JPH10327860A

JPH10327860A - マーカー遺伝子を必要に応じて除去できる植物への遺伝子導入用ベクター

Info

Publication number: JPH10327860A
Application number: JP9118938A
Authority: JP
Inventors: Koichi Sugita; 耕一杉田; Mikiko Yamakado; 幹子山門; Etsuko Matsunaga; 悦子松永; Hiroyasu Ebinuma; 宏安海老沼
Original assignee: Nippon Paper Industries Co Ltd; Jujo Paper Co Ltd
Current assignee: Nippon Paper Industries Co Ltd; Jujo Paper Co Ltd
Priority date: 1996-05-09
Filing date: 1997-05-09
Publication date: 1998-12-15

Abstract

(57)【要約】【課題】目的遺伝子と共に植物細胞へ導入されたマー
カー遺伝子を、その発現後に必要に応じて、これが存在
し、機能する染色体等のＤＮＡから除去してその機能を
消失させることができ、しかもかかるマーカー遺伝子の
機能の発現・消失を、その導入された植物細胞に由来す
る組織の形態変化により検出することができる、植物へ
の遺伝子導入用ベクターを提供する。【解決手段】マーカー遺伝子として形態異常誘導遺伝
子を用い、一方、脱離能を有するＤＮＡ因子を発現誘導
型の調節因子の制御下において、形態異常誘導遺伝子が
この脱離能を有するＤＮＡ因子と挙動を一つにする位置
に存在し、かつ、目的遺伝子がこれとは挙動を一つにす
ることのない位置に存在するよう、ベクターを構築す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子工学的手法によ
り目的遺伝子を植物に導入して形質転換植物を得る際に
有用な新規ベクターに関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子工学技術を利用した微生物、培養
細胞などの形質転換は、現在、医薬品として有用な生理
活性物質の生産等の目的に応用され、実産業においても
多大の貢献をなしている。植物育種の分野においては、
植物細胞のライフサイクルが微生物等に比較して長いこ
と等の理由から、遺伝子工学技術の実産業への応用はや
や遅れているが、この技術は、目的とする遺伝子を直
接、育種の対象となる植物に導入することを可能とする
ため、（ａ）改変すべき形質のみが導入できる、（ｂ）
植物以外の種（微生物等）の形質も植物に導入できる、
（ｃ）育種期間の大幅な短縮ができるなど、交配を重ね
て行う古典的な育種と比べて多くのメリットを有し、そ
の応用は、植物育種の飛躍的進歩をもたらすものと期待
され、またこの期待は現実のものとなりつつある。

【０００３】具体的に、目的遺伝子を対象植物に導入
し、遺伝子導入植物を作成するには（１）目的遺伝子の
植物細胞への導入（染色体、核等に導入される場合も含
む。）、（２）目的遺伝子が導入された細胞のみからな
る植物組織の選抜、（３）選抜された植物組織からの植
物体の再生、の３段階を必ず経ることになる。また、こ
のうち、目的遺伝子導入組織の選抜にあたっては通常、
マーカー遺伝子を使用する。即ち、これを目的遺伝子と
共に植物細胞へ導入し、その導入細胞、ひいてはこの細
胞から生ずる組織がマーカー遺伝子の発現によって示す
特徴的な性質を、目的遺伝子導入の指標として用いるの
が普通である。従って、遺伝子工学的手法によって形質
転換された植物は、現在のところ殆ど例外なく、目的遺
伝子の他にマーカー遺伝子が導入され、発現している。

【０００４】しかし、このようにマーカーとして使用さ
れる遺伝子の遺伝子産物に関しては、まだごく一部の遺
伝子につき、人体への安全性が確認されたのみである。
このため、たとえマーカー遺伝子を用い、有用な形質を
導入したトマトやジャガイモが作出できたとしても、こ
のマーカー遺伝子が発現している限り、これらを、例え
ば食用として供給することについては、消費者の漠然と
した不安感によるものも含め、多くの障害が予想され
る。

【０００５】さらに、遺伝子導入組織を選抜した後にお
いては、マーカー遺伝子の発現は、植物育種を目的とす
る研究者のレベルにおいても、大きな障害を与える。す
なわち、あるマーカー遺伝子を用いて作成された遺伝子
導入植物に対して、さらに別の遺伝子を新たに導入しよ
うとする場合には、二度と、同一のマーカー遺伝子を用
いて遺伝子導入を行うことができない。すでに、対象と
なる植物には、このマーカー遺伝子が存在しているた
め、再びこれを、新たな目的遺伝子と共にその同じ植物
に導入しても、新たな目的遺伝子が導入されようがされ
まいが、その植物においてはこのマーカー遺伝子が常に
発現し、これを目的遺伝子導入の指標とすることは、も
はやできないからである。従って、ある植物に対して遺
伝子導入を繰り返すことができる数は、その植物に対し
て何種類の異なったマーカー遺伝子を使用できるかによ
って、自ずから制約を受けることとなる。しかし、現在
実用できるマーカー遺伝子の種類はさして多くない。し
かも、これらのマーカー遺伝子全てが、対象となる植物
に使用できるわけではないのである。

【０００６】これらの問題を解決し、マーカー遺伝子に
よる影響から完全に解放された遺伝子導入組織・植物を
効率良く作成するため、本発明者らは先に、目的遺伝子
を植物細胞へ導入するための新規なベクターを開発した
（特願平７−３１３４３２）。これは、目的遺伝子、マ
ーカー遺伝子として形態異常誘導遺伝子、及び脱離能を
有するＤＮＡ因子を含み、かつ、形態異常誘導遺伝子は
この脱離能を有するＤＮＡ因子と挙動を一つにする位置
に存在し、また目的遺伝子はこの脱離能を有するＤＮＡ
因子とは挙動を一つにすることがない位置に存在する、
という構成を有するものであり、これを用いて植物細胞
中へ遺伝子導入を行うと、目的遺伝子と共に導入された
マーカー遺伝子は、その発現後に一定の確率で、これが
存在し、機能していたＤＮＡ上から脱離してその機能を
失い、しかもそのマーカー遺伝子の機能の発現も消失
も、これが導入された植物細胞に由来する組織の形態変
化として検出することができる。即ち、このマーカー遺
伝子が発現している細胞から由来して形成された組織
は、なにがしかの異常な形態を示し、また、その後かか
る組織から、このマーカー遺伝子が脱離して機能を消失
した細胞（換言すれば目的遺伝子のみが導入されている
細胞）が生じた場合には、正常な形態をした組織が、こ
の細胞に由来して再び出現するようになるのである。そ
れ故このベクターは、目的遺伝子のみが導入されている
細胞からなる植物組織、さらには植物体を、遺伝子導入
細胞の培養と、培養して得られた組織の肉眼による選抜
とを繰返すだけで得ることを可能とする。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかし、本発明者らの
開発したこのベクターにおいても、マーカー遺伝子の脱
離を任意に制御することはできなかった。そのため、脱
離能を有するＤＮＡ因子の能力が高い場合には、マーカ
ー遺伝子が極めて速やかに脱離して、例えば、目的遺伝
子と共に植物細胞へ導入した直後、その発現前にマーカ
ー遺伝子が脱離してしまうことも起こり得たが、こうな
ると、目的遺伝子のみが導入されている細胞からなる組
織が得られたとしても、マーカー遺伝子の働きによる遺
伝子導入組織の形態変化は全く起こらず、結局、かかる
組織を選抜することができなくなる。

