JP2003505012A - 活性なタンパク質産生物を発現し得る分断した非伝達性遺伝子を産生させるための方法 - Google Patents

活性なタンパク質産生物を発現し得る分断した非伝達性遺伝子を産生させるための方法

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ルオ・スン
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明において、本発明者らは、効率的なタンパク質発現を許容するが遺伝子結合アプローチを必要としない、および水平な遺伝子移入による伝播の有意により低い機会を有する、新規なタイプの導入遺伝子を提案するものである。 【解決手段】 本発明によれば、植物のような標的宿主において効果的なタンパク質発現を許容するが、花粉を介して関連の宿主系へのおよび／または環境への、導入遺伝子の移入の所望されない結果を回避する、新規なタイプの導入遺伝子系が開示される。本明細書中に記載される方法はまた、真核生物体（酵母、昆虫、哺乳動物の細胞など）および原核生物体（Ｅ.ｃｏｌｉなど）における実質的に任意の目的のタンパク質（例えば毒性タンパク質）の発現に適用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物体内で予め決定された位置において標的タンパク質を再構築す
る方法に関する。また、微生物及び植物遺伝子におけるＤＮＡフラグメントにも
関する。
【０００２】
【従来の技術】
過去数年間、米国における農業は、特異的な疾患、昆虫、除草剤に対して耐性
であるか、または改善された栄養価を有するトランスジェニック作物の導入によ
って革命をもたらされてきた。同時に、これらの遺伝子改変された（ＧＭ）農産
物は消費者に対して有害であり得るという、および導入遺伝子は、昆虫または除
草剤耐性の「超雑草」を作製するように関連の植物種に移入され得るか（Ｆｅｒ
ｂｅｒ、Ｄ.、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：１６６２（１９９９））またはそれら
の有害に対して他の生物体によって消費され得る（Ｌｏｓｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ
３９９：２１４（１９９９））という、多くの懸念が世界中で表明された。一
方、「ＧＭ食品」の有害な影響の不安に対する科学的根拠はほとんどなく、導入
遺伝子が他の植物に移入され、それによって有害な環境学的影響を有するという
可能性は完全には排除されていない（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３
９５：２５（１９９８））。このような移入は、密接に関連される種の受粉によ
って、またはその移入が植物随伴性の真菌、細菌、もしくは昆虫によって媒介さ
れ得るウイルスもしくはプラスミドベクターによる関連のない植物への遺伝子フ
ラグメントの移入によってのいずれかで、生じ得る。 導入遺伝子の伝播を防止するために考察される多くの技術があるが、これらの
手順は、直列の構築物の場合におけるように新規なハイブリッド植物に対してネ
ガティブな影響を有するように設計されるか（Ｇｒｅｓｓｅｌ、Ｔｒｅｎｄｓ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.、１７：３６１-３６６（１９９９））、または水平な遺
伝子移入による伝播の可能性を排除しないか（ＢｅｒｔｏｌｌａおよびＳｉｍｏ
ｎｅｔ、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１５０：３７５-３８４（１９９９）
）のいずれかである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明において、本発明者らは、効率的なタンパク質発現を許容するが遺伝子
結合アプローチを必要としない、および水平な遺伝子移入による伝播の有意によ
り低い機会を有する、新規なタイプの導入遺伝子を提案するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、植物のような標的宿主において効果的なタンパク質発現を許
容するが、花粉を介して関連の宿主系へのおよび／または環境への、導入遺伝子
の移入の所望されない結果を回避する、新規なタイプの導入遺伝子系が開示され
る。本明細書中に記載される方法はまた、真核生物体（酵母、昆虫、哺乳動物の
細胞など）および原核生物体（Ｅ.ｃｏｌｉなど）における実質的に任意の目的
のタンパク質（例えば毒性タンパク質）の発現に適用され得る。
【０００５】 各場合において、標的遺伝子は、少なくとも２つのセグメントに分断され、そ
れぞれはインテイン（ｉｎｔｅｉｎ）をコードする配列の１部分に融合され得る
。各融合遺伝子は不活性なタンパク質として発現され、そしてこれらの別々に発
現される融合タンパク質は、活性なタンパク質に再構築される。遺伝子フラグメ
ントの区分化は、標的タンパク質が所望される位置において再構築されることを
許容し、および他の生物体への機能的遺伝子の伝達を防止し得る。
【０００６】 本発明は農学および植物バイオテクノロジーにおいて具体的に例示されるが、
本明細書中で提案されるアプローチは非常により広い範囲を有し、および別の生
物体への偶発的な移入の防止のために、任意の生物体において発現される任意の
遺伝子に適応され得ることが留意されるべきである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
図１および２において説明されるように、タンパク質スプライシングは、ポリ
ペプチドからの介在配列の切り出しを包含し、隣接する配列の同時の結合を伴っ
て新規なポリペプチドを生じる（Ｃｈｏｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２
７１：２２１５９-２２１６８（１９９６））。タンパク質スプライシングの機
構の解明は多くのインテインベースの適用を導いた（Ｃｏｍｂら、米国特許第５
，４９６，７１４号；Ｃｏｍｂら、米国特許第５，８３４，２４７号；Ｃａｍａ
ｒｅｒｏおよびＭｕｉｒ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２１：５５９
７-５５９８（１９９９）；Ｃｈｏｎｇら、Ｇｅｎｅ、１９２：２７１-２８１（
１９９７）、Ｃｈｏｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２６：５
１０９−５１１５（１９９８）、Ｃｈｏｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
３：１０５６７−１０５７７（１９９８）、Ｃｏｔｔｏｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．、１２１：１１００−１１０１（１９９９）；Ｅｖａｎｓら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：１８３５９−１８３６３（１９９９）；Ｅｖａ
ｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３９２３−３９２６（１９９９）、
Ｅｖａｎｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．、７：２２５６−２２６４（１９９８
）；Ｅｖａｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５：９０９１−９０９４（
２０００）；ＩｗａｉおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５９
：１６６−１７２（１９９９）；Ｍａｔｈｙｓら、Ｇｅｎｅ、２３１：１−１３
（１９９９）；Ｍｉｌｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９５：３５４３−３５４８（１９９８）；Ｍｕｉｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６７０５−６７１０（１９９８）；Ｏｔｏｍ
ｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：１６０４０−１６０４４（１９９９）
；Ｏｔｏｍｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌｍｏｌ．ＮＭＲ １４：１０５−１１４（１９９
９）；Ｓｃｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：
１３６３８−１３６４３（１９９９）；ＳｅｖｅｒｉｎｏｖおよびＭｕｉｒ、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３：１６２０５−１６２０９（１９９８）；Ｓｈ
ｉｎｇｌｅｄｅｃｋｅｒら、Ｇｅｎｅ、２０７：１８７−１９５（１９９８）；
Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈら、ＥＭＢＯ Ｊ．１７：９１８−９２６（１９９８）；
Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２７：１１０−１２０
（１９９９）；Ｗｏｏｄら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７：８８９−
８９２（１９９９）；Ｗｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９５：９２２６−９２３１（１９９８ａ）；Ｗｕら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ Ａｃｔａ １３８７：４２２−４３２（１９９８ｂ）；Ｘｕら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：３８８−３９３（１９９９
）；Ｙａｍａｚａｋｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２０：５５９１−
５５９２（１９９８））。
【０００８】 トランスでのタンパク質スプライシングは近年インビボおよびインビトロの両
方で記載されており（Ｓｈｉｎｇｌｅｄｅｃｋｅｒら、Ｇｅｎｅ ２０７：１８
７（１９９８）、Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈら、ＥＭＢＯ Ｊ．１７：９１８（１９
９８）；Ｍｉｌｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５
：３５４３−３５４８（１９９８）；Ｌｅｗら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２
７３：１５８８７−１５８９０（１９９８）；Ｗｕら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３８７：４２２−４３２（１９９８ｂ）、Ｙａｍａｚａ
ｋｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：５５９１（１９９８）、Ｅｖａ
ｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：９０９１（２０００）；Ｏｔｏｍｏ
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：１６０４０−１６０４４（１９９９）、
Ｏｔｏｍｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌｍｏｌ．ＮＭＲ １４：１０５−１１４（１９９９
）；Ｓｃｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１
３６３８−１３６４３（１９９９））、そして２つの不活性なフラグメントとし
てタンパク質を発現させる機会を提供し、これは続いて、連結を受けて機能的な
産物を形成し得る（図３及び４）。
【０００９】 トランス−タンパク質スプライシングはまた、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ
ｓｐ ＰＣＣ６８０３において天然で生じ（Ｗｕ，Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：９２２６（１９９８））、ここでこれは染色タンパ
ク質ＤＮＡの７５０ｋｂによって分離される２つの遺伝子によってコードされる
、ＤｎａＥタンパク質の２つのフラグメントを結合することによって機能的なＤ
ＮＡポリメラーゼＩＩＩを形成するために必要不可欠である（図５）。
【００１０】 これらの観察は、機能的な遺伝子産物が、目的の遺伝子を２つのフラグメント
に分断し、そして各部分の標的遺伝子にインテインフラグメントを融合すること
によって作製され得るか否かを調査することに、本発明者らを導いた。２つのタ
ンパク質フラグメントの発現、その後のトランス−スプライシング、インテイン
媒介性の区分、またはタンパク質区分は、標的タンパク質の活性な形態を作製す
る（図６及び７）。この筋書きにおいて、標的遺伝子フラグメントは、宿主ゲノ
ム中のいずれの場所でも位置され得、核、葉緑体、ミトコンドリア、プラスミド
、細菌人工染色体、酵母人工染色体、またはこれらの任意の組み合わせにおいて
広範に分離されることを包含する。さらに、例えば、植物の核に２分の１および
染色体またはミトコンドリアにもう２分の１のように、異なる細胞小器官または
プラスミドに遺伝子フラグメントを配置することによって、受粉による、または
細菌、真菌、もしくはウイルスベクターを介する水平な遺伝子移入による遠い関
連物への両方の遺伝子半片の移入は、十分に活性な標的タンパク質の再構成を必
要とする。これは、その関連の環境の外部への導入遺伝子の伝播の危険性を非常
に低減し、および潜在的に排除する。
【００１１】 タンパク質スプライシングエレメントを使用して標的遺伝子を分断し、および
活性を再構築する２つの例が以下に記載される。調査された２つの遺伝子は。Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからのアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）遺伝子お
よびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍからの５−エノールピルビ
ル-３-ホスホシキミ酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）遺伝子の変異体形態であり、これ
はスルホニル尿素およびグリフォセート除草剤に対する耐性をそれぞれ付与する
。両方の酵素は、タンパク質構築ブロックの生合成に関与する。ＡＬＳは分岐鎖
アミノ酸の生合成における第１の共通の酵素であり（ＬａＲｏｓｓａおよびＳｃ
ｈｌｏｓｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５９：８７５３−８７５７（１９８
４）；ＣｈａｌｅｆｆおよびＲａｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２３：１１４８−１１
５１（１９８４）；ＦａｌｃｏおよびＤｕｍａｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１０９：
２１−３５（１９８５））、一方ＥＰＳＰＳは芳香族アミノ酸の合成において必
要とされる（Ｓｔａｌｋｅｒら、Ｊ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：４７２４−
４７２８（１９８５））。化学化合物によるこれらの酵素の阻害は、生物体の死
を導き得る。
【００１２】 スルホメツロン（ｓｕｌｆｏｍｅｔｕｒｏｎ）メチル（ＳＭ）（Ｓｈｏｒｔお
よびＣｏｌｂｕｒｎ、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｉｎｄ．Ｈｅａｌｔｈ、１５：２４０−
２７５（１９９９））のような一般的に使用されるスルホニル尿素除草剤（ＳＵ
）は、アセト尿酸合成酵素（ＡＬＳ）（ＥＣ４．１．３．１８）を阻害すること
によって、細菌、酵母、および高等植物の生長をブロックする。除草剤耐性の植
物を作製するために、ＳＭの存在下での生長を許容する変異体ＡＬＳ遺伝子を同
定するにおいて多大な努力があった。細菌および酵母をＳＭに対して耐性にする
変異が最初に報告された（Ｈｉｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３３５：６５３
−６６１（１９９８））。続いて、類似の点変異が、天然に存在する耐性作物、
トウモロコシ、オナモミ、およびタバコから単離されたＡＬＳ遺伝子において確
認された（Ｌｅｅら、ＥＭＢＯ Ｊ．、７：１２４１−１２４８（１９８８）；
Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０：１７３８１−１
７３８５（１９９５））。トウモロコシ ＩＣＩ８５３２ ＩＴおよびＰｉｏｎ
ｅｅｒ３１８０ ＩＲのようなこれらのＳＵ耐性作物のいくつかが市販されてい
る。
【００１３】 以下の実施例１において、除草剤耐性遺伝子が分断され、そしてインテインフ
ラグメントが各部分的な遺伝子にインフレームに融合された。分断遺伝子は、Ｅ
.ｃｏｌｉにおいて除草剤ＳＭに対する耐性を付与することが決定された。Ｅ.ｃ
ｏｌｉは、これが活性なＡＬＳＩおよびアセト乳酸合成酵素ＩＩＩ（ＡＬＳＩＩ
Ｉ）酵素を含むが、活性なＡＬＳＩＩを含まないので、モデル系として使用した
。ＡＬＳＩおよびＡＬＳＩＩＩはＥ.ｃｏｌｉにおけるＡＬＳ遺伝子の２つのイ
ソ型であり、これらはバリン、イソロイシン、およびロイシンの合成に重要であ
る（ＤｅＦｅｌｉｃｅら、Ａｎｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐａｒｉｓ）１３３
Ａ：２５１-２５６（１９８２））。それらの活性はバリンフィードバック阻害
に感受性である。それゆえ、バリンで増殖培地を飽和することによって、ＡＬＳ
ＩおよびＡＬＳＩＩＩは阻害され、そして細胞は増殖を停止する。Ｅ.ｃｏｌｉ
細胞に組換えＡＬＳＩＩを導入することによって、ＡＬＳＩＩがバリン阻害に耐
性であるのでそれらの増殖が救済される。この特徴は、リンカー挿入またはトラ
ンス-スプライシングインテインエレメントによって遺伝子改変されたＥ.ｃｏｌ
ｉ ＡＬＳＩＩ遺伝子の活性を調査するためのＥ.ｃｏｌｉ株 ＥＲ２７４４を
良好なインビボモデル系にする。
【００１４】 試験された第２の除草剤耐性遺伝子は、Ｃ３０１からＴへの変異を有する、Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍからのａｒｏＡ遺伝子（Ｓｔａｌ
ｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：４７２４（１９８５））であった
。これは、Ｐｒｏ１０１からＳｅｒへの変化を伴う５−エノールピルビル−３−
ホスホシキミ酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）（ＥＣ２．５．１．１９）タンパク質を
コードし、そして除草剤グリフォセート（Ｒｏｕｎｄ−Ｕｐ（登録商標）として
一般に市販される）に対する耐性を付与する。この実施態様において、ＥＰＳＰ
Ｓ遺伝子のＮ−末端フラグメントは、Ｓｓｐ ＤｎａＥインテインのＮ−末端ス
プライシングドメインに融合され、およびＥＰＳＰＳ遺伝子のＣ−末端フラグメ
ントは、Ｓｓｐ ＤｎａＥインテインのＣ−末端スプライシングドメインに融合
された。インテインの挿入を寛容するＥＰＳＰＳタンパク質における部位を決定
するために、タンパク質配列を通してランダムに５アミノ酸を挿入したリンカー
スキャニング実験（Ｂｉｅｒｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２
８：１０６７−１０７７（２０００））（ＧＰＳ（登録商標）−ＬＳ ｆｒｏｍ
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ
）が行われた。それらの部位に挿入されたインテインは、アミノ酸挿入に寛容で
あることが見出された。次いで一方のプラスミド上でＳｓｐ ＤｎａＥインテイ
ンのＮ−末端に融合されるＥＰＳＰＳのＮ−末端フラグメントおよび、他方のプ
ラスミド上でＳｓｐ ＤｎａＥインテインのＣ−末端スプライシングドメインに
融合されるＥＰＳＰＳのＣ−末端部分をコードする遺伝子融合を配置したトラン
ス-スプライシング構築物が作製された。例えば、ＥＰＳＰＳタンパク質は、Ｇ
ｌｙ２３５に対応する部位で分断され得た。２つのプラスミドは機能的なＥＰＳ
ＰＳタンパク質を欠損したＥ．ｃｏｌｉ細胞に同時形質転換され、そして除草剤
グリフォセートの存在下または不在下でのＭ９最小培地における細胞増殖が観察
された。
【００１５】 分離ＡＬＳおよび分断ＥＰＳＰＳ除草剤耐性遺伝子の両方の活性が観察され、
インテインが改変されなかったか、または変化されたその触媒残基を有したか、
従ってトランス−スプライシング活性を排除したかのいずれかであった。このこ
とは、スプライシングは共有結合的に付着されたタンパク質産物を作製するが、
全ての状況においてそのようにする必要性はないことを示す。この兆候における
インテインは、２つのタンパク質フラグメントをともにおよび正確な方向におい
てもたらすための親和性ドメインとして作用する。これらの実験において、イン
テインの存在は分断タンパク質の活性に絶対に必要であった。これは、インテイ
ンの融合を伴わない分断ＡＬＳ遺伝子および分離ＥＰＳＰＳ遺伝子の両方が、適
切な除草剤に対するＥ．ｃｏｌｉ増殖を許容し得なかったという観察に基づく。
【００１６】 本発明の１つの実施態様において、インテインスプライシングドメインに融合
された２つの遺伝子フラグメントが、遺伝子移入を確認するための、抗生物質ま
たは他の増殖インヒビターに対する耐性のような選択マーカーを使用して、核染
色体に独立して導入される。２つの融合遺伝子の独立した移入は、植物ゲノム上
への、おそらく別々の染色体上への遠隔性の位置を確実にし、従って他の生物体
への移入に対して、両方の遺伝子が単一のウイルスまたはプラスミドベクターに
よって獲得され得る可能性を排除する。そのように所望される場合、２つの遺伝
子の遠隔性の位置は、公知のＤＮＡ配列を用いる相同組換えによって特定の部位
に標的することによって確認され得る。
【００１７】 別の実施態様において、遺伝子の不活性なフラグメントのみが花粉に存在する
ので、関連される種の他家受粉を含む任意の考え得る機構によって関連の植物に
遺伝子移入される任意の機会が排除されるように、２つの融合タンパク質の一方
が細胞核に形質転換され、および他方が葉緑体に形質転換される。葉緑体におけ
る遺伝子フラグメントは母性伝達され、および花粉を介して伝達され得ない。同
じ考慮がミトコンドリアにおいて発現される遺伝子フラグメントに対して適用さ
れる。
【００１８】 この技術はまた、非植物系に対して適用され得る。例えば、区分化される導入
遺伝子は分断され得、およびインテインが遺伝子フラグメントに融合され得る。
細菌の場合において、分断遺伝子は好ましくは、標準的な形質転換技術を使用し
て細菌染色体上に非常に離れて配置される。さらなるコントロール測定として、
遺伝子セグメントはまた、反対の方向に配置され得る。この方法の別の徴候は、
導入遺伝子活性が環境または隣接の細胞に伝播されることを防止するために、標
的遺伝子を２つに分断し、そして真核生物細胞への分断遺伝子の導入の前に適切
なインテインドメインに融合することである。分断遺伝子はまた、真核生物染色
体上に非常に離れて配置されるか、または別々の染色体上に配置される。さらに
、遺伝子フラグメントは核およびミトコンドリアのような別々の細胞小器官に位
置され得る。ミトコンドリアにおける遺伝子フラグメントは、母性伝達される。
【００１９】 本発明の１つの適用は、トランスジェニック植物から環境への、完全な導入遺
伝子の伝播を防止することにある。これは、導入遺伝子の融合物を２つ以上のフ
ラグメントに分断し、そしてそれらをインテインフラグメントに融合することに
よって達成される。部分的な導入遺伝子融合物は、一方の部分が核ＤＮＡにおい
ておよび第２の部分が葉緑体ＤＮＡにおいてのように、別々の区分に位置される
。部分的な遺伝子の発現に続いて、タンパク質フラグメントは、標的タンパク質
活性を再構成するようにそれらが会合される活性の部位に指向される。葉緑体Ｄ
ＮＡは次の世代に母性的にのみ継代されるので、核に存在する導入遺伝子フラグ
メントのみが、花粉を介して伝播される。これは、環境への完全な導入遺伝子の
伝播を非常に減少する。
【００２０】 本発明の別の利点は、タンパク質の１つの不活性な融合タンパク質種のみを発
現する宿主細胞が安全に操作され得、それによって毒素などであり得る標的タン
パク質にヒトおよび環境を曝露する危険性を減少する。また、２つの別々の遺伝
子座に標的遺伝子を分断することは、ＤＮＡキャリア（プラスミド、ウイルス、
コスミドなど）または他の手段（細胞融合など）を介する他の生物体への完全な
タンパク質をコードする配列の移入の機会を非常に減少する。１つの理論的な場
合は、毒素遺伝子、例えばジフテリア毒素を発現することである。ジフテリア毒
素タンパク質はヒトおよび動物細胞に対して極めて毒性のタンパク質であり、な
らびに極めて注意深く操作される必要がある。このタンパク質は、腫瘍細胞を根
絶するための薬剤としての使用について、前臨床および臨床治験第一相において
試験されている（Ｋｅｌｌｅｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８５（１１）：３９８０−３９８４（１９８８）；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、Ｎ
ｅｕｒｏｎ ３（１）：１３３−１３９（１９８９）；Ｍａｘｗｅｌｌら、Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１（１６）４２９９−４３０４（１９９１）；Ｍａｄｓｈ
ｕｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９（２６）：１７７２３−１７７２９（
１９９４）；ＭｕｒｐｈｙおよびｖａｎｄｅｒＳｐｅｃｋ、Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｂｉｏｌ．６（５）：２５９−２６７（１９９５）；Ｒｏｚｅｍｕｌｌ
ｅｒおよびＲｏｍｂｏｕｔｓ、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１２（５）：７１０−７１７
（１９９８）；Ｖｅｇｇｅｂｅｒｇ、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ４（３）：９
３（１９９８）；Ｋｒｅｉｔｍａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．、１１（５）：５７０−５７８（１９９９）；Ｖａｌｌｅｒａら、Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（９）：７７９−７８５（１９９９））。それゆえ、ジフ
テリア毒素遺伝子を２つのインテイン融合ＤＮＡセグメントに分断し、そしてそ
れらを２つの異なる細菌および酵母株において発現することは有利である。２つ
の融合タンパク質は混合され得、必要である場合、毒素を構築する。
【００２１】 第３に、標的遺伝子の少なくとも１つのフラグメントを、母性遺伝に供される
細胞小器官（例えば、葉緑体またはミトコンドリア）に区分化することによって
、関連される生物体への他家受精のようなプロセスを介する機能的遺伝子の遺伝
子移入が回避され得る。
【００２２】 ここに記載される本発明はまた、トランスジェニック動物において目的の任意
の遺伝子を発現するための手段として利用され得る。トランスジェニック動物モ
デルは、生物医学的研究を行うためのまたは所望のタンパク質を生成するための
科学的道具として広範に使用されている。トランスジェニックマウス、およびト
ランスジェニック魚、カエル、ラット、ウシ、ブタなどのような他のトランスジ
ェニック動物は、ワクチンまたは治療学的薬剤の生成のような研究および商業的
な目的のために、ヒト遺伝子（または外来遺伝子）を発現することが示されてい
る（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、Ｎｅｕｒｏｎ ３（１）：１３３−１３９（１９８９
）；Ｇｒｏｎｅｒら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４（１）：５３−７７（１９９０
）；Ｐａｔｉｌら、Ｎｅｕｒｏｎ ４（３）：４３７−４４７（１９９０）；Ａ
ｌｏｅら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ９（２）：１４９−１５５（１９９
３）；Ａｇｕｚｚｉら、Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．４（１）３−２０（１９９
４）；Ｇｒｏｎｅｒら、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．４８（５-
６）２３１−２４０（１９９４）；Ｓｃｈｏｒｄｅｒｅｔ、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔ
ｉａ ５１（２）：９９−１０５（１９９５）。関連文献の１つは、トランスジ
ェニック動物が所望されない外来遺伝子を獲得し得、およびこれを次の世代およ
びそれ以降に継代し得ることに関する。これは遺伝的に変化された動物種を生じ
、これは予期しない社会的および倫理的重大性を有し得る。本発明によれば、こ
のような導入遺伝子は２つの不活性な融合ＤＮＡフラグメントに分断され得る。
これらの一方は、動物ゲノムに遺伝的に取り込まれ得、他方のフラグメントはゲ
ノムに取り込まれ得ないＤＮＡキャリア（例えばウイルスなど）によって供給さ
れ得る。それゆえ、融合タンパク質の、動物からの一方の融合タンパク質とＤＮ
Ａキャリアからの他方とが同時発現される場合、融合タンパク質は再構築し、ト
ランス−スプライスし、そして活性なタンパク質を生成する。この遺伝子配置は
、動物が完全な外来遺伝子を獲得することを防止し、それによって遺伝子混入を
回避する。
【００２３】 ２つの遺伝子フラグメントの区分化はトランス−スプライシングの延長である
。問題のタンパク質はフラグメントに分割され、そして適切な分断遺伝子が同じ
または異なるＤＮＡ分子上に分けられる。例えば、適切なフラグメントに融合さ
れたＳｓｐ ＤｎａＥまたはＳｓｐ ＤｎａＢインテインスプライシングドメイ
ンを有する、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ ＰＣＣ ６８０３からのＤｎ
ａＥタンパク質の２つの半片の遺伝子（Ｗｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：９２２６−９２３１（１９９８ａ）；Ｗｕら、Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １３８７：４２２−４３２（１９９８ｂ
））は、一方の半片が核にあり、第２の半片が特定化された生物体のミトコンド
リアにあるように分割され得る。
【００２４】 本発明を実施するにおいて、１つ以上の以下の方法を用いなくてはならない、
すなわち、 （１）標的導入遺伝子において適切な分断部位を同定すること； （２）２つ以上のフラグメントに遺伝子を分断し、および各フラグメントを分
断インテインに融合するための方法論； （３）分断遺伝子産物を機能的な酵素またはタンパク質に首尾よく作製するた
めの方法論； （４）活性な遺伝子産物または生物体について宿主細胞をスクリーニングする
ための方法論； （５）関連する細胞性区分における分断遺伝子配列の配置； （６）標的遺伝子を２つよりも多いフラグメントに分断する方法； （７）導入遺伝子伝播を示すためのタンパク質相補の使用；および （８）導入遺伝子の導入。
【００２５】 （１）任意の導入遺伝子における適切な分断部位の同定のための方法 導入遺伝子において分断部位を同定するための１つの好ましい方法は、目的の
タンパク質およびそのアナログの構造解析に基づき、および配列相同性による。
このアプローチは、タンパク質をフラグメントに分割するための好ましいインテ
イン挿入部位（単数および／または複数）を同定するために、公知の生化学およ
びＸ線、ＮＭＲ、または関連される構造情報を研究することを包含する。特に、
どれが適切な反応性アミノ酸残基であるかを、およびタンパク質内のそれらの間
隔および空間配置を決定するべきである。可能であれば、触媒アミノ酸が各フラ
グメント上に分布されるように標的遺伝子を分断することが理想であり得る。こ
れは、いずれのフラグメントも単独で活性でないという尤度を増加する。タンパ
ク質分断部位は、タンパク質におけるいずれの場所でもあり得るが、試験するた
めの最初の部位は、βシートまたはα螺旋のような二次モチーフ間に存在するル
ープまたはリンカーであるべきである。選択される第１のループは触媒部位の部
分であるべきでないが、最終的な分断部位はそこに位置され得る。第１の試行と
して、好ましい分断部位は、タンパク質内の２つの折り畳みドメイン間のループ
またはリンカー領域である。これはタンパク質フラグメントが別々に発現される
場合に正確に折り畳まれる可能性を増加する。
【００２６】 生化学的なまたは構造的な情報が目的のタンパク質について利用可能ではない
場合、異なる生物体からの類似のタンパク質配列の、または同じ生物体からの類
似のタンパク質配列のアラインメントが有益であり得る。タンパク質アラインメ
ントは伝統的な方法によるか、またはＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔ
ｅｒ Ｇｒｏｕｐｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のような任意の多様なコンピュ-
タ-プログラムを使用することによる、配列比較により得る。全ての可能性にお
ける類似のタンパク質間の高い保存性の領域は、概して重要性の領域を示し、お
よび高い保存性の領域においてタンパク質を分断することは後の試験のために取
り置いておかれるべきである。むしろ、低い保存性の領域、好ましくは高い保存
性の領域間にあるアミノ酸数がまた変化する領域を決定するべきである。低い保
存性は、触媒残基が存在する低い可能性を示し、およびアミノ酸残基長の変化は
、保存されたドメイン間の正確な空間配置が、アミノ酸のこのストレッチによっ
て指令されないかもしれないことを示す。これらの特性は、インテイン挿入の部
位に、および標的タンパク質を分断することに有利である。
【００２７】 また、目的のタンパク質中にインテインを挿入するための部位を選択する場合
、試験されるインテインのスプライシング活性に好ましいアミノ酸残基を保有す
る部位を試験するべきである。好ましくは、調査の下、インテインの天然に存在
するイクステイン残基に類似または同一である標的タンパク質における部位が選
択され得た。あるいは、上手なスプライシングを促進することが知られる残基が
、インテインとともに挿入され得る。この場合において、スプライシング反応後
にこれらの残基はスプライスされた産物の配列中に存在し、そして標的タンパク
質の活性を変化し得る。標的タンパク質に対するこれらの余分な残基の効果が、
標的タンパク質に余分なアミノ酸を挿入し、そして所望の特性または活性を確認
することによって試験されるべきである。
【００２８】 別の好ましい方法は、ランダムなリンカー挿入による目的のタンパク質の体系
的な走査に基づく。リンカースキャニングは多くの方法によって行われ得る（Ｇ
ｕｓｔｉｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３０：８５−９０（２０
００）；Ｈｏｂｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：２７９−
２８５（１９９６）；Ｂｉｅｒｙ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８
：１０６７−１０７７（２０００））。このプロトコルは、全体を通してランダ
ムに挿入されたＤＮＡの余分なストレッチを有する遺伝子のライブラリーを作製
する。このライブラリーが翻訳される場合、これは異なる部分において挿入され
た余分な（単数か複数の）アミノ酸残基を伴うタンパク質のセットを生成する。
次いで、ライブラリーは、標的タンパク質の所望される特性についてスクリーニ
ングされる。例えば、標的タンパク質が除草剤に対する耐性を付与する場合、ラ
イブラリーは余分なアミノ酸残基を伴うタンパク質のどれが、除草剤の存在下で
標的生物の増殖を許容し得るのかを決定するためにスクリーニングされる。余分
なアミノ酸を寛容し得るタンパク質における部位の列挙が作製される。構造的な
および生化学的な情報が利用可能である場合、この列挙は公知の情報と比較され
得る。理想的な場合は、余分なアミノ酸挿入を寛容し、およびリンカーまたはル
ープ領域に存在し、そして触媒残基が異なるフラグメント上に位置されることを
生じる分断部位を選択することを含む。構造的な情報が利用可能でない場合、好
ましくは、標的タンパク質の中間に最も近い寛容部位にて遺伝子を分断すること
から開始し、そして所望される活性が再構築されるまで、そこから外側に向かっ
て分断部位を試験することを続ける。両方の方法において、好ましい挿入部位は
また、使用されるインテインについてのネイティブなイクステイン配列を保有す
るが、これは必要とされない。融合タンパク質は機能的な産物が評価されること
を許容する分断接合部位にて至適化されるアミノ酸残基を有し得る。
【００２９】 （２）遺伝子を分断するための、および各遺伝子フラグメントを分離インテイン
コード配列にインフレームで融合するための方法 一旦目的の遺伝子を分断するための部位が決定されると（上述を参照のこと）
、標的遺伝子は、一般的な遺伝子技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ：Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）
）を用いて、２つ以上のフラグメントに分断される。例えば、適切な制限部位を
有するＰＣＲプライマーが、一方が標的遺伝子の開始に対応され、および他方が
分断部位での配列に対応されるように設計され得る。分断部位および標的遺伝子
の他の末端に対応するＰＣＲプライマーの別のセットが作製され得る。ついで、
２つの標的遺伝子フラグメントは、ＰＣＲによって増幅され（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら、前出）、そしてＰＣＲプライマーに存在する同じ独特のクローニング部位を
有するプラスミドベクターにクローン化される。一旦別々のベクターにクローン
化されると、インテインフラグメントは標的遺伝子に融合される。１つの方法に
おいて、標的タンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡのＣ−末端は、インテ
インのＮ−末端部分をコードするＤＮＡのＮ−末端に融合され、そして（別々の
融合物において）標的タンパク質のＣ-末端部分をコードするＤＮＡのＮ−末端
は、インテインのＣ−末端部分をコードするＤＮＡのＣ−末端に融合される。
【００３０】 次いで、これらの遺伝子フラグメント融合物は、同じまたは別々の発現ベクタ
ーにトランスファーされ、そして細菌または真核生物細胞に形質転換され、単一
のまたは多細胞生物体として存在し、標的タンパク質の所望される活性について
スクリーニングされる。問題の遺伝子フラグメントが、天然に存在するかまたは
変異によって付加されるかのいずれかである、インテイン遺伝子内のまたはイン
テイン遺伝子に対して外側の制限部位を使用してクローン化され得ることが留意
されるべきである。また、組換え部位が組換えによる遺伝子の移動のために制限
酵素部位の代わりに使用され得る。次いで、遺伝子または遺伝子フラグメントは
トランスファーされ得、および/またはプラスミドベクター、ウイルスゲノム、
または細菌、真核生物、もしくは原始的な生物体のゲノムから発現され得る。１
つの好ましい方法は、天然に存在するトランス−スプライシングインテイン、例
えばＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ種ＰＣＣ６８０３のＤｎａＥ遺伝子からのイン
テイン（Ｗｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：９２
２６-９２３１（１９９８））を利用することである。しかし、任意の公知のイ
ンテインが使用され得る（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｎｅｂ.ｃｏｍ/ｎｅｂ/ｆｒａｍ
ｅ_ｔｅｃｈ.ｈｔｍｌでのＩｎＢａｓｅ；Ｐｅｒｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２８：３４４-３４５（２０００）を参照のこと）。これ
は所望の親和性またはトランス−スプライシングドメインを作製するために、完
全長インテインを分離することを包含する。１つの方法は、タンパク質スプライ
シングドメインのブロックＢとＦとの間のリンカー領域において完全長インテイ
ンを分離することである（Ｐｅｔｒｏｋｏｖｓｋｉ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．
７：６４−７１（１９９８）；Ｐｅｒｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２５：１０８７−１０９３（１９９７）；Ｐｅｒｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：３４４−３４５（２０００））。
【００３１】 （３）発現される分断フラグメントから機能的なタンパク質を作製する 次の工程は、機能的な酵素へのタンパク質のＮ−末端およびＣ−末端の半片の
相補および再構築を促進する親和性ドメインとしてインテインを使用することで
ある。タンパク質分断を決定するための部位は、上述の（１）において記載され
るとおりであり、ならびに標的遺伝子フラグメントのクローニングおよびインテ
インドメイン付加は（２）において記載されるとおりである。この場合において
、インテインフラグメントは酵素活性を再構築するために２つのタンパク質フラ
グメントのスプライシングを引き起こすことを必要としない。１つの好ましい実
施態様において、インテインドメインは、スプライシング活性の可能性を消滅す
るために変異され、そしてタンパク質相補の促進因子としてのみ作用する。イン
テインスプライシング活性は、スプライシング反応に関与されるアミノ酸残基を
変異することによって消滅され得る（Ｘｕら、ＥＭＢＯ Ｊ．１５：５１４６−
５１５３（１９９６）；Ｃｈｏｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２
１５９−２２１６８（１９９６）；Ｃｈｏｎｇら、ＢｉｏＣｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ ２５９：１３６−１４０（１９９９）；Ｃｈｏｎ
ｇら、Ｇｅｎｅ、１９２：２７１−２８１（１９９７）；Ｃｈｏｎｇら、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２６：５１０９−５１１５（１９９８）；Ｃ
ｈｏｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３：１０５６７−１０５７７（１
９９８）；ＣｈｏｎｇおよびＸｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：１５５
８７−１５５９０（１９９７）；Ｅｖａｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２
７４：１８３５９−１８３６３（１９９９）；Ｅｖａｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．、２７４：３９２３−３９２６（１９９９）、Ｅｖａｎｓら、Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｓｃｉ．、７：２２５６−２２６４（１９９８）、Ｅｖａｎｓら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５：９０９１−９０９４（２０００）；Ｍａｔｈｙ
ｓら、Ｇｅｎｅ，２３１：１−１３（１９９９）；Ｐａｕｌｕｓ、Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．Ｒｅｖ．、２７：３７５−３８６（１９９８）；Ｐｅｒｌｅｒら、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：１０８７−１０９３（１９９７）；Ｐ
ｉｅｔｒｏｋｏｖｓｋｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．、３：２３４０−２３５
０（１９９４）；Ｐｉｅｔｒｏｋｏｖｓｋｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．、７
：６４−７１（１９９８）、Ｓｃｏｔｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、９６：１３６３８−１３６４８（１９９９）、Ｓｈｉｎｇｌｅｄｅ
ｃｋｅｒら、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３７５：１３８−１
４４（２０００）；Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２
７：１１０−１２０（１９９９）；Ｔｅｌｅｎｔｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
．、１７９：６３７８−６３８２（１９９７）；Ｗｏｏｄら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ．、１７：８８９−８９２（１９９９）；Ｗｕら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １３８７：４２２−４３２（１９９８ｂ）；Ｗｕ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：９２２６−９２３
１（１９９８ａ））。
【００３２】 別の実施態様において、インテイン親和性ドメインはその正常な触媒ドメイン
残基を保持する。さらに、インテインは欠失または変異体形態から構成され得、
それによって、これはその元来の一次配列に比較される場合、有意により小さい
またはより大きいか、またはネイティブでないアミノ酸残基を含む。インテイン
の欠失形態は、遺伝子レベルまたはタンパク質分解的にのいずれかでインテイン
の大きさを連続的に減少し、次いで親和性活性について試験することによって作
製され得る。親和性活性は、分離除草剤耐性遺伝子を使用し、および新規な欠失
変異体を適切な除草剤耐性遺伝子フラグメントに融合し、そして、問題の除草剤
に対する増殖を調べることによって試験され得る。インテインフラグメントの変
異は、エラー傾向ＰＣＲ、リンカースキャニング、部位特異的変異誘発によって
、または変異原性化合物によって形成され得、そしてインテインフラグメントの
活性は上記のように試験される。除草剤耐性遺伝子が薬剤耐性遺伝子、緑色蛍光
タンパク質、または任意の選択マーカーによって置換され得ることに留意のこと
。インテインフラグメントの親和性はまた、１つのフラグメントを固体支持体上
に固定化し、そして第１のフラグメントへの第２のフラグメントの結合について
試験することによって試験され得た。
【００３３】 （４）適切な宿主細胞または生物体において目的の活性なタンパク質を生成する
構築物をスクリーニングする方法 標的遺伝子活性についてのスクリ-ニングは、標的遺伝子とともに変化するが
、発現および生成後のまたは粗細胞溶解物中のインビトロアッセイにより得るか
、または生存性、形態学、薬剤もしくは化合物に対する感受性もしくは非感受性
、外観、または特異的な分子もしくは化合物を結合するかまたは結合しない能力
のような細胞表現型によってタンパク質活性を決定することによってインビボで
あり得る。１つの好ましい方法は、例えば、分断遺伝子の再構築される産物の除
草剤耐性活性を試験するために、Ｅ．ｃｏｌｉを宿主細胞として使用することで
ある。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、問題の除草剤に対して感受性でなければならない。
標的遺伝子フラグメントは、インテインの融合を伴って、プラスミド（単数また
は複数）上に存在し、そして標準的な技術を使用してＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転
換される。
【００３４】 遺伝子融合は、構成的に、または誘導性のプロモーターによるかのいずれかで
発現される。次いでＥ．ｃｏｌｉは、選択条件下、すなわち、除草剤の存在下、
適切な遺伝子フラグメントの存在下または不在下の両方で、増殖について試験さ
れる。遺伝子フラグメントの存在下での増殖は、標的タンパク質活性の再構築を
示す。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、当該分野において周知の技術を用いることによって
、任意の細菌、古細菌、または真核生物の細胞型（単細胞または多細胞のいずれ
か）、およびウイルスで置換され得る。
【００３５】 さらに、標的遺伝子フラグメントの両方が生物体のゲノムに存在し得るか、ま
たは一方のフラグメントはゲノムに存在し得、および他方はプラスミドまたはい
くつかの他のベクターに存在し得る。標的タンパク質フラグメントは１つの生物
体においてともにまたは別々に発現され得、そしてアッセイのために別の細胞型
に添加され得る。融合物は、宿主生物体の核、葉緑体、またはミトコンドリアの
ゲノム中に導入遺伝子フラグメントを配置し、そして所望される活性が存在する
か否かを決定することによって、植物細胞または他の多細胞生物体において直接
的に試験され得る。標的遺伝子またはタンパク質フラグメントは、細菌、真菌、
ウイルス、ミセル、機械的手段（微粒子銃）、または類似のベクターによって、
試験される細胞型または生物体に送達され得る。
【００３６】 （５）分断遺伝子の位置 本発明はまた、異なる細胞区分、染色体における異なる位置、または異なるベ
クターにおける分離標的遺伝子配列の位置を含む。１つの好ましい方法は、２つ
の分離遺伝子配列を、核、葉緑体、ミトコンドリア、細菌人工染色体、酵母人工
染色体、プラスミドに、好ましくは上述のいずれにおいてもともにではなく配置
することである。フラグメントの位置は、標準的な分子生物学技術に従って達成
され得る。そのフラグメントから遺伝子産物を再構築するために、適切な遺伝子
フラグメントは、それらのタンパク質産物が、機能的な再構築が起こり得る細胞
区分（例えば、葉緑体）に輸送されるように標的化／局在化配列に融合されなく
てはならない。
【００３７】 （６）２つ以上のフラグメントに標的遺伝子を分断する方法 本発明はまた、標的遺伝子を２つ以上のフラグメントに分離し、およびトラン
ス−スプライシング、インテイン媒介性の区分、または全ての必要なフラグメン
トのタンパク質相補によって所望される活性を再構築するための方法を包含する
。例えば、異なる親和性を有するインテインは、以前に記載される様式において
（Ｏｔｏｍｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８；１６０４０−１６０４４（
１９９９）；Ｏｔｏｍｏら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ、１４：１０５−１１４
（１９９９））、標的タンパク質フラグメントに、それらが活性なタンパク質を
再構築するように付着され得る。この場合において、各フラグメントは染色体中
