CN106554926A - 制备重组l-谷氨酸生产菌株的方法、由该方法制备的菌株及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备具有高产酸性能的重组L-谷氨酸生产菌株的方法、由该方法制备的重组L-谷氨酸生产菌株以及使用该重组L-谷氨酸生产菌株发酵生产L-谷氨酸的方法。在由本发明的方法制备的重组L-谷氨酸生产菌株中，lpdA基因以及任选的odhA基因和/或sucB基因的表达水平相对于野生型菌株而言下降了至少10％。相比野生型菌株而言，本发明的重组L-谷氨酸生产菌株在L-谷氨酸生产中的产酸浓度和葡萄糖-谷氨酸转化率都得到显著提高，即，本发明的重组L-谷氨酸生产菌株具有显著提高的生产L-谷氨酸的产酸性能。通过使用本发明的重组L-谷氨酸生产菌株来发酵生产L-谷氨酸，可以大大提高L-谷氨酸的产率。

Description

制备重组L-谷氨酸生产菌株的方法、由该方法制备的菌株及其使用方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域。具体而言，本发明涉及制备具有高产酸性能的重组L-谷氨酸生产菌株的方法、由该方法制备的重组L-谷氨酸生产菌株以及使用该重组L-谷氨酸生产菌株生产L-谷氨酸的方法。

背景技术

在工业生产和学术研究中，一般使用具有L-谷氨酸生产能力的棒杆菌属(Corynebacterium spp.)或短杆菌属(Brevibacterium spp.)细菌(现在一般认为短杆菌属细菌也属于棒杆菌属)来发酵生产L-谷氨酸。为了提高这些L-谷氨酸生产细菌的生产能力，通常使用从自然界分离的细菌菌株或它们的人工突变菌株或重组菌株来生产L-谷氨酸。

然而，现有的L-谷氨酸生产菌株、特别是野生型L-谷氨酸生产菌株的产酸性能较低，因此，迫切需要开发出具有高产酸性能的基因工程菌。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供制备具有高产酸性能的重组L-谷氨酸生产菌株的方法、由该方法制备的重组L-谷氨酸生产菌株以及使用该重组L-谷氨酸生产菌株生产L-谷氨酸的方法。

经过大量分析与实验，发明人发现，通过采用基因工程技术使L-谷氨酸生产菌株中编码α-酮戊二酸脱氢酶复合体(2-oxoglutaratedehydrogenase complex，ODHC)中的二氢硫辛酸脱氢酶的lpdA基因以及任选的编码ODHC E1o亚基酮戊二酸脱氢酶的odhA基因和/或编码ODHCE2o亚基二氢硫辛酰琥珀酰转移酶的sucB基因的表达水平下降，可显著提高该L-谷氨酸生产菌株的产酸性能。

因此，在第一方面，本发明提供了一种制备重组L-谷氨酸生产菌株的方法，该方法包括：使L-谷氨酸生产菌株中编码α-酮戊二酸脱氢酶复合体的lpdA基因以及任选的odhA基因和/或sucB基因的表达水平相对于野生型菌株而言下降至少10％，从而得到所述重组L-谷氨酸生产菌株。

在第二方面，本发明提供了由第一方面所述的方法制备的重组L-谷氨酸生产菌株，所述重组L-谷氨酸生产菌株中lpdA基因的表达水平相对于野生型菌株而言下降了至少10％，任选地，所述重组L-谷氨酸生产菌株中odhA基因和/或sucB基因的表达水平相对于野生型菌株而言也下降了至少10％。

在第三方面，本发明提供了使用第二方面所述的重组L-谷氨酸生产菌株发酵生产L-谷氨酸的方法。

相比野生型菌株而言，由本发明的制备重组L-谷氨酸生产菌株的方法制备的重组L-谷氨酸生产菌株(下文也称为“本发明的重组L-谷氨酸生产菌株”)在L-谷氨酸生产中的产酸浓度和葡萄糖-谷氨酸转化率(下文也称为“糖酸转化率”)都得到显著提高，即，本发明的重组L-谷氨酸生产菌株具有显著提高的生产L-谷氨酸的产酸性能。相应地，通过使用本发明的重组L-谷氨酸生产菌株来发酵生产L-谷氨酸，可以大大提高L-谷氨酸的产率。

本发明的其它特征和优势将通过以下具体实施方式进行详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

除非另有说明，本文中使用的术语“L-谷氨酸生产菌株”或“野生型L-谷氨酸生产菌株”、“野生型菌株”是指未通过本发明第一方面所述的制备重组L-谷氨酸生产菌株的方法来使得lpdA基因以及任选的odhA基因和/或sucB基因的表达水平相对于野生型菌株下降了至少10％的L-谷氨酸生产菌株；相应地，本文中使用的术语“重组L-谷氨酸生产菌株”则是由本发明第一方面所述的制备重组L-谷氨酸生产菌株的方法制备得到的lpdA基因以及任选的odhA基因和/或sucB基因的表达水平相对于野生型菌株下降了至少10％的L-谷氨酸生产菌株。

