KR102665987B1 - 대마의 미성숙 배아를 이용한 재분화 효율 증진 방법 - Google Patents
대마의 미성숙 배아를 이용한 재분화 효율 증진 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 대마의 미성숙 배아를 이용한 재분화 효율 증진 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 GRF3(Growth-regulating factor 3)-GIF1(GRF-interacting factor 1) 키메라 단백질 발현 카세트를 포함하는 대마의 재분화 효율 증진용 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 이용한 대마의 재분화 효율 증진 방법 및 재분화 효율이 증진된 대마 형질전환 식물체의 제조방법에에 관한 것이다.
Description
본 발명은 대마의 미성숙 배아를 이용한 재분화 효율 증진 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 대마 식물체를 기내에서 재분화시키거나 아그로박테리아를 이용하여 형질전환 식물체를 개발할 경우에 그 효율을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다.
현대 생명과학 분야에서 대마(Hemp) 또는 카나비스(Cannabis sativa)의 형질전환 및 조직배양 기술 개발이 중요한 연구 주제 중 하나로 부각되어 왔다. 대마의 조직배양은 조직 절편이나 세포를 적절한 조건 하에서 배양하여 대량의 대마 식물체를 생산하는 기술로, 하이브리드 육종으로 사용되어지는 대마 식물체에 일정한 품질 유지를 위해 중요한 기술이다. 또한, 대마 식물의 특정 형질을 수정하거나 원하는 성장 및 대사 경로를 강화하기 위해 형질전환 기술이 필수적이라고 볼 수 있다. 이때, 대마의 재분화는 조직배양과 형질전환에서 가장 중요한 역할을 한다. 하지만 아직까지 대마 식물체를 형질전환하는 효율적이고 안정적인 방법이 알려져 있지 않다.
본 발명에서는 대마에서 재분화 효율을 증가시키는 방법 및 기술을 연구하여, 대마의 조직배양 및 형질전환에서 재분화 효율이 증가되는지를 확인하고자 하였다.
한편, 국제특허공개공보 WO2022/115850에는 자동개화(auto-flowered) 대마 식물체의 미소대량증식을 위한 배지 조성에 관한 'TISSUE CULTURE OF AN AUTOFLOWER CANNABIS PLANT'가 개시되어 있고, 미국공개특허 제2023-0044740호에는 'IN VITRO DIRECT REGENERATION OF POLYPLOID CANNABIS PLANTS'가 개시되어 있으나, 조직배양 및 재분화 효율을 증가시키기 위해 대마 미성숙 배아의 획득 시기, 형질전환을 위한 아그로박테리움과 공동배양 시 조건 및 miR396-저항성을 가진 대마 유래의 GRF3-GIF1 키메라 단백질 코딩 서열을 이용한 본 발명의 '대마의 미성숙 배아를 이용한 재분화 효율 증진 방법'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 형질전환을 이용한 대마 신품종을 개발하기 위해 대마 식물체 절편으로부터 재분화 효율을 증가시키기 위한 방법을 제공하고자 하였다. 이를 위해, 대마 식물체 절편을 획득하기 위한 미성숙 배아의 조건 및 아그로박테리아 공동배양 시 온도 조건 등을 테스트하여, 대마 조직 절편체의 재분화 효율을 증진시켜 고빈도의 대마 재분화 식물체를 획득할 수 있는 방법을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 GRF3(Growth-regulating factor 3)-GIF1(GRF-interacting factor 1) 키메라 단백질 발현 카세트를 포함하는, 대마의 재분화 효율 증진용 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 대마 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 대마의 재분화 효율 증진 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 대마 식물세포를 상기 재조합 벡터로 형질전환시키는 단계; 및 상기 형질전환된 대마 식물세포로부터 대마를 재분화하는 단계를 포함하는, 재분화 효율이 증진된 대마 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 GRF3-GIF1 키메라 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 대마의 재분화 효율 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명은 대마의 조직배양 뿐만 아니라 형질전환 기술에 관하여 재분화 효율 증가를 목표로 하는 여러 가지 방법 및 시스템을 제공한다. 본 발명의 방법을 이용하면 일관된 형질 특성을 가진 대마 하이브리드 품종을 유지시키는데 도움을 줄 수 있을 것이며, 본 발명은 아직까지 안정적으로 정립되지 못한 대마 형질전환 방법에서 재분화 효율 부분을 향상시킴으로써, 의학, 농업, 생명과학 연구 등 다양한 대마 관련 산업 및 연구 분야에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 대마 식물체로부터 미성숙 배아를 획득하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 대마 암꽃이 수꽃에 의해 수분된 후, embryo rescue 되어진 날(Days after pollination)에 따른 미성숙 배아를 나타낸 사진이다.
