列进行分析：该基因有1824bp，编码607个氨基酸，有ATG起始密码子和TGA终止密码子，说明该基因的完整性；其编码的氨基酸含有一个IspS高度保守标签序列DDXXD区域，同时也包含了RRX8W保守区域。利用BLAST软件在NCBI中进行同源比对，结果如图5，显示该基因为Isoprenoid_Biosyn_C1 superfamily成员，与二穗短柄草(Brachypodium distachyon])Alpha-terpineol synthase(alpha-松油醇合成酶)同源性为58％，与节节麦(Aegilops tauschii)的月桂烯合成酶有56％同源性，与乌拉图小麦(Triticum urartu)的月桂烯合成酶有53％同源性，说明我们得到的是禾本科异戊二烯合成酶基因，简写为PaIspS基因，得到了编码PAISPS蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No.2所示序列)。
实施例3：大肠杆菌异戊二烯生产菌株的构建
全长引物PAFa及PARa序列如下：
PAFa：5'ATTAACCATGGTGCAGATGACGGCGTCGAAGC 3'
PARa：5'ATATGGTACCCTAGTTCCGAGGCAGCAAAATGTTT 3'
1.大肠杆菌表达载体pBAD-PaIspS构建
将使用引物PAFa及PARa获得的PaIspS基因片段进行NcoI和KpnI(TAKARA公司)双酶切，并将pBAD-HisB表达载体(购自Invitrogen公司)进行NcoI和KpnI双酶切，PaIspS基因连接至pBAD-HisB载体后转化至trans5α感受态细胞，选取阳性克隆进行测序，pBAD-PaIspS的核苷酸序列是SEQ ID No.5。
2.异戊二烯生产菌株MV/pPaIspS的构建
将构建好的pBAD-PaIspS与质粒p1及p2共转化至BW25113宿主得到异戊二烯生产菌株MV/pPaIspS。
并且构建对照菌株MV/pBAD,方法为将pBAD-HisB与质粒p1及p2共转至BW25113宿主，得到无异戊二烯合成酶基因的对照菌株MV/pBAD。
上述异戊二烯生产菌的构建方法中，p1，p2包含异戊二烯合成途径-甲羟戊酸(MVA)途径基因。其中p1由MvaE(乙酰辅酶A乙酰转移酶)基因、MvaS(HMG-乙酰辅酶A合成酶)基因及MVK(甲羟戊酸激酶)基因组成，所述MvaE基因编码由SEQ ID No.8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述MvaS基因编码由SEQ ID No.9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述MVK基因编码由SEQ ID No.10所示的氨基酸序列组成的蛋白质。p2由PMK(磷酸甲羟戊酸激酶)基因、MVD(焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶)基因及idi(异戊二烯焦磷酸异构酶)基因组成，所述PMK基因编码由SEQ ID No.11所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述MVD基因编码由SEQ IDNo.12所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述idi基因编码由SEQ ID No.13所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
其中，p1为链霉素抗性阿拉伯糖诱导型表达载体，p1的核苷酸序列是SEQ IDNo.6，包含MVA上游途径基因表达盒，MVA上游途径基因表达盒的核苷酸序列是SEQ ID No.6的第1307-5821位，SEQ ID No.6的第89-964位为阿拉伯糖启动子，SEQ ID No.6的第5930-6087位为TrrnB终止子，SEQ ID No.6的第1307-3729位是MvaE基因的编码序列，SEQ IDNo.6的第3730-4904位是MvaS基因的编码序列，SEQ ID No.6的第4905-5821位是MVK基因的编码序列。
