CN113637699A - 一种提高氨基酸产生菌生产能力的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高氨基酸产生菌生产能力的方法，其包括使染色体上编码α‑酮戊二酸脱氢酶复合物的Elo亚基的odhA基因的调控区发生突变和/或缺失。本发明的方法能够将L‑脯氨酸生产菌的L‑脯氨酸生产能力提高至少3倍，构建的工程菌CCTCC NO:M 2020060在发酵生产L‑脯氨酸的产量高达119.90g/L，具有工业应用前景。

Description

一种提高氨基酸产生菌生产能力的方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种提高氨基酸产生菌生产能力的方法，尤其涉及一种提高L-脯氨酸产生菌生产能力的方法、一种L-脯氨酸基因工程生产菌及其应用。
背景技术
L-脯氨酸是含有亚氨基的中性氨基酸，是构成蛋白质的20种基本氨基酸之一，属于人体非必需氨基酸。L-脯氨酸具有一定的生理活性，广泛用于医药、农业和食品工业，尤其在医药研究和治疗中的作用，日益受到重视(Thi Mai Hoa,B.,et al.,AppliedMicrobiology and Biotechnology,2013.97(1):p.247-257.List,B.,Tetrahedron,2002.58(28):p.5573-5590.)。
目前L-脯氨酸的生产方法主要有三种：1.化学合成法，工艺线路较长，难以投产(缪正兴，张仲明，李宝忠，L-脯氨酸的生产及其应用.发酵科技通讯，2004(2):p.35-36.)；2.从天然蛋白质水解液中提取，但由于其成本高，不适于现代化工业大生产(曹者瑜，张振家，从鸡毛中分离L—脯氨酸.氨基酸和生物资源,1986(1):p.1-7.)；3.直接发酵法，原料成本低，反应条件温和，易大规模生产(5374542 Process for producing 4-hydroxy-l-proline:Katsumata Ryoich；Yokoi Haruhiko Machida,Japan Assigned to Kyowa HakkoKogyo Co Ltd.Biotechnology Advances,1995.13(4):p.719-720.方佩静，毛维颖，陈琦，L-脯氨酸发酵研究.微生物学报,1982(4):p.63-70.)，成为L-脯氨酸生产的主要途径。
传统的L-脯氨酸生产菌株有两类：一类是生产谷氨酸的野生型菌株，通过改变培养条件，使得发酵向有利于L-脯氨酸的方向进行；另外一类L-脯氨酸生产菌株的开发主要依赖于营养缺陷型或抗反馈抑制的突变株的选育(Nakamori,S.,et al.,Agriculturaland Biological Chemistry,1982.46(2):p.487-491.Araki,K.,Y.Takasawa,andJ.Nakajima,Agricultural and Biological Chemistry,1975.39(6):p.1193-1200.Nakanishi,T.,et al.,Journal of Fermentation Technology,1987.65(2):p.139-144.Ryu,W.S.,et al.,Journal of Microbiology and Biotechnology,1999.9(5):p.613-618.)，这会引入一些负突变，利用基因工程技术获得L-脯氨酸生产菌株则能避免这一问题。
在谷氨酸棒杆菌中，L-脯氨酸是由谷氨酸通过γ-谷氨酸激酶(编码基因proB)、谷氨酸-5-半醛脱氢酶(编码基因proA)和吡咯啉-5-羧酸还原酶(编码基因proC)经三步酶催化和一步自发环化形成(Ahn,J.,et al.,Biotechnology and Bioprocess Engineering,2004.9(4):p.326-329.Jensen,J.V.K.and V.F.Wendisch,Microbial Cell Factories,2013.12.Zhang,Y.,et al.,Biotechnol Biofuels,2017.10:p.169.)，其中ProB的酶活受到L-脯氨酸的反馈抑制(Sleator,R.D.and C.C.Gahan,Applied&EnvironmentalMicrobiology,2001.67(10):p.4560-4565.)。在少数生物如Pseudomonas putida中被报道含有鸟氨酸环脱氨酶(OCD)，鸟氨酸通过OCD催化生成L-脯氨酸，鸟氨酸环脱氨酶基因ocd在谷氨酸棒杆菌中的异源表达实现了L-脯氨酸的过量生产(Jensen,J.V.K.andV.F.Wendisch,Microbial Cell Factories,2013.12.)。Zhang,Y.等人以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株，从头通过理性设计将G446A点突变引入基因组的proB基因解除L-脯氨酸的反馈抑制，敲除(失活)脯氨酸脱氢酶(编码基因putA)阻断L-脯氨酸到谷氨酸的转化，替换顺头乌酸酶(编码基因acn)的启动子并将起始密码子从TTG更换为ATG增加α-酮戊二酸通路流量，使用质粒形式用Ptac启动子过表达proBG446A构建了一株L-脯氨酸高产菌株Pro-6，分批补料发酵60h产L-脯氨酸66.43g/L(Zhang,Y.,et al.,BiotechnolBiofuels,2017.10:p.169.)。Jiang Y.等人使用CRISPR介导的ssDNA重组工具对谷氨酸棒杆菌ATCC13032 ProB的G149位点进行饱和突变，筛选得到了一系列抗L-脯氨酸反馈抑制菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032ProBG149K，并证明ProB G149位点突变为赖氨酸K时效果最好，96孔板发酵L-脯氨酸产量达到6.6±1.0g/L(Jiang,Y.,et al.,CRISPR-Cpf1 assistedgenome editing of Corynebacterium glutamicum.Nature Communications,2017.8.)。
通过基因工程手段获得更高产量的L-脯氨酸生产菌株对于提高L-脯氨酸生产的效益具有重要意义。
发明内容
为了构建一株产量更高的L-脯氨酸生产菌株，本发明利用基因工程技术来改造谷氨酸棒杆菌，通过增强与L-脯氨酸生产相关的基因，弱化分支代谢途径，提高辅因子NADPH水平，获得一株高产L-脯氨酸的菌株ZQJY-9，从而提升了L-脯氨酸的生产能力，降低生产成本，具有广阔的工业化应用前景。基于相同的原理，上述方法还可以应用于其他氨基酸产生菌，以便提高其他氨基酸的生产能力。具体而言，本发明包括如下技术方案：
一种提高氨基酸产生菌生产能力的方法，其包括下述步骤：使该氨基酸产生菌的染色体上编码α-酮戊二酸脱氢酶复合物的Elo亚基的odhA基因的调控区发生突变和/或缺失。
上述氨基酸选自L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-羟脯氨酸、L-精氨酸、L-瓜氨酸、L-鸟氨酸及其它L-谷氨酸衍生物。
上述氨基酸产生菌选自大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌、钝齿棒杆菌、北京棒杆菌、停滞棒杆菌、产氨棒杆菌等棒杆菌，优选是谷氨酸棒状杆菌，更优选是谷氨酸棒杆菌ATCC13032或其衍生菌株。
优选上述方法中，所述odhA基因的阅读框起始密码子之前第11至第15个碱基的核糖体结合RBS区域的碱基序列AGGCG被其它碱基序列取代。
上述的其它碱基序列选自下组：AGAGG、TGAGG、GGAGG、CGAGG、GAAGG。
