DE69838222T2

DE69838222T2 - Verfahren zur co-expression von mehr als einem gen unter verwendung von mindestens einer internen ribosomenzugangsstelle

Info

Publication number: DE69838222T2
Application number: DE69838222T
Authority: DE
Inventors: Joseph Moscow Atabekov; Timo Korpela; Yurii Moscow DOROKHOV; Peter Moscow Ivanov; Maxim Moscow Skulachev; Nina Moscow Rodionova; Olga Moscow Karpova
Original assignee: Icon Genetics AG
Current assignee: Icon Genetics AG
Priority date: 1997-05-30
Filing date: 1998-05-29
Publication date: 2008-02-21
Anticipated expiration: 2018-05-30
Also published as: JP2002514086A; ATE369433T1; US6376745B1; FI972293A; EP1017834A1; WO1998054342A1; AU7533998A; DE69838222D1; FI972293A0; EP1017834B1; CA2291803A1; CA2291803C

Description

Das zweite Kreuzblütler-Tobamovirus (crucifer tobamovirus) (crTMV) genomische RNA-Sequenz-Element, das einen internen Translationsmechanismus der Genexpression in vitro und in planta bereitstellt, wurde aufgefunden. Dieses RNA-Sequenz-Element, das sich stromaufwärts vom Movement-Protein (MP)-Gen befindet, wird als interne Ribosomen-Eingangsstelle des MP-Gens (IRESmp) bezeichnet. IRESmp kann zusammen mit früher entdecktem RNA-Element stromaufwärts von crTMV-Hüllenprotein (CP)-Gen, IREScp (Ivanov et al., (1997), Virology, 232, 32-43) verwendet werden, um chimäre multicistrinische mRNAs für die Co-Expression heterologer oder mehrfach homologer Gene in Pflanzenzellen und transgenen Pflanzen zu bilden.
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Pflanzen-Molekularbiologie im Allgemeinen und insbesondere Nucleinsäuresequenzen, die die interne und 3'-proximale Genexpression in polycistronischen mRNA-Transcripts regulieren. Die Erfindung ermöglicht die Kontrolle einer transgenen Expression durch die Ausbildung von polycistronischen Fusions-mRNAs, in denen alle Gene aufgrund des Vorhandenseins des/der IRESmp-Element/Elemente translationsaktiv sind.
Hintergrund der Erfindung
Gemäß dem Ribosomen-Scanning-Modell, das für die meisten eukaryotischen mRNA traditionell ist, bindet die 40S-ribosomale Untereinheit an die 5'-Cap-Struktur und bewegt sich entlang der nicht-translatierten 5'-Sequenz, bis sie ein AUG-Codon erreicht (Kozak (1986), Adv. Virus Res. 31:220-292; Kozak (1989), J. Mol. Biol. 108:229-241). Obwohl für die Mehrheit von eukaryotischen mRNAs nur der erste offene Leserahmen (ORF) translationsaktiv ist, gibt es verschiedene Mechanismen, durch die mRNA polycistronisch wirken kann (Kozak (1986), Adv. Virus Res., 31:229-292). Wenn die erste AUG einen ungünstigen Sequenz-Kontext aufweist, können 40S-Untereinheiten diese umgehen und beim stromabwärtigen AUG-Codon initiieren (leaky scanning mechanism). Um die Initiierung der Translation funktioneller dicistronischer eukaryotischer mRNAs zu erklären, wurde auch eine Terminations-Reinitiierung vorgeschlagen (Kozak (1989), J. Mol. Biol. 108:229-241). Ein anderer Mechanismus für eine diskontinuierliche Ribosomen-Migration ("shunting") am mRNA wurde kürzlich für Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV) 35S RNA vorgeschlagen (Futerrer et al. (1993), Cell, 73:789-802).
Im Gegensatz zum Großteil eukaryotischer mRNAs findet die Initiierung der Translation von Picornavirus RNAs durch einen alternativen Mechanismus einer internen Ribosomen-Eingangsstelle statt. Eine picornavirale 5'-nichttranslatierte Region (5'NTR) enthält eine so genannte interne Ribosomen-Eingangsstelle (IRES) oder Ribosomen-Landungskissen (ribosome landing pad) (Pelletier und Sonennberg (1988), Nature, 334:320-325; Molla et al. (1992), Nature, 356:255-257), die in eine komplexe sekundäre Struktur gefaltet ist und einen Pyrimidin-reichen Trakt, gefolgt von einem AUG-Codon, enthält (Agol (1991), Adv. Virus Res. 40:103-180; Wimmer et al. (1993), Annu. Rev. Genet., 27:353-436; Sonennberg und Pelletier (1989), BioEssays, 11:128-132). Eine interne Ribosomen-Eingangsstelle wurde auch für andere virale (Le et al. (1994), Virology, 198:405-411; Gramstat et al. (1994), Nucleic Acid Res., 22:3911-3917) und zelluläre (Oh et al. (1992), Gen Dev., 6:1643-1653) RNAs berichtet. WO 97/14809 beschreibt Expressionsvektoren, die Tiervirus-IRESes enthalten.
Es ist wichtig, zu unterstreichen, dass der Picornavirus und andere bekannte IRESes in den Pflanzenzellsystemen nicht aktiv sind.
