MXPA03011302A - Procesamiento y vectores para la produccion de plantas trasgenicas. - Google Patents
Procesamiento y vectores para la produccion de plantas trasgenicas.Info
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Abstract
Un procedimiento para la produccion de plantas transgenicas o celulas de plantas capaces de expresar una secuencia de codificacion de interes bajo el control de traduccion y de transcripcion de los elementos de traduccion y de transcripcion nuclear del clon, que comprende la introduccion en el genoma nuclear, de las plantas clonadas o de las celulas de las plantas, un vector que comprende la secuencia de codificacion de interes la cual esta libre de (a) un elemento en direccion de la iniciacion de la transcripcion eficaz en las planas clonadas o en las celulas de las plantas y enlazadas eficazmente a la secuencia de codificacion y requerida para su transcripcion; (b) un elemento en direccion de la iniciacion de la traduccion eficaz en las plantas clonadas o en las celulas de las plantas y enlazadas eficazmente a la codificacion de la secuencia; y posteriormente la seleccion de las celulas de las plantas o las plantas que expresan la secuencia de codificacion de interes.
Description
PROCEDIMIENTO Y VECTORES PARA LA PRODUCCIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS .
CAMPO DE LA INVENCIÓN. La presente invención se refiere a . un procedimiento y a los vectores para la producción de plantas transgénicas asi también como las plantas y las células de las plantas obtenidas a partir del mismo .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN.
La realización de un patrón heredable estable y deseable de la expresión transgénica permanece como uno de . los problemas mayores en la biotecnología de las plantas. La investigación común se refiere a la introducción de un transgénico como parte de una unidad de transcripción independiente completa en un vector, en donde el transgénico está bajo el control de transcripción de una planta especifica heteróloga, o un iniciador homólogo, y las secuencias de la terminación de la transcripción (por ejemplo, ver patente de E.Ü.A. 05,591,605; la patente de E.U.A. 05,977,441; WO 0053762; de E.U.A. NO. 05,352,605, etc.) Sin embargo, después de la integración en el ADN genómico, debido a la introducción aleatoria del ADN exógeno en el ADN genómico de la planta, la expresión del gen desde los vectores de trascripción que se convierten afectados por la mayoría de los factores de clonación diferentes. Estos factores hacen la expresión del transgénico inestable, impredecible y frecuentemente conducen a la acción lenta del transgénico en la progenie (Matzke & Matzke, 2000, Plant Mol. Biol., 43, 401-415; S.B. Gelvin, 1998, Curr. OPin Biotecnol , 9, 227-232; Vaucheret y col., 1998, Plant J. 16, 651-659) . Existen 'ejemplos muy bien documentados de la acción lenta del transgénico en las plantas, los cuales incluyen el procedimiento de transcripción (TGS) y la acción lenta del gen de post-transcripción (PTGS) . Recientes descubrimiento revelan una relación cercana entre la metilación y la estructura de la cromatina en TGS y el desarrollo de la polimerasa de ARN dependiente de ARN y de la nucleasa en PTGS (Meyer , P., 2000, Plant Mol. Biol., 43, 21-234; Ding, S.W. 2000, Cur. Opin Biotechnol. , 11, 152-156, Lyer y col., Plant Mol. Biol, 2000, 43, 323-346) . Por ejemplo, en TGS, el iniciador transgénico puede frecuentemente experimentar la metilación de la mayoría de los sitios de integración con la estructura de la cromatina no favorable a la expresión del transgénico estable. Como un resultado, la práctica de los métodos existentes que requieren de la . mayoría de las plantas transgénicas independientes para que se produzcan y se analicen para las varias generaciones con el fin de encontrar aquellos con el patrón de expresión estable deseado. Además, aún tales plantas exhiben un patrón de expresión ¦ transgénico estable a través de las generaciones que pueden convertirse enseguida a la acción lenta bajo las condiciones que ocurren naturalmente tales como la tensión o un ataque patógeno. Las investigaciones existentes ayudan al control de expresión mejorado, tal como el uso de las regiones de unión estructuradas ( (Alien, G.C., 1996, Plant CelT, 8_, 899-913; Clapham, D, 1995. J. Exp.Bot., 46, 655-662; Alien, G.C., 1993, Plant Cell, 5_, 603-613) que alinea la unidad de transcripción, que pueden incrementar potencialment e la , independencia y la estabilidad de la expresión transgénica mediante la reducción de la dependencia del así conocido "variación de efecto de posición" (Matzke & Matzke, 1998, Curr. Opin. Plant Biol. 1, 142-148; S.B.Gelvin, 1998, Curr. Opin. Biotechnol., 9_, 227-232 , WO 9844 139 Al; WO 006757 Al; EP 1 005 560 Al; AU 00, 018 , 331 Al) . Sin embargo solo proporcionan una solución parcial a un problema existente de plantas designadas con un patrón de expresión requerido de un transgénico. El gen de acci ón lenta puede estar como activador de un mecanismo de defensa de planta mediante los virus que infectan la planta (Ratcliff y col., 1977, Science, 276, 1558-1560; Al-Kaff y col., 1998 Science, 279, 2113-2115) . En las plantas no transgénicas tal acción lenta se dirige contra el patógeno, aunque en las plantas transgénicas puede también ser de acción lenta el transgénico, especialmente cuando el transgénico comparte la homología con un patógeno. Este es un problema especialmente en la mayoría de los diferentes niveles de origen viral que se usan en la designación de los vectores de transcripción. Un ejemplo ilustrativo es la publicación reciente por Al-Kaff y colegas (Al-Kaff y col 2000, Nature Bioteích; 18_, 995-999) quien demostró que la infección de CAMV (virus de mosaico de la coliflor) de una planta transgénica puede ser de acción lenta al gen BAR bajo el control del iniciador 35S derivado de CaMV. Se menciona precisamente que todas las plantas transgénicas liberadas así en el ambiente y cultivadas comercialmente son modificadas ¡usando el iniciador 35S como la señal de iniciación' de transcripción. Durante los últimos años, el conjunto de los elementos cis-reguladores han aumentado significativamente e incluyen en el presente ¦ herramientas para el control temporal y en el tiempo de una manera sofisticada de la expresión transgénica. Esto incluye varios elementos de transcripción tales como varios iniciadores y finalizadores de transcripción asi como también elementos reguladores de transcripción/intensificadores de la expresión del gen. En general los int ensificadores de traducción pueden ser definidos como los elementos de accionamiento cis los cuales junto con los factores de accionamiento trans celular inician la traducción del mARN , La traducción en las células eucariotas es generalmente iniciada por la exploración del ribosoma del extremo 5' de mARN cubierto. Sin embargo la iniciación de traducción puede también ocurrir mediante un mecanismo el cual es independiente de la estructura cubierta. En este caso, los ribosomas son dirigidos al codón de inicio de traducción mediante los elementos del sitio de entrada, del ribosoma interno (IRES) . Estos elementos se descubren inicialment e. en los picornavirus ( Jackson & Kaminski, 1995 ARN, 1_¡_ 985-1000) han sido también identificados en otros mARNs eucariotas celulares y virales. Los IRESs son elementos que actúan cis, tal que junto con otros factores celulares que actúan trans inician el conjunto del complejo ribosomal en el codón de inicio interno del mARN . Esta modalidad de los elementos IRES han sido explotados en los vectores que permiten la expresión de dos o más proteínas de las unidades de transcripción policistrónicas en células de insectos o ánimales. En la actualidad se usan ampliamente en los vectores de expresión bicistrónicos para los sistemas en animales, en los cuales el primer gen se traduce de una manera dependiente cubierto y el segundo es uno bajo el control de un elemento de IRES (Mountford & Smith, 1995, Trenes Genet, 4_, ¦ 179-184 , Martines-Salas, -1999, Curr Opin Biotech. , 19, 458-464) . üsualmente el nivel de expresión de un gen bajo el control de un IRES varía significativamente y está dentro de una variación de 6-100% comparada a la expresión dependiente cubierta de uno primero (Mizuguchi y col., 2000 Mol. Ther., lj_ 376-382) . Estos encuentros tienen implicaciones importantes para el uso de los IRESs, por ejemplo para la determinación