DE10318644A1 - Transgene Pflanzen mit kontrollierter Weitergabe eines Merkmals an die Nachkommen - Google Patents

Transgene Pflanzen mit kontrollierter Weitergabe eines Merkmals an die Nachkommen

Info

Publication number
DE10318644A1
DE10318644A1 DE2003118644 DE10318644A DE10318644A1 DE 10318644 A1 DE10318644 A1 DE 10318644A1 DE 2003118644 DE2003118644 DE 2003118644 DE 10318644 A DE10318644 A DE 10318644A DE 10318644 A1 DE10318644 A1 DE 10318644A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
nucleotide sequence
plant
heterologous
heterologous nucleotide
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE2003118644
Other languages
English (en)
Inventor
Stefan Werner
Anatoly Giritch
Serik Eliby
Sylvestre Marillonnet
Victor Klimyuk
Yuri Gleba
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Icon Genetics AG
Original Assignee
Icon Genetics AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Icon Genetics AG filed Critical Icon Genetics AG
Priority to DE2003118644 priority Critical patent/DE10318644A1/de
Publication of DE10318644A1 publication Critical patent/DE10318644A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C12N15/8265—Transgene containment, e.g. gene dispersal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C12N15/8289—Male sterility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C12N15/8231—Male-specific, e.g. anther, tapetum, pollen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Verfahren zur Herstellung eines transgenen multizellulären pflanzlichen Organismus oder Teile desselben, der ein gewünschtes Merkmal exprimiert und der das Merkmal an Nachkommen kontrolliert weitergibt, wobei das Verfahren umfasst: DOLLAR A (i) Herstellen einer ersten Pflanze oder einer Zelle derselben, die in einem ersten Genort eines Kernchromosomens eine erste heterologe Nukleotid-Sequenz aufweist, die ein erstes Fragment einer für das gewünschte Merkmal kodierenden Nukleotid-Sequenz enthält, DOLLAR A (ii) Herstellen einer zweiten Pflanze oder einer Zelle derselben, die in einem zweiten Genort eines Kernchromosomens, das zu dem Kernchromosom von Schritt (i) homolog ist, eine zweite heterologe Nukleotid-Sequenz aufweist, die ein zweites Fragment der für das gewünschte Merkmal kodierenden Nukleotid-Sequenz enthält, DOLLAR A (iii) Hybridisieren der ersten mit der zweiten Pflanze oder Zellen derselben, um Nachkommen zu bilden, die das gewünschte Gen infolge einer Bindung zwischen einem Protein oder Polypeptid, das von der ersten heterologen Nukleotid-Sequenz kodiert wird, und einem Protein oder Polypeptid, das von der zweiten heterologen Nukleotid-Sequenz kodiert wird, exprimieren.