Das Genom von Tobamovirus (TMV UI ist das Typelement) enthält vier große ORFs. Translationsversuche in vitro haben gezeigt, dass die zwei Komponenten der Replicase (das 130K und seine durchgelesenen 183K-Proteine) direkt aus der genomischen RNA translatiert werden (Pelham und Jackson (1976), Eur. J. Biochem., 67:247-256). Die anderen zwei Proteine (30K Movement-Protein, MP, und Hüllenprotein, CP) werden aus zwei individuellen subgenomischen RNAs (sgRNAs) translatiert. Zwei strukturell discistronische
I₂ sgRNAs werden translatiert, und ergeben das 30K MP, während sein 3'-terminales CP-Gen unterdrückt ist und ein monocistronisches sgRNA das CP codiert (Palukaitis und Zaitlin (1986) in The Plant Viruses, Hrgb. Van Regenmortel und M. Fraenkel-Conrat, 2:105-131, Plenum Press).
Kürzlich wurde ein neues Tobamovirus, crTMV, aus Oleracia officinalis L.-Pflanzen isoliert und das Genom wurde sequenziert (6312 Nucleotide) (Dorokhov et al. (1993), Doklady of Russian Academy of Sciences, 332:518-522; Dorokhov et al. (1994), FERS Lett. 350:5-8). Ein besonderes Merkmal von crTMV ist seine Fähigkeit, systemisch die Elemente der Kreuzblütler-Familie (cruciferae-Familie) zu infizieren. Die crTMV RNA enthält vier ORFs, die die Proteine von 122K (ORF1), 178K (ORF2), das durchgelesene Produkt von 122K, 30K MP (ORF3) und 17K CP (ORF4) codieren. Zum Unterschied von anderen Tobamoviren überlappen die codierenden Regionen der MP- und CP-Gene von crTMV 25 Codons, d.h. 5' der CP-codierenden Region sind MP codierende Sequenzen.
Es wurde gezeigt, dass im Unterschied zur RNA typischer Tobamoviren die Translation des 3'-proximalen CP-Gens von crTMV RNA in vitro und in planta durch einen Mechanismus einer internen Ribosomen-Eingangsstelle auftritt, der durch ein spezifisches Sequenz-Element, IREScp (Ivanov et al. (1977), Virology, 231, im Druck) vermittelt wird. In dieser Arbeit wurden drei Arten synthetischer dicistronischer RNA-Transcripte konstruiert und in vitro translatiert: (i) "MP-CP-3'NTR"-Transcripte, MP-Gen, CP-Gen und die 3'-nicht-translatierte Region (NTR) von crTMV enthalten. Diese Konstrukte waren mit durch Tobamoviren in vivo gebildeten dicistronischen subgenomischen RNAs strukturell äquivalent. (ii) "ΔNPT-CP"-Transkripte, enthaltend teilweise abgestumpftes Neomycin-Phosphotransferase-I-Gen und CP-Gen. (iii) "CP-GUS"-Transkripte, enthaltend das erste CP-Gen und das Gen von E. coli (β-Glucuronidase (GUS) an der 3'-proximalen Position.
Die Ergebnisse zeigten, dass die 148-nt Region stromaufwärts vom CP-Gen von crTMV RNA IREScp enthielt, das eine interne Initiierung der Translation in vitro fördert. Dicistronische IREScp, enthaltend chimäre mRNAs mit der 5'-terminalen Stamm-Schleifenstruktur, die die Translation des ersten Gens (MP, ΔNPT oder CP) verhindern, exprimierten trotz ihrer 3'-proximalen Lokalisation CP- oder GUS-Gene. Die Kapazität von crTMV IREScp zur Vermittlung einer internen Translation unterscheidet dieses Tobamovirus von dem allgemein bekannten Typelement des Genus, TMV UI. Die äquivalente 148-nt Sequenz von TMV RNA war nicht dazu fähig, eine interne Translation zu vermitteln. Zwei Mutanten wurden verwendet, um Strukturelemente von IREScp zu untersuchen. Es wurde angenommen, dass die Integrität von IREScp für eine interne Initiierung essentiell ist. Die RNA-Analyse von IREScp ergab die Polyurin-reiche Streckung und Stamm-Schleifenstruktur.
crTMV stellt ein neues Beispiel für eine interne Initiierung der Translation bereit, die für Picornaviren und andere virale und eukaryotische mRNAs gezeigte IREScs deutlich verschieden ist.
Um zu zeigen, dass IREScp nicht nur in vitro aktiv ist, sondern auch in vivo, wurden zwei Verfahren verwendet: i) Konstruieren der transgenen Rübsamenpflanzen (Brassica napus L.), die in ihrem Genom die crTMV cDNA, die MP, CP-Gene und 3'NTR umfasst, enthalten; ii) den Teilchenbeschuss von Tabakpflanzenblättern mit dem cDNA-Konstrukt "CP-IREScp-GUS" unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promotors und Terminators. Beide Verfahren zeigen, dass IREScp in Pflanzen aktiv ist (Ivano et al., unveröffentlichte Ergebnisse).