除非另有说明，本文中使用的术语“产酸性能”是指当在培养基中培养L-谷氨酸生产菌株时，该菌株在细胞中积累并向胞外运输L-谷氨酸的能力，由此可在培养基中获得L-谷氨酸；本文中使用的术语“产酸浓度”是指培养基中累积的L-谷氨酸的浓度。

“ODHC”表示α-酮戊二酸脱氢酶复合体，它是三羧酸循环中的关键酶，是主要由lpdA、odhA和sucB三个基因编码的大分子酶蛋白。其中，“lpdA”表示编码二氢硫辛酸脱氢酶的基因(如Gene ID：3342869)；“odhA”表示编码ODHC E1o亚基酮戊二酸脱氢酶的基因(如Gene ID：16537923)；“sucB”表示编码ODHC E2o亚基二氢硫辛酰琥珀酰转移酶的基因(如Gene ID：16538758)。在野生型L-谷氨酸生产菌株中，所述lpdA、odhA和sucB基因的核苷酸序列例如分别由SEQ ID NO：9-SEQ ID NO：11所示。

本文使用的术语“下降”、“降低”、“减少”或“抑制”通常都意味着统计学显著量的下降。然而，为避免疑义，术语“下降”、“降低”、“减少”、或“抑制”表示相比参比水平(例如野生型L-谷氨酸生产菌株中的水平)下降至少10％，例如下降至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或上至并包括下降100％(如，相比参比水平的缺失水平或不可检测水平)、或相比参比水平下降在10％到100％之间的任意量。

本文使用的术语“增加”、“提高”、“增强”或“活化”通常都意味着统计学显著量的增加。然而，为避免疑义，术语“增加”、“提高”、“增强”或“活化”表示相比参比水平(例如野生型L-谷氨酸生产菌株中的水平)增加至少10％，例如增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或上至并包括增加100％、或相比参比水平增加在10％到100％之间的任意量；或相比参比水平至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的增加、或在2倍和10倍之间的任意量的增加、或是更大量的增加。

就此而言，“基因的表达水平下降”意指重组L-谷氨酸生产菌株中基因的表达水平相比野生型L-谷氨酸生产菌株而言下降至少10％，例如下降至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或上至并包括下降100％(即，无基因表达或无可检测水平的基因表达)。在重组L-谷氨酸生产菌株中基因的表达水平相比野生型L-谷氨酸生产菌株而言下降至少约90％的情况下，本文中也可将其称之为“基因失活”。

另一方面，“基因的表达水平增加”或“基因的过量表达”意指重组L-谷氨酸生产菌株中基因的表达水平相比野生型L-谷氨酸生产菌株而言增加至少20％，例如增加至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或上至并包括增加100％、或增加在20％到100％之间的任意量；或至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的增加、或在2倍和10倍之间的任意量的增加、或是更大量的增加。

根据本发明的第一方面，本发明提供了制备重组L-谷氨酸生产菌株的方法。在本发明的制备重组L-谷氨酸生产菌株的方法中，可使用本领域技术人员已知的任何方法来使靶基因(例如lpdA基因以及任选的odhA基因和/或sucB基因)的表达水平下降(包括使靶基因失活)，此类方法包括但不限于：同源重组、定点突变或RNA干扰(RNAi)。

在本发明的涉及同源重组的一些实施方式中，可通过以下方法来实现靶基因(例如lpdA基因以及任选的odhA基因和/或sucB基因)表达水平的下降：将靶基因的野生型启动子替换为相比所述野生型启动子而言起始靶基因转录的能力低的启动子，以使靶基因的表达水平下降；或者将靶基因的野生型启动子替换为受温度调控的温度敏感型启动子，以使靶基因在特定温度的培养条件下表达水平下降。

在此类涉及启动子替换的优选实施方式中，可通过受温度调控的温度敏感型启动子来切换靶基因(例如lpdA基因以及任选的odhA基因和/或sucB基因)在不同温度范围时的表达水平，从而使ODHC复合体的相关靶基因在高于37℃时表达水平显著下降。例如，可通过将lpdA基因的野生型启动子替换为温度敏感型启动子，从而使所述lpdA基因在30～34℃时基因表达水平为野生型启动子时的70％～150％，在34～37℃时基因表达水平为野生型启动子时的30％～70％，在高于37℃时基因表达水平仅为野生型启动子时的1％～30％。在将lpdA基因的野生型启动子替换为温度敏感型启动子的基础之上，还可任选地将odhA基因和/或sucB基因的野生型启动子也替换为温度敏感型启动子。

在此类涉及启动子替换的更优选的实施方式中，所述受温度调控的温度敏感型启动子选自中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞S100a6基因启动子和大肠杆菌dsrAp(Δ4)启动子，但本发明并不限于此，本领域技术人员可使用任何合适的受温度调控的温度敏感型启动子。

