CN108220215B - 一种GlnR蛋白结合位点突变的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，具体公开了一种GlnR蛋白结合位点突变的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用。所述耐铵固氮微生物为在类芽孢杆菌属菌株基因组中，将长度为313bp的nif启动子区替换为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。所得耐铵固氮微生物在无铵和高铵条件下都能进行生物固氮，提高了类芽孢杆菌属微生物在高铵条件下的固氮酶活性，突破了高铵条件对生物固氮的抑制作用，在农业生产中具有广泛的应用前景。

Description

一种GlnR蛋白结合位点突变的耐铵固氮微生物及其构建方法 与应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地说，涉及一种GlnR蛋白结合位点突变的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用。

背景技术

氮素是植物生产中必需的最大元素。化学氮肥在保障我国粮食生产、蔬菜种植和果树栽培中起着十分重要的作用。但长期过量偏施化学氮肥，导致土壤酸化和盐渍化，土壤微生物活力下降，己成为农业可持续发展的一个重要制约因子。

固氮微生物在常温常压下，利用体内的固氮酶能将空气中的氮气还原成铵，供植物生长利用。但固氮效率受铵浓度的影响，即，在无铵或铵浓度低时固氮，铵浓度一般大于10mM以上抑制固氮。在贫瘠的土壤里，固氮微生物的固氮效率高，而在肥沃的土壤里，只生长但不固氮。因此，获得在高铵条件下固氮的微生物，在农业生产中具有重要的应用价值。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种GlnR蛋白结合位点突变的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明经研究发现，在固氮类以便杆菌中的固氮基因簇(nifBHDKENXhesAnifV)上游的启动子中，有个GlnR蛋白结合位点(ATGTAAGGGAATATAACGT)，该结合位点位于该固氮基因簇转录起点下游24bp处。在高铵条件下，GlnR蛋白结合位点与该位点结合后抑制固氮基因的表达。因此将该位点的核苷酸序列突变后，GlnR蛋白结合位点不再与该位点结合，则固氮基因能在高铵条件下表达，则在高铵条件下具有固氮酶活性。

第一方面，本发明提供了一种GlnR蛋白结合位点突变的耐铵固氮微生物，在微生物菌株基因组中长度为313bp的nif启动子区替换为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

进一步地，所述微生物为固氮类芽孢杆菌属。

在本发明的具体实施方式中，采用多粘类芽孢杆菌作为代表，以说明本发明构建方法构建得到的突变株。

进一步地，本发明以多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)为例，提供了所述耐铵固氮微生物的构建方法，包括如下步骤：

(1)利用引物MPnif1和MPnif2，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因组为模板PCR扩增得到长1205bp的上游同源臂；

利用引物MPnif5和MPnif6，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因组为模板PCR扩增得到长1101bp的下游同源臂；

利用引物MPnif3和MPnif4，以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为模板PCR扩增得到长313bp的GlnR第二个结合位点发生突变的nif启动子区；

用Tiangen胶回收试剂盒切胶回收以上3个片段；

(2)用BamHI和HindIII酶切温敏型质粒pRN5101，得到酶切片段；

(3)用Gibson assembly master mix(New England Biolabs)将回收纯化后的3个片段和酶切纯化后的pRN5101组装在一起，得到载体pRMP2；

(4)将载体pRMP2通过电击转化到Paenibacillus polymyxa WLY78感受态细胞中，39℃传代培养，先筛选得到具有红霉素抗性的单交换菌株，再继续传代，从中筛选不再具有红霉素抗性的菌株，经PCR验证和测序确认得到同源双交换后的nif启动子区第二个GlnR结合位点突变的菌株MPnif；

其中，所述引物MPnif1、MPnif2、MPnif3、MPnif4、MPnif5和MPnif6的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～7所示。

第二方面，本发明提供了SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列在提高类芽孢杆菌属微生物在高铵条件下固氮酶活性方面的应用，通过使所述微生物基因组DNA中的GlnR蛋白结合位点发生突变，提高类芽孢杆菌属微生物在高铵条件下固氮酶活性。