に、別々の染色体上に、または上記されるように複数の位置において、非常に離
れて位置されるが、ただし位置の数は、タンパク質が分割されたフラグメントの
数を適合し得る。
【００３８】 （７）導入遺伝子伝播の防止におけるタンパク質相補の使用 このプロトコルは、所望のタンパク質特性を再構築するための２つのタンパク
質フラグメントの天然の相補活性を使用する。タンパク質の半片をコードする２
つの遺伝子は、核、葉緑体、ミトコンドリア、細菌人工染色体、酵母人工染色体
、プラスミド、またはこれらの細胞小器官もしくはベクターの任意の組み合わせ
において位置される。発現後、両方のタンパク質フラグメントは、タンパク質作
用の部位に標的化され得、および所望されるタンパク質特性がタンパク質フラグ
メントの相補によって作製される。タンパク質相補は以前に報告され（Ｒｏｓｓ
ｉら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０：１１９−１２２（２０００）
）、およびインテインを代替に相補ドメインとして使用することを可能にする。
この実験を行うために必要な手順は、インテイン融合が使用されないことを除い
て既に考察されたことに類似する。標的遺伝子を分断する部位は（１）において
記載されるように決定される。導入遺伝子フラグメントは、インテインが融合対
として使用されないことを除いて、（２）において記載されるようにクローン化
される。分断タンパク質の活性についてのスクリーニングは、（４）において記
載されるように行われる。
【００３９】 （８）ウイルス感染によって生物体に導入遺伝子を導入する なお別の実施態様において、２つの導入遺伝子フラグメントは、インテイン融
合物であるかまたはそうでないかのいずれかであり、別々のウイルス粒子にパッ
ケージングされ得る。これらのウイルスは生物体を同時感染し、および両方の導
入遺伝子が発現される。所望されるタンパク質特性は、タンパク質スプライシン
グ、インテイン媒介性相補、またはタンパク質相補後に生成される。１つの好ま
しい方法は分断部位を選択し、フラグメントをクローン化し、および実施例（１
）、（２）、および（４）において記載されるように、イントランスでの活性を
確認する工程を包含する。適切に分断された導入遺伝子または導入遺伝子インテ
イン融合物は、アデノウイルスにパッケージングされる。適切な導入遺伝子を含
有するアデノウイルスは、対象の生物体に導入され得、そしてトランスフェクシ
ョンの際に標的タンパク質の活性が発現されるように２つの遺伝子フラグメント
を導入する。
【００４０】 後記する実施例について、以下にまとめる。 実施例１において、本発明者らはインテインによって、除草剤耐性遺伝子を分
断する方法を実証する。本発明者らは、目的のタンパク質またはそのアナログの
配列相同性解析および結晶構造に基づいてアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）をコー
ドするＥ．ｃｏｌｉ除草剤耐性遺伝子における潜在的な分断部位をどのように選
択するのかを示す。ＡＬＳタンパク質のＮ-末端３２７アミノ酸残基をコードす
るＤＮＡフラグメントが、Ｓｓｐ ＤｎａＥインテインのＮ−末端の１２３アミ
ノ酸にインフレームで融合され、一方Ｃ−末端の２２１アミノ酸残基をコードす
るＤＮＡフラグメントはＳｓｐ ＤｎａＥインテインのＣ−末端の３６アミノ酸
にインフレームに融合された。１つの融合遺伝子を保有するプラスミドベクター
は、不活性なＡＬＳタンパク質フラグメントとして発現される。両方の融合遺伝
子ベクターが同じ宿主細胞に導入され、そして同時発現される場合、２つの不活
性な融合タンパク質はトランス−スプライシングを受けてインビボで機能的な酵
素を生成し、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞に対して除草剤耐性を付与する。このアプロ
ーチは、インテイン配列への融合のための、任意の遺伝子における適切な部位の
選択に適用され得る。
【００４１】 実施例２において、本発明者らは、トウモロコシＡＬＳ遺伝子およびそのＥ．
ｃｏｌｉ対応物の、ＡＬＳＩＩ遺伝子の配列相同性に基づいた、トウモロコシＡ
ＬＳ遺伝子において分断部位を選択する方法を実証する。トウモロコシＡＬＳ遺
伝子のＮ−末端３９７アミノ酸残基をコードするＤＮＡは、Ｓｓｐ ＤｎａＥイ
ンテインのＮ−末端の１２３アミノ酸をコードするＤＮＡ配列にインフレームで
融合され、一方、Ｃ−末端の２４１アミノ酸残基をコードするＤＮＡフラグメン
トは、Ｓｓｐ ＤｎａＥインテインのＣ−末端の３６アミノ酸をコードするＤＮ
Ａにインフレームで融合された。本発明者らは、２つの融合遺伝子が同時発現さ
れ、２つの融合タンパク質がトランス−スプライシングを受けて成熟タンパク質
について予測される大きさのタンパク質産生物を生成することを示す。
【００４２】 実施例３において、本発明者らは、トランスポゾンランダムリンカー挿入に基
づいた、５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）を
コードする、変異体Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ａｒｏＡ遺伝子における潜在
的な分離部位を同定する方法を実証する。全ての４２個の潜在的な部位のうちの
ＥＰＳＰＳのアミノ酸２１５位および２３５位の２つの部位を、ＥＰＳＰＳ遺伝
子を分離するために選択した。ＥＰＳＰＳタンパク質のＮ−末端の２１５および
２３５アミノ酸残基をコードするＤＮＡフラグメントは、Ｓｓｐ ＤｎａＥイン
テインのＮ-末端の１２３アミノ酸にインフレームに融合され、一方ＥＰＳＰＳ
のＣ−末端の２１２または１９２アミノ酸残基をコードするＤＮＡフラグメント
は、Ｓｓｐ ＤｎａＥインテインのＣ−末端の３６アミノ酸をコードするＤＮＡ
にインフレームに融合された。融合されるインテインを伴うかまたは伴わないＥ
ＰＳＰＳ遺伝子の半片のみ、およびインテインを伴わない２つの相補な半片がＥ
Ｒ２７９９に導入される場合、ＥＰＳＰＳは非機能的なタンパク質として発現さ
れた。しかし、活性なまたは不活性なインテインの半片の両方で融合されるＥＰ
ＳＰＳの両方の半片がＥＲ２７９９に導入される場合、ＥＰＳＰＳは機能的なタ
ンパク質として発現され、および除草剤グリフォセートに対する耐性を付与し、
Ｓｓｐ ＤｎａＥインテインのＮ−末端およびＣ−末端の半片が密接に近位にＥ
ＰＳＰＳの半片を結合することによってＥＰＳＰＳのＮ−末端およびＣ−末端の
半片の相補および再構築を促進することを示す。
【００４３】 実施例４において、本発明者らは、アミノグリコシド−３−アセチルトランス
フエラーゼ（薬剤スペクチノマイシンまたはストレプトマイシンの代謝を担う酵
素）およびＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａの可溶性の改変された緑色蛍光
タンパク質のような２つの未関連の遺伝子産物がＥ.ｃｏｌｉ細胞において１つ
のハイブリッドタンパク質にトランス-スプライスされ得た方法を記載する。両
方の遺伝子は、それぞれＳｓｐ ＤｎａＥインテインからのトランス−スプライ
シングエレメントを有する２つの異なるプラスミド上に位置される。プラスミド
は２つの独立した発現の機構を有する。このハイブリッドタンパク質はスペクチ
ノマイシン硫酸に対する耐性を付与する。
【００４４】 実施例５において、本発明者らは、ａａｄＡ（アミノグリコシド−３−アセチ
ルトランスフエラーゼをコードする）およびｓｍＧＦＰ（可溶性の改変された緑
色蛍光タンパク質）のような２つの未関連の遺伝子が、葉緑体プロモーター（Ｐ
ｐｓｂＡ）による転写および翻訳制御下で単一のＥ.ｃｏｌｉ−植物バイナリー
ベクター上に位置し得た方法を記載する。両方の遺伝子は、発現される場合、ハ
イブリッドアミノグリコシド−３−アセチルトランスフエラーゼ-可溶性の改変
された緑色蛍光タンパク質を生成し得る。従って、この方法は、Ｅ.ｃｏｌｉお
よび植物細胞性機構の両方によって認識され得るプロモーターを使用して、植物
細胞に導入する前のタンパク質／タンパク質フラグメントの迅速なトランス−ス
プライシングスクリーニングを許容する。
【００４５】 実施例６において、本発明者らは、Ｓｓｐ ＤｎａＥインテインとともに５−
エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）またはアセト乳
酸合成酵素（ＡＬＳ）遺伝子のいずれかの２つのフラグメントを含むシス−スプ
ライシング構築物が、植物細胞質において成熟タンパク質にスプライシングされ
得る方法を記載する。この実験は、細胞質におけるシス／トランス−スプライシ
ングの発想を強調する。この技術は、細胞質の環境における活性／折り畳みのた
めに特異的な改変を必要とするタンパク質について有用である。必要な輸送シグ
ナルおよびスプライシングエレメントとともに標的タンパク質遺伝子の一部分は
、前駆体ポリペプチドの形態における細胞質輸送のために細胞小器官中に配置さ
れる。
【００４６】 実施例７、第１節において、本発明者らは、ａａｄＡ（アミノグリコシド−３
−アセチルトランスフエラーゼ）およびｓｍＧＦＰ（可溶性の改変された緑色蛍
光タンパク質）のような２つの未関連の遺伝子が葉緑体ゲノム上に位置され得、
そしてタンパク質トランス−プライシングを介してハイブリッドタンパク質を生
成し得た方法を記載する。この方法における成功は、タンパク質／タンパク質フ
ラグメントの区分化および機能的タンパク質のトランス−スプライシングに導く
。また、多機能性タンパク質を形成するための１つのベクターにおけるいくつか
の別々の遺伝子の形質転換は、新規な特徴の操作を単純化する。
【００４７】 実施例７、第２節において、本発明者らは、２つの未関連の遺伝子（単数／複
数）フラグメントが、植物細胞における、葉緑体および核のような２つの異なる
区分に局在化され得、そしてそれぞれのタンパク質／ポリペプチドを発現し得た
方法を記載する。核にコードされる成分は、タンパク質フラグメントが細胞質に
おいて合成され、そしてトランス−スプライシング事象を生じるために葉緑体に
移行されることを補助する葉緑体輸送ペプチドを伴った３部分からなる。葉緑体
の半片は細胞小器官の環状ゲノム中に取り込まれた成分として存在する。得られ
る植物は、新しく導入された導入遺伝子の新規な特徴を、任意の密接に関連され
る種に伝達し得ない。
【００４８】 本発明は、以下の実施例によってさらに説明される。これらの実施例は本発明
を理解することを補助するために提供され、および本発明の制限として解釈され
ない。
【００４９】 上述および以下で引用される文献は本明細書中に参考として援用される。
【００５０】
【実施例】
実施例１：タンパク質トランス-スプライシングによるＥ.ｃｏｌｉにおける機能
的な除草剤−耐性アセト乳酸合成酵素の生成 本実施例において、本発明者らは、Ｓｓｐ ＤｎａＥインテインコード配列（
Ｅｖａｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：９０９１−９０９４（２００
０）；Ｓｃｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６：
１３６３８-１３６４３（１９９９））との融合によって、除草剤耐性変異を保
有するＥ.ｃｏｌｉアセト乳酸合成酵素ＩＩ（ＡＬＳＩＩ；ＥＣ４．１.３．１８
；アセトヒドロヒドロキシ酸合成酵素）をコードする遺伝子（Ｙａｄａｖら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：４４１８−４４２２（１
９８６）；Ｈｉｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３３５：６５３−６６１（１９
９８））を分断するための方法を実証する。本発明者らは、細菌Ｅ．ｃｏｌｉ
ＥＲ２７４４（ｆｈｕＡ２ ｇｌｎＶ４４ ｅｌ４−ｒｆｂＤ１？ ｒｅｌＡ１
？ ｅｎｄＡ１ ｓｐｏＴ１？ Ｔｈｉ−１Δ（ｍｃｒＣ-ｍｒｒ）１１４：：
ＩＳ１０ ｌａｃＺ：：Ｔ７遺伝子１）においてタンパク質トランス−スプライ
シングを通して機能的に活性なＡＬＳＩＩ酵素を再構築し得た（図８）。先ず、
本発明者らは、その配列および構造相同性の解析に基づいてアセト乳酸合成酵素
ＩＩ遺伝子における潜在的な分断部位をどのように選択するのかを示す。次いで
本発明者らは、分断ＡＬＳタンパク質のタンパク質トランス−スプライシング活
性を分析するための実験をどのように設計し、そして行うのか、および再構築さ
れたＡＬＳの酵素学的活性をどのようにアッセイするのかを示す。本発明者らは
、２つの別々のプラスミドベクターから生成される、ＡＬＳ融合タンパク質の２
つの部分がトランス−スプライシングを受けて、成熟タンパク質について予測さ
れる大きさのタンパク質産物を生成することを実証する。さらに、分断ＡＬＳ遺
伝子フラグメントの同時発現が、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７４４において除草剤に
対する耐性を付与した。この方法は、トランス-スプライシングインテインを利
用して任意のタンパク質の生成に適用され得る。
【００５１】 １．野生型Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＬＳＩＩのクローニングおよびその除草剤耐性変
異体の作製 最初の工程は、野生型ＡＬＳＩＩをクローン化し、そしてアラニン２６からバ
リンへの置換を保有する除草剤耐性ＡＬＳＩＩ変異体（Ｙａｄａｖら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：４４１８−４４２２（１９８６
）；Ｈｉｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３３５：６５３−６６１（１９９８）
）を作製することである。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＩ１６２は、酵素学的に活性なコピ
ーＡＬＳＩＩを含有し、ＣＧＳＣ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ
Ｃｅｎｔｅｒ（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｃｉｔｙ、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ
）から得られた。ゲノムＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉ
ａｇｅｎ、Ｉｎｃ．Ｓｔｕｄｉｏ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用してＥ．ｃｏｌｉ株
ＭＩ１６２から抽出した。ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、プライマ
ー５’−ＧＧＡＣＧＧＧＧＡＡＣＴＡＡＣＴＡＴＧ−３’（配列番号１）および
、５’−ＣＣＡＣＧＡＴＧＡＣＧＣＡＣＣＡＣＧＣＧ−３’（配列番号２）なら
びにＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して、完全長のＡＬＳＩＩをクロー
ン化するためにＥ．ｃｏｌｉＤＮＡサンプルに対して行った。ＡＬＳＩＩコード
配列を、プライマー５’−ＧＧＡＧＧＧＧＧＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＧＣＧＣＡＣ
ＡＧＴＧＧＧ−３’（配列番号３）および５’−ＧＧＧＧＧＧＴＣＡＴＧＡＴＡ
ＡＴＴＴＣＴＣＣＡＡＣ−３’（配列番号４）を使用してさらに増幅し、そして
ｐＴＹＢ１プラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒ
ｌｙ、ＭＡ）のＮｄｅＩおよびＰｓｔＩ部位にクローン化し、ベクターｐＡＬＳ
ＩＩを作製した。より短い構築物、ｐＴＹＢＴ−ＡＬＳＩＩを、ＰｍｅＩおよび
ＢｓｔＺ１７２での制限消化、続く自己ライゲーションによるｐＡＬＳＩＩから
の３−ｋｂ非必須配列の除去によって得た。除草剤耐性変異、アラニン２６から
バリンを、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇ
ｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用
する部位特異的変異誘発によってｐＴＹＢＴ−ＡＬＳＩＩにおいて導入した。変
異誘発プライマーは、５’−ＣＣＧＧＧＴＧＧＣＧＴＡＡＴＴＡＴＧＣＣＧＧＴ
ＴＴＡＣＧ−３’（配列番号５）および５’−ＣＧＴＡＡＡＣＣＧＧＣＡＴＡＡ
ＴＴＡＣＧＣＣＡＣＣＣＧＧ−３’（配列番号６）であった。ｐＴＹＢＴ−ＡＬ
ＳＩＩｍの部分ＮｄｅＩおよびＰｓｔＩ消化によって作製された変異されたＡＬ
ＳＩＩ（ＡＬＳＩＩｍ）コード配列を、ｐＴＹＢ１とともにライゲーションして
、ＡＬＳＩＩｍ発現ベクター、ｐＡＬＳＩＩｍを生成した。
【００５２】 ２．分断部位の選択 任意の遺伝子内の適切な分断部位を同定するための１つの好ましい方法は、タ
ンパク質のファミリーの配列相同性を分析すること、およびそのタンパク質構造
またはその相同体の構造を試験することである（Ｉｂｄａｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ、３５：１６２８２−１６２９１（１９９６））。配列アラインメン
トおよび構造比較は、細菌、酵母、および高等植物のＡＬＳ遺伝子が高度に保存
された領域を共有することを示唆する（図９、部分的な配列アラインメントのみ
がここで示される）。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉアセト乳酸合成酵素のイソ型ＩＩに
おけるアミノ酸残基Ｑ３２７およびＣ３２８の周囲の領域のような、タンパク質
に存在する高度な可変領域がある（図９）。Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＬＳＩＩは他の相
同体と比較してこの領域において１０個のアミノ酸ギャップを有し、および隣接
配列は異なる種からのＡＬＳ遺伝子間でほとんど相同性を有しない（図９）。さ
らに、相同体、ピルビン酸酸化酵素の結晶構造の解析は、Ｑ３２７およびＣ３２
８が、触媒コアから離れた、２つの分子内ドメイン間のリンカー構造に位置され
るようであることを示唆する（Ｉｂｄａｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５
：１６２８２−１６２９１（１９９６））。それゆえ、本発明者らは、この領域
でのインテインによるＡＬＳＩＩ分離は、効率的なタンパク質トランス−スプラ
イシングを許容するために必要な可動性を保持し得ることを考えた。さらに、こ
の位置への外来タンパク質配列の挿入は、ＡＬＳＩＩの触媒ドメインの構造およ
びその触媒活性に対する影響をほとんど有しないかまたは全く有しないかもしれ
ない。従って、アミノ酸残基Ｑ３２７およびＣ３２８を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＬＳ
ＩＩの分離部位の１つとして選択した（矢印によって示される、図９）。
【００５３】 ３．Ｅ．ｃｏｌｉアッセイ系 変異Ａｌａ２６Ｖａｌを保有するＥ．ｃｏｌｉアセト乳酸合成酵素のイソ型Ｉ
Ｉは、ＡＬＳＩＩｍと呼ばれ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７４４株において、スルホ
メツロンメチル（ＳＭ）のようなスルホニル尿素除草剤（ＳＵ）に対する耐性を
付与する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７４４株を、Ｑ３２７とＣ３２８との間のリン
カー挿入によって遺伝子改変された除草剤耐性Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＬＳＩＩ遺伝子
の活性を評価するためのインビボモデル系として用いた。Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２
７４４は、活性なＡＬＳＩおよびＡＬＳＩＩＩ酵素を含むが、活性なＡＬＳＩＩ
を含まない野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２に由来する。ＡＬＳＩおよびＡＬＳＩＩ
Ｉは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＡＬＳ遺伝子の２つのイソ型であり、バリン、イソ
ロイシン、およびロイシンの合成に重要である（ＬａＲｏｓｓａおよびＳｃｈｌ
ｏｓｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：８７５３−８７５７（１９８４））
。それらの活性は、バリンフィードバック阻害に感受性である。それゆえ、増殖
培地を１００μｇ／ｍｌバリン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で飽和
することによって、ＡＬＳＩおよびＡＬＳＩＩＩは阻害され、そして細胞は増殖
を停止する。組換え除草剤耐性ＡＬＳＩＩ（ＡＬＳＩＩｍ）をＥ．ｃｏｌｉ細胞
において導入することによって、ＡＬＳＩＩはバリン阻害に耐性であるので、そ
れらの増殖は救済される。
【００５４】 ４．改変された除草剤耐性ＡＬＳ遺伝子の作製 インテインはしばしば、至適なスプライシングまたはトランス−スプライシン
グ活性を達成するためにそのＮ−末端およびＣ−末端を隣接するあるアミノ酸残
基を必要とする。例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ種ＰＣＣ６８０３のｄｎ
ａＥ遺伝子からのインテインは、５つのネイティブな残基がそのＮ−末端および
Ｃ−末端の両方で存在した場合、効率よくスプライスされたが、これらの残基の
欠失は種々の程度にスプライシング活性を阻害した（Ｅｖａｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：９０９１-９０９４（２０００））。スプライス接合部
でのこれらの至適なアミノ酸残基の包含は、上手なスプライシング活性のために
必要とされ得る。それゆえ、得られる産物は２つのタンパク質配列の連結接合部
にてこれらの残基を保有し得る。従って、各インテイン挿入部位について、これ
らの余分なアミノ酸残基が産物の活性に対して有害な影響を有するか否かを評価
することが必要である。
【００５５】 ＡＬＳＩＩｍ−１４を、ＡＬＳＩＩｍコード配列のＱ３２７とＣ３２８Ａとの
間への以下の１４アミノ酸残基（ＮＨ２−ＬＥＫＦＡＥＹＣＦＮＫＳＴＧ−ＣＯ
ＯＨ（配列番号７））をコードする合成ＤＮＡリンカー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）の挿入によって構築した。ＡＬＳ
ＩＩｍ-１４の除草剤耐性活性を、ＡＬＳＩＩｍ−１４タンパク質を発現するプ
ラスミドによって形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７４４宿主細胞を使用し
て試験した。野生型ＡＬＳＩＩおよび除草剤耐性ＡＬＳＩＩ（ＡＬＳＩＩｍ）を
発現するプラスミドで形質転換されたＥ.ｃｏｌｉ ＥＲ２７４４細胞をコント
ロールとして使用した。
【００５６】 プレートアッセイを、ＡＬＳＩＩｍ−１４が、バリン（１００μｇ/ｍｌ）ま
たはバリン＋除草剤ＳＭ（５０μｇ／ｍｌ、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｐａｒｋ、Ｂｅｌ
ｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡ）で飽和されたＭ９最小培地プレート（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら、（１９８９））からＥ.ｃｏｌｉ ＥＲ２７４４を救済する能力を試験する
ために行った。Ｍ９培地は、２μｇ／ｍｌチアミン、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．
１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．２％グルコ-ス、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、１
００μｇ／ｍｌのアンピシリン、および０．３ｍＭ ＩＰＴＧを含む。プレーテ
ィングアッセイのために、１００μｌの２５ｍｇ／ｍｌバリンを、５０μｌの２
５μｇ／ｍｌスルホメツロンメチル（ＳＭ）を伴ってまたは伴わないで、Ｍ９選
択培地上に広げた。細菌増殖をアッセイするために、一晩培養物を、バリンおよ
び／またはＳＭを含有するまたは含有しないＭ９プレート上に画線した。プレー
トを写真を撮影する前に、種々の温度（図１０において示されるように）で、４
８〜７２時間インキュベートした。バリンが補充されたプレートにおいて、ＡＬ
ＳＩＩ、ＡＬＳＩＩｍ、またはＡＬＳＩＩｍ−１４のいずれかを発現する細胞は
、増殖し得た（図７左側）、しかし、バリンおよびＳＭの両方が適用された場合
、除草剤耐性ＡＬＳＩＩｍまたはＡＬＳＩＩｍ−１４を発現する株のみが増殖し
得た（図７右側）。これらのインビボでの結果は、推定の分離部位に挿入された
１４個のアミノ酸残基を有するＡＬＳＩＩｍが、バリンおよびＳＭの存在下でＥ
．ｃｏｌｉ ＥＲ２７４４の増殖を救済したことを実証した。それゆえ、ＡＬＳ
ＩＩｍ−１４は機能的に活性であり、および１４個のアミノ酸挿入はその酵素学
的活性を影響しない。
【００５７】 ５．ＡＬＳ−ＩＩインテイン融合遺伝子の構築 次に、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＬＳＩＩｍ遺伝子を分離し、そしてＳｓｐ ＤｎａＥ
インテインコード領域のＮ−末端およびＣ−末端半片にインフレームに融合した
。融合遺伝子を、Ｅｖａｎｓら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：９０９１−
９０９４（２０００））によって以前に記載されるように、同じＥ．ｃｏｌｉ宿
主細胞において２つのインテイン融合遺伝子を同時発現し得る、２つの適格性Ｅ
．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＭＥＢ１０およびｐＫＥＢ１を使用して作製した。除