Zusammenfassung der Erfindung
Eine primäre Aufgabenstellung der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, das es ermöglicht, gleichzeitig gewünschte Gene in vitro und in planta zu exprimieren. Die Erfindung stellt die Verfahren der Ansprüche 1 und 2 bereit, eine prokaryotische Pflanzenzelle gemäß Anspruch 11 und eine transgene Pflanze gemäß Anspruch 12.
Die Erfindung kann erzielt werden, indem man crTMV RNA-Sequenzen stromaufwärts des MP-Gens, das hier als IRESmp bezeichnet wird, verwendet. Das erfindungsgemäße Verfahren beinhaltet die Konstruktion eines rekombinanten DNA-Moleküls, das einen Transkriptions-Promotor umfasst, das erste pflanzenexprimierbare Gen, das mit dem Transkriptions-Promotor gekoppelt ist, wobei die 3' zum ersten Gen und das zweite pflanzenexprimierbare Gen 3' zur IRES angeordnet ist, so dass das zweite Gen sich unter der Translationskontrolle der IRES befindet. Das primäre chimäre kontinuierliche RNA-Transkript in positive Sense-Polarität wird durch die transformierten Zellen vom pflanzenexprimierbaren Promotor gebildet. Die Expression des ersten Gens findet durch direk te Translation des 5'-proximalen Gens dieser mRNA statt, aber die Translation des 5'-distalen Gens der dicistronischen mRNA wird durch die IRES gefördert.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Genkarte von TMV UI und crTMV. Die Lokalisierung von IRESmp und IREScp auf der crTMVGenkarte ist angezeigt.
2 zeigt die Nucleotidsequenz und vorgeschlagene Sekundärstruktur der 228-nt IRESmp enthaltenden Region von crTMV RNA stromaufwärts des MP-Gen AUG-Codon (hervorgehoben).
3 ist eine schematische Darstellung der di- und monocistronischen Transkripte: (a) HCPUIspmpGUS, das 5'-proximale crTMV CP-Gen, mit stromaufwärtiger Sequenz, die eine potentielle stabile Haarnadel (H) bildet und durch die 228-nt-Region stromaufwärts vom TMV UI MP-Gen (UIspmp) getrenntes GUS-Gen; (b) HCPIREScpGUS, die 148-nt-Region stromaufwärts von crTMV CP-Gen (IREScp), als intercistronischer Spacer eingefügt; (c) die 228-nt-Region stromaufwärts von crTMV MP-Gen (IRESmp), als intercistronischer Spacer eingefügt; (d) monocistronische IRESmpGUS, GUS-Gen mit IRESmp als Leader; (e) monocistronische αβGUS, αβ-Translations-Enhancer von PVX-genomischer RNA als Leader; (f) die Nucleotidsequenz und putative Sekundärstruktur der Haarnadel (H) stromaufwärts vom CP-Gen in den Transkripten (a-c).
4 Analyse von in vitro in Kaninchen-Reticulocytenlysat (RRL) durch die in 3 dargestellten Transkripte gelenkten Proteinen. Autoradiogramm von Gradienten 8-20 % Polyacrylamid-SDS-Gelen, die [³⁵S]Methionin-markierte Produkte enthalten, gelenkt durch (uncapped) Transkripte in RRL. Die Konzentration der Transkripte beträgt 40 (μg/ml).
5 Histochemische Analyse der GUS-Aktivität in Blättern von Nicotiana benthamiana-Pflanzen, beschossen mit pFFCPIREScpGUS (Tafel a) und pFFCPIRESmpGUS (Tafel b). Die Gegenwart der GUS-Aktivität wird durch die blaue histochemische Reaktion angezeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Um Zweifel im Zweck oder Rahmen ihrer Verwendung auszuräumen, werden die folgenden Definitionen angegeben. Expression bezieht sich auf die Transkription und Translation von Genen zur Synthese eines Proteins. Promotoren beziehen sich auf die Sequenz am 51 Ende des ersten Gens, das die Initiierung der DNA-Transkription lenkt. Promotorsequenzen sind notwendig, um die Expression des stromabwärtigen Gens (Gene) zu steuern. Eukaryotische (einschließlich pflanzenspezifische) Promotoren enthalten im Allgemeinen die TATA-Box circa 10-35 bp 5' zur Transkription-Startstelle. 35S-Promotor bezieht sich auf einen pflanzenexprimierbaren Blumenkohl-Mosaikvirus-Promotor, der die TATA-Box und andere Sequenzen bereitstellt, die für eine maximale Effizienz der Transkription verantwortlich sind. Dieser Promotor könnte auch als transkriptionaler rekombinanter Promotor zur Genexpression in monocotyledonen Pflanzen (Last et al., europäische Patentanmeldung Nummer: 91304205.7 ) und anaerobes pflanzenregulierendes Element (Peacock et al., europäische Patentanmeldung Nummer: 88300852.6 ) dienen. IRESmp bezieht sich auf die Sequenz stromaufwärts von crTMV MP-Gen.
Eine primäre Aufgabenstellung dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, das einem Fachmann auf diesem Gebiet ermöglicht, gleichzeitig gewünschte Gene in planta zu exprimieren. Diese Aufgabenstellung kann erzielt werden, indem man crTMV RNA-Sequenzen stromaufwärts vom MP-Gen verwendet, die wird im Gegensatz zum früher beschriebenen IREScp (1) als IRESmp (1 und 2) bezeichnet haben. Es wurde festgestellt, dass die 228-nt-Region stromaufwärts vom crTMV RNA MP-Gen IRESmp enthält (1 und 2). Dieses IRES-Element wirkt in chimären bicistronischen Transkripten und ergibt eine Expression von 3'-proximalen Genen in vitro (Pflanzen- und Tierprotein synthetisierende Systeme) und in planta.