所述类芽孢杆菌属微生物优选为多粘类芽孢杆菌。

本发明所述的高铵条件指微生物所处环境中NH₄ ⁺的浓度为100～400mM。

本发明提供的GlnR蛋白结合位点突变的耐铵固氮微生物，在限铵和高铵条件下，均具有固氮酶活性。而野生型菌株只在0-10mM NH₄ ⁺范围内才有固氮酶活性。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

例如，本发明所述的BamHI和HindIII限制性内切酶购自New England Biolabs。所述的载体质粒pRN5101购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心。所述的Paenibacillus polymyxa WLY78为本实验室筛选菌株，也可使用购自上海柯维化学技术有限公司的多粘类芽孢杆菌进行替代。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种耐铵固氮类芽孢杆菌，在限铵和高铵条件下都能进行生物固氮，提高了固氮酶活性，突破了高铵条件对生物固氮的抑制作用，在农业生产中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为野生型菌株(WT)和MPnif菌株在限铵和高铵条件下固氮酶活性比较。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1、GlnR蛋白结合位点突变的固氮类芽孢杆菌菌株构建

(1)引物与载体

MPnif1：GCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCCGCCAACCGTGTAGACCGC；

MPnif2：TAGTCTCCGCTTATCATTCCTTCACATCTATTTTCGTC；

MPnif3：TGTGAAGGAATGATAAGCGGAGACTATTTCCC；

MPnif4：CTAAAGAGTCCATTCATTCCCTCCTCTCTA；

MPnif5：GAGGAGGGAATGAATGGACTCTTTAGCTGATCTCTC；

MPnif6：CTGCGCAAAAGACATAATCGATAAGCTTCCACCACGACTAGCCAC。

pRN5101：温敏型穿梭质粒，Em^R，由中国农科院植物保护研究所赠送。

(2)在南京金斯瑞(Genscript,Nanjing)公司合成长313bp的DNA片段，其中将第二个GlnR结合位点的最后6个碱基替换为ClaI酶切位点(第二处下划线中小写字母所示位置)，片段序列如下：

TAAGCGGAGACTATTTCCCAAAATATATAATAAAAAATTAAAGTTTCTTATCTCAAAAGGAGAGCCGTATTTACGGACTCTCTTTTTTTACGTCTTGATGTTATTGAGAATATGAAATGTAACCGCGCACATGTAAAGTGTACG ATATATTACTTGACGTAAAATTTGACACATATGTGAATTGAGGATAAATGTCAGGGATTTCATGGAGAAGTGAATTGACTGTATTTGTCCCTGTCTCTAAGATGTAATTATATTCCAGACAAAAACAGAGATTTATGTAAGGGAATAatcga tAGAGAGGAGGGAATGA。

(3)用引物MPnif1和MPnif2，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因组为模板PCR扩增得到长1205bp的上游同源臂；用引物MPnif3和MPnif4，以合成的片段为模板，扩增得到长313bp的突变了GlnR结合位点的nif启动子区；用引物MPnif5和MPnif6，以Paenibacilluspolymyxa WLY78基因组为模板PCR扩增得到长1101bp的下游同源臂。

用Tiangen胶回收试剂盒切胶回收以上片段；用BamHI和HindIII酶切温敏型质粒pRN5101，37℃酶切3小时后过柱回收。

用Gibson assembly master mix(New England Biolabs)将纯化后的片段与载体组装在一起，得到载体pRMP2。

将构建好的载体电击转化到Paenibacillus polymyxa WLY78感受态细胞中，39℃传代培养，先筛选得到具有红霉素抗性的单交换菌株，再继续传代，从中筛选不再具有红霉素抗性的菌株，经PCR和酶切验证，测序确认得到同源双交换后的nif启动子区第二个GlnR蛋白结合位点突变的菌株MPnif。

2、固氮酶活性测定

将GlnR蛋白结合位点突变菌株MPnif和野生型菌株(WT)分别培养在限铵培养基(-N)和高铵培养基(+N)中。限铵培养基(-N)是基本培养基中添加2mM谷氨酸，高铵培养基(+N)是在无铵培养基中添加100mM NH₄Cl。培养10小时以上测定固氮酶活力(乙炔还原法)。