在一种实施方式中，上述odhA基因的调控区发生缺失是指odhA基因的阅读框起始密码子之前的序列发生缺失，在3’-端包含起始密码子GTG的所述序列选自下组：
AATAAACCCTCAAGAAGCAAGGGAGAGTACCTGCCGTG(SEQ ID NO:1)；
AATAAACCCTCAAGAAGCAAGGTAGGAGTACCTGCCGTG(SEQ ID NO:2)；
AATAAACCCTCAAGAAGCAAGAGGAGTACCTGCCGTG(SEQ ID NO:3)；
AATAAACCCTCAAGAAGCAGAGGAGTACCTGCCGTG(SEQ ID NO:4)；
AATAAACCCTCAAGAAGCAAGAGAGGAGTACCTGCCGTG(SEQ ID NO:5)；
AATAAACCAGAAGCAAGGAAAAGAGGCGAGTACCTGCCGTG(SEQ ID NO:6)。
这些序列SEQ ID NOs:1-6在3’-端都包含有起始密码子GTG。
优选地，上述方法包括下述步骤：所述odhA基因的阅读框起始密码子之前的序列变成SEQ ID NO:2；并且使氨基酸产生菌的染色体上发生putA基因失活(例如基因全部或部分删除、或阅读框内突变终止密码子)；gnd*(S361F)和zwf*(A243T)基因突变；gdh基因强化(例如更换启动子或增加拷贝数)；avtA基因失活(例如基因全部或部分删除、或阅读框内突变终止密码子)；proB*(G149K)基因突变；proB*(G149K)基因以游离质粒pXMJ19表达，并置于组成型启动子Peftu后，例如以重组质粒pXMJ19-Peftu::ProBG149K表达，该重组质粒的核苷酸序列为SEQ ID NO:7。
在一种实施方式中，上述putA基因失活是编码区第60位精氨酸突变为终止密码子；所述gdh基因强化是将天然启动子替换为强启动子Peftu；所述avtA基因失活是将编码区第63位亮氨酸突变为终止密码子。
上述方法尤其可用于L-脯氨酸生产菌的改造和基因工程菌构建。
具体来说，本发明提供了一种提高L-脯氨酸产生菌生产能力的方法，包括以下步骤：
A.以L-脯氨酸产生菌为出发菌株，进行putA*(R60 stop codon(即编码区第60位精氨酸突变为终止密码子))、gnd*(S361F)和zwf*(A243T)基因突变，并将gdh的启动子更换为Peftu以使gdh基因过表达，获得gdh基因增强菌株；
B.失活步骤A中所得的gdh基因增强菌株中的基因avtA*(L63 stop codon(即编码区第63位亮氨酸突变为终止密码子))，获得avtA基因失活菌株；
C.调控步骤B中所得的avtA基因失活菌株中基因odhA的表达，获得odhA表达调控菌株；
D.构建包含过表达出发菌株中基因突变体proB*(G149K)的重组质粒pXMJ19-Peftu::ProBG149K，其核苷酸序列为SEQ ID NO:7；
E.将步骤D中所述重组质粒转化到步骤C中所得的odhA表达调控菌株中，获得基因工程菌。
上述步骤A中的putA、gnd和zwf基因突变可以是其中一个基因突变、其中两个基因突变、或者三个基因同时突变。
上述步骤A的作用是增强L-脯氨酸产生菌比如谷氨酸棒杆菌的L-脯氨酸代谢途径中辅因子NADPH水平，阻断L-脯氨酸的降解，增加谷氨酸合成的通量，获得基因增强菌株。
上述步骤B的作用是降低L-脯氨酸代谢途径中的分支途径丙氨酸的合成。
上述步骤C的作用是微调代谢途径中的TCA循环。
上述步骤D的作用是将基因突变体proB*(G149K)以质粒的形式在步骤C中所述的基因弱化菌株中表达。
在一种实施方式中，步骤A中所述的L-脯氨酸产生菌是谷氨酸棒杆菌ATCC13032或其衍生菌株。
例如，所述谷氨酸棒杆菌ATCC13032的衍生菌株可以是文献Jiang,Y.,et al.,CRISPR-Cpf1 assisted genome editing of Corynebacterium glutamicum.NatureCommunications,2017.8中报道的谷氨酸棒杆菌ATCC13032ProBG149K。
当谷氨酸棒杆菌ATCC13032ProBG149K作为出发菌株时，步骤A获得的gdh基因增强菌株的基因型可以为ATCC13032 ProBG149K(ΔputA,Peftu::gdh,GndS361F,ZwfA243T)；
步骤B获得的avtA基因失活菌株的基因型为ATCC13032 ProBG149K(ΔputA,Peftu::gdh,GndS361F,ZwfA243T,ΔavtA)；
步骤C获得的odhA表达调控菌株的基因型为ATCC13032 ProBG149K(ΔputA,Peftu::gdh,GndS361F,ZwfA243T,ΔavtA,odhA(调控区突变))；
步骤E获得的基因工程菌的基因型为ATCC13032 ProBG149K(ΔputA,Peftu::gdh,GndS361F,ZwfA243T,ΔavtA,odhA(调控区突变))/pXMJ19-Peftu::ProBG149K。
在一种实施方式中，步骤C通过将其odhA基因的调控区突变和/或缺失而实现。例如，所述odhA基因的调控区序列(在3’-端包含起始密码子GTG)可以为：
AATAAACCCTCAAGAAGCAAGGTAGGAGTACCTGCCGTG(SEQ ID NO:2)。
根据本发明的第二个方面，提供了一种基因工程菌，其按照上述的方法构建。比如是基因型为ATCC13032 ProBG149K(ΔputA,Peftu::gdh,GndS361F,ZwfA243T,ΔavtA,odhA(调控区突变))/pXMJ19-Peftu::ProBG149K的谷氨酸棒杆菌，本文中称为ZQJY-9，该菌株现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020060。
根据本发明的第三个方面，提供了上述基因工程菌在生产L-脯氨酸中的应用。
优选通过上述基因工程菌的发酵来生产L-脯氨酸。
当上述基因工程菌是谷氨酸棒杆菌ATCC13032或其衍生菌株时，发酵培养基组成如下：(NH4)2SO4 20g/L，KH2PO4 0.5g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 250mg/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，MnSO4·H2O 10mg/L，ZnSO4·7H2O 1mg/L，CuSO4 0.2mg/L，NiCl2·6H2O 0.02mg/L，生物素0.2mg/L，40g/L葡萄糖。
种子液培养基组成如下：(NH4)2SO4 5g/L，尿素5g/L，3-吗啉丙磺酸(MOPS)21g/L，K2HPO4 1g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 250mg/L，CaCl2 10mg/L，微量元素溶液1ml/L，生物素0.2mg/L，原儿茶酸0.3mg/L，玉米浆2g/L和葡萄糖60g/L，pH 7.0，其中，微量元素溶液组成如下：FeSO4·7H2O 16.4g/L，MnSO4·H2O 100mg/L，CuSO4 200mg/L，ZnSO4·7H2O 1g/L，NiCl2·6H2O 20mg/L，用HCl调节至pH 1.0以便溶化上述组分。
优选地，上述发酵还可以包含如下组成的补料培养基：葡萄糖800g/L。
在一种实施方式中，当上述谷氨酸棒杆菌ATCC13032或其衍生菌株进行摇瓶培养时，摇瓶发酵培养基(命名为QFYS)组成如下：葡萄糖·H2O100 g/l，玉米浆20g/l，(NH4)2SO430g/l，MgSO4·7H2O 0.4g/l，KH2PO4 1.2g/l，尿素2g/l，CaCO3 30g/l，pH 7.2。
摇瓶种子液培养基为：BHISG，BHI 37g/L，D-山梨糖醇91g/L，(NH4)2SO4 10g/l，葡萄糖20g/l。