Die IRES-Elemente können in transgenen Expressionskonstrukten verwendet werden, um die Beschränkungen der Cap-vermittelten Translation zu umgehen und um polyfunktionelle RNAs zu bilden:

a) Co-Expression von definierten Genprodukten in Zellkulturen und transgenen Pflanzen und Tieren. Viele in vitro-Anwendungen für transgene Pflanzen und Säuger erfordern die Co-Expression heterologer Genprodukte. Um zum Beispiel stabile Zellklone und Linien transgener Pflanzen und Tiere, die ein rekombinantes Protein bilden, herzustellen, ist es im Allgemeinen erforderlich, Vektoren zur Expression des gewünschten Proteins und des Selektionsmarkers einzuführen. Dies wird üblicherweise entweder durch co-transfektierende Zellen mit zwei unabhängigen Konstrukten oder durch Einführen eines einzigen Vektors, der zwei diskrete Expressionskassetten beherbergt, erzielt. Der erste Ansatz wird oft durch die Ineffizienz der Co-Transfektion beschränkt. Der zweite erfordert die Konstruktion eines relativ komplexen Vektors und leidet im Allgemeinen an einer unzuverlässigen und/oder geringen Expression der nicht selektiverbaren cDNA. Die Verwendung von IRES in dicistronischen Expressionsvektoren kann diese Probleme umgehen, indem sie es einer einzigen Transkriptionseinheit ermöglicht, eine effiziente Produktion des gewünschten Proteins und eines selektierbaren Markers zu erzielen (Kaufman et al. (1991), Nucleic Acids Res. 19:4485-4490; Ghattas et al. (1991), Mol. Cell. Biol. 11:5848-5859; Sugimoto et al. (1994), Biotechnology, 12:694-698);
b) funktionelles Expressionsklonieren neuer cDNAs Zusätzlich zur Erleichterung der stabilen Expression charakteristischer cNDAs können Vektoren, die eine IRES-vermittelte Co-Expression eines selektiverbaren Markers inkorporieren, auf die Isolierung neuer Gene durch funktionelle Klonierverfahren angewendet werden. Ein Weg zur Identifizierung von cDNAs, die das Wachstum oder die Differenzierung eines bestimmten Zelltyps beeinflussen, ist zum Beispiel das Screenen von Zellpopulationen, die mit cDNA-Expressionsbibliotheken transfektiert sind. Vektoren mit einer IRES-gekoppelten Genexpression eines selektiverbaren Markers versprechen ein beträchtliches Ansteigen der Effizienz durch Sicherstellen, dass die Mehrzahl selektierter Transfektanten ebenfalls cDNA exprimiert. Eine starke Strategie zum Klonieren von cDNAs, die aufeinander wirkende Proteine codieren, ist das Zwei-Hybrid-System (Fields und Song (1989), Nature, 340:245-246). Dieses Screening basiert auf einer Co-Expression eines Hybrids zwischen einer cDNA und einer Aktivierungsdomäne zusammen mit einem Fusionsprotein einer DNA-Bindungsdomäne und einem Ziel-Protein. Das Erfordernis zur Produktion von zwei Proteinen legt nahe, dass die Methodologie vereinfacht werden könnte, indem man ein IRES-Element einbaut, um einen einzigen Vektor zur Co-Expression beider Fusionsproteine herzustellen. Kürzlich wurde gezeigt, dass bestimmte IRES-Sequenzen in Saccharomyces cerevisiae (Iisuka et al. (1994), Mol. Cell. Biol. 14:7322-7330) funktionieren, weshalb dieses Verfahren in Hefe sowie in analogen Säugetiersystemen anwendbar sein könnte (Vasavada et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:10686-10690); Fearon et al. (1992), ibid 89:7958-7962).

Es wurde gezeigt, dass crTMV RNA IREScp in bicistonischen Transkripten in vivo (Ivanov et al. (1997), im Druck) und in planta (Ivanov et al., nicht veröffentlichte Ergebnisse) wirkt. Die vorliegende Erfindung stellt die erste Bestätigung dafür bereit, dass die Nucleotid-Sequenzregion stromaufwärts vom crTMV MP-Gen IRESmp ist, die in chimären bicistronischen Transkripten in vitro wirksamer ist als ein IREScp-Element. Die DNA-Sequenzen, DNA-Fragmente, die IRESmp-Elemente und erfindungsgemäße Konstruktionen enthalten, ermöglichen es Reporter-Gene in vitro und in planta zu exprimieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren beinhaltet die Konstruktion eines rekombinanten DNA-Moleküls, das aus einem pflanzenexprimierbaren Struktur-Gen, IRESmp und pflanzenexprimierbaren Reporter-Gen besteht, wobei das pflanzenexprimierbare Reporter-Gen 3' zu IRESmp lokalisiert und so positioniert ist, dass die Expression des Reporter-Gens durch IRESmp kontrolliert wird. Das rekombinante DNA-Molekül kann in einem DNA-Konstrukt oder Vektor in Kombination mit geeigneten regulatorischen Sequenzen (Promotor, Terminator, Enhancer, Transit-Peptid, usw.) inkorporiert sein. Das Transit-Peptid kann homolog oder heterolog zum Reporter-Protein sein und wird gewählt, um eine Sekretion in die gewünschte Organelle oder den extrazellulären Raum sicherzustellen. Ein solches DNA-Konstrukt kann in ein biologisches System kloniert oder transformiert werden, das die Expression des Reporter-Proteins ermöglicht. Geeignete biologische Systeme umfassen Hefe, Viren, Kulturzellen (wie zum Beispiel Insektenzellen, Säugetierzellen und Pflanzenzellen) und Tiere und Pflanzen.