草剤耐性ＡＬＳＩＩ（ＡＬＳＩＩＭ）遺伝子の３２７個のアミノ酸のＮ−末端フ
ラグメントをコードするＤＮＡ配列を、Ｓｓｐ ＤｎａＥインテインのＮ−末端
を隣接する７アミノ酸残基、続くインテインＮ-末端の１２３アミノ酸残基（Ｉ
Ｎｎ）のコード領域にインフレームに融合した（図８）。ＡＬＳＩＩｍのＣ−末
端の２２１アミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列を、Ｓｓｐ ＤｎａＥインテイ
ンのＣ−末端３６アミノ酸残基（ＩＮｃ）およびインテインのＣ−末端を隣接す
る７アミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列にインフレームに融合した（図８）。
ＡＬＳＩＩ Ｎ−末端フラグメントを、プライマー５’−ＧＧＧＧＧＴＣＡＴＧ
ＡＡＴＧＧＣＧＣＡＣＡＧＴＧＧＧ−３’（配列番号１０）および５’−ＧＣＧ
ＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＧＡＴＴＴＡＡＣＧＧＣＴＧＣＴＧＴＡＡＴＧ−３’（配
列番号１１）を使用して、ｐＡＬＳＩＩｍから増幅した。増幅されたフラグメン
トを消化し、そしてｐＭＥＢ１６のＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位にクローン化し
、これはＳｓｐ ＤｎａＥインテインのＮ−末端１２３アミノ酸残基をコードす
る配列を含む。得られるベクターｐＥＡ（Ｎ）は、ＡＬＳＩＩｍ Ｎ−末端フラ
グメントおよびＤｎａＥ Ｎ−末端フラグメント（ＡＬＳＩＩｍ（Ｎ）-ＩＮｎ
）から構成される融合タンパク質を発現する。ＡＬＳＩＩのＣ−末端フラグメン
トを、プライマー５’−ＧＣＧＣＧＡＣＣＧＧＴＴＧＴＧＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡ
ＡＣＡＣＴＧＣ−３’（配列番号１２）および５’−ＧＧＧＧＧＧＣＴＧＣＡＧ
ＴＣＡＴＧＡＴＡＡＴＴＴＣＴＣＣＡＡＣ−３’（配列番号１３）を使用して増
幅した。フラグメントをＡｇｅＩおよびＰｓｔＩで消化し、次いで、ｐＭＥＢ９
のＡｇｅＩおよびＰｓｔＩ部位にクローン化した。得られるプラスミドｐＥＡ（
Ｃ）は、Ｓｓｐ ＤｎａＥインテインＣ−末端フラグメントおよびＡＬＳＩＩＣ
−末端フラグメント（ＡＬＳＩＩｍ（Ｃ）−ＩＮｃ）から構成される融合タンパ
ク質を発現する。ＡＬＳＩＩｍ（Ｃ）−ＩＮｃ融合遺伝子を含有する１ｋｂのＸ
ｂａＩ−ＰｓｔＩフラグメントを、カナマイシン耐性発現ベクターｐＫＥＣ３を
生成するために、ｐＥＡ（Ｃ）からｐＫＥＢ１プラスミドのＸｂａＩおよびＰｓ
ｔＩ部位にサブクローン化した。
【００５８】 ｐＥＡ（Ｎ）およびｐＫＥＣ３がＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７４４において同時発
現される場合、２つの融合タンパク質のトランス−スプライシングが、連結接合
部にて存在する１４アミノ酸を伴って、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＬＳＩＩｍの２つの分
断の半片の連結を生じることが予測された。
【００５９】 ６．トランス−スプライシング活性の特徴づけ ＡＬＳＩＩ-ＤｎａＥインテイン融合タンパク質が、ＡＬＳＩＩｍ−１４を生
成するためにＥ．ｃｏｌｉ細胞においてトランス−スプライスし得る否かを決定
するために、ウェスタンブロットを、ＡＬＳＩＩのＮ−末端またはＣ-末端フラ
グメントのいずれかに特異的に対するウサギ抗血清を使用して行った。
【００６０】 ２つのウサギ抗血清を、それぞれ、ＡＬＳＩＩのＮ−末端およびＣ−末端領域
に由来するペプチドに対して起こした（ＣＯＶＡＮＣＥ）。これらの２つのペプ
チドは、１）ＡＬＳＩＩ Ｎ−末端配列（アミノ酸残基Ａｌａ４からＴｙｒ２３
）に由来するＮＨ２−ＣＡＱＷＶＶＨＡＬＲＡＱＧＶＮＴＶＦＧＹＧ−ＣＯＯＨ
（配列番号８）および２）ＡＬＳＩＩ Ｃ−末端配列（アミノ酸残基Ｖａｌ５３
０ＶからＳｅｒ５４８）に由来するＮＨ２−ＣＶＷＰＬＶＰＰＧＡＳＮＳＥＭＬ
ＥＫＬＳ−ＣＯＯＨ（配列番号９）である。単一の細菌コロニーを、１００μｇ
／ｍｌのアンピシリンを補充したＬＢ培地中で、４時間３７℃にて接種した。次
いで、これを０．３ｍＭ最終濃度へのＩＰＴＧの添加によって誘導した。細胞を
さらに、２〜１６時間１５℃にて培養した。２０μｌの細胞培養物を取り出し、
３×ＳＤＳロ-ディング緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂ
ｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）と混合し、５分間煮沸し、そして２μｌを１２％トリス−
グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）にロ-ドした。続いて
、タンパク質をニトロセルロ-ス膜にトランスファーし、そして５％粉乳で１時
間室温でブロックした（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ、（１９８９））。免疫ブロッティングを、抗血清（１：２００００希釈）
を使用して、１％粉乳の存在下、一晩４℃にて行った。次いで、ブロットを３回
それぞれ１５分間洗浄し、そして１：１００００希釈したＨＲＰ結合抗ウサギ二
次抗体とともに、１時間室温でインキュベートした。反応を、Ｃｈｅｍｉｌｕｍ
ｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いて可視化した。
【００６１】 １５℃で培養したコントロール細胞において、ＡＬＳＩＩの発現（図１１、１
２、および１３、レーン２）が、両方の抗体によって特異的に認識された。単一
のＡＬＳＩＩ−インテイン融合ベクターおよびアンピシリンおよびカナマイシン
耐性の両方を付与するための別のコントロールベクターを保有する細胞において
、ＡＬＳ（Ｎ）−ＩＮｎまたはＡＬＳ（Ｃ）−ＩＮｃタンパク質のみが、抗ＡＬ
Ｓ（Ｎ）または抗ＡＬＳ（Ｃ）血清によって検出された（図１１、レーン３、図
１２、レーン４）。ＡＬＳ（Ｎ）−ＩＮｎおよびＡＬＳ（Ｃ）−ＩＮｃが、スプ
ライス産物ＡＬＳＩＩｍ−１４について予測されるような、６０ｋＤバンドを同
時発現した場合、ＡＬＳＩＩのＮ−末端およびＣ−末端に対して惹起された抗体
と反応した（図１１及び１２、レーン５）。ＡＬＳＩＩｍ−１４のこのバンドは
、予測されるように、ネイティブなＡＬＳＩＩよりもわずかに高い分子量を示し
た。データは、トランス−スプライシングが２つのＡＬＳＩＩ−インテイン融合
タンパク質間で生じたことを示した。抗ＡＬＳ（Ｎ）と反応する非特異的なタン
パク質が観察された（図１１および図１３、レーン１〜レーン５）。
【００６２】 Ｓｓｐ ＤｎａＥインテインのトランス−スプライシング活性は温度感受性で
あることが以前に示された（Ｅｖａｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：
９０９１−９０９４（２０００））。ＡＬＳＩＩ−Ｓｓｐ ＤｎａＥインテイン
タンパク質のトランス−スプライシングの温度感受性を、ＡＬＳＩＩ Ｎ−末端
フラグメントに対する抗血清を使用するウェスタンブロット分析によって試験し
た（図１３）。細胞をＡＬＳＩＩ、またはＡＬＳＩＩｍ（Ｎ）−ＩＮｎおよびＡ
ＬＳＩＩｍ（Ｃ）−ＩＮｃの両方を発現するプラスミドによって形質転換した。
ＡＬＳＩＩタンパク質の発現を、３７℃で３時間誘導した。ＡＬＳＩＩｍ（Ｎ）
−ＩＮｎおよびＡＬＳＩＩｍ（Ｃ）−ＩＮｃの同時発現を、３７℃で３時間、３
０℃で３時間、２５℃で６時間、または１５℃で１６時間誘導した。細胞抽出物
をＳＤＳサンプル緩衝液で処理し、そして９５℃〜１００℃で５分間変性し、次
いで１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける電気泳動に供した。ウェスタンブロット
を、ＡＬＳＩＩ Ｎ−末端フラグメントに対して惹起された抗血清を使用してプ
ローブした。図１３は、以下のサンプルを含む：ＡＬＳＩＩを含有しない細胞（
レーン１、コントロール）、ＡＬＳＩＩ（レーン２）、ＡＬＳＩＩｍ（Ｎ）−Ｉ
ＮｎおよびＡＬＳＩＩｍ（Ｃ）−ＩＮｃ（レーン３〜６）。細胞培養温度は、レ
ーン１〜レーン３について３７℃、レーン４について３０℃、レーン５について
２５℃、およびレーン６について１５℃である。
【００６３】 ３７℃での細胞増殖において、ＡＬＳＩＩｍ−１４は検出可能ではなかった（
図１３、レーン３）。しかし３０℃で培養された細胞において、スプライスされ
た産物が有意な量のＮ-末端融合タンパク質蓄積を伴って観察された（図１３、
レーン４）。２５℃および１５℃で培養された細胞において（図１３、レーン５
および６）、スプライスされた産物のみが観察され、スプライスされた産物への
Ｎ−末端融合タンパク質の完全な変換を示す。ＡＬＳＩＩｍ（Ｃ）−ＩＮｃタン
パク質は、全ての発現条件下で過剰に生成された。データは、Ｓｓｐ ＤｎａＥ
インテインが、Ｎ−末端およびＣ−末端のＡＬＳＩＩｍタンパク質セグメントの
トランス−スプライシングを媒介して、ＡＬＳＩＩｍ−１４を形成し得たことを
実証した。スプライシング反応は、実験が３７℃で行われた場合に阻害された。
スプライシングは、細胞が３０℃にてよりも１５℃〜２５℃にて培養された場合
により効率的であるようであった。
【００６４】 ７．分離ＡＬＳ遺伝子を保有する細胞における除草剤耐性 次の工程は、スプライスされた産物が、ＡＬＳＩＩｍ（ＡＬＳＩＩｍ（Ｎ）−
ＩＮｎおよびＡＬＳＩＩｍ（Ｃ）−ＩＮｃ）融合タンパク質のトランス−スプラ
イシングの結果として、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７４４をバリンおよびＳＭに対し
て耐性にするか否かを決定することであった。第１の実験をバリンで飽和された
Ｍ９最小培地における細胞増殖に対するＡＬＳＩＩｍ（Ｎ）-ＩＮｎおよびＡＬ
ＳＩＩｍ（Ｃ）−ＩＮｃ融合タンパク質の同時発現の効果を試験することであっ
た。プレーティングアッセイ（第４節を参照のこと）において、全ての形質転換
された細胞は、バリンの不在下、Ｍ９培地上で良好に増殖した（図１４左上）。
しかし、ＡＬＳＩＩおよびその除草剤耐性変異体ＡＬＳＩＩｍのみが、バリンの
存在下、３０℃および３７℃の両方で細胞増殖を救済した（図１４右上、左下）
。有意に、ＡＬＳＩＩ（Ｎ）−ＩＮｎおよびＡＬＳＩＩ（Ｃ）−ＩＮｃの同時発
現は３０℃（図１４左下）またはより低い温度（データ示さず）で、バリンプレ
ートから細胞増殖を救済した。さらに、ＡＬＳＩＩｍまたはＡＬＳＩＩｍ（Ｎ）
−ＩＮｎおよびＡＬＳＩＩｍ（Ｃ）−ＩＮｃの発現は、さらなる除草剤阻害から
細胞を救済した（図１４右下）。さらに、野生型ＡＬＳＩＩの形質転換は、除草
剤阻害から細胞増殖を救済し得なかった（図９右下）。ＡＬＳＩＩ（Ｎ）−ＩＮ ｎ またはＡＬＳＩＩ（Ｃ）−ＩＮｃのいずれかのみを発現したコントロール細胞
は、バリンプレート上で増殖しなかった（図１４右上、左下）；インテインに融
合されなかったＡＬＳＩＩ- Ｎ-およびＣ−末端セグメントの同時発現も増殖し
なかった（図１４右上、左下）。データは、ＡＬＳＩＩｍ（Ｎ）−ＩＮｎおよび
ＡＬＳＩＩｍ（Ｃ）−ＩＮｃフラグメントの同時発現がトランス−スプライシン
グおよび機能的なＡＬＳＩＩを作製するために必要とされ、これはバリンおよび
除草剤阻害から細胞増殖を救済し得ることを示す。
【００６５】 定量的な液体培養アッセイを、プレーティングアッセイから得られた結果を検
証するために行われた。液体アッセイを以下のように行った。単一のコロニーを
、カナマイシンおよびアンピシリンが補充されたＬＢ培地を３７℃で４時間接種
するために使用した。発現を、０．３ｍＭ ＩＰＴＧによって誘導し、そして細
胞培養物を３０℃でさらに２時間移行した。次いで、２００μＬの等価なＯＤ６ ００ ８．０をスピンダウンし、Ｍ９培地で一回洗浄し、そして２００μｌ Ｍ９
培地中に再懸濁した。４０μｌを２ｍｌの適切な培養培地中にアリコ-トし、そ
してそのＯＤ６００を測定する前に、２４〜７２時間増殖した。バリンについて
の濃度は、１００μｇ/ｍｌ、およびＳＭについての濃度は５０μｇ/ｍｌである
。３０℃で、全ての形質転換された細胞は、Ｍ９最小培地において、等しく良好
に増殖した（図１５）。バリンで飽和されたＭ９培地において、野生型ＡＬＳは
細胞は増殖することを許容したが、ＳＭが添加された場合、増殖は何も観察され
なかった。しかし、ＡＬＳＩＩｍの発現、またはＡＬＳＩＩｍ（Ｎ）−ＩＮｎお
よびＡＬＳＩＩｍ（Ｃ）−ＩＮｃフラグメントの同時発現は、細胞がバリンＭ９
培地およびＳＭを含有する培地において増殖することを許容した。コントロール
実験において、ＡＬＳＩＩｍ（Ｎ）−ＩＮｎもしくはＡＬＳＩＩｍ（Ｃ）−ＩＮ ｃ フラグメント単独、またはインテインに融合されないＡＬＳＩＩｍのＮ−末端
およびＣ−末端の同時発現は、バリンを含有する培地における細胞増殖を救済し
なかった。このデータは、プレーティングアッセイからの結果と一致する。トラ
ンス−スプライシング媒介性の細胞増殖対野生型ＡＬＳＩＩ媒介性の細胞増殖に
ついての増殖動力学をさらに比較するために、経時的な研究を行った。データは
、ＡＬＳＩＩを発現する細胞が最も早い増殖速度を有し、ＡＬＳＩＩｍを発現す
る細胞がそれに続いた。ＡＬＳ（Ｎ）−ＩＮｎおよびＡＬＳ（Ｃ）−ＩＮｃを形
質転換された細胞は、ＡＬＳＩＩ野生型を発現する細胞に比較して遅い細胞増殖
を有するが、ＡＬＳＩＩｍを発現する細胞の増殖速度よりも有意に少なくなかっ
た。インテインの融合を何も伴わずに分離ＡＬＳＩＩを発現する細胞は、非常に
遅い増殖を有する。それゆえ、プレーティングおよび液体アッセイから、本発明
者らは、Ｓｓｐ ＤｎａＥがＡＬＳＩＩトランス−スプライシングを媒介し得、
これは機能的な除草剤耐性ＡＬＳＩＩｍ−１４をインビボで生じることを実証し
た。
【００６６】 まとめると、データは、２つの異なる遺伝子座から生成された、２つのＡＬＳ
−インテイン融合タンパク質が、温度依存性の様式でトランス-スプライシング
を受けて、完全長の、機能的なＡＬＳＩＩｍタンパク質を形成することを示した
。両方のＡＬＳＩＩｍ融合遺伝子フラグメントを有するＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は
、除草剤耐性表現型を示した。
【００６７】 実施例２：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるトウモロコシアセト乳酸合成酵素のトランス−
スプライシング 本実施例において、本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、タンパク質トラン
ス−スプライシングにより完全長のトウモロコシアセト乳酸合成酵素を生成する
ための方法を実証する。本発明者らは、トウモロコシＡＬＳ遺伝子およびそのＥ
．ｃｏｌｉ対応物のＡＬＳＩＩ遺伝子の配列相同性に基づいて、トウモロコシＡ
ＬＳ遺伝子における分断部位をどのように選択するのかを実証する。本発明者ら
は、分断トウモロコシＡＬＳ-インテイン融合遺伝子が同時発現された場合、２
つの融合タンパク質がトランス-スプライシングを受けて、成熟トウモロコシＡ
ＬＳタンパク質について予測される大きさのタンパク質産物を生成したことを示
す。
【００６８】 １．分断部位の選択 トウモロコシアセト乳酸合成酵素（ｃＡＬＳ）遺伝子のような、その除草剤耐
性変異体形態が植物を遺伝子改変するために利用されている（Ｂｅｒｎａｓｃｏ
ｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１７３８１−１７３８５（１９９５
））、他の除草剤耐性遺伝子のトランス−スプライシングを実証することが重要
である。任意の遺伝子内の適切な分離部位を同定するための１つの好ましい方法
は、異なる生物体からの相同な遺伝子のトランス−スプライシング活性を分析す
ることである。本発明者らは、実施例１において、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＬＳＩＩ遺
伝子が、Ｑ３２７とＣ３２８との間で分断された後、インビボでＳｓｐ Ｄｎａ
Ｅインテインのトランス−スプライシング活性によって再構築され得ることを記
載した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＬＳＩＩとトウモロコシＡＬＳとの間の配列アライン
メントを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＬＳＩＩ遺伝子の分断部位に対応するトウモロコシ
ＡＬＳ遺伝子における領域を探索するために行った。結果は、セリン３９７およ
びスレオニン３８９が、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＬＳＩＩの分断部位（グルタミン３２
７およびシステイン３２８）とアラインすることを示唆する。セリン３９７とス
レオニン３９８との間でトウモロコシＡＬＳを分断することは、星印によって示
されるように（図９）、上手なスプライシングを行い得る２つのトウモロコシＡ
ＬＳ−インテイン融合タンパク質を生じ得る。
【００６９】 ２．トウモロコシＡＬＳ遺伝子のクローニング 逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ-ＰＣＲ）を、トウモロコシＡＬＳ
ｃＤＮＡをクローン化するために行った。
【００７０】 全ＲＮＡを、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓキット（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．、Ｔｅｘａ
ｓ）を使用して、トウモロコシの葉から単離した。次いで、ＲＮＡを、逆方向プ
ライマー３−３（５’−ＡＴＣＡＧＴＡＣＡＣＡＧＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣ−３’
（配列番号１４））およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎ
ｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＬＴＩ−ＧＩＢＣＯＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を
使用する第１鎖ｃＤＮＡ合成のために使用した。次いで、第１鎖ｃＤＮＡをＰＣ
Ｒ反応における鋳型として使用する前に、ＲＮａｓｅＨ（ＬＴＩ−ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で処理した。ＰＣＲ反応を、Ｅｘｐａｎｄ
Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ系（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して行った。この反応において使用されたプラ
イマーは、逆方向プライマー３−３およびｃＡＬＳ ５−４プライマー（５’−
ＧＡＧＡＣＡＧＣＣＧＣＣＧＣＡＡＣＣＡＴ−３’（配列番号１５）であった。
【００７１】 ＰＣＲ産物のアリコートをアガロースゲルに対して電気泳動し、そして約２ｋ
ｂのバンドを観察した。このフラグメントをＴＯＰＯ２．１ベクター（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、製造業者のプロトコル）にクローン
化して、ｐＣＡＬＳ１を作製した。ｐＣＡＬＳ１の配列を、Ｍ１３正方向および
逆方向プライマーを使用して確認した。
【００７２】 ３．トウモロコシＡＬＳ−インテイン融合物の構築 トウモロコシＡＬＳ遺伝子のＮ−末端３９７アミノ酸残基をコードするＤＮＡ
を、正方向プライマー５’−ＧＧＧＣＣＣＡＴＡＴＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣ
ＧＣＣＧＣＧ−３’（配列番号１６）、逆方向プライマー５’−ＧＧＧＣＣＣＴ
ＣＧＡＧＧＣＴＴＣＣＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＧＣ−３’（配列番号１７）、およ
び鋳型ｐＣＡＬＳ１を使用するＰＣＲによって増幅した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、（１９８９））。１．２ｋｂＰＣＲ産物
をＴＯＰＯ−平滑ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ
製造業者のプロトコル）にクローン化し、ＴＯＰＯ−ｃＡＬＳ（Ｎ）を得た。
次いでＴＯＰＯ−ｃＡＬＳ（Ｎ）をＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化した。１．２
ｋｂの消化されたＤＮＡフラグメントを低融点アガロースゲルから回収し、そし
てＳｓｐ ＤｎａＥインテインのＮ−末端１２３アミノ酸をコードするＤＮＡ配
列にインフレームに融合して、ベクター（Ｎ−末端ｃＡＬＳ−インテイン融合タ
ンパク質、ｃＡＬＳ（Ｎ）−ＩＮ−ｎを発現するＭＥＢ１０−ｃＡＬＳ（Ｎ））
を得た。トウモロコシＡＬＳ遺伝子のＣ−末端２４１アミノ酸残基をコードする
ＤＮＡフラグメントを、正方向プライマー５’−ＧＧＧＣＣＡＣＣＧＧＴＡＣＡ
ＴＣＡＡＡＧＡＡＧＡＧＣＴＴＧ−３’（配列番号１８）、逆方向プライマー５
’−ＧＧＧＧＣＴＧＣＡＴＴＣＡＧＴＡＣＡＣＡＧＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣ−３’
（配列番号１９）、および鋳型ｐＣＡＬＳ４を使用してＰＣＲ増幅した。０．８
ｋｂＰＣＲ産物をＴＯＰＯ−平滑ベクター（上述のプロトコルを参照のこと）に
クローン化した、ＴＯＰＯ−ｃＡＬＳ（Ｎ）。次いで、ＴＯＰＯ−ｃＡＬＳ（Ｎ
）をＡｇｅＩおよびＰｓｔＩで消化した。７００ｂｐのＤＮＡフラグメントを低
融点アガロ-スゲルから回収し、そしてＳｓｐ ＤｎａＥインテインのＣ−末端
３６アミノ酸をコードするＤＮＡにインフレームに融合して、ベクターＭＥＢ９
−ｃＡＬＳ（Ｃ）を得た。ＭＥＢ９−ｃＡＬＳ（Ｃ）をさらにＸｂａＩおよびＰ
ｓｔＩで消化し、そして１ｋｂのフラグメントを放出した。この１ｋｂのフラグ
メントをｐＫＥＢ１ベクターにクローン化して、ｃＡＬＳ−インテインＣ−末端
融合タンパク質、ｃＡＬＳ（Ｃ）−ＩＮｃについてのカナマイシン耐性発現ベク
ターを作製した。同じ余分な７アミノ酸、ＮＨ２−ＬＥＫＦＡＥＹ-ＣＯＯＨ（
配列番号２０）およびＮＨ２−ＣＦＮＫＳＴＧ−ＣＯＯＨ（配列番号２１）はま
た、それぞれ、Ｎ−末端およびＣ−末端のｃＡＬＳ−インテイン融合タンパク質
の接合部にて存在した。
【００７３】 ４．トウモロコシＡＬＳ−インテイン融合タンパク質のトランス−スプライシ
ング 第３節において記載されたＡＬＳ−インテイン融合フラグメント、ｃＡＬＳ（
Ｎ）−ＩＮｎおよびｃＡＬＳ（Ｃ）−ＩＮｃの両方を、実施例１、第６節におい
て記載されるのと同じ条件下で、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７４４において同時発現
した。ウェスタンブロットを、トランス-スプライシング産生物を検出するため
に行った（方法、実施例１、第６節を参照のこと）。ブロット上の、６９ｋＤの
フラグメントは、野生型ｃＡＬＳの大きさに対応し（図１６、および図１７、レ
ーン２）、両方の融合タンパク質を発現した細胞において検出され、およびトウ
モロコシＡＬＳのＮ−末端およびＣ−末端配列に由来する２つのペプチドに対し
て特異的に惹起されたウサギ抗血清によって認識された（図１６および図１７、
レーン５）。トウモロコシＡＬＳのＮ−末端に対する抗血清と反応する非特異的
なタンパク質が観察された（図１６、レーン１〜レーン５）。抗体を惹起するた
めに使用されたペプチドは、（１）Ｌｙｓ６６からＡｌａ８５までの配列に対応
するＡＬＳ−Ｎペプチド、ＮＨ２−ＣＫＧＡＤＩＬＶＥＳＬＥＲＣＧＶＲＤＶＦ
Ａ−ＣＯＯＨ（配列番号２２）、および（２）Ｉｌｅ６１９からＴｙｒ６３８ま
での配列に対応するＡＬＳ−Ｃペプチド、ＮＨ２-ＣＩ ＰＳＧＧＡＦＫＤＭＩ
ＬＤＧＤＧＲＴＶＹ−ＣＯＯＨ（配列番号２３）である。完全長ｃＡＬＳ種はＮ
−末端またはＣ−末端融合タンパク質のいずれかを発現する細胞において検出さ
れなかった（図１６および図１７、レーン３およびレーン４）。このことは、分
断トウモロコシＡＬＳがまた、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＬＳＩＩのように、Ｓｓｐ Ｄ
ｎａＥインテインと融合された場合、トランス−スプライシングを行い得、完全
長のＡＬＳを生成したことを実証した。
【００７４】 まとめると、トウモロコシＡＬＳ遺伝子は、Ｓｓｐ ＤｎａＥインテインによ
って分断され、および２つの別々のプラスミドベクターにクローン化された。両
方の融合遺伝子ベクターが同じ宿主細胞に導入され、そして同時発現される場合
、２つの融合タンパク質はトランス−スプライシングを受けて、完全長ｃＡＬＳ
を生成した。機能的なアッセイが、植物においてスプライスされたトウモロコシ
ＡＬＳタンパク質の活性を決定するために必要とされるが、これは植物の除草剤
耐性または疾患耐性遺伝子を２つの不活性な遺伝子セグメントに首尾よく分離す
る可能性を生じる。これらの２つの遺伝子フラグメントは、葉緑体および核のよ
うな２つの別々の細胞区分、または染色体上の２つの別々の遺伝子座、または２
つの別々のＤＮＡベクターに拘束され得る。遺伝子発現のこの新規なモデルは、
完全な活性な導入遺伝子が他の種に伝播する機会を非常に減少し得る。
【００７５】 実施例３ 本実施例は、ａｒｏＡ遺伝子を分離し、およびインテインを使用して所望され
るタンパク質活性を生成する可能性を詳述する。実験は、種々の位置での変異体
ａｒｏＡ遺伝子をコードする遺伝子を分割すること、およびＳｓｐ ＤｎａＥイ
ンテイン（ＩＮｎ）のＮ−末端スプライシングドメインをコードする遺伝子を、
ＥＰＳＰＳタンパク質のＮ−末端フラグメントをコードする遺伝子に融合するこ
とからなった。従って、Ｓｓｐ ＤｎａＥインテイン（ＩＮｃ）のＣ−末端スプ
ライシングドメインをコードする遺伝子は、ＥＰＳＰＳタンパク質のＣ−末端フ
ラグメントをコードする遺伝子に融合された。融合遺伝子が２つの別々のプラス