例如，在所述受温度调控的温度敏感型启动子为中国仓鼠卵巢细胞S100a6基因启动子时，将lpdA基因的野生型启动子替换为中国仓鼠卵巢细胞S100a6基因启动子的方法可包括以下步骤：将含有中国仓鼠卵巢细胞S100a6基因启动子序列的同源重组片段(ΔlpdA-Pwt::PS100a6-LR，由SEQ ID NO：1表示)连接至pK18mobsacB质粒(购自中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心，货号为SMD1168H)的多克隆位点，将得到的重组质粒导入L-谷氨酸生产菌株进行同源重组，并对菌株进行筛选，从而得到本发明所述的重组L-谷氨酸生产菌株。

在本发明的涉及同源重组的另一些实施方式中，可通过以下方法来实现靶基因(例如lpdA基因以及任选的odhA基因和/或sucB基因)表达水平的下降：敲除ODHC的lpdA基因以及任选的odhA基因和/或sucB基因的核糖体结合位点序列(RBS)、启动子序列或开放阅读框序列的部分或全长序列，从而导致靶基因的表达水平下降。

在此类涉及序列敲除的优选实施方式中，可将靶基因(例如lpdA基因以及任选的odhA基因和/或sucB基因)开放阅读框序列的部分或全长序列敲除，从而导致靶基因的表达水平下降。

在此类涉及序列敲除的更优选的实施方式中，使lpdA基因表达水平下降的方法包括：将lpdA基因开放阅读框序列中1％～100％的序列敲除。在将lpdA基因开放阅读框序列中1％～100％的序列敲除的基础之上，还可任选地将odhA基因和/或sucB基因的核糖体结合位点序列(RBS)、启动子序列或开放阅读框序列的部分或全长序列也敲除。

例如，通过序列敲除使lpdA基因表达水平下降的方法可包括以下步骤：将lpdA基因的上下游同源臂片段(ΔlpdA-LR，由SEQ ID NO：2表示)连接至pK18mobsacB质粒(购自中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心，货号为SMD1168H)的多克隆位点，将得到的重组质粒导入L-谷氨酸生产菌株进行同源敲除，并对菌株进行筛选，从而得到本发明所述的重组L-谷氨酸生产菌株。

在本发明的涉及同源重组的实施方式中，优选通过同源重组来敲除L-谷氨酸生产菌株、特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)基因组中的特定开放阅读框序列或启动子序列。同源敲除中使用的同源序列片段可来源于：根据本领域公知的数据库上公布的L-谷氨酸生产菌株中的靶基因(例如lpdA基因以及任选的odhA基因和/或sucB基因)序列进行人工合成；或者利用PCR的方法从L-谷氨酸生产菌株的基因组上扩增靶基因，从而获得靶基因的初始同源序列片段。在此，靶基因的部分或全部初始同源序列是指含有上述靶基因(lpdA基因以及任选的odhA基因和/或sucB基因)的序列。

同源重组的具体操作方法是本领域技术人员所熟知的，例如，可以参照“Corynebacterium Glutamicum:Biology and Biotechnology”(Yukawa等人，Springer出版社，第51-106页，2012)来进行同源重组，在此不再进行赘述，通过引用的方式将其整体并入本文。

在本发明的涉及定点突变的实施方式中，对于定点突变法并没有特别限定，可采用本领域技术人员所熟知的各种定点突变技术，例如，可以使用市售的QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司制造)等进行。作为引入定点突变的方法，例如，Gapped duplex法和Kunkel法都是已知的。针对L-谷氨酸生产菌株中的靶基因(例如lpdA基因以及任选的odhA基因和/或sucB基因)进行定点突变，可以导致包括碱基的添加、删除、转换和颠换等，从而引起靶基因的表达水平下降。

在本发明的涉及RNAi的实施方式中，对于实现RNAi的方法也没有特别限定，可采用本领域技术人员所熟知的各种RNAi技术，例如，可以通过使用小干扰RNA(siRNA)、反义核酸、微RNA(microRNA)等来阻碍靶基因(例如lpdA基因以及任选的odhA基因和/或sucB基因)的转录或翻译，从而引起靶基因的表达水平下降。

本领域技术人员可以理解的是，可以独立地对不同靶基因(例如lpdA基因以及任选的odhA基因和/或sucB基因)进行相同或不同的处理(例如，同源重组、定点突变或RNAi)，以实现使各靶基因的表达水平下降这一目的。例如，可仅通过同源重组技术使lpdA基因以及任选的odhA基因和/或sucB基因的表达水平下降；或者，也可通过同源重组技术使lpdA基因的表达水平下降，并使用定点突变技术或RNAi技术使任选的odhA基因和/或sucB基因的表达水平下降。

在本发明的制备重组L-谷氨酸生产菌株的方法中，可利用的L-谷氨酸生产菌株例如可为野生型谷氨酸棒杆菌，包括但不限于：谷氨酸棒杆菌野生型菌株ATCC13032(中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC20213)或谷氨酸棒杆菌野生型菌株S9114(中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC20935)。