en la cual el gen debe ser usado como uno primero en un vector bicistrónico . La presencia de un IREs en un vector de expresión confiere la traducción selectiva no solo bajo condiciones normales, sino también bajo condiciones cuando la traducción dependiente cubierta se inhibe. Esto usualmente espera bajo condiciones acentuadas (infección viral, choque térmico, reducción de crecimiento, etc.) normalmente debido a la ausencia de los factores necesarios de accionamiento trans (Johannes & Sarnow, 1998, ARN, _4, 1500-1513; Sonenberg & Gingras, 1998 , Cur r Opin Cell Biol., 10 , 268-275) . Los vectores basados en traducción recientemente atraen la atención de los investigadores que trabajan con sistemas celulares animales. Existe un reporte ¦ el cual describe el uso de una caja de recombinasa IRES-Cre para la obtención de la expresión especifica del tejido de la ere recombinasa en ratones (Michael y Col., 1999 Mech Dev., 85_, 35-47) . En este trabajo una caja novedosa de IRES-Cre se introduce en la secuencia de exon . del gen EphA2 que codifica un receptor de Eph de la quinasa de tirosina de proteina que expresa anteriormente en el desarrollo. Este trabajo es de un interés especifico como es la primera demostración del uso de los vectores de traducción para la expresión especifica del tejido de un transgénico en células animales que están en el control de transcripción del ADN clonado. Otra aplicación importante de los elementos IRESs y su uso en vectores para la mutagénesis de .inserción. En tales vectores, el informador o el gen marcador elegible está bajo el control de un elemento IRES y puede solamente ser expresado si se inserta dentro de la región traducida del gen activo transcripcional (Zambrowich y col., 1998, Nature, 392, 608-611., Araki y col. , 1999 CeJI Mol Biol, 45, 737-750. Sin embargo a pesar del progreso que se hace en la aplicación de IRES.S en sistemas animales, los elementos de IRES a partir de estos sistemas no trabajan en las células de las plantas. Además, ya que el sitio dirigido o recombinación homologa en las células de las plantas es extremadamente raro y el uso no práctico, investigaciones similares con las células de plantas no están contempladas. Existen datos menos significati os en los elementos de IRES específicos de plantas. Sin embargo recientemente varios IRES que son también activos en plantas se descubren en tobamovirus crTMV (un virus TMV infecta plantas cruciferas) (Ivanov y col., 1997 Virology 232, 32-43; Skulachev y col., 1999 Virology, 263, 139-154; W098/54342) y existen indicaciones del control de traducción de IRES en otros virus de plantas (Hefferon y col., 1997, J. Gen Virol, 78, 3051-3059; Niepel & Gallie, 1999, J. Virol; 73, 9080-9088) . La tecnología de IRES tiene un potencial mayor para el uso en las plantas transgénicas y en los vectores virales de plantas proporcionando una alternativa conveniente para la existencia de los vectores. Actualmente, la aplicación única conocida de los elementos de IRES de la planta para la transformación nuclear estable conecta con el uso de IRES para expresar un gen de interés en construcciones bicistrónicas (W098 /54342 ) . La construcción en cuestión comprende, en dirección 5' a 3' un iniciador de transcripción, el primer gen enlazado al iniciador de transcripción, un elemento IRES localizado 3' al primer gen y el segundo gen localizado 3' al elemento IRES, es decir que aun contiene un conjunto completo de los elementos de control de transcripción. Recientemente en nuestra solicitud de patente internacional (PCT/EPOl/14421) describe el uso de los vectores de traducción basados en IRES libres de los elementos reguladores de transcripción. Sorprendentemente hemos encontrado que los vectores usados como control negativo y libres de cualquier elemento regulador de traducción y transcripción, aún dan la frecuencia de transformación, la cual es lo suficientemente elevado para las aplicaciones prácticas, por ejemplo para la producción de plantas transgénicas , la característica de expresión' de interés como la fusión de traducción con proteína endogénica'. Es un objeto de esta invención proporcionar un procedimiento novedoso para la producción de plantas transgénicas o células de plantas las cuales son capaces de la expresión estable de una secuencia de codificación integrada en el genoma y que son reducidamente susceptibles a la acción lenta del transgénico. DESCRIPCION GENERAL DE LA INVENCION. Esta invención proporciona un procedimiento para la producción de plantas transgénicas o células de plantas capaces de expresar una secuencia de codificación bajo el control de traducción y transcripción de los elementos de traducción y transcripción nucleares clonados, mediante la introducción en el genoma nuclear de plantas clonadas o células de plantas para las plantas transgénicas o células de plantas de un vector que comprende la secuencia de codificación la cual está desprovista de
(a) un elemento en dirección en la iniciación de la transcripción eficaz en las plantas clonadas o células de plantas y que se enlazan eficazmente a la secuencia de codificación y que se requiere para su transcripción; (b) un elemento en dirección de iniciar la traducción eficaz en las plantas clonadas o en las células de plantas y que se enlazan eficazmente a la secuencia de codificación; y enseguida seleccionar las células de plantas o plantas que expresan la secuencia de codificación. Esta invención proporciona además un procedimiento para ' la producción de plantas transgénicas o células de plantas capaces de expresar una característica útil, un procedimiento de expresión de una secuencia de codificación bajo el control de traducción y transcripción de los elementos de traducción y transcripción nucleares clonados mediante la introducción en el genoma nuclear de» las plantas clonadas o de las células de plantas para las plantas transgénicas o células de plantas, un vector que comprende la secuencia de codificación la cual está desprovista de (a) Un elemento en dirección de iniciar la transcripción eficaz en las plantas clonadas o células de plantas que se enlazan eficazmente a- la secuencia de codificación y que se requiere para su transcripción; (b) U'n elemento en dirección de iniciar la traducción eficaz en las plantas clonadas o en las células de plantas y que se enlazan eficazmente a' la secuencia de codificación; y seleccionar enseguida las células de plantas o plantas que expresan la secuencia de codificación. Durante la experimentación con los vectores de traducción se ha encontrado un nuevo método de la transformación genética de las plantas o de las células de. las plantas. Se basa en el uso de los vectores que tienen una secuencia de codificación libre de cualquier transcripción eficaz o de elementos de iniciación de traducción (elementos eficaces (a) y (b) que se enlazan eficazmente y que están trabajando en las plantas clonadas o células de plantas. La secuencia de codificación puede o no puede tener un elemento eficaz de terminación de la transcripción que se enlaza eficazmente al mismo. De preferencia tiene · una señal de tope de traducción (codón de tope) estos vectores son terminados "vectores de fusión de traducción". La comparación de la eficiencia de transformación que usa los vectores de fusión de traducción y. de traducción- basado en IRES, y de transcripción revela un resultado muy sorprendente. El número de