ミド上に配置され、および同じ細菌細胞において同時形質転換されおよび同時発
現された場合、これらの細菌細胞が除草剤グリフォセートに対して耐性であった
ことが実証された。
【００７６】 グリフォセートに対する抵抗性を付与するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ
ｍｕｒｉｕｍ ａｒｏＡ遺伝子のクローニング １．プラスミドｐＥＰＳ番号１の作製 Ｃ３０１からＴへの変異を伴うＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ
ｍ ａｒｏＡ遺伝子を、アメリカンタイプカルチャーセンターから細菌Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ ｓｕｂｓｐ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕ
ｉｓ（ＡＴＣＣ番号３９２５６）におけるコスミドの形態で獲得した。改変され
たａｒｏＡ遺伝子を、プライマーＥＰＳＰ番号１（５’−ＧＧＡＴＣＣＴＡＡＧ
ＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＣＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＴＧＡＣＧＴＴＡＣＡ−３
’（配列番号２４）およびＥＰＳＰ番号２（５’−ＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＴＣＣ
ＴＧＣＡＧＴＴＡＧＧＣＡＧＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＣ−３’（配列番号２５）
を使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、コスミドから増幅した。ＰＣＲ産物
をプラスミドＬＩＴＭＵＳ２８（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉ
ｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）のＳｔｕＩ部位に挿入した。形質転換およびプ
ラスミド調製後、配列決定は、予期されない変異（Ｃ１０３からＧ）を示し、こ
れはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）のＱｕｉｃｋ Ｃｈａｎ
ｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｒｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ、およ
びプライマーＥＰＳＰ番号１０（５’−ＧＣＴＴＴＧＣＴＣＣＴＧＧＣＧＧＣＴ
ＴＴＡＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＡＡＡＣＣＧＣ−３’（配列番号２６））およびＥ
ＰＳＰ番号１１（５’−ＧＣＧＧＴＴＴＴＡＣＣＡＣＡＡＧＧＴＡＡＡＧＣＣＧ
ＣＣＡＧＧＡＧＣＡＡＡＧＣ−３’（配列番号２７））を使用して復帰された。
得られるコロニーからのＤＮＡ配列決定は、予期されない変異が予期されるＣに
復帰されたことを示した。このプラスミドを、ｐＥＰＳ番号８と称し、およびそ
の後の転移リンカースキャニング反応における受容体プラスミドとして使用した
。
【００７７】 ２．ＥＲ２７９９、ａｒｏＡ遺伝子構築物を試験するために使用されたＥ．ｃ
ｏｌｉの記載 その染色体から欠失されたａｒｏＡ遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉ株を、Ｙａｌ
ｅ Ｅ．ｃｏｌｉストックセンター（Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＢ２８２９、ＣＧＳＣ番
号２８２９、ＩＤ番号８２１５）から獲得した。この株はｈｓｄＲ-にされ、そ
してＥＲ２７９９と命名された。ＥＲ２７９９は芳香族アミノ酸合成に必要であ
るａｒｏＡ遺伝子を欠損するので、これはＭ９最小培地において増殖しない。こ
の株は、新規なａｒｏＡ遺伝子が細菌を救済し得、およびグリフォセートの存在
下または不在下のいずれかで最小培地における増殖を許容し得るか否かを観察す
るために、種々のａｒｏＡ遺伝子構築物を試験するために使用される。
【００７８】 ３．トランスポゾンベースのリンカースキャニングによってａｒｏＡ標的遺伝
子を分断するための部位を見出すこと この実験を行うにおける第１の工程は、インテインのシスでの挿入を許容し得
る５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）タンパク
質における部位を決定することであった。シスでは、完全なインテインが完全な
ＥＰＳＰＳタンパク質に挿入されたという事実をいう。しかし、ＥＰＳＰＳタン
パク質自身のどの部分が余分なアミノ酸残基に対して寛容であるのかは知られて
いなかった。従って、ＥＰＳＰＳタンパク質がアミノ酸挿入を寛容し得る場所を
決定するために、新規な技術、ＧＰＳ（登録商標）−ＬＳキット（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡから入手可能）
を、ＥＰＳＰＳタンパク質配列を通じて５アミノ酸残基をランダムに挿入するた
めに使用した。発現プラスミドライブラリーを、ランダムに挿入された５アミノ
酸を有するＥＰＳＰＳ遺伝子を用いて構築した。このライブラリーをＥ.ｃｏｌ
ｉ株 ＥＲ２７９９に形質転換し、そしてＭ９最小培地を含有するプレートに適
用した。ＥＲ２７９９は、ａｒｏＡ遺伝子を欠損し、および活性なＥＰＳＰＳ遺
伝子がプラスミド形質転換によって供給されない限り、Ｍ９最小プレート上で増
殖しない。ライブラリーでの形質転換後に増殖するＥＲ２７９９ Ｅ.ｃｏｌｉ
は５アミノ酸挿入を有し活性であるＥＰＳＰＳタンパク質を含むはずである。こ
れらを配列決定して、５アミノ酸導入の位置を決定し、そしてＭ９最小プレート
においてＥＲ２７９９の増殖を許容した４２個の独特の部位がＥＰＳＰＳタンパ
ク質中に発見された（図２３及び２４）。さらに、５アミノ酸挿入を寛容しなか
った別の１９個の独特の部位が見出された（図２５）。
【００７９】 ４.転移反応 反応を、６μｌの２０ｎｇ／μｌｐＥＰＳ番号８（標的ＤＮＡ）、１．５μｌ
の２０ｎｇ／μｌＰｍｅＩドナーＤＮＡ、３μｌの蒸留水、３μｌの１０×ＧＰ
Ｓ（登録商標）−ＬＳ緩衝液、および１．５μｌのＴｎ＊ＡＢＣを添加し、そし
て１５分間３７℃で混合することによって行った。１μｌの開始溶液を添加し、
そして反応を３７℃で１時間２０分インキュベートした。反応を、１５分間７５
℃での熱不活性化によって停止した。反応混合物を室温に冷却し、そして水に対
して２時間透析した後、反応混合物を新鮮に作製したＥＲ２６８５（ｆｈｕＡ２
ｇｌｎＶ４４ ｅｌ４−ｒｆｂＤ１？ ｒｅｌＡ１？ ｅｎｄＡ１ ｓｐｏＴ
１？ ｔｈｉ−１Δ（ｍｃｒＣ−ｍｒｒ）１１４：：ＩＳ１０Δ（ｌａｃＩ−ｌ
ａｃＡ）２００ Ｆ’ｐｒｏＡ＋Ｂ＋ｌａｃＩｑ ＤＩ（ｌａｃＺ）Ｍ１５ ｚ
ｚｆ：Ｔｎ１０（ＴｅｔＲ））細胞にエレクトロポレーションによって形質転換
した。細胞を、１時間３７℃でインキュベートし、次いでアンピシリンおよびカ
ナマイシンを含有するＬＢプレート上にプレートした。細胞増殖を３７℃で一晩
進行させた。１０μｌの反応混合物が、形質転換後に１０，０００個を上回るコ
ロニーを与えたことが発見された（全ての潜在的なトランスポゾン挿入部位、ｐ
ＥＰＳ番号８における２８４０部位をカバーするのに十分、３．３倍）。
【００８０】 ５.ＥＰＳＰＳ遺伝子＋トランスポゾンを含有するＤＮＡフラグメント（３．
０ｋｂ）の単離 転移反応からの全ての形質転換体を、ＬＢ培地を使用して回収し、そして６６
％の細胞を、２０％グリセロ-ルの添加によって−７０℃にて保存した。残りを
１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する５
００ｍｌのＬＢ液体培地中で３７℃にて一晩増殖した。細胞を遠心分離によって
採集し、そしてプラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅ
ｎ、Ｓｔｕｄｉｏ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して精製した（合計５０８μｇ）。
３．０ｋｂ ａｒｏＡ遺伝子−トランスポゾンＤＮＡフラグメントを、ＰｓｔＩ
，ＮｃｏＩ、およびＡｈｄＩでＤＮＡ（５８μｇ）を消化することによって放出
し、そしてエタノ-ル沈殿後にアガラ-ゼを使用するゲル精製によって単離した（
４μｇＤＮＡが回収された）。
【００８１】 ６．ｐＣＹＢ３ベクターにａｒｏＡ遺伝子-トランスポゾン３．０ｋｂフラグ
メントをクローニングする ゲル精製された３．０ｋｂ ａｒｏＡ遺伝子-トランスポゾンＤＮＡフラグメ
ントを、ｐＣＹＢ３のＮｃｏＩからＰｓｔＩ部位（５．２ｋｂ）にライゲーショ
ンし、そして２時間の滴下透析後エレクトロポレ-ションによってＥＲ２６８５
に形質転換した。エレクトロポレーションされた細胞をＬＢ培地中で１時間イン
キュベートした。２５０μｌのこの細胞懸濁液を、１００μｇ／ｍＬアンピシリ
ンおよび５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢプレート上にプレートし、
別の５．５ｍｌを１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬカナマイ
シンを含有する１リットルのＬＢ液体培地に接種し、そして３７℃で一晩増殖し
た。ａｒｏＡ遺伝子内にトランスポゾンを含有するプラスミドＤＮＡライブラリ
ーをＱｉａｇｅｎ（Ｓｔｕｄｉｏ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）Ｍｉｄｉキットによって単
離した（７５０μｇ）。
【００８２】 ７．５アミノ酸リンカーを有し、活性であるライブラリーＥＰＳＰＳタンパク
質をスクリ-ニングする １０５μｇのライブラリーＤＮＡをＰｍｅＩで消化して、ａｒｏＡ遺伝子から
トランスポゾンを除去した。これは、トランスポゾン挿入部位で１５塩基（また
は５アミノ酸残基）を残す。７ｋｂフラグメントを回収し（４００μｌ ＥＢの
最終容量において）、自己ライゲーションし（１００μｌ ｒｘｎ中の、４００
μｌのうちの８６μｌの７ｋｂフラグメント）、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＥＲ２７９９に
形質転換し（１００ｒｘｎのうちの３０μｌ）、そしてそれぞれ０．３ｍＭ Ｉ
ＰＴＧの存在下で１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有する、ＬＢおよびＭ９最
小プレートの両方にプレートした。３７℃で一晩のインキュベーション後、約２
０％の元来の細胞がＬＢプレートに比較してＭ９最小プレート上で生存した。Ｍ
９最小培地プレート上で増殖した個々のコロニーを、ＤｒａＩ消化およびＤＮＡ
配列決定によって分析して、ａｒｏＡ遺伝子へのリンカーの挿入部位の位置を確
認した。
【００８３】 ａｒｏＡ遺伝子に挿入される５アミノ酸残基を寛容し得る７２個の活性な個々
のクローン間で４２個の異なる挿入部位が同定され、およびＭ９最小培地選択プ
レート上で増殖し得ない３９個の不活性なクローンの間で１９個の異なる挿入部
位が同定された（図２３、２４および図２５を参照のこと）。プラスミドｐＣＥ
−５−２２、ｐＣＥ−５−２１、ｐＣＥ−５−３５、およびｐＣＥ−５−２３は
、それぞれ、１８２位、２１５位、２３５位、および２６７位にてＥＰＳＰＳタ
ンパク質（ａｒｏＡ遺伝子産物）に組み込まれた５アミノ酸残基を有する活性な
クローンであった。これらの４つの部位をさらなる研究のために選択した。
【００８４】 Ｓｓｐ ＤｎａＥシス−およびトランス−スプライシングベクターの構築 １．シス-スプライシングについてのベクターｐＣＥ１８２ＤｎａＥ、ｐＣＥ
２１５ＤｎａＥ、ｐＣＥ２３５ＤｎａＥ、およびｐＣＥ２６７ＤｎａＥの構築 これは、５アミノ酸の挿入を寛容することが発見された標的タンパク質におけ
る部位にインテインを挿入することを包含する。
【００８５】 ４つの部位をさらなる研究のために選択した（１８２位、２１５位、２３５位
、および２６７位）。完全長Ｓｓｐ ＤｎａＥインテインをこれらの部位に挿入
し、そしてＥＰＳＰＳ−インテイン融合物をＥＲ２７９９細胞がＭ９最小プレー
ト上で増殖することを許容するその能力について試験した。全ての４つの部位は
、Ｍ９プレート上で増殖することが見出され、ＥＰＳＰＳタンパク質がこれらの
位置で挿入されたインテインを寛容し得たことを示した（図１８および図２２を
参照のこと）。
【００８６】 ＣＥ１８２またはＣＥ２１５は、１８２または２１５にて５アミノ酸リンカー
が除去されたという例外を伴うｐＣＥ−５−２２またはｐＣＥ−５−２１の線形
ＤＮＡであり、ＣＥ１８２についてプライマー５’−ＧＣＣＣＣＴＡＡＡＧＡＣ
ＡＣＡＡＴＴＡＴＴＣＧＣＧ−３’（配列番号２８）および５’−ＣＡＧＣＧＧ
ＣＧＣＣＧＴＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧ−３’（配列番号２９）、またはＣＥ
２１５についてプライマー５’−ＧＣＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＡＣＡＡ
ＴＴＴＧ−３’（配列番号３０）および５’−ＴＡＴＣＴＣＣＡＣＧＣＣＡＡＡ
ＧＧＴＴＴＴＣＡＴＴ−３’（配列番号３１）を使用して、鋳型ｐＣＥ−５−２
２またはｐＣＥ−５−２１からポリメラ-ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作製し
た。２つのネイティブなＮ−イクステイン残基および３つのネイティブなＣ−イ
クステイン残基を含有するＳｓｐ ＤｎａＥインテイン遺伝子を、プライマー５
’−ＧＡＡＴＡＴＴＧＣＣＴＧＴＣＴＴＴＴＧＧＴ−３’（配列番号３２）およ
び５’−ＧＴＴＡＡＡＧＣＡＧＴＴＡＧＣＡＧＣＧＡＴ−３’（配列番号３３）
を使用して、ｐＭＥＢ８（Ｅｖａｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５：
９０９１（２０００））からＰＣＲによって増幅した。得られるＰＣＲフラグメ
ントをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋカラム（
Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｓｔｕｄｉｏ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって精製し、そ
してＣＥ１８２またはＣＥ２１５にライゲーションして、ｐＣＥ１８２ＤｎａＥ
またはｐＣＥ２１５ＤｎａＥをそれぞれ作製した。
【００８７】 ４つのネイティブなＮ−イクステイン残基および３つのネイティブなＣ−イク
ステイン残基を含有するＳｓｐ ＤｎａＥインテイン遺伝子を、プライマー５’
−ＴＧＣＴＧＡＡＴＡＴＴＧＣＣＴＧＴＣＴＴＴＴＧＧ−３’（配列番号３４）
および５’−ＣＣＧＴＴＡＡＡＧＣＡＧＴＴＡＧＣＡＧＣＧＡＴＡＧＣ−３’（
配列番号３５）を使用して、ｐＭＥＢ８からＰＣＲによって増幅した。得られる
ＰＣＲフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｓｔ
ｕｄｉｏ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって精製し、そしてゲル精製し、ＰｍｅＩ切断
したｐＣＥ−５−３５またはｐＣＥ−５−２３ベクターＤＮＡにライゲーション
してｐＣＥ２３５ＤｎａＥまたはｐＣＥ２６７ＤｎａＥをそれぞれ作製した。
【００８８】 ２．トランス−スプライシングについてのベクターｐ２１５ＥＮ２／ｐＥＰＳ
番号２８およびｐ２３５ＥＮ２／ｐＥＰＳ番号２９の作製 ２つのプラスミドを、適格性複製起点を伴って構築した。適切なＥＰＳＰＳタ
ンパク質のＮ−末端をＮ−末端Ｓｓｐ ＤｎａＥスプライシングドメイン（ＩＮ ｎ ）のＮ−末端に融合し、そして一方のプラスミドに挿入した。残りの適切なＥ
ＰＳＰＳタンパク質のＣ−末端部分を、Ｓｓｐ ＤｎａＥインテインのＣ−末端
スプライシングドメイン（ＩＮｃ）のＣ-末端に融合した。この融合物を、第２
のプラスミドに挿入した。プラスミドを、エレクトロポレ-ションによってＥＲ
２７９９に同時トランスフェクトした。融合タンパク質の発現は、ＩＰＴＧ誘導
性のｐＴａｃプロモーターの制御下にあった。形質転換された細胞は、Ｍ９最小
培地、液体Ｍ９最小培地、またはグリフォセートが補充された液体Ｍ９最小培地
上で増殖した（図１８、１９、２０、２１および２２を参照のこと）。これはタ
ンパク質の半片が同じ細胞において同時発現された場合、活性なＥＰＳＰＳタン
パク質を作製し得たことを示した。
【００８９】 ｐＭＥＢ４の０．６キロベースのＸｈｏＩからＰａｔＩフラグメントを、ＱＩ
Ａｑｕｉｃｋ抽出キットを使用してゲル精製し、そしてｐＣＹＢ３（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）ベクターに
おいてＸｈｏＩからＰｓｔＩ部位にライゲーションして、ｐＣＥＮ1を作製した
。Ｓｓｐ ＤｎａＥインテインとキチン結合ドメイン（ＣＢＤ）との間のＮｃｏ
Ｉ部位を、ｐＣＥＮ２のＰａｃＩおよびＳａｐＩ消化によって除去し、続いてＴ
４ ＤＮＡポリメラ-ゼ処理し、そして自己ライゲーションしてプラスミドｐＣ
ＥＮ２を作製した。このベクターは、ｐＴａｃプロモーターの制御下でＳｓｐ
ＤｎａＥインテインのＮ-末端の１２３アミノ酸残基（ＩＮｎ）を含み、アンピ
シリンに対する耐性を付与する。
【００９０】 ｐ２１５ＥＮ２またはｐ２３５ＥＮ２を、ｐＣＥ２１５ＤｎａＥまたはｐＣＥ
２３５ＤｎａＥのＮｃｏＩからＫｐｎＩフラグメントを、ｐＣＥＮ２の同じ部位
にライゲーションすることによって構築した。ｐ２１５ＥＮ２またはｐ２３５Ｅ
Ｎ２は、ＩＮｎに融合されるＥＰＳＰＳのＮ−末端を有する（ｐ２１５ＥＮ２に
ついて残基１〜２１５、ｐ２３５について残基１〜２３５）。
【００９１】 ｐＣＹＢ３のＮｃｏＩからＦｓｐＩフラグメントを、ｐＫＥＢ１のＮｃｏＩか
らＤｒａＩ部位にライゲーションしてｐＫＥＢ１２（ＮＥＢ番号１２８２）を作
製した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＥＲ２５６６において形質転換されたｐＫＥＢ１２プラ
スミドのサンプルは、２０００年５月２３日、ブタペスト条約の期間および条件
の下にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴ
ＣＣ特許アクセス番号ＰＴＡ−１８９８を受けた。このベクターは、ＣＢＤに融
合されたＳｓｐ ＤｎａＥインテイン（ＩＮｎ）のＣ−末端３６アミノ酸残基を
有し、およびカナマイシンに対する耐性を付与する。
【００９２】 ｐＥＰＳ番号２８およびｐＥＰＳ番号２９を、ｐＣＥ２１５ＤｎａＥおよびｐ
ＣＥ２３５ＤｎａＥのＢｇｌＩＩからＰｓｔＩフラグメントを、ｐＫＥＢ１２の
同じ部位にライゲーションすることによって構築した。ｐＥＰＳ番号２８および
ｐＥＰＳ番号２９は、ＥＰＳＰＳのＣ-末端を有し（ｐＥＰＳ番号２８について
残基２１６〜４２７、ｐＥＰＳ番号２９について２３６〜４２７）、ｐＫＥＢ１
２におけるＣＢＤを置き換え、およびＩＮｃのＣ-末端に付着される。
【００９３】 ３．ＥＰＳＰＳ相補性構築物ｐＥＰＳ番号３４およびｐＥＰＳ番号３６の作製 ＥＰＳＰＳタンパク質フラグメントは、インテインドメインを欠損し、ＥＲ２
７９９細胞において同時発現される場合、細胞はＭ９最小プレート、液体Ｍ９最
小培地、またはグリフォセートが補充された液体Ｍ９最小培地上で増殖できなか
った（図１９、２０および２１）。このことはＥＰＳＰＳ活性がインテインの半
片の両方の存在に絶対的に依存したことを示した。
【００９４】 ＥＰＳＰＳタンパク質のＮ−末端、１から２３５残基（ＥＰＳ２３５Ｎ）をコ
ードするＤＮＡを、プライマー５’−ＧＧＡＴＣＣＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡ
ＴＡＣＣＣＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＴＧＡＣＧＴＴＡＣＡ−３’（配列番号３６）
および５’−ＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＧＴＴＡＡＣＣＴＧＧＡＧＡＧＴＧＡＴＡ
ＣＴＧＴＴＧＡＣＣ−３’（配列番号３７）を使用して、ｐＣＥ２３５ＤｎａＥ
からＰＣＲによって増幅した。得られたＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣ
Ｒキットを使用して精製し、ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩで消化し、ＱＩＡｑｕｉｃ
ｋ抽出キットを使用してアガロ-スゲルから精製し、そしてプラスミドｐＣＹＢ
３のＮｃｏＩからＰｓｔＩ部位にライゲーションして、ｐＥＰＳ番号３４を作製
した。
【００９５】 プラスミドｐＥＰＳ番号３６を、プライマー５’−ＧＡＴＡＴＣＣＣＡＴＧＧ
ＧＡＣＧＣＴＡＴＣＴＧＧＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧ−３’（配列番号３８）お
よび５’−ＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＧＣＡＧＧＣＧＴＡ
ＣＴＣＡＴＴＣ−３’（配列番号３９）を使用して、ｐＣ+Ｅ２からＰＣＲによ
って、ＥＰＳＰＳのＣ−末端、２３６〜４２７残基（ＥＰＳ２３５Ｃ）をコード
するＤＮＡを増幅することによって作製した。得られたＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕ
ｉｃｋ ＰＣＲキットを使用して精製し、ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩで消化し、ア
ガロ-スゲルから精製し、そしてプラスミドｐＫＥＢ１２のＮｃｏＩからＰｓｔ
Ｉ部位にライゲーションした。余分な残基Ｍｅｔ−Ｇｌｙをまた、クローニング
のためのＮｃｏＩ部位に起因してＥＰＳ２３５ＣのＮ−末端に組み込んだ。
【００９６】 ４．シスまたはトランス「ｄｅａｄ」Ｓｓｐ ＤｎａＥインテインを２３５位
にて含有するベクターの作製（ｐＥＰＳ番号３１、ｐＥＰＳ番号３３、ｐＥＰＳ
番号３７）。 興味深いことに、Ｓｓｐ ＤｎａＥインテインの最も高度に保存された触媒残
基のうちの３つがアラニンに変化された場合、同時形質転換されたＥＲ２７９９
細胞はなお増殖したので、トランス-スプライシングは活性には必要とされなか
った。この事象は、インテインが２つのＥＰＳＰＳインテインフラグメントをと
もにもたらすための親和性ドメインとして作用し得ることを実証する（図１２お
よび図１３）。
【００９７】 ４つのネイティブなＮ-イクステイン残基および３つのネイティブなＣ−イク
ステイン残基を含有するＳｓｐ ＤｎａＥインテイン遺伝子を、プライマー５’
−ＴＧＣＴＧＡＡＴＡＴＧＣＧＣＴＧＴＣＴＴＴＴＧＧＴＡＣＣＧＡＡ−３’（
配列番号４０）および５’−ＣＣＧＴＴＡＡＡＣＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＴ
ＡＧＣＧＣＣ−３’（配列番号４１）を使用して、ｐＭＥＢ８からＰＣＲによっ
て増幅した。得られたＰＣＲフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａ
ｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｓｔｕｄｉｏ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって精製し、そしてプ
ラスミドｐＣＥ−５−３５のＰｍｅＩ部位にライゲーションして、ｐＥＰＳ番号
３１を作製した。このＳｓｐ ＤｎａＥインテインは、そのスプライシング活性
を排除する触媒残基において、３つの変異、Ｃｙｓ１→Ａｌａ／Ｃｙｓ+１→Ａ
ｌａ／Ａｓｎ１５９→Ａｌａを含む。
【００９８】 ５．ＥＰＳＰＳ活性をアッセイするための方法 ＥＰＳＰＳ活性についてのプレーティングアッセイ。機能的なＥＰＳＰＳタン
パク質の存在は、内因的に活性なＥＰＳＰＳを欠損するＥ．ｃｏｌｉ株ＥＲ２７
９９（上述を参照のこと）を使用してインビボで決定され得た。ＥＲ２７９９細
胞単独は、Ｍ９最小プレート（０．３ｍＭ ＩＰＴＧが補充された）上で増殖で
きない。以下の記載において、Ｍ９最小プレートが言及される場合、これらはま
た０．３ｍＭ ＩＰＴＧを含む。プラスミドｐＣ＋Ｅ２は、Ｃ３０１からＴへの
変異を有する完全長野生型ＥＰＳＰＳ遺伝子を含み、形質転換によって導入され
る場合、Ｍ９最小プレートにおけるＥＲ２７９９の増殖を救済し得る。
【００９９】 Ｓｓｐ ＤｎａＥシス-スプライシング構築物をアッセイする。プラスミドｐ
ＣＥ１８２ＤｎａＥ、ｐＣＥ２１５ＤｎａＥ、ｐＣＥ２３５ＤｎａＥ、ｐＣＥ２
６７ＤｎａＥ（それぞれ０．０５μｇ）を、エレクトロポレ-ション（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））によってＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７９９細胞に形
質転換した、図１１を参照のこと。０．８ｍＬのＬＢ培地を形質転換した細胞に
添加し、そしてこれらを３７℃で１時間振盪しながらインキュベートした。２０
０μＬのこの溶液を、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを補充したＬＢまたはＭ９
最小プレート（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））のいずれか上にプレー
トした。プレートを種々の長さの時間、種々の温度にてインキュベートした。最
も一般的に使用されたのは一晩３７℃であった。
【０１００】 Ｓｓｐ ＤｎａＥトランス−スプライシング構築物をアッセイする。各ＥＰＳ
ＰＳトランス構築物の活性を、試験される構築物をＥＲ２７９９に同時形質転換