在本发明的制备重组L-谷氨酸生产菌株的一些实施方式中，可通过下述方法得到本发明的靶基因(例如lpdA基因以及任选的odhA基因和/或sucB基因)表达水平下降的重组L-谷氨酸生产菌株：用经改造的基因序列片段来构建具有基因敲除或基因表达水平弱化功能的质粒，并将所得的质粒转化进L-谷氨酸生产菌株(例如野生型谷氨酸棒杆菌)中，然后进行菌株筛选，从而得到本发明所述的重组L-谷氨酸生产菌株。

在本发明的制备重组L-谷氨酸生产菌株的实施方式中，将构建的重组质粒转化(导入)L-谷氨酸生产菌株的方法可以为本领域常规的转化方法。例如，所述转化方法可包括以下步骤：制备L-谷氨酸生产菌株的感受态细胞，然后用重组质粒转化感受态细胞，所述转化例如可选自电击转化或化学转化。其中，感受态细胞可以人工制备，也可以商购获得。

L-谷氨酸生产菌株感受态细胞的制备方法可以为本领域常规的制备感受态细胞的方法。例如，感受态细胞的制备方法可为包括以下步骤的方法：(a)挑取在固体培养基平板上生长了1天的L-谷氨酸生产菌株单菌落，并接种到5-10mL液体培养基中，然后在30-32℃下以170-190rpm的转速培养过夜，得到种子液；(b)取400-450μL种子液转接到30-35mL用于制备感受态细胞的液体培养基中，在30-32℃下以150-160rpm的转速振荡培养至OD₆₀₀达到0.8-0.9(该过程通常需要3-5h)，然后在冷冻离心机中以8000rpm的转速在4℃下收集细胞；(c)用10％的甘油洗涤细胞3-4遍，然后将细胞悬浮于0.5mL的10％甘油中；(d)将制得的感受态细胞置于-80℃超低温冰箱中保存，现用现取，使用时置于冰上融化。

在本发明的制备重组L-谷氨酸生产菌株的实施方式中，电击转化L-谷氨酸生产菌株的感受态细胞的方法可以为本领域常规的电击转化方法。例如，所述电击转化方法可为包括如下步骤的方法：(a)取50-60μL的L-谷氨酸生产菌株感受态细胞与5-6μL(约2ng/μL)构建好的质粒混合均匀，转入预冷的0.2cm一次性无菌电转杯中；(b)将电转杯置于冰浴上20min；(c)冰浴后，在电转参数为25μF、12.5Kv/cm，电击时间为5-8ms的条件下进行电击；(d)电击结束后，立即向电转杯中加入600-800μL的用于培养L-谷氨酸生产菌株的液体培养基；(e)在46-50℃水浴中热击6-7min；(f)热击结束后，将电转化后的细胞在30-32℃下孵育2-3h；(g)以5000rpm离心2min收集细胞，移除部分上清液以使上清液剩余100-200μL，然后将细胞重悬并涂布在筛选平板上以进行筛选。

在本发明的制备重组L-谷氨酸生产菌株的实施方式中，对重组L-谷氨酸生产菌株进行筛选的方法可以为本领域常规的筛选方法。例如，所述筛选方法可为包括以下步骤的方法：(a)将经转化处理的细胞均匀涂布在含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板上，在30-32℃下静置培养24-48h，待长出菌落后，挑取具有抗性的单菌落接种至含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，180rpm振荡培养12h；(b)吸取上述含有筛选后的菌株的液体培养基100μL，均匀涂布在含有100g/L蔗糖的LB固体培养基平板上，待长出菌落后，对该菌株进行菌落PCR扩增实验，得到的能够在含蔗糖的固体培养基上生长的菌株，为阳性菌株；(c)将在菌落PCR扩增实验中得到的阳性菌株进行液体扩大培养，并利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，然后以所提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增；(d)将步骤(c)中的PCR扩增产物送测序公司进行测定，当测序结果与所引入的片段或基因序列一致时，则证明目标基因序列已导入到L-谷氨酸生产菌株中，得到重组L-谷氨酸生产菌株。

根据本发明的第二方面，本发明提供了由第一方面所述的制备重组L-谷氨酸生产菌株的方法制备的重组L-谷氨酸生产菌株。

在本发明优选的实施方式中，相比野生型菌株中lpdA基因的表达水平，本发明的重组L-谷氨酸生产菌株中lpdA基因的表达水平下降了至少约80％、优选下降了至少约90％、更优选下降了至少约95％。

在本发明一个更优选的实施方式中，本发明的重组L-谷氨酸生产菌株中无可检测水平的lpdA基因表达。

在本发明优选的实施方式中，除lpdA基因的表达水平下降了至少10％之外，所述重组L-谷氨酸生产菌株中odhA基因和/或sucB基因的表达水平也下降了至少10％。进一步优选地，所述重组L-谷氨酸生产菌株中odhA基因和/或sucB基因的表达水平下降了至少约75％、优选下降了至少约85％、更优选下降了至少约90％。

