DE10303937A1 - Pflanzentransformation mit Assemblierung einer gewünschten Sequenz in Vivo - Google Patents

Pflanzentransformation mit Assemblierung einer gewünschten Sequenz in Vivo Download PDF

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Abstract

Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen oder Pflanzenzellen, die auf einem Chromosom stabil mit einer gewünschten DNA-Sequenz tranzformiert sind und eine gewünschte Funktion von der gewünschten DNA-Sequenz exprimieren können, wobei das Verfahren umfasst: DOLLAR A (a) Behandeln von Pflanzenzellen oder Pflanzen mit mindestens zwei verschiedenen Vektoren, wobei DOLLAR A (i) die mindestens zwei verschiedenen Vektoren so eingerichtet sind, dass sie miteinander mittels ortsspezifischer Rekombination in den Pflanzenzellen rekombinieren, um ein nichtreplizierendes Rekombinationsprodukt zu ergeben, das die gewünschte DNA-Sequenz enthält, DOLLAR A (ii) die mindestens zwei verschiedenen Vektoren so eingerichtet sind, dass sie die gewünschte DNA-Sequenz in das Chromosom integrieren können, DOLLAR A (iii) die gewünschte DNA-Sequenz Sequenzabschnitte von mindestens zweien der mindestens zwei verschiedenen Vektoren enthält, wobei die Sequenzabschnitte für die Expression der gewünschten Funktion von der gewünschten DNA-Sequenz nötig sind, und DOLLAR A (b) Selektieren von Pflanzen oder Pflanzenzellen, die die gewünschte Funktion exprimieren.

Description

  • Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, die auf einem Chromosom transformiert sind. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Screening von Nucleotid-Sequenzen nach einem gewünschten Phänotyp in Pflanzen. Die Erfindung betrifft ebenso transgene Pflanzen und Bibliotheken von Pflanzen oder Pflanzensamen, die gemäß dem Verfahren der Erfindung erhalten wurden oder erhältlich sind. Ferner betrifft die Erfindung Vektoren für diese Verfahren und Pflanzen oder Pflanzenzellen, die mit ihnen transformiert sind.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Gegenwärtig verwendete Methoden zur stabilen Transformation von Pflanzen machen üblicherweise Gebrauch von der direkten (Mikroprojektil-Bombardierung, Elektroporation oder PEG-vermittelte Behandlung von Protoplasten für eine Übersicht siehe: Gelvin, S.B., 1998, Curr. Opin. Biotechnol., 9, 227–232; Hansen & Wright, 1999, Trends Plant Sci., 4, 226–231) oder der Agrobakterium-vermittelten Verabreichung von gewünschten DNA-Fragmenten in Pflanzenzellen. Manipulationen mit den DNA-Vektoren in planta sind auf die Auflösung komplexer Integrationsmuster ( US 6 114 600 ; Srivastava & Ow, 2001, Plant Mol Biol., 46, 561–566; Srivastava et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 11117–11121) oder auf das Entfernen von Hilfs-DNA-Sequenzen aus Vektoren, die stabil in chromosomale DNA integriert sind, beschränkt. Bei der Agrobakterium-vermittelten Integration von T-DNA-Regionen in Pflanzenzellen werden gewünschte DNA-Fragmente verwendet, die mit linken (LB) und rechten (RB) Grenzsequenzen (border sequences) für den T-DNA-Transfer und die Integration in die chromosomale DNA des Wirts flankiert sind ( US 4 940 838 ; US 5 464 763 ; EP 0 224 287 ; US 6 051 757 ; US 5 731 179 ; WO 94/00977; EP 0 672 752 ). Meistens wird eine spezifische T-DNA-Region in chromosomale DNA integriert, seltener werden zwei oder mehr verschiedene T-DNA-Regionen kointegriert ( US 4 658 082 ). Letzteres wird für die Segregation verschiedener T-DNA in Nachkommen für verschiedene Zwecke verwendet. Zum Beispiel beschreiben Komari und Kollegen ( US 5 731 179 ) eine Methode, Pflanzenzellen mit zwei T-DNAs simultan zu transformieren, wobei eine T-DNA einen in Pflanzen funktionsfähigen Selektionsmarker trägt, während die andere T-DNA ein gewünschtes DNA-Fragment enthält, das in Pflanzenzellen eingeführt werden soll.
  • Im allgemeinen werden die DNA-Regionen, die stabil in Pflanzenzellen integriert werden sollen, in vitro nach Standardmethoden der Molekularbiologie modifiziert (Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989, Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor, NY: CSH Laboratory Press). Daneben wird die in vivo-Modifizierung in Bakterienzellen verwendet, z.B. um den Binärvektor mit Hilfe der homologen Rekombination zusammenzufügen ( US 5 731 179 ). Manipulationen mit T-DNA in planta sind auf in ein Chromosom präintegrierte T-DNA-Regionen beschränkt. Diese Manipulationen sind auf das Entfernen bestimmter Sequenzen aus der T-DNA beschränkt, wie z.B. solcher, die für Selektionsmarker kodieren, darunter Gene, die morphologische Abnormalitäten induzieren (morphological abnormality induction genes) und auf die Integration eines gewünschten DNA-Fragments. Das Entfernen unerwünschter DNA-Fragmente aus T-DNA-Regionen geschieht entweder mit Hilfe der ortsspezifischen Rekombination (WO 97/42334; Endo et al., 2002, Plant J., 30, 115–122) oder mit Hilfe der Transposition ( US 5 792 924 ).
  • Die ortsspezifische Rekombination wird dazu verwendet, Hilfssequenzen aus T-DNA-Regionen zu entfernen. Obwohl die ortsspezifische Rekombination/Integrase-vermittelte DNA-Exzision effizienter als die Integration ist, ist die Selektion auf Exzisionsereignisse eine Notwendigkeit, was zu einem weiteren Schritt Gewebekultur oder Screening nach Nachkommen für gewünschte Rekombinationsereignisse führt. Zusammengenommen sind alle Verfahren zur Manipulation mit stabil in pflanzliche Chromosomen integrierten T-DNAs zeitaufwendig, unflexibel und im allgemeinen auf das Herausschneiden (mit geringerer Effizienz auf die Integration) von gewünschten DNA-Fragmenten beschränkt. Weiterhin sind diese Verfahren üblicherweise bezüglich der kombinatorischen Vielfalt sehr beschränkt, da sie auf einfache Manipulationen mit einer beschränkten Anzahl bekannter Gene und Regulationselemente beschränkt sind.
  • Offringa et al. (EMBO J. (1990), 9, 3077–3084) haben ein extrachromosomales homologes Rekombinationsereignis zwischen zwei mit Agrobakterium eingebrachten T-DNAs in Planzenzellen gefolgt von der Integration des Rekombinationsprodukts in nukleäre DNA beschrieben. Die Effizienz der extrachromosomalen homologen Rekombination zwischen den zusammen verabreichten (co-delivered) T-DNAs in den Pflanzenzellen war jedoch zu gering, um für das Vektor-Engineering in vivo von praktischem Nutzen zu sein, und wurde daher als Kontrollexperiment in wissenschaftlichen Untersuchungen des Mechanismus der homologen Rekombination in Pflanzen benutzt (Offringa et al., 1990, EMBO J., 9, 3077–3084; Tinland et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 8000–8004; Puchta et al., 1996, Proc. Natl. Acad.
  • Sci. USA, 93, 5055–5060). Die Häufigkeit der homologen Rekombination gefolgt von der Integration in chromosomale DNA betrug ungefähr 1 % der Häufigkeit der Kotransformation mit zwei T-DNAs in Pflanzen (Offringa et al., 1990, EMBO J., 9, 3077–3084; Tinland et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 8000–8004; Puchta et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 5055–5060). Wegen der geringen Gesamteffizienz dieses Verfahrens wurden keine praktischen Anwendungen dieser Methode entwickelt.
  • Die Häufigkeit der gezielten Integration (targeted integration) transient verabreichter T-DNA in eine vorbereitete IoxP-Stelle in Pflanzen ist auch sehr gering. Zum Beispiel haben Vergunst und Kollegen (1998, Nucl. Acids Res., 26, 2729–2734) gezeigt, dass die Häufigkeit der Crevermittelten ortsspezifischen Integration eines mit Agrobakterium eingeführten T-DNA-Fragments in eine genomische T-DNA-Region mit einer IoxP-Stelle im Bereich zwischen 1,2 bis 2,3% der Häufigkeit von zufälligen Integrationsereignissen liegt. Wegen dieser geringen Effizienz benötigen diese Integrationsprozesse eine zusätzliche Selektionsrunde und die Verwendung der Zellkultur, um Zellen zu gewinnen, die die Rekombinationsereignisse tragen. Im Gegensatz dazu ist die Häufigkeit der Umordnung von chromosomaler doppelsträngiger DNA mit Hilfe von ortsspezifische Rekombinasen deutlich höher und tritt in 29 bis 100% aller pflanzlichen Keimzellen auf (Zuo et al., 2001, Nature Biotechnol., 19, 157–161; Luo et al., Plant J., 23, 423–430). Dies ist nicht überraschend, da ortsspezifische Integrasen/Rekombinasen ein doppelsträngiges DNA-Substrat zur Erkennung von Rekombinationsstellen und zur Durchführung der ortsspezifischen Rekombinationsreaktion benötigen (Panigrahi et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 5927–5935; Martin et al., 2002, J. Mol. Biol., 19, 107–127; Thorpe et al., 2000, Mol. Microbiol., 38, 232–241).
  • Alle oben erwähnten Ergebnisse legen nahe, dass transient in Pflanzenzellen verabreichte T-DNA ein schlechtes Substrat für ortsspezifische Rekombinasen ist.
  • In einer früheren Erfindung haben wird die oben beschriebene geringe Effizienz durch die Assemblierung RNA-viraler Amplikons durch ortsspezifische Rekombination bewältigt (WO 02/088369). Die assemblierten viralen Amplikons waren zur starken autonomen Amplifikation, zur Wanderung von Zelle zu Zelle und zur systemischen Wanderung befähigt und konnten daher die seltenen Rekombinationsereignisse stark amplifizieren. Die viralen Amplikons wurden in planta aus zwei oder mehreren Vektoren durch Rekombinase-vermittelte ortsspezifische Rekombination zusammengefügt und enthielten ein transient zu exprimierendes gewünschtes Gen mit dem Ziel, die stärkstmögliche Expression des gewünschten Gens in einer mit den Vektoren infizierten Pflanze zu erreichen. Jedoch war die Expression des gewünschten Gens transient; die stabile Transformation von pflanzlichen Chromosomen für eine stabile und vererbbare Expression eines gewünschten Gens war nicht beabsichtigt.
  • Für viele Anwendungen kann das in WO 02/088369 beschriebene Verfahren jedoch nicht angewandt werden wegen der folgenden Probleme: die Amplifizierung und die Ausbreitung des vitalen Amplikons führt zu vitalen Krankheitssymptomen, die die Gesundheit der Pflanzen schädigen. Daher können diese Methoden zur Bestimmung von Genfunktionen (funktionelle Genomanalyse) nicht verwendet werden, da Krankheitssymptome häufig die Funktion des zu bestimmenden Gens verdecken oder die Expression der zu bestimmenden Funktion verhindern. Ferner gibt die Expression eines gewünschten Gens von einem Amplikon unnatürlich hohe Expressionslevels, was zu Phänotypen führt, die sich von dem natürlichen Phänotyp des Gens unterscheiden, möglicherweise infolge unnatürlicher Wechselwirkungen mit Funktionen nativer Gene der Pflanze.
  • Es ist daher eine Aufgabe dieser Erfindung, ein effizientes, schnelles und vielseitiges Verfahren zur Transformation einer Pflanze oder von Pflanzenzellen auf einem Chromosom, insbesondere einem nukleären Chromosom, bereitzustellen, wodurch genetisch stabile transgene Pflanzen oder Pflanzenzellen hergestellt werden können.
  • Es ist eine andere Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen bereitzustellen, die auf einem Chromosom transformiert sind, wobei die in das Chromosom zu integrierenden DNA-Sequenzen in planta manipuliert werden können (z.B., um die Klonierarbeit zu vermindern).
  • Es ist eine weitere Aufgabe, ein Verfahren zur stabilen Transformation von Pflanzen oder Pflanzenzellen auf einem Chromosom mit einer gewünschten DNA-Sequenz bereitzustellen, die für Bakterien, die zur Klonierung der gewünschten DNA-Sequenz verwendet werden, toxisch ist.
  • Es ist eine andere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur genetischen Transformation pflanzlicher nukleärer DNA bereitzustellen, das das Screening nach einer optimalen Expressionseinheit eines gewünschten Gens erlaubt.
  • Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zur stabilen Transformation von Pflanzen oder Pflanzenzellen auf einem Chromosom bereitzustellen, wobei die Vektoren modular verwendet werden können, um die Klonierarbeit und die Gesamtgröße der Vektormoleküle zu vermindern.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur stabilen Transformation von Pflanzen oder Pflanzenzellen auf einem Chromosom bereitzustellen, wobei das Verfahren das Screening von DNA-Bibliotheken nach gewünschten Funktionen in Pflanzen ermöglicht. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein in planta-Verfahren zum Shuffling von genetischen Elementen/Genfragmenten bereitzustellen, wobei das Verfahren mit einem Verfahren zur stabilen Transformation von Pflanzen oder Pflanzenzellen mit einer gewünschten DNA-Sequenz, die bei dem Shuffling entsteht, verknüpft ist.
  • ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die obigen Aufgaben werden gelöst von Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen oder Pflanzenzellen, die auf einem Chromosom stabil mit einer gewünschten DNA-Sequenz transformiert sind und eine gewünschte Funktion von der gewünschten DNA-Sequenz exprimieren können, wobei das Verfahren umfasst:
    • (a) Behandeln von Pflanzenzellen oder Pflanzen mit mindestens zwei verschiedenen Vektoren, wobei (i) die mindestens zwei verschiedenen Vektoren so eingerichtet sind, dass sie miteinander mittels ortsspezifischer Rekombination in den Pflanzenzellen rekombinieren, um ein nichtreplizierendes Rekombinationsprodukt zu ergeben, das die gewünschte DNA-Sequenz enthält, (ii) die mindestens zwei verschiedenen Vektoren so eingerichtet sind, dass sie die gewünschte DNA-Sequenz in das Chromosom integrieren können, (iii) die gewünschte DNA-Sequenz Sequenzabschnitte von mindestens zweien der mindestens zwei verschiedenen Vektoren enthält, wobei die Sequenzabschnitte für die Expression der gewünschten Funktion von der gewünschten DNA-Sequenz nötig sind, und
    • (b) Selektieren von Pflanzen oder Pflanzenzellen, die die gewünschte Funktion exprimieren.