し、そして両方が０．１ｍｇ/ｍＬアンピシリンおよび０．０５ｍｇ/ｍＬカナマ
イシンが補充された、０．３ｍＭ ＩＰＴＧを含有するＭ９最小プレートまたは
ＬＢプレートのいずれか上にプレートすることによって、アッセイした。１つの
プラスミドのみがＥＰＳＰＳ遺伝子またはＥＰＳＰＳ遺伝子の一部分を含んだ場
合において、相補的な抗生物質耐性は、これを、ＥＰＳＰＳ遺伝子が存在しない
ｐＣＹＢ３またはｐＫＹＢ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅ
ｖｅｒｌｙ、ＭＡ）のいずれかとともにＥ．ｃｏｌｉを同時形質転換することに
よって供給された。
【０１０１】 使用したプラスミドは以下のようであった：ｐＣ+Ｅ２、ｐ２１５ＥＮ２、ｐ
２３５ＥＮ２、ｐＥＰＳ番号２８、ｐＥＰＳ番号２９、ｐＥＰＳ番号３３、ｐＥ
ＰＳ番号３７、ｐＥＰＳ番号３４、およびｐＥＰＳ番号３６。これらのプラスミ
ドを０．１μｇの適切なプラスミドを、種々の組み合わせにおいて使用して、Ｅ
Ｒ２９７７Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に同時形質転換し（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２
版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ：Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１
９８９））、そしてそれぞれ１００μｇ/ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ/ｍＬ
カナマイシンを含有する、ＬＢプレートおよびＭ９最小培地プレートの両方にプ
レートした。Ｍ９最小培地はまた、０．３ｍＭ ＩＰＴＧを含んだ。そして３７
℃で一晩、または室温で２〜３日間のインキュベーション後、個々のクローンを
各ＬＢプレートからつつき、Ｍ９最小培地選択プレート上にストリップした。使
用した組み合わせは以下のようであった：ＷＴ、ｐＣ+Ｅ２およびｐＫＹＢ１（
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）；２１５Ｎ
Ｃ、ｐ２１５ＥＮ２およびｐＥＰＳ番号２８；２１５Ｃ、ｐＥＰＳ番号２８およ
びｐＣＹＢ３；２３５ＮＣ−Ｄｅａｄ、ｐＥＰＳ番号３３およびｐＥＰＳ番号３
７；２３５ＮＣ、ｐ２３５ＥＮ２およびｐＥＰＳ番号２９；２３５Ｎ、ｐ２３５
ＥＮ２およびｐＫＹＢ１；２３５Ｃ、ｐＥＰＳ番号２９およびｐＣＹＢ３；２３
５Ｎ-２１５ｃ、ｐ２３５ＥＮ２およびｐＥＰＳ番号２８；ならびに２３５相補
物、ｐＥＰＳ番号３４およびｐＥＰＳ番号３６（図１９を参照のこと）。
【０１０２】 グリフォセートの存在下または不在下での液体培養におけるＥＲ２７９９増殖
の決定。２３５トランス構築物についてのグリフォセート耐性の試験を、以下の
ようなプラスミドの組み合わせを使用して行った：ＷＴ、ｐＣ＋Ｅ２およびｐＫ
ＹＢ１；２３５ＮＣ−Ｄｅａｄ、ｐＥＰＳ番号３３およびｐＥＰＳ番号３７；２
３５ＮＣ、ｐ２３５ＥＮ２およびｐＥＰＳ番号２９；２３５Ｎ、ｐ２３５ＥＮ２
およびｐＫＹＢ１；２３５Ｃ、ｐＥＰＳ番号２９およびｐＣＹＢ３；ならびに２
３５相補物、ｐＥＰＳ番号３４、ｐＥＰＳ番号３６。これらのプラスミドを上記
のようにＥＲ２７９９ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に同時形質転換し、そして１００μｇ
/ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ/ｍＬカナマイシンを含有するＬＢプレート上
にプレートした。コントロールとして、ｐＣＹＢ３/ｐＫＹＢを、Ｅ．ｃｏｌｉ
株ＥＲ２７４４に同時形質転換し、そして１００μｇ/ｍＬアンピシリンおよび
５０μｇ/ｍＬカナマイシンを含有するＬＢプレート上にプレートした。前培養
物を、新鮮なコロニーを１００μｇ/ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ/ｍＬカナ
マイシンを含有するＬＢ培地に３０℃で一晩接種することによってそれぞれの形
質転換について調製した。等量の前培養物（細胞密度に依存して１０〜１１μＬ
）を、異なる量のグリフォセートの存在下または不在下で新鮮に作製した１００
μｇ/ｍｌアンピシリン、５０μｇ/ｍｌカナマイシン、および０．３ｍＭ ＩＰ
ＴＧを含有するＭ９最小培地に接種した。各構築物の増殖を、６００ｎｍでのＯ
Ｄによって測定した、図２０及び２１を参照のこと。
【０１０３】 Ｍ９液体最小培地におけるシス２３５構築物の増殖。一方はスプライシング適
格性Ｓｓｐ ＤｎａＥインテインを含有し（２３５シス）、他方は、それぞれ、
スプライシング不適格性インテイン（２３５ｄｅａｄ）、ｐＣＥ２３５ＤｎａＥ
、およびｐＥＰＳ番号３１を含有する２つのプラスミドベクターを、別々のＥＲ
２７９９ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換し、そして、１００μｇ/ｍｌアンピシ
リンおよび５０μｇ/ｍＬカナマイシンを補充したＬＢプレート上にプレートし
た。前培養物を、新鮮なコロニーを１００μｇ/ｍｌアンピシリンおよび５０μ
ｇ/ｍＬカナマイシンを補充したＬＢ培地に３０℃で一晩接種することによって
それぞれの形質転換について調製した。等量の前培養物（細胞密度に依存して１
０〜１１μＬ）を、１００μｇ/ｍｌのアンピシリン、５０μｇ/ｍｌのカナマイ
シン、および０．３ｍＭ ＩＰＴＧを含有する新鮮に作製したＭ９最小培地に接
種した。細胞密度を、６００ｎｍでのＯＤを使用して種々の時間にて決定した（
図１４を参照のこと）。
【０１０４】 ｐＥＰＳ番号３１のＮｃｏＩからＫｐｎＩフラグメントをプラスミドｐＣＥＮ
２の同じ部位にライゲーションしてｐＥＰＳ番号３３を作製した。プラスミドｐ
ＥＰＳ番号３７を、ｐＥＰＳ番号３１のＢｇｌＩＩからＰｓｔＩフラグメントを
、プラスミドｐＫＥＢ１２における同じ部位にクローニングすることによって作
製した。
【０１０５】 実施例４：Ｅ．ｃｏｌｉにおいて機能的なハイブリッドタンパク質を生じるため
の、２つの未関連の遺伝子産物の、アミノグリコシド−３−アセチルトランスフ
エラーゼ（ａａｄＡ）および可溶性の改変された緑色蛍光タンパク質（ｓｍＧＦ
Ｐ）のトランス−スプライシング。 アミノグリコシド−３−アセチルトランスフエラーゼ遺伝子をＳｓｐ Ｄｎａ
ＥインテインＮ−フラグメント（ＩＮｎ）に融合した。Ｓｓｐ ＤｎａＥインテ
インのＣ−フラグメント（ＩＮｃ）をｓｍＧＦＰ遺伝子に融合した。融合タンパ
ク質は、それぞれの構築物からの個々のポリペプチドとして翻訳され得た。ＤＮ
Ａ配列をコードするこれらの融合タンパク質を、ｐＩＨ９７６（図２６）または
ｐＡＧＲ３（図２７）プラスミドのいずれかにクローン化した。両方のプラスミ
ド（ｐＩＨａａｄＥ−Ｎ（ｐＩＨ９７６はａａｄＡおよびＩＮｎ末端を含有する
）およびｐＡＧＲＥ−ＣｓｍＧＦＰ（ｐＡＧＲ３はＩＮｃおよびｓｍＧＦＰを含
有する））を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて同時形質転換した（図２８）。形質転換さ
れたＥｃｏｌｉは、スペクチノマイシン／ストレプトマシン硫酸に対して耐性で
あった（図２９）。細胞抽出物を増殖の１６時間後に作製した。抽出物中のタン
パク質をＳＤＳトリスグリシンゲル上で分離し、そしてＰＶＤＦメンブレン上に
ブロットした。このメンブレンを抗ＧＦＰモノクロ-ナル抗体でプローブした。
トランス−スプライシングが、Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物において観察され、ここでは
両方のプラスミドが導入された。トランス−スプライシングの結果として、融合
産物は両方のタンパク質の算定される累積的な質量と同一な分子量を有した（図
３０）。
【０１０６】 以下のプロトコルは、カセットの、ｐＩＨａａｄＥ−Ｎ（アミノグリコシド−
３−アセチルトランスフエラーゼ遺伝子がＩＮｎをコードするＤＮＡに融合され
る）、ｐＡＧＲＥ−ＣｓｍＧＦＰ（ＩＮｃをコードするＤＮＡがｓｍＧＦＰ遺伝
子に融合される）の生成、ウェスタンブロッティング、および検出を記載する。
【０１０７】 ポリメラ-ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、所望されるプラスミドへのオープンリー
ディングフレーム（ＯＲＦ）をクローニングするために使用した。反応は、２単
位のＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラ-ゼとともに５０μｌの全容量中に２
ｍＭ硫酸マグネシウム、２００μＭ ｄＮＴＰ、１μＭの各プライマー、および
１００ｎｇプラスミドＤＮＡが補充されたＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラ
ーゼ緩衝液を含んだ。１０〜２０回の間の増幅を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ遺
伝子増幅ＰＣＲ２４００系（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を使用して行った。
以下のプライマーをａａｄＡ遺伝子の増幅のために使用した（ａａｄＡ正方向プ
ライマー：ＧＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＡＧＧＧＡＡＧＣＧＧＴＧＡＴＣ
ＧＣＣＧ（配列番号４７）、ａａｄＡ逆方向プライマーＴＧＣＧＧＴＣＧＡＣＴ
ＴＴＧＣＣＧＡＣＴＡＣＣＴＴＧＧＴＧＡＴＣＴＣ（配列番号４８）。ＰＣＲ産
物をＱｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）からのＰＣＲ精製キット（ＱＩＡ
ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製）を使用して精製した。精製したＰＣＲ産物を、Ｐａｃ
ＩおよびＳａｌＩ制限酵素によって消化し、そしてｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）プラスミド
にクローン化した。ａａｄＡ遺伝子を含有するクローンをｐＮＥＢａａｄ３と命
名した。類似のプロトコルを、特異的なプライマー（ｓｍＧＦＰ正方向プライマ
ー：ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＣＣＡＴＧＡＧＴＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣ
ＴＴＴＴＣＡＣ（配列番号４９）およびｓｍＧＦＰ逆方向プライマー：ＧＣＧＡ
ＣＣＧＧＴＴＴＡＴＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＧ（配列番
号５０）を使用して、ｓｍＧＦＰ遺伝子の増幅およびｐＬＩＴＭＵＳ２８（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）への
クローニングのために使用した。ｓｍＧＦＰ遺伝子を含有するクローンをｐｓｍ
ＧＦＰ７と命名した。ａａｄＡおよびｓｍＧＦＰ遺伝子の両方についての配列を
、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１０８】 Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ種ＰＣＣ６８０３のｄｎａＥ遺伝子からのインテ
インをＰＣＲ増幅した。インテインのアミノ末端部分（アミノ酸１〜１２３）を
ＩＮｎと、およびカルボキシ末端をＩＮｃ（アミノ酸１２４〜１５９）という。
ＩＮｎおよびＩＮｃフラグメントの両方を、それぞれ、ｐＬＩＴＭＵＳ２８およ
びｐＮＥＢ１９３にクローン化した。ＩＮｎおよびＩＮｃの増幅のためのプライ
マー対が列挙される（ＩＮｎ正方向プライマー：ＡＧＧＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡ
ＣＡＡＡＴＴＴＧＣＴＧＡＡＴＡＴＴＧＣＣＴＧＴＣＴ（配列番号５１）、ＩＮ ｎ 逆方向プライマー：ＧＧＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＡＡＴＴＧＴＣＣＣＡＧ
ＣＧＴＣＡＡＧＴＡＡＴＧ（配列番号５２）、ＩＮｃ正方向プライマー：ＡＧＣ
ＴＴＴＧＴＴＴＡＡＡＣＣＡＴＧＧＴＴＡＡＡＧＴＴＡＴＣＧＧＴＣＧＴＡＧＡ
ＴＣ（配列番号５３）、ＩＮｃ逆方向プライマー：ＣＡＧＣＧＴＣＧＡＣＧＧＣ
ＧＣＣＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＴＴＡＡＡＧＣＡＧＴＴＡＧＣＡＧＣ（配列番号５
４））。ＩＮｎおよびＩＮｃフラグメントを含有するプラスミドは、それぞれ、
ｐＬｉｔＤｎａＥ-Ｎ１およびｐＮＥＢＤｎａＥ−Ｃ２であった。
【０１０９】 インテインフラグメントと、ａａｄＡまたはｓｍＧＦＰ遺伝子産物のいずれか
との融合構築物は、以下の方法において作製された：ｐＮＥＢａａｄ３からのＢ
ａｍＨＩおよびＳａｌＩフラグメント（８００ｂｐ）を、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ
消化されたｐＬｉｔＤｎａＥ−Ｎ１にライゲーションして、ｐＡＥＮ１を生じた
。類似の方法において、１５０ｂｐインサート（ＰｓｔＩおよびＫａｓＩで消化
されたｐＮＥＢＩＮ-ｃ）を、ＰｓｔＩおよびＫａｓＩ消化されたｐＬＩｔ ｓ
ｍＧＦＰ５にライゲーションして、ｐＧＦＰＥＣを生じた。プラスミドｐＡＥＮ
は、ＩＮｎとインフレームのａａｄＡ遺伝子を含み、およびｐＧＦＰＥＣは、Ｉ
ＮｃとインフレームのｓｍＧＦＰ遺伝子を含む。
【０１１０】 融合された遺伝子をＰＣＲ増幅し、そしてＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターにクロー
ン化した。ｐＡＥＮおよびｐＧＦＰＥＣのインサートをｐＩＨ９７６（ＮｃｏＩ
およびＳａｃＩ部位）およびｐＡＧＲ３（ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩＩ部位）ベ
クターにクローン化した。プライマーが列挙される（ａａｄＡ−ＩＮｎ正方向プ
ライマー：ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＧＧＡＡＧＣＧＧＴＧＡＴＣＧＣＣＧＡＡＧ
（配列番号５５）、ａａｄＡ−ＩＮｎ逆方向プライマー：ＡＣＧＣＧＡＧＣＴＣ
ＴＴＡＴＴＴＡＡＴＴＧＴＣＣＣＡＧＣＧＴＣＡＡＧＴＡＡＴＧ（配列番号５６
）、ＩＮｃ-ｓｍＧＦＰ正方向プライマー：ＣＧＡＡＴＴＣＴＡＴＧＧＴＴＡＡ
ＡＧＴＴＡＴＣＧＧＴＣＧＴＡＧＡＴＣ（配列番号５７）、ＩＮｃ-ｓｍＧＦＰ
逆方向プライマー：ＡＧＣＣＣＧＣＧＧＴＴＡＴＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴＣＡＴＣ
ＣＡＴＧＣＣＡＴＧ（配列番号５８））。Ｅ．ｃｏｌｉ発現プラスミドは、宿主
のＰｔａｃプロモーターの制御下の、ｐＩＨ９７６-ａａｄＥ-ＮおよびｐＡＧＲ
−Ｎｃ-ｓｍＧＦＰであった。プラスミドのいずれか、または両方をともに、Ｅ
．ｃｏｌｉ ＥＲ１９９２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ
．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に形質転換し、そしてＬＢ寒天−アンピシリンプレ
ートならびにＬＢ寒天アンピシリンおよびスペクチノマイシンプレート上にプレ
ートした。
【０１１１】 ウェスタンブロッティングについて、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞抽出物を、1ｍＭ Ｄ
ＴＴを含有するＳＤＳロ-ディング色素とともに混合し、９５℃で５分間煮沸し
、そして１０〜２０％トリス−グリシン−ＳＤＳ勾配ゲル上にロ-ドした。タン
パク質を、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎ-Ｐメンブレン上にブロットし、そして抗ＧＦＰ
モノクローナル抗体（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）でプロ-ブし、続いてＧＦＰおよびａ
ａｄＡ−ＧＦＰ融合タンパク質を化学発光検出した。
【０１１２】 実施例５：機能的なハイブリッドタンパク質を生じるための、２つの未関連の遺
伝子産物の、アミノグリコシド-３-アセチルトランスフエラーゼ（ａａｄＡ）お
よび可溶性の改変された緑色蛍光タンパク質（ｓｍＧＦＰ）のトランス−スプラ
イシングについてのＥ．ｃｏｌｉにおける植物プロモーターの利用。 上述のＤＮＡフラグメントを、葉緑体特異的プロモーターＰｐｓｂＡ（配列番
号５９）の下流にクローン化した。同じ遺伝子のターミネーター配列（Ｔｐｓｂ
Ａ（配列番号６０）を、クローン化された遺伝子の下流においた。２つの遺伝子
は、読み過ごしを回避するために反対の方向において発現された。植物プロモー
ターは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける形質転換の際に機能的であり、およびトランス-
スプライスされた産物（ａａｄＡ-ｓｍＧＦＰ融合タンパク質、５７ｋＤａ）が
、抗ＧＦＰ抗体を使用するウェスタンブロットアッセイにおいて観察された。従
って、葉緑体特異的プロモーターはＥ．ｃｏｌｉにおいて機能的であり、および
遺伝子発現研究のために使用され得た。
【０１１３】 以下のプロトコルは、インビボで導入遺伝子を相同組換えし得るＥ．ｃｏｌｉ
／植物シャトルベクター（ｐＮＣＴ１１４／ｐＮＣＴ２２４）の生成を記載する
。
【０１１４】 シャトルベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉおよび植物細胞の両方においてこれを機能
的にするエレメントからなる。プラスミドｐＬＩＴＭＵＳ２８（Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）は、ｐＮＣＴ１
１４およびｐＮＣＴ２２４遺伝子標的化ベクターについての骨格である。ベクタ
ーＤＮＡは、少なくとも（１）プラスミドゲノムに相同な２つのＤＮＡ配列（標
的化配列/フラグメントともまたいわれる）、（２）１つ以上のプロモーターエ
レメント、（３）転写終結エレメント、および（４）１つ以上の選択可能な／薬
剤耐性（致死的でない）マーカー遺伝子を含む。
【０１１５】 ＭｕｒｒａｙおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．、８：４３２１−４３２５（１９８０））によって記載されるようなＣＴＡＢ
法を用いて７日齢のタバコ芽生えから抽出したゲノムＤＮＡから、プロモーター
エレメント（ＰｐｓｂＡ）ＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅した。増幅のために使用した
プライマーが列挙される（ＰｐｓｂＡ正方向プライマー：ＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡ
ＡＴＡＧＡＴＣＴＡＣＡＴＡＣＡＣＣＴＴＧＧ（配列番号６４）、ＰｐｓｂＡ逆
方向プライマー：ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＴＡＡＡＡＴＣＴ
ＴＧＧＴＴＴＡＴＴＴＡＡＴＣ（配列番号６５））。同様に、ターミネーター配
列（ＴｐｓｂＡ）をＰＣＲによって増幅し、そしてクローン化した。増幅のため
に使用されたプライマーが列挙される（ＴｐｓｂＡ正方向プライマー：ＧＣＧＡ
ＣＣＧＧＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＣＴＡＧＴＣＴＡＴＡＧＧＡＧＧ（配列番号６６
）、ＴｐｓｂＡ逆方向プライマー：ＡＧＧＣＣＴＡＧＧＡＧＡＡＴＡＣＴＣＡＡ
ＴＣＡＴＧＡＡＴＡＡＡＴＧＣ（配列番号６７））。ｐｓｂＡプロモーターおよ
びターミネーターＤＮＡ配列を有するベクターは、タンパク質の発現のためにそ
れらの間に遺伝子がクローン化されることを許容する。標的化ＤＮＡ配列を増幅
し、そして隣接する様式においてプロモーターおよびターミネーターの外側に挿
入し（図３１）、したがって予め決定された遺伝子座での導入遺伝子の相同組換
えを促進する。ｐＮＣＴ１１４は、１６ＳｒＤＮＡ−ｔｒｎａＶおよびｒｐｓ７
／１２標的化配列（配列番号６１）を含み、一方、ｐＮＣＴ２２４はレフトボー
ダーとしてｏｒｆ２２８−ｓｓｂおよびライトボーダーとしてｏｒｆ１２４４（
配列番号６２）を含む。以下のプライマーを、標的化配列のＰＣＲ増幅のために
使用した。
【０１１６】 ｐＮＣＴ１１４についてのプライマー レフトボーダー正方向プライマー： ＴＴＧＧＣＧＣＧＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＴＡＧＣＡＡＴＴＴＴＧＣＴＴＧＧ（配
列番号６８） レフトボーダー逆方向プライマー： ＴＴＧＣＧＴＡＣＧＡＴＴＴＡＴＣＴＣＡＧＡＴＴＡＧＡＴＧＧＴＣＴＡＧ（配
列番号６９） ライトボーダー正方向プライマー： ＴＴＧＣＣＴＡＧＧＣＧＴＡＴＴＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＡＡＣＣＡＧ（
配列番号７０）。 ライトボーダー逆方向プライマー： ＡＧＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＴＴＣＴＡＧＡＧＴＣＴＡＧＡＧ（配
列番号７１） ｐＮＣＴ２２４についてのプライマー レフトボーダー正方向プライマー： ＴＴＧＧＣＧＣＧＣＡＡＴＴＣＡＣＣＧＣＣＧＴＡＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＧ（配
列番号７２） レフトボーダー逆方向プライマー：ＴＴＧＣＧＴＡＣＧＣＣＴＴＴＧＡＣＴＴＡ
ＧＧＡＴＴＡＧＴＣＡＧＴＴＣ（配列番号７３） ライトボーダー正方向プライマー： ＴＴＧＣＣＴＡＧＧＧＴＣＧＡＧＡＡＡＣＴＣＡＡＣＧＣＣＡＣＴＡＴＴＣ（配
列番号７４） ライトボーダー逆方向プライマー： ＡＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＣＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＴＡＴＡＡＧＡＡＧＡＡＣ（
配列番号７５）。
【０１１７】 ｐＮＣＴ１１４/２２４についての詳細な模式図は図３１にある。両方のプラ
スミドは２つのプロモーターおよび２つのターミネーターＤＮＡフラグメントを
含む。方向性クローニングのために、独特の制限酵素部位が組み込まれる。プラ
スミドｐＮＣＴ１１４およびｐＮＣＴ２２４は独特の制限酵素部位（ＰｍｅＩ-
ＡｇｅＩおよびＰａｃＩ-ＸｈｏＩ部位）を有する。プラスミドｐＡＥＮからの
インサート（ＩＮｎとインフレームのａａｄＡ遺伝子）を、ＰａｃＩ-ＸｈｏＩ
での消化によって得、そしてｐＧＦＰＥＣ（ＩＮｃとインフレームのｓｍＧＦＰ
）を、ＰｍｅＩ−ＡｇｅＩで消化することによって得、続いてｐＮＣＴ１１４ま
たはｐＮＣＴ２２４にライゲーションした。プラスミドをｐ１１５ａｇおよびｐ
２２５ａｇと命名した（図３２）。プラスミドをＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、そ
してアンピシリンおよびスペクチノマイシンで選択した（図３３）。細胞抽出物
を一晩培養物から作製し、そして１０〜２０％トリス−グリシン−ＳＤＳ勾配ゲ
ル上で分離した。タンパク質を、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎ-Ｐメンブレン上にブロッ
トし、そして抗ＧＦＰモノクローナル抗体（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）でプロ-ブし、
続いてＧＦＰおよびａａｄＡ-ＧＦＰ融合タンパク質を化学発光検出した（図３
４）。
【０１１８】 実施例６：分子ＤＮＡに取り込まれたＤＮＡカセットから発現される植物細胞質
におけるＥＰＳＰＳおよびＡＬＳ遺伝子産物のシス−スプライシング 植物核へのＤＮＡの導入は、エレクトロポレ-ション、ポリエチレングリコー
ル媒介性、アグロバクテリウム媒介性、マイクロインジェクション、および微粒
子銃形質転換のような多くの異なる方法において達成されている。本発明に従っ
て、植物細胞質がシスまたはトランスにおいてタンパク質-スプライシング事象
を媒介するか否かを決定するべきである。これは植物におけるさらなるトランス
-スプライシング技術のために必要である。この技術は、標的タンパク質が活性
のために特異的な細胞質修飾を必要とする場合に有用である。上述の技術のいず
れもが、ＥＰＳＰＳおよび/またはＡＬＳ遺伝子カセットをタバコまたは任意の
適切な植物の組織または細胞に導入するために用いられ得る。一般的なカセット
は以下からなる：（１）カナマイシンまたは任意の他の適切な選択マーカーのよ
うな薬剤選択／分解マーカー遺伝子；（２）３５ｓＣＭＶ（カリフラワーモザイ
クウイルス）のような強力なプロモーターエレメント；および（３）アグロバク
テリウムのライトおよびレフトボーダーＴ ＤＮＡ反復。このようなカセットは
、微粒子銃プロセスによってまたはアグロバクテリウム媒介性の遺伝子移入（Ｈ
ｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１２２９−１２３１（１９８５））に
よってのいずれかで植物に導入され得た。カセットはｐＢＩ１２１遺伝子移入ベ
クター（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．、６：３９０１-３９０７（１
９８７））に基づく。最終的なカセットの設計は図３５において説明される。
【０１１９】 微粒子銃プロセスにおいて、形質転換するＤＮＡは微細な金粒子の表面上にコ
ートされ、そして粒子アクセレ-タ-銃（ＰＤＳ１０００／Ｈｅ銃、Ｂｉｏｒａｄ
、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）によって植物細胞に導入される。アグロバクテリウ
ム媒介性の遺伝子移入について、形質転換するＤＮＡカセットは、細菌に導入さ