-transformados con los vectores de fusión de traducción los cuales inicialmente se refieren como el control negativo en los experimentos de transformación, son solamente de dos a diez veces por debajo de- los asi obtenidos con los vectores de traducción basados en IRES. Esta eficacia de transformación está también dentro de los limites útiles prácticamente. Por ejemplo el vector de fusión de traducción pIC1451 (figura 3) que resulta en un determinado número de transformados de Brassica napus los cuales son solamente dos veces inferiores comparados al vector de traducción basado en IRES pIC1301. Los vectores de traducción comprenden un elemento de iniciación de traducción similar a un IRES en dirección de una secuencia de codificación de interés y se basa en la estructura de transcripción de la planta clonada. La Figura 3 muestra un ejemplo de la forma más simple del vector de fusión de traducción de conformidad a la invención. Lo que contiene una secuencia de codificación y está desprovisto de los elementos de iniciación de traducción y de transcripción capaces de enlazarse eficazmente al mismo. El vector puede opcionalmente tener un finalizador de transcripción (finalizador 35S en la Figura 3) . Una modalidad del procedimiento de la invención usa tal vector de fusión de traducción el cual se describe en la Figura 1A: la transformación conducirá a la incorporación del vector en una parte de codificación (un exón) de ¦ un gen activo transcripcionalmente de la planta clonada. Después de la transcripción un mARN híbrido se forma el cual comprende el ARN derivado del ADN nuclear de la planta transgénica o de las células de plantas y del ARN derivado de la secuencia de codificación, es decir un mARN híbrido. Después del proceso del ARN (es decir el empalme del intrón, el revestimiento y la poli adenilación ) , la traducción resulata en una proteína de fusión tiene una porción de una proteína clonada nativa como la parte N-terminal- y el producto del gen de la secuencia de codificación como una parte C-terminal. Preferiblemente los topes de traducción después de la secuencia de codificación se debe a una señal de tope de traducción. La Figura IB desarrolla una modalidad general más compleja, en donde el vector comprende una secuencia de codificación (transgénico 1) .desprovisto de los elementos funcionales (a) y (b) y el cistrón adicional que se une a los mismos y en dirección contraria del mismo. En este caso la secuencia de codificación de- interés (transgénico 1) preferiblemente no tiene un elemento terminal de transcripción eficaz el cual finaliza la transcripción después del transgénico 1. Los cistrones adicionales pueden enlazarse eficazmente a los elementos de traducción y/o transcripción similares a un iniciador o a un elemento de IRES en dirección contraria de la secuencia de codificación de interés y en dirección del cistrón adicional. Además el cistrón adicional preferiblemente tiene una señal de terminación de ' transcripción en dirección contraria a la misma. Preferiblemente los cistrones están bajo el control de traducción del elemento de IREs . En el caso que se muestra en la Figura IB la transcripción y traducción conduce a una proteina de fusión que comprende el producto del gen de la secuencia de codificación de interés. ün cistrón adicional (transgénico 2) se traduce bajo el control de un elemento de IRES. Si el vector de fusión de traducción contiene la secuencia de codificación de interés como la única secuencia de codificación o cistrón, la secuencia de codificación preferiblemente codifica para un marcador seleccionado que permite la selección de los transformados. Si el vector contiene uno o más de los cistrones en dirección contraria de la secuencia de codificación, uno de los cistrones puede codificar para un marcador seleccionado. En otra modalidad preferida, la secuencia de codificación de interés (preferiblemente codificando una marcador seleccionado) en el vector de fusión de traducción es continuado por una secuencia de ADN reconocible mediante las recombinasas del sitio especifico (Figura 1C) . Un transformado obtenido en el proceso de la invención puede luego ser usado para integrar cualquier gen de interés en una segunda transformación. El gen de interés puede de preferencia estar bajo el control de traducción de un elemento de IRES. El elemento de IRES se puede proporcionar en dirección de la secuencia reconocible por una recombinasa de sitio especifico en el vector de fusión de traducción. Un transformado con un patrón de expresión adecuado o deseado y conocido puede ser seleccionado de la segunda transformación.
Alternativamente, el gen del marcador seleccionado en un transformado puede ser reemplazado por cualquier gen de interés usando sitios para la recombinación del lugar especifico en el vector de fusión de traducción (ver por ejemplo que se muestra en la Figura 4). Por lo tanto las plantas transgénicas o las células de las plantas producidas mediante el procedimiento de invención se pueden usar para la ingeniería genética, particularmente para la transformación asignada usando la recombinación de sitio específico. Si el vector de fusión de traducción contiene cistrones adicionales en dirección contraria de la secuencia de codificación de interés, el marcador de transformación es preferiblemente usado como el primer cístrón en el vector. Este procedimiento preferido tiene todas las ventajas de los vectores de traducción basados en IRES, aunque puede aumentar además el cambie de la recuperación del transformado. Tal selección directa para la traducción de la expresión basada en la fusión permite también seleccionar directamente para otras características útiles tales como pero que no se limitan a la resistencia del herbicida. Los vectores para el procedimiento de esta invención pueden ser fácilmente mejorados por ejemplo mediante la incorporación de sitios empalmados con el fin de aumentar el cambio de las fusiones "en-marco" por lo tanto aumenta significativamente la eficiencia de transformación. Típicamente, el procedimiento de la invención conduce a la formación del mensajero híbrido ARN (mARN) que comprenden el ARN derivado del ADN nuclear de las plantas transgénicas o de las células de las plantas y el ARN se deriva de las secuencias de codificación de interés en una modalidad típica el mARN híbrido codifica una proteína de fusión. El mARN híbrido puede también codificar las secuencias de los polipéptidos heterólogos múltiples, por ejemplo cuando el vector contiene además uno o más cistrones en dirección contraria de la secuencia de codificación de interés. En una modalidad adicional el mARN híbrido contiene una segunda secuencia la cual es al menos parcialmente complementaria (contrasentido) para un mARN nativo a la planta o a las células de las lantas para la expresión supresora del mARN nativo de la planta o de las células de las plantas, por ejemplo para el análisis genómico funcional. Con el fin de facilitar la inclusión del vector de fusión de traducción en el mARN híbrido, la característica de la secuencia de codificación del vector puede ser precedido por los sitios del aceptor empalmado ( Figuras 6 y 7 ) . Se conoce que la mayoría de las proteínas incluyen aquellas que codifican el informador de la planta GUS (Kertlundint y col., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 5212-5216) , GFP (Santa Cruz y col. , 1996 Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. A. 93, 6286-6290) y los marcadores seleccionables de transformación NPTII (Vergunst y col., 1998 Nucleic Acids Res., 2_6 2729-2734) , APH (3' ) II (Koncz y col., 1989) Proc. Nat Acad. Sci., USA 8_6, 8467-8471) , BAR (Botterman y col., 1991, Gene, 102, 33-37) puede conservar su actividad como proteínas de fusión (traducción) . Sin embargo esto encuentra que tiene un límite de aplicación, el cual no va más allá por ejemplo de introducir un gen en las plantas (Koncz y col., 1989, Proc. Nat Acad. Sci., USA 8_6, 8467-8471 ) ; Sundaresan y col., 1995 Genes Dev, 9_ 1797-1810) o el estudio de los patrones localización de la proteína /expresión . En todos los casos mencionados anteriormente los vectores con algúna clasificación de las señales de terminación dé la traducción y/o transcripción son usadas. En la presente se demuestra en el primer tiempo que los marcadores de transformación pueden ser eficientemente usados para seleccionar directamente las células de las plantas transformadas como los productos de fusión de traducción con las proteínas codificadas de gen residentes. Además el vector para el procedimiento de la invención puede contener una o más secuencias que codifican los sitios de división protéolíticos seguidos a o dentro de la secuencia de codificación de interés de los cistrones en dirección contraria del mismo. Esto permite obtener la proteína codificada por la secuencia de codificación de interés dividida desde la protéina de fusión expresada principal. El sitio de división pro.teolít ico puede ser autocatalítico permitiendo la au o-división de la proteína de fusión. Alternativamente, la división de la proteína de fusión expresada puede requerir una proteasa de sitio específico. Tal proteasa puede ser nativa a la planta o a las células de las plantas. Alternativamente la planta o las células de las plantas puede estar genéticamente modificada o transfectada de manera que proporciona una proteasa de sitio específico heterologa para la división de la proteína de fusión.