在本发明一个最优选的实施方式中，本发明的重组L-谷氨酸生产菌株中无可检测水平的lpdA基因表达、odhA基因表达和sucB基因表达。

根据本发明的第三方面，本发明还提供了使用第二方面所述的重组L-谷氨酸生产菌株发酵生产L-谷氨酸的方法。

在本发明的发酵生产L-谷氨酸的方法中，对本发明的重组L-谷氨酸生产菌株进行发酵培养可以获得L-谷氨酸。其中，发酵培养的方法可以为本领域常规的用于L-谷氨酸生产的发酵方法。例如，发酵培养的方法可包括以下步骤：将新鲜制备的重组L-谷氨酸生产菌株或在甘油冻存管中冻存于-80℃冰箱中的重组L-谷氨酸生产菌株接种于谷氨酸棒杆菌液体培养基中进行活化，然后30-32℃过夜培养，将过夜培养的培养液进行扩大培养，制得发酵种子液；以10％体积的接种量分别将上述种子液接种至装有2-3L L-谷氨酸生产发酵培养基的5L全自动发酵罐中，控制发酵罐起始培养温度为30-33℃，初始通气量为1-2L/min，初始搅拌速度为400-600rpm，其中，发酵过程中的相关参数可设置为如下所示的参数：

温度：采用间隔升温方式控制发酵温度，即控制发酵起始温度为30-33℃，每间隔2-5h使发酵温度提高0.5℃；

溶氧：采用分段式供氧，通过调节通气量及搅拌转速来控制发酵液中的溶氧浓度，使得在发酵延滞期和稳定期至发酵结束溶氧浓度在5％-10％的范围内，而在产酸旺盛的对数生长期溶氧浓度在20％-25％的范围内；

pH值：发酵过程中自动流加25％的氨水，以将发酵液的pH值控制在7.0-7.2；

泡沫处理：根据发酵罐中的泡沫情况，流加15-25％(w/v)浓度的消泡剂进行消泡；

补料：当残留葡萄糖含量降至1％(w/v)时，采用流加40-60％(w/v)浓度的葡萄糖水溶液的方式进行补料。

实施例

以下实施例将对本发明作进一步的说明，但并不用于限制本发明。

在以下实施例和对比例中所使用的培养基的组成如下：

(1)LB液体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl；LB固体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，15g/L琼脂。

(2)谷氨酸棒杆菌液体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/LNaCl，10g/L葡萄糖；谷氨酸棒杆菌固体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L葡萄糖，15g/L琼脂。

(3)制备谷氨酸棒杆菌感受态的培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L葡萄糖，40g/L甘氨酸。

(4)L-谷氨酸生产种子培养基：26g/L葡萄糖，2.8g/L玉米浆，5.6g/L尿素，1.6g/L K₂HPO₄·3H₂O，0.5g/L MgSO₄·7H₂O，pH＝7.1±0.1。

(5)L-谷氨酸生产发酵培养基：140g/L葡萄糖，3.0g/L玉米浆，2.0g/L糖蜜，2.0g/L Na₂HPO₄·12H₂O，1.5g/L KCl，0.6g/L MgSO₄·7H₂O，2mg/LMnSO₄·H₂O，2mg/L FeSO₄·7H₂O，0.2mg/L维生素B1，pH＝7.1±0.1。

在以下实施例和对比例中，pK18mobsacB质粒购自中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心，货号为SMD1168H；谷氨酸棒杆菌野生型菌株S9114购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，货号为CICC20935；双酶切试剂购自天根生化科技(北京)有限公司；连接反应试剂为购自天根生化科技(北京)有限公司的试剂盒；细菌基因组DNA提取试剂盒以及质粒提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司。

所用引物均由深圳华大基因科技有限公司合成，测序和全长基因片段的合成均由北京擎科新业生物技术有限公司完成。

实施例和对比例中使用的引物序列如下：

表1.引物序列

实施例1

本实施例用于说明本发明的制备重组L-谷氨酸生产菌株的方法。

(1)ΔlpdA-Pwt::PS100a6-LR同源臂序列的设计与合成：

依据谷氨酸棒杆菌CICC20935中lpdA基因野生型启动子的序列及其上下游序列，设计用于替换lpdA基因野生型启动子的含有中国仓鼠卵巢细胞S100a6基因启动子序列的同源臂序列(ΔlpdA-Pwt::PS100a6-LR，如SEQ ID NO：1所示)，并由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

其中，谷氨酸棒杆菌CICC20935中lpdA基因野生型启动子的序列及其上下游序列分别由SEQ ID NO：12-SEQ ID NO：14表示，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞S100a6基因启动子序列由SEQ ID NO：15表示。

(2)pK18mobsacB-ΔlpdA-Pwt::PS100a6-LR质粒的构建：

使用Xba I和Hind III限制性内切酶对合成的ΔlpdA-Pwt::PS100a6-LR序列进行双酶切，分别切除5'端6bp的序列和3'端6bp的序列，形成两端分别带有Xba I和Hind III酶切位点粘性末端的线性DNA片段ΔlpdA-Pwt::PS 100a6-LR-；同样，使用Xba I和Hind III限制性内切酶对pK18mobsacB质粒进行双酶切，使pK18mobsacB质粒形成两端带有XbaI和Hind III酶切位点粘性末端的线性DNA片段pK18mobsacB-；将线性DNA片段ΔlpdA-Pwt::PS100a6-LR-与pK18mobsacB-连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞；在含有25μg/ml卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆，将阳性克隆接种到含有25μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中，180rpm、37℃培养16h后用质粒提取试剂盒提取获得pK18mobsacB-ΔlpdA-Pwt::PS 100a6-LR质粒，送至测序公司进行测序。