Die zweite Aufgabenstellung dieser Erfindung ist die Bereitstellung einer simultanen Expression von von Pflanzenvirus abgeleiteten Genen (Replicase, MP- und CP-Gene) unter Verwendung von IRESmp und IREScp, zum Beispiel in den folgenden DNA-Expressionskassetten: Replicase-Gen/IRESmp/MP-Gen/IREScp/CP-Gen. Es ist allgemein bekannt, dass transgene Pflanzen, die in ihrem Genom von Pflanzenvirus abgeleitete Gene enthalten, gegenüber homologen Pflanzenviren resistent sind. Es ist möglich, transgene Pflanzen zu bilden, die gegenüber verschiedenen Pflanzenviren resistent sind, indem man eine solche DNA-Konstruktion verwendet. Die DNA-Expressionskassetten können in ein DNA-Konstrukt oder einen Vektor in Kombination mit geeigneten regulatorischen Sequenzen (Promotor, Terminator, Transitpeptid, Enhancer, usw.) eingebaut werden. Die DNA-Sequenz kann unter die Kontrolle eines homologen oder heterologischen Promotors gestellt werden, der ein konstitutiver oder ein induzierbarer Promotor sein kann (zum Beispiel stimuliert durch Umgebungsbedingungen, in Gegenwart eines Pathogens, in Gegen wart einer Chemikalie). Pflanzenzellen können mit rekombinanten DNA-Konstrukten gemäß einer Vielzahl bekannter Methoden transformiert werden (Agrobacterium Ti-Plasmide, Elektroporation, Mikroinjektion, Mikroprojektilbeschuss, usw.). Die transformierten Zellen können dann in geeigneten Fällen in ganze Pflanzen regeneriert werden, in denen das neue Kernmaterial in das Genom stabil eingebaut wird. Transformierte monocotyledone und dicotyledone Pflanzen können auf diese Weise erhalten werden. Beispiele genetisch modifizierter Pflanzen, die produziert werden können, umfassen Feldfrüchte, Getreide, Früchte und Gemüse, wie zum Beispiel Canola, Sonnenblumen, Tabak, Zuckerrüben, Baumwolle, Soja, Mais, Weizen, Gerste, Reis, Sorghum, Tomaten, Mangos, Pfirsiche, Apfel, Birnen, Erdbeeren, Bananen, Melonen, Kartoffeln, Karotten, Lauch, Kohl, Zwiebeln.
Die dritte Aufgabenstellung der Erfindung ist es, in transgenen Pflanzen koordiniert eine Gruppe von Genen zu exprimieren. Eine koordinierte Expression ist zum Beispiel brauchbar, wenn es notwendig ist, ein Protein zu exprimieren, das aus verschiedenen Polypeptiden besteht, oder wenn verschiedene Enzyme eines biosynthetischen Wegs exprimiert werden müssen.
Eine weitere Aufgabenstellung dieser Erfindung ist die Bereitstellung der simultanen Produktion proteolytischer Enzyme zur Spaltung eines Polyprotein-Produkts.
Die Objekte dieser Erfindung sind Pflanzen, Pflanzenzellen und Pflanzengewebe, die auf Feldern oder in spezifischen Fermentoren gewachsen sind. Weitere Objekte sind Vektoren und Expressionskassetten, die aus IRESmp bestehen, und Bakterienzellen, die solche Vektoren umfassen, die geeignet sind zur Aufrechterhaltung, Replikation und Pflanzentransformation.
Es ist darauf hinzuweisen, dass eukaryotische IRES-Sequenzen weit verbreiteter sein können als dies bisher realisiert wurde, weil sie durch Sequenzhomologie nicht identifiziert werden können; bekannte IRESes wurden funktionell definiert und, bisher, nicht-konservierte Merkmale aufgefunden. Die vorliegende Erfindung ist deshalb nicht auf irgendwelche spezifische, hier beschriebene IRES-Sequenzen beschränkt. Vielmehr beschreibt die Erfindung die funktionelle Eigenschaft irgendeiner IRESmp-Sequenz.
Die Erfindung wird nun in den folgenden, nicht beschränkenden Beispielen und unter Bezugnahme auf die Figuren beschrieben.