Description

    GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines transgenen multizellulären pflanzlichen Organismus, der ein gewünschtes Merkmal exprimiert, und bei dem die Weitergabe des Merkmals an die Nachkommen oder an andere Organismen kontrolliert ist. Die Erfindung betrifft ferner eine Pflanze, die ein Merkmal exprimiert, wobei die Weitergabe des Merkmals an die Nachkommen kontrolliert ist, d. h., dass die Wahrscheinlichkeit der Weitergabe des Merkmals an unerwünschte Nachkommen, insbesondere durch Fremdbestäuben, sehr gering ist. Weiterhin beschreibt die Erfindung ein modulares Prinzip zum Zusammensetzen eines Merkmals aus nicht funktionellen Proteinfragmenten zu funktionellen Proteinen.
    • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die kommerzielle Verwendung von genetisch veränderten Nutzpflanzen hat Bedenken hinsichtlich des möglichen Transfers von Transgenen und Merkmalen von genetisch veränderten Pflanzen (GM-Pflanzen) in Landrassen, freilebende verwandte Pflanzen oder Nicht-GM-Pflanzensorten oder in verwandte Nutzpflanzensorten hervorgerufen (Ellstrand, N. C., 2001, Plant PhysioL 125, 1543-1545; Quist & Chapela, 2001, Nature, 414, 541-543), was das ökologische Gleichgewicht in den betroffenen Öko-Systemen stören oder zu anderen, insbesondere sozioökonomischen Problemen führen könnte. Weiterhin besteht die Sorge, dass Transgene, insbesondere Antibiotika-Resistenzgene, die als Transformationsmarker verwendet werden, sich durch sogenannten horizontalen Gentransfer in Mikroorganismen der Umgebung verbreiten können (Chiter et al., 2000, FEBS Lett., 481, 164-168), was die Mikroflora in ungewünschter Weise verändern könnte.
  • Obwohl viele dieser Bedenken wissenschaftlich wenig begründet sind (Christou, P., 2002, Transgenic Res., 11, iii-v), ist die Schaffung eines sicheren Systems zur Kontrolle von Transgenen äußerst wünschenswert, da es zukünftige Probleme verhindern und das Keimplasma existierender Pflanzensorten auf effektive Weise schützen kann. Ferner gibt es Probleme, die durch Kontamination organischer Nutzpflanzen oder Nicht-GM-Nutzpflanzen mit transgenen Sorten hervorgerufen werden. Dies hat einen wichtigen Einfluss auf die Vermarktung von transgenen und nicht-transgenen Pflanzen, eine Frage, die von Herstellern nicht ignoriert werden sollte.
  • Anders als andere von Menschen hergestellte Produkte sind biotechnologische Produkte potentiell selbstreproduzierend. Daher kann transgenes Material, das in die Umgebung gelangt ist, möglicherweise sehr lange überdauern. Üblicherweise werden beim Genetic Engineering Expressionskassetten und Vektoren verwendet, die kontinuierliche Kodiersequenzen des gewünschten Gens enthalten. Solche Expressionskassetten werden in ein Wirtschromosom integriert und werden infolge von Hybridisierung oder eines anderen genetischen Informationsaustausches zwischen einer GM-Pflanze und einem anderen Organismus mit hoher Wahrscheinlichkeit an die Nachkommen oder an einen anderen Empfänger als funktionelle Transkriptionseinheit weitergegeben.
  • WO 00/52146 beschreibt allgemeine Ideen zur Verschlüsselung eines gewünschten Gens durch Spalten eines Gens in zwei oder mehr Fragmente und Zusammenfügen der Fragmente durch Trans-Spleißen nach dem Kreuzen der Elternorganismen, wobei die Elternorganismen die Fragmente bereitstellen. WO 00/52146 geht nicht über allgemeine Ideen hinaus. Sie enthält keine ausführbare Lehre, wie diese Ideen in die Praxis umgesetzt werden könnten. Insbesondere enthält sie kein Beispiel. WO 00/71701 beschreibt das Zusammenfügen eines funktionellen Proteins durch Intein-vermitteltes Trans-Spleißen/Protein-Interaktion, um das Containment eines für das Protein kodierenden Transgens zu verbessern. WO 00/71701 beschreibt nicht das Zusammenbringen von Proteinfragmenten durch Kreuzen von Elternorganismen. Außerdem ist die Häufigkeit der Weitergabe eines Transgens gemäß WO 00/71701 nicht niedrig genug für Anwendungen im großen Maßstab, wie in der Landwirtschaft, insbesondere wenn ein Transgen einen Selektionsvorteil verleiht.
  • WO 01/16287 beschreibt die Schaffung alleler Positionen von Transgenen, deren Expression einen Phänotyp bestimmt, mit dem Ziel, dass die Transgene auf verschiedene Gameten segregieren. Diese Patentanmeldung betrifft nicht das Problem der Kontrolle der Ausbreitung von Transgenen, sondern die Erzeugung eines Merkmals, insbesondere von männlicher Sterilität, die von mindestens zwei Transgenen kodiert wird. Intein-vermitteltes Trans-Spleißen wird nicht erwähnt. Ferner beschreibt diese Patentanmeldung nicht die Kontrolle der Genausbreitung durch Spalten eines für ein Merkmal kodierenden Gens in zwei oder mehr Fragmente.
  • Das Zusammenfügen eines Merkmals aus Teilen, die dafür kodieren, ist ohne großen Wert, wenn nicht bekannt ist, wie die geeignetsten Positionen der kodierenden Fragmente am einfachsten bewerkstelligt werden können, um die strikteste Kontrolle über die Genausbreitung des Merkmals zu erreichen. Für Anwendungen im großen Maßstab wie der Landwirtschaft erfordert die biologische Sicherheit, dass die Häufigkeit der ungewünschten Ausbreitung eines Transgens auf einen Wert von annähernd Null gesenkt wird.
  • Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze bereitzustellen, die ein gewünschtes Gen exprimiert, wobei die Weitergabe des Gens an Nachkommen strikt kontrolliert ist und mit niedriger Häufigkeit geschieht.
  • Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung einer biologisch sicheren transgenen Pflanze bereitzustellen, die ein gewünschtes Merkmal exprimiert, wobei für das Merkmal kodierende Genfragmente so angeordnet werden, dass eine ungewünschte Weitergabe des Merkmals mit geringer Wahrscheinlichkeit stattfindet.
  • Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Positionierung transgener DNA- Sequenzen auf homologen Chromosomen bereitzustellen, insbesondere am selben Genort homologer Chromosomen eines multizellulären Organismus.
    • ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die obigen Aufgaben werden von den Ansprüchen gelöst.
  • Die Erfinder dieser Erfindung haben erstmals ein Verfahren zur Herstellung umweltsicherer transgener Organismen entwickelt, insofern, als das Transgen oder ein gewünschtes Merkmal, das die Pflanze exprimiert, kontrolliert an Nachkommen der Pflanze weitergegeben wird. Die Erfindung löst ein Hauptproblem der Biotechnologie, insbesondere der Pflanzenbiotechnologie, da die Weitergabe eines Transgens von einer GM-Pflanze zu anderen Organismen nunmehr effektiv kontrolliert und begrenzt werden kann. Transfer eines Transgens zu anderen Organismen umfasst den Transfer zu geschlechtlichen Nachkommen infolge Fremdbestäubens (cross-pollination) sowie lateralen Gentransfer. Die obigen Verfahren machen genetisch veränderte multizelluläre Pflanzen mit einem kontrollierten Containment eines gewünschten Gens verfügbar.
  • Diese Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur Herstellung eines transgenen multizellulären pflanzlichen Organismus oder Teilen desselben, der ein gewünschtes Merkmal exprimiert und das Merkmal an Nachkommen kontrolliert weitergibt, wobei das Verfahren umfasst:
    • a) Herstellen einer ersten Pflanze oder einer Zelle derselben, die in einem ersten Genort eines Kernchromosoms eine erste heterologe Nukleotidsequenz aufweist, die ein erstes Fragment einer für das gewünschte Merkmal kodierenden Nukleotidsequenz enthält,
    • b) Herstellen einer zweiten Pflanze oder einer Zelle derselben, die in einem zweiten Genort eines Kernchromosoms, das zu dem Kernchromosom von Schritt (i) homolog ist, eine zweite heterologe Nukleotidsequenz aufweist, die ein zweites Fragment der für das gewünschte Merkmal kodierenden Nukleotidsequenz enthält,
    • c) Hybridisieren der ersten mit der zweiten Pflanze oder Zellen derselben, um Nachkommen zu bilden, die das gewünschte Gen infolge einer Bindung zwischen einem Protein oder Polypeptid, das von der ersten heterologen Nukleotidsequenz kodiert wird, und einem Protein oder Polypeptid, das von der zweiten heterologen Nukleotidsequenz kodiert wird, exprimieren.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Nucleotid-Sequenz, die für das Merkmal kodiert oder an dem Merkmal beteiligt ist, in zwei oder mehr Fragmente gespalten.
  • Vorzugsweise wird die Nucleotid-Sequenz in zwei Fragmente gespalten, wodurch ein 5'- und ein 3'-Teil der Nucleotid-Sequenz erhalten wird. Der 5'-Teil entspricht im wesentlichen dem ersten Fragment. Der 3'-Teil entspricht im wesentlichen dem zweiten Fragment. Die Nucleotid- Sequenz ist typischerweise eine Kodiersequenz (oder ein Offener Leserahmen) eines Proteins, das an dem Merkmal beteiligt ist. Die Nucleotid-Sequenz kann jedoch ein oder mehrere Introns enthalten. Um die Fragmente zu erhalten, wird die Nucleotid-Sequenz vorzugsweise so gespalten, dass jedes erhaltene Fragment bei der Expression in Abwesenheit des anderen Fragments nicht in der Lage ist, das Merkmal hervorzurufen. Jedes Fragment enthält einen Sequenzabschnitt, der für die Funktion des an dem Merkmal beteiligten Proteins nötig ist. Wenn das an dem Merkmal beteiligte Protein z. B. ein Enzym ist, enthält jedes Fragment vorzugsweise Aminosäuren, die für die Katalyse oder die Substratbindung des Enzyms nötig sind. Ein für ein Merkmal kodierendes oder an dem Merkmal beteiligten Protein kann auf viele verschiedene Weisen in zwei Fragmente gespalten werden, solange die Expression des Merkmals alle Fragmente und das Binden aller Fragmente zueinander voraussetzt. Über das Protein bekannte strukturelle und funktionelle Information kann für das Auffinden einer geeigneten Spaltstelle der Nucleotid-Sequenz hilfreich sein. In jedem Fall kann experimentell einfach bestimmt werden, ob ein Fragment, das durch Spalten einer Nucleotid-Sequenz an einer zufällig gewählten Stelle erhalten wurde, ein Merkmal exprimieren kann, das von der Nucleotid-Sequenz kodiert wird. Diese Beschreibung konzentriert sich im folgenden auf die bevorzugte Ausführungsform, bei der die für das Merkmal kodierende Nucleotid-Sequenz in zwei Fragmente gespalten wird.
  • Die Expression des Merkmals setzt die Gegenwart beider Fragmente in derselben Pflanze, vorzugsweise in denselben Zellen der Pflanze voraus. Die Expression des Merkmals erfordert weiterhin die Transkription und die Translation des ersten und des zweiten Fragments und das Binden der Translationsprodukte der Fragmente aneinander, mit oder ohne Bildung einer Peptidbindung. Vorzugsweise führt das Binden zur Bildung einer Peptidbindung zwischen den Fragmenten.
  • Das erste Fragment wird in eine erste heterologe Nucleotid-Sequenz eingefügt, das zweite Fragment wird in eine zweite heterologe Nucleotid-Sequenz einfügt. Vorzugsweise sind die heterologen Nucleotid-Sequenz DNA-Sequenzen.
  • Vorzugsweise kodiert die erste und die zweite heterologe Nucleotid-Sequenz weiterhin für ein erstes bzw. für ein zweites Bindungspolypeptid, das das Binden von von der ersten und zweiten heterologen Nucleotid-Sequenz kodierten Polypeptide ermöglicht. Jedes Bindungspolypeptid wird vorzugsweise als Fusionsprotein mit dem von dem ersten oder dem zweiten Fragment kodierten Polypeptid exprimiert.
  • Das von der ersten heterologen Nucleotid-Sequenz kodierte Polypeptid oder Protein umfasst ein, vorzugsweise besteht aus einem, ersten Bindungspolypeptid und aus einem Polypeptid, das von dem ersten Fragment kodiert wird. Das von der zweiten heterologen Nucleotid- Sequenz kodierte Polypeptid oder Protein umfasst ein, vorzugsweise besteht aus einem, zweiten Bindungspolypeptid und einem Polypeptid, das von dem zweiten Fragment kodiert wird.
  • Nach der Transkription und Translation hat jedes der Polypeptide oder Proteine zumindest die folgenden beiden Funktionen:
    • a) Bereitstellen eines Teils des an dem Merkmal beteiligten Proteins;
    • b) die Fähigkeit, an das von dem zweiten Fragment kodierte Polypeptid oder Protein zu binden.
  • Aminosäure-Sequenzabschnitte, die für die Funktionen (i) und (ii) verantwortlich sind, können überlappen, müssen dies jedoch nicht.
  • Das Binden kann die Bildung einer Peptidbindung zwischen den Proteinen oder Polypeptiden, die von der ersten und der zweiten heterologen Nucleotid-Sequenz kodiert werden, beinhalten. Ohne Peptidbindungsbildung können die Bindungspolypeptide aneinander mittels Bindungsaffinität binden. In diesem Fall können die Bindungspolypeptide Polypeptide sein, von denen bekannt ist, dass sie aneinander binden, z. B. natürlich vorkommende Bindungsdomänen aus Protein-Komplexen. Eines oder beide der Polypeptide, die an der Bindungsaffinität beteiligt sind, können künstlich verändert sein. Die Bindungspolypeptide können z. B. die Komponenten eines Antigen-Antikörper-Paares sein. Ferner können die Bindungspolypeptide künstlich selektioniert sein, z. B. unter Verwendung von Phage-Display-Bibliotheken von Zufallspeptiden (für eine Übersicht siehe: Barbas CF., 1993, Curr. Opin. Biotechnol., 4, 526-530; Irvin et al., 2001, Current Opin. Chem. Biol., 5, 314-324; Hoogenboom HR, 1997, Trends Biotechnol., 15, 63-70) oder von Yeast-two-hybrid-Systemen (für eine Übersicht siehe: Fields & Sternglanc, 1994, Trends Genet., 10, 286-292; Bartel & Fields, 1995, Methods Enzymoi., 254, 241-263). Außerdem können es Intein-Fragmente sein, die für Intein-Spleißen funktionsuntüchtig gemacht wurden.
  • In einer wichtigen Ausführungsform beinhaltet das Binden die Bildung einer Peptidbindung zwischen den Proteinen oder Polypeptiden, die von der ersten und der zweiten heterologen Nucleotid-Sequenz kodiert werden. Eine Peptidbindungsbildung zwischen den Polypeptiden, die von den Fragmenten kodiert werden, ist bevorzugt. Das Binden ist oder umfasst vorteilhafterweise Intein-vermitteltes Trans-Spleißen. Zu diesem Zweck kodiert die erste und die zweite heterologe Nucleotid-Sequenz für Proteine oder Polypeptide, die zum Trans- Spleißen befähigt sind. Durch das Trans-Spleißen können die von dem ersten und dem zweiten Fragment kodierten Proteine und Polypeptide durch Bildung einer Peptidbindung verknüpft werden. Bei dieser Ausführungsform stammen die Bindungspolypeptide vorzugsweise aus einem Intein, das zum Trans-Spleißen befähigt ist. Trans-spleißende Inteine können aus dem Genomen des Kerns und der Organellen verschiedener Organismen, darunter Eukaryoten, Archaebakterien und Eubakterien, ausgewählt sein. Inteine, die zur Ausführung dieser Erfindung verwendet werden können, sind unter http:/ / www.neb.com/neb/inteins.html aufgelistet. Es kann auch ein Intein, das in einer der hier zitierten Referenzen genannt ist, verwendet werden. Die Wahl des Inteins kann von der Konsensus-Sequenz von den Bedingungen, die zum effizienten Trans-Spleißen nötig sind, abhängen.
  • Zum Engineering der heterologen Nucleotid-Sequenzen kann die für ein Intein kodierende Nucleotid-Sequenz in ein 5'- und ein 3'-Ende, das für das 5'- bzw. das 3'-Intein (gemäß der hier verwendeten Nomenklatur) kodiert, gespalten werden. Sequenzabschnitte, die zum Trans- Spleißen nicht nötig sind (z. B. eine homing endonuclease domain) können deletiert werden. Die kodierende Intein-Sequenz wird so gespalten, dass das 5'- und das 3'-Intein zum Trans- Spleißen befähigt sind. Bezüglich einer geeigneten Spaltstelle der Intein-Sequenz können die von Southworth et al. (EMBO J. (1998), 17, 918-926) beschriebenen Gesichtspunkte befolgt werden. Die Befähigung der 5'- und 3'-Inteine zum Trans-Spleißen kann natürlich experimentell getestet werden, z. B., wie von Southworth et al. (ibid.) beschrieben. Der experimentelle Test kann über Trans-Spleißen durchgeführt werden. Ein experimentelles Testen von Intein-Teilen, die deletiert werden können, ohne die Trans-Spleißfunktionalität zu stören, kann mittels Trans- Spleißen oder mittels Cis-Spleißen durchgeführt werden.
  • Das 5'-Intein entspricht im wesentlichen dem ersten Bindungspolypeptid. Das 3-Intein entspricht im wesentlichen dem zweiten Bindungspolypeptid. Beim Engineering der heterologen Nucleotid-Sequenzen wird die Kodiersequenz für das 5'-Intein mit dem 3-Ende des ersten Fragments verknüpft. Die Kodiersequenz für das 3'-Intein wird mit dem 5'-Ende des zweiten Fragments verknüpft. Insbesondere in Nachbarschaft der Verknüpfungsstelle können Nucleotide und/oder Kodons (Aminosäuren) geändert werden, um eine gewünschte Funktionalität zum Trans-Spleißen zu erreichen.