れる。カセットを保有するアグロバクテリウムは、タバコまたは他の適切な植物
の葉の表面または組織切片と接触されることを許容される。このことは、植物核
へのＤＮＡカセットの移入を促進する。上述のアプローチのいずれかにおいて、
ＤＮＡは最終的に植物の核に取り込まれる。推定の形質転換された細胞は、マー
カー遺伝子（薬剤）選択のために使用される。選択された薬剤の存在下で再生さ
れた植物は、強力なトランスジェニック候補である。植物が成熟する後、細胞抽
出物が採取され、そして１ｍＭ ＤＴＴを含有するＳＤＳローディング色素と混
合され、９５℃で５分間煮沸され、そして１０〜２０％トリス−グリシン−ＳＤ
Ｓ勾配ゲル上にロードされる。分離されたタンパク質は、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎ−
Ｐメンブレン上にブロットされ、そして抗ＡＬＳまたはＥＰＳＰＳ抗体でプロー
ブされる。次いで、遺伝子が再配置を伴わずに予測可能な様式において取り込ま
れたか否かを決定するために、ＰＣＲが行われ得る。
【０１２０】 この技術は、細胞質環境において活性／折り畳みのための特異的な修飾を必要
とするタンパク質について有用である。必要な輸送シグナルおよびスプライシン
グエレメントを有する標的タンパク質遺伝子の一部分は、前駆体ポリペプチドの
形態において細胞質輸送のために細胞小器官中に配置される。
【０１２１】 これらの植物は、それらが成熟し、そして種子が回収されるまで、温室におい
て生長することを許容される。次いで、回収された種子は発芽され、そしてＦ１
植物は除草剤耐性について試験される。小規模の試行は、導入された導入遺伝子
の分離パターンがメンデルの遺伝パターンに従うか否かを観察するためになされ
得る。核ＤＮＡへの取り込みは、メンデル遺伝を生じ、一方、葉緑体ＤＮＡへの
取り込みは、非メンデルの母性遺伝を生じる。
【０１２２】 実施例７：植物葉緑体において機能的なハイブリッドタンパク質を生じるための
、ＥＰＳＰＳ／ＡＬＳのような分離遺伝子、またはアミノグリコシド−３−アセ
チルトランスフエラーゼ（ａａｄＡ）および可溶性の改変された緑色蛍光タンパ
ク質（ｓｍＧＦＰ）のような２つの未関連の遺伝子産物のトランス−スプライシ
ング これらの実験の目的は、植物葉緑体においてトランス−スプライシングが起こ
り得るか否かを調査することである。植物葉緑体は、それらの転写および翻訳機
能に関して細菌に類似する。実施例ＩＶ〜ＶＩにおいて、本発明者らは、シアノ
バクテリアであるＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ種ＰＣＣ６８０３のｄｎａＥ遺伝
子からの天然に存在するインテインを使用した。シアノバクテリアは、植物の葉
緑体に類似する光合成細菌である。従って、インテインが植物の葉緑体において
スプライスまたはトランス−スプライスすることは可能であるべきである。これ
らの提案される実験は２つの部分にある。第１部分、植物葉緑体において、２つ
の未関連の遺伝子産物のａａｄＡおよびｓｍＧＦＰのトランス-スプライシング
事象を実証すること、ここでは両方の遺伝子は葉緑体ゲノムに取り込まれる。；
および第２部分、葉緑体におけるトランス−スプライシング、ここではｓｍＧＦ
Ｐ遺伝子カセットが核ゲノムに取り込まれおよび輸送ペプチドを含有する翻訳さ
れるタンパク質（ルビスコ３Ａ−ＩＮｃ−ｓｍＧＦＰ）は反応の進行のために葉
緑体に輸送される。葉緑体は、ＩＮｎフラグメントに融合されるａａｄＡ遺伝子
を有する。詳細なプロトコルは以下に述べられる。
【０１２３】 葉緑体における転写および翻訳の際の、葉緑体における２つの未関連の遺伝子
産物の、アミノグリコシド−３−アセチルトランスフエラーゼ（ａａｄＡ）およ
び可溶性の改変された緑色蛍光タンパク質（ｓｍＧＦＰ）のトランス−スプライ
シングを実証する。
【０１２４】 プラスミドを実施例５におけるようにｐ１１５ａｇおよびｐ２２５ａｇとして
設計した。これらのプラスミドは、微粒子銃装置を使用して植物細胞小器官に送
達される。タバコまたは任意の他の適切な植物組織は、滅菌温室で生長された植
物または組織培養植物細胞から無菌的に採集される。植物組織は、植物生長培地
およびソルビト-ルまたは任意の他の適切な浸透圧調節物質とともに一晩平衡化
される。植物細胞は、金粒子上にコートされた上述のプラスミドでボンバードメ
ントされる。適切な回復時間後、細胞は、植物ホルモンおよびスペクチノマイシ
ン硫酸５００μｇ／ｍｌとともに植物増殖培地上に置かれる。スペクチノマイシ
ン耐性カルス組織は採集され、シュ-ト分化培地上に置かれる。シュートが約２
ｃｍ長になった場合、それらは切開され、そして根伸長培地に置かれる。トラン
スジェニック植物または植物の区分は、手動操作ＵＶランプによって同定される
（通常の（非トランスジェニック）植物はＵＶ中で赤色に蛍光するが、トランス
ジェニック植物は緑色に見える）。導入遺伝子取り込みおよびコピー数は、サザ
ンブロット解析およびＰＣＲによって確認される。トランスジェニック区分は、
抗ＧＦＰ抗体を使用してａａｄＡおよびｓｍＧＦＰのトランス-スプライシング
について試験される。これらの区分は、純粋なトランスプラストミック系統を作
製するためにさらに使用される。Ｆ1植物は、スペクチノマイシン耐性について
試験される。
【０１２５】 葉緑体におけるトランス−スプライシング。ｓｍＧＦＰ遺伝子カセットは核ゲ
ノムに取り込まれ、およびルビスコ３Ａ−ＩＮｃ-ｓｍＧＦＰの輸送ペプチドを
含有する翻訳されたタンパク質は、反応の進行のために葉緑体に輸送される。
【０１２６】 この方法は、任意の分離タンパク質（例えば、ＥＰＳＰＳまたはＡＬＳ）が、
葉緑体または核のいずれかにおいてＩＮｎまたはＩＮｃのいずれかとの融合タン
パク質として発現されることを可能にする。核にコードされる成分は、葉緑体輸
送ペプチドに融合されて、細胞質における翻訳後の葉緑体へのその移行を促進す
る。ａａｄＡおよびＧＦＰについての詳細な方法は以下に与えられる。類似の方
法は、任意の他のタンパク質／分離遺伝子について準じられ得る。
【０１２７】 この方法は、薬剤選択マーカーおよび目的の標的遺伝子を保有する、ｐＢＩ１
２１のような、核形質転換ベクターを必要とする。本発明者らの実験的な遺伝子
は、ルビスコ輸送ペプチド、続いてＩＮｃ、およびＳｍＧＦＰの３部分からなる
融合タンパク質である（ｓｍＧＦＰの代わりに、ＥＰＳＰＳまたはＡＬＳの半片
のような別のタンパク質／ペプチドが置換され得た）。輸送ペプチドは、タバコ
について至適化されるコドンである（図３９）。この融合タンパク質は、強力な
植物プロモーター、３５ＳＣＭＶの制御下にある。このようなカセットの模式図
が示される（図３６）。このＤＮＡは植物の核に導入される。安定なトランスジ
ェニック系統が選択され、およびＦ１子孫が導入遺伝子取り込みについて試験さ
れる。
【０１２８】 上述のトランスジェニック植物からの葉切片は、葉緑体ＤＮＡ形質転換のため
に使用される。葉緑体遺伝子標的化ベクターは、スペクチノマイシン耐性遺伝子
および導入遺伝子を駆動するためのＰｐｓｂＡプロモーターを有するｐ１１４お
よびｐ２２４に基づく。導入遺伝子は、必要なスプライシングエレメントを伴う
タンパク質の他の半分（これは以前に核ゲノムに取り込まれた）であり得た。モ
デル系として、本発明者らは葉緑体形質転換のためにａａｄＡ−ＩＮｎ融合遺伝
子を使用した。トランスプラストミック系統を両方の薬剤を使用して選択した（
例えば、葉緑体特異的薬剤のスペクチノマイシンおよび核特異的薬剤のカナマイ
シン）。ＰＣＲおよびウェスタンブロット分析はさらに純粋な植物系統を確立す
る。
【０１２９】 トランスジェニック植物について、Ｆ１世代が以下について試験される：（１
）導入遺伝子／セグメントのメンデル遺伝パターン；（２）導入遺伝子の安定性
；および（３）花粉を介する導入遺伝子の逸脱の可能性。
【０１３０】 ＡＬＳ／ＥＰＳＰＳトランスジェニック植物は、スルホニル尿素およびＲｏｕ
ｎｄｕｐ（登録商標）に対する耐性について試験される。
【０１３１】 本明細書中に記載される実施例および実施態様は、例示の目的のためのみであ
り、およびそれを考慮して種々の改変または変化が当業者に明白であり、そして
本出願の精神および範囲ならびに添付の請求の範囲の範囲内に含まれるべきであ
る。
【０１３２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１はタンパク質のスプライシング機構を示す。タンパク質のスプライシング
は、隣接するＮ−およびＣ−末端領域（イクステイン）の同時の連結を伴う、前
駆体タンパク質からの内部タンパク質セグメントのインテインの切り出しを含む
転写後プロセシング事象である。配列アラインメントは、２つのスプライス連結
部にて高度に保存される残基：インテインのＮ−末端でのシステインまたはセリ
ン残基、インテインのＣ−末端でのＨｉｓ−Ａｓｎ、およびＣ−末端イクステイ
ンの第１の残基としてのＣｙｓ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒが存在することを示す。
これらの保存されたスプライス連結部残基は、タンパク質スプライシング反応の
ペプチド結合の切断および連結の触媒に直接的に関与する。そのＮ−末端で、お
よびそのＣ−末端に近接してシステイン残基を有するインテインを伴うタンパク
質スプライシングの化学的機構が、図１において示される：第１工程−インテイ
ンのＮ−末端でのＣｙｓ１のＮ−Ｓアシル再配置による直鎖状チオエステル中間
体の形成；第２工程−第１工程において形成されたチオエステル上のインテイン
のＣ−末端のすぐ後ろのＣｙｓによる攻撃を含むエステル転移反応による分岐化
された中間体の形成；第３工程−インテインＣ−末端Ａｓｎ残基を含むスクシン
イミド形成に連結されるペプチド結合切断によるインテインの切り出し；第４工
程−チオエステルから安定なアミド結合への一過性の連結産物の自発的なＳ−Ｎ
アシル再配置。他のインテインを含むタンパク質スプライシングはおそらく、図
１において示されるＣｙｓ残基がＳｅｒまたはＴｈｒによって置き換えられ得、
それによって第１工程および第４工程がそれぞれ、Ｎ−ＯおよびＯ−Ｎアシルシ
フトであることを除いて、４つの類似の化学工程によって進行する。
【図２】 図２は、タンパク質スプライシングの図である。
【図３】 図３は、トランス−スプライシングを示す。Ｎ−末端およびＣ−末端インテイ
ンフラグメントの会合は、Ｎ−およびＣ−イクステイン配列の融合について２つ
のスプライス接合部をアラインする。スプライシング反応はおそらく、以前に提
案されるシス-スプライシング経路と同じスプライシング経路を介して生じる。
【図４】 図４は、トランス−スプライシングを示す。あるいは、スプライシングの不在
下でインテインは２つのイクステイン配列の会合を促進し得、その後の酵素学的
活性の生成を伴う。これは、インテイン媒介性相補と呼ばれている。
【図５】 Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ ＰＣＣ６８０３におけるＳｓｐ Ｄｎａ
Ｅインテイン遺伝子の配置を示す。青緑色藻類Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓ
ｐ ＰＣＣ６８０３のゲノムは、７４５ｋｂ離れて位置されるフラグメントを伴
う分離ｄｎａＥ遺伝子を含む。天然に存在するトランス−スプライシングインテ
インは、２つの遺伝子産物フラグメントを融合して活性なポリメラ-ゼを生成す
る。
【図６】 標的遺伝子のスプライシングを示す。標的遺伝子は、２つのフラグメントに分
断され得、Ｃ-およびＮ-末端部分で融合される部分的なインテイン遺伝子を伴う
。これらの分断遺伝子は、その後の発現が再構築され得るように、植物染色体に
配置され得る。
【図７】 導入遺伝子の封じ込めを示す。目的の遺伝子、この場合において除草剤耐性遺
伝子は、２つのフラグメント（標的Ｎおよび標的Ｃ）に分けられ、およびインテ
イン（ＩＮｎおよびＩＮｃ）は各部分的な遺伝子に融合される。２つの遺伝子融
合物は、ゲノム上の別々の、遠隔の位置に置かれる。これらのうちの一方は葉緑
体中にあり得、他方は核ゲノム中にあり得る。葉緑体に位置される導入遺伝子は
葉緑体において転写および翻訳されるのに対し、核導入遺伝子は核において転写
されそして細胞質において翻訳される。核遺伝子の翻訳後、これは、葉緑体輸送
ペプチドの補助を伴って葉緑体に輸送され、ここでこれは、会合またはスプライ
シングエレメントのいずれかとしてインテインを使用して他の遺伝子フラグメン
トと会合し得る。
【図８】 Ｅ.ｃｏｌｉ株ＥＲ２７４４におけるアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）のトラン
ス-スプライシングを示す。標的遺伝子は、インテインフラグメント（ＩＮｎお
よびＩＮｃ）によって分断され、そして２つの不活性な部分タンパク質として発
現される。タンパク質トランス−スプライシングは、活性な標的タンパク質産物
を宿主細胞において生成する。
【図９】 アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）遺伝子についての配列アラインメント（配列番
号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６）。
Ｅ.Ｃｏｌｉ アセト乳酸合成酵素ＩＩ（ＡＬＳＩＩ）についてのギャップ領域
に下線が付される。矢印はＥ.ｃｏｌｉ ＡＬＳＩＩについての分断部位を示す
。星印はトウモロコシＡＬＳについての分断部位を示す。
【図１０】 ＡＬＳＩＩｍ−１４がＥ.ｃｏｌｉ ＥＲ２７４４をバリンおよび除草剤、Ｓ
Ｍに対して耐性にすることを示すプレートアッセイ。Ｅ.ｃｏｌｉ ＥＲ２７４
４細胞は、ＡＬＳＩＩタンパク質（１）、ＡＬＳＩＩｍ（２）、ＡＬＳＩＩｍ−
１４（３）を発現するプラスミドＤＮＡで形質転換され、そして１００μｇ／ｍ
ｌのバリン（ａ）、または１００μｇ／ｍｌバリンおよび５０μｇ／ｍｌ ＳＭ
（ｂ）とともに、０．３ｍＭ ＩＰＴＧを含有するＭ９培地上にプレートされた
。プレートアッセイを３０℃で５０時間行った。
【図１１】 Ｓｓｐ ＤｎａＥインテイン媒介性トランス−スプライシングを介する、組換
えＡＬＳＩＩｍ−１４の生成を示す。コントロール（レーン１）、ＡＬＳＩＩ（
レーン２）、ＡＬＳＩＩｍ（Ｎ）−ＩＮｎ（レーン３）、ＡＬＳＩＩｍ（Ｃ）−
ＩＮｃ（レーン４）、ＡＬＳＩＩｍ（Ｎ）−ＩＮｎおよびＡＬＳＩＩｍ（Ｃ）−
ＩＮｃ（レーン５）についての発現プラスミドで形質転換された細胞からの、２
μｌの全細胞抽出物は、ＳＤＳ-ポリアクリルアミド（１２％）ゲル上で泳動さ
れ、Ｓ＆Ｓニトロセルロースメンブレンにトランスファーされ、そしてＡＬＳＩ
Ｉ Ｎ−末端に対する抗血清でプローブされた。
【図１２】 Ｓｓｐ ＤｎａＥインテイン媒介性トランス−スプライシングを介する、組換
えＡＬＳＩＩｍ−１４の生成を示す。コントロール（レーン１）、ＡＬＳＩＩ（
レーン２）、ＡＬＳＩＩｍ（Ｎ）−ＩＮｎ（レーン３）、ＡＬＳＩＩｍ（Ｃ）−
ＩＮｃ（レーン４）、ＡＬＳＩＩｍ（Ｎ）−ＩＮｎおよびＡＬＳＩＩｍ（Ｃ）−
ＩＮｃ（レーン５）についての発現プラスミドで形質転換された細胞からの、２
μｌの全細胞抽出物は、ＳＤＳ-ポリアクリルアミド（１２％）ゲル上で泳動さ
れ、Ｓ＆Ｓニトロセルロースメンブレンにトランスファーされ、そしてＡＬＳＩ
Ｉ Ｃ−末端に対する抗血清でプローブされた。
【図１３】 トランス−スプライシングの効率が温度感受性であることを示す図である。ウ
ェスタンブロットが、ＡＬＳＩＩｍ Ｎ-末端に対する抗血清を使用して行われ
た。タンパク質抽出物は、抗血清と反応する非特異的タンパク質（上部バンド）
を含むコントロールＥ.ｃｏｌｉ抽出物：（レーン１）、ＡＬＳＩＩ（レーン２
）、ＡＬＳＩＩｍ（Ｎ）-ＩＮｎおよびＡＬＳＩＩｍ（Ｃ）-ＩＮｃ（レーン３〜
６）についての発現プラスミドで形質転換された細胞から作製された。細胞培養
温度は、レーン１〜レーン３について３７℃、レーン４について３０℃、レーン
5について２５℃、およびレーン６について１５℃である。
【図１４】 アセト乳酸合成酵素ＩＩ（ＡＬＳＩＩ）活性についてのアッセイを示す。 左上では、ＡＬＳＩＩｍ（Ｎ）-ＩＮｎおよびＡＬＳＩＩｍ（Ｃ）-ＩＮｃの同
時発現は、バリンおよび除草剤を添加したプレート上での細胞増殖を減少した。
Ｅ.ｃｏｌｉ ＥＲ２７４４は、ＡＬＳＩＩ（１）、ＡＬＳＩＩｍ（２）、ＡＬ
ＳＩＩｍ（Ｎ）-ＩＮｎ、およびＡＬＳＩＩｍ（Ｃ）-ＩＮｃ（３）、ＡＬＳＩＩ
ｍ（Ｎ）-ＩＮｎ（４）、ＡＬＳＩＩｍ（Ｃ）-ＩＮｃ（５）、ＡＬＳＩＩｍ（Ｎ
）およびＡＬＳＩＩｍ（Ｃ）（６）についての発現プラスミドで形質転換され、
３７℃（ａ）、１００μｇ/ｍｌバリンとともに３７℃（ｂ）、１００μｇ/ｍｌ
バリンとともに３０℃（ｃ）、ならびに１００μｇ/ｍｌバリンおよび５０μｇ/
ｍｌスルホメツロンメチル（ＳＭ）とともに３０℃（ｄ）で、Ｍ９培地上にプレ
ートした。プレートは０．３ｍＭ ＩＰＴＧを含んだ。
【図１５】 右上では、ＡＬＳＩＩｍ（Ｎ）-ＩＮｎおよびＡＬＳＩＩｍ（Ｃ）-ＩＮｃの同
時発現は、バリンおよび除草剤を添加した培地における細胞増殖を減少した。Ｅ
.ｃｏｌｉ ＥＲ２７４４は、グラフの下に示されるような融合タンパク質につ
いての発現プラスミドで形質転換され、示されるように１００μｇ/ｍｌバリン
および５０μｇ/ｍｌスルホメツロンメチル（ＳＭ）を含有するまたは含有しな
い、Ｍ９培地（０．３ｍＭ ＩＰＴＧ）上で培養された。細胞が４０時間３０℃
で培養された後、細胞増殖速度を決定するためにＯＤ６００を行った。 左下では、ＡＬＳＩＩｍ（Ｎ）-ＩＮｎおよびＡＬＳＩＩｍ（Ｃ）-ＩＮｃを発
現する細胞の増殖速度に対する経時的研究を示す。Ｅ.ｃｏｌｉ ＥＲ２７４４
は、示されるようなタンパク質についての発現プラスミドで形質転換され、１０
０μｇ/ｍｌバリンの添加を伴うＭ９培地（０．３ｍＭ ＩＰＴＧ）中で３０℃
にて培養された。細胞密度は、示されるようにいくつかの時点でＯＤ６００を測
定することによって決定された。
【図１６】 トランス−スプライシング産物、トウモロコシＡＬＳ-１４のウェスタンブロ
ット検出を示す。コントロール（レーン１）（抗体がＥ.ｃｏｌｉにおける非特
異的タンパク質と反応することに注意されたい）、ｃＡＬＳ（レーン２）、ｃＡ
ＬＳ（Ｎ）-ＩＮｎ（レーン３）、ｃＡＬＳ（Ｃ）ＩＮｃ（レーン４）、ｃＡＬ
Ｓ（Ｎ）-ＩＮｎおよびｃＡＬＳ（Ｃ）-ＩＮｃ（レーン５）についての発現プラ
スミドで形質転換されたＥ.ｃｏｌｉ ＥＲ２７４４細胞からの２μｌの全細胞
溶解物は、１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で泳動され、Ｓ＆Ｓニトロセ
ルロ-スメンブレンにトランスファーし、そしてｃＡＬＳ Ｎ-末端に対する抗血
清でプロ-ブされた。ｃＡＬＳはコーン/トウモロコシＡＬＳタンパク質を示す。
【図１７】 トランス−スプライシング産物、トウモロコシＡＬＳ-１４のウェスタンブロ
ット検出を示す。コントロール（レーン１）（抗体がＥ.ｃｏｌｉにおける非特
異的タンパク質と反応することに注意されたい）、ｃＡＬＳ（レーン２）、ｃＡ
ＬＳ（Ｎ）-ＩＮｎ（レーン３）、ｃＡＬＳ（Ｃ）ＩＮｃ（レーン４）、ｃＡＬ
Ｓ（Ｎ）-ＩＮｎおよびｃＡＬＳ（Ｃ）-ＩＮｃ（レーン５）についての発現プラ
スミドで形質転換されたＥ.ｃｏｌｉ ＥＲ２７４４細胞からの２μｌの全細胞
溶解物は、１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で泳動され、Ｓ＆Ｓニトロセ
ルロ-スメンブレンにトランスファーし、そしてｃＡＬＳ Ｃ−末端に対する抗
血清でプロ-ブされた。ｃＡＬＳはコーン/トウモロコシＡＬＳタンパク質を示す
。
【図１８】 Ｓｓｐ ＤｎａＥインテインシス-スプライシング構築物についてのプレーテ
ィングアッセイを示す。プラスミドｐＣＥ１８２ＤｎａＥ、ｐＣＥ２１５Ｄｎａ
Ｅ、ｐＣＥ２３５ＤｎａＥ、およびｐＣＥ２６７ＤｎａＥは、それぞれ、アミノ
酸の１８２位、２１５位、２３５位、および２６７位で挿入される完全長のＳｓ
ｐ ＤｎａＥインテインとともに５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸合
成酵素（ＥＰＳＰＳ）タンパク質をコードする。これらは、ＥＲ２７９９ Ｅ．
ｃｏｌｉ細胞に形質転換され（これはＭ９最小培地における生存可能性のために
ＥＰＳＰＳタンパク質を必要とする）、そしてＭ９最小培地にプレートされた。
３７℃で一晩のインキュベーション後、各プレート上の個々のクローンをつつき
、そして単一のＭ９最小プレート上に掻きとった。次いで、このマスタープレー
トを３７℃で一晩または室温で２〜３日間、インキュベートした。コントロール
としてｐＣＹＢ３プラスミドが、これがＥＰＳＰＳ遺伝子を保有しないので使用
され、そして選択プレート上での増殖はなかった。ｐＣ＋Ｅ２、Ｐｒｏ１０１Ｓ
ｅｒ変異を含有する完全長野生型ＥＰＳＰＳを含むプラスミドは、Ｍ９選択プレ
ート上で増殖し、およびまたグリフォセート耐性を付与する。
【図１９】 ２１５位および２３５位でのＳｓｐ ＤｎａＥインテイントランス-スプライ
シング構築物についてのプレーティングアッセイを示す。 各５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）トラン
ス−スプライシング構築物が、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７９９細胞に適合する構築
物を同時形質転換し、そしてＭ９選択プレート上にプレートすることによってア
ッセイされた。ｐＣＹＢ３またはｐＫＹＢ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）は、ＥＰＳＰＳ遺伝子の存在を有
さず、各半片のＥＰＳＰＳ遺伝子の活性を試験する場合に、アンピシリンまたは
カナマイシン耐性を提供するために使用された。 使用されたプラスミドは以下のようであった：ｐＣ＋Ｅ２、これは完全長のＥ
ＰＳＰＳ変異体遺伝子を含む；Ｐ２１５ＥＮ２、これはＳｓｐ ＤｎａＥインテ
インのＮ−末端スプライシングドメインに融合されるＥＰＳＰＳの最初の２１５
アミノ酸を有する；Ｐ２３５ＥＮ２、これはＳｓｐ ＤｎａＥインテインのＮ−
末端スプライシングドメインに融合されるＥＰＳＰＳの最初の２３５アミノ酸を
有する；ｐＥＰＳ番号２８、これはＳｓｐ ＤｎａＥインテインのＣ−末端スプ
ライシングドメインに融合されるＥＰＳＰＳ遺伝子の２１６〜４２７アミノ酸を
含む；ｐＥＰＳ番号２９、これはＳｓｐ ＤｎａＥインテインのＣ−末端スプラ
イシングドメインに融合されるＥＰＳＰＳ遺伝子の２３６〜４２７アミノ酸を含
む；ｐＥＰＳ番号３３、これはＳｓｐ ＤｎａＥインテインのスプライシング欠
損Ｎ−末端ドメインに融合されるＥＰＳＰＳの最初の２３５アミノ酸を有する；
ｐＥＰＳ番号３７、これは、Ｓｓｐ ＤｎａＥインテインのスプライシング欠損
Ｃ−末端ドメインに融合されるＥＰＳＰＳの２３６〜４２７アミノ酸を有する；
ｐＥＰＳ番号３４、これは、ＥＰＳＰＳの最初の２３５アミノ酸を有するが、イ
ンテインフラグメントがない；およびｐＥＰＳ番号３６、これはＥＰＳＰＳの２
３６〜４２７アミノ酸を有するが、インテインフラグメントがない。これらのプ
ラスミドを、種々の組み合わせにおいて、ＥＲ２７９９ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に同
時形質転換し、そしてＬＢプレートおよびＭ９プレートの両方にプレートし、各
プレートは１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬカナマイシンお
よび０．３ｍＭ ＩＰＴＧが補充された。個々のクローンを、３７℃で一晩また
は室温で２〜３日間のインキュベーション後、各ＬＢプレートからつつき、そし
て１つのＭ９選択培地上に掻きとった。Ｍ９最小培地選択プレートは、１００μ
ｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび０．３ｍＭ Ｉ
ＰＴＧを含んだ。使用された組み合わせは以下のようであった：ＷＴ、ｐＣ＋Ｅ
２およびｐＫＹＢ；２１５ＮＣ、ｐ２１５ＥＮ２およびｐＥＰＳ番号２８；２１
５Ｃ、ｐＥＰＳ番号２８およびｐＣＹＢ３；２３５ＮＣ-Ｄｅａｄ、ｐＥＰＳ番
号３３およびｐＥＰＳ番号３７；２３５ＮＣ、ｐ２３５ＥＮ２およびｐＥＰＳ番
号２９；２３５Ｎ、ｐ２３５ＥＮ２およびｐＫＹＢ１；２３５Ｃ、ｐＥＰＳ番号
２９およびｐＣＹＢ３；２３５Ｎ-２１５Ｃ、ｐ２３５ＥＮ２およびｐＥＰＳ番
号２８；ならびに２３５相補物、ｐＥＰＳ番号３４およびｐＥＰＳ番号３６。
【図２０】 ２３５トランス−スプライシング構築物についてのグリフォセート耐性液体ア
ッセイを示す。プラスミド構築物は図１９において記載されるとおりであった。
使用された組み合わせは以下のようであった：ＷＴ、ｐＣ＋Ｅ２およびｐＫＹＢ
；２３５ＮＣ-Ｄｅａｄ、ｐＥＰＳ番号３３およびｐＥＰＳ番号３７；２３５Ｎ
Ｃ、ｐ２３５ＥＮ２およびｐＥＰＳ番号２９；２３５Ｎ、ｐ２３５ＥＮ２および
ｐＫＹＢ１；２３５Ｃ、ｐＥＰＳ番号２９およびｐＣＹＢ３；および２３５相補
物、ｐＥＰＳ番号３４およびｐＥＰＳ番号３６。これらのプラスミドはＥＲ２７
９９ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に同時形質転換され、そして１００μｇ／ｍＬアンピシ
リンおよび５０μｇ／ｍＬカナマイシンが補充されたＬＢプレート上にプレート
された；ｐＣＹＢ３／ｐＫＹＢは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７４４に同時形質転換
され、そして以前に記載されるように補充されたＬＢプレート上にプレートされ
た。前培養を、３０℃で一晩、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／
ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ培地に新鮮なコロニーを接種することによって
各形質転換について調製した。等量の前培養（細胞密度に依存して１０〜１１μ
Ｌ）が、異なる量のグリフォセートの存在下または不在下で、１００μｇ／ｍＬ
アンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび０．３ｍＭ ＩＰＴＧを
含有する新鮮に作製されたＭ９最小培地に接種された。各構築物の増殖は、６０