  • Die Erfindung stellt ferner transgene Pflanzen oder Teile derselben (wie Samen) bereit, die nach dem Verfahren der Erfindung hergestellt werden oder herstellbar sind. Weiterhin werden Bibliotheken von Pflanzen oder Pflanzensamen bereitgestellt, die nach diesem Verfahren erhalten werden oder erhältlich sind. Das erfindungsgemäße Verfahren weist viele wichtige Anwendungen auf, darunter die Verwendung beim Screening von DNA-Bibliotheken, bei der funktionelle Genanalyse und der funktionelle Genomanalyse, ferner die gerichtete Evolution (directed evolution) und das Gene-Shuffling. Ferner können komplexe und/oder große gewünschte DNA-Sequenzen, die in ein pflanzliches Chromosom eingeführt werden sollen, aus kleineren Vorläufern in planta zusammengesetzt werden (siehe 12). Das erfindungsgemäße Verfahren kann jedoch auch dazu verwendet werden, ein zu exprimierendes Gen in ein Chromosom einer Pflanzenzelle oder einer Pflanze einzuführen. In einer wichtigen Ausführungsform sind alle Gene und/oder kodierende Sequenzen und/oder exprimierbare Sequenzen der gewünschten DNA-Sequenz, die in ein Chromosom integriert wird, pflanzlichen Ursprungs, wodurch keine unnatürlichen Sequenzen aus den transgenen Pflanzen der Erfindung auf andere Organismen ausgekreuzt werden können.
  • Die Erfinder dieser Erfindung haben überraschenderweise gefunden, dass transient verabreichte T-DNA effizient für das in planfa-Engineering einer gewünschten Sequenz für die Integration in ein Chromosom verwendet werden kann. Vorzugsweise ist die Effizienz, mit der stabile Integrationsereignisse erhalten werden, vergleichbar zu derjenigen der üblichen Agrobakterium-vermittelten Transformation. Die Ursache für diese unerwartet hohe Effizienz ist noch nicht bekannt. Das Gesamtverfahren der Erfindung ist von ausreichend hoher Effizienz für Routineanwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Zum Beispiel kann das Screening von DNA-Bibliotheken nach einem nützlichen Merkmal erstmals in planta durchgeführt werden mit einer geringen Gefahr, Elemente der Bibliothek zu verpassen, die mit den beim Klonieren nach herkömmlichen Verfahren verwendeten prokaryotischen Systemen nicht kompatibel sind. Dies erlaubt eine Kombination der Verfahren zum Vektor-Engineering (z.B. für die funktionelle Genomanalyse oder für die gerichtete Evolution) mit der Herstellung stabiler Transformanten, was den Screening-Prozess nach gewünschten Kombinationen von zu testenden genetischen Elementen beträchtlich erhöht.
  • Das Verfahren der Erfindung erlaubt die Herstellung von transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen, die auf einem Chromosom stabil mit einer gewünschten DNA-Sequenz transformiert sind, wobei die gewünschte DNA-Sequenz sich von mindestens zwei verschiedenen Vektoren herleitet. Stabile Transformation eines Chromosoms bedeutet, dass die gewünschte DNA-Sequenz so in das Chromosom integriert wird, dass die gewünschte DNA-Sequenz zusammen mit dem Chromosom repliziert wird. Vorzugsweise kann die gewünschte DNA-Sequenz bei der Zellteilung und bei der Reproduktion des Organismus über mehrere Generationen vererbt werden.
  • In Schritt (a) des Verfahrens dieser Erfindung wird eine Pflanze oder Pflanzenzellen mit mindestens zwei verschiedenen Vektoren behandelt (oder ausgestattet), wobei die mindestens zwei verschiedenen Vektoren der Definition unten entsprechen. "Verschiedene Vektoren" bedeutet vorzugsweise "verschiedene Typen von Vektoren". Pflanzenzellen können mit den mindestens zwei verschiedenen Vektoren in Gewebekultur, insbesondere in Gewebekultur von Protoplasten von Pflanzenzellen, behandelt werden. Ferner können Pflanzenteile (explants) (z.B. Wurzelteile, Blattscheiben) einer Pflanze mit den mindestens zwei verschiedenen Vektoren behandelt werden. Ferner können gesamte Pflanzen oder Teile von gesamten Pflanzen mit den Vektoren behandelt werden.
  • Das Behandeln von Schritt (a) kann durch eine direkte Transformationsmethode durchgeführt werden (z.B. Partikelbombardierung, Elektroporation, PEG-vermittelte Transformation von Protoplasten) oder durch Agrobakterium-vermittelte Verabreichung von T-DNA, wobei die Agrobakterium-vermittelte Verabreichung von T-DNA wegen ihrer überlegenen Effizienz im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt ist. Die mindestens zwei verschiedenen Vektoren können der Pflanze oder den Pflanzenzellen nacheinander verabreicht werden. Jedoch ist das Verabreichen mit den mindestens zwei verschiedenen Vektoren nicht durch einen Reproduktionszyklus oder einen Regenerationszyklus einer mit einem Vektor transformierten Pflanze vor der Transformation mit einem anderen Vektor der mindestens zwei verschiedenen Vektoren getrennt. Vorzugsweise wird die Pflanze oder die Pflanzenzellen mit den mindestens zwei verschiedenen Vektoren in einem Schritt behandelt. Im Fall der direkten Vektorverabreichung bedeutet dies, dass in Schritt (a) vorzugsweise Mischungen der Vektoren verwendet werden. Im Fall der Agrobakterium-vermittelten Verabreichung von T-DNA werden vorzugsweise Mischungen von Agrobakterien-Stämmen (oder Zellen) verwendet, wobei jeder Stamm oder jede Zelle ein unterschiedliches Ti-Plasmid enthält, wobei jedes Ti-Plasmid einen verschiedenen Vektor der mindestens zwei verschiedenen Vektoren enthält. Am bevorzugtesten enthält ein Agrobakterium-Stamm einen Typ eines Ti-Plasmids mit einem bestimmten Vektor, jedoch keine Ti-Plasmide mit einem verschiedenen Vektor, während ein anderer Agrobakterium-Stamm einen anderen Typ Ti-Plasmid mit einem anderen Typ Vektor enthält, jedoch keine Ti-Plasmide mit einem anderen Vektor. Das bedeutet, dass keine Agrobakteriumzelle mehr als einen Typ der mindestens zwei verschiedenen Vektoren bereitstellt. Das Behandeln (Bereitstellen) der Pflanzenzellen oder Pflanzen in einem Verfahrensschritt mit den Vektoren, insbesondere gleichzeitig, ist arbeitseffizient und ergibt eine gute Gesamteffizienz des erfindungsgemäßen Verfahrens. Nachdem die Pflanze oder die Pflanzenzellen mit den mindestens zwei verschiedenen Vektoren behandelt oder versorgt wurden, wird innerhalb von Pflanzenzellen ein Rekombinationsprodukt gebildet, das die gewünschte DNA-Sequenz enthält, durch ortsspezifische Rekombination zwischen mindestens zweien der mindestens zwei verschiedenen Vektoren. Zu diesem Zweck ist jeder der mindestens zwei verschiedenen Vektoren so eingerichtet, dass er mit mindestens einem anderen der mindestens zwei verschiedenen Vektoren rekombiniert. Wenn drei oder mehr verschiedene Typen von Vektoren verwendet werden, kann jeder so eingerichtet sein, dass er mit jedem anderen Vektor rekombiniert. Für einige Anwendungen kann es jedoch ausreichend sein, wenn jeder Vektor der mindestens zwei verschiedenen Vektoren so eingerichtet ist, dass er mit einem anderen Vektor der mindestens zwei verschiedenen Vektoren rekombinert.
  • Das Eingerichtetsein für die Rekombination kann so erreicht werden, dass in die Vektoren ortsspezifische Rekombinationsstellen eingebaut werden, um die ortsspezifischen Rekombinationen zu ermöglichen. Vorzugsweise ist die ortsspezifische Rekombination so eingerichtet, dass die Reversion (d.h. die Rückreaktion) der ortsspezifischen Rekombination mit geringer Wahrscheinlichkeit geschieht. Dies kann z.B. erreicht werden, indem das Enzym für die Rekombination transient bereitgestellt wird (z.B. indem das Rekombinasegen durch die Rekombination nicht exprimierbar gemacht wird). Noch bevorzugter wird ein ortsspezifisches Rekombinase/Rekombinationsstellen-System gewählt, das irreversible Rekombinationen durchführt, was erreicht werden kann, indem eine Integrase zusammen mit den entsprechenden Rekombinationsstellen verwendet wird. Integrasen verwenden zwei verschiedene Rekombinationsstellen (wie z.B. AttP und AttB im Fall der phi C31-Integrase), was die gerichtete und irreversible Rekombination ermöglicht.
  • Es sollte ein Gen einer ortsspezifischen Rekombinase oder Integrase, die mit den gewählten ortsspezifischen Rekombinationsstellen kompatibel ist, so bereitgestellt werden (z.B. mit einem der mindestens zwei verschiedenen Vektoren), dass die Rekombinase oder Integrase exprimiert werden kann. Vorzugsweise wird das Gen der Rekombinase oder Integrase auf einem der mindestens zwei verschiedenen Vektoren so bereitgestellt, dass (i) es vor dem ortsspezifischen Rekombinationsereignis exprimiert werden kann und dass (ii) seine Expression nach dem Rekombinationsereignis blockiert ist. Alternativ können die Pflanzenzelle oder die Pflanzen, die in Schritt (a) mit den mindestens zwei verschiedenen Vektoren behandelt werden, bereits ein Gen, das für eine Rekombinase oder Integrase kodiert, enthalten und exprimieren.
  • Durch die ortsspezifische Rekombination zwischen den mindestens zwei verschiedenen Vektoren können ein oder mehrere verschiedene Rekombinationsprodukte gebildet werden, wobei mindestens ein Rekombinationsprodukt die gewünschte DNA-Sequenz enthält. Ein die gewünschte DNA-Sequenz enthaltendes Rekombinationsprodukt ist nicht replizierend, um Krankheitssymptome infolge starker Replikation des Rekombinationsproduktes zu vermeiden. Vorzugsweise sind alle Rekombinationsprodukte nicht replizierend. Nicht replizierend bedeutet, dass das Rekombinationsprodukt keine virale Nucleinsäure ist, die sich autonom replizieren kann, da dies üblicherweise Krankheitssymptome hervorruft, die mit vielen Anwendungen, wie Funktionsbestimmungen von Genen, nicht kompatibel sind.
  • Die gewünschte DNA-Sequenz enthält Sequenzabschnitte aus mindestens zweien der mindestens zwei verschiedenen Vektoren, wobei die Sequenzabschnitte für die Expression der gewünschten Funktion von der gewünschten DNA-Sequenz nötig sind. Die gewünschte DNA-Sequenz kann drei oder mehr Sequenzabschnitte aus drei oder mehr verschiedenen Vektoren enthalten. Jedoch enthält die gewünschte DNA-Sequenz vorzugsweise zwei Sequenzabschnitte von zwei Vektoren der mindestens zwei verschiedenen Vektoren. Die Rekombination zwischen den mindestens zwei verschiedenen Vektoren kann zur Bildung von mehr als einem Rekombinationsprodukt führen. Mindestens ein Rekombinationsprodukt enthält die gewünschte DNA-Sequenz. Weitere Rekombinationsprodukte können gebildet werden, die die gewünschte DNA-Sequenz nicht enthalten.
  • Die gewünschte DNA-Sequenz enthält Sequenzabschnitte von mindestens zweien der mindestens zwei verschiedenen Vektoren. Mindestens zwei der Sequenzabschnitte sind für die Expression der gewünschten Funktion von der gewünschten DNA-Sequenz nötig. Daher kann die gewünschte Funktion nicht exprimiert werden, wenn die Pflanzenzellen oder die Pflanze mit nur einem Vektor behandelt wird/werden. Die gewünschte DNA-Sequenz kann natürlich auch Sequenzen enthalten, die von den mindestens zwei verschiedenen Vektoren herrühren und die nicht für die Expression der gewünschten Funktion nötig sind.
  • In einer grundlegenden Ausführungsform wird die Pflanze oder werden die Pflanzenzellen mit zwei verschiedenen Vektoren behandelt, und ein Rekombinationsprodukt, das die gewünschte DNA-Sequenz enthält, wird aus den zwei verschiedenen Vektoren zusammengefügt. Die gewünschte DNA-Sequenz wird dann die zwei Sequenzabschnitte dieser zwei verschiedenen Vektoren enthalten. In einer komplexeren Ausführungsform wird die Pflanze oder werden die Pflanzenzellen mit drei oder mehr verschiedenen Vektoren behandelt, was das Zusammenfügen von zweien oder mehr Rekombinationsprodukten erlaubt, wobei jedes eine andere gewünschte DNA-Sequenz enthält. Jede der zwei oder mehr verschiedenen gewünschten DNA-Sequenzen wird vorzugsweise aus zwei verschiedenen Vektoren zusammengefügt. Dies erlaubt die Herstellung von zwei oder mehr verschiedenen transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen, wobei jede auf einem Chromosom mit einer verschiedenen gewünschten DNA-Sequenz transformiert ist. Als Beispiel kann die Pflanze oder die Pflanzenzellen mit drei verschiedenen (Typen von) Vektoren behandelt werden, die Vektor A, Vektor B und Vektor C genannt werden. Diese Vektoren enthalten die Sequenzabschnitte a, b bzw. c. Ortsspezifische Rekombination zwischen Vektor A und Vektor B erlaubt das Zusammenfügen der gewünschten DNA-Sequenz ab. Die ortsspezifische Rekombination von Vektor A und Vektor C erlaubt das Zusammenfügen der gewünschten DNA-Sequenz ac. Daher können nach der Segregation und/oder der Selektion zwei verschiedene transgene Pflanzen erhalten werden, von denen eine auf einem Chromosom mit einer gewünschten DNA-Sequenz ab und die andere auf einem Chromosom mit der gewünschten DNA-Sequenz ac transformiert ist. Je nach der Anordnung der Rekombinationsstellen auf diesen drei Vektoren können weitere gewünschte DNA-Sequenzen zusammengefügt werden (z.B. die gewünschten DNA-Sequenzen bc, ba, ca oder cb), und weitere transgene Pflanzen oder Pflanzenteile können dementsprechend hergestellt werden, wobei jede auf einem Chromosom mit einer dieser gewünschten DNA-Sequenzen transformiert ist.