  • Die erste (zweite) heterologe Nucleotid-Sequenz kann umfassen: Das erste (zweite) Fragment, das erste (zweite) Bindungspolypeptid, regulatorische Sequenzen zur Transkription (z. B. Promotor, 3'-Transkriptionsterminationssequenz) sowie für die Translation. Ferner kann sie einen Selektions- und/oder Counter-Selektionsmarker enthalten, wie sie zur Herstellung der ersten (zweiten) Pflanze benötigt werden, sowie Sequenzen, die von einer spezifischen Rekombinase erkannt werden, oder Transposon-Sequenzen (siehe unten).
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zur Zusammenstellung von zwei oder mehr Merkmalen durch Trans-Spleißen verwendet werden. Jedoch sollten unterschiedliche Intein- Systeme für das Zusammenstellen der Merkmale verwendet werden, um falsches Spleißen der Merkmale wegen der universellen Art der Interaktion zwischen Intein-Teilen zu vermeiden; die Interaktion ist weitgehend unabhängig von den anhängenden Proteinfragmenten, die transgespleißt werden sollen.
  • In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die erste Pflanze oder Zellen derselben mittels Einführen der ersten heterologen Nucleotid-Sequenz in eine Vorläufer-Pflanze oder Zellen derselben hergstellt werden. Die zweite Pflanze oder Zellen derselben können mittels Einführen der zweiten heterologen Nucleotid-Sequenz in eine Vorläufer-Pflanze oder Zellen derselben hergestellt werden. Das Einführen kann nach allgemein bekannten Methoden durchgeführt werden. Vorzugsweise werden beide heterologen Nucleotid-Sequenzen in ein Chromosom des Kern-Genoms der ersten und der zweiten Pflanze stabil integriert. Die so erhaltene erste und zweite Pflanze wird vorzugsweise homozygot bezüglich der betreffenden heterologen Nucleotid-Sequenz nach bekannten Verfahren gemacht, insbesondere durch Selbstkreuzen (selfing). Die erste und die zweite Pflanze gehören vorzugsweise zur selben Familie, bevorzugter zur selben Gattung und am vorteilhaftesten zur selben Art von Organismen.
  • Die Erfindung stellt multizelluläre Pflanzen (und Teile davon, wie z. B. Samen) zur Verfügung, die ein gewünschtes Gen exprimieren, und bei denen die Weitergabe des Merkmals an die Nachkommen kontrolliert ist, wobei ein an dem Merkmal beteiligtes Protein durch das Binden, insbesondere durch Trans-Spleißen, von von den heterologen Sequenzen kodierten Polypeptiden generiert wird. Die Polypeptide werden auf homologen Chromosomen des Organismus auf einer ersten und einer zweiten heterologen Nucleotid-Sequenz kodiert.
  • Prinzipiell gibt es mehrere relative Positionen der ersten und zweiten heterologen Nucleotid- Sequenz und der betreffenden Fragmente zueinander in den Chromosomen der transgenen Pflanze gemäß der Erfindung. Die erste und zweite heterologe Nucleotid-Sequenz in der erfindungsgemäßen transgenen Pflanze sollten so positioniert werden, dass sie als ungekoppelte Genorte segregieren. Die ungekoppelten Genorte werden vorzugsweise so positioniert, dass meiotische Rekombination oder ein Crossing-over und die Schaffung einer Kopplung zwischen den Genorten minimiert wird.
  • Mögliche relative Orte der ersten und der zweiten heterologen Nucleotid-Sequenz und der darin enthaltenen Fragmente zueinander sind allgemein in Fig. 2B anhand eines diploiden Organismus als Beispiel gezeigt.
  • Im Fall I von Fig. 2B liegen das erste und das zweite Fragment auf demselben Chromosom, d. h., sie sind physisch gekoppelt auf demselben DNA-Molekül, jedoch voneinander von nativen Chromosom-Sequenzen des Organismus getrennt. Die Fragmente werden zu verschiedenen Transkriptionseinheiten gehören. Da ein Crossing-over in der Meiose zu einer Trennung der Fragmente (oder der heterologen Sequenzen, die die Fragmente enthalten) führen kann, ist die Wahrscheinlichkeit einer Weitergabe eines von beiden Fragmenten kodierten Merkmals an Nachkommen im Vergleich zum herkömmlichen Fall, bei dem das Merkmal von einer kontinuierlichen Kodier-Sequenz kodiert wird, reduziert.
  • Im Fall II (siehe Fig. 2B) liegen das erste und das zweite Fragment auf verschiedenen heterologen Chromosomen. Die Häufigkeit der Vererbung des von beiden Fragmenten auf verschiedenen Chromosomen kodierten Merkmals nach Selbstkreuzen beträgt ungefähr 50% und nach Kreuzen mit einem Organismus, der keines dieser Fragmente enthält, 25%. In den Fällen I und II des Standes der Technik ist die Wahrscheinlichkeit der Weitergabe beider Fragmente an Nachkommen oder an andere Organismen für praktische Zwecke zu hoch, insbesondere, wenn das von den Fragmenten kodierte Merkmal einen Überlebens- oder Vermehrungsvorteil verleiht. Diese Fälle stellen keine biologisch sicheren Fälle einer transgenen Pflanze dar.
  • Die Erfinder dieser Erfindung haben gefunden, dass die Häufigkeit der Weitergabe des Merkmals an Nachkommen (nach Kreuzen mit Pflanzen, die das Merkmal nicht haben) und an andere Organismen enorm reduziert werden kann, wenn die Fragmente, wie schematisch in Fig. 2B, Fall III und IV gezeigt, auf homologen Chromosomen liegen.
  • Im Fall III (Fig. 2B) liegen die zwei Fragmente in verschiedenen Genorten auf homologen Chromosomen, d. h., sie sind linked in repulsion. Je näher die Fragmente zueinander liegen, desto geringer ist die Häufigkeit einer Rekombination zwischen den Genorten und einer Weitergabe des Merkmals an Nachkommen infolge einer Fremd-Hybridisierung (crosshybridisation). Im bevorzugtesten Fall (Fall IV in Fig. 2B) liegen die Fragmente am selben Gen- Ort auf homologen Chromosomen. Damit segregiert das Merkmal verlässlich in hybriden Nachkommen (cross progeny) der multizellulären Pflanze der Erfindung.
  • Solche relativen Anordnungen der ersten und der zweiten heterologen Nucleotid-Sequenzen auf homologen Chromosomen der erfindungsgemäßen Pflanze werden durch Hybridisieren, insbesondere durch Kreuzen, der ersten und der zweiten Pflanze oder Zellen derselben erhalten. Die erste und die zweite Pflanze können gemäß bekannten Verfahren erhalten werden. Weitere Möglichkeiten werden im folgenden beschrieben.
  • In einer Ausführungsform werden viele Transformanten sowohl mit der ersten als auch mit der zweiten heterologen Nucleotid-Sequenz produziert. Dann kann mittels genetischer oder molekularbiologischer Methoden das Chromosom, das die heterologe Nucleotid-Sequenz enthält, bestimmt werden, sowie der Ort der transformierten Sequenz in dem Chromosom. Dann kann eine transformierte Pflanze oder ein Zeliklon derselben, bei der/dem die heterologe Nucleotid-Sequenz an einer gewünschten Stelle liegt, ausgewählt werden. Dann kann eine transformierte Pflanze oder ein Zeliklon derselben mit der zweiten heterologen Nucleotid- Sequenz an einer geeigneten Stelle relativ zu der Stelle der ersten Sequenz ausgewählt werden. So kann ein geeignetes Paar einer ersten und einer zweiten Pflanze ausgewählt werden.
  • In einer zweiten Ausführungsform kann die gezielte Integration in einen gewünschten Gen-Ort eines gewünschten Chromosoms unter Verwendung von homologer Rekombination angewandt werden. Vorzugsweise wird die gezielte Integration (targeted integration) in Kombination mit ortsspezifischer Rekombination unter Verwendung einer multizellulären Pflanze durchgeführt, die eine in ein Chromosom vorintegrierte Zielstelle (targeting site) aufweist. Dieses Verfahren ist besonders nützlich, um die erste und die zweite heterologe Nucleotid-Sequenz in denselben Gen-Ort desselben Chromosoms einzuführen, da dieselbe Ausgangslinie eines Organismus, der die vorintegrierte Zielstelle enthält, zur Transformation der ersten und der zweiten heterologen Nucleotid-Sequenz verwendet werden kann. Die gezielte Integration wird z. B. in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP02/03266 beschrieben. Verfahren zur Herstellung von Zielstellen für die gezielte Integration von Pflanzen mit verschiedenen Expressionsprofilen wird in PCT/US02/11924 beschrieben. Verfahren zur Verbesserung der Effizienz der ortsgerichteten Integration wird z. B. in der internationalen Anmeldung PCT/EP 02/03266 beschrieben.
  • Alternativ kann die erste heterologe Nucleotid-Sequenz in ein Kern-Chromosom des ersten Organismus inkorporiert werden, und die zweite heterologe Nucleotid-Sequenz kann in ein plastidäres oder mitochondrielles Genom desselben oder eines anderen Organismus inkorporiert werden. Das Einführen beider heterologen Nucleotid-Sequenzen in Kern- Chromosomen ist jedoch bevorzugt.
  • Bevorzugte Methoden zur Herstellung der ersten und der zweiten Pflanze sind schematisch auf der rechten Seite ("Excision") von Fig. 2E und in den Fig. 5 bis 8 gezeigt. In diesen bevorzugten Methoden werden die Schritte (i) und (ii) von Anspruch 1 durchgeführt durch:
    • a) Einführen einer heterologen Vorläufer-Nucleotid-Sequenz, die die erste und die zweite heterologe Nucleotid-Sequenz enthält, in ein Kern-Chromosom von Elternorganismen oder Zellen desselben,
    • b) wahlweise Auswahl von Organismen oder Zellen derselben, die die heterologe Vorläufer- Nucleotid-Sequenz in ein gewünschtes Chromosom oder in einen gewünschten Gen-Ort eines Chromosoms integriert enthält,
    • c) anschließendes Spalten der heterologen Vorläufer-Nucleotid-Sequenz, so dass die erste und die zweite heterologe Nucleotid-Sequenz in homologe Chromosomen verschiedener Organismen oder Zellen zu liegen kommen.
  • Die heterologe Vorläufer-Nucleotid-Sequenz umfasst die erste und die zweite heterologe Nucleotid-Sequenz. Vorzugsweise enthält sie ferner Sequenzen zum Herausschneiden der ersten und/oder der zweiten heterologen Nucleotid-Sequenz (für Einzelheiten siehe unten). Das Einführen (a) kann mittels jedes bekannten Transformationsverfahrens (siehe unten) durchgeführt werden. Agrobacterium-vermittelte Transformation ist bevorzugt. Pflanzen oder Zellen, die die heterologe Vorläufer-Nucleotid-Sequenz tragen, können mittels eines darin enthaltenen Selektionsmarkers selektioniert werden. Vollständige Pflanzen können aus transformierten Zellen oder Geweben regeneriert werden. Vorzugsweise werden Pflanzen regeneriert, die für die Vorläufer-Sequenz homozygot sind.
  • Eine Pflanze (oder eine Gruppe von Pflanzen), die die Vorläufer-Sequenz enthalten, kann dann zum Herausschneiden der ersten heterologen Nucleotid-Sequenz aus der Vorläufer-Sequenz verwendet werden. So kann die zweite Pflanze erhalten werden. Eine andere Pflanze (oder eine Gruppe von Pflanzen) kann zum Herausschneiden der zweiten heterologen Nucleotid- Sequenz verwendet werden, um die erste Pflanze zu erhalten. Die nicht herausgeschnittene heterologen Sequenzen liegen in der ersten und der zweiten Pflanze auf homologen Chromosomen, insbesondere am selben Gen-Ort der homologen Chromosomen.
  • Die so erhaltene erste und zweite Pflanze oder Zellen derselben (oder Nachkommen derselben) werden vorteilhafterweise für eine Reintegration einer herausgeschnittenen heterologen Nucleotid-Sequenz in das Genom analysiert, z. B. mittels genetischer oder molekularbiologischer Techniken (z. B. PCR und Verwendung von Nucleotidsonden für Southern Hybridisierung). Pflanzen oder Zellen derselben, die die heterologe Nucleotid- Sequenz in einen gewünschten Gen-Ort eines Chromosoms, das homolog zu dem Chromosom ist, das die nicht herausgeschnittene heterologe Nucleotid-Sequenz enthält, kann dann ausgewählt werden. So kann die transgene Pflanze der Erfindung direkt erhalten werden. Vorzugsweise werden Pflanzen und Zellen derselben ausgewählt, die frei von der herausgeschnittenen heterologen Nucleotid-Sequenz sind. Das Auswählen kann eine Analyse mittels genetischer oder molekularbiologischer Techniken umfassen. Vorzugsweise wird die Auswahl von einem Counter-Selektionsmarker in der herauszuschneidenden heterologen Sequenz unterstütz. Die erste und die zweite Pflanze werden vorzugsweise homozygot für die nicht herausgeschnittene heterologe Sequenz gemacht.
  • Das Herausschneiden kann beispielsweise unter Verwendung ortsspezifischer Rekombinasen (vergleiche Fig. 2E) bewerkstelligt werden. Es ist besonders bequem, das Herausschneiden unter Verwendung von Transposons, insbesondere nicht autonomer Transposons (d. h. eines Transposons, das nicht für die betreffende Transposase kodiert) zu bewerkstelligen. Für diese Ausführungsform wird die erste und/oder die zweite heterologe Nucleotid-Sequenz in der heterologen Vorläufer-Nucleotid-Sequenz in ein solches Transposon eingebettet. Das Herausschneiden beinhaltet die Bereitstellung einer Transposase für das Transposon. Insbesondere
    • A) ist die erste heterologe Nucleotid-Sequenz in der heterologen Vorläufer-Nucleotid-Sequenz in einem ersten Transposon enthalten, und die zweite heterologe Nucleotid-Sequenz ist in einem zweiten Transposon enthalten und
    • B) die erste heterologe Nucleotid-Sequenz wird durch Bereitstellen einer ersten Transposase, die mit dem ersten Transposon funktionell ist, herausgeschnitten, und die zweite heterologe Nucleotid-Sequenz wird durch Bereitstellen einer zweiten Transposase, die mit dem zweiten Transposon funktionell ist, herausgeschnitten.
  • Das erste und das zweite Transposon in der heterologen Vorläufer-Nucleotid-Sequenz überlappen vorzugsweise, so dass das Herausschneiden der ersten oder der zweiten heterologen Nucleotid-Sequenz zur Zerstörung des zweiten bzw. des ersten nicht-autonomen Transposons führt. Überlappende Transposons werden vorteilhafterweise mit einem Selektions- und einem Counter-Selektionsmarker im überlappenden Bereich, wie in den Fig. 7 und 8 dargestellt, verwendet.
  • In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die erste und die zweite Pflanze oder Zellen derselben dann hybridisiert, um die transgene multizelluläre Pflanze der Erfindung zu erhalten. Die Hybridisierung kann sexuelles Kreuzen oder die Fusion von Zellen der Pflanzen sein. Die Zelifusion kann eine Fusion von Keimzellen oder von somatischen Zellen sein. Vorzugsweise beinhaltet das Hybridisieren das Bestäuben von Pflanzen oder die Zellfusion von Protoplasten von somatischen Zellen. Sexuelles Kreuzen von Pflanzen ist am bevorzugtesten. Das Hybridisieren bringt die Fragmente, die für das Merkmal kodieren oder daran beteiligt sind, in einer Pflanze oder in Zellen derselben zusammen, so dass die Pflanze das gewünschte Merkmal infolge des Trans-Spleißens von Proteinen exprimiert. Exprimieren des Merkmals infolge Bindens oder Trans-Spleißens von Proteinen bedeutet, dass das Binden oder das Trans-Spleißen eine notwendig Bedingung für die Expression des gewünschten Merkmals ist. Die Herstellung des transgenen Organismus der Erfindung kann zusätzlich zum Hybridisieren weitere Schritte umfassen. Im Falle von Pflanzen sind Beispiele für solche weiteren Schritte u. a.: Heranziehen und Ernten von Samen, Aussäen und Heranziehen der Pflanzen der Erfindung. Im Fall der Fusion von Protoplasten sind solche weiteren Schritte u. a.: Vermehren der fusionierten Protoplasten, um Kolonien zu erhalten; die Regeneration von Pflanzen.
  • Die kontrollierte Weitergabe des Merkmals an Nachkommen bedeutet, dass die Wahrscheinlichkeit der Weitergabe des Merkmals an Nachkommen im Vergleich zu konventionellen transgenen Organismen, die ein an dem Merkmal beteiligtes Transgen in einem Gen-Ort eines Chromosoms kodiert haben, insbesondere in einer Transkriptionseinheit oder auf heterologen Chromosomen, signifikant reduziert ist. Die Häufigkeit des Auftretens des Merkmals in Nachkommen nach Kreuzen der transgenen multizellulären Pflanze der Erfindung mit einer Pflanze, die die erste und die zweite heterologe Sequenz nicht enthält, niedriger als 10%, vorzugsweise niedriger als 1%, noch bevorzugter niedriger als 0,1%, noch bevorzugter weniger als 0,01% und am bevorzugtesten geringer als 0,001% ist. Zum Vergleich beträgt die Häufigkeit des Auftretens eines Transgens in Nachkommen nach Kreuzen eines konventionellen transgenen (diploiden) Organismus, der das Transgen in einer Transkriptionseinheit enthält und bezüglich des Transgens heterozygot ist, mit einem anderen Organismus derselben Art, der das Transgen nicht enthält, ungefähr 50%. Ob eine transgene Pflanze, die ein gewünschtes Merkmal exprimiert, die Kriterien dieser Erfindung bezüglich der Häufigkeit der Weitergabe erfüllt, kann experimentell leicht überprüft werden.
  • Unter Peptidbindung wird hier die Amidbindung zwischen der Carboxylgruppe eines Polypeptids und der Aminogruppe eines anderen Polypeptids verstanden. Die Bindung erlaubt keine frei Rotation und kann in Cis- oder in Transkonfiguration auftreten, wobei mit Ausnahme von Peptidbindungen an die Aminogruppe von Prolinen, die Transkonfiguration in natürlichen Peptiden am häufigsten ist (Quelle: http:/ / www.mblab.gla.ac.us/dictionary/). Die Bildung einer Peptidbindung kann mittels Intein-vermittelten Trans-Spleißens erreicht werden.