도 3은 13, 14, 17, 21 DAP의 미성숙 배아를 이용하여 RUBY로 형질전환한 뒤, 10일 후 실험체 사진이다.
도 4는 Embryo rescue 된 미성숙 배아를 수술용 칼을 이용하여 자엽을 포함한 경정분열조직을 잘라내는 방법을 나타내는 모식도이다.
도 5A는 미성숙 배아에서 잘려지는 부분을 붉은 점선으로 표시한 사진이고, 도 5B는 미성숙 배아에서 실험에 사용될 하배축 절편을 흰 원으로 표시한 사진이며, 도 5C는 미성숙 배아의 하배축 절편이 획득되어지고 10일이 지난 후 새순이 재분화된 사진이며, 도 5D는 미성숙 배아의 하배축 절편이 획득되어지고 14일이 지난 후 새순이 재분화된 사진이다.
도 6은 미성숙 배아를 배양하는 기간(AR; after rescue)에 따른 대마 하배축 절편의 재분화 효율을 대마 품종 아프가니쿠시(Afghani kush)와 청삼(Chung-sam)에서 각각 비교한 결과이다.
도 7은 대마 하배축 절편과 아그로박테리움의 공동배양 시 온도 조건에 따른 대마 하배축의 재분화 효율을 비교한 결과이다.
도 8은 miR396-저항성을 가진 대마 유래의 GRF3-GIF1 키메라 단백질 코딩 서열이 도입되었을 때 대마 하배축의 재분화 효율을 비교한 결과이다.
도 9A는 본 발명에서 사용된 pLSL.R.Ly-hCas9-GFP 재조합 벡터의 맵이며, 도 9B는 본 발명에서 사용된 pLSL.R.Ly-hCas9-GRF3-GIF1 재조합 벡터의 맵이다.
도 2는 대마 암꽃이 수꽃에 의해 수분된 후, embryo rescue 되어진 날(Days after pollination)에 따른 미성숙 배아를 나타낸 사진이다.
도 3은 13, 14, 17, 21 DAP의 미성숙 배아를 이용하여 RUBY로 형질전환한 뒤, 10일 후 실험체 사진이다.
도 4는 Embryo rescue 된 미성숙 배아를 수술용 칼을 이용하여 자엽을 포함한 경정분열조직을 잘라내는 방법을 나타내는 모식도이다.
도 5A는 미성숙 배아에서 잘려지는 부분을 붉은 점선으로 표시한 사진이고, 도 5B는 미성숙 배아에서 실험에 사용될 하배축 절편을 흰 원으로 표시한 사진이며, 도 5C는 미성숙 배아의 하배축 절편이 획득되어지고 10일이 지난 후 새순이 재분화된 사진이며, 도 5D는 미성숙 배아의 하배축 절편이 획득되어지고 14일이 지난 후 새순이 재분화된 사진이다.
도 6은 미성숙 배아를 배양하는 기간(AR; after rescue)에 따른 대마 하배축 절편의 재분화 효율을 대마 품종 아프가니쿠시(Afghani kush)와 청삼(Chung-sam)에서 각각 비교한 결과이다.
도 7은 대마 하배축 절편과 아그로박테리움의 공동배양 시 온도 조건에 따른 대마 하배축의 재분화 효율을 비교한 결과이다.
도 8은 miR396-저항성을 가진 대마 유래의 GRF3-GIF1 키메라 단백질 코딩 서열이 도입되었을 때 대마 하배축의 재분화 효율을 비교한 결과이다.
