CN106755044A - 高效产氢功能基因载体pET32a‑fdhF及其构建和应用 - Google Patents

高效产氢功能基因载体pET32a‑fdhF及其构建和应用 Download PDF

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Abstract

高效产氢功能基因载体pET32a‑fdhF及其构建和应用涉及基因工程技术领域。pET32a‑fdhF基因载体为包含有蜡状芽孢杆菌甲酸脱氢酶fdhF基因的pET32a质粒。其构建是通过设计引物扩增蜡状芽孢杆菌中甲酸脱氢酶fdhF基因片段，并用重组酶将其连接到含有对应连接末端的pET32a片段中，进行基因测序，验证基因的完整性。将pET32a‑fdhF质粒转化到细菌中，在产氢培养基中培养此细菌生产氢气。pET32a‑fdhF能够应用于不同细菌中，既能使不产氢的细菌产氢，也能使产氢的细菌的产氢效率明显提高，消耗同样的底物浓度能产生更快更多的氢气。也能够改良现有工业产氢的大肠杆菌。

Description

高效产氢功能基因载体pET32a-fdhF及其构建和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种高效产氢功能基因载体pET32a-fdhF及其构建和应用。
背景技术
随着煤炭、石油等化石能源的储备不断枯竭，急需发展新型能源，而氢能做为清洁且高热能的能源而备受关注。氢能源虽可通过化学方法得到，但因其成本高且可能造成的环境污染问题而受到争议，而生物产氢则能解决这个问题。生物产氢的微生物有很多，其中大肠杆菌产氢无论从成本还是从效率来看都是最佳选择之一。目前来看，野生的大肠杆菌不产氢或者产氢较少，无法满足人类对能源的需求，因此，基因工程或者代谢工程方法就被用来改造大肠杆菌使其产氢性能大量增加。现有的产氢大肠杆菌消耗底物多，但是产生的氢气比较少，效率还比较低，急需通过改造引入外源基因使其产氢效率大幅度提高，而不同的外源基因的产氢效率也有所差别。
发明内容
本发明的目的是提供一个高效产氢功能基因载体pET32-fdhF，及其构建方法。其能够应用于大肠杆菌BL21中，也能使产氢的细菌的产氢效率明显提高。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明提供一种高效产氢功能基因载体pET32a-fdhF，其为包含有蜡状芽孢杆菌的甲酸脱氢酶基因fdhF的pET32a-fdhF质粒。(说明：将蜡状芽孢杆菌中甲酸脱氢酶基因fdhF进行克隆用于提高产氢量为本发明首创，选用pET32a为载体与甲酸脱氢酶基因fdhF进行重组也为本发明的创新)
本发明还提供了高效产氢功能基因载体pET32a-fdhF的构建方法，主要通过使用clone smarter technologyTM试剂盒Seamless Assembly Cloning Kit完成重组反应，其原理如下式子所示：
(说明：选用Seamless Assembly Cloning Kit试剂盒的方法将载体pET32a与甲酸脱氢酶基因fdhF进行重组构建新的质粒的方法也为本发明的创新，该方法不同于以往采用T4连接酶连接基因片段与载体，可以避免在基因片段中间如果含有酶切位点则会被从中间切断的风险。而且此方法操作简便，省去双酶切、连接等步骤，简化了操作过程。例如，在本例中，外源基因连接到pET32a载体的位点选择的是NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，而克隆的fdhF基因内部也有NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，如果用传统的酶切、连接方法，无法将完整的fdhF基因克隆到载体上。)
具体操作过程包括以下步骤：(1)线性化载体制备：使用pET32a为载体，使用双酶切方法获得线性化载体。根据pET32a上的酶切点设计引物，PCR扩增fdhF基因片段，其中，作为优选，所述甲酸脱氢酶基因的酶切位点为Nde I，XhoI。
(2)DNA片段制备：设计蜡状芽孢杆菌中甲酸脱氢酶基因fdhF的引物，并扩增甲酸脱氢酶基因fdhF。
(3)重组反应：通过加入重组酶，将准备好的线性化载体和fdhF基因片段连接起来，得到重组载体。
(4)转化：将构建好的重组载体转入感受态大肠杆菌DH5α中。
(5)阳性重组子的鉴定：挑取克隆菌，采用载体克隆位点两端的引物做为菌落PCR反应的扩增引物，进行菌落PCR反应，通过电泳进行鉴定，确定重组子后，再提取质粒、测序。
本发明还提供高效产氢功能基因载体pET32a-fdhF的应用：将pET32a-fdhF质粒转化到大肠杆菌BL21中，在产氢培养基中培养此大肠杆菌生产氢气。
本发明中使用的蜡状芽孢杆菌，从普如汀生物技术北京有限公司购入。购入后进过鉴定，和蜡状芽孢杆菌Q1株最为接近。
本发明的有益效果是pET32a-fdhF能够应用于大肠杆菌中，能使产氢的细菌的产氢效率明显提高，消耗同样的底物浓度能产生更快更多的氢气。能够改良现有工业产氢的大肠杆菌。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明：
图1是载体pET32a-fdhF的构建方案示意图及其western-blot电泳图；
a.构建重组质粒pET32a-fdhF-His
b.Western blot结果
图2是pET32a-fdhF质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中随时间的产氢曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
(1)在NCBI上查找关于蜡状芽胞杆菌甲酸脱氢酶的同源基因序列，再结合pET32a质粒序列，利用DNAMAN软件，设计出带有载体同源序列的甲酸脱氢酶基因的引物。将设计好的引物交给生工生物工程(上海)股份有限公司进行引物合成。
设计出来的引物为：
Forward-Primer：AACTTTAAGAAGGAGATATACATatggcagaacagacagtccgtgt
Reverse-Primer：
CAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGTCCACAAGTGATACGTATTGT
(2)根据设计好的引物，利用PCR技术扩增fdhF基因片段。PCR条件设置：变性95℃30s，复性58℃30s，延伸72℃3分钟，30个循环；50uL体系：25uL 2*HiFi-PCR Master，22uLddH2O，1uLDAN模板，2uL上游引物(10umol/L)，2uL下游引物(10umol/L)。(即用PCR扩增试剂盒，上海生工)
(3)将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离，并在凝胶成像仪下切割回收基因片段，最后将切割片段用胶回收试剂盒(Omega Bio-Tek,USA)回收，为35uL基因片段。
(4)将胶回收的片段送往基因测序公司测序，以验证扩增基因的正确性。
(5)使用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切pET32a载体。
琼脂糖凝胶电泳分离，并在凝胶成像仪下切割载体的大片段(约5400bp)，用胶回收试剂盒回收，获得线性化载体约30uL。
(6)从步骤(5)获得线性化的pET32a载体，步骤(3)获得fdhF基因，经重组反应得到含有fdhF基因片段的pET32a质粒10uL：①重组反应(Seamless Assembly Cloning Kit,clone smarter technologyTM)：1uL pET32a Vector，3uLfdhF基因片段，1uL ddH2O,5uLSeamless Master Mix；②50℃反应15分钟；③转化：将连接好的质粒取5uL加入100uL的DH5α感受态中，冰中放置30分钟；④42℃水浴30秒，再在冰中放置2分钟；⑤加入400uLLB培养基(不含抗生素)，37℃200rpm振荡培养60分钟；⑥将培养液200uL倒入含有氨苄的固体LB培养基37℃培养过夜；挑选单菌落放入100mL含有氨苄的液体LB培养基扩大培养，最后用质粒提取试剂盒(OmegaBio-Tek,USA)提取质粒。