【０００８】また、マーカー遺伝子の脱離が任意に制御
できたならば、目的遺伝子のみが導入されている細胞の
発生、そしてかかる細胞からなる植物組織の発生を同期
させたり、適宜調整することも可能となるので、実際に
このようなベクターを使用して遺伝子導入植物を作出等
する上で、非常に便利となる。

【０００９】従って本発明の目的は、マーカー遺伝子を
有し、かつ、目的遺伝子と共に植物細胞へ導入されたこ
の遺伝子を、その発現後に必要に応じて、これが存在
し、機能する染色体等のＤＮＡから除去してその機能を
消失させることができ、しかもかかるマーカー遺伝子の
機能の発現・消失を、その導入された植物細胞に由来す
る組織の形態変化により検出することができる、植物へ
の遺伝子導入用ベクターを提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明の目的は、マーカ
ー遺伝子として形態異常誘導遺伝子を用い、また脱離能
を有するＤＮＡ因子を発現誘導型の調節因子の制御下に
おいて、形態異常誘導遺伝子がこの脱離能を有するＤＮ
Ａ因子と挙動を一つにする位置に存在し、かつ、目的遺
伝子がこの脱離能を有するＤＮＡ因子とは挙動を一つに
することのない位置に存在するようベクターを構築する
ことにより、達成することができる。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。

【００１２】ここで形態異常誘導遺伝子とは、植物の組
織に、矮化、頂芽優勢の崩壊、色素の変化、根頭癌腫、
毛状根、葉の波打ち等の、通常と異なる形態分化を引起
こす遺伝子を意味する。例えば、これらの形態異常誘導
遺伝子としては、すでに、ｉｐｔ（isopentenyltransfe
rase）遺伝子（A.C.Smigocki、L.D.Owens 、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA、85:5131 、1988）、ｉａａＭ（tryptoph
an monooxygenase）遺伝子（H.J.Klee et al. 、GENES
& DEVELOPMENT 、1:86、1987）、ｇｅｎｅ５遺伝子
（H.koerber et al.、EMBO Journal、10:3983 、199
1）、ｇｅｎｅ６ｂ遺伝子（P.J.J.Hooyaas et al.、P
lant Mol.Biol. 、11:791、1988）、及びｒｏｌＡ〜Ｄ
のｒｏｌ遺伝子群（F.F.White et al.、J.Bacteriol.、
164:33、1985）等、それぞれ特異的な遺伝子が、各種の
植物に癌腫、奇形腫（すなわち不定芽・不定根等の形
成）を引起こす細菌である、アグロバクテリウム等に存
在していることが報告されており、また、シュードモナ
ス・シリンガエの亜種（Pseudomona s syringae subsp.
savastanoi ）ではｉａａＬ（indoleacetic acid-lysi
ne synthetase ）遺伝子（A.Spena et al.、Mol.Gen.Ge
net.、227:205 、1991）の存在が、さらに種々の植物か
らもホメオボックス遺伝子やフィトクローム遺伝子等の
存在が報告されている。

【００１３】これらの遺伝子は、いずれも本発明におい
て使用することができるが、中でも特に、頂芽優勢の崩
壊を引き起こすｉｐｔ遺伝子や、毛状根の形成、及び毛
状根から再生した植物の矮化や葉の波打ち等を引き起こ
すｒｏｌ遺伝子群は、種々の形態異常誘導遺伝子の中で
も特徴的な形態の異常を引き起こすことから、本発明に
使用するマーカー遺伝子として好ましい。

【００１４】さらに、これらの形態異常誘導遺伝子はま
た、互いに組み合わせることにより、それが導入された
特定の植物に、不定芽・不定根等の特定の構造を再分化
させるよう設計することも可能である。本発明において
は、このような遺伝子の組み合わせを利用し、遺伝子導
入のターゲットとなる植物の種類等、遺伝子導入植物の
作成条件に応じて形態異常誘導遺伝子を構築し、用いる
こともできる。

【００１５】また、脱離能を有するＤＮＡ因子とは、こ
れらが存在し、機能する染色体ＤＮＡ等から、それ自身
が脱離し得る能力を有するＤＮＡ配列をいう。植物では
このような因子として、染色体上に存在するトランスポ
ゾンと呼ばれるものが知られており、その構造と働き、
そしてその挙動もほぼ判明している。すなわち、トラン
スポゾンが機能するためには、原則として、その内部に
ある遺伝子から発現し、それ自身の脱離及び転移を触媒
する酵素（転移酵素）と、やはりその内部の末端領域に
存在し、この転移酵素が結合し作用するＤＮＡ配列とい
う、２つの構成要素が必要とされる。これらの働きによ
り、トランスポゾンはその存在する染色体上から脱離
し、その後、普通はＤＮＡ上の新たな位置に転移する
が、一定の確率で転移できぬままその機能を失い、消失
等する場合も生ずるので、本発明ではこのようなトラン
スポゾンの転移ミスを利用する。

【００１６】なお、トランスポゾンには、このような自
律性トランスポゾン、すなわち、転移酵素とＤＮＡ結合
配列という２つの要素を保持していて、トランスポゾン
内部から発現する転移酵素が末端領域に存在するＤＮＡ
配列に結合して作用することにより、自律的にその存在
する染色体上から脱離して転移しうるものの他、非自律
性トランスポゾンと呼ばれるタイプもある。この非自律
性トランスポゾンとは、転移酵素が結合し作用する末端
のＤＮＡ配列は保持しているものの、内部にある転移酵
素遺伝子に変異が生じており、転移酵素の発現がないた
め、自律的に染色体上から脱離することができないもの
をいうが、しかし、非自律性トランスポゾンも、自律性
トランスポゾンあるいはこれとは独立して存在する転移
酵素遺伝子から転移酵素が供給されると、自律性トラン
スポゾンと同様の挙動を示すこととなる。

【００１７】従って、本発明においては、自律性、非自
律性のいずれのトランスポゾンを使用することもでき
る。つまり、非自律性のトランスポゾンを用いる場合に
は、その内部に、形態異常誘導遺伝子の他、自律性トラ
ンスポゾン等から取得、または合成した転移酵素遺伝子
を挿入して使用すればよい。