El procedimiento de la invención puede ser usada para la producción de plantas transgénicas, preferiblemente plantas de cosecha transgénicas. Estas plantas preferiblemente expresan una característica útil. Tal característica puede al menos parcialmente ser el resultado de la expresión de la secuencia de codificación de interés para obtener una molécula de ARN por ejemplo un ribosomal, un transfer o un ARN mensajero (por ejemplo para la tecnología contrasentido) . Preferiblemente la característica puedes ser el resultado de la expresión de la secuencia de codificación con lo cual se proporciona un polipéptido o proteína. Además la característica puede ser el resultado de la expresión de la secuencia de codificación de interés y uno o más de los cistrones adicionales. El procedimiento de la invención tiene la ventaja de que las plantas transgénicas o las células de plantas que se produce contiene un número mínimo de elementos xenogenéticos , los cuales producen la expresión transgénica más estable y accionan más lento similarmente el transgénico. De preferencia las secuencias y los elementos usados en los vectores para el procedimiento son de origen de plantas que reduce además el contenido de secuencias extrañas en las plantas transgénicas y en las células de las plantas producidas .
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS. La Figura 1 muestra 3 de la mayoría de las variantes del vector de fusión de traducción posibles . ? - La versión más simple de un vector de fusión de traducción tiene una secuencia . de codificación de interés ( transgénico ) ; B - El vector contiene un segundo transgénico separado del primero mediante un elemento IRES; C - El vector contiene un IRES y un sitio ' recombinant e (RS) reconocido mediante una recombinasa de sitio especifico; La Figura 2 menciona el vector de traducción pIC 1301 que contiene IRES Mp,75CR<- BAR y el terminador 35S.
La figura 3 menciona el vector 3 pIC1451 que contiene el gen BAR promoterless y el terminador 35S. La Figura 4 menciona el vector pIC052 que contiene un sitio loxP, el gen HPT y un terminador nos. La Figura 5 menciona el vector pIC-BG que contiene la fusión de traducción BAR-GFP. La Figura 6 menciona el vector Binario pICH3781, que contiene el gen BAR promoterless que precede por 3 sitios de aceptación empalmados (3xSA) . La Figura 7 menciona el vector binario pICHC3831, que contiene en gen BAR promoterless que precede por tres sitios de aceptación empalmados (3xSA) la Figura 8 menciona el vector binario pICBVIO.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La construcción de los vectores para la transformación estable de las plantas ha sido descrita por numerosos autores (para su revisión, ver Hansen & Whight, 1999, Trenes in Plant Science, 4_,
226- 231, Gelvin, S.B. 1998, Curr. Opin. Biotech, 9_,
227- 232) . Los principios básicos de todas estas construcciones - son idénticas-una unidad de transcripción completamente funcional consiste de, en la dirección 5' a 3', un iniciador especifico de planta, una parte estructural- de un gen dé interés y un terminador de transcripción se ha introducido en la célula de la planta e integrado estable en el genoma con el fin de- lograr la expresión de un gen de interés . Hemos desarrollado una tecnología diferente para la obtención de los transformados nucleares estables de las plantas. Esta invención se basa sobre el encuentro sorprendente de la introducción en una célula de plantas de la secuencia de codificación desprovista de cualquier transcripción funcional o de los elementos iniciales de traducción que resulta en una frecuencia relativamente elevada de los transformados que expresan la secuencia de codificación de interés, aparentemente como un resultado de la estructura de traducción/transcripción de los clones de las plantas que son adecuados para impulsar la formación del mARN a partir de un transgénico de interés en una célula de planta transformada. El' procedimiento propuesto utiliza vectores que tienen una secuencia de codificación de interés que no se enlaza eficazmente a un iniciador o un elemento de IRES en el vector, aunque después de la inserción en la parte de codificación del genoma clonado, forma una fusión de traducción con la proteina residente codificada de la planta. Los vectores usados en el procedimiento de la invención, después de la integración en la región traducida de un gen de planta residente, proporciona el mARN imaginario el cual es traducido enseguida en la proteina de fusión de interés (Figura 1) . en lo mejor de nuestro conocimiento no existe en la técnica anterior algo relacionado a esta investigación para la generación de los transformados de planta nucleares estables. Es muy sorprendente que dada la proporción baja del ADN transcripcionalmente. activo en la mayoría de los genomas de las plantas, los experimentos de transformación utilizan los vectores de fusión de traducción como se describe en la presente invención, obteniendo transformados numerosos de expresión del gen de la presente invención . La invención se dirige a problemas inminentes de la expresión del transgénico confiable. El transgénico integrado en el genoma clonado que usa el procedimiento de la invención se basa en la construcción de t anscripción/traducción que incluye todos o la mayoría de los elementos reguladores de transcripción del gene residente clonado, por lo tanto reduce la acción del transgénico usualmente asignado mediante los elementos reguladores del ADN xenogenético s . Los vectores para el suministro del transgénico se pueden construir en la mayoría de vías diferentes. La versión más simple consiste de la secuencia de codificación de un gen o una porción del mismo (vector de fusión de traducción básica - Figura 1) y una señal de tope de traducción y transcripción es la deseada. En otra versión, un IRES o un elemento de iniciación se incorpora después de la secuencia de codificación para impulsar la traducción y/o transcripción de cualquiera de los cistrones adicionales . Versiones avanzadas del vector de fusión de traducción puede incluir secuencias para la recombinación de sitios específicos (para la revisión ver Corman & Bullock, 2000 Curr Opin Biotechnol., 11 , 455-460) permitiendo ya sea el reemplazamiento de un transgénico existente o integración de cualquier gen adicional en la región de transcripción del ADN clonado (Figura C) . El sitio especifico de las recombinasas /integrasas a partir de los bacteriófagos y de las levaduras son ampliamente usadas para la manipulación del ADN in vitro y en las plantas. Los ejemplos para los sitios de las recombinasas-recombinación para el uso en esta invención incluye los siguientes: sitio de recombinación de ere recombinasa-LoxP , sitios de recombinación FLP recombinasa-FRT sitios de recombinación R recombinasa-RS sitios de recombinación phiC31 integrasa-attP/attB, etc. La introducción de los sitios empalmados en el vector de traducción se puede usar para aumentar la probabilidad de la incorporación del transgénico en la t anscripción procesada. El vector puede además comprender una secuencia de codificación para un péptido de señal asignado en dirección de la secuencia de codificación de interés o de los castrones adicionales. Los ejemplos preferibles de tales péptidos de señal incluye péptido plastid transid, un péptido mitocondrial transid, un péptido de señal asignado nuclear, un péptido asignado de vacuola, y un péptido de ' señal de secreción . Los vectores que pueden incluir los sitios proteoliticos que se alinean a la secuencia de codificación resultarán en la división de la proteina de fusión y liberan la proteina de la invención en una forma pura, si las condiciones se proporcionan tales que permitan