BEISPIELE
Beispiel 1: Konstruktion von IRES enthaltenden Plasmiden
Gemäß Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York., wurden molekularbiologische Standardverfahren durchgeführt. Alle in der Erfindung verwendeten Plasmide können gemäß den Angaben der Beschreibung durch einen Fachmann auf diesem Gebiet ohne übermäßig große experimentelle Arbeiten unter Verwendung von auf diesem Gebiet leicht erhältlichen Materialien durchgeführt werden.
Um pCP zu erhalten, wurde crTMV cDNA mittels PCR mit Primern amplifiziert, die die KpnI-Position am 5'-Ende und die HindIII-Position am 3'-Ende des crTMV CP-Gens einführten, und das Produkt wurde zwischen den KpnI- und HindIII-Positionen von pBluescript II KS+ kloniert. Das Plasmid pHCP unterscheidet sich vom früheren Konstrukt durch die Gegenwart von inverted tandem repeat (KpnI-EcoRI und ClaI-KpnI-Fragmente von pBluescript II KK+ Polylinker-Sequenz). Das Klonieren des BamHI/SacI-Fragments aus pTBSMPΔCPSma (beschrieben von Ivanov et al. (1997), Virology, 231, im Druck) in pCP ergab die Bildung von pCPMP. Dieses Plasmid enthält crTMV CP und MP-Gene mit mehreren Restriktionsstellen im intercistronischen Bereich. CPIRESmpMP-Konstrukt wurde durch Digestion des pCPMP mit EcoRV und BgIII, gefolgt von einer Insertion des Eco RV/BgIII-Fragments, abgeleitet von pG7S3 crTMV cDNA-Sequenz-Klon, gebildet. Dieses Klon enthielt den C-terminalen Teil des Replicase-Gens (EcoRI-Stelle) und den 5'-terminalen codierenden Teil des MP-Gens (BgIII-Stelle). Um monocistronisches Konstrukt IRESmpGUS zu erhalten, wurde pGEM3zf+-Vektor mit EcoRI und SalI digestiert und dann mit zwei Inserten ligiert: GUS-Gen (NcoI/SalI-Fragment von pRTαβGUS, beschrieben von Zelenina et al. (1992), FERS Lett., 296, 276-270) und EcoRI/NcoI-Schnitt-PCR-Produkt, das aus dem crTMV cDNA-Klon pG7S20 (Ivanov et al. (1997), Virology, 231, im Druck) unter Verwendung von Primern mit eingeführten EcoRI- und KpnI-Positionen am 5'-Ende und NcoI-Position am 3'-Ende der IRESmp-Sequenz (228 Nucleotide stromaufwärts vom crTMV MP-Gen) amplifiziert wurde. Das EcoRI/PstI-Fragment von IRESmpGUS wurde in EcoRI/PstI-Schnitt pHCP eingeführt, um dicistronisches Konstrukt pHCPIRESmpGUS zu ergeben. Das Plasmid UIspGUS wurde durch Klonieren von zwei Fragmenten (HindIII/NcoI-Schnitt UIspGUS und NcoI-XbaI-Schnitt GUS-Gen) zwischen den HindIII- und XbaI-Positionen von Bluescript II SK+ gebildet. UIsp wurde in RT-PCR unter Verwendung von genomischer TMV UI RNA mit 5'-Oligonucleotid-Primer entspre chend 4676-4686 der TMV UIS CDNA, enthaltend HindIII-Stelle und 3'-Primer, enthaltend NcoI-Stelle, und komplementär zu den Nucleotiden 4883-4903 derTMV UI cDNA, erhalten. GUS-Gen wurde durch Digestieren von pRTαβGUS-Plasmid mit NcoI und XbaI erhalten. Das HindIII/XBaI-Fragment von UIspGUS wurde in HindIII/XBaI-Schnitt pHCP kloniert, um pHCPUIspGUS zu erhalten. Die Bildung von αβGUS wurde von Ivanov et al. (1997) (Virology, 231, im Druck) beschrieben.
Die pFF-Serien von Konstrukten weisen 35S-Enhancer, 35S-Promotor und 35S-Polyadenylierungssignal auf (Topfer et al. (1987), Nucleic Acids Res., 415, 5890). Diese Plasmide wurden von pFF19- und pFF19GUS-Konstrukten, die früher beschrieben wurden (Morozov et al. (1997), J. Gen. Virol., im Druck) abgeleitet. Die Konstrukte pFFCPI-REScpGUS, pFFCPIRESmpGUS und pFFCPUIspmpGUS wurden durch Klonieren von KpnI/XBaI-Fragmenten von CPIRESmpGUS bzw. CPUIspmpGUS in pFF19-Vektor gebildet.
Beispiel 2: in vitro-Transkription
Die Plasmide HCPIRESmpGUS, JCPIREScpGUS, HCPUIspGUS, αβGUS, UIspGUS wurden mittels SacI linearisiert. Die rekombinanten Plasmide wurden in vitro (wie von Tomashevskaya et al. (1993), J. Gen. Virol. 74, 2717-2724 beschrieben) transkripiert. Agarosegel-Elektrophorese von RNA-Transkripten bestätigte, dass sie intakt waren. Die RNA-Konzentration wurde durch Agarosegel-Elektrophorese und Spektrophotometrie quantifiziert.