(7)阳性重组子的鉴定(菌落PCR法)：；①挑取大小中等的克隆菌至10uL无菌水中，充分混合，取2uL混合液作为PCR反应的模板：②使用载体克隆位点两端的引物做为鉴定重组子的扩增引物③PCR反应条件：变性94℃30s，复性58℃30s，延伸72℃3分钟，30个循环；④取10uLPCR产物电泳鉴定；⑤确认重组子后，将剩下的8uL混合液转接到LB培养基(含氨苄抗生素)，37℃培养过夜；最后用质粒提取试剂盒(OmegaBio-Tek,USA)提取质粒。
(8)将(7)中的质粒在扩增后送往基因公司测序，以验证基因的完整性；
(9)将(8)中已验证后的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，利用产氢培养基检验其产氢特性。
在含有100μg/mL氨苄的250mL的LB中培养，培养条件：37℃，200rpm，培养时间：20小时，得到富集后的大肠杆菌；
将LB培养基中的大肠杆菌按1％v/v的量接种到含有200mL产氢培养基的无菌厌氧瓶中发酵，发酵条件：①37℃，200rpm培养到OD600nm＝0.6；②加入IPTG诱导剂至浓度为1mM，37℃，静置培养。当加入IPTG后，每隔一小时从厌氧瓶抽取500uL的气体样品，使用GC3420气相色谱仪进行样本分析。分析条件，80/100目的5A分子筛，TCD检测器温度120℃，进样口温度100℃，柱温80℃，载气为高纯氮气。产氢实验时间一共持续14小时。
在产氢实验进行14小时后，氢气产率415.5mLH2/L培养基，产氢曲线如图2所示，产氢效率为每消耗1mol的葡萄糖能产生0.22mol的氢气。实验效果显示，与不产氢的大肠杆菌BL21(DE3)比较，pET32a-fdhF能使不产氢的大肠杆菌产生氢气，且效果良好。实验也证明，本发明所构建的产氢质粒pET32a-fdhF能用于改良产氢细菌，使产氢效率大幅度提高。转化细菌种类仅限于通过镍铁氢酶产氢的原核微生物。
上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。
如图1，质粒融合了AMP抗性和His标签。
Forward-Primer：AACTTTAAGAAGGAGATATACATatggcagaacagacagtccgtgt
Reverse-Primer：CAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGTCCACAAGTGATACGTATTGT
蜡状芽孢杆菌中fdhF基因序列
1 atggcagaac agacagtccg tgtaaccgta gatggtaaag aattttcagc atcaggtgaa
61 aagacaatac tacaattatt taacgagagt aatttggaac atcctcaaat ttgtcatgta
121 ccagaagtag atccaattca aacttgtgat acgtgtattg tagaagtaga tgggaagtta
181 atgcgtgctt gttcaacgaa gctcgagaat ggtatgcata ttgaaagaca gtcacagcgt
241 gcgaaagagg cgcagactga ggcgatggat cgaatattag agaatcattt attgtattgt
301 accgtatgtg ataacaataa cggtaattgt aaagttcata atacagtaca tatgatggga
361 attgaagaac agaaatatcc gtatgagccg aaagtaagtg cttgtgaagt ggatatgtca
421 catccgtttt atcggtatga tccaaatcaa tgtattgctt gtggacagtg tgtagaagta
481 tgtcaaaact tacaggttaa cgaaactata tcaatagatt ggagcctaga tcggccacgt
541 gttatatggg atcatggtgt aagcatcaat gactcgtctt gtgtaagttg cgggcagtgt
601 gtaacggtat gtccatgtaa tgcgttaatg gaaaaatcaa tgttaggtga agctggattc
661 atgacaggat taaaatcaga tgtgttagat ccgatgattg attttgtaaa ggatgtagag
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901 tccacatgtg taaaaggtaa atttggatgg gactttgtaa atagtgaaga tcgaattacg
961 aagccattaa ttcgccaagg agatatgttt gttgaagcta cttgggaaga agcattagaa
1021 gttgtggctt ctaacatgca acatattaaa tcagaatacg gcagcgatgc atttggattt
1081 atttcttctt cgaaagtaac gaatgaagaa aattatctta tgcaaaaact agctcgtcaa
1141 atatatggaa caaataatgt agataactgc tcgcgttatt gccaatctcc agcaactgat
1201 ggtttattta aaactgtcgg tatgggcggc gatgctggaa cagtgaaaga tattgcggag
1261 gcaggccttg tcattatcgt tggtgcgaat ccaacagaag gacatcctgt actcgcgacg
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1921 ttacttgcgg cagaagaagg aaaactacgt ggtatgtatg tcatgggtga agaaatggct
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2341 tgttggggta gtcatgatgg tagcgataca ccgctattat atgtagacgg atttaacttc
2401 ccagataaac tagctcgttt atcattagat gaatgggtac caccagttgt agcgccagat
2461 gagtatgatt tacttttaaa taatggacgt atgctagaac atttccatga agggaatatg
2521 acgaataagt cggctggtat tttatctaaa gtatctgaag tgttcgttga aatttcacct
2581 gaacttgcta tagagcgcaa tgtgaaagat ggtggtcttg tagaattagc atcaccattt
2641 ggcaaaatta aagtacaagc gcttattacg gatcgtgtaa cggggaaaga gctatactta
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2881 ggtgttgaaa tcgagcaaaa atggcaaaga aaacaatacg tatcacttgt ggactag