la división proteolítica . Varios métodos se pueden usar para el suministro de los vectores de traducción en las células de las plantas, incluyendo la introducción directa del vector en la célula de la planta por medio de bombardeo de micro-proyectiles, elect oporación o el tratamiento regulado de PEG de protoplastos . La transformación de la planta regulada de agrobacterium también presenta una vía eficiente del suministro de vector de traducción. La mutagénesis de inserción del T-ADN en Arabidopsis y Nicotiana con el informante promotorless APH (3' ) 2 del gen enlazados cercanamente a la derecha del borde del T-ADN muestra que al menos 30% de todos los insertos inducen las fusiones de los genes de transcripción y traducción (Koncz y col., 1989, Proc, Nati. Acad. Sci, 8_6, 8467-8471) . Todas las investigaciones descritas anteriormente ayudan a la designación de un sistema que coloca una secuencia de codificación bajo el control de expresión de un gen residente en el cual se realiza la inserción. Esto puede resultar en un nivel de expresión adecuado de secuencia de interés en la mayoría de los casos un patrón modificado de la expresión transgénica puede ser preferido. En estos casos el vector de fusión de traducción puede estar equipado con los elementos activos de transcripción tales como los intensificadores que pueden modular el patrón de expresión de un transgénico. Se conoce que las secuencias de mejoramiento pueden afectar la resistencia de los iniciadores localizados tanto como varios pares de bases de cientos (Mulle, J. 2000. Current Biology, 10_, R241-R244 ) . La viabilidad de tal investigación demostró en experimentos con la activación designada en Arabidopsis (Weigel y col., 2000, Plant Physiol, 122 1003-1013) , en donde el T-ADN localiza los elementos de mejoramiento 35S que cambia el patrón de expresión de los genes residentes y en el transposon que inserta-mejoramiento marcado descrito antes. En el último ejemplo, el mejoramiento del gen residente determina el patrón de expresión del transgénico informante. Esta investigación puede ser últil, por ejemplo en las etapas iniciales de la transformación de plantas, o cuando la regulación del patrón de expresión del transgénico se requiere después de la transformación. El patrón de expresión también puede ser regulado mediante el uso de intensificadores de traducción. Las secuencias del intensificador pueden ser fácilmente manipuladas por medio de los sistemas de recombinación especificas de secuencia (insertadas, reemplazadas o removidas) dependiendo de las necesidades . de la aplicación. Sin embargo los intensificadores no pueden trabajar como iniciadores de transcripción o de traducción. Nuestra investigación hace de preferencia un conjünto de construcciones basadas en el gen marcador seleccionable eficaz de plantas como la proteina de fusión de traducción. Tal gen marcador puede ser precedido o continuado por un sitio de recombinación reconocido por la recombinasa de sitio especifico, por lo que permite la integración de cualquier gen en un sitio predeterminado mediante el empleo de una etapa de transformación adicional. Opcionalmente , el gen marcador puede estar continuado por otro transgénico' (cistrón) bajo el control de un IRES o de un iniciador. Estas construcciones se pueden usar directamente para la transformación de las células de las plantas después de que sean linearizado desde el extremo 5' y enfrente de la secuencia de codificación o se puede clonar en T-ADN por Agrobacterium-reg lado del transfer AD . El conjunto adicional de las construcciones ayuda a la expresión de una característica deseable como un producto de fusión de una sola colocación. En estos experimentos, una secuencia de codificación tiene para proporcionar una ventaja de selección, tal como pero que no se limita a la resistencia de herbicidas. Un ejemplo se construye sobre el uso de un vector de fusión de traducción para formar una resistencia de expresión de la planta al herbicida Basta, por tener una proteina de fusión que contiene una parte funcional de la enzima.
Esta investigación puede ser útil solo si la secuencia de interés es una secuencia de antisentido y la transcripción resulta en la creación del ARN híbrido, una parte de la cual está designada en antisentido para la reducción de la acción de un gene endógeno . Otro conjunto de construcciones, sirven como reguladores, que pueden contener ya sea un gen seleccionable promoterless bajo el control de IRES (un vector de traducción positivo) o un gen seleccionable bajo el control de un iniciador constitutivo funcional en las células
¦ monocotiledóneas y/o dicotiledóneas (un control positivo o el vector de transcripción) . El ADN se transforma en las células de plantas que usan tecnologías adecuadas diferentes, tales como el vector Tri-plásmido portado por Agrobacterium (US 5,591,616; US 4,940,838; US 5,464,763), una partícula o el bombardeo de microproyectiles (US 05100792; EP00444882 Bl; EP00434616 Bl) . En principio otros métodos de .transformación de plantas se pueden usar, pero no se limita a la microinyección (WO 09209696, WO 09400583 Al; EP 175966 Bl), electroporación (EP00564595 Bl; ÉP 00290395 Bl; WO 08706614 Al) . El método de transformación dependen de las especies de las plantas que se van a transformar. Los ejemplos de la presente incluyen los datos en la eficiencia de la transformación para representar a las monocot iledóneas (por ejemplo Triticum monococcum) , y dicotiledóneas (por ejemplo Brassica napus, Ori chophragmus violaceous) especies de plantas demostrando asi la disponibilidad de nuestra inves igación para las especies de plantas o de origen diferente filogenético y con diferentes densidades de las regiones transcritas dentro de especies de los genomas . La secuencia de codificación transgénica en el vector puede representar solo parte de un gen, este gen luego se reconstruye a una longitud funcional según el resultado del siguiente sitio dirigido o recombinación homologa. EJEMPLOS. EJEMPLO 1 Construcción de vectores de fusión de traducción y que contiene IRES. Las series de los vectores de expresión regulados de IRES son construidos usando las técnicas de biología molecular conocidas (Maniatis y col., 1982, Molecular cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory New York) . El vector pIC1301 (Figura 2) se obtiene mediante la digestión del plásmido pIC501 (p35S-GFP-IRESmp, 75cr - terminador BAR-35S en pUC120) , con HindIII y fragmento purificado de gel largo que se vuelve a unir. La secuencia de IRES inp75cr representa 75 bases de 3' terminal de la secuencia que conduce sin traducción 5' del ARN subgenómica del movimiento de la proteina (MP) de una crucifera (CR) de infección de tobamovirus . ¦ Una construcción que contiene el gen BAR promoterless se hace mediante la eliminación del iniciador 35S de un plásmido que contiene p35S:BAR-3' 35S (pIC1311, no mostrado) el plásmido pIC1311 se somete a digestión con HindlII-Nrul y terminado en blunt, mediante el tratamiento con el fragmento Klenow de la polimerasa I del AD . El fragmento de restricción largo es gel purificado y que se vuelve a unir para la producción de pIC1451 (terminador de BAR-35S promoterless; ver Figura 3) . El vector pIC-VG (Figura 5) se obtiene como sigue: el extremo 3' del gen BAR se amplifica PCR usando el plásmido pIC026 como el patrón y dos iniciadores específicos del gen-BAR (iniciador inicial: 5' acgcgtcgaccgtgtgacgt ct cc-3 ' y el iniciador reverso: 5 ' -ccatggcgatctcggtgacggc aggac-3' ) . Con estos iniciadores un Sal I y un sitio Neo I se introduce en los extremos 5'- y 3'- de este fragmento PCR, respectivamente. Para clonar la construcción final de BAR / GFP-fusión, este Sal I / Neo