  • Indem Pflanzenzellen oder Pflanzen mit vielen verschiedenen Vektoren behandelt werden, kann eine große Anzahl von verschiedenen gewünschten DNA-Sequenzen (z.B. Dutzende, Hunderte oder noch mehr verschiedene gewünschte DNA-Sequenzen) zusammengefügt werden und in ein Chromosom eingefügt werden, um viele verschiedene transgene Pflanzen oder Pflanzenzellen herzustellen. Auf diese Weise können Pflanzen oder Pflanzenzellen DNA-Bibliotheken verabreicht werden. Die so hergestellten transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen können dann nach einem nützlichen Merkmal oder einem gewünschten Phänotyp gescreent werden. In diesen Screeningmethoden kann das volle Potential der vorliegenden Erfindung ausgenutzt werden.
  • Wenn drei oder mehr verschiedene Typen von Vektoren in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, kann jeder Vektor so eingerichtet sein, dass er mit allen anderen der mindestens zwei verschiedenen Vektoren rekombiniert. Im obigen Beispiel mit den Vektoren A, B und C können dann bis zu sechs verschiedene gewünschte DNA-Sequenzen gebildet werden (ab, ac, bc, ba, ca und cb). In dieser allgemeinen Ausführungsform kann die größte kombinatorische Vielfalt von gewünschten DNA-Sequenzen (und daher transgenen Pflanzen) gebildet werden. In einer spezielleren Ausführungsform kann ein Primärvektor in einen Mischung mit einer Menge von Sekundärvektoren verwendet werden. Dann können verschiedene gewünschte DNA-Sequenzen gebildet werden, wobei jede einen Sequenzabschnitt aus dem Primärvektor und eine Sequenzabschnitt aus einem Vektor der Menge von Sekundärvektoren enthält. Der Primärvektor kann z.B. Sequenzen liefern, die Sequenzabschnitte der Sekundärvektoren nach dem Zusammenfügen einer gewünschten DNA-Sequenz, die einen Sequenzabschnitt aus dem Primärvektor und einen Sequenzabschnitt aus einem Vektor der Menge von Sekundärvektoren enthält, exprimierbar gemacht werden.
  • Zur Herstellung von transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen, die auf einem Chromosom mit einer gewünschten DNA-Sequenz transformiert sind, sind die mindestens zwei verschiedenen Vektoren so eingerichtet, dass die gewünschte DNA-Sequenz in das Chromosom integriert werden kann. Das Chromosom kann ein Kernchromosom, ein plastidäres Chromosom oder ein mitochondriales Chromosom sein. Nukleäre und plastidäre Chromosomen sind bevorzugt, und ein nukleäres Chromosom ist am bevorzugtesten. Das Eingerichtetsein für die Integration hängt von dem Typ des Chromosoms ab. Für die Integration der gewünschten DNA-Sequenz in das plastidäre Chromosom, d.h. das Plastom, kann z.B. die homologe Rekombination verwendet werden. In diesem Fall sind die Vektoren und/oder die entsprechenden Sequenzabschnitte so eingerichtet, dass das Rekombinationsprodukt, das die gewünschte DNA-Sequenz enthält, auch Sequenzen enthält, die zu Plastom-Sequenzen homolog sind, um die Integration der gewünschten DNA- Sequenz in das Plastom zu ermöglichen. Die zu den Plastom-Sequenzen homologen Sequenzen werden vorzugsweise so ausgewählt, dass die Integration an einer gewünschten Stelle des Plastoms stattfindet. Methoden zur Plastom-Transformation sind für verschiedene Pflanzenarten gut etabliert, siehe z.B. Svab et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 8526–8530; Koop et al., 1996, Planta, 199, 193–201; Ruf et al., Nat. Biotechnol., 2001, 19(9): 870–875; für eine Übersicht siehe: Maliga, P., 2002, Curr. Opin. Biol., 5, 164–172; WO 02/057466.
  • Die Integration einer gewünschten DNA-Sequenz in ein nukleäres Chromosom kann z.B. durch ortsgerichtete (site-targeted) Transformation in eine vorbereitete (pre-engineered) Integrationsstelle mittels der ortsspezifischen Rekombination erreicht werden. Vorzugsweise wird die nukleäre Integration jedoch mit Hilfe von linken und rechten agrobakteriellen T-DNA-Grenzsequenzen (left and right border sequences) in der gewünschten DNA-Sequenz erreicht (siehe unten und Beispiele). Einer oder alle der mindestens zwei verschiedenen Vektoren können ein funktionelles Cytokinin-Autonomie-Gen (cytokinin autonomy gene) enthalten, wobei die gewünschte DNA-Sequenz vorzugsweise frei von einem funktionellen Cytokinin-Autonomie-Gen ist.
  • Eine transgene Pflanze oder Pflanzenzellen, die auf einem Chromosom mit einer gewünschten DNA-Sequenz transformiert ist/sind, kann/können eine gewünschte Funktion von der gewünschten DNA-Sequenz exprimieren. Hergestellte transgene Pflanzen oder Pflanzenzellen, die eine gewünschte Funktion nicht exprimieren können oder die eine Funktion exprimieren, die nicht erwünscht ist, können in Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens eliminiert werden. Was die gewünschte Funktion angeht, ist das Verfahren der Erfindung nicht begrenzt. Typischerweise ist die gewünschte Funktion in einer kodierenden Sequenz in der gewünschten DNA-Sequenz kodiert. Die gewünschte Funktion kann eine Funktion von DNA, RNA (insbesondere Messenger-RNA) oder eines Proteins sein, das in der gewünschten DNA-Sequenz kodiert ist. Vorzugsweise ist die gewünschte Funktion eine Funktion von RNA oder einem Protein, die in der gewünschten DNA-Sequenz kodiert sind, und die Expression der Funktion setzt die Transkription einer kodierenden Sequenz in der gewünschten DNA-Sequenz voraus. Wenn die Funktion die Funktion eines in der gewünschten DNA-Sequenz kodierten Proteins ist, setzt die Expression der Funktion die Transkription und die Translation einer kodierenden Sequenz der gewünschten DNA-Sequenz voraus. Für die Transkription und, wahlweise, die Translation enthält die gewünschte DNA-Sequenz die notwendigen Kontrollelemente, die hierfür nötig sind, wie einen Promotor, eine 5'-nicht-translatierte Region, eine 3'-nicht-translatierte Region, ein Polyadenylierungssignal usw. Die gewünschte Funktion kann z.B. eine Antibiotikum-Resistenz sein, die für die Selektion von Schritt (b) verwendet werden kann. Mehr als eine gewünschte Funktion kann von der gewünschten DNA-Sequenz exprimiert werden. Die gewünschte Funktion steht üblicherweise im Zusammenhang mit dem Grund für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Typischerweise ist ein Selektionsmarker, der in Schritt (b) der Erfindung verwendet wird, unter den gewünschten Funktionen, die von der gewünschten DNA-Sequenz exprimiert werden können.
  • Mindestens zwei Sequenzabschnitte von mindestens zwei verschiedenen Vektoren sind für die Expression der gewünschten Funktion von der gewünschten DNA-Sequenz nötig. Die gewünschte Funktion wird durch das Zusammenfügen der gewünschten DNA-Sequenz durch ortsspezifische Rekombination zwischen mindestens zweien der mindestens zwei verschiedenen Vektoren exprimierbar gemacht. Es gibt mehrere Möglichkeiten, wie die gewünschte Funktion gemäß der Erfindung exprimierbar gemacht werden kann: Das Zusammenfügen (assembling) der gewünschten DNA-Sequenz kann z.B. eine kodierende Sequenz, die für die gewünschte Funktion kodiert, unter die Kontrolle eines Regulatorelements bringen (z.B. eines Promotors), das für die Expression der kodierenden Sequenz nötig ist. So kann eine funktionelle Expressionseinheit durch das Zusammenfügen in der gewünschten DNA-Sequenz gebildet werden. Diese Möglichkeit ist besonders bevorzugt, wenn das erfindungsgemäße Verfahren für das Screening einer großen Anzahl von DNA-Sequenzen, wie eine Sammlung von DNA-Sequenzen (z.B. eine Bibliothek), nach einem nützlichen Merkmal verwendet wird. Die Sammlung von DNA-Sequenzen kann z.B. aus unterschiedlich mutierten Formen einer ausgewählten kodierenden Sequenz eines Proteins bestehen, wobei die unterschiedlich mutierten Formen z.B. durch zufälliges Einführen von Mutationen (z.B. durch error-prone PCR oder gene shuffling) geschaffen werden können. Dann kann ein mutiertes Protein, das von der ausgewählten kodierenden Sequenz kodiert wird und gewünschte Eigenschaften aufweist, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert werden. In einem solchen Screening-Verfahren kann ein Primärvektor die regulatorischen Sequenzen, die für die Expression einer Testsequenz aus der Bibliothek nötig sind, bereitstellen, und eine Menge von Sekundärvektoren enthält jeweils eine verschiedene Testsequenz. So kann eine Menge transgener Pflanzenzellen oder Pflanzen hergestellt werden, wobei jede eine verschiedene gewünschte DNA-Sequenz enthält. Diese verschiedenen Pflanzen oder Pflanzenzellen können nach einer nützlichen gewünschten Funktion (ein gewünschtes Merkmal), die von einer der Testsequenzen kodiert wird, gescreent werden.
  • Alternativ kann das Shuffling-Verfahren in planta während dem durch ortsspezifische Rekombination vermittelten Zusammenfügen der gewünschten DNA-Sequenz durchgeführt werden. Wie in 1B gezeigt, können die Vektorfamilien An und Bn Bibliotheken von verschiedenen Varianten von strukturellen/funktionellen Domänen eines gewünschten Proteins sein. Das Verbinden der Domänen durch ortsspezifische Rekombination kann die kombinatorische Vielfalt des in planta generierten gewünschten Proteins bewirken. Die kodierenden Sequenzen der diversifizierten gewünschten Proteine werden stabil in pflanzliche chromosomale DNA integriert. 11 zeigt eine schematische Darstellung eines Vektors, der für ein solches Shuffling geeignet ist.
  • Eine andere wichtige Ausführungsform erlaubt das Screening nach optimalen regulatorischen Sequenzen (z.B. nach einem Promotor), um eine gewählte Kodiersequenz je nach Bedarf optimal zu exprimieren. In diesem Fall kann ein Primärvektor die Kodiersequenz bereitstellen, und eine Menge von verschiedenen regulatorischen Sequenzen werden mit einer Menge von Sekundärvektoren bereitgestellt. Verschiedene transgene Pflanzen oder Pflanzenzellen, die verschiedene gewünschte DNA-Sequenzen enthalten, können gescreent werden, und ein geeignetes regulatorisches Element für die Expression der gewählten Kodiersequenz kann gefunden werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann das Zusammenfügen der gewünschten DNA-Sequenz Fragmente einer kodierenden Sequenz, die für eine zu exprimierende gewünschte Funktion kodiert, zusammenbringen. Vorzugsweise werden zwei Fragmente einer kodierenden Sequenz durch das Zusammenfügen zusammengebracht, wobei jedes Fragment mit einem verschiedenen Sequenzabschnitt eines anderen Vektors bereitgestellt wird. Vorzugsweise sind die Fragmente der Kodiersequenz nicht fähig, die gewünschte Funktion in Abwesenheit des anderen Fragments zu exprimieren. Das kann leicht dadurch erreicht werden, dass eine Kodiersequenz in zwei Fragmente so gespalten wird, dass jedes Fragment einen Abschnitt enthält, der für die Expression der gewünschten Funktion nötig ist. Die zwei Fragmente können dann in einen Vektor eingeführt werden, wobei zwei verschiedene Vektoren gemäß dieser Erfindung gebildet werden. Jeder Sequenzabschnitt kann einige der regulatorischen Sequenzen liefern, die für die Expression der Kodiersequenz von der zusammengefügten gewünschten DNA-Sequenz nötig sind.
  • Um die Kodiersequenz exprimierbar zu machen, kann die Expression der gewünschten Funktion von der gewünschten DNA-Sequenz Intron-vermitteltes cis-Spleißen umfassen. Beim Zusammenfügen kann gleichzeitig ein Intron zusammengefügt werden, insbesondere ein selbstspleißendes Intron, so dass das Spleißen eines RNA-Expressionsprodukts der Kodiersequenz zu einer mRNA führt, die beide Fragmente geeignet miteinander verbunden enthält, so dass ein gewünschtes Protein korrekt translatiert werden kann (siehe z.B. 10 und 11). Genauer gesagt kann ein
    • – erster Vektor der mindestens zwei verschiedenen Vektoren einen ersten Sequenzabschnitt enthalten, der enthält: einen ersten Teil einer Sequenz, die für die zu exprimierende Funktion kodiert, und stromabwärts davon einen 5'-Teil eines Introns, und
    • – zweiter Vektor der mindestens zwei verschiedenen Vektoren einen zweiten Sequenzabschnitt enthalten, der enthält: einen zweiten Teil einer Sequenz, die für die exprimierende Funktion kodiert, und stromaufwärts davon einen 3'-Teil eines Introns. Diese wichtige Ausführungsform ist auch in den Beispielen illustriert.
  • In Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden transgene Pflanzen oder Pflanzenzellen, die die gewünschte Funktion exprimieren, selektiert. Das Selektieren (oder Selektionieren) kann die Anwendung eines zu dem Selektionsmarker passenden Antibiotikums oder Inhibitors auf die Pflanzenzellen oder Pflanzen, die in Schritt (a) erhalten werden, umfassen. Das Selektieren kann auch das Screening nach transformierten Pflanzen oder Pflanzenzellen umfassen, in denen die Rekombination zwischen mindestens zweien der mindestens zwei verschiedenen Vektoren geschehen ist. Ferner umfasst das Selektieren vorzugsweise die Selektion nach der Integration der gewünschten DNA-Sequenz in das Chromosom. In Schritt (b) kann man auch verschieden transformierte Pflanzenzellen segregieren lassen, insbesondere Pflanzenzellen, die verschiedene (z.B. verschieden zusammengefügte) gewünschte DNA-Sequenzen enthalten. Das Selektieren und wahlweise das Segregieren kann die Verwendung eines Selektionsmarkergens auf der gewünschten DNA-Sequenz umfassen. Zu diesem Zweck können die mindestens zwei verschiedenen Vektoren so eingerichtet sein, dass die gewünschte DNA-Sequenz ein Selektionsmarkergen oder eine andere Sequenz enthält, die das Screening nach transformierten Pflanzen oder Pflanzenzellen, die die gewünschte DNA-Sequenz enthalten, erlaubt.