Beispiel 3: Zellfreie Translation
Eine in vitro-Translation in Kaninchen-Reticulocytenlysaten (RRL) wurde gemäß Pelham und Jackson (1976) (Eur. J. Biochem., 67, 247-256) mit kleinen Modifikationen, durchgeführt. Die Translationsmischung (25 μl Endvolumen) enthielt 10 μl mit Nuclease behandeltes Lysat, enthaltend 1 mM CaCl₂ mit Heroin; 20 mM Hepes, pH 7,6; 1 mM ATP; 200 mM GTP; 2,5 mM Magnesiumacetat; 100 mM Kaliumacetat; 2 mM DTT; 15 mM Creatinphosphat; 1 μg Creatinphosphokinase; 5 mM cAMP; 2 mM EGTA; 3 μg Hefe tRNA; 125 μM jeder essentiellen Aminosäure ausschließlich Methionin; 800 μCi/ml [³⁵S]-Methionin (Amersham, > 1000 Ci/mmol) und 40-100 μg/ml Viren-RNA. Die Inkubation wurde bei 30 °C während 60 Minuten durchgeführt. Die Translation in Weizenkeimextrakten (WG) wurde gemäß der Vorschrift des Herstellers (Promega) in Gegenwart von [³⁵5]-Methionin während 60 Minuten bei 25 °C durchgeführt. Radiomarkierte Translationspro dukte wurden mittels SDS-PAGE analysiert und durch Autoradiographie am getrockneten Gel lokalisiert.
Es war lange bekannt, dass nur das 5'-proximale Gen von Tobamovirus genomischer RNA direkt durch Ribosomen translatiert werden kann. Ein dicistronisches uncapped sgRNA lenkt nur die Translation von MP, während eine zweite monocistronische capped sgRNA die Synthese des CP lenkt (besprochen von Palukaitis und Zaitlin (1986) in The Plant Viruses, Hrgb. Van Regenmortel und M. Fraenkel-Conrat, 2:105-131, Plenum Press). Unerwarteterweise haben unsere Versuche gezeigt, dass im Gegensatz zu TMV UI RNA genomische RNA von crTMV Tobamovirus die Synthese von MP in vitro lenkt (Daten nicht angegeben).
Es erhebt sich die Frage, ob die MP-codierenden Sequenzen unmittelbar zu IRESmp benachbart für die interne Initiierung essentiell sind. Deshalb wurde chimäre mRNA (HCPIRESmpGUS in 3), die das 3'-proximale fremde GUS-Gen enthält, in WEG (Daten nicht angegeben) und RRL (4) translatiert. Es wurde gefunden, dass IRESmp von crTMV Tobamovirus bei der Vermittlung der 3'-proximalen GUS-Genexpression wirksam ist und wirksamer ist als IREScp.
Um zu zeigen, dass die IRESmp-vermittelte Translation für Tobamoviren unüblich ist, wurde das äquivalente dicistronische Konstrukt (HCPUIspmpGUS in 3) hergestellt, das die 228-nt-Region stromaufwärts von TMV UI MP-Gen als intercistronischen Spacer enthielt. 4 zeigt, dass die TMV UI-abgeleitete Sequenz nicht dazu fähig war, eine interne Ribosomen-Eingangsstelle zu vermitteln. Es ist wichtig, dass der zweite ORF aus IREScp und IRESmp enthaltenden dicistronischen RNA-Transkripten translatiert wurde, die ihre Integrität während der Inkubation im Translationsextrakt (Daten nicht angegeben) beibehielten.
Beispiel 4: Teilchenbeschuss
Der Teilchenbeschuss wurde durchgeführt unter Verwendung der Flugscheibenmethode (flying disk method) (siehe zum Beispiel Daniell (1993) (Methods in Enzymology, 217, 537-557) mit einer Hochdruckapparatur auf der Basis von Helium, PDS-1000 (Bio-Rad). Für jede Beschussserie wurde DNA auf Wolfram-Teilchen mit Calciumchlorid und Ethanol nach der Zugabe ausgefällt, während 10 μl Plasmid-DNA (bei 0,5-1,5 mg/ml bis 6 mg Wolfram-Teilchen in 100 μl 50 %igem Glycerin suspendiert), verwirbelt wurde, und dann die Wolfram-Teilchen in kaltem 95 %igem Ethanol in Suspension gehalten wurden (90 mg/ml). Nach Beschallung wurden 5 μl dieser Mischung sofort auf eine Flugscheibe aus Kunststoff gegeben und zum Beschuss verwendet, wenn die Teilchen trocken waren. Ein abgelöstes Blatt von Nicotiana benthamiana (15-30 mm Größe) wurde in das Zentrum einer Petrischale aus Kunststoff gegeben und auf einer festen Unterlage mit einer Zieldistanz von 7 cm beschossen. Der Beschuss wurde mit einem Puls von 1350 kPa Heliumgas in einer Vakuumkammer durchgeführt.
Inokulierte Blätter wurden 24 bis 72 Stunden nach dem Beschuss gesammelt. Die IRES-Aktivität wurde durch histochemische Bestimmung der GUS-Expression (beschrieben bei Jefferson (1987), Plant Molecular Biology, Report, 5, 387-405) festgestellt. Proben wurde in das colorimetrische GUS-Substrat, modifiziert (De Block und Debrouwer (1992), Plant J., 2, 261-266) infiltriert, um die Diffusion der Zwischenprodukte der Reaktion zu begrenzen: 0,115 M Phosphatpuffer, pH 7,0, enthaltend 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid (X-Gluc) 600 μg/ml; 3 mM Kaliumferricyanid; 10 mM EDTA. Nach Inkubation über Nacht bei 37 °C wurden die Blätter in 70 % Ethanol fixiert und mittels Lichtmikroskopie untersucht.