I se digiere y se gel-purifica el producto PCR que se une con el gel purificado del fragmento Neo I / PstI -pequeño de la construcción pICOll (iniciador HBT: del término GFP-NOS) y el fragmento largo gel-purificado de la construcción pIC.1451 se someten a digestión con Sal I y Pst I. En esta construcción (pIC BG) el gen BAR se une en el marco al extremo 5' del gen GFP. En la cantidad de la proteina, una proteina de fusión de BAR-GFP se puede expresar a partir de . esta construcción, en donde la parte de la proteina BAR se separa mediante un aminoácido (Ala) a partir de la proteina GFP. La parte amplificada de esta construcción se somete a secuencia para confirmar la secuencia. Todos los vectores son linearizados para usarse en los experimentos de transformación mediante la digestión ya sea con SacI (pIC1451,pIC BG) o HindIII (pIC052; pIC1301) de la enzima de restricción y gel-purificado para separarse de los vectores sin digerir. EJEMPLO 2 Transformación de protoplastos regulados de PEG de Brassica napus . Aislamiento de protoplastos . El aislamiento .de protoplastos de Brassica se basa en los protocolos anteriormente descritos (Glimelius K; 1984 Physiol Plant 61 38-44; Sundberg y Glimelius, 1986, Plant Science, 43, 155-162 y Sundberg y col., 1987.. Theor, Appl . Genet, 7_5, 96-104) . Las semillas esterilizadas (ver apéndice) son germinadas en cajas Petri de 90mm que contiene un medio de MS ½ con gelrite 0.3%. Las semillas son colocadas en hileras ligeramente separadas una de la otra. Las cajas Petri son selladas colocadas a un ángulo de 45° y se mantiene al abrigo de la luz por 6 dias a 28°C. Los Hipocotiledóneas se cortan en pedacitos largos l-3mm con una navaja de corte. Las navajas se reemplazan frecuentemente para evitar la maceración del material. Los pedacitos de las hipocotiledóneas se colocan en la solución TVL (ver apéndice) para la plasmólisis de las células. El material se trata durante uno a tres horas a la temperatura , ambiente. Este pret ratamiento mejora significativamente el rendimiento de los protoplastos intactos. La solución de la pre-plasmólisis se coloca en una solución de la enzima de 8-10ml (ver apéndice) la solución de la enzima cubre todo el material pero no se usa en exceso. El material se incuba a 20-25°C al abrigo de la luz por al menos 15 horas . Las cajas Petri se colocan en un agitador rotatorio con agitación muy suave. La mezcla de los protoplastos y los desechos celulares se filtran a través de un filtro de un tamaño de malla de 70mm. Las cajas Petri se lavan con una solución W5 de 5 a 10 mi. (Menczel y col., 1981, Theor. Appl. Genet, 59, 191-195) (ver apéndice) , que también se filtran y se combinan con el resto de la suspensión. La suspensión de los rotoplastos se cambia a tubos Falcon estériles de 40ml. y los protoplastos se convierten a gránulos mediante centrifugación a 120g por 7 minutos. El sobrenadante se elimina y los gránulos de los protoplastos se vuelven a suspender en sacarosa 0.5m. La suspensión se coloca en tubos estériles de 10ml en una centrifuga. (8ml. por tubo) y se cargan con 2mi . de la solución W5. Después de 10 min. De la centrifugación a 190g. los protoplastos intactos que se recogen a partir de la interfase con una pipeta Pasteur. Estos se cambian a tubos nuevos de la centrifuga, se vuelven a suspender en una solución de manitol 0.5m. con lOmM de CaCl2 y se granulan a 120g. por 5 minutos. Tratamiento PEG Los protoplastos se vuelven a suspender en la solución reguladora de transformación (ver apéndice). La concent ación de protoplastos se determina usando la cámara de conteo y luego se ajustan a 1-1.5 x 106 protoplastos /mi . Una gota de 100 µ? de esta suspensión se coloca en el borde inferior de la caja Petri de 6cm y se deja por unos cuantos minutos permitiendo que los protoplastos se sedimenten. Los protoplastos luego se mezclan suavemente con 50-100µ1 de la solución ADN (Qiagen purificada, se disuelve en TE a la concentración ds un mg/ml. Luego 200 µ? de la solución de PEG (ver apéndice) se adiciona en porciones a la mezcla de protoplasto/ADN. Después de 15-30 minutos la solución reguladora de transformación (solución W5, se adiciona en alícuotas pequeñas (en porciones) hasta que- la caja Petri esté casi llena (~6 mi) . La suspensión se deja sedimentar por 1-5 horas. Luego los protoplastos se cambian a tubos para centrifugar, se vuelven a suspender en una solución W5 y se granulan a 120g por 5-7 minutos. Cultivo de protoplastos y_ selección para transformados.
Los protoplastos se transfieren a un medio de cultivo de 8 pM ( ao Y Michayluk, 1975, planta, 126, 105-110; también ver apéndice, y se incuba a 25°C, densidad ligeramente baja en cajas Petri de 5cm.ó de 2.5cm. con 0.5ml . o 1.5ml del medio respectivamente. La densidad de los protoplastos es de 2.5 x 104 protoplastos /mi . Los tres volúmenes del medio fresco de 8pM. sin ninguna hormona son adicionados después de la primera división de protoplastos. Las células son incubadas en una intensidad ligeramente elevada, 16 horas por dia. Después de 10-14 dias las células se transfieren al medio de K3 (Nagy y Maliga, 1976, Z Pflanzenphisiol , 78, 453-455) con sacarosa O.lm., agarosa 0.13%, 5-15mg/l PPT y la concentración de la hormona 4 veces menos que en el medio 8pM. Para facilitar la transferencia al medio fresco, las células se colocan en la parte superior del papel filtro estéril mediante el rociado cuidadoso en una capa fina. Las células se mantienen a intensidad ligeramente elevada, 16 horas por dia. Las colonias de las células luego se cambian a cajas Petri con el cambio dé medio K3 después de que el tamaño se ha alcanzado aproximadamente 0.5cm. en el diámetro. EJEMPLO 3 Transformación de Triticum monococcum mediante el bombardeo de microproyect iles . Cultivo de la célula de laplanta. La suspensión de la linea de las células de T monococcum L crece en MS2 (sales MS (Murashige & Skoog, 1962 Physiol, Plant, 15, 473-497) , del medio de 0.5mg/l de clorhidrato de tiamina, 100rtig/l de inosid, 30g/l de sacarosa, 200mg/l de Bacto-Tr ipt ona , 2mg/l de 2.4-D) en frascos de 250ml en un agitador rotatorio a 160rpm a 25°C y se subcultiva por una semana. 4 dias después del subcultivo, las células se rocian en discos de papel filtro estériles de 50mm sobre un gelri te-solidificado (4g/l) de MS2 con sacarosa 0.5M . Bombardeo de microproyectiles El bombardeo con microproyectiles se realiza utilizando el sistema de suministro de partículas Biolistic PDS-1000/He (Bio-Rad) las células se bombardean a 61.4-83.6 Kg/cm2, a 15ml. de distancia de un punto de unión del macroport ador para detener la selección y una distancia de 60mm a partir de detener la selección a un tejido asignado. La distancia entre el disco de ruptura y el punto de enlace del mac oportador es de 12mm. Las células son bombardeadas después de 4 horas de pr e-tratamiento osmótico. El revestimiento del ADN-oro de conformidad al protocolo original de Bio-Rad (Sanford y col., 1993 en: Métodos en Enzimologia, edición R. Wu, 217 , 483-509) se obtiene como sigue: 25 µ? del polvo de oro (0.6, l.lOmm en gliserol al 50% (60mg/ml se mezclan con 5µ1 del plásmido del ADN a 0.2 g/pl, 25µ1 de CaCl2 (2.5M) y» 10 µ? de espermidina O.lm. La mezcla se agita por 2 minutos seguido por la incubación por 30 minutos a la temperatura ambiente, se centrifuga (2000rpm, 1 minuto) se lava con etanol al 70% y 99.5%. Finalmente el gránulo se vuelve a suspender en 30µ1 de etanol al 99.5% (6 µ? /disparo) . Un procedimiento de revestimiento novedoso de AD -oro (PEG/Mg) se realiza como sigue: 25 µ? de la suspensión de oro (60mg/ml en glicerol al- 50%) se mezcla con 5µ1 del plásmido del ADN en un tubo Eppendorf y se complementa enseguida por 30µ1 de PEG al 40% y 1. Om de MgCl2- La mezcla se agita por 2 minutos y luego se incuba por 30 minutos a la temperatura ambiente sin mezclar. Después de la centrifugación (2000rpm, 1 minuto), los gránulos se levan 2 veces con un mililitro de etanol al 60%, una vez con un mililitro de etanol al 99.5% y se dispersa finalmente en 30 µ? de etanol al 99.5%. Las alícuotas (6µ1) de la suspensión del ADN-oro en etanol se carga en discos del macroportador y se deja secar por 5-10 minutos. Preparación del plásmido ADN. Los plásmidos ' se transforman en la cepa E-coli