도 9A는 본 발명에서 사용된 pLSL.R.Ly-hCas9-GFP 재조합 벡터의 맵이며, 도 9B는 본 발명에서 사용된 pLSL.R.Ly-hCas9-GRF3-GIF1 재조합 벡터의 맵이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 GRF3(Growth-regulating factor 3)-GIF1(GRF-interacting factor 1) 키메라 단백질 발현 카세트를 포함하는, 대마의 재분화 효율 증진용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
또한, 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다.
본 발명에서 용어 "발현 카세트(expression cassette)"는 하나 이상의 유전자 및 이들의 발현을 조절하는 서열, 예를 들어 다양한 cis-작용 전사 조절 요소들의 임의의 조합을 포함하는 핵산 서열을 의미한다. 본 발명의 발현 카세트는 하기의 세 가지 주요한 요소를 포함한다: i) 프로모터; ⅱ) 상기 프로모터에 작동가능하게 연결되고 상기 발현 카세트가 세포 내로 도입되는 경우 상기 프로모터에 의해 그 전사가 지시되는 것인 "코딩 폴리뉴클레오티드(coding polynucleotide)", 또는 "코딩 서열(coding sequence)(코딩 유전자라고도 함)"로 지칭될 수 있는 제2 폴리뉴클레오티드; 및 ⅲ) 전사의 종료를 지시하고 상기 제2 폴리뉴클레오티드의 바로 하류에 위치하는 종결자(terminator) 폴리뉴클레오티드(전사종결인자라고도 함).
상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터 또는 Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 상부의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포분화하에서 활성이 있는 프로모터이며, 본 발명에서는 항시성 프로모터의 사용이 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(nopaline synthase), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 유전자 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 재조합 벡터에 있어서, 상기 GRF3-GIF1 키메라 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 대마 식물체의 재분화 효율을 증진시키는 활성을 의미한다.
또한, 본 발명에 따른 GRF3-GIF1 키메라 단백질을 코딩하는 서열은 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 코딩 서열은 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 서열번호 1의 염기서열은 보다 구체적으로, miR396-저항성을 가지는 대마 유래의 GRF3 코딩 서열과 링커 서열 및 대마 유래 GIF1 코딩 서열이 순차적으로 연결된 것으로서, 상기 GRF3 코딩 서열 내에 miR396-결합 서열이 위치한다. 상기 miR396-결합 서열은 서열번호 1의 염기서열에서 597번째 부터 609번째에 위치한다.
본 발명에 따른 대마의 재분화 효율 증진용 재조합 벡터는, 상기 키메라 단백질 발현 카세트 외, 외래 유전자 발현 카세트 또는 유전자 교정 카세트를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 외래 유전자 발현 카세트는 대마에서 발현시키고자 하는 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 유전자 교정 카세트는 엔도뉴클레아제(endonuclease) 발현 카세트 및 가이드 RNA (guide RNA) 발현 카세트를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "유전자/유전체 교정(gene/genome editing)"은, 인간 세포를 비롯한 동·식물 세포의 유전체 염기서열에 표적지향형 변이를 도입할 수 있는 기술로서, DNA 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자의 결실(deletion), 삽입(insertion), 치환(substitutions) 등에 의하여 특정 유전자를 녹-아웃 또는 녹-인하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩(non-coding) DNA 서열에도 변이를 도입할 수 있는 기술을 말한다. 또한, "유전자 교정"은 "유전자 편집"과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 엔도뉴클레아제 단백질은 Cas9, Cpf1 (also known as Cas12a), TALEN (Transcription activator-like effector nuclease), ZFN (Zinc Finger Nuclease) 또는 이의 기능적 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 RNA-가이드 뉴클레아제인 Cas9 또는 Cpf1 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 Cas9 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(S. thermophilus) 또는 스트렙토코커스 아우레우스(S. aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질, 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 유래의 Cas9 단백질, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) 유래의 Cas9 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas9 단백질 또는 이의 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 상기 Cas9 유전자 정보는 공지된 서열을 그대로 사용할 수도 있고, 형질도입되는 대상(유기체)의 코돈에 최적화된 서열을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
Cas9 단백질은 RNA-guided DNA 엔도뉴클레아제 효소로, 이중 가닥 DNA 절단(double stranded DNA break)을 유도한다. Cas9 단백질이 정확하게 표적 염기서열에 결합하여 DNA 가닥을 잘라내기 위해서는 PAM (Protospacer Adjacent Motif)이라 알려진 3개의 염기로 이루어진 짧은 염기서열이 표적 염기서열 옆에 존재해야 하며, Cas9 단백질은 PAM 서열(NGG)로부터 3번째와 4번째 염기쌍 사이를 추정하여 절단한다.