【００１８】現在、単離されている自律性トランスポゾ
ンとしては、トウモロコシより単離されたＡｃとＳｐｍ
があり、詳細な解析がなされている（A.Gieri and H.Sa
edler 、Plant Mol.Biol. 、19:39 、1992）。とりわけ
Ａｃは、トウモロコシの染色体中、ｗｘ−ｍ７遺伝子座
を制限酵素Ｓａｕ３Ａで切出すことにより得ることがで
きる（U.Behrens et al.、Mol.Gen.Genet.、194:346 、
1984）、植物トランスポゾンの中では最も解析の進んで
いる自律性トランスポゾンであり、そのＤＮＡシーケン
スも既に解明されているので（M.Mueller-Neumann et a
l.、Mol.Gen.Genet.、198:19、1984）当業者が容易に取
得可能なことから、本発明に使用するＤＮＡ因子として
相応しい。また、非自律性トランスポゾンとしては、そ
れぞれＡｃ、Ｓｐｍの内部領域が欠損したものである、
ＤｓやｄＳｐｍを始め（H.-P.Doering and P.Starlinge
r 、Ann.Rev.Genet.、20:175、1986）種々のものが、ト
ウモロコシ以外にも、キンギョソウ、アサガオ等の多く
の植物から単離されている（例えば、Y.Inagaki et a
l.、Plant Cell、6:375 、1994）。ちなみに、これらの
トランスポゾンは、その由来する植物と異なる種類の植
物の染色体に導入された場合でも、その能力を発揮して
脱離し、転移することが多くの例で知られている（例え
ば、B.Baker et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、83:484
4 、1986）。

【００１９】さらに、植物以外に存在する脱離能を有す
るＤＮＡ因子としては、部位特異的組換え系（site-spe
cific recombination system）に由来するものが知られ
ている。この部位特異的組換え系は、特徴的なＤＮＡ配
列を有する組換え部位（本発明の脱離能を有するＤＮＡ
因子にあたる。）、及びこのＤＮＡ配列（組換え配列）
に特異的に結合して、その配列が２以上存在したとき、
その配列間の組換えを触媒する酵素、という２つの要素
からなっており、そして、この組換え配列が同一ＤＮＡ
分子上に、同一方向を向いてある一定の間隔で２か所存
在している場合には、これに挟まれた領域がこのＤＮＡ
分子（プラスミド、染色体等）から脱離し、またこの配
列が対向する方向を向いて２か所存在している場合に
は、この領域が反転する、という挙動を示す。本発明で
は、この前者の脱離作用を利用するが、このような組換
え部位の脱離・反転は、部位特異的組換え系によるいわ
ゆる相同的組換えの結果として生ずるものであり、これ
が、転移の過程としてその脱離を起こす、トランスポゾ
ンを用いた場合の機構ともっとも異なる点である。なお
組換え酵素をコードする遺伝子は、必ず組換え部位と同
一のＤＮＡ分子上に存在する必要はなく、これと同一細
胞内に存在し、発現していさえすれば、この組換え配列
間の脱離・反転を生ぜしめ得ることが知られている（N.
L.Craig Annu.Rev.Genet. 、22:77 、1988）。

【００２０】現在、部位特異的組換え系はファージ、細
菌（例えば大腸菌）、酵母等の微生物から分離されたＣ
ｒｅ／ｌｏｘ系、ｐＳＲ１系、ＦＬＰ系、ｃｅｒ系、ｆ
ｉｍ系等が知られているが（総説として、N.L.Craig 、
Annu.Rev.Genet. 、22:17 、1988）、高等生物ではまだ
その存在を知られていない。しかし、これらの微生物か
ら分離された部位特異的組換え系も、Ｐ１ファージ由来
のＣｒｅ／ｌｏｘ系が植物への遺伝子導入用ベクターに
利用されて、植物中でもその機能を発揮するなど（国際
公開WO93/01283号公報）、その由来する生物種と異なる
生物種（植物を含む）に導入された場合でも、そのそも
そもの生物内における挙動と同一の挙動をとることが知
られている。ちなみに本発明の実施例では、酵母（Zygo
saccharo myces rouxii ）の部位特異的組換え系である
ｐＳＲ１系（H.Matsuzaki et al.、J.Bacteriology、17
2:610 、1990）を、その組換え部位に組換え酵素を挿入
して利用したが、このｐＳＲ１系もまた、高等植物にお
いてその本来の機能を発揮することがすでに報告されて
いる（H.Onouchi et al 、Nucleic Acid Res. 、19:637
3 、1991）。

【００２１】本発明においては、この脱離能を有するＤ
ＮＡ因子を発現誘導型の調節因子の制御下におく。

【００２２】即ち、細菌等の原核生物から酵母、カビ、
高等植物、哺乳類等の真核生物に至る全ての生物の遺伝
子には、その構造遺伝子の上流領域に発現誘導型の調節
因子が存在し、これらが単独で、あるいは幾つかが協働
して機能することにより、ある遺伝子または遺伝子群の
発現を制御しており、例えば、時には個体の分化や発育
のステージに応じ、時には熱、光、金属等の様々な環境
要因に応じて、遺伝子発現のオン・オフを行っている。
本発明ではこのような働きを有する発現誘導型の調節因
子を利用し、この下流域に脱離能を有するＤＮＡ因子を
配置して、その発現、つまりは脱離能を制御するのであ
る。

【００２３】かかる発現誘導型の調節因子としては現在
までに、化学物質に反応するものとしてグルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼＩ系遺伝子のプロモーター（特
開平5-268965号公報）、グルタチオン−Ｓ−トランスフ
ェラーゼＩＩ系（ＧＳＴ−ＩＩ）遺伝子のプロモーター
（国際公開WO93/01294号公報）、Ｔｅｔリプレッサー融
合型カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター
（C.Gatz et al. 、Mol.Gen.Genet.、227:229 、199
1）、Ｌａｃオペレーター／リプレッサー系プロモータ
ー（R..Wilde et al. 、The EMBO Journal、11:1251 、
1992）、ａｌｃＲ／ａｌｃＡ系プロモーター（国際公開
WO94/03619号公報）、グルココルチコイド系プロモータ
ー（青山卓史、蛋白質核酸酵素、41:2559 、1996）
等が、熱に反応するものとしてｈｓｐ８０プロモーター
（特開平5-276951号公報）等が、そして光に反応するも
のとしてリブロース２リン酸カルボキシラーゼ小サブユ
ニット遺伝子（ｒｂｃＳ）のプロモーター（R.Fluhr et
al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、83:2358 、1986）、フ
ルクトース−１、６−ビスホスファターゼ遺伝子のプロ
モーター（特表平7-501921号公報）、集光性クロロフィ
ルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（特開平
5-89号公報）等が知られている。

【００２４】このうち、高等植物の発現誘導型調節因子
として最も研究が進んでいるのはｒｂｃＳのプロモータ
ーであり、Ｃｈｕａらにより詳細な解析が行われている
（例えば、松岡、植物細胞工学臨時増刊、3:552 、1991
を参照）。それ故、本発明の実施例１でもこの調節因子
を使用したが、この因子がいかにして光による遺伝子発
現調節を行うかは、現状ではまだ確定していない。一
方、ＧＳＴ−ＩＩ遺伝子のプロモーターを代表とする化
学物質反応性のプロモーターは、遺伝子発現の誘導を化
学物質の存在量によって比較的自由に制御できるため、
熱や光を調節して遺伝子発現を制御しなければならな
い、熱あるいは光反応性のプロモーターよりも、実用
上、使いやすいというメリットを有する。