本发明的方法能够将L-脯氨酸生产菌的L-脯氨酸生产能力提高至少3倍。本发明的构建的工程菌CCTCC NO:M 2020060在发酵后，L-脯氨酸的产量高达119.90g/L，具有工业应用前景。
本发明构建的L-脯氨酸高产基因工程菌的拉丁学名是Corynebacteriumglutamicum，中文名称是谷氨酸棒杆菌，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2020年3月29日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020060。
附图说明
图1为质粒pXMJ19-Peftu::ProBG149K的示意图。
具体实施方式
本文中的术语“L-脯氨酸基因工程生产菌”、“L-脯氨酸生产菌”、“基因工程菌”、“L-脯氨酸基因工程生产菌”表示相同的意义，尤其是指L-脯氨酸生产菌ZQJY-9即保藏菌株CCTCC NO:M 2020060。
本发明的L-脯氨酸生产菌的出发菌株或称原始菌株、野生型(WT)菌株是谷氨酸棒杆菌ATCC13032，术语“谷氨酸棒杆菌”、“谷氨酸棒杆菌ATCC13032”、“ATCC13032”表示相同的意义。
本发明中涉及的基因的名称解释如下：
proA：谷氨酸-5-半醛脱氢酶
proB：γ-谷氨酸激酶
proC：吡咯啉-5-羧酸还原酶
ocd：鸟氨酸环脱氨酶
putA：脯氨酸脱氢酶
acn：顺头乌酸酶
gnd：6-磷酸葡糖酸脱氢酶
zwf：葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶
gdh：谷氨酸脱氢酶
avtA：缬氨酸-丙酮酸氨基转移酶
odhA：α-酮戊二酸脱氢酶
在本文中，为了描述简便，有时会将某种蛋白比如6-磷酸葡糖酸脱氢酶Gnd与其编码基因(DNA)gnd名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。本领域技术人员根据语境和上下文容易理解它们的含义。例如，对于Gnd，用于描述6-磷酸葡糖酸脱氢酶功能或类别时，指的是蛋白质；在作为一种基因描述时，指的是编码该Gnd的基因。显然，基因突变gnd*(S361F)是指编码突变体GndS361F的基因突变。
众所周知地，基因名称后标注星号“*”代表该基因的变体，比如：proB*(G149K)是指第149位甘氨酸(G)突变成赖氨酸(K)的γ-谷氨酸激酶的基因proB的突变体；gnd*(S361F)是指第361位丝氨酸(S)突变成苯丙氨酸(F)的6-磷酸葡糖酸脱氢酶的基因gnd的突变体；zwf*(A243T)是指第243位丙氨酸(A)突变成苏氨酸(T)的葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶的基因zwf的突变体；putA*(R60 stop codon)指第60位精氨酸(R)突变成终止密码子失活脯氨酸脱氢酶的putA突变体；avtA*(L63 stop codon)指第63位亮氨酸(L)突变成终止密码子失活脯氨酸脱氢酶的avtA突变体。
本发明在设计基因工程菌的构建方案中，根据谷氨酸棒杆菌L-脯氨酸的代谢途径，在谷氨酸棒杆菌ATCC13032ProBG149K上构建了一系列突变体，如：基因putA、gnd、zwf、avtA的突变或失活；gdh的增强；odhA的调控。其中putA的失活阻断了L-脯氨酸的降解，gnd和zwf的突变提高了辅因子NADPH的水平，avtA的失活降低了副产物丙氨酸的合成，gdh的增强增加了L-脯氨酸生物合成前体谷氨酸的供应，odhA的调控微调了TCA循环，增加L-脯氨酸生物合成通量，在以上突变体中使用质粒形式过表达proB*(G149K)进一步增强L-脯氨酸生物合成通量从而有利于L-脯氨酸的合成，构建出了高产L-脯氨酸的工程菌株ZQJY-9，保藏编号为CCTCC NO:M 2020060。
本发明中，提高L-脯氨酸产生菌生产能力的一个策略是步骤C，即，使odhA基因的表达调控，是通过改变调控区序列而实现。如对RBS区域进行突变，RBS是核糖体结合位点(ribosomebinding site)的简称，是指起始密码子AUG上游的一段富含嘌呤G、A的非翻译区。在RBS中有SD(Shine-Dalg-arno)序列，长度一般为5个核苷酸，该序列与核糖体16SrRNA的3’端互补配对，促使核糖体结合到mRNA上，有利于翻译的起始。
谷氨酸棒杆菌ATCC13032突变菌株的构建方法，参考Jiang Y.等报道的文献(Jiang,Y.,et al.,Nature Communications,2017.8)。例如，发明人从原始菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032出发，经过多个步骤的基因改造，构建出多种基因型，不断提高L-脯氨酸的产量，最终得到具有工业应用前景的工程菌，参见表1，不同基因型菌株L-脯氨酸产量的逐步提高验证了本发明设计思路的正确。
表1、本发明构建的基因工程菌
Figure BDA0002508620750000071
Figure BDA0002508620750000081
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
实施例
材料和方法
本文中的全基因合成、引物合成及测序皆由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。比如感受态细胞转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆实验指南》(第三版)第1章96页进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
主要培养基及缓冲液：
LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠。(固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
BHIS培养基：37g/L BHI，91g/L山梨醇。(固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
BHIS-suc培养基：37g/L BHI，91g/L山梨醇，200g/L蔗糖，10g/L葡萄糖。
20×电转母液：80g/L甘氨酸，2％吐温80。
以下实施例中，所述卡那霉素在培养基中的终浓度为50μg/ml，所述壮观霉素在培养基中的终浓度为100μg/ml，所述氯霉素在培养基中的终浓度为10μg/ml。
以下实施例中使用的引物序列信息如表2所示。
表2、引物序列
Figure BDA0002508620750000091
Figure BDA0002508620750000101
表中，名称中的“-F”代表正向；“-R”代表反向。
表3、基因odhA表达调控所用修复模板
Figure BDA0002508620750000102
Figure BDA0002508620750000111
注：下划线为PAM序列，大写处为替换碱基。
实施例1：构建基因putA、gnd突变和基因gdh增强的菌株ZQJY-3
1、pk18mobsacB-spec-Peftu-gdh质粒的构建
(1)用引物pk18-kan-zzz-F和pk18-EcoRI-R，以pk18mobsacB为模板，扩增约4.3kb的片段1，用引物pk18-crtYf-L和pk18-crtYf-R，以文献(Jiang,Y.,et al.,NatureCommunications,2017.8)中报道的质粒pJYS3_ΔcrtYf为模板，扩增约2.1kb的片段2，用引物pk18-HindIII-F和pk18-kan-qdz-R，以pk18mobsacB为模板，扩增约500bp的片段3，用引物pk18-spec-F和pk18-spec-R，从文献(Jiang,Y.,et al.,Nature Communications,2017.8)中报道的质粒pJYS2_crtYf上扩增约1.2kb的壮观抗性片段4，将片段1、2、3、4进行Gibson连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(上海东寰生物科技有限公司)，涂布LB-spec平板，得到质粒pk18mobsacB-spec_ΔcrtYf。
