DE10143238A1 - Identifizierung eukaryotischer interner Ribosomen-Eingangsstellen (IRES)-Elemente - Google Patents

Identifizierung eukaryotischer interner Ribosomen-Eingangsstellen (IRES)-Elemente

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DE10143238A1
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Abstract

Verfahren zur Suche nach und zur Identifizierung eines eukaryotischen IRES-Elements, das bei der cap unabhängigen Translation von RNA in eukaryotischen Zellen aktiv ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: DOLLAR A (i) Screening von eukaryotischen mRNA Sequenzen oder von entsprechenden DNA Sequenzen nach einem potentiellen IRES-Element, das einen Nukleotidblock aufweist, der DOLLAR A (a) eine Länge von mindestens 30 Nukleotiden, DOLLAR A (b) einen Adeninnukleotidgehalt von mindestens 40 Mol-% und DOLLAR A (c) einen Pyrimidinnukleotidgehalt von weniger als 40 Mol-% hat, DOLLAR A (ii) Einführen des potentiellen IRES-Elements in ein lineares dicistronisches Konstrukts zwischen ein stromaufwärts gelegenes Gen und ein stromabwärts gelegenes GUS Reportergen, wobei das potentielle IRES-Element für eine IRES-abhängige Translation des stromabwärts gelegenen GUS-Gens positioniert wird und wobei dem stromaufwärts gelegenen Gen eine stabile Hairpin-Struktur vorausgeht, um die IRES-abhängige Translation der Gene zu verhindern, und DOLLAR A (iii) Testen des potentiellen IRES-Elements auf IRES-abhängige Translation des GUS-Gens in Kaninchen-Recticulocyten-Lysat - oder Weizenkeimextrakt - in vitro Translationstests, wobei die GUS Genexpression quantifiziert wird, vorzugsweise bezüglich eines Konstrukts, das ein Referenz-IRES-Element oder ein nicht-IRES-Element zwischen dem stromaufwärts gelegenen Gen und dem stromabwärts gelegenen GUS-Gen enthält.

Description

    GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Methode zur Suche und Identifizierung neuer eukaryotischer IRES-Elemente, die in pflanzlichen, Säuger- und Hefezellen aktiv sind, und ein Verfahren zur Capunabhängigen Expression einer gewünschten Nucleotid-Sequenz in eukaryotischen Zellen unter Verwendung eines gemäß der obigen Methode identifizierten oder identifizierbaren IRES-Elements. Die Erfindung betrifft ferner gemäß der obigen Methode identifizierte oder identifizierbare IRES- Elemente und transgene oder transient transfizierte eukaryotische Zellen, die mit einem ein solches IRES-Element enthaltenden Vektor transformiert sind.
    • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Es besteht ein wachsendes Interesse an der Verwendung interner ribosomaler Eingangsstellen (IRES) - elemente zur Expression fremder Gene in eukaryotischen Zellen. Obwohl die Anzahl von Nucleotidsequenzen, die eine Cap-unabhängige Translation bewirken können, ständig ansteigt, findet die Identifizierung neuer IRESs nur gelegentlich oder zufällig statt ohne gezielte Strategie zur Vorhersage von IRES-Elementen.
  • Die Translationsinitiation von mRNA in eukaryotischen Zellen ist ein komplexer Prozess, der die konzertierte Interaktion zahlreicher Faktoren beinhaltet (Pain, V. M., 1996, Eur. J. Biochem. 236, 747-771). Für die meisten mRNAs besteht der erste Schritt in der Rekrutierung ribosomaler 40S Untereinheiten zur RNA an oder in der Nähe ihres 5'Endes (Fig. 1). Die Assoziierung von 40S an die mRNA wird von dem Cap-bindenden Komplex eIF4F sehr erleichtert. Faktor eIF4F besteht aus drei Untereinheiten: der RNA-Helicase eIF4A, dem Cap-Bindeprotein eIF4E und dem Multiadaptorprotein eIF4 G, das als Rahmen für die Proteine in dem Komplex wirkt und Bindestellen für eIF4E, eIF4a, eIF3 und ein Poly(A)-bindendes Protein aufweist.
  • Die Infektion von Zellen mit einer Vielzahl von RNA Viren führt zur selektiven Inhibition der Translation von mRNA des Wirts jedoch nicht des Virus. Zum Beispiel führt die Infektion von Zellen mit dem Poliovirus, einem zytoplasmatischen RNA Virus, zur Modifizierung mehrerer Translationsinitiationsfaktoren. Inbesondere die Proteolyse beider Formen von eIF4G, eIF4GI und eIF4GII (Gradi et al. 1998, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95, 11089-11094), durch viruskodierte Proteasen führt zur Inhibition der Translation der meisten zellulären mRNAs mit Cap. Dagegen wird die Translation polioviraler mRNA, die eine 450 nt Sequenz in der 5'nichtkodierenden Region (5'NCR) enthält, welche 40S Untereinheiten in Abwesenheit von intaktem eIF4F rekrutieren kann, nicht inhibiert. Dieses Sequenzelement wurde interne Ribosomeneingangsstelle (internal ribosome entry site) oder IRES genannt (Jang et al. 1988 J. Virol. 62, 2363-2643). Solche IRES Elemente wurden in picornaviraler, flaviviraler, pestiviraler, retroviraler, lentiviraler, insektenviraler RNA (Tabelle 1) und in tierischer zellulärer RNA (Tabelle 2) gefunden. IRES enthaltende tierische mRNAs können 40S- Ribosomen vermutlich sowohl über ihr 5'-Cap-Ende oder ihre IRES-Elemente rekrutieren, was wahrscheinlich die Translation unter Bedingungen erlaubt, wenn die Cap-abhängige Translation reduziert ist, wie z. B. während einer viralen Infektion, während der G2/M-Phase des Zellzyklus, Apoptose- oder Stressbedingungen (Johannes et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 13118-13123; Cornelis et al. (2000), molecular Cell 5, 597-605; Pyronnet et al. (2000), molecular Cell 5, 607-616; Stein et al., 1998, Mol. and Cell. Biol. 18, 3112-3119; Holcik et al., 2000, Oncogene 19, 4174-4177; Stoneley et al., 2000, mol. and Cell. Biol. 20, 1162-1169). Bis zu 3% der zellulären mRNAs von Tieren werden bei verminderter Konzentration des Cap-bindenden Komplexes eIF4F translatiert (Johannes et al., 1999).
  • In den letzten Jahren hat ein rekonstituierter Ribosomenbindungsassay die Aufklärung der Mechanismen erlaubt, nach denen verschiedene IRES Elemente arbeiten (Pestova el al. 1998 Genes Dev. 12, 67-83). Einige dieser Elemente wirken, indem sie der RNA-Bindungsoberfläche auf eIF4G eine hochaffine Bindungsstelle bereitstellen. Andere wirken durch Binden and eIF3 und/oder die 40S Untereinheit (Fig. 2). Kürzlich wurde eine wichtige Rolle der IRES RNA/18S rRNA gezeigt. Die Gtx- IRES enthält mehrere nicht überlappende Segmente, die Komplementarität zur 18S rRNA zeigen, und die interne Translationsinitiation vermitteln können (Hu et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1339-1344). In einem dieser Segmente wurde eine 9-nt-GC-reiche Sequenz CCGGCGGGU identifiziert, die 100% komplementär zur 18S rRNA bei den Nucleotiden 1132-1124 ist, und es wurde gezeigt, dass synthetische IRESs, die aus mehreren verbundenen Kopien dieses 9-nt-IRES-Moduls zusammengesetzt sind, die interne Initiation in tierischen Zellen stark unterstützen (Chappel et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1536-1541).