P2为氯霉素抗性阿拉伯糖诱导型表达载体，p2的核苷酸序列是SEQ ID No.7，包含MVA下游途径基因表达盒，MVA下游途径基因表达盒的核苷酸序列是SEQ ID No.7的第1309-4442位，SEQ ID No.6的第89-964位为阿拉伯糖启动子，SEQ ID No.6的第4569-4726位为TrrnB终止子，SEQ ID No.6的第1309-2661位是PMK基因的编码序列，SEQ ID No.6的第2677-3864位是MVD基因的编码序列，SEQ ID No.6的第3894-4442位是idi基因的编码序列。
实施例4：PaIspS基因在大肠杆菌中的应用
1、ISPS蛋白表达
上述大肠杆菌工程菌MV/pPaIspS，使用L-arab诱导之后，蛋白表达结果SDS-PAGE如图所示(图7)，可见不含异戊二烯合成酶的大肠杆菌宿主本身不表达异戊二烯合成酶ISPS，PaIspS基因的转入使宿主细胞表达ISPS蛋白。
备注：图为PAISPS蛋白在大肠杆菌工程菌中表达情况。
2、大肠杆菌发酵产物的检测
将上述2个菌株进行发酵，方法如下：将工程菌以百分之一的接种量转接到30mL(500mL三角瓶)含有链霉素、氯霉素及氨苄抗性的阿拉伯糖自诱导培养基(ZYM)中，30℃，280rpm培养20h后。4℃，4000rpm离心收集菌液，用含有4％葡萄糖的M9培养基重悬至60OD菌体浓度，取1mL重悬菌液置于20mL顶空瓶内，37℃，280rpm震荡培养30h。
含有链霉素、氯霉素及氨苄的自诱导培养基自诱导培养基ZYM配方如下：100mL A+2mL B+2mL C+200μL D+100μL E(以下均为质量百分比浓度)；
A.ZY：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉；
B.50×M：1.25M Na2HPO4，1.25M KH2PO4，2.5M NH4Cl和0.25M Na2SO4；
C.50×5052：25％甘油，2.5％葡萄糖，10％乳糖；
D.1M MgSO4；
E.1000×微量元素：50Mm FeCl3，20mM CaCl2，10mM MnCl2，10mM ZnSO4，CoCl2、NiCl2、Na2Mo4、Na2SeO3和H3BO3各2mM；
链霉素:终浓度50mg/L、氯霉素终浓度34mg/L、氨苄终浓度100mg/L。
M9培养基配方如分子克隆实验指南(科学出版社)第三版1595页所示。
反应结束后，进行气相色谱(GC)分析，使用的气相色谱分析仪为Agilent 7890AGC Sysytem及Agilent7697A headspace Sampler顶空进样器，气相分离柱为HP-5。顶空取样方法如下，Time：GC cycle time 20min，Vial equib time 6min；Temperature(℃)：Oven51,Loop/Valve 55,Transfer line 60。GC方法如下：流速：2mL/min，0min～4min 50℃，4min～8.5min 50～280℃，8.5min～10.6min 280℃。
此方法下异戊二烯标准品(Sigma公司)出峰时间为1.75min(图8)，大肠杆菌工程菌MV/pPaIspS及阴性对照菌株MV/pBAD的GC色谱图(图9)，可见MV/pPaIspS在1.75min的保留峰，而对照没有。可见未加入PaIspS基因的菌株不具备异戊二烯生产能力，转入PaIspS基因后使得大肠杆菌具备了生产异戊二烯的能力，大肠杆菌中产量可达860mg/L。
实施例5：经过氨基酸突变的PAISPS蛋白在大肠杆菌中的应用
对PAISPS蛋白进行取代、添加和缺失突变，使用实施例3构建的pBAD-PaIspS为模版，按照Fast Mutagenesis System(TransGen公司)试剂盒说明进行突变。
1、PAISPS蛋白的氨基酸突变
氨基酸的取代突变：将53位氨基酸T突变为A，即将核酸序列157-159位的ACG突变为GCG，使用突变引物为1F和1R；
氨基酸的添加突变：53位氨基酸T后面添加一个氨基酸A，即将核酸序列159位之后添加GCG碱基，使用的突变引物为2F和2R；
氨基酸的缺失突变：将53位氨基酸T去掉，即将核酸序列157-159位碱基ACG去掉，使用的突变引物为3F和3R。
突变引物序列如下：
编号 序列
1F CCGGCAATGCGGGTGCAGATGGCGGCGTCGAAGCAGTTTCAGTCTC
1R GAGACTGAAACTGCTTCGACGCCGCCATCTGCACCCGCATTGCCGG