  • Schritt (b) kann durch viele verschiedene Ausführungsformen implementiert werden. Ein Sequenzabschnitt eines der mindestens zwei verschiedenen Vektoren kann einen Selektionsmarker enthalten, wodurch der Selektionsmarker bei dem Zusammenfügen in die gewünschte DNA-Sequenz integriert wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Selektionsmarker durch das Zusammenfügen der gewünschten DNA-Sequenz eingeschaltet, so dass er Pflanzenzellen, die die zusammengefügte gewünschte DNA-Sequenz enthalten, Antibiotikum-Resistenz verleiht; jedoch verleiht er Zellen, in denen das Zusammenfügen nicht aufgetreten ist, keine Antibiotikum-Resistenz. Am bevorzugtesten kann das Selektionsmarkergen in den Pflanzenzellen nicht von einem der mindestens zwei verschiedenen Vektoren transkribiert werden. Diese Ausführungsform kann so implementiert werden, dass der Selektionsmarker unter die Kontrolle eines genetischen Elementes gebracht wird, was die Transkription des Selektionsmarkergens nach dem Zusammenfügen der gewünschten DNA-Sequenz erlaubt, z.B., indem die kodierende Sequenz des Selektionsmarkers unter die Kontrolle eines Promotors gebracht wird. Vorteilhafterweise kann ein IRES-Element (internal ribosome entry site) die Translation des Selektionsmarkers kontrollieren (siehe 11). Referenzen, die die Verwendung von IRES-Elementen beschreiben, werden unten angegeben.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform werden die transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen nach der Abwesenheit eines oder aller der mindestens zwei verschiedenen Vektoren und/oder nach der Abwesenheit von Rekombinationsprodukten derselben gescreent, mit der Ausnahme von Rekombinationsprodukten, die die gewünschte DNA-Sequenz enthalten. Mit dieser Ausführungsform kann die Herstellung von transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen, die unnötige fremde DNA-Sequenzen aus den mindestens zwei verschiedenen Vektoren enthalten, vermieden werden. Solche unnötigen fremden DNA-Sequenzen können die Expression der gewünschten DNA-Sequenz stören oder die Bestimmung der gewünschten Funktion (z.B. bei der funktionellen Genomanalyse) kompromittieren. Diese Ausführungsform kann mit Hilfe eines negativen Selektionsmarkers (counter-selectable marker) ausgeführt werden. Wahlweise kann das Screening durch PCR-Analyse und Selektion geeigneter Transformanten unterstützt werden. Mindestens einer der mindestens zwei verschiedenen Vektoren kann einen negativen Selektionsmarker oder eine andere Sequenz enthalten, die ein effizientes Screening gegen transformierte Zellen, die einen der mindestens zwei verschiedenen Vektoren enthält, erlaubt. Vorzugsweise sind mindestens zwei verschiedene Vektoren so eingerichtet, dass das negative Selektionsmarkergen nach der Rekombination in den Rekombinationsprodukten enthalten ist, die die gewünschte DNA-Sequenz nicht enthalten. Das negative Selektionsmarkergen oder die andere Sequenz, die ein effizientes Screening gegen transformierte Zellen erlaubt, die einen oder mehrere der mindestens zwei verschiedenen Vektoren enthalten, sind vorteilhafterweise unter translationaler Kontrolle eines internen Ribosomeneingangsstellenelements (IRES-Element).
  • Die Erfindung stellt transgene Pflanzen oder Teile derselben, wie Samen, bereit, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden. Vorzugsweise sind alle kodierenden Sequenzen und/oder exprimierbaren Sequenzen der gewünschten DNA-Sequenz in den transgenen Pflanzen oder den Teilen derselben pflanzlichen Ursprungs. Ferner werden Bibliotheken von Pflanzen, von Pflanzenzellen oder von Pflanzensamen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden oder erhältlich sind, bereitgestellt.
  • BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
  • Verfahren zur Herstellung transgener multizellulärer Pflanzen oder Pflanzenzellen, die auf einem Kernchromosom stabil mit einer gewünschten DNA-Sequenz transformiert sind und eine gewünschte Funktion von der gewünschten DNA-Sequenz exprimieren können, wobei das Verfahren umfasst:
    • (a) Behandeln von Pflanzenzellen oder Pflanzen mit mindestens zwei verschiedenen Vektoren mittels Agrobakterium-vermittelter Transformation, wobei (i) die mindestens zwei verschiedenen Vektoren so eingerichtet sind, dass sie miteinander mittels ortsspezifischer Rekombination in den Pflanzenzellen rekombinieren, um ein nichtreplizierendes Rekombinationsprodukt zu ergeben, das die gewünschte DNA-Sequenz enthält, (ii) die mindestens zwei verschiedenen Vektoren so eingerichtet sind, dass sie die gewünschte DNA-Sequenz so in das Chromosom integrieren können, dass die gewünschte DNA-Sequenz die T-DNA Grenzsequenzen (T-DNA border sequences) enthält, (iii) die gewünschte DNA-Sequenz Sequenzabschnitte von mindestens zweien der mindestens zwei verschiedenen Vektoren enthält, wobei die Sequenzabschnitte für die Expression der gewünschten Funktion von der gewünschten DNA-Sequenz nötig sind, und
    • (b) Selektieren von Pflanzen oder Pflanzenzellen, die die gewünschte Funktion exprimieren.
  • Verfahren zur Herstellung verschiedener transgener multizellulärer Pflanzen oder Pflanzenzellen, die auf einem Chromosom, vorzugsweise auf einem Kernchromosom, mit einer gewünschten DNA-Sequenz transformiert sind und eine gewünschte Funktion von der gewünschten DNA-Sequenz exprimieren können, umfassend die folgenden Schritte (A) und (B):
    • (A) Behandeln von Pflanzen oder Pflanzenzellen mit einem Gemisch aus (i) einem Primärvektor, der einen primären Sequenzabschnitt a, enthält, und (ii) einer Gruppe von n Sekundärvektoren, von denen jeder einen sekundären Sequenzabschnitt ausgewählt aus der Gruppe (b1, b2,..., bn) enthält, wobei n eine ganze Zahl > 1 sind, der primäre Sequenzabschnitt a1 für die Expression der Funktion eines sekundären Sequenzabschnitts (b1, b2,..., bn) nötig ist, der Primärvektor und die Sekundärvektoren so eingerichtet sind, dass der Primärvektor mit jedem Element der Gruppe von n Sekundärvektoren mittels ortsspezifischer Rekombination rekombinieren kann zur Erzeugung von Rekombinationsprodukten, die verschiedene gewünschte DNA-Sequenzen des Typs (a1b1, a2b2,..., a1bn) oder des Typs (b1a1, b2a2,..., bna1) enthalten, der Primärvektor und die Sekundärvektoren für die Integration der gewünschten DNA-Sequenzen des Typs (a1b1, a2b2,..., a1bn) oder des Typs (b1a1, b2a1,..., bna1) in ein Chromosom eingerichtet sind,
    • (B) Selektieren von transformierten Pflanzen oder Pflanzenzellen, die eine gewünschte Funktion von der gewünschten DNA-Sequenz exprimieren, vorzugsweise von einer gewünschten DNA-Sequenz des Typs (a1b1, a1b2,..., a1bn) oder des Typs (b1a1, b2a1, ..., bna1).
  • Die verschiedenen transgenen multizellulären Pflanzen unterscheiden sich u.a. darin, dass sie verschiedene gewünschte DNA-Sequenzen enthalten. Die gewünschte DNA-Sequenzen enthaltenden Rekombinationsprodukte können replizierend oder nichtreplizierend sein. Vorzugsweise sind sie nichtreplizierend wie im allgemeinen Teil der Beschreibung definiert. Die Pflanzenzellen werden vorzugsweise mit der Mischung von primären und sekundären Vektoren mittels einer Mischung von Agrobakterium-Zellen behandelt, wobei jede Zelle einen Typ Vektor bereitstellt.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 zeigt ein allgemeines Schema des Zusammenbaus in planta einer gewünschten DNA-Sequenz, die für die stabile Integration in pflanzliche chromosomale DNA vorgesehen ist. RS steht für Rekombinationsstellen.
  • 1A zeigt schematisch das Zusammenfügen einer gewünschten DNA-Sequenz aus zwei (Vorläufer-)Vektoren.
    I – Das Zusammenfügen einer gewünschten DNA-Sequenz (AB) aus zwei verschiedenen Vektoren (A und B) mittels ortsspezifischer Rekombination.
    II – Zusammenfügen einer gewünschten DNA-Sequenz (AB) aus zwei Vorläufervektoren (AA' und B'B), die Helfer-Sequenzen (A' und B') enthalten, die in der gewünschten DNA-Sequenz (AB) nicht vorhanden sind.
  • 1B zeigt schematisch das Zusammenfügen einer gewünschten DNA-Sequenz aus mehr als zwei verschiedenen Vektoren.
    I – Zusammenfügen einer gewünschten DNA-Sequenz aus zwei Komponenten (AnBn) aus einer Bibliothek der Vorläufervektoren A und B, worin n die Anzahl der Vorläufervektoren in der Bibliothek ist.
    II – Zusammenfügen von einer gewünschten DNA-Sequenz (ABC) aus drei Komponenten aus einer Bibliothek der Vorläufervektoren A, B und C. RS1 und RS2 sind Rekombinationsstellen, die durch verschiedene Rekombinasen/Integrasen erkannt werden.
  • 2 zeigt schematisch die T-DNA-Regionen der Binärvektoren plCBV19 und plCH10605. GUS: β-Glucuronidase-Gen; P35S: CaMV35S-Promotor; BAR: Phosphinothricin-Acetyltransferase-Gen (plCH10605 enthält ein Intron, das die kodierende Sequenzen von BAR unterbricht); PNOS: Promotor des Nopalin-Synthase-Gens aus Agrobakterium; TNOS: Transkriptionsterminationsregion des Nopalin-Synthase-Gens aus Agrobakterium; TOCS: Transkriptionsterminationsregion des Octopin-Synthase-Gens.
  • 3 zeigt schematisch die T-DNA-Region des Binärvektors plCH7410.
    GFP: Das für das grün fluoreszierende Protein kodierende Gen; NPT: Neomycin-Phosphotransferase-II-Gen, das Resistenz gegen Kanamycin verleiht; POCS: Promotorregion des Octopin-Synthase-Gens aus Agrobakterium; NTR: 3'-nicht-translatierte Region des Tabak-Mosaik-Virus(TMV)-RNA; AttB: Rekombinationsstelle.
  • 4 zeigt schematisch die T-DNA-Region der Plasmide plCH11140 und plCH11150.
    PACT2-i: Promotor des Arabidopsis-Actin2-Gens mit einem ersten Intron.
  • 5 zeigt die T-DNA-Regionen der Binärvektoren plCBV16 und plCH8430.
    PACT2: Promotor des Arabidopsis-Actin2-Gens; TVCV-Polymerase: RNA-abhängige RNA-Polymerase des Turnip-Vein-Clearing-Virus (TVCV); MP: Movement-Protein aus Tobamovirus; IRESmp75: IRES des crTMV-Movement-Proteins.
  • 6 zeigt schematisch die T-DNA-Regionen der Binärvektoren plCH11160 und plCH11170.
  • 7 zeigt schematisch die T-DNA-Region, die durch ortsspezifische Rekombination zwischen den T-DNAs von plCH11150 und plCH11170 entsteht. Diese Region trägt ein BAR-Gen, das von einem Intron unterbrochen wird, das eine AttR-Stelle enthält. Intron-Spleißen nach der Transkription erlaubt die Expression eines funktionellen BAR-Proteins.
  • 8 zeigt schematisch die T-DNA-Region des Binärvektors plCH12022 und plCH12031, die für die Transformation von einkeimblätterigen Pflanzen vorgesehen sind. PUBQ: Promotor des Ubiquitin-Gens aus Mais; PACT1: Promotor des Actin1-Gens aus Reis; IPT: Isopentenyl-Transferase-Gen.
  • 9 zeigt schematisch die T-DNA-Region, die bei der ortsspezifischen Rekombination zwischen den T-DNA-Regionen der Binärvektoren plCH12022 und plCH12031 entsteht. Diese Region trägt ein funktionelles BAR-Gen mit einem Intron unter der Kontrolle des Actin1-Promotors PACT1 aus Reis.
  • 10 zeigt schematisch das Zusammenfügen einer gewünschten DNA-Sequenzen (C) aus zwei Vorläufervektoren (A und B), einschließlich des Zusammenfügens eines funktionellen Selektionsmarkergens aus Fragmenten des Selektionsmarkergens, wobei die Fragmente mit "selectable" und "marker" bezeichnet sind. Gleichzeitig wird ein Intron (bezeichnet mit "INTRON") aus Intron-Fragmenten zusammengefügt, die mit "INT" und "RON" bezeichnet sind. P: Promotor; T: Transkriptionsterminationsregion; CSM: Negativer Selektionsmarker; IRES: Interne Ribosomeneingangsstelle.
  • 11 zeigt schematisch das Zusammenfügen einer gewünschten DNA-Sequenz (C) aus zwei Vorläufervektoren (A und B), einschließlich des Zusammenfügens eines gewünschten funktionellen Gens aus Fragmenten des gewünschten Gens, wobei die Fragmente mit "Gene of" und "Interest" bezeichnet sind. Ein Selektionsmarker unter der translationalen Kontrolle eines IRES-Elements wird durch das Zusammenfügen exprimierbar gemacht, indem er unter die transkriptionelle Kontrolle eines Promotors zu liegen kommt. Beide Vorläufervektoren A und B enthalten ein negatives Selektionsmarkergen CSM. Durch das Zusammenfügen erscheint CSM in Rekombinationsprodukt D, das das gewünschte Gen nicht enthält. Durch Verwenden des CSM können transgene Pflanzen oder Pflanzenzellen selektiert werden, die weder Vorläufervektor A noch Vorläufervektor B noch Rekombinationsprodukt D enthalten. P: Promotor; T: Transkriptionsterminationsregion; CSM: Negativer Selektionsmarker; IRES: Interne Ribosomeneingangsstelle.