DH10B, las maxi preparaciones crecen en un medio de LB y el ADN se purifica usando un paquete de Qiagen. Selección Para los experimentos de transformación estables, los filtros con las células tratadas se transfieren al medio sólido de MS2 con el agente selectivo esterilizado filtrado apropiado (150mg/ld higromicina B (Duchefa) ; 10mg/l de bialafos (Duchefa) las placas son incubadas al abrigo de la luz a 26°C. EJEMPLO 4 Transformación de Orychofragmus violaceus mediante el bombardeo de microproyectiles Preparación del cultivo en suspensión. Las plantas de O .violaceus crecen in vitro sobre un medio MS, 0.3% de Gelrite (alternativamente ½ de MS, sacarosa 2% y agar 0.8%) a 24°C y 16/8 horas día/noche con un fotoperíodo de 3-4 semanas. Se cortan de 4 a 6 veces en pequeños trozos (dependiendo de su tamaño) y se cambian a una caja Magenta con 30ml. del Callus Inducing Médium' (CIM) (ver apéndice) . El material se mantiene' durante 4-5 semanas a la luz ligera (o en la oscuridad a 24°C y agitación vigorosa. Durante este periodo el medio de CIM fresco se adiciona para mantener el tejido de la planta en la caja Magenta cubierta con el liquido. Las células se adhieren a la pared de la caja Magenta luego se liberan en el medio mediante la inversión vigorosa y la agitación de la caja. Preparación del material de la planta por, bombardeo de microproyectiles Una alícuota de la suspensión celular se coloca cuidadosamente en el papel filtro estéril soportado por el medio CIM sólido en una caja Petri . La caja Petri con el material de la planta se mantiene en la oscuridad por 5-7 días. 4 horas antes del procedimiento, el apel filtro con las células se mueven al CIM fresco con sacarosa al 10%. El bombardeo de microproyectiles se realiza como se describe en el ejemplo 3. 14 horas después del bombardeo el material se cambia a CIM con -sacarosa al 3% y se mantiene en la oscuridad. Selección de transformados Dos a cuatro días después del bombardeo el papel filtro con las células se cambian a la placa con CIM complementado con el agente de selección apropiado (10-15 g/mlPPT) . Cada 7 días el material se cambia al medio de selección fresco. Las placas se mantienen en la oscuridad y después de aproximadamen e 6 semanas el material de la planta se cambia a las cajas Petri con el Medio de Inducción de Morfogénesis (MIM) (ver apéndice) complementado con el agente de selección apropiado ( 10-15pg/mlPPT) las placas se incuban a intensidad ligeramente elevada, 16 horas por dia) . EJEMPLO 5 Tranformación del Triticum monococcum con el gen loxP-HPT promoterless La- construcción pIC052 (Figura 4) se linearisa mediante la digestión con la enzima de restricción de HindIII, de gel-purif icado para separar el material sin digerir y se usa para el bombardeo · de microproyect iles como se ha descrito antes (ver Ejemplo 3) . El vector linearizado contiene el polienlazador pUC19 (57bp) seguido por un sitio loxP desde el extremo 5' del gen HPT. En general, aproximadamente 100BP se localiza en el extremo 5' del codón de inicio de traducción del gen HPT. 34 placas se transforman y después de 1.5 meses de selección en el medio que contiene higromicina (ejemplo 3) , 3 colonias resistentes a la higromicina se recuperan. La secuencia de los sitios de integración recuperados por PCR, confirman la independencia de los 3 transformados. EJEMPLO 6 Vectores de fusión de traducción basados en T-ADN
La ayuda de este ejemplo es para demostrar un suministro regulado de Agrobacterium de los vectores de traducción en células de plantas. La mejora adicional de la existencia de los ' vectores de fusión de traducción se logra mediante la subclonación de elementos de vectores diferentes en el vector binario pICBVIO (ver figura 8) para adecuar la transformación regulada de los Agrobacterium tumefaciens de las plantas dicotiledóneas. Ambos vectores binarios se construyen usando técnicas biológicas moleculares estándar (Maniatis y col., 1982, Molecular clonning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) . Para construir el vector pICH3781 (ver figura 6), la caja de expresión de promoterless de la construcción de pICH3651 ( gen-BAR/t erminador /elemento de mejoramiento) se subclona en un unión de tres fragmentos como Xbal/EcoRl- y EcoRI /BGamHI-fragmento en la poli-unión de pICBV-10. La construcción pICH3831 representa el mismo vector de fusión de traducción similar al vector pICH3871, sin el elemento de mejorar (Actin iniciador-2 sin la caja de TATA, ver Figura 7) . Con el fin de eliminar este elmento de mejoramiento, la construcción de pICH3781, el EcoRI se somete a digestión y se vuelve a unir. Ambas construcciones pICH3781 y pICH3831 contienen el gen BAR precedido por tres sitios del aceptor empalmado (SA) con el fin de facilitar la incorporación de la secuencia de codificación BAR, en el transcrip procesado del gen residencial y la formación del producto de fusión de traducción corregido. Con el fin de comparar la eficiencia de los vectores de transcripción contra los de traducción, el gen NPTII bajo control del iniciador NOS también se incorpora en piCH3781 y el piCH3831. El T-ADN de pICH3781 y el pICH3831 se introduce en plantas de Arabidopsis thaliana (Col-o), como se describe en Bent y col., (1994, Science, 285, 1856-1860). Las semillas son cosechadas tres semanas después de la infiltración al vacio, y se divide en dos grupos iguales. Un grupo se esteriliza y se seleccionan para los transformados sobre GM + 1% del medio de glucosa (Valvekens y col., 1988, Proc. Nati, Acad, Sci., USA, 85, 5536-5540) , que contiene 50 mg/L"1 de kanamicina.
El otro grupo se germina en el suelo y se rocía varias veces con la solución de fosfino ricina (50 pg/ml) . El número de los transformados desde cada uno de los experimentos seleccionados se cuenta. La proporción del número de los transformados obtenidos con los vectores de la traducción para que se obtengan con los vectores de transcripción (pptR:KmR) están casi en la escala de 1:15- 1:25 dependiendo de la construcción usada. Todas las construcciones descritas en la presente son también usadas para las transformaciones de Nicotiana Tabaccum Agrobacterium- reguladas del disco de hoja (Horsh y col., 1985, Scince 221, 1229-1231) y Brassica napus (cv-Westar) hipo cotiledóneas (Radke y col.,' 1988 , Theor, Appl Genet, 75, 685-694) A pesar de la diferencia de 10-20 veces en el tamaño del genoma de Arabidopsis comparada a Brassica napus y el tabaco, respectivamente, y la densidad mas elevada de las regiones de transcripción en Arabidopsis comparada al tabaco y Brassica , la frecuencia de los transformados de Brassica y del tabaco se obtienen con los vectores de fusión de traducción, que . es comparable a la de Arabidopsis (15-25 veces inferiores comparadas a los vectores de transcripción) .
Apéndice
Esterilización de semillas Se remoja las semillas en una solución de PPM al 1% por al menos 2 horas (durante la noche de preferencia) . Se lavan las semillas en EtOH al 70% por 1 minutos tal que se esterilicen en una solución de cloro al 10% con 0.01% de SDS o Twen 20) en un recipiente de 250ml que se coloca en un agitador rotatorio. Se lavan las semillas en 0.5 L de agua estéril .