其中，Xba I和Hind III双酶切的反应体系为：Xba I，1μL；Hind III，1μL；10×M Buffer，2μL；目的DNA，≤1μg；ddH₂O加至反应总体系为20μL。Xba I和Hind III双酶切的反应条件为：将装载上述20μL反应体系的EP管置于37℃水浴锅中进行双酶切3h。

连接反应的体系为：ΔlpdA-Pwt::PS100a6-LR-线性DNA片段，1ng；pK18mobsacB-线性DNA片段，0.2ng；10×T4DNA Ligation Buffer，1μL；T4DNA Ligase，1μL。连接反应的条件为：在16℃下连接过夜。

(3)pK18mobsacB-ΔlpdA-Pwt::PS100a6-LR质粒的转化和筛选：

采用电击转化将验证正确的pK18mobsacB-ΔlpdA-Pwt::PS100a6-LR质粒导入谷氨酸棒杆菌CICC20935细胞中，经菌株筛选得到重组L-谷氨酸生产菌株A1。具体实验过程如下：

谷氨酸棒杆菌CICC20935感受态细胞的制备：(a)挑取在谷氨酸棒杆菌固体培养基上生长了1天的谷氨酸棒杆菌CICC20935的单菌落，将其接种到含5mL谷氨酸棒杆菌液体培养基的大试管中，在30℃、175rpm下培养过夜；(b)取400μL种子液转接到30mL用于制备谷氨酸棒杆菌感受态细胞的液体培养基中，在30℃下以150rpm的转速振荡培养至OD₆₀₀达到0.8，在冷冻离心机中以4℃、8000rpm收集细胞；(c)用10％的甘油洗涤细胞4遍，然后将细胞悬浮在0.5mL的10％甘油中；(d)将制得的谷氨酸棒杆菌CICC20935感受态细胞置于-80℃超低温冰箱中保存，现用现取，使用时置于冰上融化。

电击转化：(a)取50μL上述制备的谷氨酸棒杆菌CICC20935感受态细胞与2ng pK18mobsacB-ΔlpdA-Pwt::PS100a6-LR质粒混合均匀，转入预冷的0.2cm一次性无菌电转杯中；(b)将电转杯置于冰浴上20min；(c)冰浴后，在电转参数为25μF、12.5kV/cm，电击时间为5ms的条件下进行电击；(d)电击结束后，立即向电转杯中加入600μL的用于培养谷氨酸棒杆菌的液体培养基；(e)在46℃水浴中热击6min；(f)热击结束后，将电转化后的细胞在30℃条件下孵育2h；(g)以5000rpm离心2min来收集细胞，移除部分上清液以使上清液剩余100μL，然后将细胞重悬并涂布在筛选平板上以进行筛选。

重组L-谷氨酸生产菌株的筛选：(a)将上述重悬细胞均匀涂布在含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板上，在30℃下静置培养24h，待长出菌落后，挑取单菌落接种至5mL含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在30℃、180rpm下振荡培养12h；(b)取上述含有筛选后的菌株的液体培养基100μL，均匀涂布在含有100g/L蔗糖的LB固体培养基上，待长出菌落后，挑取单菌落并接种于10mL的含有100g/L蔗糖的LB液体培养基中，在30℃、180rpm下振荡培养12h，然后使用如表1中所示的引物P1和P2(SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4)进行菌落PCR扩增实验；(c)将在菌落PCR扩增实验中验证为阳性的菌株进行扩大培养，使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取该菌株的基因组DNA，然后使用引物P1和P2(SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4)以所提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增；(d)将步骤(c)中获得的PCR扩增产物送至北京擎科新业生物技术有限公司进行测序，测序结果显示，扩增片段与所设计合成的同源臂序列ΔlpdA-Pwt::PS100a6-LR完全一致，证明pK18mobsacB-ΔlpdA-Pwt::PS100a6-LR质粒已成功导入到谷氨酸棒杆菌CICC20935菌株中，并已将lpdA基因的野生型启动子替换为中国仓鼠卵巢细胞S100a6基因启动子，从而得到了重组L-谷氨酸生产菌株CICC20935-ΔlpdA-Pwt::PS100a6-LR，将该菌株编号为A1。

在重组L-谷氨酸生产菌株筛选的步骤(b)中的PCR扩增体系为：2×PrimeSTARMax Premix，25μL；引物P1和P2(10μM)各0.5μL；菌液，10μL；ddH₂O，14μL；总体系50μL。