  • 12 zeigt schematisch das Zusammenfügen einer komplexen gewünschten DNA-Sequenz C durch ortsspezifische Rekombination in planta der Vektoren A und B. P: Promotor; T: Transkriptionsterminationsregion; CSM: Negativer Selektionsmarker; IRES: Interne Ribosomeneingangsstelle; Ds (3' oder 5'): Enden des nicht autonomen Transposonelements (Ds), die von der Ac-Transposase erkannt werden; dSpm (3' oder 5'): Enden des nicht autonomen Transposonelements dSpm, die von der Spm-Transposase erkannt werden; GOl: Gene of Interest (gewünschtes Gen).
  • 13 zeigt schematisch eine Methode zur Erzeugung verschiedener allelischer Vektoren aus einer gewünschten DNA-Sequenz, die in planta gemäß 12 zusammengefügt wird. P: Promotor; T: Transkriptionsterminationsregion; CSM: Negativer Selektionsmarker; IRES: Interne Ribosomeneingangsstelle; Ds (3' oder 5'): Enden des nicht autonomen Transposonelements (Ds), die von der Ac-Transposase erkannt werden; dSpm (3' oder 5'): Enden des nicht autonomen Transposonelements dSpm, die von der Spm-Transposase erkannt werden; GOl: Gene of Interest (gewünschtes Gen).
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • In dieser Erfindung wird ein schnelles, einfaches Verfahren zum Zusammenfügen in planta einer gewünschten DNA-Sequenz, die für die stabile Integration in ein Pflanzenchromosom vorgesehen ist, beschrieben. Dieser Ansatz erlaubt unter anderem das schnelle Optimieren der zu exprimierenden Sequenzen, indem verschiedene Transkriptions- oder Translationseinheiten oder Einheiten mit verschiedenen Fusionsproteinen oder verschiedenen Protein-Targeting-Modifikationen oder Proteine mit verschiedenen posttranslationalen Modifikationen usw. getestet werden. Das Verfahren kann effizient zum Screening von Bibliotheken von kodierenden oder Regulatorsequenzen verwendet werden. Eine andere Anwendung der Erfindung ist das Entwerten von sicheren Vektoren, die gewünschte Sequenzen nicht durch ungewollten Gentransfer weitergeben können. Ferner kann schwieriges Klonieren beim Design von komplexen DNA-Regionen (z.B. solchen, die beim Klonieren in Bakterienzellen instabil sind) für die stabile Kerntransformation vermieden werden, da zwei oder mehr komplexe DNA-Fragmente vor der Integration in die pflanzlichen Kern-DNA in planta verbunden werden können.
  • Gegenwärtig verwendete Methoden zur transienten oder konstitutiven Transgen-Expression in Pflanzen verwenden üblicherweise das Einführen von zusammengefügten Vektoren mit dem oder den gewünschte(n) Genen) in Pflanzenzellen. Die transiente Expression einer gewünschten Sequenz liegt jenseits des Anwendungsbereichs dieser Erfindung. Die Unterschiede zwischen der transienten und der konstitutiven Transgen-Expression können am besten im Rahmen der funktionellen Genomanalyse von Pflanzen illustriert werden, bei der durch Verwendung vitaler Vektoren in manchen Fällen relativ schnell anfängliche Information über eine mögliche Funktion eines Transgens erhalten werden kann (WO 99/3651; Kumagai et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1679–1683). In vielen anderen Fällen wird jedoch keine Information oder es werden Artefakte erhalten. Ferner erlaubt die Verwendung aller Vektoren keine weitergehende Untersuchung der transgenen Funktion, z.B. während der Pflanzenentwicklung usw. Zusätzlich verursachen Agrobakterien oder virale Vektoren als solche schwerwiegende Veränderungen in Pflanzenzellen, was beispielsweise die Untersuchung der Funktion von Genen, die an der Wechselwirkung von Pflanze und Pathogenen beteiligt sind, schwierig macht. Stabil transformierte transgene Pflanzen mit verschiedenen Expressionsmustern (inter- oder intrazelluläre Kompartementalisierung, gewebs-, organ- oder zellspezifische Expression) sind für eine genaue Untersuchung eines gewünschten Gens notwendig. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Zusammenfügen, die Optimierung und die Identifizierung einer gewünschten DNA-Sequenz für die stabile Kerntransformation von Pflanzenzellen mit hoher Effizienz in planta durchgeführt werden, und kann daher mit der Pflanzentransformation als einstufiges Verfahren kombiniert werden. Im folgenden werden die mindestens zwei verschiedenen Vektoren der Erfindung auch als Vorläufervektoren bezeichnet.
  • Das allgemeine Schema eines solchen Zusammenfügens aus zwei oder mehr Vorläufervektoren durch ortsspezifische DNA-Rekombination ist in 1 gezeigt. Das einfachste Beispiel eines solchen Zusammenfügens ist die Bildung einer gewünschten DNA-Sequenz ab aus zwei Vorläufervektoren A und B durch Rekombination unter Verwendung der Rekombinationsstelle RS (1A, 1). Es erübrigt sich zu sagen, dass ein solches Rekombinationsereignis selektierbar sein sollte. Dies kann leicht erreicht werden, z.B. wenn bei der Rekombination ein funktionelles Gen erzeugt wird, das die Selektion erlaubt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine T-DNA-Region (7), die die gewünschte DNA-Sequenz enthält, aus zwei Vorläufervektoren mit zwei anderen T-DNA-Regionen (4 und 6, unten) mittels der Integrase PhiC31-vermittelter Rekombination zusammengefügt. Die T-DNA-Region kann ein funktionelles BAR-Gen enthalten, das in den Vorläufervektoren nicht vorliegt, was die Selektion des Rekombinationsereignisses ermöglicht. Die für das Zusammenfügen der gewünschten T-DNA-Region nötige Integrase kann transient durch einen der Vorläufervektoren bereitgestellt werden, plCH11150 (4). Da die durch die PhiC31-Integrase katalysierte Rekombinationsreaktion irreversibel ist, kann diese Integrase auch von einer genetisch modifizierten Pflanze oder Pflanzenzelle konstitutiv exprimiert werden.
  • Viele verschiedene ortsspezifische Rekombinasen/Integrasen, die für die Durchführung dieser Erfindung verwendet werden können, sind bekannt. Geeignete Rekombinasen/Rekombina- tionsstellen sind unter anderem das Cre-Lox-System aus dem Bakteriophagen P1 (Austin et al., 1981, Cell, 25, 729–736), das Flp-Frt-System aus Saccharomyces cerevisiae (Broach et al., 1982, Cell, 29, 227–234), das R-RS-System aus Zygosaccharomcyces rouxii (Araki et al., 1985, J. Mol. Biol., 182, 191–203), die Integrase aus dem Streptomyces-Phagen PhiC31 (Thorpe & Smith, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5505–5510; Groth et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci., 97, 5995–6000) und Resolvasen. Ferner sind auch andere Methoden zur Umordnung von DNA im Bereich dieser Erfindung. Andere Enzymsysteme zur DNA-Modifikation können zur Erzeugung verwandter, jedoch funktionell verschiedener gewünschter DNA-Sequenzen in einer nativen oder einer genetisch modifizierten Pflanzenzelle verwendet werden: Restriktionsendonucleasen, Transposasen, allgemeine oder spezifische Rekombinasen usw. Die Verwendung ortsspezifischer Rekombinasen, die irreversibel wirken, ist für die Erfindung bevorzugt, da dies die Bildung eines stabilen Rekombinationsproduktes erlaubt, das die gewünschte DNA-Sequenz mit vorhersagbarer Struktur erlaubt.
  • Verschiedene Methoden können für das Behandeln der Pflanzenzelle mit den mindestens zwei verschiedenen Vektoren (Vorläufervektoren) verwendet werden. Die Vektoren können in die Pflanzenzelle über ein Ti-Plasmid mit Agrobakterium transformiert werden ( US 5 591 616 ; US 4 940 838 ; US 5 464 763 ) oder durch Partikel- oder Mikroprojektil-Bombardierung ( US 05 100 792 ; EP 00 444 882 B1 ; EP 00 434 616 B1 ). Weitere Transformationsmethoden für Pflanzen, wie die Mikroinjektion (WO 09209696; WO 09400583 A1; EP 175 966 B1 ), die Elektroporation ( EP 00 564 595 B1 ; EP 00 290 395 B1 ; WO 08706614 A1) oder die PEG-vermittelte Transformation von Protoplasten usw. Die Wahl der Transformationsmethode sowie des Transformationsprotokolls hängt von der zu transformierenden Pflanzenart ab. Zum Beispiel ist die Mikroprojektilbombardierung im allgemeinen für die Transformation von einkeimblätterigen Pflanzen bevorzugt, während für zweikeimblätterige Pflanzen die Agrobakterium-vermittelte Transformation im allgemeinen bessere Ergebnisse liefert.
  • In der oben beschriebenen Ausführungsform wurde die Agrobakterium-vermittelte Verabreichung von Vorläufervektoren in Nikotianazellen verwendet. Jedoch kann die heterogene DNA auch mit einer anderen Standardtechnik, die für die stabile Transformation der gewünschten Pflanzenart geeignet ist, eingeführt werden. Transformationstechniken für zweikeimblätterige Pflanzen sind bekannt und umfassen Agrobakterium-basierte Methoden und Methoden, die nicht Agrobakterium benötigen. Zu letzteren Methoden gehört die Aufnahme exogenen genetischen Materials direkt durch Protoplasten oder Zellen. Zu diesen Methoden gehört die PEG- oder Elektroporation-vermittelte Aufnahme, die Partikelbombardierung und die Mikroinjektion. Beispiele für diese Techniken sind von Paszkowski et al., EMBO J. 3: 2717–2722 (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199: 169–177 (1985), Reich et al., Biotechnology 4: 1001–1004 (1986), und Klein et al., Nature 327: 70–73 (1987), beschrieben. In jedem Fall können transformierte Zellen zu vollständigen Pflanzen nach Standardmethoden regeneriert werden.
  • Die Agrobakterium-vermittelte Transformation ist bevorzugt für die Transformation von zweikeimblätterigen Pflanzen wegen ihrer hohen Transformationseffizienz und ihrer breiten Anwendbarkeit auf viele verschiedene Pflanzenarten. Zu den Nutzpflanzenarten, die mit Agrobakterium routinemäßig transformiert werden können, gehören Tabak, Tomaten, Sonnenblumen, Baumwolle, Raps, Kartoffeln, Sojabohnen, Alfalfa und Pappeln ( EP 0 317 511 (Baumwolle), EP 0 249 432 (Tomaten), WO 87/07299 (Brassica), US-Patent 4 795 855 (Pappeln)). Bei der Agrobakterium-Transformation wird typischerweise der Binärvektor, der die gewünschte Fremd-DNA enthält, in einen geeigneten Agrobakterium-Stamm eingebracht, der von vir-Genen abhängig sein kann, die im Agrobakterium-Wirtsstamm entweder auf einem ebenfalls vorhandenen Plasmid oder chromosomal vorhanden sind (Uknes et al., Plant Cell 5: 159–169 (1993). Der Transfer des rekombinanten Binärvektors in Agrobakterium kann durch triparentales Kreuzen unter Verwendung von E. coli, das den rekombinanten Binärvektor trägt, einem E. coli-Hilfsstamm, der ein Plasmid, wie pRK2013, trägt, das den rekombinanten Binärvektor in den Agrobakterium-Zielstamm mobilisieren kann. Alternativ kann der rekombinante Binärvektor in Agrobakterium mittels DNA-Transformation eingebracht werden (Höfgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res. 16, 9877 (1988)).
  • Die Transformation der Zielpflanze durch das rekombinante Agrobakterium umfasst üblicherweise die Kokultivierung des Agrobakteriums mit Gewebestücken (explants) der Pflanze nach bekannten Methoden. Transformiertes Gewebe, das einen Antibiotikum- oder Herbizid-Resistenzmarker zwischen den Grenzen der T-DNA des binären Plasmids enthält, kann auf Selektionsmedium regeneriert werden.
  • Bevorzugte Transformationsmethoden für einkeimblätterige Pflanzen sind unter anderem der direkte Gentransfer in Protoplasten mittels PEG oder Elektroporation und die Partikelbombardierung in Kallusgewebe.
  • Die Patentanmeldungen EP 0 292 435 , EP 0 392 225 und WO 93/07278 beschreiben Verfahren zur Präparation von Kallus und Protoplasten von Mais, die Transformation von Protoplasten mittels PEG oder Elektroporation und die Regeneration von Maispflanzen aus transformierten Protoplasten. Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603–618 (1990), und Fromm et al., Biotechnology 11: 194–200 (1993), beschreiben Methoden zur Transformation von Auslese-Inzucht-Linien (elite inbred lines) von Mais durch Partikelbombardierung.
  • Die Transformation von Reis kann auch durch direkten Gentransfer in Protoplasten oder durch Partikelbombardierung erreicht werden. Protoplasten-vermittelte Transformation wurde für die Japonica-Sorten und Indica-Sorten beschrieben (Zhange et al., Plant Cell Rep. 7: 739–384 (1988); Shimamoto et al., Nature 338: 274–277 (1989); Datta et al., Biotechnology 8: 736–740 (1990)). Beides Sorten können auch routinemäßig über Partikelbombardierung transformiert werden (Christou et al., Biotechnology, 9: 957–962 (1991)). Die Agrobakteriumvermittelte Transformation von Reis ist ebenso anwendbar (Chan et al., 1993, Plant Mol. Bio%, 22, 491–506).
  • Die EP 0 332 581 beschreibt Techniken zur Erzeugung, Transformation und Regeneration von Pooideae-Protoplasten. Die Transformation von Weizen wird von Vasil et al., Biotechnology 10: 667–674 (1992), beschrieben unter Verwendung der Partikelbombardierung in Zellen vom Typ C-Langzeit-regenerierbarem Kallus (type C longterm regenerable callus). Vasil et al., Biotechnology 11: 1553–1558 (1993), und Weeks et al., Plant Physiol. 102: 1077–1084 (1993), beschreiben die Partikelbombardierung früher Embryos und frühem Kallus aus Embryogewebe.