  • In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden transgene multizelluläre Pflanzenorganismen erhalten. Unter Pflanzen sind Nutzpflanzen, darunter Gerste, Hafer, Roggen, Weizen, Zea- Mais, Reis, Hirse, Kartoffeln, Raps, Kanola, Tomaten, Baumwolle, Sorghum und Tabak bevorzugt. Die Verfahren der Erfindung können auf diploide oder auf polyploide Pflanzen angewandt werden.
  • Beispiele für Merkmale, die gemäß der Erfindung insbesondere in Pflanzen exprimiert werden können, sind männliche Sterilität, Herbizidresistenz, Insektizidresistenz, Selektionsmarker, Counter-Selektionsmarker, Morphologie von Organismen, Sameninhalt, Samenstabilität, Klimaadaption, Vitamingehalt, Kohlenhydratgehalt und -zusammensetzung, Fettgehalt und -zusammensetzung usw. Ferner kann das Merkmal die Expression eines gewünschten Proteins, insbesondere eines pharmazeutischen Proteins sein. Beispiele für solche Proteine werden unten angegeben. In einem Fall (vergleiche Beispiel 1) wird ein Reporter-Gen in einer Pflanze gemäß der Erfindung exprimiert. In einem anderen Beispiel der Erfindung (Beispiel 2) wird das EPSPS(5-Enolpyruvylschikimat-3-phosphat-Synthase)-Gen, das Herbizidresistenz, wie z. B. Glyphosat-Resistenz, verleiht, exprimiert. Die multizellulären Pflanzen und die transgenen multizellulären Pflanzen der Erfindung können zusätzlich genetisch oder transient modifiziert sein, z. B., um Funktionen bereitzustellen, die für das Trans-Spleißen und/oder das Exprimieren des gewünschten Merkmals nötig sind. Ferner kann ein zweites Transgen exprimiert werden, das bei der Expression des gewünschten Merkmals oder eines anderen Merkmals beteiligt ist.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann für eine große Anzahl von Anwendungen eingesetzt werden. Es kann z. B. zur Expression eines gewünschten Merkmals in dem transgenen Organismus verwendet werden. Das Merkmal kann irgendeine Eigenschaft des Organismus sein, unabhängig davon, ob es von einem einzigen oder von mehreren Genen kodiert wird. Das Merkmal kann durch Expression mindestens eines Proteins verursacht sein. Zwei oder mehr Proteine können für das Merkmal nötig sein. In diesem Fall kann es ausreichend sein, die Expression von nur einem Protein gemäß der Erfindung zu kontrollieren. Es ist jedoch für die Umwelt sicherer, alle Proteine, die ein Merkmal hervorrufen, gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren zu kontrollieren.
  • Die Erfindung erlaubt ferner das Zusammenfügen einer Sequenz, die für ein Protein kodiert, aus Modulen, z. B. von Signalpeptiden, Bindungsdomänen, Retentionssignalen, Transmembransignalen, Aktivitätsdomänen, Domänen mit enzymatischer Aktivität, Affinitätssignale (-tags) und Regulator-Sequenzen. Ein solcher modularer Ansatz macht es einfach, eine optimale Expressionskassette für einen bestimmten Zweck oder ein optimales Segretions- oder Signalpeptid für ein bestimmtes Gen, das überexprimiert und in der Zelle oder einem bestimmten Kompartment angereichert werden soll, aufzufinden. Es könnte zur funktionellen Genomanalyse und Proteomanalyse wertvoll sein. Zum Beispiel kann eine Pflanzenbibliothek geschaffen werden, wobei jede Pflanze der Bibliothek ein bestimmtes Modul (z. B. ein spezifisches Signalpeptid) einer der oben genannten Klassen von Modulen, z. B. als das erste Fragment, enthält. Das zweite Fragment kodiert dann für das gewünschte Protein. Infolge der Hybridisierung wird die Sequenz des Proteins mittels Trans-Spleißens an das Modul gekoppelt.
  • Eine besonders wichtige Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Herstellung von hybriden Samen zur Erzeugung von Pflanzen für landwirtschaftliche Zweck oder zur Proteinproduktion in den Pflanzen, wobei die Weitergabe eines Merkmals der Pflanzen an Nachkommen kontrolliert ist. Die hybriden Samen erlauben die Erzeugung von Pflanzen, die ein gewünschtes Merkmal exprimieren, das weder in der Elternlinie exprimiert wird und in den Nachkommen schnell segregiert.
  • Die Erfindung stellt weiterhin einen transgenen multizellulären pflanzlichen Organismus bereit, der ein gewünschtes Merkmal exprimiert, bei dem die Weitergabe des Merkmals von dem Organismus an Nachkommen kontrolliert ist, wobei die Expression des Merkmals die Produktion eines Proteinmoleküls mittels Trans-Spleißens von Polypeptid-Fragmenten beinhaltet, wobei die Polypeptid-Fragmente auf verschiedenen heterologen Nucleotid- Sequenzen kodiert werden. Die verschiedenen heterologen Nucleotidmoleküle sind in homologe Chromosomen der Pflanze eingefügt. Vorzugsweise bilden die Polypeptide nach dem Trans-Spleißen oder einer spezifischen Polypeptid-Interaktion ein heterologes Protein. Die Erfindung umfasst weiterhin Teile oder Produkte der transgenen Organismen der Erfindung und Pflanzensamen, die durch das Hybridisieren erhalten werden. Ferner Pflanzen oder Pflanzenmaterial (insbesondere Samen oder Zellen derselben), die gemäß Schritt (i) oder (ii) von Anspruch 1 erhalten werden oder erhältlich sind. Ferner werden Vektoren zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung bereitgestellt, wobei die Vektoren die heterologen Vorläufer-Nucleotid-Sequenz, wie hier definiert, umfasst. Ferner wird ein Vektor bereitgestellt zur Durchführung des in einem der Ansprüche 8 bis 13 definierten Verfahrens.
  • Zusammenfassend wird hier ein Verschlusssystem für Merkmale/Gene vorgeschlagen, das auf dem modularen Prinzip der Schaffung des Merkmals durch Zusammenfügen von nichtfunktionellen Protein-Fragmenten oder-Untereinheiten zu einem funktionellen Protein beruht. Dieses System beruht auf der genetischen Kontrolle eines gewünschten Gens über mindestens zwei Genorte, die beim Kreuzen unabhängig voneinander segregieren, insbesondere beim unerwünschten sexuellen Kreuzen oder bei einem horizontalen Gentransfer. Bei diesem Verschlusssystem für ein funktionelles Protein zusammengefügt, wenn die nötigen Genorte in derselben Zeile oder im selben Organismus vorhanden sind und exprimiert werden. Diese Schaffung einer Funktion wird vorzugsweise über Trans-Spleißen erreicht. Es war bereits bekannt, das Intein-vermitteltes Trans-Spleißen das Zusammenfügen eines funktionellen Proteins aus nicht unktionellen Protein-Fragmenten in vitro erlaubt (Mills et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 3543-3548) sowie in verschiedenen Mikroorganismen (Schingledecker et al., 1998, Gene, 207, 187-195; Wu et al., 1998, Proc. Nafl. Acad. Sci USA, 95, 9226-9231; Sun et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol., 67, 1025-29; Chen et al., 2001, Gene, 263, 39-48). Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf Trans-Spleißen als Mechanismus des Zusammenfügens eines Proteins beschränkt. Ein solches Zusammenfügen, das zu einem gewünschten Merkmal führt, kann auch durch Bereitstellen verschiedener Untereinheiten eines heteromeren Proteins erreicht werden, vorausgesetzt, dass (a) die Funktionsfähigkeit des gewünschten Proteins vom Vorliegen der fraglichen Untereinheiten abhängt, und dass (b) die Gene der Komponenten so kodiert sind, dass unerwünschte Kreuzungen verhindert werden.
  • Die hier verwendete Verschlusstechnik zielt auf dasselbe Ergebnis ab wie das Verschlusssystem unter Verwendung von trans-spleißenden Ribozymen (PCT/EP02/04724). Die dahinter stehenden Techniken sind jedoch völlig verschieden und haben verschiedene Anwendungen. Die Verschlusssysteme unter Verwendung von Trans-Spleißen von Messenger- RNA sind hochgradig spezifisch, können zum Targeting von wild-typ mRNA verwendet werden, jedoch ist die Effizienz des Trans-Spleißens niedrig und die RNA-Spezies müssen im selben subzellulären Kompartiment vorliegen. Andererseits kann Protein-Spleißen zwischen mindestens zwei genetisch veränderten Genorten geschehen, es läuft in vitro mit sehr hoher Effizienz ab, was das quantitative Spleißen von Vorläufer-Polypeptiden erlaubt, und es kann zwischen Polypeptiden stattfinden, die in verschiedenen Genomen von Organellen kodiert sind, wie dem Kern-Genom, Plastid- oder mitrochondriellen Genomen oder extrachromosomalen Episomen, sofern die translatierten Polypeptide zum selben Organell geleitet werden. Es sollte erwähnt werden, dass die hier beschriebene Technik auch auf multizelluläre Tiere angewandt werden kann. Menschen sind jedoch ausgeschlossen.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Fig. 1 Allgemeines Schema des Intein-vermittelten Trans-Spleißens, das zu einem funktionellen Protein führt.
  • Fig. 2A zeigt das allgemeine Prinzip der Erfindung, bei dem die Trans-Spleißing-vermittelte Bildung eines funktionellen Proteins in Zellen hybrider Nachkommen stattfindet;
  • Fig. 2B zeigt vier mögliche relative Anordnungen der ersten und der zweiten heterologen Nucleotid-Sequenz auf Chromosomen eines Wirtsorganismus. Die Fälle III und IV zeigen relative Anordnungen der heterologen Sequenzen in der transgenen multizellulären Pflanze der Erfindung. Ein diploider Organismus mit zwei Chromosomen und einem gewünschten Merkmal, das von zwei Fragmenten (A und B) kodiert wird, dient als Beispiel.
  • Fig. 2C zeigt ein Grundprinzip zum Erreichen alleler Anordnungen der ersten und zweiten heterologen Nucleotid-Sequenzen zum Trans-Spleißen mittels ortsgerichteter Integration.
  • Fig. 2D zeigt ein Grundprinzip zum Erreichen alleler Anordnungen der ersten und zweiten heterologen Nucleotid-Sequenzen zum Trans-Spleißen mittels Transposition.
  • Fig. 2E ist ein allgemeines Schema von Methoden zum Erreichen alleler Anordnungen verschiedener heterologer Nucleotid-Sequenzen auf homologen Chromosomen.
  • Fig. 3 zeigt schematisch die T-DNA-Bereiche der Plasmide plC5'gfpint und plCintgfp3'.
  • Fig. 4 zeigt schematisch die T-DNA-Bereiche der Plasmide plC5'epsp-int und plCint-epsp3.
  • Fig. 5 zeigt schematisch die T-DNA-Bereiche der Plasmide plCS'epsp-intM und plCintepsp3'M.
  • Fig. 6 zeigt schematisch ein Konstrukt, das zum Erreichen alleler Anordnungen der 5'- oder 3'-Teile der EPSP-Kodiersequenz (A) und seiner Derivate (B und C) entworfen wurde, nach dem Herausschneiden nicht autonomer Transposon-Elemente (Ds bzw. dSpm), durch Bereitstellen einer Quelle für eine Transposase.
  • Fig. 7 zeigt ein allgemeines Schema eines Konstrukts zum Erreichen alleler Anordnungen verschiedener heterologer DNA-Fragmente (hDNA 1 und hDNA 2) mittels Transpositions-vermittelter Entfernung unerwünschter Fragmente nach Anwendung einer Quelle einer Transposase. SM-selektierbare Transformationsmarker; CSM- Counter-selektierbare Marker.
    Oben sind die unerwünschten Fragmente gezeigt, die durch die Wirkung der entsprechenden Transposase herausgeschnitten wurden. Unten sind die gewünschten Fragmente gezeigt, die bei der Transposition zurückbleiben.
  • Fig. 8 zeigt schematisch eine Methode zur Erzeugung von Pflanzen mit verschiedenen heterologe DNA-Fragmenten (hDNA 1 und hDNA 2) in alleler Anordnung unter Einsatz der Transposition. Den Nachkommen von Pflanze 1 wird eine Transposase durch Kreuzen von Pflanze 1 mit Pflanze 2 bereitgestellt. SM-Selektionsmarker-Gen; CSM- Marker-Gen zur Gegenselektion; TPase-Transposase.
  • Fig. 9 zeigt intermediäre Konstrukte und binäre Vektoren, wie sie zur Herstellung der in Fig. 3 und 4 gezeigten Konstrukte verwendet werden.
  • Fig. 10 zeigt eine Genkarte von Plasmid plCH5300.
  • Fig. 11 zeigt eine Genkarte des binären Vektors von Icon Genetics plCBV16.
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • In dieser Erfindung wird vorgeschlagen, die Kodiersequenz eines an einem gewünschten Gen beteiligten Transgens in zwei oder mehr Fragmente zu spalten, die auf der Proteinebene aneinander gekoppelt werden können, insbesondere mittels Trans-Spleißen. Diese Fragmente enthaltende heterologe Nucleotid-Sequenzen werden in das Genom einer Wirtspflanze eingeführt, vorzugsweise in homologe Chromosomen oder in das Genom und das Plastom einer transgenen multizellulären Pflanze über Hybridisierung von Elternpflanzen. Nach Transkription und Translation können die Protein-Fragmente mittels Trans-Spleißen zusammenfügt werden, wobei ein funktionelles Protein entsteht, insbesondere ein Protein, das das gewünschte Merkmal hervorruft. Da Pflanzenzüchtungsverfahren üblicherweise spezifische Kreuzungen von Elternpflanzen umfasst, bereitet das erfindungsgemäße Verfahren keine ernsthaften weiteren Probleme. Jede unerwünschte, spontane Kreuzung zwischen der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen und unerwünschten Organismen führt effektiv zum Zerfall des Merkmals, was die Expression verhindert und die Wahrscheinlichkeit der Weitergabe eines funktionellen Gens an unerwünschte Nachkommen stark vermindert.
  • Erfindungsgemäß kann entweder die Expression des Transgens selber kontrolliert werden, oder die transgene Sorte kann kontrolliert werden, wenn die Nachkommen einer unerwünschten Kreuzung nicht überlebensfähig sind. Unter anderem werden diese beiden Möglichkeiten für diese Erfindung in Betracht gezogen.
  • Ferner kann ein Fachmann Verfahren zur Selektion von Primärtransformanten entwickeln, das auf einem Selektionsmarker beruht, der in T0-Nachkommen wirkt, dessen Fragmente oder Allele jedoch bei nachfolgenden Kreuzungen zu verschiedenen transgenen Nachkommen segregieren und so als funktionelles Selektionsmarker-Gen verschwindet.
  • Ferner erlaubt die Erfindung das schnelle Zusammenfügen in vivo von verschiedenen Genen durch Kreuzen von Eltern, die verschiedene Fragmente einer gewünschten Transkriptionseinheit enthalten, was den Austausch verschiedener funktioneller Domänen, wie von Translations-Enhancern, Leit- oder Signalpeptiden, Reinigungs-Tags (purification tags), verschiedener funktioneller Proteindomänen usw., durch einfaches Kreuzen von Pflanzen erlaubt, die gewünschte Fragmente eines solchen funktionellen Gens enthalten.
  • Das Binden der Proteine und/oder das Trans-Spleißen kann über genetisch veränderte Inteine erreicht werden. Inteine wurden ursprünglich als Protein-Sequenzen identifiziert, die in-frame in Proteinvorläufern eingefügt sind und bei der Proteinreifung herausgeschnitten werden (Perler et al., 1994, Nucleic Acids Res., 22, 1125-1127; Perler, F. B., 1998, Cell, 92, 1-4). Alle Informationen und katalytischen Gruppen, die zum Selbst-Spleißen nötig sind, liegen in dem Intein und zwei flankierende Aminosäuren. Der chemische Mechanismus des Proteinspleißens wird im Detail von Perler und Kollegen (1997, Curr Opin. Chem. Biol., 1, 292-299) und von Shao & Kent (1997, Chem. Biol., 4, 187-194) beschrieben. Inteine bestehen üblicherweise aus N- und C-terminalen Spleißregionen und einem zentralen Homing-Endonucleasen-Bereich oder einer kleinen Linkerregion. Über 100 Inteine aus Kern- und Organell-Genomen verschiedener Orgasnismen, darunter Eukaryoten, Archaebakterien und Eubakterien sind bekannt (http:/ / www.neb.com/neb/inteins.html). Es wurde gezeigt, dass Inteine zum Trans-Spleißen befähigt sind. Das Entfernen des Homing-Endonucleasen-Bereichs hat keinen Effekt auf das Selbst-Spleißen des Inteins. Dies ermöglichte unter anderem die Entwicklung von Trans-Spleiß- Systemen, bei denen die N-terminalen und C-terminalen Fragmente des Inteins als getrennte Fragmente koexprimiert werden und, wenn sie mit Exteinen verbunden sind (Protein- Fragmente, die mit Hilfe eines Inteins verbunden werden können), in vivo zum Trans-Spleißen befähigt sind (Shingledecker et al., 1998, Gene, 207, 187-195). Ebenso wurde mit den N- und C-terminalen Segmenten des RecA-Inteins aus Mykobakterium tuberculosis gezeigt, dass Protein-Trans-Spleißen in vitro stattfinden kann (Mills et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 3543-3548). Dieses Phänomen wurde auch am DnaE-Protein aus Synechocystis Sp.- Stamm PCC6803 gefunden (Wu et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 9226-9231).
  • Dieses Protein wird von zwei Genen kodiert, die auf entgegengesetzten DNA-Strängen mehr als 700 Kb.p. entfernt liegen. Es wurde gezeigt, dass die von diesen Genen kodierten Intein- Sequenzen ein gespaltenes Mini-Intein darstellen und in Esherichia coli Trans-Spleißing- Aktivität haben. Das Intein aus derselben Quelle (DnaE-Intein aus Synechocystis sp.-Stamm PCC6803) wurde zur Herstellung funktioneller Herbizidresistenz über Acetolactat-Synthase II aus zwei nicht verknüpften Fragmenten (Sun et al., 2001, AppL Environ. Microbiol., 67, 1025-29) und von 5-Enolpyruvylschikimat-3-Phosphat-Synthase (EPSPS) (Chen et al., 2001, Gene, 263, 39-48) in E. coli verwendet.
  • Das allgemeine Prinzip des Intein-vermittelten Trans-Spleißens ist in Fig. 1 gezeigt. Eine andere gut etablierte Anwendung von Inteinen ist ihre Verwendung in Protein- Reinigungssystemen (für eine kurze Übersicht siehe Amitai & Pietrokovski (1999, Nature Biotechnol., 17, 854-855). Das Herausschneiden eines Inteins setzt das Extein als freies Protein-Molekül nach pH- oder Temperaturänderungen frei (Soutworth et al., 1999, Biotechniques, 27, 110-114). Nucleophile Agenzien (z. B. DTT) starten ebenso die Spaltung, bleiben jedoch kovalent an das freigesetzte Protein gebunden (Klabunde et al., 1998, Nat.