CRISPR/Cas9 시스템은 교정하고자 하는 특정 유전자의 특정위치에 이중나선 절단을 도입하여 DNA 수선 과정에서 유도되는 불완전 수선에 의한 삽입-결실(insertiondeletion, InDel) 돌연변이를 유도시키는 NHEJ(non-homologous end joining) 기작에 의한 유전자 교정 방법이다.
또한, 본 발명에서 용어 "가이드 RNA(guide RNA)"는 짧은 단일 가닥의 RNA로, 표적 유전자를 암호화하는 염기서열 중 표적 DNA에 특이적인 RNA를 의미하며, 표적 DNA 염기서열과 전부 또는 일부가 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 염기서열로 엔도뉴클레아제 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미한다. 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA (dual RNA); 또는 표적 유전자 내 염기서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 엔도뉴클레아제(특히, RNA-가이드 뉴클레아제)와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA) 형태를 말하나, 제한없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있으며, 함께 사용된 엔도뉴클레아제의 종류 또는 엔도뉴클레아제의 유래 미생물 등을 고려하여 당업계의 공지된 기술에 따라 제조하여 사용할 수 있다. 상기 가이드 RNA는 PAM(protospacer adjacent motif) 자리와 인접하며, 편집하려는 DNA의 10~20bp의 염기 서열과 상보적인 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 가이드 RNA는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것, 생체 외(in vitro)에서 전사된(transcribed) 것(예컨대, 올리고뉴클레오티드 이중가닥) 또는 합성한 가이드 RNA 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에 따른 대마의 재분화 효율 증진용 재조합 벡터는, 상기 GRF3-GIF1 키메라 단백질 발현 카세트;와 외래 유전자 발현 카세트 또는 유전자 교정 카세트;가 별개의 플라스미드로 구성되거나 또는 한개의 플라스미드로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), G418(geneticin), 블레오마이신(bleomycin)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA (aminoglycoside-3'-adenyl transferase) 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 대마 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 대마의 재분화 효율 증진 방법을 제공한다.
재조합 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 원핵세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 유전자총-매개 형질전환 방법(bombardment), 아그로박테리움-매개 형질전환법, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 DEAE-덱스트란 처리법 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 대마의 재분화 효율 증진 방법은 보다 상세하게는,
대마 식물체로부터 미성숙 배아를 획득하는 단계;
상기 획득된 미성숙 배아로부터 자엽을 포함하는 경정분열조직을 잘라내는 단계; 및
상기 자엽을 포함하는 경정분열조직을 본 발명에 따른 상기 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 공동배양하는 단계;를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 대마의 재분화 효율 증진 방법에 있어서, 상기 미성숙 배아는 수분(pollination) 후 17~24일째에 획득한 미성숙 배아일 수 있고, 보다 바람직하게는 수분 후 20~22일째에 획득한 미성숙 배아일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 수분 후 21일째에 획득한 미성숙 배아일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 대마 식물체에서 미성숙 배아를 획득하기 위해 대마 식물체 또는 종자를 22~28℃, 장주기의 빛 조건에서 3~6주 이상 생육시킨 후 대마 식물체를 단주기의 빛 조건으로 옮겨 개화를 유도하였다. 이 때, 성 판별 마커를 이용한 PCR 검정 또는 꽃망울(미성숙 꽃)이 생성되었을 때 암수를 구분하여 암나무와 수나무를 격리시켜 생육하였다. 이 후, 대마 수나무가 개화하여 꽃가루를 만들게 되면 대마 암꽃 또는 암나무에 수분시키고 이 날을 기준으로 배아(embryo)가 완전히 성숙하기 전에 미성숙 배아를 획득하였다.
