BR112013023003B1 - Método para produção de açúcares solúveis a partir de material de planta genéticamente modificada e cassete de expressão - Google Patents

Método para produção de açúcares solúveis a partir de material de planta genéticamente modificada e cassete de expressão Download PDF

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Abstract

pré-tratamento e hidrólise consolidados de biomassa que expressa enzimas que degradam a parede celular são fornecidos métodos para pré-tratamento e hidrólise consolidados de plantas engenheiradas geneticamente, que expressam enzimas que degradam a parede celular. são descritos vetores e cassetes de expressão para preparação de plantas transgênicas. são também fornecidas plantas engenheiradas para expressarem uma ou mais enzimas que degradam a parede celular usando vetores e cassetes de expressão da invenção.

Description

[0001] Esse pedido reivindica o benefício do pedido provisório norte-americano de número 61/449.769, depositado em 07 de março de 2011, o qual é aqui incorporado por referência, como se fosse completamente apresentado.
[0002] A listagem de sequências depositada eletronicamente, depositada com esse pedido, intitulada “Listagem de Sequências”, criada em 07 de março de 2012, e tendo um tamanho de arquivo de 620.037 bytes, é aqui incorporada por referência como se fosse completamente apresentada.
Campo da invenção
[0003] A invenção se refere a métodos para produção de açúcares solúveis a partir de plantas que expressam enzimas que degradam a parede celular, a plantas transgênicas, a vetores de expressão, a ácidos nucléicos e a proteínas que degradam a parede celular.
Histórico
[0004] A biomassa lignocelulósica é uma matéria-prima atraente para a produção de biocombustíveis, produtos químicos e bioprodutos. A biomassa lignocelulósica fornece muitos benefícios, incluindo disponibilidade abundante, potencial baixo custo, sustentabilidade, e o fato de que ela não é ordinariamente consumida por seres humanos como uma fonte de alimento (Langeveld JWA et al. 2010 Crop Sei 50: S131-S151). Para converter biomassa lignocelulósica em energia e produtos bioquímicos renováveis, bioprocessos convertem uma porção da biomassa lignocelulósica em açúcares simples, os quais são convertidos em biocombustíveis ou em outros bioprodutos.
[0005] O custo da produção de açúcar através de conversão biológica é caro devido aos custos do pré-tratamento e da hidrólise enzimática (Alvira P et al. 2010 Bioresour Technol 101: 4851; Abramson M et al. 2010 Plant Science 178: 61; Daniel Klein-Marcuschamer et al. Biotechnol. Bioeng.2012; 109:1083). As paredes celulares das plantas são recalcitrantes em relação à hidrólise enzimática porque a heterogeneidade, a composição química e as características estruturais dos polissacarídeos da parede celular as tornam inacessíveis às enzimas hidrolíticas (Zhu L et al. 2008 Bioresour Technol 99: 3817). Por essa razão, a hidrólise enzimática exige um pré-tratamento que possa tornar acessíveis as paredes celulares das plantas. As tecnologias de pré-tratamento predominantes na indústria, tipicamente, empregam condições drásticas, tais como elevadas temperaturas e pHs extremos (Wyman CE et al. 2005 Bioresour Technol 96:1959; Mosier N et al. 2005 BioresourTechnol 96: 673). Essas condições provocam a degradação de açúcares e resultam em reduzidos rendimentos em açúcares e na formação de compostos de fermentação tóxicos, exigindo etapas adicionais caras para desintoxicação, separação e neutralização, assim como equipamento de caro capital antecipado.
[0006] Os custos de pré-tratamento, os elevados custos de cargas de enzimas exógenas, a baixa velocidade de hidrólise e o suprimento limitado de enzimas são também preocupações para a comercialização de processos envolvendo a biomassa lignocelulósica.
Sumário
[0007] Em um aspecto, a invenção se refere a um método para produção de açúcares solúveis a partir de material de planta geneticamente modificado. O método inclui o pré- tratamento por mistura do material de planta genéticamente modificado com uma formulação de formação de polpa para formar uma mistura. O material de planta genéticamente modificado inclui uma primeira sequência de polinucleotídeo, que codifica uma primeira proteína selecionada a partir do grupo consistindo em: uma xilanase, uma endoglicanase, uma exoglicanase, uma feruloil esterase, uma xilanase modificada com inteína, uma endoglicanase modificada com inteína, uma exoglicanase modificada com inteína e uma feruloil esterase modificada com inteína. O método também inclui o fornecimento de condições de hidrólise.
[0008] Em um aspecto, a invenção se refere a uma planta geneticamente modificada. A planta geneticamente modificada inclui uma primeira sequência de polinucleotídeo, que codifica uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90 % de identidade em relação a uma primeira sequência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11.