  • 5'-Leader-Sequenzen mehrerer pflanzenviraler polycistronischer genomischer RNAs, darunter der Familien der Poty- und Comoviren, sind für eine Cap-unabhängige Translation verantwortlich. Tobamovirus und Potexvirus X IRESs sind in internen Regionen der viralen Genome lokalisiert. Tabakmosaik-Tobamovirus (TMV) ist ein positiv-Strang-RNA-Pflanzenvirus mit einem einteiligen (monopartite) Genom von 6395 Nucleotiden (nt) Länge (Goelet et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5818-5822). Die 5'-proximalen ORFs, die replikative Proteine kodieren, werden direkt von der genomischen RNA exprimiert, und das Syntheselevels des kleineren (126 kDa) Proteins ist ungefähr zehnmal höher als das Expressionsniveau des 183 kDa-Proteins, das durch gelegentliches Hindurchlesen (read through) des Stop-Kodons für das 126-kDa-ORF produziert wird (Pelham, 1978, Nature 272, 469-471). Obwohl etwas Replikation mit dem größeren Protein alleine stattfinden kann, werden beide Proteine für eine effiziente Replikation benötigt (Ishikawa et al., 1986, Nucl. Acid. Res.
  • 14, 8291-8305). Die übrigen TMV-Genprodukte, das Movement-Protein (MP) und das Hüllprotein (coat protein, CP) werden von 3'-koterminalen subgenomischen mRNAs (sgRNAs) exprimiert (für eine Übersicht siehe Palukaitis und Zaitlin, 1986, in: "The plant virus", herausgeber: Mliv. von Regenmortel und M. Fraenkel-Conrat, Band 2, S. 105-131, Plenum Press, NY). Das interne Movement- Protein (MP)-Gen und das 3-proximale Hüllprotein-Gen können also nicht von genomischer RNA typischer Tobamoviren translatiert werden (TMV UI ist ein typisches Mitglied der Gattung Tobamovirus). Die dicistronische RNA-2 mittlerer Länge, genannt sgRNA I2 RNA, wird translatiert und produziert das 30 kDa-MP (Bruening et al., 1976, Virology 71, 498-517; Higgins et al., 1976, Virology 61, 486-497; Beachy und Zaitlin, 1977, Virology 81, 160-169; Goelet und Kam, 1982, J. mol. Biol. 154, 541-550), während das 3'-proximalen Hüllprotein (CP)-Gen von Iz RNA translatorisch still ist. Dieses Gen wird nur von der kleinen monocistronischen sgRNA exprimiert (Siegel et al., 1976, Virology 73, 363-371; Beachy und Zaitlin, 1977).
  • Es wurde gezeigt (Ivanov et al. (1997), Virology 232, 32-43), dass die Translation des CP-Gens eines Kreuzblütler-infizierenden Tobamovirus (crTMV) im Gegensatz zu typischen Tobamoviren in vitro über einen internen Ribosomen-Eingangsmechanismus stattfindet. Das crTMV-Genom (6312 nts) enthält vier traditionelle Gene, die für zwei Komponenten der Replikase kodieren (Proteine von 122 und 178 kDa, das Durchleseprodukt des 122 kDa-Proteins), ein 30 kDa-MP und ein 17 kDa-CP-Gen (Dorokhov et al., 1993, Dokl. Russian Acad. Sci. 332, 518-552; Dorokhov et al., 1994 FEBS Lett. 350, 5-8). Es wurde gefunden, daß die 148-nt-Region stromaufwärts des CP-Gens von crTMV RNA eine interne Ribosomen-Eingangsstelle (IRESCP148 CR) enthält, die die interne Translationsinitiation des CP- Gens und verschiedener Reportergene fördert (Ivanov et al., 1997). Analog zu crTMV findet die Translation des 3'-proximalen CP-Gens von Kartoffelvirus X über einen internen Initiationsmechanismus statt (Hefferon et al., 1997). Die Fähigkeit der crTMV IRESCR CP, die interne Translationsinitiation zu vermitteln, unterscheidet diesen Tobamovirus von dem bekannten Mitglied der Gattung, TMV U1. Die äquivalente 148-nt-Sequenz des TMV U1-RNA (UICP,148 SP) konnte die interne Translationsinitiation nicht vermitteln (Ivanov et al., 1997).
  • Vor kurzem wurde gezeigt, dass die 228- und 75-nt-Regionen stromaufwärts des MP-Gens der crTMV- und TMV U1-RNA IRES-Elemente enthalten, IRSMP,75 CR bzw. IRESMP,228 CR, die die Expression von 3'- proximalen Reportergenen aus dicistronischen Konstrukten in zellfreien Translationssystemen und in isolierten Protoplasten bestimmen (Skulachev et al., 1999). Darüber hinaus konnte die äquivalente Sequenz der TMV U1-RNA, die als intercistronischer Spacer verwendet wurde (IRESMP.75 U1), die Translation des zweiten Gens in dicistronischen Transkripten vermitteln.
  • Es gibt mehrere Erfindungen, die IRES-Elemente beschreiben, die zur Cap-unabhängigen Expression fremder Gene in linearer multicistronischer mRNA in tierischen Zellen benutzt wurden (US 6 060 273; US 6 114 146; US 5 358 856; US 6 096 505; US 171 821; US 5 766 903), in Pflanzenzellen (WO 98/54342) und, allgemein, in eukaryotischen Zellen (US 171 821; US 5 766 903; US 5 925 565; US 6 114 146). Ferner wurde zirkuläre RNA zur Cap-unabhängigen IRES-vermittelte Expression eines Gens entwickelt (US 5 766 903). Die Cap-unabhängige Translation einer eukaryotischen mRNA konnte von einer Translations-Enhancer-Sequenz aus Gersten-Yellow Dwarf Virus-RNA vermittelt werden, die sich prinzipiell von bekannten IRES unterscheidet (US 5 910 628). Allgemein beschreiben alle veröffentlichten Erfindungen auf diesem Gebiet natürliche IRESs, die aus tierischen (siehe z. B. US 5 358 856) oder Pflanzenviren (WO 98/54342) isoliert wurden, ohne die Frage nach der Cross- Kingdom-Aktivität zu stellen, d. h. die Aktivität bekannter IRESs ist entweder auf tierische oder auf pflanzliche Zellen beschränkt. Ansätze für die Herstellung nicht natürlicher, künstlicher IRESs, die die Cap-unabhängige Expression fremder Gene in tierischen und pflanzlichen Zellen vermitteln können, wurden nicht beschrieben. Ferner gibt es keine Ansätze zur Herstellung oder Identifizierung neuer IRES-Elemente, die im Tier- und Pflanzenreich aktiv sind.
  • Im Gegensatz zu tierischer zellulärer mRNA gibt es keine Berichte über eine IRES-vermittelte Initiation der Translation in Pflanzenzellen in vivo (Tabelle 2). Die geringe Aktivität tierischer viraler IRESs (Enzephalomyokarditis-Virus-IRES, IRESEMCV) in Pflanzen wurde berichtet (Urwin et al., 2000, Plant J. 24, 583-589). Bislang gibt es keine Hinweise auf Aktivität eines IRES-Elements in verschiedenen Reichen (Pflanzen, Tiere, Hefe; Cross-kingdom activity). Obwohl die Anzahl der Nucleotid-Sequenzen, die eine Cap-unabhängige Translation bewirken können, ständig ansteigt, geschieht die Identifizierung neuer IRES selten und rein zufällig, und es gab keine Methode zu ihrer Vorhersage.