【００２５】なお本発明において、形態異常誘導遺伝子
を挿入する場所は、脱離能を有するＤＮＡ因子と共に、
これが脱離し得る位置でありさえすればよい。例えば、
脱離能を有するＤＮＡ因子としてトランスポゾンを用い
た場合には、転移酵素遺伝子のプロモーター領域より上
流で、この転移酵素が結合する末端領域よりは下流の、
トランスポゾンの脱離に影響を及ぼさない位置にこれを
挿入することができる。またｐＳＲ１系を用いた場合に
は、組換え配列に挟まれた領域内で、組換え酵素の発現
を阻害しない位置でありさえすれば、これをどこにでも
挿入することができる。

【００２６】本発明のベクターは、遺伝子工学的手法に
より遺伝子導入が可能な、いかなる植物においても用い
ることができ、また、本発明のベクターにより植物に導
入できる目的遺伝子は、農業的に優れた形質を付与でき
る遺伝子、農業的に優れた形質を付与するとは限らない
が、遺伝子発現機構の研究に必要とされる遺伝子等、目
的に応じて種々選択することができる。

【００２７】また、かかる目的遺伝子のプロモーター、
ターミネーターについては、植物において機能するもの
でありさえすれば、別に制限なく使用することができ
る。例えば、このようなプロモーターとしては、カリフ
ラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター（J.T.Od
ell et al.、Nature（London）、313:810 、1985）、ノ
パリン合成酵素のプロモーター（W.H.R.Langridge et a
l.、Plant Cell Rep. 、4:355 、1985）等を、またター
ミネーターとしては、ノパリン合成酵素のポリアデニル
化シグナル（A.Depicker et al. 、J.Mol.Appl.Gen. 、
1:561 、1982）、オクトピン合成酵素のポリアデニル化
シグナル（J.Gielen et al. 、EMBO J. 、3:835 、198
4）等を使用することができる。

【００２８】さらに、本発明において使用する遺伝子、
すなわちＤＮＡは、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのクロ
ーニングにより得ることができるが、あらかじめそのシ
ーケンスが明らかにされているものであれば、これを化
学合成して得ることもできる。

【００２９】本発明のベクターは、植物に感染するウイ
ルスや細菌を介して、植物細胞に間接的に導入すること
ができる（I.Potrykus、Annu.Rev.Plant Physiol.Plant
Mol.Biol.、42:205、1991）。この場合、例えば、ウイ
ルスとしては、カリフラワーモザイクウイルス、ジェミ
ニウイルス、タバコモザイクウイルス、ブロムモザイク
ウイルス等が使用でき、細菌としては、アグロバクテリ
ウム・ツメファシエンス（以下、Ａ．ツメファシエンス
と略す。）、アグロバクテリウム・リゾジェネス等が使
用できる。なおアグロバクテリウム属は、一般に単子葉
植物には感染せず、双子葉植物にのみ感染するとされて
いるが、最近では、これらを単子葉植物へ感染させて遺
伝子導入を行った例も報告されている（例えば、国際公
開WO94/00977号公報）。

【００３０】本発明のベクターはまた、マイクロインジ
ェクション法、エレクトロポレーション法、ポリエチレ
ングリコール法、融合法、高速バリスティックベネトレ
ーション法等の物理的・化学的手法によっても、植物細
胞に直接導入することができる（I.Potrykus、Annu.Re
v.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.、42:205、1991）。
単子葉植物の多くやアグロバクテリウムの感染しにくい
双子葉植物に対しては、遺伝子導入法として汎用されて
いるアグロバクテリウムを用いた間接導入法が使用でき
ないため、これらの直接導入法が有効である。

【００３１】

【作用】本発明において、マーカー遺伝子として用いた
形態異常誘導遺伝子は、これが発現することにより、そ
の導入された植物細胞において、植物成長ホルモンの異
常生産等、その細胞内の生理状態に異常をもたらし、結
果としてその増殖・分化の方向を狂わせ、これに由来し
て形成される組織に様々な形態異常を引き起こす。つま
り、ここで生じる異常な形態をした組織、例えば頂芽優
勢の崩れた無秩序な芽の集合体（多芽体）や毛状根等
は、こうした形態異常誘導遺伝子が導入された細胞に由
来し、これが異常な増殖・分化をした結果生じたもので
あるので、この遺伝子を有する細胞のみからなってい
る。従って、これをマーカー遺伝子として目的遺伝子と
共にベクターを構築し、このベクターを植物細胞に導入
してこの細胞を培養しさえすれば、これから生じる異常
な形態を示す組織を肉眼で選抜することのみにより、マ
ーカー遺伝子、つまりは目的遺伝子が導入された細胞だ
けからなる組織を選抜できることとなる。

【００３２】さらに本発明では、この形態異常誘導遺伝
子を、発現誘導型の調節因子の制御下におかれた脱離能
を有するＤＮＡ因子と挙動を一つにする位置に組込んで
用いる。かかる構成を有するベクターを用いて植物に遺
伝子を導入すれば、導入後、その植物細胞に熱、光、化
学物質等、使用した発現誘導型調節因子に応じた適当な
刺激を人為的に加えることで、脱離能を有するＤＮＡ因
子を発現させることができ、その結果、マーカー遺伝子
である形態異常誘導遺伝子はこのＤＮＡ因子と共に、そ
れらが導入され機能していたＤＮＡ上から、一定の確率
で脱離してその機能を失い、一方、これとは挙動を一つ
にしない目的遺伝子は同じＤＮＡ上に残留して機能を保
持し続ける、つまり、目的遺伝子のみが発現可能に導入
されている細胞が得られることになる。

【００３３】しかもこのマーカー遺伝子、つまり形態異
常誘導遺伝子の機能の消失は、遺伝子導入の際と同様
に、遺伝子導入組織の形態の変化として肉眼で検出でき
ることから、マーカー遺伝子の機能の消失した細胞だけ
からなる組織、換言すれば、目的遺伝子のみが発現可能
に導入されている細胞だけからなる組織は、確実・容易
に選抜できることとなる。すなわち、かかる細胞だけか
らなる組織を得るためには、まず、遺伝子導入処理後の
細胞を培養して、形態異常誘導遺伝子の発現により生じ
てくる多芽体、毛状根等、異常な形態を示す組織を肉眼
で選抜し、これを分離する。そして、その分離した組織
の培養中に、必要に応じて、使用した発現誘導型調節因
子に応じた適当な刺激を加えてやれば、これらの形態異
常を示す組織から今度は正常な形態を示す組織が生じて
くるので、これをやはり肉眼で選抜すればよい。

【００３４】

【実施例】以下に、本発明を実施例に基づいて説明す
る。なお、以下の実施例において、更に詳細な実験操作
は、特に述べる場合を除き、モレキュラー・クローニン
グ第２版（Sambrook et al.eds. 、Cold Spring Harbar
Laboratory Press 、New York、1989）、又は製造業者
の取扱い説明書に従い行われた。