  • Struct. Biol., 5, 31-37). Unseres Wissens nach gibt es keinen Stand der Technik, der die Verwendung von Inteinvermitteltem Trans-Spleißing von Proteinen zum Aufbau eines gewünschten Merkmals in Pflanzen auf biologisch sichere Art und Weise beschreibt. Fig. 2A zeigt ein allgemeines Schema zur Zusammenstellung eines Merkmals durch Trans-Spleißen in F1-Nachkommen. Keine der Elternlinien (P1 und P2) verfügt über ein funktionelles kontinuierliches Gen, das für das Merkmal kodiert. Jede enthält ein Fragment (A oder B) des Gens, die vorzugsweise auf homologen Chromosomen liegen. Als Folge der Hybridisierung zwischen P1 und P2 entstehen Nachkommen, die über das funktionelle Merkmal infolge des Zusammenbaus von von Fragment A und B kodierten Proteinen durch Trans-Spleißen verfügen. Aus der Figur ist ersichtlich, dass nur ein Viertel der S1-Nachkommen, die von Selbstbestäubung der Primärhybride herrühren, das gewünschte Merkmal noch enthalten, während die Hälfte nur eines der zwei für das Merkmal nötigen Fragmente erbt, und ein Viertel erbt weder A noch B. Es ist offensichtlich, dass Fremdbestäuben (cross-pollination) mit einer anderen Pflanze (illicit cross), die keines der Fragmente A und B enthält, nicht zur Weitergabe des Merkmals führt, da nur eines der zwei für das funktionelle Gen nötigen Fragmente an jeden Nachkommen weitergegeben wird.
  • Es gibt mehrere gut entwickelte Ansätze und veränderte lnteine, die zur Durchführung dieser Erfindung verwendet werden können (siehe oben genannte Referenzen). Praktisch alle bekannten Typen von Inteinen können zum Engineering von Trans-Spleißen in eukaryotischen Zellen verwendet werden. In Beispiel 3 beschreiben wir eine Intein-vermittelte Interaktion, die zwei Domänen der EPSP-Synthase zusammenbringt, was Herbizidresistenz verleiht. Dies demonstriert die Möglichkeit, ein funktionelles Protein-Dimer durch Zusammenbringen der für die Funktion nötigen Domänen zusammen zu bauen, ohne dass Trans-Spleißen stattfindet. Solche Intein-vermittelten Protein-Protein-Interaktionen bieten eine Alternative für Spezialfälle, um ein Merkmal ohne Trans-Spleißen zu erhalten.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren bietet einen bequemen Weg zum Zusammensetzen einer gewünschten Sequenz und/oder Expressionseinheit aus verschiedenen Teilen in trans, wobei verschiedene transgene Pflanzen als Module oder Bausteine verwendet werden. In den hybriden Nachkommen werden von verschiedenen Eltern geerbte Module mittels Inteinvermittelten Trans-Spleißens zusammengefügt. Man kann ein gewünschtes Merkmal durch Auswahl eines geeigneten Paars transgener Eltern, die die geeigneten Sequenzen enthalten, generieren, ganz ähnlich wie die Auswahl eines geeigneten Paars von Elternpflanzen zur Herstellung von hochwertigen Hybridsamen beim konventionellen Züchten. Beispiele für solche Module sind unter anderem verschiedene Signalpeptide, Bindungsdomänen (z. B. Cellulose, Pektin, Stärke-bindende Domänen usw.), Retentionssignale, Kompartimentalisierungssignale, Aktivierungsdomänen, Domänen mit enzymatischer Aktivität, Affinity-Tags, Regulator- Sequenzen, verschiedene gewünschte Gene und Teile davon. In dieser Hinsicht ist ein "gewünschtes Merkmal" weit auszulegen und umfasst nicht nur ein funktionelles Protein mit einer speziellen Fähigkeit, sondern insbesondere ein in ein spezielles Kompartiment oder eine makromolekulare Matrix geleitetes Protein oder ein für die nachfolgende Isolierung/Reinigung genetisch verändertes Protein.
  • Weiterhin hat Trans-Spleißen auf der Proteinebene viele wichtige Vorteile, die RNA-Trans- Spleißen nicht aufweist. Diese Vorteile sind das Ergebnis der folgenden Eigenschaften:
    • a) Intein-vermitteltes Trans-Spleißen führt direkt zu einem Proteinmolekül, während Ribozymvermitteltes Trans-Spleißen zu einem RNA-Molekül führt, das in den meisten Fällen zu einem Protein translatiert werden soll, was die Auswahlmöglichkeiten eines zellulären/interzellulären Kompartiments für das Trans-Spleißen beschränkt;
    • b) das Targeting der Komponenten für das Intein-vermittelte Trans-Spleißen ergibt ein hohes Maß an Flexibilität, während das Targeting von RNA-Molekülen hauptsächlich auf das Cytosol beschränkt ist;
    • c) genetisch veränderte Inteine ermöglichen zusätzlich eine Regulation des Trans-Spleißens durch Änderung des pH, der Temperatur oder eines nucleophilen Mittels;
    • d) zum Trans-Spleißen modifizierte Inteine interagieren mit hoher Effizienz und können Protein- Domänen zusammenbringen, die nach einer solchen Interaktion eine enzymatische Aktivität haben, auch ohne kovalente Bindung durch Trans-Spleißen.
  • Eine solche Vielfalt in der Wahl der Parameter für eine Regulation des Intein-vermittelten Trans- Spleißens oder der Interaktion (Kombination der Wahl der Kompartimentierung mit der Modulation abiotischer Parameter) ergibt eine hohe Flexibilität im Vergleich zum RNA-Trans- Spleißen.
  • All diese potentiellen Anwendungen haben jedoch einen begrenzten Wert, sofern nicht bekannt ist, wie die günstigste Anordnung der heterologen Fragmente relativ zueinander, vorzugsweise auf Kern-Chromosomen, erreicht werden kann.
  • Gemäß dieser Erfindung sind die Fragmente auf verschiedenen homologen Chromosomen (Fig. 2B, Fall III und IV). Im Fall III können eigene Nachkommen (self-progeny) das Merkmal erben. Nachkommen, die durch Kreuzen mit Pflanzen, die keines der Fragmente enthalten, erhalten werden, erben das Merkmal nicht, wenn Crossing-over in der Meiose nicht vorkommt oder vernachlässigt wird. Eine meiotische Rekombination zwischen den beiden homologen Chromosomen kann jedoch die Fragmente A und B physisch koppeln. Die Häufigkeit solcher Rekombinationsereignisse hängt direkt vom relativen Abstand zwischen den Fragmenten auf den beiden homologen Chromosomen ab.
  • Um eine physische Kopplung der Fragmente bei einer meiotischen Rekombination zu unterdrücken, werden die Fragmente vorzugsweise mit kurzem relativem Abstand auf homologe Chromosomen gesetzt, oder am bevorzugtesten am selben Gen-Ort auf den homologen Chromosomen (Fig. 2B, Fall IV), womit die Häufigkeit einer meiotischen Rekombination zwischen den Fragmenten praktisch auf Null reduziert wird. Es gibt verschiedene technische Lösungen, um eine solche vorteilhafteste allele Anordnung der Fragmente zu erreichen. Die Fragmente können in genetisch modifizierte Integrationsstellen mittels unspezifischer Rekombination in denselben Gen-Ort integriert werden (Fig. 2C). Beispiele für solche Systeme sind unter anderem das Cre-Lox-System aus dem Bakteriophagen P1 (Austin et al., 1981, Cell, 25, 729-736), das Flp-Frt-System aus Saccharomyces cerevisiae (Broach et al., 1982, Cell, 29, 227-234), das R-RS-System aus Zygosaccharomyces rouxii(Araki et al., 1985, J. Mol. BioL, 182, 191-203) und die Integrase aus dem Streptomyces-Phagen PhiC31 (Thorpe & Smith, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci., 95, 5505-5510; Groth et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci., 97, 5995-6000).
  • Die Fragmente A und B können in chromosomale DNA als ein Konstrukt AB integriert werden (Fig. 2D). Der Aufbau des Konstrukts sollte das selektive Entfernen eines der DNA-Fragmente (A oder B) über einen Mechanismus der kontrollierten DNA-Umordnung (Exzision oder Transposition) erlauben, wobei Nachkommen erhalten werden, die entweder Fragment A oder Fragment B im selben Gen-Ort enthalten. Wenn beide Fragmente oder deren Transkripte zusammen gebracht werden, indem Pflanzen gekreuzt werden, die jeweils eines der Fragmente oder beide Fragmente, jedoch nur eins der nötigen Transkripte, enthalten, wird dies zur Expression des gewünschten Merkmals führen.
  • Ein Beispiel der kontrollierten DNA-Umorganisation ist das Flankieren der Fragmente A und B mit Sequenzen, die von verschiedenen ortsspezifischen Rekombinasen erkannt werden, und Bereitstellen der entsprechenden Rekombinase, woraufhin selektiv entweder Fragment A oder Fragment B entfernt wird. Alternativ kann die Anordnung einer von invertierten Rekombinationsstellen flankierten Transkriptionsinitiationsregion (Promotor) zur selektiven Transkription von entweder Fragment A oder Fragment B führen, je nach der Orientierung der Transkriptionsinitiationsregion. Die Umkehrung der Orientierung (jedoch nicht das Herausschneiden) dieser Region kann induziert werden, wenn sie einer Quelle der Rekombinase ausgesetzt wird. Im Ergebnis ist es möglich, die selektive Transkription von entweder Fragment A oder Fragment B zu erreichen, ohne sie (physisch) zu entfernen, sondern unter Verwendung der DNA-Umkehrung als Schalter. Jedoch ist das selektive Exprimieren eines heterologen DNA-Fragments in der Gegenwart beider heterologer DNA-Sequenzen am selben Gen-Ort nicht unter den bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung, da es möglicherweise nicht das nötige Maß Kontrolle über die Expression und Weitergabe des Merkmals gestattet.
  • Eine wichtige Ausführungsform der kontrollierten DNA-Umordnung verwendet Transposition, wobei eines der Fragmente, z. B. Fragment B, in einem nicht-autonomen transponierbaren Element liegt und dort transkribiert wird, und wobei das Herausschneiden aus dem Konstrukt die Transkription von Fragment A auslöst. Das Herausschneiden des Transposons kann von der Reinsertion an einem anderen Ort gefolgt werden, muss dies jedoch nicht. Dann können Nachkommen selektiert werden, die nur Fragment A oder B enthalten. Wenn man in Betracht zieht, dass die meisten Reinsertionen von Transposons an Orten geschehen, die mit der Donorstelle eng gekoppelt sind (Jones et al., 1990, Plant Cell, 2, 701-707; Carroll et al., 1995, Genetics, 139, 407-420), ist die Wahrscheinlichkeit, Nachkommen zu selektionieren, die Fragment A und B auf verschiedenen Chromosomen eines Chromosomenpaares (linked in repulsion) haben, sehr hoch. Fig. 2E fasst eine Anzahl von Möglichkeiten zum Bewerkstelligen einer allelen Anordnung der ersten und der zweiten heterologen Nucleotid-Sequenz zusammen, darunter ortsgerichtete Integration und die Exzision der Fragmente. Das Transposase-vermittelte oder Rekombinase-vermittelte Herausschneiden der Fragmente kann mit Hilfe eines (Fig. 2E, a/, a'/, d/ und d'/) oder zweier verschiedener Transposon- oder Rekombinase-Systeme (Fig. 2E, b/, b'/, c/, c'/, e/, e'/, f/ und f'/ erreicht werden. Die Verwendung zweier verschiedener Systeme ist bevorzugt. Die Verwendung zweier verschiedener Transposons ist bevorzugter. Die Verwendung zweier verschiedener Transposons mit überlappenden Transposonenden (c/ und c'/) ist die vorteilhafteste Ausführungsform.
  • Der mögliche Aufbau von Konstrukten führt den Zusammenbau eines Merkmals mittels Inteinvermitteltem Trans-Spleißen (Fig. 3 und 4) oder mittels der Intein-vermittelten Interaktion von Proteinfragmenten (Fig. 5) wird in den Beispielen 1, 2 und 3 beschrieben. Die Verwendung der ortsspezifischen Rekombination oder Transposition erlaubt die Positionierung der ersten und der zweiten heterologen Nucleotid-Sequenz aus einem Konstrukt am selben Gen-Ort auf homologen Chromosomen, das für die kontrollierte Weitergabe eines gewünschten Merkmals an Nachkommen am bevorzugtesten ist. Eine schematische Darstellung eines solchen Konstrukts (in der T-DNA eines Vektors für die Agrobakterium-vermittelte Transformation) und das Herausschneiden einer oder der anderen heterologen Nucleotid-Sequenzen unter Verwendung von verschiedenen pflanzlichen Transposon-Systemen (Spm/Spm und Ac/Ds) ist in Fig. 6 gezeigt. Hier liegen die beiden Komponenten (heterologe Nucleotid-Sequenzen) des lntein-Trans-Spleißing-Systems in derselben T-DNA (Fig. 6A), jedoch sind sie von verschiedenen Transposonenden (Ds oder dSpm) flankiert, die von verschiedenen Transposasen, Ac bzw. Spm erkannt werden. Das Konstrukt in der T-DNA enthält zwar nichtautonome transponierbare Elemente, die an einem Ende überlappen. Wenn eine Pflanze oder eine Pflanzenzelle, die ein solches Konstrukt trägt, einer Quelle der Spm- oder der Ac- Transposase ausgesetzt wird, wird das zum Herausschneiden des Fragmentes führen, das von den Ds-Sequenzen (mit Ac-Transposase) flankiert ist, oder zum Herausschneiden des Fragments, das von der dSpm-Sequenzen (mit der Spm-Transposase) flankiert ist. Die erhaltenen T-DNA-Strukturen sind in Fig. 6B bzw. 6C gezeigt. Die erhaltenen Konstrukte sind sogar in Gegenwart von Spm-Transposase (im Fall von B) oder in Gegenwart der Ac- Transposase (im Fall von C) stabil, da jeweils eines der beiden Enden des nicht-autonomen Transposons, das für die Transposition nötig ist, zusammen mit dem anderen nicht-autonomen transponierbaren Element herausgeschnitten wird. Diese Stabilisierung des zurückbleibenden Transposons ist äußerst nützlich, insbesondere im Fall von Pflanzen, die eine endogene Quelle für eine Transposase enthalten, z. B. im Fall von Mais und der Ac- oder Spm-Transposase. Fig. 7 zeigt ein Schema zum selektiven Entfernen unerwünschter DNA-Fragmente mittels Transposons. Hier führt die Transposition auch zur Entfernung anderer unerwünschter Sequenzen, z. B. eines selektierbaren (SM) und eines gegenselektierbaren (CSM) Markergens, was das Screening nach Pflanzen oder Pflanzenzellen, die nur die nötige heterologe Nucleotid- Sequenz (hDNA 1 oder 2) enthalten, erleichtert. Fig. 8 zeigt schematisch einen möglichen Weg zur Erzeugung von Pflanzen mit verschiedenen heterologen Nucleotid-Sequenzen in alleler Beziehung. Diese Beispiele mit Selektionsmarkergenen sind nicht auf Gene beschränkt, die eine Antibiotikum- oder Herbizidresistenz verleihen. Eine Liste solcher Gene wird unten gegeben. Beispiele für in Pflanzen anwendbare Gegenselektionsmarkergene, wie das bakterielle codA und Cytochrom P-450 (Kopreck et al., 1999, Plant J., 19, 719-726; Gallego et al., 1999, Plant Mol Biol., 39, 83-93) sind in mehreren Publikationen beschrieben, unter anderem auch ihre Anwendung in Kombination mit Transposon-Systemen (Tissier et al., 1999, Plant Cell, 11, 1841-1852).
  • Es gibt gut beschriebene Transposon-Systeme für Pflanzen, die in der Literatur beschrieben sind (für Übersichtsartikel siehe: Dean et at, 1991, Symp Soc Exp Bioh, j% 63-75. Walbot, V., 2000, Plant Cell Physiol., 41 733-742; Fedoroff, N., 2000, Proc Natl Acad Sci U S A., 97, 7002-7007). The Ac/Ds (Briza ef al., 1995, Genetics, 141, 383-390; Rommens et at, 1992, Plant Mol Biol, 20, 61-70; Sundaresan et at, 1995, Genes Dev., 9 1797-810; Takumi, S. 1996, Genome, 39, 1169-1175; Nakagava et al., 2000, Plant Cell Physiol., 41, 733-742) and Spm/dSpm (Cardon et al., 1993, Plant J. 3, :773-784; Aarts et al., 1995, Mol Gen Genet 247, 5555-64; Tissier et al., 1999, Plant Cell, 11 1841-1852), sind gut etabliert sind in für das Transposon- Tagging in vielen Pflanzenarten gut etabliert, darunter in in vielen Nutzpflanzen, und ihre Anwendung zur Durchführung diese Erfindung ist für den Fachmann Routine. Das Ac/Ds- und das Spm/dSpm-System sind zum Transposon-Tagging in vielen Pflanzenarten, darunter vielen Nutzpflanzen, gut etabliert und ihre Anwendung zur Ausführung dieser Erfindung ist für den Fachmann Routine. Diese Erfindung ist jedoch nicht auf die Ac/Ds- und Spm/dspm-Systeme beschränkt. Jedes Transposon-System, das in Pflanzen aktiv ist und einen "Cut-andpaste"(Herausschneiden und Reinsertion)-Mechanismus bei der Transposition verwendet, kann für diese Erfindung verwendet werden.
  • In den Beispielen verwenden wir Agrobacterium-vermitteltes Einführen von T-DNA in Pflanzenzellen, wobei die T-DNA die erste und/oder die zweite heterologe Nukleotid-Sequenz als Vektor enthält. Verschiedene Methoden können zur Ausstattung einer Pflanzenzelle mit einem Vektor verwendet werden, wie die direkte Einführung des Vektors in die Zellen über Mikroprojektil-Bombardierung, Elektroporation oder PEG-vermittelte Transformation von Protoplasten. Die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Pflanzen ist bevorzugt. DNA kann in Pflanzenzellen also über verschiedene Methoden eingeführt werden, wie mit einem Ti- Plasmid-Vektor in Agrobakterium (US 5 591 616; US 4 940 838; US 5 464 763), durch Teilchen- oder Mikroprojektil-Bombardierung (US 5 100 792; EP 00 444 882; EP 00 434 616). Andere Pflanzentransformationsmethoden wie Mikroinjektion (WO 09209696; WO 09400583; EP 175 966), Elektroporation (EP 00564595; EP 00290395; WO 087056614) usw. können ebenso verwendet werden. Die Wahl der Transformationsmethode hängt von der zu transformierenden Pflanzenart ab. Zum Beispiel wird die Mikroprojektil-Bombardierung im allgemeinen für die Transformation von Monocotyledonen verwendet, während für zweikeimblättrige die Agrobakterium-vermittelte Transformation bessere Ergebnisse liefert. Das Trans-Spleiß-System dieser Erfindung umfasst zwei Fragmente, die in trans bereitgestellt werden und in allelen Positionen auf homologen Chromosomen vorliegen. Daher ist unser System strikter kontrolliert und sicherer, z. B. kann es im nicht-induzierten Zustand ein Expressionsgrad von Null haben und keinen Transfer des Merkmals beim Fremdbestäuben mit anderen Pflanzen.