  • Es ist deshalb eine Aufgabe dieser Erfindung, eine Methode zur Identifizierung neuer eukaryotischer IRES-Elemente bereitzustellen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, neue eukaryotische IRES-Elemente, insbesondere pflanzlichen Ursprungs, bereitzustellen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe, neue IRES-Elemente mit Aktivität in mehreren Organismenreichen bereitzustellen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Expression einer gewünschten Nucleotid- Sequenz in eukaryotischen Zellen und translationeller Kontrolle eines neuen IRES-Elements, insbesondere eines IRES-Elements pflanzlichen Ursprungs, bereitzustellen.
    • BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die obigen Aufgaben werden von den Ansprüchen der Erfindung gelöst.
  • Diese Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Suche nach und zur Identifizierung eines eukaryotischen IRES-Elements, das bei der cap-unabhängigen Translation von RNA in eukaryotischen Zellen aktiv ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    • a) Screening von eukaryotischen mRNA Sequenzen oder von entsprechenden DNA Sequenzen nach einem potentiellen IRES-Element, das einen Nukleotidblock aufweist, der
      • a) eine Länge von mindestens 30 Nukleotiden,
      • b) einen Adeninnukleotidgehalt von mindestens 40 mol-%, und
      • c) einen Pyrimidinnukleotidgehalt von weniger als 40 mol-% hat,
    • b) Einführen des potentiellen IRES-Elements in ein lineares dicistronisches Konstrukt zwischen ein stromaufwärts gelegenes Gen und ein stromabwärts gelegenes GUS Reportergen, wobei das potentielle IRES-Element für eine IRES-abhängige Translation des stromabwärts gelegenen GUS-Gens positioniert wird und wobei dem stromaufwärts gelegene Gen eine stabile Hairpin- Struktur vorausgeht, um die IRES-unabhängige Translation der Gene zu verhindern, und
    • c) Testen des potentiellen IRES-Elements auf IRES-abhängige Translation des GUS-Gens in Kaninchen-Reticulocyten-Lysat- oder Weizenkeimextrakt- in vitro Translationstests, wobei die GUS Genexpression quantifiziert wird, vorzugsweise bezüglich eines Konstrukts, das ein Referenz-IRES-Element oder ein nicht-IRES-Element zwischen dem stromaufwärts gelegenen Gen und dem stromabwärts gelegenen GUS Gen enthält.
  • Ein IRES Element, das in mindestens einem dieser in virtro Translationsassays zur GUS Expression führt, kann dann ausgewählt werden.
  • Die Erfinder dieser Erfindung haben überraschenderweise Kriterien zur Identifizierung von Nucleotid- Sequenzen, die IRES-Aktivität zeigen (IRES-Elemente) identifiziert, d. h. Sequenzen, die eine Capunabhängige Translation eines stromabwärts gelegenen Gens oder einer Kodiersequenz über einen internen Ribosomen-Eintrittsmechanismus bewerkstelligen können. Die Erfinder haben gefunden, dass Nucleotid-Sequenzen mit einem Block von mindestens 30 Nucleotiden mit einem hohen Adeningehalt und einem niedrigen Pyridmidinnucleotidgehalt eine hohe Neigung haben, IRES-Aktivität zu zeigen. Durch ein Screening bekannter Nucleotid-Sequenzen unter Anwendung dieser Kriterien kann eine Nucleotid-Sequenz oder ein Satz von Nucleotid-Sequenzen mit hoher Neigung, IRES-Aktivität zu haben, identifiziert werden. Das erfindungsgemäße Screening stellt eine Vorauswahl von Nucleotid- Sequenzen aus allen bekannten Nucleotid-Sequenzen dar. Ein vorausgewähltes potentielles IRES- Element oder ein Satz solcher potentieller IRES-Elemente kann dann experimentell auf tatsächliche IRES-Aktivität und den Grad derselben getestet werden. Das Screening oder die Vorausauswahl gemäß der Erfindung reduziert die experimentell auf IRES-Aktivität zu testende Anzahl von Sequenzen enorm, so dass eine direkte Identifizierung neuer IRES-Elemente, einschließlich der experimentellen Bestätigung, erstmals möglich wird.
  • Das Screening kann auf jede bekannte Nucleotid-Sequenz und auf Sequenzen, die in Zukunft bekannt werden, angewandt werden. Nucleotid-Sequenzen eukaryotischen Ursprungs, d. h. pflanzliche oder tierische Sequenzen, werden gescreent, und diejenigen von höheren Pflanzen oder höheren Tieren sind bevorzugt. Das Screening viraler Sequenzen liegt nicht im Bereich dieser Erfindung.
  • Ganze Genom-Sequenzen, einschließlich von Kerngenomen und Organellgenomen, wie Plastiden oder mitochondriellen Genomen, können gescreent werden. Eukaryotische Kerngenom-Sequenzen sind bevorzugt. Das Screening kann auf DNA- oder RNA-Sequenzen angewandt werden. Wenn doppelsträngige DNA verwendet wird, können beide Stränge gescreent werden. Der kodierende Strang wird vorzugsweise gescreent. Das Screening kann auf die 5-untranslatierten Sequenzen (5' UTR sequences) von Genen beschränkt werden. Es ist dazu äquivalent, 5' UTR-Sequenzen auf RNA-Ebene zu screenen. Die Sereeningkriterien der Erfindung bezüglich dem Adenin- und dem Pyrimidingehalt sind auf Messenger-RNA oder den entsprechenden kodierenden Strang auf DNA-Ebene bezogen.
  • Das Screening kann im einfachsten Fall per Auge ausgeführt werden durch Ablesen gedruckter oder geschriebener Nucleotid-Sequenzen. Dieser Ansatz kann erfolgreich sein, insbesondere wenn man sich auf 5' UTR-Sequenzen konzentriert. Es ist jedoch einfacher, eine automatisierte Screeningmethode z. B. unter Verwendung eines Computers und eines geeigneten Computerprogramms zu verwenden. Auf diese Weise können große Datenbanken von Nucleotid-Sequenzen, insbesondere Genom-Datenbanken, gescreent werden, mit dem Potential, viele IRES-Elemente zu finden.
  • Hierin bedeutet "adeninreich" oder "hoher Adeningehalt" einen Adeningehalt, der mindestens 40 Mol-% beträgt. "Pyrimidinarm" oder "niederer Pyrimidingehalt" bedeutet einen Gehalt an Thymin (Uracil) + Cytidin, der geringer als 40 Mol-% Thymin (Uracil) + Cytidin ist. Bezüglich der beim Screening anzuwendenden Kriterien wird ein Block von mindestens 30 Nucleotiden mit einem Adeningehalt von mindestens 40, vorzugsweise mindestens 50 und am bevorzugtesten von mindestens 60 Mol-% gesucht. Der Pyrimidingehalt sollte unter 40 Mol-%, vorzugsweise unter 30 Mol-% und am bevorzugtesten unter 20 Mol-% liegen.