또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 대마의 재분화 효율 증진 방법에 있어서, 상기 공동배양은 바람직하게는 4~25℃의 암(dark) 조건에서 2~4일 동안 배양되는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 16~25℃의 암 조건에서 3일 동안 배양되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 대마의 재분화 효율 증진 방법은, 상기 아그로박테리움 튜머파시엔스와 공동배양한 자엽을 포함하는 경정분열조직은 재분화 배지로 옮겨 22~25℃에서 7~14일 동안 추가로 배양하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한,
대마 식물세포를 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환시키는 단계; 및
상기 형질전환된 대마 식물세포로부터 대마를 재분화하는 단계를 포함하는, 재분화 효율이 증진된 대마 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 재조합 벡터는 전술한 것과 같다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 재조합 벡터는 대마 식물체에서 유전자 교정(편집)을 위한 표적 DNA에 특이적인 gRNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 삽입하고 이를 대마 식물세포 내에서 발현시킬 수 있는 발현 시스템을 포함하는 플라스미드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 플라스미드는 목적 유전자 발현을 위한 요소(elements)를 포함하는 것으로, 복제원점(replication origin), 프로모터, 작동 유전자(operator), 전사 종결 서열(terminator) 등을 포함할 수 있고, 숙주세포의 게놈 내로의 도입을 위한 적절한 효소 부위 (예컨대, 제한 효소 부위) 및/또는 임의로 숙주세포 내로의 성공적인 도입을 확인하기 위한 선별 마커 및/또는 단백질로의 번역을 위한 리보좀 결합 부위(ribosome binding site; RBS) 및/또는 전사 조절 인자 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법은 상기 형질전환된 대마 식물세포로부터 형질전환 대마 식물체를 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 GRF3-GIF1 키메라 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 대마의 재분화 효율 증진용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 대마 식물 조직의 재분화 효율을 증가시키는 효과를 가지는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 GRF3-GIF1 키메라 단백질을 코딩하는 서열을 포함하고 있어, GRF3-GIF1 키메라 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 벡터를 대마 식물세포에 형질전환함으로써 대마 식물체의 재분화 효율을 증진시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. miR396-저항성을 가진 대마 유래의 GRF3-GIF1 키메라 단백질 발현 유전자 클로닝
본 발명에서 재분화 효율을 올리기 위해 도입되어질 miR396-저항성을 가진 대마 유래의 GRF3(Growth-regulating factor 3)-GIF1(GRF-interacting factor 1) 키메라 단백질 코딩 유전자(서열번호 1)를 얻기 위하여, 대마 청삼(chung-sam) 품종의 cDNA를 주형으로 PCR (polymerase chain reaction)을 이용한 부위지정돌연변이 유발(site-ditected mutagenesis) 기법(Hemsley, Anne, et al., Nucleic Acids Res. 1989, 17(16):6545-51)을 통해 클로닝을 진행하였다.
이후 대마 식물체 내에 유전자 발현을 위한 재조합 벡터 백본으로 Bean yellow dwarf virus (BeYDV) 유래 레플리콘 pLSL.R.Ly (Vu, Tien Van, et al., Plant Biotechnol J. 2020, 18(10):2133-2143)을 사용하였으며, LB (left border) 및 RB (right border) 서열 사이에, 항생제 마커 발현 카세트; GFP (Green fluorescent protein) 발현 카세트; 엔도뉴클레아제(endonuclease) 발현 카세트 및 대마 유래 THCAS (tetrahydrocannabinolic acid synthase) 유전자(GenBank: MN422084.1)를 표적하는 gRNA 발현 카세트;를 포함하는 재조합 벡터 pLSL.R.Ly-hCas9-GFP(도 9A)와, LB 및 RB 서열 사이에 항생제 마커 발현 카세트; miR396-저항성을 가진 대마 유래의 GRF3-GIF1 키메라 단백질 발현 카세트; 엔도뉴클레아제 발현 카세트 및 대마 유래 THCAS 유전자를 표적하는 gRNA 발현 카세트;를 포함하는 재조합 벡터 pLSL.R.Ly-hCas9-GRF3-GIF1(도 9B)를 Type ⅡS 제한 효소인 BsaI을 이용한 골든게이트 클로닝(Engler et al., PLoS One. 2008, 3(11):e3647) 방법으로 구축하였다.