  • Gewünschte Gene oder Fragmente derselben, die in sense- oder in antisense-Orientierung mit dieser Erfindung exprimiert werden können, sind unter anderem: Stärke-modifizierende Enzyme (Stärke-Synthase, Stärke-phosphorylierendes Enzym, debranching Enzym, Stärke verzweigendes Enzym, Stärke-verzweigendes Enzym II, granule bound Stärke-Synthase), Sucrosephosphat-Synthase, Sucrose-Phosphorylase, Polygalacturonase, Polyfructan-Sucrase, ADP-Glucose-Pyrophosphorylase, Cyclodextrin-Glycosyltransferase, Fructosyl-Transferase, Glycogen-Synthase, Pectin-Esterase, Aprotinin, Avidin, Bacterielle Levansucrase, E.coli glgA Protein, MAPK4 und Orthologe, Stickstoff-Assimilierungs/Methabolismus-Enzyme, Glutamin- Synthase, pflanzliches Osmotin, 2S Albumin, Thaumatin, ortspezifische Recombinasen/Integrasen (FLP, Cre, Recombinase, Int, SSVI Integrase R, Integrase phiC31, oder ein aktives Fragment oder Variante derselben), Isopentenyl-Transferase, Sca M5 (Sojabohnen-Calmodulin), Coleopteran-artige Toxine oder ein insektizidaktives Fragment, Fusionsproteine des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms (E2), Enzyme die Lipide, Aminosäuren, Zucker, Nukleinsäuren und Polysaccharide metabolisieren, Superoxide-Dismutase, inaktives Proenzym einer Protease, pflanzliche Proteintoxine, faserverändernde Merkmale in faserproduzierenden Pflanzen, gegen Coleoptera aktive Toxin von Bacillus thuringiensis (Bt2 Toxin, insektizides Kristallprotein (ICP), CryIC Toxin, Delta-Endotoxin, Polyopeptidtoxin, Protoxin etc.), insektenspezifisches Toxin AaIT, Cellulose-abbauendes Enzym, E1 Cellulase von Acidothermus celluloticus, Lignin-modifizierende Enzyme, Cinnamoylalkohol- Dehydrogenase, Trehalose-6-phosphat-Synthase, Enzyme des Cytokinin metabolic pathway, HMG-CoA Reductase, E. coli anorganische Pyrophosphatase, Samenlagerungsprotein (seed storage protein), Erwinia herb/cola Lycopen-Synthase, ACC Oxidase, pTOM36 kodiertes Protein, Phytase, Ketohydrolase, Acetoacetyl-CoA-Reductase, PHB (Polyhydroxybutanoate)- Synthase, Acyl-carrier-protein, Napin, EA9, Phytoen-Synthase aus nichthöheren Pflanzen, pTOM5-kodiertes Protein, ETR (Ethylen-Rezeptor), plastidäre Pyruvat-Phosphat-Dikinase, Nematoden-induzierbares Transmembranporenprotein, merkmalsfördernde photosynthetische oder plastidäre Funktion der Pflanzenzelle, Stilben-Synthase, Enzyme, die Phenole hydroxylieren können, Catechol-Dioxygenase, Catechol-2,3-Dioxygenase, Chloromuconat- Cycloisomerase, Anthranilat-Synthase, Brassica AGL15 Protein, Fructose-1,6-Biphosphatase (FBPase), AMV RNA3, PVY Replicase, PLRV Replikase, Potyvirus-Hüllprotein, CMV- Hüllprotein, TMV-Hüllprotein, Luteovirus Replicase, MDMV messenger RNA, mutierte geminivirale Replicase, Umbellularia californica C12 : 0 bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase, pflanzliche C10 or C12 : 0 bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase, C14 : 0 bevorzugende Acyl- ACP-Thioesterase (luxD), pflanzlicher Synthasefaktor A, pflanzlicher Synthasefaktor B, 6- Desaturase, ein Protein mit einer enzymatischen Aktivität in der peroxysomalen Oxidation von Fettsäuren in Pflanzenzellen, Acyl-CoA-Oxidase, 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase, Lipase, Acetyl-CoA- Carboxylase aus Mais, 5-Enolpyruvylschikimat-3-Phosphat-Synthase (EPSP), Phosphinothricin-Acetyl-Transferase (BAR, PAT), CP4 Protein, ACC-Deaminase, Ribozyme, Proteine mit posttranslationgen Spaltstellen, Proteinfusionen bestehend aus einer DNA-Binde- Domäne des Gal4 Transkriptionsaktivators und einer Transkriptionsaktivierungsdomäne, eine translationale Fusion des Oleosin-Proteins mit einem gewünschten Protein, das das Fusionsprotein in die Lipidphase leiten kann, DHPS Gen, das Sulfonamid-Resistenz verleiht, bakterielle Nitrilase, 2,4-D Monooxygenase, Acetolactat-Synthase oder Acetohydroxysäure- Synthase (ALS, AHAS), Polygalacturonase, bacterielle Nitrilase, Fusion einer aminoterminalen hydrophoben Region eines reifen Phosphat-Translokator-Proteins der inneren Envelope- Membran des Plastids mit einem gewünschten Protein, das in die Membran geleitet werden soll usw.
  • Jedes humane oder tierische Protein kann mit dem Trans-Spleiß-System der Erfindung exprimiert werden. Beispiele für solche gewünschten Proteine sind u. a. Immunantwort-Proteine (monoklonale Antikörper, Einzelketten-Antikörper, T-Zell-Rezeptoren usw.), Antigene, Kolonie- Stimulationsfaktoren, Relaxine, Polypeptid-Hormone, Cytokine und deren Rezeptoren, Interferone, Wachstumsfaktoren und Koagulationsfaktoren, enzymatisch aktive lysosomale Enzym, fibrinolytische Polypeptide, Blutgerinnungsfaktoren, Trypsinogen, 1-Antitrypsin (AAT) sowie funktionskonservative Proteine, wie Fusionsproteine, mutierte Varianten und synthetische Derivate dieser Proteine.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner die Expression eines Gens umfassen, das für ein post-transkriptionelles Gen-Silencing(PTGS)-Suppressor-Protein oder für eine funktionskonservative Variante oder ein Fragment desselben kodiert, zur Unterdrückung eines PTGS der transgenen Kodiersequenz in der Pflanze. Das Gen des PTGS-Suppressor-Proteins oder einer funktionskonservativen Variante desselben kann in eine Pflanze auf demselben Vektor, der die transgene Kodiersequenz trägt, oder auf einem gesonderten Vektor eingebracht werden. Dieses PTGS-Suppressor-Protein ist vorzugsweise viralen oder pflanzlichen Ursprungs. Beispiele für PTGS-Suppressor-Proteine sind das p25-Protein aus Kartoffelvirus X, das AC2-Protein aus dem afrikanischen Kassava-Mosaikvirus, das Rice-Yellow-Mottle-Virus- P1-Protein, das Tomato-Bushy-Stunt-Virus-19K-Protein, rgs-CAM oder eine funktionskonservative Variante oder ein Fragment eines dieser Proteine. Die funktionskonservative Variante oder das Fragment hat vorzugsweise eine Sequenzidentität von mindestens 75% zu einem der obigen Proteine. Einzelheiten zu PTGS-Suppressor-Proteinen und ihre Verwendung können in WO 01/38512 gefunden werden.
  • Unsere Erfindung kann auch zur Fusion von Selektionsmarkergenen mit verschiedenen gewünschten Genen verwendet werden, was die direkte Selektion eines optimalen Proteinproduzenten erlaubt. Beispiele für solche Selektionsmarker sind unter anderem Gene oder deren Fragmente von: Neomycin-Phosphotransferase II (NPTII), Hygromycin- Phosphotransferase, Aminoglycosid-6'-N-Acetyltransferase, 5-Enolpyruvylschikimat-3- Phosphat-Synthase, Phosphinothricin-Acetyltransferase (BAR), Betainaldehyd-Dehydrogenase (BADH), Dihydrofolat-Reduktase (DFR1), 6'-Genatmicin-Acetyltransferase (6' GAT), Acetolactat-Synthase (ALS), Phosphomannose-Isomerase (PMI), Glyphosat-Oxidoreduktase, Acetohydroxysäure-Synthase (AHAS), 2-Deoxyglucose-6-phosphat-Phosphatase (2-DOG-6-P), Luciferase, grün fluoreszierendes Protein (GFP) und Fusionsproteine von Selektionsmarkem.
    • BEISPIELE BEISPIEL 1 Intein-vermitteltes Trans-Spleißen von GFP
  • Das 5'-Ende des GFP-Gens wurde mittels PCR und der Primer 35spr3 (cgc aca atc cca cta tcc tte g) und gfppr8 (ctg ctt gtc ggc cat gat ata g) und dem Plasmid plCH5290 amplifiziert (35S-omega leader-gfp Kodiersequenz-ocs-Terminator im lcon Genetics binary vector plCBV1, der zur Selektion das BAR-Gen enthält, siehe Fig. 9). Ein das C-terminale Ende des DNAE-lnteins aus Synechocystis enthaltendes DNA-Fragment wurde mittels PCR aus genomischer DNA (Stamm PCC6803 des American Type Culture Center) und den Primern gfpinte1 (cta tat cat ggcc gac aag cag aag ttt gcgg aatat tgcc tcagt) und intepr2 (ttt gga tcc tta ttt aat tgt ccc agc gtc aag) amplifiziert. Mit den voramplifizierten DNA-Fragmenten und den Primern 35Spr3 und intepr2 wurde in einer zweiten Amplifikation eine Fusion von gfp und den Intein-Fragmenten hergestellt. Das PCR-Fragment wurde als Nco-1-BamHl-Fragment in plCBV16 (Binärvektor von Icon Genetics mit Nptll zur Selektion in Pflanzen, siehe Fig. 11; andere Binärvektoren können ebenfalls verwendet werden) kloniert. Das erhaltene Plasmid plC5'gfpint (Fig. 3) wurde durch Sequenzieren überprüft.
  • Das 3'-Ende des GFP-Genes wurde mittels PCR und den Primern gfppr9 (aag aac ggc atc aag gtg aac) und nosterrev (tca tcg caa gac cgg caa cag g) aus dem Plasmid plCH5290 amplifiziert. Ein das N-terminale Ende des DNAE-Inteins aus Synechocystis enthaltendes DNA-Fragment wurde mittels PCR aus genomischer DNA mit den Primern intepr3 (ttt cca tgg tta aag tta tcg gtc gtc) und integfp2 (gtt cac ctt gat gce gtt ctt aca att ggc ggc gat cgc ccc att) amplifiziert. Mit den voramplifizierten DNA-Fragmenten und den Primern intepr3 und nosterrev wurde mittels PCR in einer zweiten Amplifikation eine Fusion der Intein- und GFP-Fragmente hergestellt. Das PCR-Produkt wurde als Nco1-BamHl-Fragment in plCBV16 kloniert. Das erhaltene Plasmid plCintgfp3' (Fig. 3) wurde mittels Sequenzieren überprüft.
  • Das beim Intein-vermittelten Trans-Spleißen entstehende Produkt enthält sechs zusätzliche Aminosäuren (KFAEYC) zwischen den Aminosäuren 156 (K) und 157 (Q). Es wurde gezeigt, dass diese Insertion die GFP-Fluoreszenz nicht wesentlich beeinflusst (Ozawa et al., 2001, AnaL Chem 73, 5866-5874).
  • plC5'gfpint und plCintgfp3' wurden durch Elektroporation in den Agrobakterium-Stamm GV3101 transformiert. Beide Konstrukte wurden transient koexprimiert in Nicotiana benthamiana- Blättern unter Verwendung derAgrobakterium-vermittelten transienten Expression (Vaquero et al., 1999, Proc. Natl. Acad. 56 USA, 96, 11128-11133). Wenn beide Konstrukte koexprimiert wurden, wurde eine GFP-Fluoreszenz beobachtet, nicht jedoch, wenn die Konstrukte individuell exprimiert wurden.
  • Beide Konstrukte wurden auch in Arabidopsis thaliana (Col-0) gemäß Bent et al. (1994, Science, 285, 1856-1860) transformiert. Drei Wochen nach einer Vakuum-Infiltration wurden Samen geerntet, gekeimt und auf 50 mg/l, Kanamycin enthaltenden Platten wurden Transformanten gescreent. Dieselben Konstrukte wurden auch zurAgrobaktedum-vermittelten Transformation von Nicotiana tabacum-Blattscheiben verwendet (Horsch et al., 1985, Science, 227, 1229-1231), wobei 50 mg/l, Kanamycin für die Selektion von Transformanten verwendet wurde. In Tabak und Arabidopsis konnte keine GFP-Fluoreszenz detektiert werden, wenn eines der Konstrukte alleine verwendet wurde, in F1-Pflanzen, die beide Transgene enthielten, jedoch schon.
    • BEISPIEL 2 Intein-vermitteltes Trans-Spleißen von EPSP
  • Das Enzym 5-Enolpyruvylschikamat-3-phosphat-Synthase (EPSP-Synthase) katalysiert die Bildung von 5-Enolpyruvylschkiimat-3-phosphat aus Phosphoenolpyruvat und Schikimat-3- phosphat. EPSP-Synthase ist das zelluläre Target des Herbizids Glyphosat (N- Phosphonomethylglycin). Ein mutantes Allel des aroA-Gens aus Salmonella typhimurium mit einer P101S-Mutation kodiert für eine EPSP-Synthase mit erniedrigter Aktivität gegenüber Glyphosat. Die Expression dieses Gens in Pflanzen verleiht Glyphosat-Resistenz (Comai et al., 1985, Nature, 317, 741-744). Das 5'-Ende des mutierten EPSP-Gens wurde mittels PCR aus genomischer DNA Salmonella typhimurium (mit Stamm ATCC 39256 des American Type Culture Center) präpariert unter Verwendung der Primer epsp1 (tctcc atg gaa tcc ctg acg tta caa c) und epsppr2 (acc tgg aga gtg ata ctg ttg). Ein das C-terminale Ende des DNAE-Inteins aus Synechocystis enthaltendes DNA-Fragment wurde mittels PCR aus plC5'gfpint unter Verwendung der Primer intepr5 intepr5 (caa cag tat cac tct cca ggt aag ttt gcg gaa tat tgc ctc agt) und intepr2 amplifiziert. Mittels PCR, den amplifizierten DNA-Fragmenten und Primern epsp1 und intepr2 wurde eine Fusion von EPSP und dem Intein-Fragmenten erhalten. Das PCR-Produkt wurde als Nco1-BamHI-Fragment in plCH5300 (binärer Vektor von lcon Genetics mit dem BAR-Gen zur Selektion, Fig. 10) kloniert. Das erhaltene Plasmid plC5'epsp-int (Fig. 4) enthält die EPSP-N-Intein-Fusion unter der Kontrolle des 355-Promotors, das translationell mit einem künstlichen Chloroplasten-Transit-Peptid fusioniert wird. plC5'epsp-int wurde mittels Sequenzieren überprüft.
  • Das 3'-Ende des EPSP-Gens wurde mittels PCR aus Salmonella typhimurlum genomscher DNA mit den Primern epsp3 (cgc tat ctg gtc gag ggc gat) und epsp4 (cgg ggatcc tta ggc agg cgt act cat tc) amplifiziert. Ein das N-terminale Ende des DNAE-Inteins aus Synechocystis enthaltendes DNA-Fragment wurde mittels PCR aus plCintgfp3'-DNA und den Primern intepr3 und intepr6 (atc gcc ctc gac cag ata gcg gga ttt gtt aaa aca att ggc ggc gat) amplifiziert. Mit den amplifizierten DNA-Fragmenten und den interp3 und epsp4 wurde mittels PCR eine Fusion des Inteins mit dem EPSP-Fragmenten gemacht. Das PCR-Produkt wurde als Nco1-BamHI- Fragment in plCH5300 kloniert. Das erhaltene Plasmid plCint-epsp3' (Fig. 4) enthält die C- Intein-EPSP-Fusion unter der Kontrolle des 35S-Promotors, das translationell an das künstliche Chloroplasten-Transit-Peptid fusioniert ist. plCintepsp3' wurde mittels Sequenzieren überprüft.
  • Das durch Intein-vermitteltes Trans-Spleißen erhaltene EPSP-Genprodukt enthält zehn zusätzliche Aminosäuren (KFAEYCFNKS) zwischen den Aminosäuren 235 (G) und 236 (R). Es wurde bereits früher gezeigt, dass diese Position im EPSP-Gen Insertionen von mindestens 5 bis 10 Aminosäuren ohne Störung der Funktion verkraften kann (Chen et al., 2001, Gene, 263, 39-48).
  • plC5'epsp-int und plCint-epsp3' wurden in den Agrobakterium-Stamm GV3101 durch Elektroporieren transformiert. Beide Konstrukte wurden in Arabidopsis thaliana-Pflanzen (Col-0) gemäß Bent et al. (1994, Science, 285, 1856-1860) transformiert. Drei Wochen nach Vakuum- Infiltration wurden Samen geerntet, im Boden gekeimt und nach Transformanten gescreent, indem mehrmals mit einer 50 mg/l, phosphinotricin(PPT)haltigen Lösung gesprüht wurde. Dieselben Konstrukte wurden auch zur Agrobakterium-vermittelten Blattscheiben- Transformation von Nicotiana tabacum-Pflanzen verwendet (Horsh et al., 1985, Science, 227, 1229-1231), wobei 10 mg/l PPT zur Selektion von Transformanten verwendet wurden.
  • Transformanten wurden auf EPSP-Genaktivität überprüft, indem Pflanzen mit einer kommerziellen Formulierung von Glyphosat (N-Phosphonomethylglycin) besprüht wurden. In Arabidopsis und Tabak zeigten Transformanten, die eines der Konstrukte alleine enthielten, keine Glyphosat-Resistenz. F1-Pflanzen, die beide Konstrukte enthielten, waren Glyphosatresistent.
    • BEISPIEL 3 Intein-vermittelter Aufbau von funktionellem EPSP ohne Trans-Spleißen
  • plC5'epsp-IntM ähnelt dem Konstrukt plC5'epsp-int, unterscheidet sich jedoch an der EPSP-N- Intein-Verbindung durch den Zusatz von vier nativen N-Extein-Aminosäuren anstatt von fünf und durch die erste N-Intein-Aminosäure, die von Cys auf Ala geändert wurde. PlC5'epsp-intM wurde nach derselben Strategie wie plC5'epsp-int hergestellt, mit der Ausnahme, dass Primer intepr7 (caa cag tat cac tct cca ggt ttt gcg gaa tat gcc ctc agt ttt ggc ac) anstelle von Primer intepr5 verwendet wurde.
  • PlCint-epsp3'M ähnelt dem Konstrukt PlCint-epsp3', unterscheidet sich jedoch an der C-Intein- EPSP-Verbindung durch den Zusatz von 3 C-Extein-Aminosäuren anstelle von fünf, wobei die erste von Cis zu Ala mutiert ist, und die anderen beiden nativ sind, und durch die letzte C- Intein-Aminosäure, die von Asn auf Ala geändert wurde. PlCint-epsp3'M wurde gemäß derselben Strategie wie plCint-epsp3' hergestellt, mit der Ausnahme, dass Primer intepr8 (atc gcc ctc gac cag ata gcg gtt aaa agc agc ggc ggc gat cgc ccc att g) anstelle von Primer intepr6 verwendet wurde.
  • Die drei mutierten Aminosäuren verhindern das Intein-vermittelte Trans-Spleißen vollständig, jedoch nicht die Assoziation der N- und C-Intein-Fragmente (Chen et al., 2001, Gene, 263, 39-48).
  • plCS'epsp-intM und plCint-epsp3'M wurden in Agrobakterium-Stamm GV3101 mittels Elektroporation transformiert. Beide Konstrukte wurden in Arabidopsis thaliana (Col-0) und Tabak, wie oben beschrieben, transformiert. Primärtransformanten waren alle Glyphosatsensitiv. Hybride F1-Pflanzen, die beide Konstrukte enthalten, zeigten sowohl in Tabak als auch in Arabidopsis Glyphosat-Resistenz.