  • Es gibt keine strikte obere Grenze für die Länge des Nucleotidblocks. Aus praktischen Erwägungen wird der Block beim Screening kürzer als 500 Nucleotide gewählt. Der Block hat eine Länge von mindestens 30 Nucleotiden. Bevorzugt wird nach Blocks zwischen 200 und 30 Nucleotiden gesucht. Bevorzugter hat der Block eine Länge zwischen 40 und 100 Nucleotiden.
  • Der erfindungsgemäße Nucleotidblock weist eine hohe Neigung auf, einer Sequenz, die ihn enthält, IRES-Aktivität zu verleihen. Wenn 5' UTR-Sequenzen gescreent werden, können 2, 3 oder noch mehr erfindungsgemäße Nucleotidblocks gefunden werden.
  • Wenn das Screening mit der Hilfe eines Computers durchgeführt wird, kann es mehrfach durchgeführt werden, wobei die Screeningkriterien jedes Mal geändert werden. Vorzugsweise beginnt man mit strikten Kriterien, d. h. einem hohen Adeningehalt, niedrigen Pyrimidingehalt und kurzen Nucleotidblock, um Sequenzen mit der höchsten Wahrscheinlichkeit, IRES-Aktivität zu haben, zu finden. Weitere IRES-Elemente können durch Anwenden von weniger strengen Kriterien mit niedrigerem Adeningehalt, höherem Pyrimidingehalt oder längeren Blocks oder Kombinationen davon angewandt werden, innerhalb der oben gegebenen Kriterien. Auf diese Weise können IRES-Elemente verschiedener IRES-Aktivitäten gefunden werden, was nützlich ist, um ein gewünschtes Expressionsniveau zu erreichen, wenn ein gewünschtes Gen unter translationeller Kontrolle eines IRES- Elements exprimiert wird.
  • Die Fig. 7 und 8 zeigen mehrere 5' UTR-Sequenzen, die erfindungsgemäße Nucleotidblocks menschlichen bzw. pflanzlichen Ursprungs zeigen. Diese 5' UTR-Sequenzen sind potentielle IRES- Elemente gemäß Schritt 1 von Anspruch 1. Für einige dieser potentiellen IRES-Elemente wird in den Beispielen Cross-Kingdom-IRES-Aktivität gezeigt.
  • Ein gemäß Schritt 1 von Anspruch 1 gefundenes potentielles IRES-Element wird dann einer experimentellen Bestätigung seiner IRES-Aktivität zugeführt. Zu diesem Zweck wurde ein Testsystem entworfen, das das bicistronische DNA-Konstrukt "H-GFP-GUS" mit den folgenden Elementen in dieser Reihenfolge umfasst: Eine Struktur, die eine stabile Haarnadel (H) auf mRNA-Ebene bildet, ein Gen des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) (GFP-kodierende Sequenz), einen intercistronischen Spacer mit einer oder mehreren Restriktionsstellen zur Insertion potentieller IRES-Elemente und das GUS-Gen (die GUS-kodierende Sequenz). Ein potentielles IRES-Element wird in den Spacer zwischen GUS und GFP inseriert. Dieses Konstrukt wird dann in vitro transkribiert, z. B. mit T7 RNA- Polymerase, um mRNA zu erhalten. Die erhaltene mRNA wird dann in vitro translatiert unter Verwendung von Kaninchen-Reticulozytenlysat (RRL) oder von Weizenkeimextrakt (WGE) in invitro-Translationssystemen. Beide in-vitro-Translationssysteme sind kommerziell erhältlich, z. B. von Promega und von Roche Diagnostics und können gemäß den Instruktionen der Hersteller verwendet werden. Nach der Translation kann die GUS-Expression z. B. über die enzymatische Aktivität und eine kolorimetrische Detektion, über Autoradiographie oder mittels Westernblotting bestimmt werden. Die GUS-Genexpression wird vorzugsweise relativ zu einem Konstrukt, das ein Referenz-IRES- Element oder ein Nicht-IRES-Element zwischen dem stromaufwärts gelegenen Gen und dem GUS-Gen enthält, bestimmt. Als ein Referenz-IRES-Element mit starker IRES-Aktivität kann der Nucleotidblock (GAAA)16 (siehe Beispiele) oder jedes andere bekannte IRES-Element verwendet werden. Als Nicht- IRES-Element kann der synthetische, in Fig. 4 genannte Spacer (siehe Beispiele) z. B. verwendet werden, oder ein zufälliger Nucleotidblock.
  • Die Haarnadelstruktur in dem bicistronischen DNA-Konstrukt verhindert die Cap-abhängige Translation, so dass die gesamte GUS-Expression der translationalen Aktivität des potentiellen IRES- Elements, das in den intercistronischen Spacer des Konstrukts inseriert ist, zugeschrieben werden kann. Die Haarnadelstruktur muss stabil genug sein, um die Cap-abhängige Translation effizient zu verhindern. Vorzugsweise ist die Stabilität größer als 30 kcal/mol (siehe Kozak, M. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2850). Eine nicht ausreichende Stabilität der Haarnadel kann durch eine Expression des GFP-Gens erkannt werden. Eine GFP-Translation kann z. B. über die Fluoreszenz, durch Westernblotting oder durch Autoradiographie detektiert werden.
  • Das H-GFP-GUS-Konstrukt wurde aus dem Plasmid pBluescriptll Sk+, einer GUS-Nucleotid-Sequenz und einer GFP-Sequenz hergestellt. Die Haarnadelstruktur hat die folgende Sequenz:
    ggtaccgggccccccctcgaggtcgacggtatcgataccgtcgacctcgagggggggcccggtacc.
  • Äquivalente Strukturen können von einem Fachmann leicht hergestellt werden.
  • Alle Aspekte im Zusammenhang mit den in-vitro-Translationssystemen sind gut untersucht und im Stand der Technik bekannt. Details können in den folgenden Dokumenten und darin zitierten Referenzen gefunden werden: Anderson, C. et al. (1985), Meth. Enzymol. 101, 635; Krieg, P. und Melton, D. (1984), Nucl. Acids Res. 12, 7057; King, R. W. et al. (1997), Science 277, 973; DiDonato, J. A. und Karin, M. (1993), Promega Notes 42, 18; Pelham, H. R. B. und Jackson, R. J. (1976), Eur. J. Biochem. 67, 247; Jackson, R. J. und Hunt, T. (1983), Meth. Enzymol. 96, 40; Technical Bulletins Nr. 126 und Nr. 165, oder Technical Manual Nr. 232, alle von Promega Corp.
  • Potentielle IRES-Elemente, die in einem solchen WGE- oder RRL-Translationsassay zu einer GUS- Genexpression führen, sind erfindungsgemäße IRES-Elemente. Die gemäß dieser Erfindung identifizierten oder identifizierbaren IRES-Elemente zeigen typischerweise Cross-Kingdom-Aktivität, d. h., sie können dazu benutzt werden, ein gewünschtes Gen unter translationaler Kontrolle der IRES in Pflanzen und in Tieren zu exprimieren. Trotz der Cross-Kingdom-Aktivität ist die Aktivität des IRES- Elements normalerweise nicht dieselbe, wenn die Expression eines gewünschten Gens im pflanzlichen und im tierischen System verglichen wird. Es existieren Unterschiede im Expressionsniveau zwischen den beiden oben genannten in-vitro-Translationssystemen. In in-vivo-Systemen sind diese Unterschiede im allgemeinen noch größer. Dennoch zeigen die in dieser Erfindung identifizierten IRES-Elemente eine überraschend hoher IRES-Aktivität in beiden in-vitro-Systemen, in Pflanzenzellen und in tierischen Zellen.