【００３５】［実施例１］I ．ベクターの作成特願平７−３１３４３２において得られたｐＮＰＩ１２
５より、酵母の部位特異的組換え系（ｐＳＲ１系）の組
換え酵素遺伝子（以下、Ｒ遺伝子とする。）とこれに連
結されたノパリン合成酵素ポリアデニル化シグナルを制
限酵素ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩで切出し、これをｐＨＳ
Ｇ３９８（宝酒造（株）より購入）のＸｂａＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ制限酵素部位間に挿入してプラスミドｐＮＰＩ２０
０を得た。

【００３６】一方、リブロース−１、５−ビスリン酸カ
ルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子のプロモーター
（ｒｂｃＳ−３Ｂ）を含むプラスミド（名古屋大学杉
田護氏より譲渡）を制限酵素ＫｐｎＩで切断し、その切
断により生じた突出末端をＴ４ポリメラーゼＩ（大サブ
ユニット）にて平滑化した後、ここに５´リン酸化Ｓａ
ｌＩリンカーを挿入してプラスミドｐＲＢＣＳを作成
し、このｐＲＢＣＳからｒｂｃＳ−３Ｂを制限酵素Ｓａ
ｌＩで切出してｐＮＰＩ２００のＳａｌＩ制限酵素部位
に挿入し、プラスミドｐＮＰＩ２０１を得た。

【００３７】なお、このｒｂｃＳ−３Ｂは、トマト（Ly
copersicon esculentum VFNT LA1221）に由来する光反
応性のプロモーターである。トマトはｒｂｃＳの発現誘
導型調節因子として、この他に５種類の同様のプロモー
ターを有しているが（ｒｂｃＳ−１、−２、−３、−３
Ａ、−３Ｃ）、その発現様式は杉田らにより解析されて
いる（M.Sugita et al. 、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、8
4:7104 、1987）。

【００３８】次に、このｐＮＰＩ２０１を制限酵素Ｐｓ
ｔＩ及びＢａｍＨＩで切断し、その突出末端をＴ４ポリ
メラーゼＩ（大サブユニット）にて平滑化した後、再連
結して、これをプラスミドｐＮＰＩ２０２とした。この
ｐＮＰＩ２０２より、ｒｂｃＳ−３Ｂ、Ｒ遺伝子及びノ
パリン合成酵素ポリアデニル化シグナルを含む断片を制
限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切出し、これをｐ
ＵＣ１１９（宝酒造（株）より購入）のＥｃｏＲＩ−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位間に挿入して、プラスミドｐ
ＮＰＩ２０３を作成し、さらにこのｐＮＰＩ２０３よ
り、再びｒｂｃＳ−３Ｂ、Ｒ遺伝子及びノパリン合成酵
素ポリアデニル化シグナルを含む断片を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切出して、特願平７−３１３４
３２において得られたｐＮＰＩ１２８のＥｃｏＲＩ−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位間に挿入することにより、プ
ラスミドｐＮＰＩ２０４を得た。

【００３９】そしてこのｐＮＰＩ２０４のＨｉｎｄＩＩ
Ｉ制限酵素部位に、やはり特願平７−３１３４３２にお
いて得られたｐＮＰＩ１２３より制限酵素ＨｉｎｄＩＩ
Ｉにて切出した、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ
プロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）とこれに
連結されたｉｐｔ遺伝子を含む断片を挿入して、プラス
ミドｐＮＰＩ２０５を得た。

【００４０】目的とするベクターは、このｐＮＰＩ２０
５から、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターに連結されたｉｐ
ｔ遺伝子、ｒｂｃＳ−３Ｂに連結されたＲ遺伝子及びノ
パリン合成酵素ポリアデニル化シグナル、そしてこれら
の両端にある酵母の部位特異的組換え系の組換え配列Ｒ
ｓを制限酵素ＰｓｔＩで切出して、植物への遺伝子導入
用ベクタープラスミドｐＢＩ１２１（東洋紡績（株）よ
り購入）のＳｓｅＩ制限酵素部位に挿入することにより
得られ、これをプラスミドｐＮＰＩ２０６と命名した。
このプラスミドを有するＡ．ツメファシエンスを植物に
感染させた場合、その構造の内、いわゆるＴ−ＤＮＡ領
域と呼ばれるＲＢサイトとＬＢサイトの内側、ここでは
ｎｐｔＩＩ遺伝子（ネオマイシンリン酸化酵素遺伝子）
部位からＧＵＳ遺伝子（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）
部位にかけての約１２．５ｋｂの領域が植物染色体に組
込まれることになる。

【００４１】なお、このプラスミドｐＮＰＩ２０６は、
大腸菌（Escherichia coli ）ＪＭ１０９株に導入し、
この大腸菌をＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐＮＰＩ２０
６）（受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−５５１８号）とし
て、国際寄託に付した。

【００４２】ｐＮＰＩ２０６の作成スキムを図１〜４
に、そのＴ−ＤＮＡ領域の制限酵素地図を図５に示す。
また、ｐＮＰＩ１２５の作成スキムは図６、ｐＮＰＩ１
２８の作成スキムは図７、ｐＮＰＩ１２３の作成スキム
は図８〜１１に示した。なお、これらの図中、３５Ｓ−
Ｐはカリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモータ
ー、ＮＯＳ−Ｐはノパリン合成酵素のプロモーター、Ｔ
は同じくノパリン合成酵素のポリアデニル化シグナル、
丸で囲ったＴはｉｐｔ遺伝子自身のポリアデニル化シグ
ナルであり、網かけした三角形は組換え配列Ｒｓとその
配列方向を表している。

【００４３】図５より明らかなように、このプラスミド
はＴ−ＤＮＡ領域、即ち植物染色体に組込まれることに
なる領域内に、マーカー遺伝子としてｉｐｔ遺伝子を、
目的遺伝子のモデルとしてｎｐｔＩＩ遺伝子及びＧＵＳ
遺伝子を有している。このｉｐｔ遺伝子は、病原性Ａ．
ツメファシエンスが保持する腫瘍化遺伝子の一員であ
り、これを植物細胞に導入すると、植物ホルモンの一種
であるサイトカイニンの過剰生産が起こり、その細胞の
分化の方向が多芽体形成に向かうことになる。また、ｎ
ｐｔＩＩ遺伝子はカナマイシン抵抗性に寄与する遺伝子
として、ＧＵＳ遺伝子はこれを有する細胞が特殊な基質
を代謝して青色の色素を生産することから、ともに植物
における遺伝子発現の解析に汎用されている遺伝子であ
る。

【００４４】そして、このプラスミドにおいて脱離能を
有するＤＮＡ因子として機能するのは、酵母の部位特異
的組換え系であるｐＳＲ１系の組換え配列、Ｒｓ間の領
域であり、それ故、ｉｐｔ遺伝子は、同一方向を向いた
この二つの組換え配列Ｒｓに挟まれた形で挿入されてい
る。しかし同時に、Ｒｓ間の脱離を触媒する酵素の遺伝
子であるＲ遺伝子は発現誘導型の調節因子、即ち光反応
性プロモーターｒｂｃＳ−３Ｂの下流域に連結されてお
り、そのためこのプロモーターの制御を受けて、適当な
光条件下でなければこれが発現しないように、つまりＲ
ｓ間の脱離が起こらないようになっている。