Claims (33)

1. Verfahren zur Herstellung eines transgenen multizellulären pflanzlichen Organismus oder Teile desselben, der ein gewünschtes Merkmal exprimiert und der das Merkmal an Nachkommen kontrolliert weitergibt, wobei das Verfahren umfasst:
a) Herstellen einer ersten Pflanze oder einer Zelle derselben, die in einem ersten Genort eines Kernchromosoms eine erste heterologe Nukleotid-Sequenz aufweist, die ein erstes Fragment einer für das gewünschte Merkmal kodierenden Nukleotid-Sequenz enthält,
b) Herstellen einer zweiten Pflanze oder einer Zelle derselben, die in einem zweiten Genort eines Kernchromosoms, das zu dem Kernchromosom von Schritt (i) homolog ist, eine zweite heterologe Nukleotid-Sequenz aufweist, die ein zweites Fragment der für das gewünschte Merkmal kodierenden Nukleotid-Sequenz enthält,
c) Hybridisieren der ersten mit der zweiten Pflanze oder Zellen derselben, um Nachkommen zu bilden, die das gewünschte Gen infolge einer Bindung zwischen einem Protein oder Polypeptid, das von der ersten heterologen Nukleotid- Sequenz kodiert wird, und einem Protein oder Polypeptid, das von der zweiten heterologen Nukleotid-Sequenz kodiert wird, exprimieren.
2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei Schritt (i) und (ii) durchgeführt werden durch
a) Einführen einer heterologen Vorgänger-Nukleotid-Sequenz, die die erste und die zweite heterologe Nukleotid-Sequenz umfasst, in ein nukleäres Kernchromosom von Elternorganismen oder Zellen derselben,
b) wahlweise Auswählen von Organismen oder Zellen derselben, die die heterologe Vorgänger-Nukleotid-Sequenz in ein gewünschtes Chromosom oder einen gewünschten chromosomalen Genort integriert haben, und
c) anschließendes Spalten der heterologen Vorgänger-Nukleotid-Sequenz, so dass die erste und die zweite heterologe Nukleotid-Sequenz auf homologen Chromosomen in verschiedenen Organismen oder Zellen zu liegen kommen.
3. Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei nach Schritt (a) oder (b) Organismen oder Zellen desselben hergestellt werden, die bezüglich der Vorgänger-Nukleotid-Sequenz homozygot sind.
4. Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der in Schritt (a) oder (b) erhaltene Organismus bezüglich der Vorgänger-Nukleotid-Sequenz heterozygot ist.
5. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei Schritt (c) das Herausschneiden der zweiten heterologen Nukleotid-Sequenz aus der Vorgänger- Nukleotid-Sequenz umfasst, optional gefolgt von der Reintegration der herausgeschnittenen zweiten heterologen Nukleotid-Sequenz in einen Genort eines Chromosoms, das homolog zu dem Chromosom der Vorgänger-Nukleotid-Sequenz ist.
6. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei Schritt (c) das Herausschneiden der ersten heterologen Nukleotid-Sequenz aus der Vorgänger- Nukleotid-Sequenz umfasst, optional gefolgt von der Reintegration der herausgeschnittenen ersten heterologen Nukleotid-Sequenz in einen Genort eines Chromosoms, das homolog zu dem Chromosom der Vorgänger-Nukleotid-Sequenz ist.
7. Das Verfahren gemäß Anspruch 5 oder 6, wobei die gemäß Anspruch 5 oder 6 erhaltenen Pflanzen oder Zellen derselben oder Nachkommen der Pflanzen oder der Zellen für die Reintegration der herausgeschnittenen heterologen Nukleotid-Sequenz analysiert werden und wobei Pflanzen oder Zellen derselben selektiert werden, die die herausgeschnittene heterologe Nukleotid-Sequenz nicht enthalten oder die herausgeschnittene heterologe Nukleotid-Sequenz an einem gewünschten Ort auf einem Chromosom enthalten, das homolog zu dem Chromosom ist, das die nicht herausgeschnittene heterologe Nukleotid-Sequenz enthält.
8. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die erste und/oder die zweite heterologe Nukleotid-Sequenz in der Vorgänger-Nukleotid-Sequenz in ein nichtautonomes Transposon integriert ist, und wobei das Herausschneiden das Bereitstellen einer Transposase für das Transposon umfasst.
9. Das Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei
A) die erste heterologe Nukleotid-Sequenz in der Vorgänger-Nukleotid-Sequenz in ein erstes nichtautonomes Transposon und die zweite heterologe Nukleotid- Sequenz in ein zweites nichtautonomes Transposon integriert ist und
B) die erste heterologe Nukleotid-Sequenz durch Bereitstellen einer ersten Transposase für das erste nichtautonome Transposon und die zweite heterologe Nukleotid-Sequenz durch Bereitstellen einer zweiten Transposase für das zweite nichtautonome Transposon herausgeschnitten wird.
10. Das Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das erste und das zweite Transposon in der Vorgänger-Nukleotid-Sequenz überlappen, so dass das Herausschneiden der ersten oder der zweiten heterologen Nukleotid-Sequenz zur Zerstörung des zweiten beziehungsweise des ersten nichtautonomen Transposons führt.
11. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die erste heterologe Nukleotid-Sequenz in der Vorgänger-Nukleotid-Sequenz von Rekombinationsstellen einer ersten ortsspezifischen Rekombinase flankiert ist und wobei die zweite heterologe Nukleotid-Sequenz in der Vorgänger-Nukleotid-Sequenz von Rekombinationsstellen einer zweiten ortsspezifischen Rekombinase flankiert ist.
12. Das Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei sich die erste von der zweiten ortsspezifischen Rekombinase unterscheidet.
13. Das Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei ein Segment 1 und ein Segment 2 der Vorgänger-Nukleotid-Sequenz überlappen, wobei
Segment 1 die erste heterologe Nukleotid-Sequenz umfasst, die von den Rekombinationsstellen, die mit der ersten ortsspezifischen Rekombinase funktionell sind, flankiert wird, und
Segment 2 die zweite heterologe Nukleotid-Sequenz umfasst, die von den Rekombinationsstellen, die mit der zweiten ortsspezifischen Rekombinase funktionell sind, flankiert wird.
14. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 13, wobei die Transposase oder die ortsspezifische Rekombinase durch Hybridisieren oder Kreuzen mit einer Pflanze oder Zelle derselben bereitgestellt wird, die ein Gen enthält, das für die Rekombinase oder die Transposase kodiert, oder durch Agrobacterium-vermittelte Transformation, virale Transfektion, Partikelbombardierung, Elektroporation oder PEG-vermittelte Transformation mit einem Gen, das für die Rekombinase oder die Transposase kodiert.
15. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei der erste und der zweite Genort nach geringer Wahrscheinlichkeit für ein Crossing-over ausgewählt wird.
16. Das Verfahren nach Anspruch 15, wobei der erste und der zweite Genort einander entsprechende Genorte auf den homologen Chromosomen sind.
17. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die erste und die zweite Pflanze oder Zellen derselben homozygot für die erste und die zweite heterologe Nukleotid-Sequenz gemacht werden.
18. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei das Binden der Proteine oder Polypeptide von einer Peptidbindungsbildung zwischen den Proteinen oder Polypeptiden gefolgt wird.
19. Das Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Binden und die Peptidbindungsbildung Intein-vermitteltes Trans-Spleißen ist.
20. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die kontrollierte Weitergabe bedeutet, dass nach Kreuzen des transgenen multizellulären pflanzlichen Organismus mit einem Organismus, der die erste und die zweite heterologe Nukleotid-Sequenz nicht enthält, die Häufigkeit des Auftretens des gewünschten Merkmals in den Nachkommen geringer als 1%, vorzugsweise geringer als 0,1%, noch bevorzugter geringer als 0,01% und am bevorzugtesten geringer als 0,001% ist.
21. Das Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei der transgene multizelluläre pflanzliche Organismus das gewünschte Merkmal in Abwesenheit von entweder der ersten oder der zweiten heterologen Nukleotid-Sequenz nicht exprimieren kann.
22. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei der transgene multizelluläre pflanzliche Organismus ferner genetisch oder transient modifiziert ist, um Funktionen zu haben, die für das Binden und/oder das Bilden der Peptidbindung nötig sind.
23. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die erste und/oder die zweite heterologe Nukleotid-Sequenz ein Intron zum RNA-Spleißen eines Transkriptionsproduktes der erste oder der zweitenheterologe Nukleotid-Sequenz enthält.
24. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei das gewünschte Merkmal in männlicher oder weiblicher Sterilität involviert ist.
25. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei das Merkmal aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Herbizidresistenz, Insektizidresistenz, Selektionsmarker, Gegenselektionsmarker, Transkriptionsfaktor, DNA- oder RNAmodifizierende Enzym, Produktion eines gewünschten Gens.
26. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 25, wobei der transgene multizelluläre pflanzliche Organismus Nachkommen erzeugen kann.
27. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei das Binden und/oder das Bilden der Peptidbindung ein Protein produziert, das ein Polypeptid gebunden hat, das ausgewählt ist aus der Gruppe: Signal-, Ziel- und Membrantransduktionspolypeptid; Bindedomäne, Erkennungs- oder Visualisierungsmarker, Reinigungs-Tag, Proteinspaltstelle.
28. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27, wobei das zweite oder das erste Fragment des Gens, das für das gewünschte Merkmal kodiert, operationell an einen regulierbaren Promotor gekoppelt ist.
29. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 28, wobei das erste oder das zweite Fragment des Gens, das für das gewünschte Merkmal kodiert, für eine interne Ribosomenbindungsstelle (IRES) kodiert, was die Translation eines Transkriptes des ersten oder zweiten Fragments erlaubt.
30. Pflanze, Samen oder Pflanzenzelle, die ein gewünschtes Merkmal exprimieren, erhalten oder erhältlich gemäß einem der Ansprüche 1 bis 29 sowie davon abgeleitete Produkte.
31. Pflanze oder Samen oder Zelle davon, erhalten oder erhältlich gemäß Schritt (i) oder Schritt (ii) von Anspruch 1.
32. Vektor zur Durchführung des Verfahrens gemäß eines der Ansprüche 1 bis 29, umfassend die Vorgänger-Nukleotid-Sequenz gemäß Anspruch 2.
33. Vektor zur Durchführung des Verfahrens wie in einem der Ansprüche 8 bis 13 definiert.
DE2003118644 2002-05-31 2003-04-24 Transgene Pflanzen mit kontrollierter Weitergabe eines Merkmals an die Nachkommen Withdrawn DE10318644A1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2003118644 DE10318644A1 (de) 2002-05-31 2003-04-24 Transgene Pflanzen mit kontrollierter Weitergabe eines Merkmals an die Nachkommen