  • Die Transformation von Monocot-Zellen, wie Zea mays , kann erreicht werden, indem die Monocot-Zellen in Kontakt mit einer Vielzahl von nadelförmigen Körpern gebracht werden, auf die die Zellen aufgespießt werden, was einen Bruch in der Zellwand verursacht und den Eintritt der transformierenden DNA in die Zellen erlaubt (siehe US 5 302 523 ). Transformationstechniken, die sowohl auf Monocotyledonen und Dicotyledonen anwendbar sind, werden beschrieben in US 5 240 855 (particle gun); 5 204 253 (mittels Kaltgas-Schock beschleunigte Mikroprojektile); 5 179 022 (biolistischer Apparat); 4 743 548 und 5 114 854 (Mikroinjektion); und 5 149 655 und 5 120 657 (Transformation mit beschleunigten Partikeln); 5 066 587 (gasgetriebener Mikroprojektil-Beschleuniger); 5 015 580 (Partikel-vermittelte Transformation von Sojabohnenpflanzen); 5 013 660 (Laserstrahl-vermittelte Transformation); 4 849 355 und 4 663 292.
  • Transgene Pflanzenzellen oder Pflanzengewebe, die/das mittels einer der oben beschriebenen Methoden transformiert wurde, kann/können dann zu vollständigen Pflanzen nach Standardtechniken herangezogen werden. Transgene Samen können von transgenen Blütenpflanzen nach Standardmethoden erhalten werden. Nicht blühende Pflanzen, wie Kartoffel und Zuckerrüben, können nach mehreren Verfahren fortgeplanzt werden (siehe z.B. Newell et al., Plant Cell Rep. 10: 30–34 (1991) (die die Kartoffeltransformation mit Stammkultur beschreiben).
  • Das Zusammenfügen einer gewünschten DNA-Sequenz in planta aus Vorläufervektoren kann durch Anwesenheit von Hilfssequenzen A' und B' (1A, II) stark erleichtert werden, die vorzugsweise in der zusammengefügten gewünschten DNA-Sequenz AB (1A, II) abwesend sind. Diese Hilfssequenzen können in Rekombinationsprodukte gelangen, die die gewünschte DNA-Sequenz nicht enthalten. Solche Hilfssequenzen können gewünschte Gene bereitstellen, die für das Zusammenfügen der gewünschten DNA-Sequenz (z.B. Rekombinasen), für das Entfernen von Transformanten, die einen Vorläufervektor stabil in chromosomale DNA integriert haben (z.B. mit Hilfe eines negativen Selektionsmarkers), für das transiente Bereitstellen von Genprodukten, die für die frühen Phasen der Gewebekultur (z.B. Gene, die für die Biosynthese von Phytohormonen verantwortlich sind) usw., nötig sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Erzeugung einer gewünschten DNA-Sequenz für einkeimblätterige Pflanzen (9) aus Vorläufervektoren (8) beschrieben. Die Vorläufervektoren können zwei Arten von Hilfssequenzen enthalten, wobei eine Art die ortsspezifische Integrase PhiC31 und eine andere Isopentenyl-Transferase (IPT), die endogene Cytokinine in betroffenen Pflanzenzellen verändert (Medford et al., 1989, Plant Cell, 1, 403–413), bereitstellen kann. Das IPT-Gen kann zusätzlich zu seiner Verwendung zum Induzieren der Knospenbildung auch als Selektionsmarker verwendet werden, der morphologische Abnormalitäten der Pflanze verursacht, wenn er stabil in chromosomale DNA integriert ist (Ebinuma et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 2117–2121). In dieser Ausführungsform kann das IPT-Gen als negativer Selektionsmarker verwendet werden, der die Identifizierung und Entfernung von transformierten Pflanzengeweben erlaubt, die Sequenzen eines Vorläufervektors stabil in die genomische DNA integriert haben. Ein weiteres Beispiel von negativen Selektionsmarkern (counter-selectable marker, CSM) zur Verwendung in dieser Erfindung ist das Gen, das für die konditional-lethale Cytosin-Desaminase (cod A) kodiert (Gleave et al., 1999, Plant Mol. Biol., 40, 223–235) oder das Gen, das für bakterielles Cytochrom P-450 kodiert (O'Keefe et al., 1994, Plant Physiol., 105, 473–482).
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird ein Gemisch von mehr als zwei verschiedenen Vorläufervektoren zum Zusammenfügen verschiedener gewünschten DNA-Sequenzen verwendet. Die gewünschten DNA-Sequenzen können das Ergebnis zufälliger ortsspezifischer Rekombinationsereignisse zwischen zwei Mengen von Vorläufervektoren (Menge An und Menge Bn, 1B, I) sein. Es kann eine Menge von gewünschten DNA-Sequenzen vom Typ AnBn in einer Pflanzenzell mittels ortsspezifischer Rekombination einer Menge von Vorläufervektoren (A1, A2,...., An) mit einer Menge von Vorläufervektoren (B1, B2, ...., Bn) erzeugt werden, worin n die Anzahl der Vorläufervektoren vom Typ A oder vom Typ B ist. Mindestens drei verschiedenen Vorläufervektoren sind nötig, um die Zelle mit mindestens zwei verschiedenen gewünschten DNA-Sequenzen auszustatten. Die Anzahl aller möglicher Kombinationen von gewünschten DNA-Sequenzen, die aus der Vielzahl von Vorläufervektoren A und der Vielzahl von Vorläufervektoren B zusammengefügt werden können, kann durch Multiplikation der Anzahl der Vorläufervektoren vom Typ A mit der Anzahl der Vorläufervektoren vom Typ B errechnet werden.
  • Beispiele für Nucleinsäure-Sequenzen, die Teil von Vektor A oder B sein können und mittels ortsspezifischer Rekombination miteinander verbunden werden können, sind kodierende Sequenzen oder Teile derselben oder irgendwelche genetischen Elemente. Ein solches genetisches Element (oder regulatorisches Element) kann jedes DNA-Element sein, das auf DNA- oder RNA-Ebene eine bestimmte genetische Funktion aufweist, wobei die Funktion eine andere ist als das Kodieren für den Strukturteil eines Gens. Beispiele sind unter anderem: Transkriptionsverstärker (Enhancer), Promotoren oder Teile derselben, Translationsverstärker (Enhancer), Rekombinationsstellen, Transkriptionsterminations-Sequenzen, interne Ribosomeneingangsstellen (IRESs), Restriktionsstellen, autonom replizierende Sequenzen oder Replikationsursprünge.
  • In dieser Erfindung kann das die gewünschte DNA-Sequenz enthaltende Rekombinationsprodukt aus Komponenten von mehr als zwei Vorläufervektoren bestehen. In 1B, II ist das Zusammenfügen einer solchen gewünschten DNA-Sequenz, die Sequenzabschnitte aus drei verschiedenen Vorläufervektoren A, B und C enthält, gezeigt. Jedoch kann für ein effizientes Zusammenfügen der gewünschten DNA-Sequenz die Verwendung von mehr als einem Typ Rekombinase und/oder Integrase nötig sein.
  • Das Zusammenfügen einer gewünschten DNA-Sequenz für eine stabile Integration in ein Chromosom einer Pflanzenzelle sollte die Selektion von Pflanzenzellen erlauben, die die gewünschte DNA-Sequenz in die chromosomale DNA integriert haben. Ein möglicher Mechanismus für die Selektion der gewünschten DNA-Sequenz ist das Zusammenfügen eines funktionellen Selektionsmarkergens, was im Detail in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben und in allgemeiner Form in 10 gezeigt ist. Die Verwendung eines negativen Selektionsmarkers (CSM) in allen Vorläufervektoren (10 und 11) erlaubt das einfache Entfernen von Pflanzenzellen, die Vorläufervektoren stabil in chromosomale DNA integriert haben. In einigen Fällen kann das Zusammenfügen der gewünschten DNA-Sequenz zusammen mit dem Zusammenfügen eines gewünschten funktionellen Gens vorteilhaft sein, z.B., wenn das gewünschte Gen für Bakterienzellen toxisch ist. Der Selektionsmarker kann in solchen Fällen Teil eines bicistronischen Konstrukts unter der Kontrolle eines IRES-Elements sein (11). Die ortsspezifische Rekombination der Vorläufervektoren (A und B in 11) kann zur Bildung einer gewünschten DNA-Sequenz führen, die das funktionelle bicistronische Konstrukt mit dem gewünschten Gen, gefolgt von einem IRES-kontrollierten Selektionsmarkergen, enthält. Die Verwendung von IRES-Elementen in Pflanzen ist aus dem Stand der Technik bekannt (WO 9843242; WO 0246440; Dorokhov et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 5301–5306) und kann routinemäßig mit der vorliegenden Erfindung kombiniert werden.
  • Das Zusammenfügen komplexer Vektoren in planta aus Vorläufervektoren einfacherer Struktur kann ein weiterer Vorteil sein, der komplexe Klonierschritte und/oder die Manipulation mit instabilen DNA-Strukturen in Bakterienzellen zu vermeiden erlaubt. Das Zusammenfügen einer gewünschten DNA-Sequenz zur Erzeugung verschiedener Nachfolger-Vektoren (derivative vectors) in allelischer Position ist in 12 gezeigt. Die stabil in die pflanzliche chromosomale DNA integrierte gewünschte DNA-Sequenz (12C) kann einer ausgewählten Transposase (Ac oder Spm, 13) ausgesetzt werden, was das Entfernen von Zielsequenzen (flankiert von Ds-Sequenzen für Ac oder von dSpm-Sequenzen für Spm) erlaubt. Die erhaltenen Nachfolgervektoren B und C (13) befinden sich in allelischer Position relativ zueinander und kodieren für verschiedene Teile eines gewünschten Gens (GOl, gene of interest), das über Intein-vermitteltes Trans-Spleißen zusammengefügt werden kann. Dieser Ansatz berücksichtigt Aspekte der Biosicherheit, z.B. die Kontrolle Segregation eines Transgens, da die zwei Fragmente des Gens, die das gewünschte Merkmal generieren, immer infolge ihrer allelischen Anordnung auf verschiedene Gameten segregieren.
  • Die transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen gemäß dieser Erfindung können für viele verschiedene Zwecke verwendet werden, von denen einige bereits genannt wurden. In einer weiteren Anwendung kann die in planta zusammengefügte gewünschte DNA-Sequenz wiederum als Vorläufervektor für nachfolgende Prozesse verwendet werden. Die gewünschte DNA-Sequenz kann z.B. dahingehend induziert werden, eine extra-chromosomale DNA wie einen unabhängigen episomalen Vektor zu bilden. Das Induzieren kann z.B. durch Kreuzen einer transgenen Pflanze gemäß der Erfindung, die die gewünschte DNA-Sequenz enthält, mit einer anderen Pflanze erreicht werden, die einen Faktor bereitstellt, der die induzierende Funktion oder das Auslösen der Bildung der extra-chromosomalen/episomalen DNA auslöst. Alternativ kann die Bildung einer solchen episomalen DNA beispielsweise durch transiente Expression eines Faktors (z.B. einer Transposase, einer vitalen Replikase usw.) verursacht werden, der die Bildung der extra-chromosomalen/episomalen DNA aus der gewünschten DNA-Sequenz auslöst. Die episomale DNA kann in der Folge zur Reintegration befähigt sein (z.B. kann sie Eigenschaften eines Transposonelementes haben oder ein solches sein), oder sie kann zum unabhängigen Aufrechterhalten während Zellteilungen (Derivat eines DNA-viralen Vektors) befähigt sein.
  • Diese Erfindung wird vorzugsweise mit höheren multizellulären Pflanzen durchgeführt. Bevorzugte Pflanzen zur Verwendung in dieser Erfindung sind u.a. alle Pflanzenarten, vor allem jedoch Pflanzenarten, die in der Landwirtschaft oder im Gartenbau wichtig sind. Übliche Nutzpflanzen zur Verwendung in dieser Erfindung sind u.a. Alfalfa, Gerste, Bohnen, Raps, Futtererbsen, Baumwolle, Mais, Klee, Lotus, Linsen, Lupinen, Hirse, Hafer, Erbsen, Erdnüsse, Reis, Roggen, Süßklee, Sonnenblumen, süße Erbsen, Sojabohnen, Sorghum triticale, Yams-Bohnen, Seidenbohnen, Wicken, Weizen, Wisteria und Nusspflanzen. Pflanzenarten für diese Erfindung sind u.a. solche, die zu den Gramineae, Kompositeae, Solanaceae und Rosaceae gehören. Weitere Pflanzenarten für diese Erfindung sind solche der folgenden Gattungen: Arabidopsis, Agrostis, Allium, Antirrhinum, Apium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Bambusa, Brassica, Bromus, Browaalia, Camellia, Cannabis, Capsicum, Cicer, Chenopodium, Chichorium, Citrus, Coffea, Coix, Cucumis, Curcubita, Cynodon, Dactylis, Datura, Daucus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Eleusine, Festuca, Fragaria, Geranium, Glycine, Helianthus, Heterocallis, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Ipomoea, Lactuca, Lens, Lilium, Linum, Lolium, Lotus, Lycopersicon, Majorana, Malus, Mangifera, Manihot, Medicago, Nemesia, Nicotiana, Onobrychis, Oryza, Panicum, Pelargonium, Pennisetum, Petunia, Pisum, Phaseolus, Phleum, Poa, Prunus, Ranunculus, Raphanus, Ribes, Ricinus, Rubus, Saccharum, Salpiglossis, Secale, Senecio, Setaria, Sinapis, Solanum, Sorghum, Stenotaphrum, Theobroma, Trifolium, Trigonella, Triticum, Vicia, Vigna, Vitis, Zea, und Olyreae, Pharoideae und viele andere.
  • In dieser Erfindung sind Pflanzenarten, die nicht in die Nahrungskette eingehen, besonders bevorzugt für die Erzeugung pharmazeutischer oder technischer Proteine. Unter diesen sind Nicotiana-Arten besonders bevorzugt, da diese Arten leicht zu transformieren und zu kultivieren sind und es gut entwickelte Expressionsvektoren (insbesondere virale Vektoren) gibt.