【００４５】II．アグロバクテリウムへのｐＮＰＩ２０
６の導入Ａ．ツメファシエンスＬＢＡ４４０４（ＣＬＯＮＴＥＣ
Ｈ社より購入）株を、１０ｍｌのＹＥＢ液体培地（ビー
フエキス５ｇ／ｌ、酵母エキス１ｇ／ｌ、ペプトン１ｇ
／ｌ、ショ糖５ｇ／ｌ、２ｍＭＭｇＳＯ₄、２２℃で
のｐＨ７．２（以下、特に示さない場合は、２２℃での
ｐＨとする。））に接種し、ＯＤ₆₃₀が０．４から０．
６の範囲に至るまで、２８℃で培養した。培養液を６９
００×ｇ、４℃、１０分間遠心して集菌した後、菌体を
２０ｍｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ８．０）
に懸濁して、再度６９００×ｇ、４℃、１０分間の遠心
で集菌し、次いでこの菌体を２００μｌのＹＥＢ液体培
地に懸濁して、これをプラスミド導入用菌液とした。

【００４６】アグロバクテリウムへのプラスミドｐＮＰ
Ｉ２０６の導入は、１５ｍｌチューブ（ファルコン社）
内で、このプラスミド導入用菌液２００μｌとI で作成
したｐＮＰＩ２０６６μｇを混合し、これを、あらか
じめ液体窒素中で３０〜４０分間冷却しておいたエタノ
ールにチューブごと５分間浸して冷却した後、２９℃の
水浴中に２５分間置き、次いで、７５０μｌのＹＥＢ液
体培地を加えて、２９℃で１時間、振盪培養することに
より行った。

【００４７】III ．アグロバクテリウムからタバコへの
ｐＮＰＩ２０６の導入及びｐＮＰＩ２０６が導入された
タバコ細胞の培養と得られた組織の形態温室内で生育させたタバコ（Nicotiana tabacum cv. S
R1）の成葉を、１ｖ／ｖ％次亜塩素酸ナトリウム水溶液
に５分間浸漬して殺菌し、滅菌水で３回洗浄した後、中
脈を取り除いて約８ｍｍ角の葉片となるように調製し
た。

【００４８】このタバコ葉片を、IIにおいてｐＮＰＩ２
０６を導入したＡ．ツメファシエンスＬＢＡ４４０４の
菌液（ＯＤ₆₃₀＝０．２５、ＹＥＢ液体培地にて一夜培
養後、滅菌水で希釈して菌体濃度を調整。）に約１分間
浸してこれに感染させ、滅菌した濾紙の上に置いて余分
な菌液を除いてから、アセトシリンゴン５０ｍｇ／ｌを
添加した植物ホルモンを含まない（ホルモンフリー）Ｍ
Ｓ寒天培地（T.Murashige and F.skoog 、Physiol.Plan
t.、15:473、1962、但し、寒天０．８ｗ／ｖ％を添
加。）に、葉の裏が上になるように置床して、暗所で３
日間、２５℃（以下、特に記さない限り、植物組織の培
養温度は全て２５℃にて行った。）で培養した。次い
で、これを、カルベニシリン５００ｍｇ／ｌのみを含む
ホルモンフリーＭＳ寒天培地に移植し、光量約７〜１０
μ mol s^-1 m^-2で、同組成の培地に植え継ぎをしつつ培
養したところ、感染３ヶ月後には多芽体２２５系統を得
ることができたので、内１２６系統を２分割して、それ
ぞれ、光量約７〜１０μ mol s^-1m^-2又は光量約７０μ
mol s^-1 m^-2の条件下、同組成の培地を用いてさらに培
養を続けた。

【００４９】その結果、光量約７０μ mol s^-1 m^-2で培
養した系統においては、感染から約６ヶ月後に４３系統
の多芽体から、肉眼で見て正常な形態をしたシュート
（以下、正常体という。）が発生したが、光量約７〜１
０μ mol s^-1 m^-2で培養した系統では、同じ期間の経過
後に１２系統が正常体を発生させたのみであった。

【００５０】結果を表１に示す。

【００５１】

【表１】

【００５２】この表より明らかなように、本発明のベク
ターｐＮＰＩ２０６により遺伝子導入したタバコ培養組
織を、低光量条件で培養した後、高光量条件で培養した
場合には、低光量条件で培養を続けた場合に対し、正常
体発生率が４倍近く高く、このｐＮＰＩ２０６により遺
伝子導入された組織において、マーカー遺伝子である形
態異常誘導遺伝子の挙動が、脱離能を有するＤＮＡ因子
の制御に用いた、光反応性プロモーターであるｒｂｃＳ
−３Ｂにより制御され、遺伝子導入組織を低光量条件か
ら高光量条件に移すことにより、その脱離が促進された
ことを示している。

【００５３】［実施例２］Ｉ．ベクターの作成実施例１で得られたｐＮＰＩ２００をＰｓｔＩで切断
し、その切断により生じた両突出末端をＴ４ポリメラー
ゼＩ（大サブユニット）にて平滑化した後、ここに、ｐ
Ｇ１Ｅ７（ＺＥＮＥＣＡ社より譲渡）から制限酵素Ｎｄ
ｅＩで切出し、やはりその両突出末端をＴ４ポリメラー
ゼＩ（大サブユニット）にて平滑化させた、ＧＳＴ−Ｉ
Ｉの２７ｋＤサブユニット遺伝子（ＧＳＴ−ＩＩ−２
７）のプロモーター（特表平６−５１１３８５号公報
第７頁右下欄第１５〜１７行。）を挿入して、プラスミ
ドｐＮＰＩ３００を作成した。続いて、このｐＮＰＩ３
００から、ＧＳＴ−ＩＩ−２７プロモーター、Ｒ遺伝子
及びノパリン合成酵素ポリアデニル化シグナルを含む断
片を制限酵素ＥｃｏＲＩで切出し、これをｐＵＣ１８
（宝酒造（株）より購入）のＥｃｏＲＩ制限酵素部位に
挿入して、プラスミドｐＮＰＩ３０１を得た。

【００５４】なお、ＧＳＴ−ＩＩとは、除草剤解毒性に
関与するＧＳＴのアイソザイムのうちの一つであって、
トウモロコシ等に存在する酵素である。また、ＧＳＴ−
ＩＩ−２７プロモーターは、このＧＳＴ−ＩＩのサブユ
ニットのうち、２７ｋＤサブユニットの遺伝子発現を制
御しており、除草剤解毒剤、例えば２、２、５−トリメ
チル−３−（ジクロロアセチル）−１、３−オキサゾリ
ジンや、その類縁体等の化学物質の存在下、ＧＳＴ−Ｉ
Ｉ−２７の発現を誘導することによりＧＳＴ−ＩＩ活性
を劇的に上昇させ、除草剤に対する抵抗性を高めること
が、このトウモロコシなどにおいて知られている（特表
平６−５１１３８５号公報）。