  • Es sollte erwähnt werden, dass IRES-Aktivität nicht nur anhand der oben erwähnten in-vitro- Translationsassays sondern auch in pflanzlichen oder tierischen Zellen oder in vivo detektiert werden kann. Reihen synthetischer Sequenzen, die als intercistronische Spacer in den bicistronischen H-GFP- GUS-Vektoren verwendet wurden, wurden entworfen und in RRL, Tabakprotoplasten und in HeLa- Zellen untersucht. Ferner wurden zwei synthetische Sequenzen, nämlich vier verknüpfte Kopien eines 19-nt-direkten Repeats (Ecp x4) und 16 Kopien der GAAA-Sequenz (GAAA)16) hergestellt, die sich beide als IRES-Elemente erwiesen. Die wichtige Rolle adeninreicher Nucleotid-Sequenzen wurde in pflanzlichen und tierischen Translationssystemen in vitro und in vivo bewiesen.
  • Die Anwendung des Prinzips dieser Erfindung erlaubte die Entdeckung zahlreicher pflanzlicher eukaryotischer IRES-Elemente, die universell sind und die effiziente Translationsinitiationsmotive in verschiedenen Reichen lebender Organismen darstellen. Unseres Wissens haben wir die ersten IRES- Elemente in Genomen pflanzlicher Organismen identifiziert.
  • Diese Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Expression einer gewünschten Nucleotid-Sequenz in eukaryotischen Zellen durch Einführung eines Vektors in die Zellen zur Verfügung, wobei der Vektor die gewünschte Nucleotid-Sequenz umfasst, die operationell mit einem stromaufwärts gelegenen IRES- Element verknüpft ist, das gemäß der Methode dieser Erfindung zur Suche nach und zur Identifizierung von einem eukaryotischen IRES-Element identifiziert wurde oder identifizierbar ist, wobei die gewünschte Nucleotid-Sequenz Cap-unabhängig mittels des IRES-Elements translatiert wird.
  • Die gewünschte Nucleotid-Sequenz kann in einer Pflanze oder in Pflanzenzellen exprimiert werden. Sie kann auch in einem Tier oder in tierischen Zellen exprimiert werden. Unter Tieren sind Säugerzellen oder Säugetiere, einschließlich von Menschen (z. B. zur Gen-Therapie), bevorzugt. Ferner kann die gewünschte Nucleotid-Sequenz in Pilzen exprimiert werden, vorzugsweise in Hefezellen.
  • Das in dem Vektor enthaltene IRES-Element ist eukaryotischen Ursprungs, vorzugsweise pflanzlichen oder säugetierischen Ursprungs. Bevorzugter umfasst das IRES-Element eine Sequenz gemäß einer der Sequenzen von Fig. 7 oder Fig. 8 oder ein IRES-funktioneller Teil dieser Sequenzen. Noch bevorzugter ist das IRES-Element von der 5' UTR-Sequenz eines der folgenden Pflanzengene abgeleitet:
    Hitzeschockfaktor 1, Poly(A)-bindendes Protein, 48K MAP-Kinase. Am bevorzugtesten sind diese Gene aus Tabak.
  • Das erfindungsgemäße Expressionsverfahren umfasst nicht die Verwendung einer der in Fig. 11 gezeigten Sequenzen als IRES-Element.
  • Die gewünschte Nucleotid-Sequenz kann von monocistronischer mRNA exprimiert werden. Das große Potential der IRES-Technologie liegt jedoch auf dem Gebiet der bicistronischen oder polycistronischen Expression, was die Expression von Untereinheiten eines Proteinkomplexes oder das Entwerfen einer ganzen biochemischen Kaskade oder eines biochemischen Weges erlaubt.
  • Die eukaryotischen Zellen oder die eukaryotischen Organismen können stabil transformiert oder transient transfiziert mit dem Vektor sein. Verschiedene Methoden können zum Einbringen eines DNA- oder RNA-Vektors in eine Pflanzenzelle verwendet werden, darunter die direkte Einführung eines solchen Vektors in eine Pflanzenzelle mittels Mikroprojektilbombardierung, Elektroporation oder PEGvermittelter Behandlung von Protoplasten (für einen Überblick siehe: Gelvin, S. B., 1998, Curr. Opin. Biotechnol., 9, 227-232; Hansen & Wright, 1999, Trends Plant Sci., 4, 226-231). Pflanzen-RNA- und -DNA-Viren sind ebenso effiziente Ausstattungssysteme (Hayes et al., 1988, Nature, 334, 179-182; Palmer et al., 1999, Arch. Virol., 144, 1345-1360; Lindbo et al., 2001, Curr. Opin. Plant. Biol., 4, 181-185). Die Vektoren können ein Transgen entweder zur stabilen Integration in das Genom/Plastom der Pflanze (direkte oder Agrobacetrium-vermittelte DNA-Integration) oder zur transienten Expression des Transgens ("Agroinfiltration") einführen. Ähnlich können tierische Zellen elektroporiert, mit viralen Vektoren infiziert oder transfiziert werden unter Verwendung von Lipofektin.
  • Die Herstellung der Vektoren für das erfindungsgemäße Expressionverfahren kann nach Standardverfahren der molekularbiologie durchgeführt werden. Spezifische Ausführungsformen sind in den Figuren und in den Beispielen beschrieben.
  • Die Erfindung umfasst IRES-Elemente, die nach der erfindungsgemäßen Methode identifiziert wurden oder identifizierbar sind. Insbesondere umfasst die Erfindung ein IRES-Element, das eine Sequenz gemäß einer der Sequenzen von Fig. 7 oder Fig. 8 oder einen IRES-funktionellen Teil einer dieser Sequenzen aufweist.
  • Die Erfindung beschreibt erstmals IRES-Elemente pflanzlichen Ursprungs. Diese IRES-Elemente sind deshalb von dieser Erfindung umfasst, ebenso wie Vektoren, die solche IRES-Elemente enthalten. Die Erfindung umfasst ferner transgene oder transient transfizierte eukaryotische Zellen, die mit einem Vektor transformiert oder transfiziert wurden, der ein erfindungsgemäßes IRES-Element enthält.
  • Ferner wird ein RNA-Vektor, der neue IRES-RNA-Sequenzen enthält, sowie ein DNA-Vektor, der DNA-Kopien neuer IRES-DNA-Sequenzen enthält, beschrieben.
  • Die Erfindung ist nützlich, da sie einem Durchschnittsfachmann erlaubt, vormals unbekannte natürliche Translationselemente mit IRES-Aktivität zu identifizieren. Sie erlaubt es, IRES-Elemente zu identifizieren, die aktiver sind als vormals beschriebene. Ferner erlaubt sie die Identifizierung von IRES-Elementen, die universell sind und in verschiedenen taxonomischen Reichen aktiv sind.
  • Ein wesentlicher Vorteil dieser Erfindung ist die Möglichkeit, mehr als zwei Gene in multicistronischen Kassetten in transient oder stabil transformierten Pflanzenzellen (transgene Pflanzen) zu exprimieren. Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist die Möglichkeit, mehr als zwei Gene in multicistronischen Kassetten in transient oder stabil transformierten (transgene Tiere) menschlichen oder Säugerzellen zu exprimieren.
  • Ein weiterer Vorteil dieser Erfindung beruht in der Möglichkeit, mehr als zwei Gene in multicistronischen Kassetten in Hefezellen zu exprimieren.