도 9의 벡터 맵에서 2Xp35S-hCas9-tEu35SRb7(서열번호 3)은 엔도뉴클레아제 발현 카세트에 해당되며, p35SL-intron-CLOVER-tEu35SRb7(서열번호 4) 및 p35SL-intron-CsGRF3-GIF1-tEuRb7(서열번호 5)은 GFP 발현 카세트에 대응되며, AtU6-sgR.11(THCAS) (서열번호 8) 및 AtU6-sgR.13(THCAS) (서열번호 9)는 대마 유래 THCAS 유전자를 표적하는 gRNA 발현 카세트에 해당하는 것으로 각각 하기 표 1의 gRNA를 발현하는 카세트이다.
| 염기서열(5'-3') | 서열번호 | |
| gRNA11 | ACCAATTCCAGAAACTGCAA | 6 |
| gRNA13 | cccttacggtggtataatgg | 7 |
상기 재조합 벡터는 전기천공법을 통해 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA-105로 형질전환시켰다.
실시예 2. 대마 식물체에서 미성숙 배아(immature embryo)를 획득하는 방법
본 발명은 마약류 취급자(학술연구자)허가 (식별번호 L00202725) 하에서 이루어졌다.
본 발명에서는 미성숙 배아를 획득하기 위해, 온실에서 대마를 개화기 동안 장주기(16h light/8h dark)에서 재배시키고, 5주 차에 단주기 조건(12h light/12h dark)으로 옮겨 개화를 유도하였다. 이 때, 암나무와 수나무는 성별 판별 마커(Faux, Anne-Michelle, et al. Euphytica 2014, 196:183-197)를 이용한 PCR로 구분한 후 격리하여 키우고, 각각의 나무가 꽃이 피었을 때, 수나무의 수꽃에 있는 꽃가루를 암나무의 암술에 수분해주고, 이 날을 기준으로 embryo rescue를 실시하는 날까지를 Days after pollination (DAP)로 지칭하였다. 본 발명에서는 7, 10, 12, 13, 14, 17, 19, 21, 24, 28 또는 30 DAP에 embryo rescue를 수행하고, 각각의 배아 상태를 확인하였다(도 2).
실시예 3. 미성숙 배아를 배양하는 방법
본 발명에서는 embryo rescue를 통해 획득한 미성숙 배아를 25℃, 기내 고체 배지(MS 기본 배지, 1.5% 수크로스, 5% 한천, pH 5.8)에서 실험 전까지 배양하였다. 상기 embryo rescue 되어진 미성숙 배아를 배양한 기간에 따라 After rescue (AR)로 지칭하였다.
실시예 4. 대마 유묘 또는 미성숙 배아의 하배축 절편 획득 방법
Embryo rescue 이후 미성숙 배아 또는 수 일 배양되어진 대마 유묘는 면도날을 이용하여 자엽을 포함한 경정분열조직을 잘라 하배축 절편을 획득하였다(도 4).
실시예 5. 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용한 대마 형질전환 방법
상기 실시예 4에서 획득되어진 미성숙 배아의 하배축 절편을 재조합 식물 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스(A. tumefaciens)가 현탁된 균 접종 배지(1/2 MS 기본 배지, 2% 수크로스, 1% 글루코스, 200 μM 아세토시린곤, pH 5.2)에 40~50분간 침지한 후, 어두운 조건에서 공동배양 하였다.
상기 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 아그로박테리움은 20 mg/L 리팜피신, 25 mg/L 젠타마이신 및 50 mg/L 카나마이신이 함유된 액체 LB 배지에서 28℃, 180 rpm으로 16시간 동안 배양하였다. 이후, 30 ㎖의 신선한 배지를 이용하여 1:10의 비율로 희석하고 28℃, 180 rpm의 조건으로 4~6시간 동안 추가 배양하였다. 아그로박테리움(OD600=0.6~0.8)은 3,500 rpm에서 원심분리하여 수집하였고, 15분 동안 200 μM 아세토시린곤(acetosyringone, AS)을 포함하는 30 ㎖의 액체 균 접종 배지(pH 5.2; Wu et al., Plant Methods 2014, 10:19)에 재현탁하였으며, 대마 형질전환 전에 1시간 동안 28℃, 180 rpm에서 활성화하여 사용하였다.