在重组L-谷氨酸生产菌株筛选的步骤(c)中的PCR扩增体系为：2×PrimeSTARMax Premix，25μL；引物P1和P2(10μM)各0.5μL；基因组DNA，1ng；ddH₂O，14μL；总体系50μL。

在重组L-谷氨酸生产菌株筛选的步骤(b)和步骤(c)中的PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min 30s，30个循环；72℃再延伸5min；12℃保存∞。

实施例2

本实施例用于说明本发明的制备重组L-谷氨酸生产菌株的方法。

(1)ΔlpdA-LR同源臂序列的设计与合成：

依据谷氨酸棒杆菌CICC20935中lpdA基因的序列及其上下游序列，设计用于lpdA基因敲除的同源臂序列(ΔlpdA-LR)：以CICC20935基因组DNA为模板扩增lpdA基因的上下游同源臂片段，然后通过重叠PCR将该上下游同源臂片段连接，得到ΔlpdA-LR(由SEQ ID NO：2所示)。

具体步骤如下：以谷氨酸棒杆菌CICC20935的基因组DNA为模板，用如表1中所示的正向引物P3(SEQ ID NO：5)和反向引物P4(SEQ IDNO：6)扩增lpdA基因的上游同源臂(ΔlpdA-L，1009bp，SEQ ID NO：16)，其中，正向引物P3具有Xba I酶切位点；用如表1中所示的正向引物P5(SEQ ID NO：7)和反向引物P6(SEQ ID NO：8)扩增lpdA基因的下游同源臂(ΔlpdA-R，1009bp，SEQ ID NO：17)，其中，反向引物P6具有Hind III限制性酶切位点；将上述扩增片段ΔlpdA-L和ΔlpdA-R回收，并使用正向引物P3和反向引物P6进行重叠PCR，得到ΔlpdA-LR(2018bp，SEQ ID NO：2)。

用于扩增上游和下游同源臂片段的PCR体系为：2×PrimeSTARMaxPremix，25μL，正向/反向引物(10μM)各1μL，模板DNA 1μg，用ddH₂O将体系补至50μL。用于扩增上游和下游同源臂片段的PCR条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃再延伸5min；12℃保存∞。

重叠PCR的体系为：2×PrimeSTARMax Premix，25μL；引物P3(10μM)，0.5μL；引物P6(10μM)，0.5μL；上游和下游同源臂片段，各1ng；用ddH₂O将体系补至50μL。重叠PCR的扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃再延伸5min；12℃保存∞。

(2)除了使用ΔlpdA-LR同源臂序列外，以与实施例1步骤(2)相同的方法得到pK18mobsacB-ΔlpdA-LR质粒。

(3)使用与实施例1步骤(3)相同的方法，将pK18mobsacB-ΔlpdA-LR质粒导入到CICC20935的感受态细胞中并进行筛选鉴定，得到重组L-谷氨酸生产菌株CICC20935-ΔlpdA-LR，该重组L-谷氨酸生产菌株中的lpdA基因被敲除，将该菌株编号为A2。

对比例1

根据实施例1步骤(3)中的方法，制备谷氨酸棒杆菌CICC20935感受态细胞，并将pK18mobsacB质粒电击转化进谷氨酸棒杆菌CICC20935感受态细胞，然后进行筛选鉴定，得到导入有空质粒pK18mobsacB的L-谷氨酸生产菌株，将该菌株编号为D1。

对比例2

将未进行任何处理的谷氨酸棒杆菌CICC20935编号为D2。

测试例1

将以上实施例和对比例中制得的菌株A1、A2和D1、D2分别进行培养，以测试各菌株中lpdA基因的表达水平。

分别将冻存于-80℃的甘油冻存管中的菌株A1、A2和D1、D2各100μL接种于100mL谷氨酸棒杆菌液体培养基中进行活化，在30℃、150rpm下培养过夜。提取总RNA，通过反转录制备cDNA，并利用实时荧光定量PCR检测各菌株中lpdA基因的表达水平。

实时荧光定量PCR的结果表明，菌株A1和A2中lpdA基因的表达水平分别为菌株D1中的28％和7％，分别为菌株D2中的32％和5％，表明空质粒pK18mobsacB的导入并未明显改变菌株D1中lpdA基因的表达水平，而菌株A1和A2中lpdA基因的表达水平明显有所下降。

测试例2

将以上实施例和对比例中制得的菌株A1、A2和D1、D2分别进行发酵培养，以测试各菌株的L-谷氨酸生产能力。

发酵验证实验：分别将冻存于-80℃的甘油冻存管中的菌株A1、A2和D1、D2各100μL接种于100mL谷氨酸棒杆菌液体培养基中进行活化，在30℃、150rpm下培养过夜；从该过夜培养的培养液中取20mL菌液，接种于200mL的L-谷氨酸生产种子培养基中，在30℃、200rpm下培养10h，制得发酵种子液。以10％(v/v)的接种量分别将上述发酵种子液接种至装有2L L-谷氨酸生产发酵培养基的5L全自动发酵罐(每个菌株进行2个平行实验，结果取二者平均值)中，控制发酵罐起始培养温度为30℃，初始通气量为1.5L/min，初始搅拌速度为500rpm。