  • Ein weiterer Vorteil dieser Erfindung ist die Möglichkeit, virale Vektoren zur Expression fremder Gene über die neuen IRES der Erfindung in Säugetieren und insbesondere in Menschen herzustellen.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Fig. 1 vereinfachtes Modell kanonischer eukaryotischer Cap-abhängiger Translationsinitiation. Die eIF4E-eIF4G-Interaktion rekrutiert die kleine ribosomale Untereinheit zum 5'-Ende der mRNA. eIF4G interagiert auch mit Pablp, eIF3 und der RNA-Helicase eIF4A, um den Initiationsprozess zu vermitteln.
  • Fig. 2 vereinfachtes Modell des Mechanismus der Rekrutierung des Ribosoms zur mRNA während der Hepatitis-C-Virus-IRES-vermittelten Translationsinitiation. Das IRES-Element ersetzt die Notwendigkeit für eine eIF4E-eIF4G-Interaktion, indem es eine alternative Möglichkeit zur Rekrutierung des Ribosoms zur mRNA bereitstellt. Pfeile zeigen die verschiedenen direkten Wechselwirkungen zwischen IRES-Elementen und dem 40S-Initiationskomplex.
  • Fig. 3 (A) zeigt die Nucleotid-Sequenz des NtHSF-1-mRNA-5'-Leaders (EMBL-Zugriffsnummer AB014483). Das Initiationskodon AUG ist kursiv hervorgehoben. (B) Klonierungsschritte: zur Herstellung von pH-GFP-NtHSF-GUS wurde ein PCR Fragment mit den Primernaagtaagcttggcacgaggctcccattaatatttc und ggaccatggcttgtttttcccctgtatttctctg und vollständiger genomischer DNA extrahiert aus Nicotiana tabacum Samsun NN. Das erhaltene PCR Produkt wurde in pH-GFP-IRESCP,148-GUS über die HindIII und NcoI Stellen kloniert. Das erhaltene Plasmid enthält die 5'-untranslatierte Region der NtHSF-1 RNA (ohne eingeführte HindIII und NcoI Stellen) zwischen die GFP und GUS Gene kloniert.
  • Fig. 4 zeigt ein Autoradiogramm von in WGE translatierten Proteinen über H-GFP-GUS, enthaltend (i) die 36-nt-künstliche Sequenz (Spacer) GCGUGGGCGGCGUGGGCGUUUGUUCUUGUUUGACC, (ii) den 453-nt-NtHSF-1 mRNA-5'-Leader, (iii) (GAAA)16 und IRESCP,148 CR als intercistronischer Spacer. Pfeile zeigen die Position von GUS und die erwartete Position von GFP an.
  • Fig. 5 zeigt ein Diagramm der GUS-Genexpression in Tabakprotoplasten, die mit einem 35S-basierten haarnadelstrukturlosen bicistronischen GFP-GUS-Konstrukt transfiziert wurden, das die unter den Diagrammbalken gezeigten Nucleotid-Sequenzen enthielt. GUS-Aktivitätswerte jeder transgene Pflanze wurden zum GFP-Gehalt in derselben Protoplastenprobe, der über Densitometrie von GFP-Banden von Westernblots bestimmt wurde, normalisiert. Mindestens drei unabhängige Experimente wurden zur Berechnung von Durchschnittswerten und den angedeuteten Standardfehlern verwendet.
  • Fig. 6 zeigt ein Diagramm der GUS-Genexpression in HeLa-Zellen, die mit dem bicistronischen T7- basierten Konstrukt H-GFP-GUS transfiziert wurden. GUS-Werte wurden zu den Proteingehalten der Proben normalisiert. Mindestens drei unabhängige Experimente wurden für die Berechnung von Durchschnittswerten und den angedeuteten Standardfehlern verwendet.
  • Fig. 7 zeigt humane 5' UTR-Nucleotid-Sequenzen als vermutliche humane IRESs.
  • Fig. 8 zeigt pflanzliche 5' UTR-Nucleotid-Sequenzen als vermutliche pflanzliche IRES.
  • Fig. 9 zeigt experimentelle Schritte zur Identifizierung und Isolierung einer neuen pflanzlichen IRES von der 5' UTR der mRNA des Polyadenin-bindenden Proteins PABP aus Tabak sowie die Klonierstrategie. Zur Herstellung von pH-GFP-PABP-GUS wurde ein PCR Fragment mit den Primern gcggCAAGCTTcgttgctgtcggagattttgtatc (HindIII Stelle unterstrichen) und cgcgCCATGGcaaatcaacacaaaaaaaaacaaaaaaaaaataataaag (NcoI Stelle unterstrichen) und totaler genomischer DNA extrahiert aus Nicotiana tabacum Samsun NN. erhalten. Dieses PCR Produkt wurde in pH-GFP-IRESCP,148-GUS mittels der HindIII und NcoI Stellen kloniert. Das erhaltene Plasmid enthält die 5'-untranslatierte Region der PABP RNA (mit eingeführten HindIII und NcoI Stellen) kloniert zwischen das GFP und das GUS Gen.
  • Fig. 10 zeigt experimentelle Schritte der Identifizierung und Isolierung einer neuen pflanzlichen IRES von der 5' UTR der 48K MAP-Kinase (48K MAPK) aus Tabak und die Klonierstrategie. Zur Herstellung von pH-GFP-48K MAPK -GUS wurde ein PCR Fragment mit den Primern gcgaCAAGCTTcacaattccacatattcattg (HindIII Stelle unterstrichen) und cgcgCCATGGtttttttttttggaaaattcgtc (NcoI Stelle unterstrichen) und totaler genomischer DNA extrahiert aus Nicotiana tabacum Samsun NN. erhalten. Dieses PCR Produkt wurde in pH-GFP-IRESCP,148-GUS mittels der HindIII und NcoI Stellen kloniert. Das erhaltene Plasmid enthält die 5'-untranslatierte Region der 48K MAPK RNA (mit eingeführten HindIII und NcoI Stellen) kloniert zwischen das GFP und das GUS Gen.
  • Fig. 11 zeigt Nucleotid-Sequenzen bekannter tierischer und viraler IRES-Elemente.
  • Im folgenden wird die Erfindung anhand von spezifischen Beispielen weiter beschrieben.
  • Standardtechniken der Molekularbiologie wurden gemäß Sambrook et al. (1989, molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor, New York) durchgeführt. Alle in der Erfindung verwendeten Plasmide können gemäß den Vorschriften der Beschreibung von einem Durchschnittsfachmann ohne übermäßigen Aufwand mit gängigen Materialien durchgeführt werden.
    • BEISPIELE
  • Das Ziel dieser Beispiele ist es, Verfahren zur Entdeckung und Herstellung bisher nicht identifizierter natürlicher IRES in eukaryotischen 5' UTR-mRNA-Sequenzen zu demonstrieren.
    • BEISPIEL 1 Identifizierung einer neuen IRES-Sequenz aus der NtHSF-mRNA 5'UTR Klonierstrategie
  • Die 5'UTR von NtHSF-1 wurde durch Screening ausgewählt. Sie enthält adeninreiche Nucleotidblocks und wurde wie in Fig. 3 dargestellt kloniert, um den Transkriptionsvektor pH-GFP-NtHSF-GUS herzustellen.