０ｎｍでのＯＤによって測定された。ここでは、３７℃での増殖を示す。
【図２１】 ２３５トランス−スプライシング構築物についてのグリフォセート耐性液体ア
ッセイを示す。プラスミド構築物は図１９において記載されるとおりであった。
使用された組み合わせは以下のようであった：ＷＴ、ｐＣ＋Ｅ２およびｐＫＹＢ
；２３５ＮＣ-Ｄｅａｄ、ｐＥＰＳ番号３３およびｐＥＰＳ番号３７；２３５Ｎ
Ｃ、ｐ２３５ＥＮ２およびｐＥＰＳ番号２９；２３５Ｎ、ｐ２３５ＥＮ２および
ｐＫＹＢ１；２３５Ｃ、ｐＥＰＳ番号２９およびｐＣＹＢ３；および２３５相補
物、ｐＥＰＳ番号３４およびｐＥＰＳ番号３６。これらのプラスミドはＥＲ２７
９９ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に同時形質転換され、そして１００μｇ／ｍＬアンピシ
リンおよび５０μｇ／ｍＬカナマイシンが補充されたＬＢプレート上にプレート
された；ｐＣＹＢ３／ｐＫＹＢは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２７４４に同時形質転換
され、そして以前に記載されるように補充されたＬＢプレート上にプレートされ
た。前培養を、３０℃で一晩、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／
ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ培地に新鮮なコロニーを接種することによって
各形質転換について調製した。等量の前培養（細胞密度に依存して１０〜１１μ
Ｌ）が、異なる量のグリフォセートの存在下または不在下で、１００μｇ／ｍＬ
アンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび０．３ｍＭ ＩＰＴＧを
含有する新鮮に作製されたＭ９最小培地に接種された。各構築物の増殖は、６０
０ｎｍでのＯＤによって測定された。ここでは、３０℃での増殖を示す。
【図２２】 Ｍ９液体最小培地におけるシス-スプライシング２３５構築物の増殖を示す。
５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）の２３５位
に挿入された完全長Ｓｓｐ ＤｎａＥインテインを有するプラスミドが構築され
た。２つのプラスミドベクターが作製され（ｐＣＥ２３５ ＤｎａＥおよびｐＥ
ＰＳ番号３１）、一方はスプライシング適格性Ｓｓｐ ＤｎａＥインテイン（２
３５ｃｉｓ）を有し、および他方はスプライシング不適格性インテイン（２３５
ｄｅａｄ）を有した。これらのプラスミドは、ｐＫＥＢ１２とともに、ＥＲ２７
９９ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に同時形質転換され、そして１００μｇ／ｍＬアンピシ
リンおよび５０μｇ／ｍＬカナマイシンが補充されたＬＢプレート上にプレート
された。前培養が、３０℃で一晩、新鮮なコロニーをＬＢ培地に接種することに
よって、各形質転換について調製された。等量の前培養（細胞密度に依存して１
０〜１１μＬ）が、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、５０μｇ／ｍＬカナマイシ
ン、および０．３ｍＭ ＩＰＴＧを含有する新鮮に作製されたＭ９最小培地に接
種された。細胞密度は、６００ｎｍでのＯＤを使用して種々の時間で決定された
。
【図２３】 ５アミノ酸挿入を許容し、およびなお活性なタンパク質を生じる５−エノール
ピルビル−３−ホスホシキミ酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）タンパク質における部位
を示す表である。
【図２４】 ５アミノ酸挿入を許容し、およびなお活性なタンパク質を生じる５−エノール
ピルビル−３−ホスホシキミ酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）タンパク質における部位
を示す表である。
【図２５】 ５アミノ酸挿入が不活性なタンパク質を生じる、５−エノールピルビル−３−
ホスホシキミ酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）タンパク質における部位を示す表である
。
【図２６】 ｐＩＨ９７６のマップである。マルチクローニングサイトを有する環状２本鎖
ＤＮＡ。制限酵素部位が示される。括弧を伴う制限部位は独特ではない。Ｐｔａ
ｃはｔａｃプロモーターを示す。複製起点はｏｒｉである。このプラスミドは、
テトラサイクリン薬剤耐性マーカー（Ｔｅｔｒ）を有する。
【図２７】 ｐＡＧＲ３のマップである。マルチクローニングサイトを有する環状２本鎖Ｄ
ＮＡ（配列番号７３）。制限酵素部位は下に示される。Ｐｔａｃは、Ｔａｃプロ
モーターを示す。複製起点はｏｒｉである。このプラスミドは、アンピシリン薬
剤耐性マーカー（ａｍｐｒ）を有する。Ｌａｃオペレ-タ-およびリボゾーム結合
部位が示される。プラスミドｐＡＧＲ３は、いくつかのエレメント：（１）対称
な合成ｌａｃオペレ-タ-配列に結合される合成ｔａｃプロモーター；（２）ｌａ
ｃリボゾーム結合部位；（３）リボゾーム結合部位の約７ヌクレオチド下流にあ
るＮｃｏＩ部位内のＡＴＧを用いてクローニングするためのポリリンカー；（４
）ｔａｃプロモーターの抑制を提供するための１コピーのｌａｃＩｑ遺伝子；（
５）ｐＢＲ３２２からの複製起点；（６）アンピシリン耐性遺伝子；および（７
）ｔａｃプロモーターの上流の４倍コピーのリボゾーム転写ターミネーターを含
む発現ベクターである。転写ターミネーターは、上流プロモーターからの読み過
ごしの転写を減少することによって、転写の基底レベルを下げる。
【図２８】 スプライスエレメントとしてＳｓｐ ＤｎａＥインテインを使用する、Ｅ．ｃ
ｏｌｉにおける２つの未関連の遺伝子産物のトランス-スプライシングを示す。
ここで、プラスミドｐＩＨａａｄＥ-Ｎは、Ｓｓｐ ＤｎａＥインテインのＮ−
末端スプライシングドメイン（灰色のＩＮｎ）に融合されるａａｄＡ遺伝子（黒
）を示す。プラスミドｐＡＧＲＥ-ＣｓｍＧＦＰプラスミドは、Ｓｓｐ Ｄｎａ
ＥインテインのＣ−末端スプライシングドメイン（灰色のＩＮｃ）およびｓｍＧ
ＦＰ（黒）を示す。それぞれのパートナーについての算定される分子量は、ｋＤ
ａで以下に示される。矢印は、ａａｄＡ−ｓｍＧＦＰ（５７ｋＤａ）融合タンパ
ク質を生じるトランス−スプライシング事象を示す。
【図２９】 スプライスエレメントとしてＳｓｐ ＤｎａＥインテインを使用する、Ｅ．ｃ
ｏｌｉにおける２つの未関連の遺伝子産物のトランス-スプライシングを示す。
ここで、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞におけるｐＩＨａａｄＥ−ＮおよびｐＡＧＲＥ−Ｃｓ
ｍＧＦＰプラスミドのアンピシリンおよびスペクチノマイシン硫酸を選択。Ｅ．
ｃｏｌｉは右側に示されるプラスミドで形質転換された。コロニー数は上部に示
される。
【図３０】 トランス−スプライシングを介するハイブリッドａａｄＡ-ｓｍＧＦＰタンパ
ク質の発現および検出を示す。モノクロ-ナルｓｍＧＦＰ特異的抗体を使用する
、図の上部で示されるような構築物を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞抽出物のウェス
タンブロット分析。ビオチン化されたＭＷマーカーの相対的な位置（７６、５７
、４６、３７、２８、および２０）はｋＤａである。ａａｄＡ−ｓｍＧＦＰハイ
ブリッドおよびＩＮｃ-ｓｍＧＦＰに対応するタンパク質バンドが示される。
【図３１】 ｐＮＣＴ１１４/２２４のマップである。予め決定された遺伝子座に対して遺
伝子（単数または複数）を標的化し得るマルチクローニングサイトを有する環状
２本鎖ＤＮＡ。制限酵素部位が示される。ＰｐｓｂＡおよびＴｐｓｂＡは、それ
ぞれ、光合成ポリペプチドＤ１遺伝子のプロモーターおよびターミネーターを示
す。複製起点はｏｒｉである。このプラスミドはアンピシリン薬剤耐性マーカー
（ａｍｐｒ）を有する。相同組換え配列が、レフトボーダー（ｐＮＣＴ１１４に
ついてｏｒｆ２２８-ｓｓｂおよびｐＮＣＴ２２４について１６ＳｒＤＮＡ-ｔｒ
ｎａＶ）およびライトボーダー（ｐＮＣＴ１１４についてｏｒｆ１２４４および
ｐＮＣＴ２２４についてｒｐｓ７／１２）として示される。ＣＳはクローニング
部位を示す。
【図３２】 Ｅ．ｃｏｌｉにおける食物プロモーターＰｐｓｂＡの活性、およびａａｄＡお
よびｓｍＧＦＰのトランス−スプライシングを示す。プラスミドｐ１１５ａｇ／
ｐ２２５ａｇは、ＳｓＰ ＤｎａＥインテインＮ−末端ドメイン（灰色のＩＮｎ ）に融合されるａａｄＡ遺伝子（黒）およびｓｍＧＦＰ（黒）に融合されるＳｓ
Ｐ ＤｎａＥインテインＣ−末端ドメイン（灰色のＩＮｃ）を示す。両方のハイ
ブリッド遺伝子は、反対の方向に転写される。それぞれのパートナーについての
算定される分子量は、下にｋＤａで示される。矢印は融合されるａａｄＡ−Ｓｍ
ＧＦＰ（５７ｋＤａ）タンパク質を生じるトランス-スプライシング事象を示す
。
【図３３】 Ｅ．ｃｏｌｉにおける食物プロモーターＰｐｓｂＡの活性、およびａａｄＡお
よびｓｍＧＦＰのトランス−スプライシングを示す。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞における
ｐ１１５ａｇおよびｐ２２５ａｇプラスミドのアンピシリンおよびスペクチノマ
イシン硫酸選択。Ｅ．ｃｏｌｉは、右側に示されるプラスミドで形質転換された
。コロニー同一性は上部に示される。プラスミドの後ろの桁は単離された数であ
る。プラスの記号（「＋」）は示された抗生物質でのプラスミドの増殖を示す。
【図３４】 Ｅ．ｃｏｌｉにおける食物プロモーターＰｐｓｂＡの活性、およびａａｄＡお
よびｓｍＧＦＰのトランス−スプライシングを示す。トランス−スプライシング
を介するハイブリッドａａｄＡ−ｓｍＧＦＰタンパク質の発現および検出。モノ
クロ-ナルｓｍＧＦＰ特異的抗体を使用した、図の上部に示されるような構築物
を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞抽出物のウェスタンブロット分析。ビオチン化され
たＭＷマーカーの相対的な位置は、ｋＤａで左側にある。ａａｄ-ｓｍＧＦＰハ
イブリッドおよびＩＮｃ-ｓｍＧＦＰに対応するタンパク質バンドが示される。
【図３５】 植物葉緑体におけるシスでのスプライシングを示す。５−エノールピルビル−
３−ホスホシキミ酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）およびアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ
）の遺伝子は、バイナリベクターｐＢＩ１２１に挿入される。ＥＰＳＰＳまたは
ＡＬＳのアミノ末端およびカルボキシ末端フラグメントは黒で示される。Ｓｓｐ
ＤｎａＥインテイン（Ｉｎｔｅｉｎ）遺伝子は、ＥＰＳＰＳ／ＡＬＳフラグメ
ントによっていずれかの側に隣接される。アグロバクテリウムのライトボーダー
およびレフトボーダーが、ＬＢおよびＲＢとして示される。ＣａＭＶ３５Ｓプロ
モーター、ＮＯＳプロモーター（ＰＮＯＳ）およびＮＯＳターミネーター（ＴＮ
ＯＳ）が示される。
【図３６】 核移行ベクターｐＢＩＴＰＥＣまたはｐＢＩＴＰＥＣｓｍＧＦＰを示す。この
バイナリーベクターは、Ｓｓｐ ＤｎａＥインテインＣ−末端スプライシングド
メイン（ＩＮｃ）に融合されるルビスコ３Ａ輸送ペプチド（ＴＰ）を駆動するＣ
ａＭＶ３５Ｓプロモーターを有する。細胞小器官輸送のためにクローン化される
遺伝子は、ＩＮｃの後ろに示される。ｐＢＩＴＰＥＣｓｍＧＦＰの場合において
、ｓｍＧＦＰ遺伝子はマルチクローニングサイト内にクローン化される。
【図３７】 ｐｓｂＡプロモーター（ＰｐｓｂＡ）配列（配列番号５９）である。
【図３８】 ｐｓｂＡターミネーター（ＴｐｓｂＡ）（配列番号６０）である。
【図３９】 ルビスコ３輸送ペプチド（配列番号６１）である。小文字のヌクレオチドは、
コドンの至適化された単位を示す。
【図４０】 葉緑体遺伝子標的化ベクター（ｐＮＣＴ１１４）（配列番号６２）である。ｐ
ＮＣＴ１１４の特徴は図４０〜４３に示されるものを含む。ここでは、（１）ベ
クター骨格：ｐＬＩＴＭＵＳ２８を示す。
【図４１】 葉緑体遺伝子標的化ベクター（ｐＮＣＴ１１４）（配列番号６２）である。ｐ
ＮＣＴ１１４の特徴は図４０〜４３に示されるものを含む。ここでは、 （２）ＢｓｓＨＩＩからＢｓｉＷＩレフトボーダーにおいて、（ｏｒｆ２２８-
ｓｓｂ、１２１０ｂｐ）葉緑体ゲノム標的化フラグメントが挿入される；
【図４２】 葉緑体遺伝子標的化ベクター（ｐＮＣＴ１１４）（配列番号６２）である。ｐ
ＮＣＴ１１４の特徴は図４０〜４３に示されるものを含む。ここでは、（３）Ａ
ｖｒＩＩからＫｐｎＩライトボーダーにおいて（ｏｒｆ１２４４、１５５０ｂｐ
）葉緑体ゲノム標的化フラグメントが挿入されることを示す。
【図４３】 葉緑体遺伝子標的化ベクター（ｐＮＣＴ１１４）（配列番号６２）である。ｐ
ＮＣＴ１１４の特徴は図４０〜４３に示されるものを含む。ここでは、（４）Ｂ
ｓｉＷＩとＰｓｔＩとの間のＰｐｓｂＡおよびＴｐｓｂＡの付加、一方他の対は
ＡｖｒＩＩとＮｃｏＩ部位との間であることを示す。
【図４４】 葉緑体遺伝子標的化ベクター（ｐＮＣＴ２２４）（配列番号６３）である。ｐ
ＮＣＴ１１４の特徴は図４４〜４７に示されるものを含む。ここでは、（１）ベ
クター骨格：ｐＬＩＴＭＵＳ２８を示す。
【図４５】 葉緑体遺伝子標的化ベクター（ｐＮＣＴ２２４）（配列番号６３）である。ｐ
ＮＣＴ１１４の特徴は図４４〜４７に示されるものを含む。ここでは、（２）Ｂ
ｓｓＨＩＩからＢｓｉＷＩレフトボーダーにおいて、（１６ＳｒＤＮＡ-ｔｒｎ
ａＶ、１６８０ｂｐ）葉緑体ゲノム標的化フラグメントが挿入されることを示す
。
【図４６】 葉緑体遺伝子標的化ベクター（ｐＮＣＴ２２４）（配列番号６３）である。ｐ
ＮＣＴ１１４の特徴は図４４〜４７に示されるものを含む。ここでは、（３）Ａ
ｖｒＩＩからＫｐｎＩライトボーダーにおいて（ｒｐｓ７／１２、１３１０ｂｐ
）葉緑体ゲノム標的化フラグメントが挿入されることを示す。
【図４７】 葉緑体遺伝子標的化ベクター（ｐＮＣＴ２２４）（配列番号６３）である。ｐ
ＮＣＴ１１４の特徴は図４４〜４７に示されるものを含む。ここでは、（４）Ｂ
ｓｉＷＩとＰｓｔＩとの間のＰｐｓｂＡおよびＴｐｓｂＡの付加、一方他の対は
ＡｖｒＩＩとＮｃｏＩ部位との間であることを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 ボストン・バイオメディカル・リサーチ・ インスティチュート アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02472 ウォータータウン グローブ・ス トリート 25 (72)発明者 ミン・クン・シュ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01982 ハミルトン クレセント・ロード 40 (72)発明者 トマス・シー・エバンス アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02143 ソメービル ファースト・フロア アルビオン・ストリート 68 (72)発明者 スリハーサ・プラドハン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01915 ベバーリイ エセックス １ ベ バーリイ・コモンズ ６ (72)発明者 ドナルド・ジー・コーム アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01944 マンチェスター プロクター・ス トリート ９ (72)発明者 ヘンリー・パウルス アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02210 ボストン イースト・インディ ア・ロウ 85 (72)発明者 ルオ・スン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01982 ハミルトン プラム・ストリート 46 (72)発明者 リキシン・チェン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01915 ベバーリイ ラントウル・ストリ ート 409 60 (72)発明者 インカ・ゴシュ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02144 ソメービル コテージ・アベニュ ー 10 Ｆターム(参考） 4B024 AA08 BA79 CA04 CA07 DA06 EA04 FA02 FA07 GA11 HA01 4H045 AA20 BA41 CA11 CA30 DA89 EA05 FA74

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生物体内で予め決定された位置において標的タンパク質を再
    構築する方法であって、 （ａ）該標的タンパク質をコードするＤＮＡを少なくとも２つのフラグメント
    に分断する工程； （ｂ）他の生物体への該標的タンパク質をコードする遺伝子の伝達を防止する
    ために工程（ａ）のＤＮＡフラグメントを分離する工程； （ｃ）該標的タンパク質の対応するフラグメントを生成するために生物体内で
    工程（ｂ）のＤＮＡフラグメントを発現させる工程；および （ｄ）該タンパク質フラグメントから該標的タンパク質を再構築する工程、 を含む方法。
  2. 【請求項２】 標的タンパク質をコードする遺伝子の、標的タンパク質をコ
    ードする該ＤＮＡを含有する生物体内から他の生物体への伝達を防止する方法で
    あって、 （ａ）該標的タンパク質をコードするＤＮＡを少なくとも２つのフラグメント
    に分断する工程； （ｂ）該標的タンパク質をコードする遺伝子の伝達を防止するために工程（ａ
    ）のＤＮＡフラグメントを分離する工程 を含む方法。
  3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の方法であって、生物体が、植物、
    動物、真菌、ウイルス、原核生物、および単細胞真核生物からなる群より選択さ
    れる方法。
  4. 【請求項４】 請求項１または２に記載の方法であって、標的タンパク質を
    コードするＤＮＡが１つ以上のインテインまたはその部分をコードするＤＮＡに
    よって分断される方法。
  5. 【請求項５】 請求項４に記載の方法であって、標的タンパク質をコードす
    るＤＮＡが少なくとも２つのＤＮＡ融合フラグメントを形成することによって分
    断され、ここで該ＤＮＡ融合フラグメントが標的タンパク質をコードするＤＮＡ
    の一部分およびインテインをコードするＤＮＡの一部分を含んでいる方法。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載の方法であって、前記融合フラグメントの一
    方がインテインのＮ−末端部分をコードするＤＮＡのＮ−末端に標的タンパク質
    のＮ−末端部分をコードするＤＮＡのＣ−末端を連結することによって形成され
    、かつ、該融合フラグメントの他方がインテインのＣ−末端部分をコードするＤ
    ＮＡのＣ−末端部分に標的タンパク質のＣ−末端部分をコードするＤＮＡのＮ−
    末端部分を連結することによって形成される方法。
  7. 【請求項７】 請求項１または２に記載の方法であって、標的タンパク質を
    コードするＤＮＡが１つ以上の親和性ドメインをコードするＤＮＡによって２つ
    以上のＤＮＡフラグメントを形成するように分断される方法。
  8. 【請求項８】 請求項７に記載の方法であって、ここで親和性ドメインが、
    インテイン、またはインテインフラグメント、ロイシンジッパー、およびｃ−Ｊ
    ｕｎ/ｃ−Ｆｏｓからなる群より選択される方法。
  9. 【請求項９】 請求項１または２に記載の方法であって、標的タンパク質を
    コードするＤＮＡフラグメントが、各ＤＮＡフラグメントを、核、膜結合性細胞
    小器官、プラスミド、ウイルス、コスミド、および人工染色体からなる群より選
    択される異なる区分に区分化することによって分離される方法。
  10. 【請求項１０】 請求項９に記載の方法であって、ＤＮＡフラグメントのタ
    ンパク質産生物が機能的な再構築を生じ得る単一の区分に輸送されるように標的
    タンパク質をコードする少なくとも１つのＤＮＡフラグメントが輸送ペプチドを
    コードするＤＮＡ配列に融合される方法。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の方法であって、葉緑体への輸送のため
    の輸送ペプチドをコードするＤＮＡ配列に融合されながら、標的タンパク質の一
    部分をコードするＤＮＡフラグメントの１つが核中に区分され、そして標的タン
    パク質の別の部分をコードする他のＤＮＡフラグメントが葉緑体中に区分される
    方法。
  12. 【請求項１２】 請求項１または２に記載の方法であって、標的タンパク質
    をコードするＤＮＡフラグメントがＤＮＡ分子の異なる部分へのそれぞれのフラ
    グメントの挿入によって分離され、ここでＤＮＡ分子が、核からのＤＮＡ、膜結
    合性細胞小器官、プラスミドからのＤＮＡ、コスミドからのＤＮＡ、ウイルスか
    らのＤＮＡ、および人工染色体からのＤＮＡからなる群より選択される方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の方法であって、少なくとも１つのＤＮ
    Ａ分子が天然に遺伝される方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１２に記載の方法であって、少なくとも１つのＤＮ
    Ａ分子が葉緑体の中にある方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１２に記載の方法であって、少なくとも１つのＤＮ
    Ａ分子がミトコンドリアの中にある方法。
  16. 【請求項１６】 請求項４に記載の方法であって、標的タンパク質フラグメ
    ントの再構築がインテイン媒介性のスプライシングを含む方法。
  17. 【請求項１７】 請求項４に記載の方法であって、標的タンパク質フラグメ
    ントの再構築がインテイン媒介性のタンパク質相補を含む方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１に記載の方法であって、標的タンパク質フラグメ
    ントの再構築がタンパク質相補を含む、方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１８に記載の方法であって、タンパク質相補が親和
    性ドメインの存在下で生じる方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１８に記載の方法であって、タンパク質相補が親和
    性ドメインの不在下で生じる方法。
  21. 【請求項２１】 請求項１または２に記載の方法であって、標的タンパク質
    をコードするＤＮＡを分断する工程が、 （ａ）標的タンパク質の１つ以上の潜在的な分断部位領域を決定する工程；お
    よび （ｂ）潜在的な分断部位領域で標的タンパク質をコードするＤＮＡを分断する
    工程、 を含む方法。
  22. 【請求項２２】 請求項２１に記載の方法であって、標的タンパク質の潜在
    的な分断部位が非保存性領域について標的タンパク質の一次アミノ酸配列を分析
    することによって決定される方法。
  23. 【請求項２３】 請求項２１に記載の方法であって、潜在的な分断部位が標
    的タンパク質内へのリンカー挿入のリンカー寛容性によって決定される方法。
  24. 【請求項２４】 請求項２１に記載の方法であって、潜在的な分断部位領域
    が可動性ループの存在について標的タンパク質の構造を分析することによって決
    定される方法。
  25. 【請求項２５】 請求項２１に記載の方法であって、ここで潜在的な分断部
    位領域が標的タンパク質の折り畳みドメイン間のアミノ酸配列の存在について標
    的タンパク質の構造を分析することによって決定される方法。
  26. 【請求項２６】 ＥＰＳＰＳ遺伝子においてＤＮＡ分断部位を含んでいる単
    離されたＤＮＡフラグメント。
  27. 【請求項２７】 請求項２６に記載の単離されたＤＮＡフラグメントであっ
    て、ＤＮＡフラグメントがアミノ酸１〜２３５またはその部分をコードするＤＮ
    Ａ、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０
    、配列番号３１、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号
    ３９からなる群より選択されるＤＮＡフラグメント。
  28. 【請求項２８】 Ｅ.ｃｏｌｉ ＡＬＳ遺伝子においてＤＮＡ分断部位を含
    んでいる単離されたＤＮＡフラグメント。
  29. 【請求項２９】 請求項２８に記載の単離されたＤＮＡフラグメントであっ
    て、ＤＮＡフラグメントが、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およ
    び配列番号１３からなる群より選択されるＤＮＡフラグメント。
  30. 【請求項３０】 トウモロコシＡＬＳ遺伝子においてＤＮＡ分断部位を含む
    単離されたＤＮＡフラグメント。
  31. 【請求項３１】 請求項３０に記載の単離されたＤＮＡフラグメントであっ
    て、ＤＮＡフラグメントが、配列番号１７、配列番号１７、配列番号１８、およ
    び配列番号１９からなる群より選択されるＤＮＡフラグメント。
  32. 【請求項３２】 請求項２６、２８、または３０に記載の単離されたＤＮＡ
    フラグメントであって、前記ＤＮＡフラグメントがインテインまたはその部分を
    コードするＤＮＡに融合されるＤＮＡフラグメント。
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