其中，发酵过程中的相关参数控制如下：

温度：每2h提升0.5℃，直至发酵温度提升至39℃恒定不变；

溶氧：采用分段式供氧，通过调节通气量及搅拌转速来控制发酵液中的溶氧浓度，使得在发酵延滞期和稳定期至发酵结束溶氧浓度在5％-10％，而在产酸旺盛的对数生长期溶氧浓度在20％-25％；

pH值：发酵过程中通过自动流加25％的氨水将发酵液的pH值控制在7.0-7.2；

泡沫处理：根据发酵罐中的泡沫情况，流加20％(w/v)浓度的消泡剂进行消泡；

补料：当残留葡萄糖含量降至1％(w/v)时，采用流加50％(w/v)浓度的葡萄糖水溶液进行补料。

在发酵32h时，使用SBA-40E型葡萄糖-谷氨酸生物分析仪分别测定6个发酵罐中的发酵液中的L-谷氨酸产量和葡萄糖含量，结果见表2。

采用如下公式计算糖酸转化率：

糖酸转化率＝C_L-谷氨酸×V_发酵液/(285+500×V_流加糖)×100％

C _L-谷氨酸表示发酵结束后发酵液中L-谷氨酸的浓度；

V_发酵液表示发酵结束后发酵液的体积；

V_流加糖表示发酵结束后所用流加糖液的总体积。

表2

通过表2的数据可以看出，与菌株D1相比，菌株A1的发酵液中的L-谷氨酸含量提高了11.8％，转化率提高了5.2％；菌株A2的发酵液中的L-谷氨酸含量提高了8.9％，转化率提高了2.2％。由此可见，根据本发明的方法制得的重组L-谷氨酸生产菌株发酵后所产生的L-谷氨酸含量较高，并且糖酸转化率也较高，这表明根据本发明的方法制得的重组L-谷氨酸生产菌株具有较强的产酸性能。

另一方面，通过表2的数据还可以看出，与单纯敲除lpdA基因的重组菌株A2相比，将野生型启动子替换成温度敏感型启动子的重组菌株A1的发酵液中的L-谷氨酸含量提高了2.7％，转化率则提高了2.9％。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，对于在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种制备重组L-谷氨酸生产菌株的方法，该方法包括：

使L-谷氨酸生产菌株中的lpdA基因以及任选的odhA基因和/或sucB基因的表达水平相对于野生型菌株而言下降至少10％，从而得到所述重组L-谷氨酸生产菌株。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过同源重组、定点突变或RNA干扰使所述基因的表达水平下降。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，将lpdA基因以及任选的odhA基因和/或sucB基因的野生型启动子替换为相比所述野生型启动子而言起始基因转录的能力低的启动子，以使所述基因的表达水平下降；或者，将lpdA基因以及任选的odhA基因和/或sucB基因的野生型启动子替换为受温度调控的温度敏感型启动子，以使所述基因的表达水平下降，

优选地，所述起始基因转录的能力低的启动子起始基因转录的能力为野生型启动子的1％～50％；所述受温度调控的温度敏感型启动子使得所述基因在高于37℃的培养条件下培养时的表达水平下降至使用野生型启动子时的基因表达水平的1％～50％。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述受温度调控的温度敏感型启动子选自中国仓鼠卵巢细胞S100a6基因启动子和大肠杆菌dsrAp(Δ4)启动子。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述L-谷氨酸生产菌株为野生型谷氨酸棒杆菌，

优选地，所述野生型谷氨酸棒杆菌为保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心、保藏号为CICC20213的谷氨酸棒杆菌野生型菌株ATCC13032；或保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心、保藏号为CICC20935的谷氨酸棒杆菌野生型菌株S9114。

6.根据权利要求2所述的方法，其中，利用如SEQ ID NO：1或SEQID NO：2所示的同源重组片段使lpdA基因的表达水平下降。

7.由权利要求1-6中任一项所述的方法制备的重组L-谷氨酸生产菌株，所述重组L-谷氨酸生产菌株中lpdA基因的表达水平相对于野生型菌株而言下降了至少10％，

任选地，所述重组L-谷氨酸生产菌株中odhA基因和/或sucB基因的表达水平相对于野生型菌株而言也下降了至少10％。

8.根据权利要求7所述的重组L-谷氨酸生产菌株，其中，相比野生型菌株中lpdA基因的表达水平，所述重组L-谷氨酸生产菌株中lpdA基因的表达水平下降了至少80％、优选下降了至少90％、更优选下降了至少95％、最优选无可检测水平的lpdA基因表达。

9.根据权利要求8或9所述的重组L-谷氨酸生产菌株，其中，所述重组L-谷氨酸生产菌株中odhA基因和/或sucB基因的表达水平下降了至少75％、优选下降了至少85％、更优选下降了至少90％、最优选无可检测水平的odhA基因表达和sucB基因表达。

10.使用根据权利要求7-9中任一项所述的重组L-谷氨酸生产菌株发酵生产L-谷氨酸的方法。