    • In-vitro-Translationsassays
  • WGE- und RRL-Translationsassays wurden wie im Technical Bulletin Nr. 165 bzw. Nr. 126 von Promega beschrieben durchgeführt unter Verwendung der gekoppelten Transkriptions-/Translationssysteme der Katalog Nr. L4140 bzw. L4610. Alternativ wurde ein konventionelles RRL-System von Promega, Katalog Nr. L4960 (Technical Manual Nr. 232) verwendet. Lineare H-GFP-GUS-Vektoren, die potentielle IRES-Elemente zwischen dem GFP und GUS inseriert hatten, wurden unter Verwendung des T7-Promotor/RNA-Polymerasesystems transkribiert. RNA- Transkripte wurden mit LiCI präzipitiert, in Wasser gelöst und mit Ethanol repräzipitiert. RNA- Konzentrationen wurden mittels Spektrophotometrie gemessen, und 5 µg Transkript wurden pro 25 µl in-vitro-Translationsprobe verwendet. GFP- und GUS-Expression wurden mittels Autoradiographie detektiert.
    • Transientes Assaysystem mit pflanzlichen Protoplasten
  • Das folgende Verfahren zur Präparation und Transfektion von Protoplasten wurde verwendet: (i) Die Protoplasten wurden aus Blättern von N. tabacum (cv. W38) isoliert wie beschrieben (Saalbach et al., 1996, Plant Physiol. 112, 975-985). Aliquots von 4 × 105 Protoplasten wurden mit 30 µg pFFl9-basierten dicistronischen DNA-Konstrukten "GFP-Spacer-GUS" transfiziert und 36 Stunden bei 25°C im Dunkeln inkubiert. Die GUS-Aktivität wurde als relative Lichteinheiten (RLU) gemessen. Die GUS-Aktivität wurde gemäß Jefferson (1987, Plant mol. Biol. Rep. 5, 387-405) unter Verwendung von MUG bestimmt. In jedem Experiment wurden Hintergrundaktivitätswerte infolge nicht-transfizierter Protoplasten substrahiert. Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem Bio-Rad-Protein-Assaykit auf der Grundlage der Methode von Bradford (1976, Anal. Biochem. 72, 248-254) geschätzt. Die GFP-Expression wurde mittels Westernblot-Analyse bestimmt unter Verwendung monoklonaler Maus-Antikörper (Boehringer Mannheim Nr. 18 14 460) gemäß den Hinweisen des Herstellers. GFP-Mengen in Westerblot-Banden wurden unter Verwendung der Bio-Rad-Quality-One-Software berechnet.
    • Transfektion von HeLa Zellen mit Vaccinia-Virus und T7 Promotor enthaltenden Plasmiden, die für GUS kodieren
  • HeLa-Zellmonolayer wurden auf 3,5 cm Petrischalen in Dulbecco modifiziertem minimalem essentiellem Medium, das mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum und 100 Units/ml Streptomycin und Penicillin ergänzt war, gezogen. Virusvorräte an modifiziertem Vaccinia-Virus Ankara (MVA), die das Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase-Gen exprimieren, wurde nach herkömmlichen Methoden bereitet. HeLa-Zellplatten, die 80 bis 90% konfluent waren, wurden mit Virus infiziert unter Verwendung von 30 bis 40 pfu/Zelle. Nach einer 45-minütigen Absorptionsperiode wurden die Zellen gewaschen und unter Verwendung von Opti-MEM(life Technologies, Inc.)-Plasmid- DNA und Lipofektin (life Technologies, Inc.) transfiziert. Transfektionsmischungen aus 2 µg DNA in 5 µl Lipofektin wurden für eine 3,5 cm-Platte verwendet. Für jedes Konstrukt wurden für jedes Experiment 6 Platten verwendet. Die Zellen wurden bei 37°C 6 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Medium entfernt, die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und direkt auf der Platte in 250 µl Lyse-Puffer (100 mM KHPO3, pH 7, 8, 0,2% Triton X-100, 0,5 mM DTT) 10 Minuten lysiert. Das Lysat wurde gesammelt, durch Zentrifugation bei 2000 g 10 Minuten geklärt und bei -70°C gelagert. Die GUS-Aktivität wurde in 20 µl Lysat mit dem GUS-Light™-Reagenzsystem (Tropix, MA, USA) gemäß den Protokollen des Herstellers gemessen.
    • ERGEBNISSE
  • Der 453-nt-5'-Leader des Nicotiana tabacum-Hitzeschockfaktors 1 (NtHSF-1, EMBL-Nucleotid- Datenbank-Zugriffsnr. AB014483) wurde aus einer Tabak-cDNA-Bank isoliert und als intercistronischer Spacer im bicistronischen Konstrukt H-GFP-GUS verwendet, das dann in WEG- und RRL-in-vitro-Translationssystemen (Fig. 4) sowie in Tabakprotoplasten (Fig. 5) und HeLa-Zellen (Fig. 7) getestet wurde. Fig. 4 zeigt die Ergebnisse der Translation in WGE mit dem bicistronischen Konstrukt H-GFP-GUS, enthaltend den NtHSF-1 5'-Leader im Vergleich mit der 36-nt-künstlichen Sequenz GCGUGGGCGGCGUGGGCGUUUGUUCUUUGUUUGACC als Kontrolle. (GAAA)16 und IRESCP,148 CR wurden als Positivkontrollen verwendet. Man erkennt, dass der NtHSF-1-Leader eine effiziente Expression des GUS-Gens in WGE ergab, obwohl die Expression des 5'-proximalen Gens GFP von einer stabilen Haarnadelstruktur blockiert war. Analoge Ergebnisse wurden im RRL-System erhalten (Daten nicht gezeigt). Um die in vitro erhaltenen Ergebnisse zu bestätigen, wurde der NtHSF- 1-Leader in Tabakprotoplasten und humanen HeLa-Zellen auf IRES-Aktivität getestet. Die in Fig. 5 bzw. 6 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass der NtHSF-1-Leader in beiden Typen von eukaryotischen Zellen eine der IRESCP,148 CR vergleichbare IRES Aktivität zeigte. Es wurde geschlossen, dass der NtHSF-1-Leader wie IRESCP,148 CR Cross-Kingdom-Aktivität aufweist und für eine IRES-Sequenz gehalten werden kann (IRESNtHSF-1).
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die Anwendung der erfindungsgemäßen Suchkriterien es erlauben, IRES- Elemente in 5'-Leadern eukaryotischer mRNA zu identifizieren.
    • BEISPIEL 2 Identifizierung einer neuen IRES-Seguenz, die aus der mRNA 5'-UTR des Poly(A)-bindenden Proteins aus Tabak isoliert wurde
  • Eine Analyse humaner und pflanzlicher mRNA 5'-UTR nach den Kriterien dieser Erfindung ergab weitere Sequenzen mit einer hohen Wahrscheinlichkeit von IRES-Aktivität (Fig. 7 und 9). Von dieser Sequenzliste wurde die 5' UTR des Poly(A)-bindenden Proteins (PABP) aus Tabak ausgewählt, um die Effizienz unserer Methode zur Vorhersage und Identifizierung neuer IRES-Sequenzen zu bestätigen.
    • Klonierstrategie
  • Der Ansatz zur Isolation der PABP-IRES ist in Fig. 9 dargestellt.
  • Die erhaltenen DNA-Konstrukte wurden mit NotI linearisiert und mit T7-Polymerase transkribiert. RNA-Transkripte wurden mit LiCl präzipitiert, in Wasser gelöst und mit Ethanol repräzipitiert. RNA- Konzentrationen wurden mittels Spektrophotometrie gemessen, und je 5 µg jeden Transkripts wurden für eine 25 µl-in vitro-Translationsprobe (RRL, Promega) verwendet.