(2)用引物pk18-HindIII-F/pk18-EcoRI-R从pk18mobsacB-spec_ΔcrtYf扩增骨架载体片段5，分别用引物gdh-L-F/gdh-L-R、etfu-F/etfu-R、gdh-R-F/gdh-R-R从ATCC13032基因组上扩增上下游同源臂和Peftu启动子，将片段5与扩增的上下游同源臂和Peftu启动子片段Gibson连接，转化DH5α感受态细胞，得到质粒pk18mobsacB-spec-Peftu-gdh。
2、制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032ProBG149K感受态细胞
挑取谷氨酸棒状杆菌ATCC13032ProBG149K在BHIS平板上划线，30℃恒温培养箱中过夜培养，挑取单菌落到BHIS试管培养基中，在30℃，220rpm的过夜培养。接种1ml菌液到100ml的BHIS液体培养基摇瓶中，恒温摇床上30℃，220rpm培养4-6h至OD 600值达到1.0左右。在超净工作台上，将菌液全部转移至50ml离心管中，4℃，4500×g离心，弃上清，用10％甘油洗涤菌体，使菌体重悬，4℃，4500×g离心，重复洗涤1遍，弃上清。最后加入600μl的10％甘油，使菌体悬浮，分装到1.5ml离心管中，每90μl制备为一支感受态细胞，感受态细胞可放置在-80℃冰箱中保存。
3、pk18mobsacB-spec-Peftu-gdh电转化ATCC13032ProBG149K感受态细胞
取1μg以上质粒pk18mobsacB-spec-Peftu-gdh到谷氨酸棒状杆菌ATCC13032ProBG149K感受态细胞中，混匀后转移至电转杯中，在25uF、2.5kV、200Ω的条件下进行电击，电击时间为5.0ms，电击后立即转入900μl 46℃预热的BHIS液体培养基中，并在46℃水浴锅中水浴6min，然后置于恒温摇床中30℃，220rpm培养1h，使菌体复苏。复苏之后取50μl菌体涂布在含壮观霉素的BHIS平板上，将平板倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。
4、制备ATCC13032ProBG149K(pk18mobsacB-spec-Peftu-gdh)感受态细胞
制备方法同步骤2。
5、pkts-ptac-BE3-putA-gnd-gdh质粒的构建
(1)用引物pkts-F(HpaI)和pkts-R(kpnI)-1以文献(Jiang,Y.,et al.,NatureCommunications,2017.8)中报道的质粒pJYS1Peftu为模板，扩增约5.7kb的片段6，用引物rrnB-F(swaI)-1和rrnB-R以pXMJ19为模板，扩增480bp的片段7，用引物UGI-F(BE3)和APOBEC1-R(BE3)-1，以pCMW-BE3为模板扩增约5.2kb片段8，用引物ptac-F-1和lacIq-R以pXMJ19为模板扩增约1.4kb片段9，将片段6、7、8、9进行Gibson连接，转化DH5α感受态细胞，得到质粒pKts-ptac-BE3。
(2)用kpnI/swaI酶切pKts-ptac-BE3回收约12kb的骨架片段10，合成靶向基因putA、gnd、gdh的gRNA阵列(array)约400bp，酶切后与片段10使用T4连接酶进行连接，转化，得到质粒pkts-ptac-BE3-putA-gnd-gdh。
6、转化质粒pkts-ptac-BE3-putA-gnd-gdh到ATCC13032ProBG149K(pk18mobsacB-spec-Peftu-gdh)感受态细胞并验证
转化方法同步骤3。复苏之后取全部菌体涂布在含卡那霉素BHIS-suc平板上，将平板倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。挑取平板上的单菌落，分别使用引物F-sputA/R-sputA、F-sgnd/R-sgnd、F-sgdh/R-sgdh进行PCR，片段大小约2kb，将PCR片段送测序，验证正确。
7、质粒丢失
挑取菌落PCR验证为阳性的单菌落，接种于无抗生素的BHIS试管中，37℃过夜培养；次日菌液划线接种于BHIS平板上，37℃过夜培养；次日挑取BHIS平板上的转化子，分别点板BHIS平板和含卡那霉素的BHIS平板，倒置在30℃恒温培养箱中培养24小时。若能在BHIS平板上生长而不能在含卡那霉素的BHIS平板上生长，表明质粒丢失，得到基因型为ATCC13032 ProBG149KΔputA Peftu::gdh GndS361F的菌株ZQJY-3。
实施例2：构建基因zwf失活的菌株ZQJY-4
1、失活质粒pK18mobsacB-ZwfA243T的构建
使用引物pk18-F和pk18-R，以pK18mobsacB为模板，扩增约5.6kb的载体片段11，用引物zwf-aL-F/zwf-aL-R和引物zwf-aR-F/zwf-aR-R分别以ATCC 13032基因组为模板，扩增约1kb的片段12和13，将片段11、12、13进行Gibson连接，转化DH5α感受态细胞，得到质粒pK18mobsacB-ZwfA243T。
2、制备ZQJY-3感受态细胞。
制备方法同实施例1步骤2。
3、转化质粒pK18mobsacB-ZwfA243T到ZQJY-3感受态细胞
转化方法同实施例1步骤3。复苏之后取全部菌体涂布在含卡那霉素的BHIS平板上，将平板倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。
4、SacB蔗糖反筛
挑取含卡那霉素的BHIS平板上的转化子，接种到无抗性的BHIS试管培养基中，在恒温摇床中30℃，220rpm培养24小时，使其发生双交换。将菌体稀释1000倍后涂布在含20％蔗糖的BHIS-suc平板上，倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。挑取BHIS-suc平板转化子，分别点板BHIS平板和含卡那霉素的BHIS平板，倒置在30℃恒温培养箱中培养24小时。使用引物F-szwf/R-szwf进行PCR测序扩增验证在BHIS平板生长而在含卡那霉素的BHIS平板不能生长的转化子，挑取阳性转化子到4mL的BHIS试管培养基中，在恒温摇床上30℃，220rpm培养24小时，使用20％甘油保菌。得到基因型为ATCC13032ProBG149KΔputA Peftu::gdhGndS361F ZwfA243T的ZQJY-4菌株。
实施例3：构建基因avtA失活的菌株ZQJY-6
1、质粒pJYS2_avtA的构建
使用引物avtAspc-F和avtAspc-R，以pJYS2_crtYf为模板扩增片段后，直接转化DH5α感受态细胞，涂布含有壮观霉素的BHIS固体平板，得到质粒pJYS2_avtA。
2、合成修复模板avtA(TAA)59
修复模板avtA(TAA)59序列为：
CAGAGATCGCTCTTCGCTCGGGTCCTTAATAATACACCGAGGTGATTGGTGATCGTGAG
3、制备ZQJY-4感受态细胞。
制备方法同实施例1步骤2。
4、转化质粒pJYS2_avtA和修复模板avtA(TAA)59到ZQJY-4感受态细胞