실시예 6. 대마 하배축 절편으로부터 재분화 효율 확인
상기 실시예 4에서 획득된 하배축 절편은 MS 기본배지 또는 0.2 ㎎/L의 옥신(auxin, 예컨대 1-Naphthaleneacetic acid (NAA)) 및 0.4 ㎎/L 시토키닌(cytokinin, 예컨대 Thidiazuron (TDZ))이 포함된 재분화 배지에서, 상기 실시예 5에서 공동배양된 하배축 절편은 300 ㎎/L 티멘틴(timentin)이 포함된 MS 기본배지 또는 0.2 ㎎/L의 옥신 및 0.4 ㎎/L 시토키닌이 포함된 재분화 배지에서, 22~25℃의 온도로 7~14일간 배양한 후, 새순(shoot)이 나오는 절편의 숫자를 계수하여 재분화 효율을 확인하였다(도 5).
실시예 7. DAP에 따른 형질전환 대마 하배축 절편의 생육 확인
상기 실시예 2에 따라 획득되어진 13, 14, 17 또는 21 DAP의 미성숙 배아를 3일 동안 배양한 뒤 상기 실시예 4에 따라 미성숙 배아의 하배축 절편을 획득하고, 상기 실시예 5와 같은 방법으로 RUBY 리포터를 발현하는 벡터(HE, Yubing, et al., Horticulture research, 2020, 7)를 포함하는 아그로박테리움과 공동배양 하였다. 10일 뒤에 대마 절편 조직을 확인한 결과, 21 DAP의 미성숙 배아를 사용하였을 때 가장 좋은 생육 성적을 보였다(도 3).
실시예 8. 미성숙 배아의 배양기간에 따른 대마 하배축 절편의 재분화 효율 확인
상기 실시예 2에 따라 21 DAP로 획득되어진 대마 품종 아프가니쿠시(Afghani kush)와 청삼의 미성숙 배아를 각각 0, 1, 2 또는 3 AR 만큼 배양한 뒤, 실시예 4의 방법에 따라 하배축 절편을 획득하였다. 이 후, 재조합 벡터 pLSL.R.Ly-hCas9-GFP를 포함하는 아그로박테리움으로 각각의 절편을 형질전환하였다. 이 후, 실시예 5에 따라 공동배양한 후 7일 뒤에 재분화 효율을 확인하였으며, 두 개의 대마 품종 모두에서 0 AR에서 가장 좋은 재분화 효율을 가지는 것을 확인하였다(도 6).
실시예 9. 공동배양 온도 조건에 따른 대마 하배축의 재분화 효율 확인
상기 실시예 2에 따라 21 DAP로 획득되어진 대마 품종 아프가니쿠시(Afghani kush)의 미성숙 배아를 실시예 4의 방법에 따라 하배축 절편을 획득하였다. 이 때, 실시예 5에 따라 재조합 벡터 pLSL.R.Ly-hCas9-GFP를 포함하는 아그로박테리움 현탁액에 대마 하배축 절편을 침지한 후 다양한 온도 조건에서 공동배양 하였다. 구체적으로, 4, 16, 22, 25 또는 31℃의 온도와 어두운 조건에서 3일 동안 공동배양 한 뒤, 7일 뒤에 재분화 효율을 확인하였으며, 16℃에서 가장 높은 재분화 효율을 보였으나, 4~22℃와 유의미한 차이를 보이지 않았으며, 25℃부터 재분화 효율이 감소되어 31℃에서는 재분화 효율이 현저히 낮아지는 것으로 확인되었다(도 7).