【００５５】一方、ｐＮＰＩ１２３より、ＣａＭＶ３５
Ｓプロモーターとこれに連結されたｉｐｔ遺伝子を制限
酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切出し、これを、ｐＮＰＩ１２８
のＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位に挿入して、プラスミド
ｐＩＰＴ８を作成した。そして、このｐＩＰＴ８のＥｃ
ｏＲＩ制限酵素部位に、ｐＮＰＩ３０１より制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩにて切出した、ＧＳＴ−ＩＩ−２７プロモータ
ー、Ｒ遺伝子及びノパリン合成酵素ポリアデニル化シグ
ナルを含む断片を挿入し、プラスミドｐＮＰＩ３０２を
得た。

【００５６】目的とするベクターは、このｐＮＰＩ３０
２から、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターに連結されたｉｐ
ｔ遺伝子、ＧＳＴ−ＩＩ−２７プロモーターに連結され
たＲ遺伝子及びノパリン合成酵素ポリアデニル化シグナ
ル、そしてこれらの両端にある酵母の部位特異的組換え
系の組換え配列Ｒｓを制限酵素ＳｓｅＩで切出し、植物
への遺伝子導入用ベクタープラスミドｐＢＩ１２１のＳ
ｓｅＩ制限酵素部位に挿入することにより得られ、これ
をプラスミドｐＮＰＩ３０３と命名した。即ち、このｐ
ＮＰＩ３０３は、Ｒ遺伝子の調節因子として、ｐＮＰＩ
２０６で用いたｒｂｃＳ−３Ｂに代え、ＧＳＴ−ＩＩ−
２７プロモーターを用いたものである。

【００５７】図１２〜１５に、ｐＮＰＩ３０３の作成ス
キムを示す。これらの図中、用いた記号は図１〜１１で
用いたものと同様である。

【００５８】なお、このプラスミドｐＮＰＩ３０３もま
た、大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、この大腸菌をＥ．ｃ
ｏｌｉＪＭ１０９（ｐＮＰＩ３０３）（受託番号：Ｆ
ＥＲＭＢＰ−５９２７号）として、国際寄託に付し
た。

【００５９】II．タバコへのｐＮＰＩ３０３の導入及び
ｐＮＰＩ３０３が導入されたタバコの解析実施例１のII、III と同様にして、プラスミドｐＮＰＩ
３０３をＡ．ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株に導入
し、このＡ．ツメファシエンスをタバコ葉片に感染さ
せ、感染葉をアセトシリンゴン５０ｍｇ／ｌ含有ホルモ
ンフリーＭＳ寒天培地に置床して、３日間明所で培養し
た。次いで、この感染葉を、カルベニシリンのみを５０
０ｍｇ／ｌ含むホルモンフリーＭＳ寒天培地に移植し、
同組成の培地に植継ぎつつ培養を続けたところ、多芽体
を得ることができたので、培養開始から２ヶ月後、得ら
れた多芽体のうち３０系統を４分割して、そのそれぞれ
を、２、２、５−トリメチル−３−（ジクロロアセチ
ル）−１、３−オキサゾリジン０、１０、２０、３０ｍ
ｇ／ｌを添加した、カルベニシリン５００ｍｇ／ｌ含有
ホルモンフリーＭＳ寒天培地に置床し、正常体の発生頻
度を検討した。

【００６０】この２、２、５−トリメチル−３−（ジク
ロロアセチル）−１、３−オキサゾリジン添加培養１ヶ
月後の結果を表２に示す。なお、正常体の検出は肉眼に
より行い、また、本実施例において目的遺伝子のモデル
として用いた、ＧＵＳ遺伝子の発現を確かめるためのＧ
ＵＳ活性試験は、Jefferson らの方法に準拠して行っ
た。

【００６１】

【表２】

【００６２】表２より明らかなように、２、２、５−ト
リメチル−３−（ジクロロアセチル）−１、３−オキサ
ゾリジン無添加の場合には、全く正常体が発生しなかっ
たのに対して、これを１０ｍｇ／ｌ添加することにより
正常体が発生し、その発生頻度は２０ｍｇ／ｌ添加で更
に上昇した。従って、この場合においても、脱離能を有
するＤＮＡ因子の制御に用いた、化学物質反応性のプロ
モーターであるＧＳＴ−ＩＩ−２７プロモーターは適正
に機能し、ｐＮＰＩ３０３により植物組織に遺伝子を導
入してこれを適当な化学物質の存在下で培養すると、脱
離能を有するＤＮＡ因子の発現を誘導し、その脱離、ひ
いてはマーカー遺伝子である形態異常誘導遺伝子の脱離
を促すことがわかる。

【００６３】一方、正常体として生じたシュートのう
ち、約半数はＧＵＳ活性の発現、即ち、目的遺伝子の存
在と発現が確認されたものの、残りの半数ではＧＵＳ活
性を検出することができなかった。この理由について
は、まだ明らかではないが、例えば、このｐＮＰＩ３０
３のＴ−ＤＮＡ領域が、タバコの染色体中に隣接して幾
つか導入されたとすると、Ｔ−ＤＮＡ内の組換え配列Ｒ
ｓ間ではなく、互いに異なるＴ−ＤＮＡに存在する組換
え配列の間で相同的組換えが起こって、この配列に挟ま
れた領域が脱離することも考えられる。このため、脱離
能を有するＤＮＡ因子とともに脱離する領域に、ｉｐｔ
遺伝子のみならず、ＧＵＳ遺伝子が結果的に含まれるこ
とも起こり得るが、このような場合には、本実施例のよ
うに、多芽体から得られた正常体であっても、ＧＵＳ活
性を示さないものが出現するであろう。

【００６４】なお、ＧＵＳ活性を示した正常体のうち１
個については、ＰＣＲを用い、ＤＮＡ分析を行って、Ｇ
ＵＳ遺伝子の存在と、マーカー遺伝子であるｉｐｔ遺伝
子及び脱離能を有するＤＮＡ因子の脱離を、ＤＮＡレベ
ルにおいても確認した。

【００６５】

【発明の効果】本発明のベクターを用いて植物細胞へ遺
伝子導入を行うと、目的遺伝子と共に導入したマーカー
遺伝子は、導入後、この細胞に熱、光、化学物質等の特
定の刺激が与えられることにより、一定の確率で、これ
が存在し機能していたＤＮＡ上から脱離してその機能を
失い、目的遺伝子のみが、同じＤＮＡ上に発現可能に導
入されている細胞が得られる。このため、このベクター
は、導入しようとする目的遺伝子に関する部分を変更す
るのみで、マーカー遺伝子を始めとする他の構成に何ら
の変更をも加えることなく、ある一つの植物体へ遺伝子
の多重導入を行うために、何度でも無制限に繰り返して
用いることができる。