固氮酶活(nmol C₂H₄/mg protein hr)的计算公式为：

实验结果如图1，野生型菌株在高铵条件下几乎没有固氮酶活性，而以上突变菌株都能够在限铵和高铵条件下固氮。第二个GlnR结合位点突变后菌株在高铵条件下的固氮酶活也达到了野生型在固氮条件下的1/6到1/5左右。

3、固氮类芽孢杆菌的培养

将固氮类芽孢杆菌MPnif培养在培养基(1000毫升水中含有：蔗糖36克/L，胰蛋白胨5克/L，酵母粉11克/L，MgSO₄ 0.51克/L，NaCl 3.5克/L，Na₂MoO₄克/L，FeSO₄克/L)，在30℃振荡培养36-48小时，活菌浓度达10⁸个/克。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种GlnR蛋白结合位点突变的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用

<130> KHP171118653.3

<141> 2017-12-14

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 313

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taagcggaga ctatttccca aaatatataa taaaaaatta aagtttctta tctcaaaagg 60

agagccgtat ttacggactc tcttttttta cgtcttgatg ttattgagaa tatgaaatgt 120

aaccgcgcac atgtaaagtg tacgatatat tacttgacgt aaaatttgac acatatgtga 180

attgaggata aatgtcaggg atttcatgga gaagtgaatt gactgtattt gtccctgtct 240

ctaagatgta attatattcc agacaaaaac agagatttat gtaagggaat aatcgataga 300

gaggagggaa tga 313

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcacgatgcg tccggcgtag aggatccgcc aaccgtgtag accgc 45

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tagtctccgc ttatcattcc ttcacatcta ttttcgtc 38

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtgaaggaa tgataagcgg agactatttc cc 32

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctaaagagtc cattcattcc ctcctctcta 30

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaggagggaa tgaatggact ctttagctga tctctc 36

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgcgcaaaa gacataatcg ataagcttcc accacgacta gccac 45

Claims (3)

1.一种GlnR蛋白结合位点突变的耐铵固氮微生物，其特征在于，在微生物菌株基因组中长度为313bp的nif启动子区替换为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述微生物为多粘类芽孢杆菌。

2.权利要求1所述的耐铵固氮微生物的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）利用引物MPnif1和MPnif2，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因组为模板PCR扩增得到长1205bp的上游同源臂；

利用引物MPnif5和MPnif6，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因组为模板PCR扩增得到长1101bp的下游同源臂；

利用引物MPnif3和MPnif4，以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为模板PCR扩增得到长313 bp的GlnR第二个结合位点发生突变的nif启动子区；

用Tiangen胶回收试剂盒切胶回收以上3个片段；

（2）用BamHI和HindIII酶切温敏型质粒pRN5101，得到酶切片段；

（3）用Gibson assembly master mix将回收纯化后的3个片段和酶切纯化后的pRN5101组装在一起，得到载体pRMP2，其中Gibson assembly master mix为New England Biolabs品牌；

（4）将载体pRMP2通过电击转化到Paenibacillus polymyxa WLY78感受态细胞中，39℃传代培养，先筛选得到具有红霉素抗性的单交换菌株，再继续传代，从中筛选不再具有红霉素抗性的菌株，经PCR验证和测序确认得到同源双交换后的nif启动子区第二个GlnR结合位点突变的菌株MPnif；

其中，所述引物MPnif1、MPnif2、MPnif3、MPnif4、MPnif5和MPnif6的核苷酸序列如SEQID NO.2~7所示。

3.SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列在提高多粘类芽孢杆菌微生物在高铵条件下固氮酶活性方面的应用，其特征在于，通过使所述微生物基因组DNA中的nif启动子区第二个GlnR结合位点发生突变，提高多粘类芽孢杆菌微生物在高铵条件下固氮酶活性；所述高铵条件指微生物所处环境中NH₄ ⁺的浓度为100mM。

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