TVL Solución de la Enzima 0.3 M de sorbitol Celulosa RIO al 1%. 0.05M de CaCl2x H20 Macerasa RIO al 0.2%. pH 5.6 -5.8 Dricelasa.al 0.1%. suelta en mácfrosalt 8pM con 0.5 . pH 5.6-5.8.
W5 Solución de PEG 18.4 g/L CaCl2 x- H20 40'% (p/v) de PEG-2000 en H20. 9.0 g/L NaCl 1.0 g/L de glucosa 0.8 g/L de KCl pH 5.6 - 5.8
CIM MIM Macro MS Macro MS Micro MS Micro MS Vitamina B5 Vitamina B5 MES 500mg/L MES 500mg/L PVP 500mg/L PVP 500mg/L Sacarosa 30g/L Sacarosa 30g/L 2. -D 5mg/L ABA 1 mg/L Kin 0.25 mg/L BA 0.5 mg/L Gelrite 3g/L IAA 0.1 mg/L pH 5.6-5.8 Gelrite 3g/L pH 5.6-5.8
Medio Verde (MV) Medio de Auxine elevada (HAM) Macro MS Macro MS Micro MS Micro MS Vit B5 Vit B5 MES 500 mg/L MES 500mg'/L PVP 500 mg/L PVP 500 mg/L Sacarosa 30g/L Sacarosa 30g/L BA 2 mg/L ,??? 5mg/l Kin O .5mg/L KIn 0.25 mg/L NAA 0.1 mg/L BA 0.25 mg/L pH 5.6-5.8 pH 5.6-5.8
Medio de Regeneración Macro MS Micro MS Vit B5 MES 500mg/l PVP 500 mg/L Sacarosa 30g/L ABA 1 mg/L BA 0.5 mg/L IAA 0.1 mg/L pH 5.6-5.8
Las soluciones de hormona se esterilizan en filtro y se adicionan al medio de autoclave.
Claims (25)
1. -Un procedimiento para la producción de plantas transgénicas o células de plantas, que comprende la expresión de una secuencia de codificación bajo el control de traducción y transcripción de los elementos de transcripción y traducción nucleares clonados por: (i) la introducción en el genoma nuclear de las plantas clonadas o de las células de las plantas para la plantas transgénicas o las células de las plantas, un vector que comprende la secuencia de codificación la cual está libre de (a) un elemento en dirección de iniciación de la transcripción eficaz en las plantas clonadas o en las células de las plantas enlazadas eficazmente a la secuencia de codificación y requerida para su transcripción; (b) un elemento en dirección de iniciación de la traducción eficaz en las plantas clonadas o las células de las plantas y se enlaza eficazmente a la secuencia de codificación; en donde la secuencia de codificación, codifica para un marcador elegible que otorga una ventaja de selección; y (ii) la selección siguiente de las células de las plantas o de las plantas que expresan el marcador elegible, con lo cual la selección otorgada ventajosa mediante el marcador elegible se usa.
2. -El procedimien o de conformidad a la reivindicación 1, en donde el vector comprende el empalme del donador y/o los sitios del aceptor en dirección y/o en dirección contraria de la secuencia de codificación.
3. -El procedimiento de conformidad a una de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el vector comprende además uno o más castrones en dirección contraria de la secuencia de codificación, cistrones que se unen a la secuencia de codificación.
4. -El procedimiento de conformidad a la reivindicación 3, en donde al menos uno o más de los cistrones en dirección contraria de la secuencia de codificación es enlazada eficazmente a los elementos de traducción y de transcripción localizados en dirección contraria de la secuencia de codificación.
5. -El procedimiento de conformidad a una de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el vector contiene además una o mas de las secuencias de codificación para la asignación de los péptidos de señal que se enlazan eficazmente a la secuencia de codificación o los cistrones.
6. -El procedimiento de conformidad a una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el vector contiene además una o mas secuencias de codificación de los sitios de división proteolitica enseguida a o dentro de la secuencia de codificación o de los cistrones.
7. -El procedimiento de conformidad a la reivindicación 6, en donde la secuencias de codificación de los sitios de división proteolitica siguiente a o dentro de la secuencia de codificación o de los cistrones auto-cat ali icos .
8. -El procedimiento de conformidad a una de las reivindicaciones 1 a 7, en donde las plantas transgénicas o las células de las plantas son genéticamente modificadas o transfectadas de manera que proporcionan las proteasas de sitio especifico necesario para la división de las proteínas de fusión de expresión.
9. -El procedimiento de conformidad a una de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el vector contiene además uno o mas intensificadores de transcripción enlazados eficazmente a la secuencia de codificación o a los cistrones.
10. -el procedimiento de conformidad a una de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el vector contiene además uno o más intensificadores de traducción que se enlazan eficazmente a la secuencia de codificación o a los cistrones.
11. -El procedimiento de conformidad a una de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el vector contiene además uno o mas de los sitios de recombinación reconocidos por las recombinasas de sitio especifico.
12. - El procedimiento de conformidad a una de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el ANR mensajero híbrido que se produce comprende el ARN derivado del ADN nuclear de las plantas transgénicas o de las '' células de las plantas y el ARN derivados de la secuencia de codificación.
13. - El procedimiento de conformidad a la reivindicaciones 12, en donde el ARN mensajero híbrido codifica las secuencias de polipéptido heterólogo múltiples.
14. -El procedimiento de conformidad- a al reivindicación 12, en donde el ARN mensajero híbrido es al menos complementariamente parcial a un ARN mensajero presente en las plantas transgénicas o las células de las plantas.
15. -El procedimiento de conformidad a una de las reivindicaciones 12 o 13, en donde la traducción del ARN mensajero híbrido conduce a una proteína de fusión .
16. -El procedimiento de conformidad a la reivindicación 15, en donde la proteina de fusión comprende las secuencias de polipéptidos heterólogos múltiples .
17. -el procedimiento de conformidad a una de las reivindicaciones 1 a 16, en donde la secuencia de codificación es do origen de planta.
18. - El procedimiento de conformidad a una de las reivindicaciones 1 a 17, en donde el vector contiene elementos eficaces del origen de planta únicamente.
19. - El procedimiento de conformidad a una de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la secuencia de codificación está además libre de un elemento de terminación de la transcripción eficaz en las plantas clonadas o en las células de plantas y se enlaza eficazmente a la secuencia de codificación.
20. - El procedimiento de conformidad a una de las reivindicaciones 1 a 19, en donde la expresión de la secuencia de codificaron resulta en la formación del polipéptido .
21. - el ARN que se obtiene mediante el uso del procedimiento de una de las reivindicaciones 1 a 20.
22. -La proteina o polipéptido que se obtiene mediante el uso del proceso de una de las reivindicaciones 1 a 20.
23. -Las células de las plantas, plantas y su progenie que se obtienen mediante el procedimiento de una de las reivindicaciones 1 a 20.
24. -Las células de las plantas, plantas y su progenie de conformidad a la reivindicación 23, caracterizado porque contiene en el genoma nuclear una secuencia de codificación de un marcador elegible bajo el control de transcripción y traducción de los elementos de transcripción y de traducción nuclear clonados , secuencia de codificación que está libre de : (a) un elemento en dirección de iniciación de la transcripción eficaz en las plantas clonadas o en las células de las plantas que se enlazan eficazmente a la secuencia de codificación y que se requiere para su transcripción; (b) un elemento en dirección de la iniciación de la traducción eficaz en las plantas clonadas o en las células de las plantas y que se enlazan eficazmente a la secuencia de codificación.
25. -el uso de las células de las plantas o de las plantas de conformidad a las reivindicaciones 23 ó 24, para la transformación asignada de las células de las plantas o de las plantas.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FA | Abandonment or withdrawal |