  • Gewünschte Gene, deren funktionelle oder nichtfunktionelle Fragmente oder deren künstliche Derivate, die mit dieser Erfindung in Pflanzen oder Pflanzenzellen exprimiert werden können, sind unter anderem: Stärke-modifizierende Enzyme (Stärke-Synthase, Stärke-phosphorylierendes Enzym, debranching enzyme, Stärke- verzweigendes Enzym, Stärke-verzweigendes Enzym II, granule bound Stärke-Synthase), Sucrosephosphat-Synthase, Sucrose-Phosphorylase, Polygalacturonase, Polyfructan-Sucrase, ADP-Glucose-Pyrophosphorylase, Cyclodextrin-Glycosyltransferase, Fructosyl-Transferase, Glycogen-Synthase, Pectin-Esterase, Aprotinin, Avidin, Bacterielle Levansucrase, E.coli glgA Protein, MAPK4 und Orthologe, Stickstoff-Assimilierungs/Methabolismus-Enzyme, Glutamin-Synthase, pflanzliches Osmotin, 2S Albumin, Thaumatin, ortspezifische Recombinasen/Integrasen (FLP, Cre, Recombinase, Int, SSVI Integrase R, Integrase phiC31, oder ein aktives Fragment oder Variante derselben), Isopentenyl-Transferase, Sca M5 (Sojabohnen-Calmodulin), Coleopteran-artige Toxine oder ein insektizidaktives Fragment, Fusionsproteine des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms (E2), Enzyme die Lipide, Aminosäuren, Zucker, Nukleinsäuren und Polysaccharide metabolisieren, Superoxide-Dismutase, inaktives Proenzym einer Protease, pflanzliche Proteintoxine, Merkmale die in faserproduzierenden Pflanzen Fasern verändern, gegen Coleoptera-aktives Toxin von Bacillus thuringiensis (Bt2 Toxin, Insektizides Kristallprotein (ICP), CryIC Toxin, Delta-Endotoxin, Polyopeptidtoxin, Protoxin etc.), insektenspezifisches Toxin AalT, Celluloseabbauende Enzyme, E1 Cellulase von Acidothermus celluloticus, Lignin-modifizierende Enzyme, Cinnamoylalkohol- Dehydrogenase, Trehalose-6-phosphat-Synthase, Enzyme des Cytokinin metabolic pathway, HMG-CoA Reductase, Thaumatin, E. coli anorganische Pyrophosphatase, Samenlagerungsprotein (seed storage protein), Erwinia herbicola Lycopen-Synthase, ACC Oxidase, pTOM36 kodiertes Protein, Phytase, Ketohydrolase, Acetoacetyl-CoA-Reductase, PHB (Polyhydroxybutanoate)- Synthase, Acyl-carrier-protein, Napin, EA9, Phytoen-Synthase aus nichthöheren Pflanzen, pTOM5-kodiertes Protein, ETR (Ethylen-Rezeptor), plastidäre Pyruvat-Phosphat-Dikinase, Nematoden-induzierbares Transmembranporenprotein, merkmalsfördernde photosynthetische oder plastidäre Funktion der Pflanzenzelle, Stilben-Synthase, Enzyme, die Phenole hydroxylieren können, Catechol-Dioxygenase, Catechol-2,3-Dioxygenase, Chloromuconat-Cycloisomerase, Anthranilat-Synthase, Brassica AGL15 Protein, Fructose-1,6-Biphosphatase (FBPase), AMV RNA3, PVY Replicase, PLRV Replikase, Potyvirus-Hüllprotein, CMV-Hüllprotein, TMV-Hüllprotein, Luteovirus Replicase, MDMV messenger RNA, mutierte geminivirale Replicase, Umbellularia californica C12:0 bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase, pflanzliche C10 or C12:0 bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase, C14:0 bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase (luxD), pflanzlicher Synthasefaktor A, pflanzlicher Synthasefaktor B, 6-Desaturase, ein Protein mit einer enzymatischen Aktivität in der peroxysomalen b-Oxidation von Fettsäuren in Pflanzenzellen, Acyl-CoA-Oxidase, 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase, Lipase, Acetyl-CoA-Carboxylase aus Mais, 5-Enolpyruvylschikimat-3-Phosphat-Synthase (EPSP), Phosphinothricin-Acetyl-Transferase (BAR, PAT), CP4 Protein, ACC-Deaminase, Proteine mit posttranslationaen Spaltstellen, DHPS Gen, das Sulfonamid-Resistenz verleiht, bakterielle Nitrilase, 2,4-D Monooxygenase, Acetolactat-Synthase oder Acetohydroxysäure-Synthase (ALS, AHAS), Polygalacturonase, Taq Polymerase, viele andere Enzyme aus Bakterien oder Phagen, darunter Restriktionsendonucleasen, Methylasen, DNA-und RNA-Ligasen, DNA-und RNA-Polymerasen, Reverse Transcriptase, Nucleasen (Dnasen und Rnasen), Phospatasen, Transferasen, usw.
  • Die vorliegende Erfindung kann auch für Zwecke der molekularen Landwirtschaft (molecular farming) sowie für die Reinigung wertvoller und pharmazeutisch wichtiger Proteine verwendet werden, darunter industrielle Enzyme (Zellulasen, Lipasen, Proteasen, Phytasen usw.) und Faserproteine (Collagen, Seidenprotein von Spinnen usw.). Proteinwirkstoffe für Mensch und Tier können nach dieser Erfindung exprimiert und gereinigt werden. Beispiele für solche gewünschten Proteine sind unter anderem Proteine der Immun-Antwort (monoklonale Antikörper, Einzelketten-Antikörper, T-Zell-Rezeptoren usw.), Antigene, darunter solche aus pathogenen Mikroorganismen, Kolonie-stimulierende Faktoren, Relaxine, Polypeptid-Hormone, darunter Somatotropin (HGH) und Proinsulin, Cytokine und deren Rezeptoren, Interferone, Wachstumsfaktoren und Koagulationsfaktoren, enzymatisch aktives lysosomales Enzym, fibrinolytische Polypeptide, Blutgerinnungsfaktoren, Trypsinogen, a1-Antitrypsin (AAT), humanes Serumalbumin, Glucocerebosidase, natives Cholera-Toxin B, sowie funktionskonservative Proteine wie Fusionen, Mutantenversionen und synthetische Derivate der oben genannten Proteine.
  • Die oben genannten Proteine und andere können je nach Bedarf optimiert werden, indem Zufallsmutationen in ihre kodierende Sequenz eingeführt werden oder durch Gene-Shuffling-Methoden. Das Screening nach einem Protein, das für den beabsichtigten Zweck optimierte Eigenschaften hat, kann dann gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele dienen der Illustration der Erfindung. Modifizierungen und Änderungen sind von der Erfindung umfasst.
  • BEISPIEL 1
  • Vektor-Design für die stabile Transformation von Dicotyledonen mit einem gespaltenem BAR-Gen
  • Design von plCH11150
  • Dieses Konstrukt beruhte auf dem Binärvektor plCBV-19 (2). Als erster Klonierschritt wurden die Bsal-Restriktionsstellen für die Insertion des Introns in das BAR-Gen eingeführt (Konstrukt plCH10605, 2). Das Bsal-Enzym schneidet DNA außerhalb der Erkennungsstelle und macht Überhänge von 4 Nucleotiden. Im Fall von plCH10605 wurde das Bsal-Enzym zum Einführen der Spleiß-Akzeptor- und -Donor-Stellen für die nachfolgende Intron-Insertion verwendet. Im nächsten Schritt wurde ein von plCH7410 ( 3) mit den Oligos int-ad-9 (5'-tttttggtc cgacctgcaa caataagaac aaaaagtcat aaatt-3') und attbpr11 (5'-tttaagcttg agctctttcc taggctcgaa gccgcggtgc gggtg-3') amplifiziertes PCR-Fragment in plCH10605 unter Verwendung der Bsal- und Hindlll-Restriktionsstellen eingefügt. Das PCR-Fragment, das AttB und den 3'-Teil des Introns sowie Avrll- und Sacl-l-Restriktionsstellen enthält, ersetzte die GUS-Expressionskassette und den 5'-Teil der BAR-Expressionskassette. Die T-DNA des erhaltenen Konstrukts (plCH11140, 4) enthielt den 3'-Teil der BAR-Expressionskassette: AttB, 3'-Teil des Introns, 3'-Teil des BAR-Gens und den OCS-Terminator sowie die Avrll- und Sacl-Restriktionsstellen. Als letzter Schritt der Klonierung des 3'-Konstrukts wurde eine PhiC31-Integrase-Expressionskassette, die den Arabidopsis-Actin2-Promotor, die PhiC31-Integrase und einen NOS-Terminator enthielt, in plCH11140 unter Verwendung der Avrll- und Sacl-Restriktionsstellen eingefügt. Das erhaltene Konstrukt plCH11150, das das 3'-Ende des BAR-Gens mit einer AttB-Rekombinationsstelle zusammen mit dem 3'-Ende des Introns sowie eine PhiC31-Integrase-Expressionskassette enthält, ist in 4 gezeigt.
  • Design von plCH11170
  • Dieses Konstrukt wurde auf der Grundlage des Binärvektors plCBV-16 (5) geschaffen. Das mit den Oligos int-ad-10 (5'-tttaagcttg aattcttttg gtctcaggta agtttcattt tcataattac aca-3')und attppr14 (5'-tttttcaatt ggagctccta cgcccccaac tgagagaac-3') aus plCH8430 (5) amplifizierte PCR-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen Hindlll und Mfel geschnitten und in plCBV-16, der mit Hindlll und EcoRl verdaut war, eingefügt. Das den 5'-Teil des Introns und AttP sowie die Restriktionsstellen Bsal und EcoRl enthaltende PCR-Fragment ersetzte die GUS-Expressionskassette in dem intermediären Konstrukt plCH11160 (6). Als letzter Klonierschritt wurde das EcoRl/Bsal-Fragment von plCH10605 (2), das einen NOS-Promotor und den 5'-Teil des BAR-Gens enthielt, in plCH11160 inseriert. Die T-DNA-Region des erhaltenen Konstrukts plCH11170 ist in 6 gezeigt.
  • BEISPIEL 2
  • Agrobakterium-vermittelte Transformation von Nicotiana tabacum (cv Petit Havana) mit in planta zusammengefügter T-DNA-Region Die Konstrukte plCH11150 und plCH11170 wurden in A. tumefaciens (GV3101) immobilisiert und für die Agrobakterium-vermittelte Transformation von Blattscheiben von Nicotiana-Pflanzen verwendet (Horsh et al., 1985, Science, 227, 1229–1231), wobei 10 mg/l Phosphinothricin (PPT) zur Selektion verwendet wurde. Regenerierte Tabakpflanzen wurden mittels PCR nach der Anwesenheit von stabil in chromosomale DNA integrierte, in planta zusammengefügte T-DNA-Region (7) und die Abwesenheit der T-DNA-Regionen von plCH11150 und plCH11170 analysiert.
  • BEISPIEL 3
  • Vektor-Design und Agrobakterium-vermittelte Transformation von Monocotyledonen mit dem gespaltenen BAR-Gen Für das Design von Konstrukten zum Verfolgen des Zusammenfügens in planta einer gewünschten T-DNA-Region unter Verwendung des gespaltenen BAR-Gens wurden die Konstrukte plCH11150 und plCH11170 (Beispiel 1) verwendet. Das Konstrukt plCH11150 wurde modifiziert, indem der Arabidopsis-Actin2(PACT2-i)-Promotor mit dem Actin1-Promotor aus Reis (PACT1) ersetzt wurde (McElroy D. et al., 1991, Mol Gen Genet., 231, 150–160), was das Konstrukt plCH12022 (8) ergab. Das Konstrukt plCH11170 wurde modifiziert, indem der Nopalin-Synthase-Promotor (PNOS), der die Expression des BAR-Genfragments bewirkt, mit dem Reis-Actin1-Promotor (PACT1) ersetzt wurde, und die NPTll-Expressionskassette wurde mit einer IPT(Isopentenyl-Transferase, Gen-Bank Nr. X14410)-Expressionskassette unter der Kontrolle eines Mais-Ubiquitin-Gen-Promotors (PUBQ) ersetzt (Christensen AH & Quail PH, 1996, Transgenic Res., 5, 213–218), was das Konstrukt plCH12031 (8) ergab. Diese Manipulationen wurden gemäß Standardkloniertechniken durchgeführt (Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989, Molecular cloning: A laboratory manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor, NY: CSH Laboratory Press).
  • Die Linie PEN3 von Pennisetum glaucum wurde für die Agrobakterium-vermittelte Transformation mit den Plasmiden plCH12022 und plCH12031 verwendet. Aliquots vom Agrobakterium tumefaciens AGL1-Stamm, die entweder plCH12022 oder plCH12031 trugen, wurden in gleichen Mengen gemischt und für die unten beschriebene Transformation verwendet.
  • Das Kulturmedium enthielt Murashige- und Skoog(MS)-Salze und -Vitamine: (Murashige, T. & Skoog, F. A., 1962, Physiol. Plant., 15, 473–497) mit 2,0 mg/l 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyessigsäure), 30 g/l Sucrose und 0,3% Gelrite. Das Regenerationsmedium enthielt MS-Salze und -Vitamine halber Stärke mit 20 g/l Maltose, 1 mg/l IAA, 1 mg/l Zeatin und 0,6% Gelrite.
  • Das Infektionsmedium (IM) enthielt MS-Salze und -Vitamine halber Stärke mit 2 mg/l 2,4-D, 10 g/l Glucose, 60 g/l Maltose, 50 mg/l Ascorbinsäure, 1 g/l MES (2-N-Morpholinoethansulfonsäure) und 40 mg/l Acetoxyringon (AS). Der pH des Mediums wurde mit 1 N KOH auf 5,2 eingestellt. Das Kokultivationsmedium (CM) war dasselbe wie IM (mit der Ausnahme von Ascorbinsäure) und wurde durch Zugabe von 0,6% Gelrite verfestigt.
  • Das Infektionsmedium wurde filtersterilisiert, alle anderen Medien wurden autoklaviert. AS wurde in DMSO (400 mg/ml) aufgelöst und nach der Sterilisierung zugegeben. Agrobakterienkulturen (Stämme AGL1, EHA105, A4 usw.) wurden mit den entsprechenden Binärplasmiden 3 Tage bei Raumtemperatur auf LB2N-Platten (LB-Medium mit 2 g/l NaCl und 1,5% Agar), ergänzt mit den entsprechenden Antibiotika wachsengelassen. Die Bakterien wurden von den Platten geschabt und in IM in 50 ml-Falcon-Röhrchen resuspendiert. Die Röhrchen wurden horizontal auf der Plattform eines Schüttlers befestigt und bei geringer Geschwindigkeit 4 bis 5 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Die optische Dichte der Suspension wurde gemessen und die OD600 auf 1,0 eingestellt.