2F CCGGCAATGCGGGTGCAGATGACGGCGGCGTCGAAGCAGTTTCAGTCTC
2R GAGACTGAAACTGCTTCGACGCCGCCGTCATCTGCACCCGCATTGCCGG
3F CCGGCAATGCGGGTGCAGATGGCGTCGAAGCAGTTTCAGTCTC
3R GAGACTGAAACTGCTTCGACGCCATCTGCACCCGCATTGCCGG
备注：有下划线碱基为突变碱基
PCR体系
PCR条件
电泳检测
取10μl PCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测。
观察到目的条带大小正确，可用DMT酶消化及转化反应。
PCR产物的消化
加1μl DMT酶于PCR产物中，混匀，37℃孵育1h。
转化
a.加入2-5μl DMT酶消化产物于50μl DMT感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入产物)，轻弹混匀，冰浴30分钟。
b.42℃准确热激45秒，立即置于冰上2min。
c.加250μl平衡至室温的SOC，225转，37℃培养1小时。
d.取200μl菌液铺板，培养过夜(为得到较多的克隆，4000rpm离心1min，弃掉部分上清，保留100-150μl，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜)
用对照质粒模板(4.5Kb)检验突变效率，在含氨苄的平板上涂8μl500mM IPTG，40μl 40mg/mlX-gal，突变成功的菌落呈蓝色。
挑选蓝色菌落进行质粒抽提(Plasmid Mini Kit 1，OMEGA公司)，Sanger测序。得到正确突变克隆，取代突变株命名为pBAD-PaIspSc1，添加突变株命名为pBAD-PaIspSc2，取代突变株命名为pBAD-PaIspSc3。
2、异戊二烯生产菌株MV/pPaIspSc的构建
将构建好的pBAD-PaIspSc1与质粒p1及p2共转化至BW25113宿主得到异戊二烯生产菌株MV/pPaIspSc1；
将构建好的pBAD-PaIspSc2与质粒p1及p2共转化至BW25113宿主得到异戊二烯生产菌株MV/pPaIspSc2；
将构建好的pBAD-PaIspSc3与质粒p1及p2共转化至BW25113宿主得到异戊二烯生产菌株MV/pPaIspSc3。
3、大肠杆菌发酵产物的检测
具体检测方法同实施例4所述方法。MV/pPaIspSc1得到的气相检测结果如图10，MV/pPaIspSc2得到的气相检测结果如图11，MV/pPaIspSc3得到的气相检测结果如图12所示，可见MV/pPaIspSc1、MV/pPaIspSc2及MV/pPaIspSc3菌株同样具备生产异戊二烯的能力，产量分别达到480mg/L，360mg/L及260mg/L。

Claims (5)

1.一种五碳平台化合物合成基因，其特征是如下(a)或(b)的基因：
(a)所述基因cDNA的核苷酸序列如序列表的序列1所示；
(b)所述基因是编码如下蛋白质的基因：序列表的序列2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有异戊二烯合成酶活性的由序列表的序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的五碳平台化合物合成基因表达的蛋白质，其特征是如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)在(a)中的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有异戊二烯合成酶活性的由(a)衍生的蛋白质；
所述序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质是由序列表的序列1所示碱基序列编码。
3.一种含有如权利要求1所述五碳平台化合物合成基因的原核表达载体。
4.一种含有如权利要求3所述五碳平台化合物合成基因原核表达载体的产异戊二烯工程菌。
5.如权利要求4所述的产异戊二烯工程菌在制备异戊二烯中的应用。
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