실시예 10. miR396-저항성을 가진 대마 유래의 GRF3-GIF1 키메라 단백질 발현 유전자의 도입에 따른 대마 하배축 재분화 효율 확인
상기 실시예 2에 따라 21 DAP로 획득되어진 대마 품종 아프가니쿠시(Afghani kush)의 미성숙 배아를 실시예 4의 방법에 따라 하배축 절편을 획득하였다. 이 때, 재조합 벡터 pLSL.R.Ly-hCas9-GFP과 pLSL.R.Ly-hCas9-CsGRF3GIF1을 각각 포함하는 아그로박테리움으로 실시예 5에 따라 하배축 절편을 형질전환하였다. 그 후 22℃의 어두운 조건에서 3일 동안 공동배양한 뒤, 7일 뒤에 재분화 효율을 확인하였으며, miR396-저항성을 가진 대마 유래의 GRF3-GIF1 키메라 단백질 코딩 유전자가 도입된 절편에서 더 좋은 재분화 효율을 나타낸다는 것을 확인하였다(도 8).
서열목록 전자파일 첨부
Claims (10)
- 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 GRF3(Growth-regulating factor 3)-GIF1(GRF-interacting factor 1) 키메라 단백질 발현 카세트를 포함하는, 대마의 재분화 효율 증진용 재조합 벡터.
- 제1항에 있어서, 외래 유전자 발현 카세트 또는 유전자 교정 카세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 대마의 재분화 효율 증진용 재조합 벡터.
- 제2항에 있어서, 상기 GRF3-GIF1 키메라 단백질 발현 카세트;와 외래 유전자 발현 카세트 또는 유전자 교정 카세트;가 별개의 플라스미드로 구성되거나 또는 한개의 플라스미드로 구성된 것을 특징으로 하는, 대마의 재분화 효율 증진용 재조합 벡터.
- 삭제
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 대마 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 대마의 재분화 효율 증진 방법.
- 제5항에 있어서,
대마 식물체로부터 미성숙 배아를 획득하는 단계;
상기 획득된 미성숙 배아로부터 자엽을 포함하는 경정분열조직을 잘라내는 단계; 및
상기 자엽을 포함하는 경정분열조직을, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로로 형질전환된 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 공동배양하는 단계;를 포함하는, 대마의 재분화 효율 증진 방법. - 제6항에 있어서, 상기 미성숙 배아는 수분(pollination) 후 17~24일째에 획득된 것을 특징으로 하는, 대마의 재분화 효율 증진 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 공동배양은 4~25℃의 암(dark) 조건에서 2~4일 동안 배양되는 것을 특징으로 하는, 대마의 재분화 효율 증진 방법.
- 대마 식물세포를 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환시키는 단계; 및
상기 형질전환된 대마 식물세포로부터 대마를 재분화하는 단계를 포함하는, 재분화 효율이 증진된 대마 형질전환 식물체의 제조방법. - 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 GRF3(Growth-regulating factor 3)-GIF1(GRF-interacting factor 1) 키메라 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 대마의 재분화 효율 증진용 조성물.
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|---|---|---|---|
| KR1020230119701A KR102665987B1 (ko) | 2023-09-08 | 2023-09-08 | 대마의 미성숙 배아를 이용한 재분화 효율 증진 방법 |
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| KR1020230119701A KR102665987B1 (ko) | 2023-09-08 | 2023-09-08 | 대마의 미성숙 배아를 이용한 재분화 효율 증진 방법 |
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| Publication Number | Publication Date |
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| KR102665987B1 true KR102665987B1 (ko) | 2024-05-24 |
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ID=91320894
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020230119701A KR102665987B1 (ko) | 2023-09-08 | 2023-09-08 | 대마의 미성숙 배아를 이용한 재분화 효율 증진 방법 |
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| Country | Link |
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20130122989A (ko) * | 2005-01-27 | 2013-11-11 | 크롭디자인 엔.브이. | 증가된 수확량을 갖는 식물 및 이의 생산 방법 |
| US20150033413A1 (en) * | 2012-01-04 | 2015-01-29 | Universidad Nacional De Rosario | GRF3 Mutants, Methods and Plants |
-
2023
- 2023-09-08 KR KR1020230119701A patent/KR102665987B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| KR20130122989A (ko) * | 2005-01-27 | 2013-11-11 | 크롭디자인 엔.브이. | 증가된 수확량을 갖는 식물 및 이의 생산 방법 |
| US20150033413A1 (en) * | 2012-01-04 | 2015-01-29 | Universidad Nacional De Rosario | GRF3 Mutants, Methods and Plants |
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