取1μg上述质粒pJYS2_avtA和1～10μg修复模板avtA(TAA)59，混匀后加入到谷氨酸棒状杆菌ZQJY-4感受态细胞中，混匀后转移至电转杯中，转化条件同实施例1步骤3。复苏之后取全部菌体涂布在含壮观的BHIS平板上，将平板倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。挑取平板上的单菌落使用引物F-savtA/R-savtA进行PCR，片段大小约2kb，将PCR片段送测序，验证正确。
5、质粒丢失
质粒丢失方法同实施例1步骤7，得到基因型为ATCC13032 ProBG149KΔputAPeftu::gdh GndS361F ZwfA243TΔavtA的菌株ZQJY-6。
实施例4：构建基因odhA表达调控的菌株ZQJY-7
1、质粒pJYS2_odhA的构建
使用引物sgRNA-odhA-TTTC-F和sgRNA-odhA-TTTC-R，以pJYS2_crtYf为模板扩增片段后，直接转化DH5α感受态细胞，涂布含有壮观霉素的BHIS固体平板，得到质粒pJYS2_odhA。
2、合成odhA所用修复模板
odhA基因的RBS为AGGCG(Pfeifer-Sancar,K.,et al.,BMC Genomics,2013.14(1):p.888.)，我们将RBS库设计为NGG/ANG，共31条引物(表3)。GTG为odhA的起始密码子，以起始密码子上游第18位到第21位的GAAA为PAM序列，引物中将第二个A协同突变为T(表3)。
合成表3中的odhA所用修复模板共31条引物，合成引物配制浓度为2μg/μl。
3、制备ZQJY-6感受态细胞。
制备方法同实施例1步骤2。
4、转化质粒pJYS2_odhA和修复模板到ZQJY-6感受态细胞并发酵验证
取前15条引物，每管修复引物各0.5μl混匀，与1μg以上质粒pJYS2_avtA加入到谷氨酸棒状杆菌ZQJY-6感受态细胞中，混匀后转移至电转杯中，转化条件同实施例1步骤3。复苏之后取全部菌体涂布在含壮观的BHIS平板上，将平板倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时；第二批16条引物转化方法同前。PCR测序引物为F-sodhA/R-sodhA。L-脯氨酸产量提高的发酵数据以及相应odhA基因的调控区序列见表4，产量最高的菌株产量为12.80±0.18g/L，其odhA基因的RBS区域发生缺失，且其它调控区发生突变，序列为：AATAAACCCTCAAGAAGCAAGGTAGGAGTACCTGCCGTG(SEQ ID NO:2)(包括3’-端起始密码子GTG)。
表4、L-脯氨酸产量提高的菌株产量及相应odhA基因的调控区序列
Figure BDA0002508620750000151
Figure BDA0002508620750000161
5、质粒丢失
质粒丢失方法同实施例1步骤7，将产量最高的菌株丢失质粒后得到基因型为ATCC13032 ProBG149KΔputA Peftu::gdh GndS361F ZwfA243TΔavtAodhA(调控区突变)的菌株ZQJY-7。
实施例5：构建过表达基因突变体proB*(G149K)的菌株ZQJY-9
1、重组质粒pXMJ19-Peftu::ProBG149K的构建
用HpaI/EcoRI酶切pXMJ19，得到约5.3kb大片段14；使用引物proB(Peftu)-F/proB(rrnB)-R，以ZQJY-1基因组为模板，扩增约1kb片段15；使用引物Peftu(HpaI)-F/Peftu(proB)-R，以ZQJY-1基因组为模板，扩增约300bp片段16，将片段14、15、16进行Gibson连接，转化DH5α感受态细胞，得到质粒pXMJ19-Peftu::ProBG149K。
2、制备ZQJY-7感受态细胞。
制备方法同实施例1步骤2。
3、转化质粒pXMJ19-Peftu::ProBG149K到ZQJY-7感受态细胞
转化方法同实施例1步骤3。复苏之后取50μl菌体涂布在含卡那霉素的BHIS平板上，将平板倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。挑取单克隆到4mL的BHIS试管培养基中，在恒温摇床上30℃，220rpm培养24小时，使用20％甘油保菌。得到基因型为ATCC13032ProBG149KΔputA Peftu::gdh GndS361F ZwfA243TΔavtAodhA(调控区突变)/pXMJ19-Peftu::ProBG149K的ZQJY-9菌株，保藏编号为CCTCC NO:M 2020060。
实施例6：L-脯氨酸基因工程菌ZQJY-9摇瓶发酵生产L-脯氨酸
L-脯氨酸基因工程菌摇瓶发酵生产L-脯氨酸的方法如下：
取L-脯氨酸基因工程菌ZQJY-9甘油菌，划线BHIS平板，将平板倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。挑取1cm2的菌落接种到含有15mL摇瓶种子培养基的250mL摇瓶中，30℃，220rpm培养20h左右，将1mL摇瓶种子液转接到含有20mL摇瓶发酵培养基QFYS的500mL锥形瓶中，30℃，220rpm培养，发酵过程中使用氨水调节pH。发酵结束后，利用HPLC测定发酵液上清中L-脯氨酸含量。L-脯氨酸基因工程菌ZQJY-9的摇瓶发酵产量为19.68±0.22g/L。
HPLC检测方法如下：
检测方法：使用通过邻苯二甲醛-9-芴甲基氯甲酸酯(O-phthalaldehyde-9-fluorenylmethyl chloroformate,OPA-FMOC)柱前衍生高效液相色谱法来测定发酵液中L-脯氨酸含量。
色谱条件：Agilent 1200液相色谱，Eclipse Plus C18柱，3.5μm，4.6×100mm柱子，DAD G1321A检测器，检测波长UV 338nm，10nm(带宽)，参比390nm，20nm(带宽)，流速：1ml/min，柱温：40℃。
衍生剂配制：
硼酸缓冲液：0.4M硼酸缓冲液，准确称取6.183g硼酸，溶于超纯水中，用10M NaOH溶液调至pH 10.2，定容至250ml容量瓶中；
衍生剂1：准确称取500mg邻苯二甲醛(OPA)固体，加5ml无水乙醇，加500μl巯基丙酸，用0.4M pH 10.2的硼酸缓冲液定容至50ml。此溶液最好现配现用；
衍生剂2：FMOC/乙腈溶液：5g/L
流动相配制：
流动相A：10mM Na2HPO4+10mM Na2B4O7盐酸调pH至8.2，0.22μm滤膜过滤后备用；
流动相B：ACN:MeOH:H2O＝45:45:10,定容1L备用，试剂纯度为HPLC级。
梯度洗脱程序如表5：
表5、HPLC梯度洗脱程序
时间(min) 流动相B(％) 流动相A(％) 流速(ml/min)
0 2 98 1.0
2 2 98 1.0
15.5 57 43 1.0
15.6 57 43 1.0
23.5 100 0 1.0
25 2 98 1.0
实施例7：L-脯氨酸基因工程菌ZQJY-9发酵罐发酵生产L-脯氨酸
L-脯氨酸基因工程菌发酵罐发酵生产L-脯氨酸的方法如下：
在3L的BIOFLO 110发酵罐上进行补料分批发酵。取L-脯氨酸基因工程菌ZQJY-9甘油菌，划线BHIS平板，将平板倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。从平板上挑取2cm2的菌落接种到含有120mL种子液培养基的2L摇瓶中，30℃，230rpm培养26h后，按照10％的接种量接种到含有1.2L发酵液的发酵罐中。发酵温度控制在32℃，浓氨水控制pH为6.9，DO为30％，初始转速200rpm。通过使用800g/L葡萄糖补料培养基进行补料，使得发酵罐培养基中葡萄糖浓度控制在5±5g/L的范围内。发酵80h结束后，利用HPLC测定发酵液上清中L-脯氨酸含量。ZQJY-9的L-脯氨酸产量在80h达到119.90g/L，转化率为0.20g/g(L-脯氨酸/葡萄糖)，产率为1.581g/L/h，最终的L-丙氨酸产量仅为5.45g/L，ZQJY-9在76h时达到最高L-脯氨酸产量为120.18g/L。