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10224214 2002-05-31
DE10224980 2002-06-05
DE2003118644 DE10318644A1 (de) 2002-05-31 2003-04-24 Transgene Pflanzen mit kontrollierter Weitergabe eines Merkmals an die Nachkommen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE10318644A1 true DE10318644A1 (de) 2003-12-24

Family

ID=29713122

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2003118644 Withdrawn DE10318644A1 (de) 2002-05-31 2003-04-24 Transgene Pflanzen mit kontrollierter Weitergabe eines Merkmals an die Nachkommen

Country Status (10)

Country Link
US (3) US7642404B2 (de)
EP (1) EP1509610B1 (de)
JP (1) JP4603882B2 (de)
AU (1) AU2003226693B2 (de)
CA (1) CA2483145C (de)
DE (1) DE10318644A1 (de)
DK (1) DK1509610T3 (de)
ES (1) ES2388522T3 (de)
MX (1) MXPA04010443A (de)
WO (1) WO2003102197A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102012003848A1 (de) * 2012-02-29 2013-08-29 Kws Saat Ag Pathogenresistente transgene Pflanze

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10325814A1 (de) * 2003-06-06 2004-12-23 Icon Genetics Ag Sichere Erzeugung eines gewünschten Produkts in hybriden Samen
US9012729B2 (en) 2008-06-03 2015-04-21 Nordsaat Saatzuchtgesellschaft Mbh Process of producing male sterile monocotyledonous plants
JP2013514791A (ja) * 2009-12-22 2013-05-02 バイエル・クロップサイエンス・エヌ・ヴェー 除草剤耐性植物
EP2423316B1 (de) * 2010-08-25 2016-11-16 Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) Methode zur Bestimmung der meiotischen Rekombinationsfrequenz in Pflanzen
KR101622942B1 (ko) 2011-06-21 2016-05-20 서울대학교산학협력단 종자 발아 및 염색질의 구조 조절에 관여하는 유전자 및 이의 용도
US8945876B2 (en) 2011-11-23 2015-02-03 University Of Hawaii Auto-processing domains for polypeptide expression
EA201491670A1 (ru) 2012-03-13 2015-07-30 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Генетическое снижение мужской репродуктивной функции у растений
EP2825656A1 (de) 2012-03-13 2015-01-21 Pioneer Hi-Bred International Inc. Genetische reduktion von männlicher fruchtbarkeit bei pflanzen
MX2014011043A (es) 2012-03-13 2015-06-02 Pioneer Hi Bred Int Reduccion genetica de la fertilidad masculina en plantas.

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ314629A (en) * 1991-01-17 2000-08-25 Gen Hospital Corp Use trans-splicing ribozymes to prepare medicaments for gene therapies
US5717129A (en) * 1995-02-16 1998-02-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for maintaining sterility in plants
US6392119B1 (en) * 1997-01-24 2002-05-21 Dna Plant Technology Corporation Two component plant cell lethality methods and compositions
AU3391900A (en) 1999-03-05 2000-09-21 Maxygen, Inc. Encryption of traits using split gene sequences
US5990395A (en) * 1999-05-24 1999-11-23 Novartis Ag Inbred sweet corn line W1498A
JP2003505012A (ja) * 1999-05-24 2003-02-12 ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイティッド 活性なタンパク質産生物を発現し得る分断した非伝達性遺伝子を産生させるための方法
US6852911B1 (en) * 1999-08-31 2005-02-08 Fertiseed Ltd. Method of producing a male sterile plant by exogenic allelism
WO2001059091A2 (en) * 2000-02-11 2001-08-16 Metabolix, Inc. Multi-gene expression constructs containing modified inteins
EP1499734B1 (de) 2002-04-29 2009-07-29 Icon Genetics GmbH Verfahren zur herstellung umwelt sicherer transgener organismen

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102012003848A1 (de) * 2012-02-29 2013-08-29 Kws Saat Ag Pathogenresistente transgene Pflanze
EP2820137A1 (de) * 2012-02-29 2015-01-07 KWS Saat AG Pathogenresistente transgene pflanze

Also Published As

Publication number Publication date
DK1509610T3 (da) 2012-09-03
AU2003226693A1 (en) 2003-12-19
US20100138948A1 (en) 2010-06-03
EP1509610B1 (de) 2012-05-23
US20050172353A1 (en) 2005-08-04
US7642404B2 (en) 2010-01-05
WO2003102197A1 (en) 2003-12-11
JP2005536990A (ja) 2005-12-08
ES2388522T3 (es) 2012-10-16
EP1509610A1 (de) 2005-03-02
JP4603882B2 (ja) 2010-12-22
WO2003102197A8 (en) 2004-10-21
CA2483145A1 (en) 2003-12-11
US8193410B2 (en) 2012-06-05
CA2483145C (en) 2013-05-28
US8604281B2 (en) 2013-12-10
MXPA04010443A (es) 2005-10-26
US20130024986A1 (en) 2013-01-24
AU2003226693B2 (en) 2008-02-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69636225T2 (de) Stimulierung der homologen rekombination in pflanzlichen organismen mittels rekombinations fördernder enzyme
US8193410B2 (en) Transgenic plants with controlled distribution of a trait to progeny
CA2354195A1 (en) Methods and genetic compositions to limit outcrossing and undesired gene flow in crop plants
DE60037200T2 (de) Orts-spezifisches rekombinationssystem zur manipulation des plastidengenoms in höheren pflanzen
DE102015006335A1 (de) Verfahren und Konstrukte zur gezielten Nukleinsäure Editierung in Pflanzen
US11814632B2 (en) Modified excisable MON87701 soybean transgenic insect resistance locus
Schiermeyer et al. Targeted insertion of large DNA sequences by homology‐directed repair or non‐homologous end joining in engineered tobacco BY‐2 cells using designed zinc finger nucleases
US20210123067A1 (en) Compositions and methods for transferring cytoplasmic or nuclear traits or components
DE10132780A1 (de) Plastidäre Genexpression über autonom replizierende Vektoren
EP0317509A2 (de) Gezielter Einbau von Genen ins pflanzliche Genom
DE10131690A1 (de) Verfahren zum kontrollierten Umordnen von Chromosomenfragmenten für die Pflanzenzucht
DE69835812T2 (de) Anwendungsmoeglichkeiten der maennlichen sterilitaet von pflanzen
DE102015014252A1 (de) Verfahren und Konstrukte zur gezielten Nukleinsäure Editierung in Pflanzen
WO2019234129A1 (en) Haploid induction with modified dna-repair
JP2001514856A (ja) 植物における遺伝子の選択的発現
JP4518741B2 (ja) 環境に安全なトランスジェニック生物を産生する方法
Narkhed et al. Ereeding
US20200377909A1 (en) Directed genome engineering using enhanced targeted editing technologies
Rai et al. 8 CRISPR/Cas9 for Enhancing
WO2024036190A2 (en) Guide polynucleotide multiplexing
CN1454261A (zh) 降低植物中转基因的传递
DE10303937A1 (de) Pflanzentransformation mit Assemblierung einer gewünschten Sequenz in Vivo
CN115243711A (zh) 两步基因交换
CN115151637A (zh) 基因组内同源重组
DE10332597A1 (de) Transformation von Pflanzen unter Zusammenbau eines Merkmals in Vivo

Legal Events

Date Code Title Description
8141 Disposal/no request for examination