  • Die in Tabelle 3 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die PABP 5'UTR-Sequenz zu einer effizienten GUS- Genexpression im RRL-System führte. Ferner ergab die PABP 5'UTR eine GUS-Genexpression in HeLa-Zellen (Tabelle 4).
    • BEISPIEL 3 Identifizierung einer neuen IRES-Sequenz, die aus der mRNA 5'UTR der 48K MAP-Kinase aus Tabak isoliert wurde
  • Das Ziel dieses Beispiels ist es, die Gültigkeit unseres Ansatzes zur Suche neuer pflanzlicher IRESs zu bestätigen. Von der Liste vermutlicher IRESs (Fig. 8) wurde die 5' UTR der 48K MAP-Kinase (MAPK) aus Tabake ausgewählt, um die Effizienz der Methode zur Vorhersage und Identifizierung neuer IRES- Sequenzen zu bestätigen.
    • Klonierstrategie
  • Der Ansatz zur Isolation der 48K MAPK-IRES ist in Fig. 10 dargestellt.
  • Die erhaltenen DNA-Konstrukte wurden mit NotI linearisiert und mit T7-Polymerase transkribiert. RNS-Transkripte wurden mit LiCI präzipitiert, in Wasser gelöst und mit Ethanol repräzipitiert. RNA- Konzentrationen wurden mittels Spektrophotometrie gemessen, und je 5 µg jeden Transkripts wurden für eine 25 µl-in vitro-Translationsprobe (RRL, Promega) verwendet.
  • Die in Tabelle 5 gezeigten Ergebnisse zeigen das die 5' UTR der 48K-MAPK zu einer effizienten GUS- Genexpression in RRL führen kann. Tabelle 1 Virale IRESs

    Tabelle 2 Eukaryotische zelluläre mRNA IRESs

    Tabelle 3 GUS-Genexpression in RRL mittels der PABP 5'UTR in bicistronischen Konstrukten

    Tabelle 4 GUS Expression in HeLa Zellen mittels der PABP 5'UTR (Aktivitäten in RLU)

    Tabelle 5 GUS-Genexpression in RRL mittels der 48K MAPK 5'UTR in bicistronischen Konstrukten

    SEQUENZPROTOKOLL



















Claims (27)

1. Verfahren zur Suche nach und zur Identifizierung eines eukaryotischen IRES-Elements, das bei der cap-unabhängigen Translation von RNA in eukaryotischen Zellen aktiv ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
a) Screening von eukaryotischen mRNA Sequenzen oder von entsprechenden DNA Sequenzen nach einem potentiellen IRES-Element, das einen Nukleotidblock aufweist, der
a) eine Länge von mindestens 30 Nukleotiden,
b) einen Adeninnukleotidgehalt von mindestens 40 Mol-%, und
c) einen Pyrimidinnukleotidgehalt von weniger als 40 Mol-% hat,
b) Einführen des potentiellen IRES-Elements in ein lineares dicistronisches Konstrukt zwischen ein stromaufwärts gelegenes Gen und ein stromabwärts gelegenes GUS Reportergen, wobei das potentielle IRES-Element für eine IRES-abhängige Translation des stromabwärts gelegenen GUS-Gens positioniert wird und wobei dem stromaufwärts gelegene Gen eine stabile Haarnadelstruktur vorausgeht, um die IRES-unabhängige Translation der Gene zu verhindern, und
c) Testen des potentiellen IRES-Elements auf IRES-abhängige Translation des GUS-Gens in Kaninchen-Reticulocyten-Lysat- oder Weizenkeimextrakt- in vitro Translationstests, wobei die GUS Genexpression quantifiziert wird, vorzugsweise bezüglich eines Konstrukts, das ein Referenz-IRES-Element oder ein nicht-IRES-Element zwischen dem stromaufwärts gelegenen Gen und dem stromabwärts gelegenen GUS Gen enthält.
2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nukleotidblock einen Adeninnukleotidgehalt von mindestens 50 Mol-% aufweist.
3. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nukleotidblock einen Adeninnukleotidgehalt von mindestens 60 Mol-% aufweist.
4. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Nukleotidblock einen Pyrimidinnukleotidgehalt von weniger als 30 Mol-% aufweist.
5. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Nukleotidblock einen Pyrimidinnukleotidgehalt von weniger als 20 Mol-% aufweist.
6. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Nukleotidblock eine Länge von mindestens 40 Nukleotiden aufweist.
7. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Nukleotidblock eine Länge von zwischen 30 und 200 Nukleotiden aufweist.
8. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Nukleotidblock eine Länge von zwischen 40 und 100 Nukleotiden aufweist.
9. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei in Schritt (i) Genomsequenzen gescreent werden.
10. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei 5'-untranslatierte Regionen von Offenen Leserahmen gescreent werden.
11. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei zur Ausführung von Schritt (i) ein Computerprogramm benutzt wird.
12. Computerprogramm zur Ausführung von Schritt (i) des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
13. Verfahren zur Expression einer gewünschten Nukleotidsequenz in eukaryotischen Zellen durch Einführen eines Vektors in die Zellen, wobei der Vektor die gewünschte Nukleotidsequenz umfasst, die operationell mit einem stromaufwärts gelegenen IRES-Element verknüpft ist, das gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 identifizierbar ist oder identifiziert wurde, wobei die gewünschte Nukleotidsequenz cap-unabhängig mittels des IRES-Elements translatiert wird.
14. Das Verfahren nach Anspruch 13, wobei die gewünschte Nukleotidsequenz von bicistronischer oder polycistronischer mRNA exprimiert wird.
15. Das Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das IRES-Element pflanzlichen Ursprungs ist.
16. Das Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das IRES-Element säugetierischen Ursprungs ist.
17. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 oder 14, wobei das IRES-Element eine Sequenz gemäß einer der Sequenzen von Fig. 7 oder Fig. 8 oder eines IRES-funktionellen Teiles derselben umfasst.
18. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 oder 14, wobei das IRES-Element von der 5'- untranslatierten Region eines der folgenden Pflanzengene abgeleitet ist: Hitzeschockfaktor 1, Poly(A)-bindendes Protein, 48K MAP Kinase.
19. Das Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Gene Tabakgene oder dazu homologe oder orthologe Gene sind.
20. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 19, wobei die eukaryotische Zelle eine Pflanzenzelle ist.
21. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 19, wobei die eukaryotische Zelle eine tierische Zelle ist.
22. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 19, wobei die eukaryotische Zelle eine Hefezelle ist.
23. IRES-Element identifiziert oder identifizierbar gemäß dem Verfahren eines der Ansprüche 1 bis 11.
24. IRES-Element, das eine Sequenz gemäß einer der Sequenzen von Fig. 7 oder Fig. 8 oder einen IRES-funktionellen Teil derselben umfasst.
25. IRES-Element pflanzlichen Ursprungs.
26. Vektor umfassend ein IRES-Element gemäß einem der Ansprüche 23 oder 25.
27. Transgene oder transient transfizierte eukaryotische Zelle, die mit einem Vektor wie in einem der Ansprüche 13 bis 19 definiert oder mit einem Vektor gemäß Anspruch 26 transformiert oder transfiziert ist.
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