Claims (4)

1.高效产氢功能基因载体pET32a-fdhF，其特征在于，所述基因载体为包含有蜡状芽孢杆菌甲酸脱氢酶fdhF基因的pET32a质粒。
2.根据权利要求1所述的高效产氢功能基因载体pET32a-fdhF，其特征在于所述蜡状芽孢杆菌为蜡状芽孢杆菌Q1株。
3.构建如权利要求1或2所述的高效产氢功能基因载体pET32a-fdhF的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计蜡状芽孢杆菌甲酸脱氢酶fdhF基因的引物，并扩增蜡状芽孢杆菌甲酸脱氢酶fdhF基因；
(2)回收甲酸脱氢酶fdhF基因的基因片段，进行测序验证扩增基因的完整性；
(3)使用限制性内切酶Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pET32a载体，切胶回收，获得线性化载体；
(4)将准备好的线性化载体和fdhF基因片段连接起来，得到含fdhF基因片段的重组载体；
(5)将重组产物，转化DH5α感受态细菌，得到基因载体pET32a-fdhF。
4.应用如权利要求1或2所述的高效产氢功能基因载体pET32a-fdhF的方法，其特征在于，将基因载体pET32a-fdhF转化到大肠杆菌中，在产氢培养基中培养此大肠杆菌生产氢气。
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