5 zeigt, dass 35S DNA-Konstrukte CPIREScpGUS (a) und CPIRESmpGUS (b) in der durch histochemische Reaktionen hervorgerufenen GUS-Synthese aktiv sind. Die 35S-Konstrukte CPUIspcpGUS und CPUIspmpGUS sind in der GUS-Synthese in Pflanzenblättern nicht aktiv (Daten nicht angegeben).

Claims

Verfahren zur Herstellung stabiler Zellklone transgener Pflanzen, wobei die Zellklone ein gewünschtes Protein und einen Selektionsmarker produzieren, wobei das Verfahren das Einführen eines dicistronischen rekombinanten DNA-Moleküls in Zellen umfasst, und das dicistronische rekombinante DNA-Molekül (a) einen Transkriptionspromotor; (b) ein erstes pflanzenexprimierbares Gen, das mit dem Transkriptionspromotor gekoppelt ist; (c) ein cDNA-Sequenzelement, das eine interne Ribosomen-Eingangsstelle (IRES) ist, die 3' zum ersten pflanzenexprimierbaren Gen angeordnet ist, wobei die IRES eine eukaryotische IRES pflanzenviralen Ursprungs ist; und (d) ein zweites pflanzenexprimierbares Gen 3' zu der IRES umfasst, so dass das zweite Gen sich unter der Translationskontrolle der IRES befindet; wobei das dicistronische rekombinante DNA-Molekül die Produktion des gewünschten Proteins und des Selektionsmarkers ermöglicht.
Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen, wobei die Zellklone ein gewünschtes Protein und einen Selektionsmarker produzieren, wobei das Verfahren das Einführen eines dicistronischen rekombinanten DNA-Moleküls in Zellen umfasst, und das dicistronische rekombinante DNA-Molekül (a) einen Transkriptionspromotor; (b) ein erstes pflanzenexprimierbares Gen, das mit dem Transkriptionspromotor gekoppelt ist; (c) ein cDNA-Sequenzelement, das eine interne Ribosomen-Eingangsstelle (IRES) ist, die 3' zum ersten pflanzenexprimierbaren Gen angeordnet ist, wobei die IRES eine eukaryotische IRES pflanzenviralen Ursprungs ist; und (d) ein zweites pflanzenexprimierbares Gen 3' zu der IRES umfasst, so dass das zweite Gen sich unter der Translationskontrolle der IRES befindet; wobei das dicistronische rekombinante DNA-Molekül die Produktion des gewünschten Proteins und des Selektionsmarkers ermöglicht.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die IRES eine tobamovirale IRES (IRES_MP) ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die IRES eine tobamovirale IRES (IRES_CP) ist.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die IRES von einem Kreuzblütler-infizierenden Tobamovirus (crucifer-infecting tobamovirus (crTMV) herrührt.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das gewünschte Protein ein Polypeptidprodukt ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Selektionsmarkern, Toxinen, Hormonen, Proteasen und viralen Proteinen.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Selektionsmarker Antibiotikaresistenz oder Herbizidresistenz verleiht.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Transkriptionspromotor ein konstitutiver oder induzierbarer pflanzenspezifischer Promotor ist.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das rekombinante DNA-Molekül zusätzlich in 3'-Position des zweiten pflanzenexprimierbaren Gens eine andere oder die gleiche IRES und ein Gen, das für ein gewünschtes Polypeptid codiert, enthält.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Verfahren die koordinierte Expression eines aus mehreren Polypeptiden bestehenden Enzyms oder mehrerer Enzyme eines biosynthetischen Weges ermöglicht.
Eine eukaryotische Pflanzenzelle, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist, das umfasst: (a) einen Transkriptionspromotor, (b) ein erstes pflanzenexprimierbares Gen, das mit dem Transkriptionspromotor gekoppelt ist; (c) ein cDNA-Sequenzelement, das eine interne Ribosomen-Eingangsstelle (IRES) ist, die 3' zum ersten pflanzenexprimierbaren Gen angeordnet ist, wobei die IRES eine eukaryotische IRES pflanzenviralen Ursprungs ist; und (d) ein zweites pflanzenexprimierbares Gen 3' zu der IRES, so dass das zweite Gen sich unter der Translationskontrolle der IRES befindet; wobei das erste pflanzenexprimierbare Gen oder das zweite pflanzenexprimierte Gen ein Selektionsmarker ist.
Eine transgene Pflanze, enthaltend ein rekombinantes DNA-Molekül wie in Anspruch 11 definiert.
Die eukaryotische Pflanzenzelle gemäß Anspruch 11 oder die transgene Pflanze gemäß Anspruch 12, wobei das rekombinante DNA-Molekül zusätzlich in 3'-Position des zweiten pflanzenexprimierbaren Gens eine andere oder die gleiche IRES und ein Gen, das für ein gewünschtes Polypeptid codiert, enthält.