  • Kallusstücke wurden 3 Stunden bei Raumtemperatur in der Suspension der Agrobakterien inkubiert und auf mit Gelrite verfestigtes CM mit 60 g/l Maltose transferiert.
  • Nach 3-tägiger Kultivierung auf CM wurden die Kalli fünfmal mit MS-Medium halber Stärke mit 60 g/l Sucrose gewaschen und auf mit Gelrite befestigtes CM mit 60 g/l Sucrose und 5 mg/l Phosphinothricin (PPT) und in manchen Fällen 150 mg/l Timentin transferiert.
  • Phosphinothricin-resistente Kalli, die sich unter Selektion entwickelten, wurden auf Regenerationsmedium mit 5 mg/l PPT ausplattiert.
  • Die regenerierten PPTR-Pflanzengewebe wurde anfänglichen visuell auf die Abwesenheit des funktionellen IPT-Gens, das die zufällige Bildung von Sprossen in hormonfreiem Medium verursacht, getestet (Ooms et al., 1983, Theor. Appl. Genet., 66, 169–172; Smigocki, AC & Owens, LD., 1989, Plant Physiol., 91, 808–811; Smigocki, AC & Owens, LD., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5131–5135). Sekundäres Screening nach Pflanzen, die eine in planta zusammengefügte T-DNA-Region (9) tragen, und nach der Abwesenheit der T-DNA-Region aus plCH12022 und plCH12031 wurde mittels PCR-Analyse von PPTR-Pflanzengewebe nach der Anwesenheit der Integrase PhiC31 und IPT-Gen-Sequenzen durchgeführt.

Claims (33)

  1. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen oder Pflanzenzellen, die auf einem Chromosom stabil mit einer gewünschten DNA-Sequenz transformiert sind und eine gewünschte Funktion von der gewünschten DNA-Sequenz exprimieren können, wobei das Verfahren umfasst: (a) Behandeln von Pflanzenzellen oder Pflanzen mit mindestens zwei verschiedenen Vektoren, wobei (i) die mindestens zwei verschiedenen Vektoren so eingerichtet sind, dass sie miteinander mittels ortsspezifischer Rekombination in den Pflanzenzellen rekombinieren, um ein nichtreplizierendes Rekombinationsprodukt zu ergeben, das die gewünschte DNA-Sequenz enthält, (ii) die mindestens zwei verschiedenen Vektoren so eingerichtet sind, dass sie die gewünschte DNA-Sequenz in das Chromosom integrieren können, (iii) die gewünschte DNA-Sequenz Sequenzabschnitte von mindestens zweien der mindestens zwei verschiedenen Vektoren enthält, wobei die Sequenzabschnitte für die Expression der gewünschten Funktion von der gewünschten DNA-Sequenz nötig sind, und (b) Selektieren von Pflanzen oder Pflanzenzellen, die die gewünschte Funktion exprimieren.
  2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pflanzenzellen mit den mindestens zwei verschiedenen Vektoren Agrobakterium-vermittelt behandelt werden.
  3. Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei jeder der mindestens zwei verschiedenen Vektoren mit einer anderen Agrobakterium-Zelle verabreicht wird.
  4. Das Verahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei einer oder alle der mindestens zwei verschiedenen Vektoren ein funktionelles Cytokinin-Autonomie-Gen enthält, während die gewünschte DNA-Sequenz frei von einem funktionellen Cytokinin-Autonomie-Gen ist.
  5. Das Verfahren von Anspruch 1, wobei die Pflanzenzellen mit den mindestens zwei verschiedenen Vektoren mittels direktem Nukleinsäure-Transfer behandelt werden.
  6. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Schritt (a) das Bereitstellen einer ortsspezifischen Rekombinase umfasst, die für Rekombinationsstellen auf den mindestens zwei verschiedenen Vektoren spezifisch ist.
  7. Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei die ortsspezifische Rekombinase dadurch bereitgestellt wird, dass einer der mindestens zwei verschiedenen Vektoren eine exprimierbare Sequenz, die für die Rekombinase kodiert, enthält.
  8. Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Exprimierbarkeit der für die Rekombinase kodierenden Sequenz durch die ortsspezifische Rekombination zerstört wird.
  9. Das Verfahren nach einer der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Chromosom aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: ein nukleäres Chromosom, ein plastidäres Chromosom oder ein mitochondriales Chromosom.
  10. Das Verfahren nach einer der Ansprüche 1 bis 9, wobei die mindestens zwei verschiedenen Vektoren so eingerichtet sind, dass die gewünschte DNA-Sequenz T-DNA-Grenzsequenzen (T-DNA border sequences) aufweist, die die Integration der gewünschten DNA-Sequenz in das Chromosom erleichtert.
  11. Das Verfahren nach einer der Ansprüche 1 bis 9, wobei die mindestens zwei verschiedenen Vektoren so eingerichtet sind, dass die gewünschte DNA-Sequenz homologe Sequenzen enthält, die die Integration der gewünschten DNA-Sequenz in das Chromosom mittels homologer Rekombination erleichtern.
  12. Das Verfahren nach einer der Ansprüche 1 bis 9, wobei die mindestens zwei verschiedenen Vektoren für die ortsspezifische Integration in das Chromosom eingerichtet sind.
  13. Das Verfahren nach einer der Ansprüche 1 bis 12, wobei Schritt (b) das Screening nach Pflanzen oder Pflanzenzellen umfasst, die die gewünschte DNA-Sequenz in das Chromosom integriert enthalten.
  14. Das Verfahren nach einer der Ansprüche 1 bis 13, wobei Schritt (b) das Screening nach Zellen oder Pflanzen umfasst, in denen die ortsspezifische Rekombination zwischen den mindestens zwei verschiedenen Vektoren stattgefunden hat.
  15. Das Verfahren nach einer der Ansprüche 1 bis 14, wobei die mindestens zwei verschiedenen Vektoren so eingerichtet sind, dass die gewünschte DNA-Sequenz ein Selektionsmarkergen oder eine Sequenz enthält, die in Schritt (b) das Screening nach transformierten Pflanzen oder Pflanzenzellen, die die gewünschte DNA-Sequenz enthalten, ermöglicht.
  16. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei eine Teilsequenz eines der mindestens zwei verschiedenen Vektoren einen Selektionsmarker unter der translationalen Kontrolle eines internen Ribosomeneingangsstellenelementes (internal ribosome entry site element, IRES element) enthält.
  17. Das Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Selektionsmarker in den Pflanzenzellen nicht von einem der mindestens zwei verschiedenen Vektoren transkribiert werden kann, aber durch die ortsspezifische Rekombination unter die Kontrolle von genetischen Elementen gelangt, die die Transkription des Selektionsmarkers erlauben.
  18. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei Schritt (b) das Screening nach der Abwesenheit der mindestens zwei verschiedenen Vektoren und/oder Rekombinationsprodukten derselben umfasst mit der Ausnahme von Rekombiantionsprodukten, die die gewünschte DNA-Sequenz enthalten.
  19. Das Verfahren nach Anspruch 18, wobei (a) mindestens einer der mindestens zwei verschiedenen Vektoren oder (b) Rekombinationsprodukte der ortsspezifischen Rekombination, die die gewünschte DNA-Sequenz nicht enthalten, ein negatives Selektionsmarkergen (counter selectable marker gene) oder eine andere Sequenz enthalten, die das Screening gegen transformierte Zellen erlaubt, die die in (a) definierten Vektoren oder die in (b) definierten Rekombinationsprodukte enthalten.
  20. Das Verfahren nach Anspruch 19, wobei das negative Selektionsmarkergen oder die andere Sequenz, die das Screening gegen transformierte, die Vektoren enthaltenden Zellen erlaubt, unter translationaler Kontrolle eines internen Ribosomeneingangsstellenelements (IRES-Elements) ist.
  21. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die Expression der gewünschten Funktion von der gewünschten DNA-Sequenz Intron-vermitteltes cis-Spleißen umfasst.
  22. Das Verfahren nach Anspruch 21, wobei – ein erster Vektor der mindestens zwei verschiedenen Vektoren einen ersten Sequenzabschnitt enthält, der enthält: einen ersten Teil einer Sequenz, die für die zu exprimierende Funktion kodiert und stromabwärts davon einen 5'-Teil eines Introns, und – ein zweiter Vektor der mindestens zwei verschiedenen Vektoren einen zweiten Sequenzabschnitt enthält, der enthält: einen zweiten Teil einer Sequenz, die für die zu exprimierende Funktion kodiert und stromaufwärts davon einen 3'-Teil eines Introns.
  23. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die Pflanze oder die Pflanzenzellen von Schritt (a) mit drei oder mehr verschiedene Vektoren behandelt werden und wobei zwei oder mehr verschiedene transgene Pflanzen oder Pflanzenzellen hergestellt werden, wobei die verschiedenen transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen verschiedene gewünschte DNA-Sequenzen in ein Chromosom integriert enthalten.
  24. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die Pflanzenzellen mit zwei verschiedenen Vektoren behandelt werden und die gewünschte DNA-Sequenz einen Sequenzabschnitt von jedem dieser Vektoren enthält.
  25. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, umfassend die folgenden Schritte (A) und (B): (A) Behandeln von Pflanzen oder Pflanzenzellen mit einem Gemisch aus (i) einer Gruppe von m Primärvektoren, von denen jeder einen primären Sequenzabschnitt ausgewählt aus der Gruppe (a1, a2,..., am) enthält und (ii) einer Gruppe von n Sekundärvektoren, von denen jeder einen sekundären Sequenzabschnitt ausgewählt aus der Gruppe (b1, b2,..., bn) enthält, wobei m und n unabhängig voneinander beides ganze Zahlen > 1 sind, die Primärvektoren und die Sekundärvektoren so eingerichtet sind, dass jedes Element der Gruppe von Primärvektoren mit jedem Element der Gruppe von n Sekundärvektoren mittels ortsspezifischer Rekombination rekombinieren kann zur Erzeugung von Rekombinationsprodukten, die verschiedene gewünschte DNA-Sequenzen enthalten, jede gewünschte DNA-Sequenz ein Element der Gruppe von primären Sequenzabschnitten und ein Element der Gruppe von sekundären Sequenzabschnitten enthält, beide Elemente von Sequenzabschnitten für die Expression der gewünschten Funktion von der gewünschten DNA-Sequenz nötig sind, die Primärvektoren und die Sekundärvektoren für die Integration der gewünschten DNA-Sequenz in ein Chromosom eingerichtet sind, (B) Selektieren von transformierten Pflanzen oder Pflanzenzellen, die eine gewünschte Funktion von der gewünschten DNA-Sequenz exprimieren.
  26. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23 oder 25, umfassend die folgenden Schritte (A) und (B): (A) Behandeln von Pflanzen oder Pflanzenzellen mit einem Gemisch aus (i) einem Primärvektor, der einen primären Sequenzabschnitt a, enthält und (ii) einer Gruppe von n Sekundärvektoren, von denen jeder einen sekundären Sequenzabschnitt ausgewählt aus der Gruppe (b1, b2,..., bn) enthält, wobei n eine ganze Zahl > 1 sind, der primäre Sequenzabschnitt a1 für die Expression der Funktion eines sekundären Sequenzabschnitts (b1, b2,..., bn) nötig ist, der Primärvektor und die Sekundärvektoren so eingerichtet sind, dass der Primärvektor mit jedem Element der Gruppe von n Sekundärvektoren mittels ortspezifischer Rekombination rekombinieren kann zur Erzeugung von Rekombinationsprodukten, die verschiedene gewünschte DNA-Sequenzen des Typs (a1b1, a1b2,..., a1bn) oder des Typs (b1a1, b2a1,..., bna1) enthalten, der Primärvektor und die Sekundärvektoren für die Integration der gewünschten DNA-Sequenzen des Typs (a1b1, a2b2,..., a1bn) oder des Typs (b1a1, b2a1,..., bna1) in ein Chromosom eingerichtet sind, (B) Selektieren von transformierten Pflanzen oder Pflanzenzellen, die eine gewünschte Funktion von der gewünschten DNA-Sequenz exprimieren.
  27. Das Verfahren von Anspruch 25 oder 26, ferner umfassend das Bestimmen eines phänotypischen Merkmals einer transformierten Pflanze oder Pflanzenzellen, die in Schritt (B) selektiert wurden, anhand einer Funktion eines primären Sequenzabschnitts und/oder eines sekundären Sequenzabschnitts und/oder einer Kombination eines primären Sequenzabschnitts und eines sekundären Sequenzabschnitts.
  28. Transgene Pflanzen oder Teile derselben wie Samen, hergestellt oder herstellbar nach dem Verfahren eines der Ansprüche 1 bis 27.
  29. Die transgenen Pflanzen oder die Teile derselben gemäß Anspruch 28, wobei alle kodierenden Sequenzen und/oder exprimierbaren Sequenzen der gewünschten Sequenz pflanzlichen Ursprungs sind.
  30. Verwendung einer transgenen Pflanze oder Pflanzenzellen gemäß Anspruch 28 oder 29 zur Erzeugung einer zweiten transgenen Pflanze oder Pflanzenzellen, die eine extrachromosomale DNA enthalten, wobei das Erzeugen umfasst: das Induzieren der Bildung der extrachromosomalen DNA von der gewünschten DNA-Sequenz, die in die transgene Pflanze oder Pflanzenzellen von Anspruch 28 integriert ist.
  31. Die Verwendung gemäß Anspruch 30, wobei das Induzieren das Bereitstellen eines Faktors zu der transgenen Pflanze oder den Pflanzenzellen umfasst, wobei der Faktor die Bildung der extrachromosomalen DNA von der gewünschten DNA-Sequenz auslösen kann.
  32. Die Verwendung gemäß Anspruch 31, wobei das Bereitstellen des Faktors das Kreuzen der Pflanze oder der Pflanzenzellen mit einer Pflanze oder Pflanzenzellen, die in ihrem Genom den Faktor kodiert hat/haben, umfasst.
  33. Bibliothek von Pflanzen oder von Pflanzensamen, erhalten oder erhältlich gemäß einem der Ansprüche 25 bis 27.
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