上述实验可见，本发明构建的基因突变菌株ZQJY-9的L-脯氨酸生产能力比菌株ATCC13032 ProBG149K(即ZQJY-1)提高了至少3倍，在发酵过程中能够实现L-脯氨酸的有效积累，发酵罐发酵后，L-脯氨酸的产量高达119.90g/L，具有工业化应用前景。
序列表
<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心
<120> 一种提高氨基酸产生菌生产能力的方法
<130> SHPI2010231
<150> 2020103438899
<151> 2020-04-27
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
aataaaccct caagaagcaa gggagagtac ctgccgtg 38
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
aataaaccct caagaagcaa ggtaggagta cctgccgtg 39
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
aataaaccct caagaagcaa gaggagtacc tgccgtg 37
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
aataaaccct caagaagcag aggagtacct gccgtg 36
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
aataaaccct caagaagcaa gagaggagta cctgccgtg 39
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
aataaaccag aagcaaggaa aagaggcgag tacctgccgt g 41
<210> 7
<211> 6711
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
gtgtcagtag gcgcgtaggg taagtggggt agcggcttgt tagatatctt gaaatcggct 60
ttcaacagca ttgatttcga tgtatttagc tggccgttac cctgcgaatg tccacagggt 120
agctggtagt ttgaaaatca acgccgttgc ccttaggatt cagtaactgg cacattttgt 180
aatgcgctag atctgtgtgc tcagtcttcc aggctgctta tcacagtgaa agcaaaacca 240
attcgtggct gcgaaagtcg tagccaccac gaagtccagg aggacataca atgcgtgagc 300
gcatctccaa cgctaagcga gtggtggtga aaattggttc gtcctcattg actaacgatg 360
aggacggaca caccgtcgat cccaaccgca tcaacactat tgtcaatgcc ttgcaagcac 420
gcatggaagc tggctcggac ctcatcgttg tgtcctctgg cgcagtggcc gcgggaatgg 480
ccccgcttgg attgagcacc cggcccacgg aattggcagt caagcaggct gcagcagcag 540
tggggcaagt tcacctcatg caccagtggg gacgttcttt tgcccggtat ggtcgcccca 600
tcggccaggt gcttcttacc gcagctgatg caggaaagcg tgatcgtgcg aggaatgcgc 660
agcgtaccat cgacaagctg cgcattttgg gcgcggttcc tatcgtcaat gaaaatgaca 720
ccgtggcaac caccggtgtg aattttggtg acaacgaccg acttgctgca attgtggcgc 780
acctggtgtc ggctgatgct ttggtgctgc tcagtgacgt ggatggactt tttgataaaa 840
accctactga tcccaccgcg aagtttattt ccgaggttcg tgacggcaat gatttgaaag 900
gtgtcattgc cggcgacggc ggaaaagtgg gcaccggtgg catggcatca aaggtgtctg 960
ctgcacgttt ggcttcccga agtggcgtgc ctgtgctgtt gacctctgcg gcaaacattg 1020
gcccagcact ggaagacgcc caggtgggca ctgtattcca ccccaaggac aaccgcctct 1080
ccgcgtggaa gttctgggct ttgtatgccg cagatactgc aggaaagatc cgactcgatg 1140
acggcgcggt ggaagcagtg acctccggtg gtaaatcttt gctggctgtg ggcattactg 1200
aaatcattgg tgatttccag cagggtgaga tcgtggagat cttgggacct gccggccaaa 1260
tcatcgggcg aggcgaggtg tcctacgatt ctgatacctt gcaatcaatg gttggtatgc 1320
aaacgcagga ccttccagat ggcatgcagc gcccggtagt gcatgcagat tatctgtcca 1380
actacgccag ccgcgcgtaa gaattcagct tggctgtttt ggcggatgag agaagatttt 1440
cagcctgata cagattaaat cagaacgcag aagcggtctg ataaaacaga atttgcctgg 1500
cggcagtagc gcggtggtcc cacctgaccc catgccgaac tcagaagtga aacgccgtag 1560
cgccgatggt agtgtggggt ctccccatgc gagagtaggg aactgccagg catcaaataa 1620
aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg 1680
ctctcctgag taggacaaat ccgccgggag cggatttgaa cgttgcgaag caacggcccg 1740
gagggtggcg ggcaggacgc ccgccataaa ctgccaggca tcaaattaag cagaaggcca 1800
tcctgacgga tggccttttt gcgtttctac aaactctttt gtttattttt ctaaatacat 1860
tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa 1920
aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt 1980
tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag 2040
ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt 2100
tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcacttttg cttcctcgct cactgactcg 2160
ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg 2220
ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag 2280
gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 2340
gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 2400
taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 2460
accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca atgctcacgc 2520
tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 2580
cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 2640
agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 2700
gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca 2760
gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 2820
tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 2880
acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 2940
cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc 3000
acctagatcc ttttggggtg ggcgaagaac tccagcatga gatccccgcg ctggaggatc 3060
atccagccat tcggggtcgt tcactggttc ccctttctga tttctggcat agaagaaccc 3120
ccgtgaactg tgtggttccg ggggttgctg atttttgcga gacttctcgc gcaattccct 3180
agcttaggtg aaaacaccat gaaacactag ggaaacaccc atgaaacacc cattagggca 3240
gtagggcggc ttcttcgtct agggcttgca tttgggcggt gatctggtct ttagcgtgtg 3300
aaagtgtgtc gtaggtggcg tgctcaatgc actcgaacgt cacgtcattt accgggtcac 3360
ggtgggcaaa gagaactagt gggttagaca ttgttttcct cgttgtcggt ggtggtgagc 3420
ttttctagcc gctcggtaaa cgcggcgatc atgaactctt ggaggttttc accgttctgc 3480
atgcctgcgc gcttcatgtc ctcacgtagt gccaaaggaa cgcgtgcggt gaccacgacg 3540
ggcttagcct ttgcctgcgc ttctagtgct tcgatggtgg cttgtgcctg cgcttgctgc 3600
gcctgtagtg cctgttgagc ttcttgtagt tgctgttcta gctgtgcctt ggttgccatg 3660
ctttaagact ctagtagctt tcctgcgata tgtcatgcgc atgcgtagca aacattgtcc 3720
tgcaactcat tcattatgtg cagtgctcct gttactagtc gtacatactc atatttacct 3780
agtctgcatg cagtgcatgc acatgcagtc atgtcgtgct aatgtgtaaa acatgtacat 3840
gcagattgct gggggtgcag ggggcggagc caccctgtcc atgcggggtg tggggcttgc 3900
cccgccggta cagacagtga gcaccggggc acctagtcgc ggataccccc cctaggtatc 3960
ggacacgtaa ccctcccatg tcgatgcaaa tctttaacat tgagtacggg taagctggca 4020
cgcatagcca agctaggcgg ccaccaaaca ccactaaaaa ttaatagtcc ctagacaaga 4080
caaacccccg tgcgagctac caactcatat gcacgggggc cacataaccc gaaggggttt 4140
caattgacaa ccatagcact agctaagaca acgggcacaa cacccgcaca aactcgcact 4200
gcgcaacccc gcacaacatc gggtctaggt aacactgagt aacactgaaa tagaagtgaa 4260
cacctctaag gaaccgcagg tcaatgaggg ttctaaggtc actcgcgcta gggcgtggcg 4320
taggcaaaac gtcatgtaca agatcaccaa tagtaaggct ctggcggggt gccataggtg 4380
gcgcagggac gaagctgttg cggtgtcctg gtcgtctaac ggtgcttcgc agtttgaggg 4440
tctgcaaaac tctcactctc gctgggggtc acctctggct gaattggaag tcatgggcga 4500
acgccgcatt gagctggcta ttgctactaa gaatcacttg gcggcgggtg gcgcgctcat 4560
gatgtttgtg ggcactgttc gacacaaccg ctcacagtca tttgcgcagg ttgaagcggg 4620
tattaagact gcgtactctt cgatggtgaa aacatctcag tggaagaaag aacgtgcacg 4680
gtacggggtg gagcacacct atagtgacta tgaggtcaca gactcttggg cgaacggttg 4740
gcacttgcac cgcaacatgc tgttgttctt ggatcgtcca ctgtctgacg atgaactcaa 4800
ggcgtttgag gattccatgt tttcccgctg gtctgctggt gtggttaagg ccggtatgga 4860
cgcgccactg cgtgagcacg gggtcaaact tgatcaggtg tctacctggg gtggagacgc 4920
tgcgaaaatg gcaacctacc tcgctaaggg catgtctcag gaactgactg gctccgctac 4980
taaaaccgcg tctaaggggt cgtacacgcc gtttcagatg ttggatatgt tggccgatca 5040
aagcgacgcc ggcgaggata tggacgctgt tttggtggct cggtggcgtg agtatgaggt 5100