【００６６】しかも、マーカー遺伝子として形態異常誘
導遺伝子を用いたことにより、マーカー遺伝子が導入さ
れた細胞だけからなる組織、即ち、目的遺伝子が導入さ
れた細胞だけからなる組織の選抜も、そのマーカー遺伝
子が機能を失った後の、目的遺伝子のみが発現可能に導
入されている細胞だけからなる組織の選抜も、すべてそ
の組織の形態変化を指標として行うことができる。従っ
て、目的遺伝子のみが染色体等に導入されている細胞だ
けからなる組織を、確実・容易に選抜でき、選抜のため
の抗生物質等を培地中に添加する必要もないので、選抜
中に植物細胞の活性低下を招くおそれもない。このため
遺伝子の多重導入は効率良く行え、また、かかる細胞だ
けからなる遺伝子導入個体、すなわちマーカー遺伝子の
影響が排除され、その遺伝子産物がもたらす危惧から完
全に解放された個体も、交配過程を経ることなく得るこ
とができる。

【００６７】さらに、本発明のベクターにおいては、マ
ーカー遺伝子の脱離を人為的に調節することができる。
従って、このような調節ができないような場合には、マ
ーカー遺伝子の脱離があまりにも速やかに起こるため、
目的遺伝子のみ発現可能に導入されている細胞だけから
なる組織の取得が却って困難となる、非常に脱離能に優
れたＤＮＡ因子も、本発明の脱離能を有するＤＮＡ因子
としてその能力を生かすことができる。また、そうでな
くとも、本発明のベクターを用いると、かかる細胞の発
生、そしてかかる細胞からなる植物組織の発生を必要に
応じて同期させたり、適宜調整したりすることができる
ので、実際に、遺伝子導入植物を作成する上では非常に
便利となる。例えば、マーカー遺伝子である形態異常誘
導遺伝子としてｉｐｔ遺伝子を用いた場合には、これが
導入された細胞はその働きにより、植物ホルモン無添加
の条件で極めて活発に増殖し、不定芽等を分化するの
で、目的遺伝子のみが発現可能に導入されている細胞を
望めばいつでも発生させることができる組織を、あえて
その前段階のマーカー遺伝子を保持した状態で培養を続
けることにより大量に生産する、ということもできるよ
うになるのである。

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＮＰＩ２０６作成スキムのうち、ｐＮＰＩ２
０１の作成までを示す図である。

【図２】ｐＮＰＩ２０６作成スキムのうち、ｐＮＰＩ２
０１からｐＮＰＩ２０３の作成までを示す図である。

【図３】ｐＮＰＩ２０６作成スキムのうち、ｐＮＰＩ２
０３からｐＮＰＩ２０４の作成までを示す図である。

【図４】ｐＮＰＩ２０６作成スキムのうち、ｐＮＰＩ２
０４からｐＮＰＩ２０６の作成までを示す図である。

【図５】ｐＮＰＩ２０６の構造のうち、Ｔ−ＤＮＡ領域
の制限酵素地図である。

【図６】ｐＮＰＩ１２５の作成スキムである。

【図７】ｐＮＰＩ１２８の作成スキムである。

【図８】ｐＮＰＩ１２３作成スキムのうち、ｐＩＰＴ２
の作成までを示す図である。

【図９】ｐＮＰＩ１２３作成スキムのうち、ｐＩＰＴ２
からｐＩＰＴ３の作成までを示す図である。

【図１０】ｐＮＰＩ１２３作成スキムのうち、ｐＩＰＴ
３からｐＩＰＴ４の作成までを示す図である。

【図１１】ｐＮＰＩ１２３作成スキムのうち、ｐＩＰＴ
４からｐＮＰＩ１２３の作成までを示す図である。

【図１２】ｐＮＰＩ３０３作成スキムのうち、ｐＮＰＩ
２００及びｐＧ１Ｅ７からｐＮＰＩ３０１の作成までを
示す図である。

【図１３】ｐＮＰＩ３０３作成スキムのうち、ｐＮＰＩ
１２３及びｐＮＰＩ１２８からｐＩＰＴ８の作成までを
示す図である。

【図１４】ｐＮＰＩ３０３作成スキムのうち、ｐＮＰＩ
３０１及びｐＩＰＴ８からｐＮＰＩ３０２の作成までを
示す図である。

【図１５】ｐＮＰＩ３０３作成スキムのうち、ｐＮＰＩ
３０２からｐＮＰＩ３０３の作成までを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者海老沼宏安東京都北区王子５丁目21番１号日本製紙株式会社中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】目的遺伝子をマーカー遺伝子と共に植物
細胞中へ導入するためのベクターであって、マーカー遺
伝子が、その発現後に必要に応じて、これが存在し、機
能するＤＮＡから除去されてその機能を消失し、かつ、
マーカー遺伝子の発現、及びその機能の消失が、その導
入された植物細胞に由来する組織の形態変化により検出
可能である、植物への遺伝子導入用ベクター。
【請求項２】目的遺伝子、マーカー遺伝子として形態
異常誘導遺伝子、及び発現誘導型の調節因子の制御下に
おかれた脱離能を有するＤＮＡ因子を含み、かつ、形態
異常誘導遺伝子はこの脱離能を有するＤＮＡ因子と挙動
を一つにする位置に存在し、また目的遺伝子はこの脱離
能を有するＤＮＡ因子とは挙動を一つにすることがない
位置に存在する、植物への遺伝子導入用ベクター。
【請求項３】形態異常誘導遺伝子が脱離能を有するＤ
ＮＡ因子の内部に存在する、請求項２に記載の植物への
遺伝子導入用ベクター。
【請求項４】脱離能を有するＤＮＡ因子を制御する発
現誘導型の調節因子が、リブロース２リン酸カルボキシ
ラーゼの小サブユニット遺伝子（ｒｂｃＳ）のプロモー
ターである、請求項２または３に記載の植物への遺伝子
導入用ベクター。
【請求項５】脱離能を有するＤＮＡ因子を制御する発
現誘導型の調節因子が、グルタチオン−Ｓ−トランスフ
ェラーゼＩＩ系（ＧＳＴ−ＩＩ）遺伝子のプロモータで
ある、請求項２または３に記載の植物への遺伝子導入用
ベクター。
【請求項６】脱離能を有するＤＮＡ因子が部位特異的
組換え系に由来するものである、請求項２、３、４また
は５に記載の植物への遺伝子導入用ベクター。
【請求項７】形態異常誘導遺伝子がアグロバクテリウ
ム属細菌の保持する形態異常誘導遺伝子である、請求項
２、３、４、５または６に記載の植物への遺伝子導入用
ベクター。
【請求項８】形態異常誘導遺伝子がサイトカイニン合
成遺伝子である、請求項２、３、４、５、６または７に
記載の植物への遺伝子導入用ベクター。
【請求項９】サイトカイニン合成遺伝子がアグロバク
テリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefac
iens）のＴ−ＤＮＡ上に存在するｉｐｔ（isopentenylt
ransferase）遺伝子である、請求項８に記載の植物への
遺伝子導入用ベクター。