tggttctaaa aacctgcgtt cgtcctggtc acgtggggct aagcgtgctt tgggcattga 5160
ttacatagac gctgatgtac gtcgtgaaat ggaagaagaa ctgtacaagc tcgccggtct 5220
ggaagcaccg gaacgggtcg aatcaacccg cgttgctgtt gctttggtga agcccgatga 5280
ttggaaactg attcagtctg atttcgcggt taggcagtac gttctcgatt gcgtggataa 5340
ggctaaggac gtggccgctg cgcaacgtgt cgctaatgag gtgctggcaa gtctgggtgt 5400
ggattccacc ccgtgcatga tcgttatgga tgatgtggac ttggacgcgg ttctgcctac 5460
tcatggggac gctactaagc gtgatctgaa tgcggcggtg ttcgcgggta atgagcagac 5520
tattcttcgc acccactaaa agcggcataa accccgttcg atattttgtg cgatgaattt 5580
atggtcaatg tcgcgggggc aaactatgat gggtcttgtt gttggcgtcc cggaaaacga 5640
ttccgaagcc caacctttca tagaaggcgg cggtggaatc gaaatctcgt gatggcaggt 5700
tgggcgtcgc ttggtcggtc atttcgaagg gcaccaataa ctgccttaaa aaaattacgc 5760
cccgccctgc cactcatcgc agtactgttg taattcatta agcattctgc cgacatggaa 5820
gccatcacag acggcatgat gaacctgaat cgccagcggc atcagcacct tgtcgccttg 5880
cgtataatat ttgcccatgg tgaaaacggg ggcgaagaag ttgtccatat tggccacgtt 5940
taaatcaaaa ctggtgaaac tcacccaggg attggctgag acgaaaaaca tattctcaat 6000
aaacccttta gggaaatagg ccaggttttc accgtaacac gccacatctt gcgaatatat 6060
gtgtagaaac tgccggaaat cgtcgtggta ttcactccag agcgatgaaa acgtttcagt 6120
ttgctcatgg aaaacggtgt aacaagggtg aacactatcc catatcacca gctcaccgtc 6180
tttcattgcc atacggaact ccggatgagc attcatcagg cgggcaagaa tgtgaataaa 6240
ggccggataa aacttgtgct tatttttctt tacggtcttt aaaaaggccg taatatccag 6300
ctgaacggtc tggttatagg tacattgagc aactgactga aatgcctcaa aatgttcttt 6360
acgatgccat tgggatatat caacggtggt atatccagtg atttttttct ccattttagc 6420
ttccttagct cctgaaaatc tcgtcgaagc tcggcggatt tgtcctactc aagctgatcc 6480
gacaaaatcc acacattatc ccaggtgtcc ggatcggtca aatacgctgc cagctcatag 6540
accgtatcca aagcatccgg ggctgatccc cggcgccagg gtggtttttc ttttcaccag 6600
tgagacgggc aacagctgat tgcccttcac cgcctggccc tgagagagtt gcagcaagcg 6660
gtccacgtgg tttgccccag caggcgaaaa tcctgtttga tggtggttaa c 6711

Claims (10)

1.一种提高氨基酸产生菌生产能力的方法，其特征在于，包括下述步骤：使该氨基酸产生菌的染色体上编码α-酮戊二酸脱氢酶复合物的Elo亚基的odhA基因的调控区发生突变和/或缺失。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸选自L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-羟脯氨酸、L-精氨酸、L-瓜氨酸、L-鸟氨酸及其它L-谷氨酸衍生物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述odhA基因的阅读框起始密码子之前第11至第15个碱基的核糖体结合RBS区域的碱基序列AGGCG被其它碱基序列取代。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述其它碱基序列选自下组：AGAGG、TGAGG、GGAGG、CGAGG、GAAGG。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述odhA基因的调控区发生突变和/或缺失是指odhA基因的阅读框起始密码子之前的序列发生突变和/或缺失，包含起始密码子GTG的所述序列选自下组：
AATAAACCCTCAAGAAGCAAGGGAGAGTACCTGCCGTG(SEQ ID NO:1)；
AATAAACCCTCAAGAAGCAAGGTAGGAGTACCTGCCGTG(SEQ ID NO:2)；
AATAAACCCTCAAGAAGCAAGAGGAGTACCTGCCGTG(SEQ ID NO:3)；
AATAAACCCTCAAGAAGCAGAGGAGTACCTGCCGTG(SEQ ID NO:4)；
AATAAACCCTCAAGAAGCAAGAGAGGAGTACCTGCCGTG(SEQ ID NO:5)；
AATAAACCAGAAGCAAGGAAAAGAGGCGAGTACCTGCCGTG(SEQ ID NO:6)。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述odhA基因的调控区变成SEQ ID NO:2；并且使氨基酸产生菌的染色体上发生putA基因失活；gnd*(S361F)和zwf*(A243T)基因突变；gdh基因强化；avtA基因失活；proB*(G149K)基因突变；proB*(G149K)基因以游离质粒pXMJ19表达，并置于组成型启动子Peftu后。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述putA基因失活是编码区第60位精氨酸突变为终止密码子；所述gdh基因强化是将天然启动子替换为强启动子Peftu；所述avtA基因失活是将编码区第63位亮氨酸突变为终止密码子。
8.一种生产L-脯氨酸的基因工程菌，其特征在于，按照如权利要求1-7中任一项所述的方法构建得到。
9.权利要求8所述的基因工程菌，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020060。
10.如权利要求8或9所述的基因工程菌用于生产L-脯氨酸的应用。
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