[0009] Em um aspecto, a invenção se refere a um cassete de expressão. O cassete de expressão inclui uma primeira sequência de polinucleotídeo capaz de se hibridizar sob condições de rigor moderado com um ácido nucléico consistindo em uma primeira sequência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39 [P77853:S158- 30-108-35]. O cassete de expressão também inclui uma segunda sequência de polinucleotídeo capaz de se hibridizar sob condições de rigor moderado com um ácido nucléico consistindo em uma segunda sequência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 e SEQ ID: 43. A SEQ ID NO selecionada como a primeira sequência de referência é diferente da SEQ ID NO selecionada como a segunda sequência de referência.
[0010] Em um aspecto, a invenção se refere a um cassete de expressão. O cassete de expressão inclui uma sequência de polinucleotídeo capaz de se hibridizar sob condições de rigor moderado com um ácido nucléico consistindo em uma sequência de referência selecionada a partir do grupo de sequências consistindo em: SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 e SEQ ID NO: 62.
[0011] Em um aspecto, a invenção se refere a um vetor de expressão. O vetor de expressão inclui uma sequência de polinucleotídeo capaz de se hibridizar sob condições de rigor moderado a ácido nucléico consistindo em uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82 e SEQ ID NO: 83.
Breve descrição dos desenhos
[0012] A seguinte descrição detalhada das modalidades preferidas da presente invenção será melhor entendida quando lida em conjunto com os desenhos apensos.Para a finalidade de ilustração da invenção, são mostradas nos desenhos as modalidades que são atualmente preferidas. No entanto, entende-se que a invenção não está limitada às disposições e às instrumentalidades precisas mostradas. Nos desenhos: - A FIG. 1 é um fluxograma de processo ilustrando as etapas de pré-tratamento e hidrólise consolidados de biomassa de planta que expressa enzimas que degradam a parede celular. - As FIGs 2A-2B ilustram os rendimentos em glicose (FIG. 2A) e em xilose (FIG. 2B) a partir de uma planta transgênica pré-tratada, que expressa xilanase A (XynA.2015.05) e de uma planta de controle transgênica carecendo de xilanase A (TGC.4000.12), depois de hidrólise enzimática com coquetel de enzimas #5 (FCt; cinza (barra do meio para cada conjunto de três)); ou o coquetel de enzimas #5 carecendo de xilanase A (Ct-Xyn; listras diagonais (direita)); ou sem enzimas (NCt; branco (esquerda)). - As FIGs 3A-3B ilustram os rendimentos em glicose (FIG. 3A) e em xilose (FIG. 3B) a partir de uma planta transgênica pré-tratada, que expressa xilanase B (XynB. 2063.17) e de uma planta de controle de tipo selvagem pré-tratada (AxB), depois de hidrólise enzimática com coquetel de enzimas #1 (FCt; cinza (meio)); ou o coquetel enzimático #1 carecendo de xilanase (Ct-Xyn; listras diagonais (direita)), ou sem enzimas (NCt; branco (esquerda)). - A FIG. 4 ilustra os rendimentos em glicose a partir de plantas transgênicas pré-tratadas, que expressam endoglicanase (EG) seguindo a hidrólise enzimática com o coquetel de enzimas #1 (FCt; cinza (meio)), ou o coquetel de enzimas #1 carecendo de endoglicanase (Ct-EG (direita)), ou sem enzimas (NCt; branco (esquerda)). FIG. 4A ilustra o rendimento em glicose a partir de plantas transgênicas, que expressam endoglicanase A (EGA.2049.02 e EGA.2049.10) e de uma planta de controle transgênica carecendo de endoglicanase (TGC.4000.12).FIG. 4B ilustra o rendimento em glicose a partir de uma planta transgênica, que expressa endoglicanase B (EGB2042.03) e de uma planta de controle transgênica carecendo de endoglicanase (TGC.2004.8.02). - As FIGs 5A-5B ilustram os resultados de hidrólise com plantas transgênicas, que expressam múltiplas proteínas. As FIGs 5A e 5C ilustram os rendimentos em glicose, e as FIGs 5B e 5D ilustram os rendimentos em xilose, a partir de plantas transgênicas de teste e das plantas de controle transgênicas com o coquetel #1. As FIGs 5A e 5B ilustram os resultados com 1) plantas transgênicas de pilha dupla (double stack) XynA/AccA/B.2096.05 e XynA/AccA/B.2096.01, que expressam xilanase A (XynA) e enzimas acessórias (Acc) e 2) uma planta de controle transgênica TGC.2004.8.02, em tratamentos com um coquetel de enzimas completo (FCt; cinza escuro (meio)), um coquetel completo carecendo de xilanase (FCt-Xyn; barras listradas (direita)) e sem enzimas (NCt; barras brancas (esquerda)). As FIGs 5C e 5D ilustram os resultados com 1) uma planta transgênica EGA/XynA.2242.09, que expressa XynA e EGA e 2) uma planta de controle transgênica TGC.4000.12, em tratamentos com um coquetel de enzimas completo (FCt; cinza escuro (barra esquerda das quatro para cada amostra)), um coquetel completo carecendo de xilanase (Ct-Xyn; listras diagonais (segunda a partir da esquerda)), um coquetel completo carecendo de endoglicanase (Ct-EG; branco (terceira a partir da esquerda)) e um coquetel completo carecendo de xilanase e de endoglicanase (Ct-Xyn- EG; quadriculado (quarta a partir da esquerda)). - As FIGs 6A-6B ilustram os rendimentos em glicose e em xilose, respectivamente, a partir dos caules e das folhas (stover) da planta de controle de tipo selvagem pré-tratada AxB e as plantas de milho transgênico XynB/EGA/CBHB.2349.56, XynB/EGA/CBHB.2349.55 e XynB/EGA/CBHA.2345.116, que expressam proteínas de pilha tripla. Os rendimentos foram medidos seguindo a hidrólise enzimática com o coquetel de enzimas Accelerase® 1500/XY (FCt; barras pretas (direita)) comparado a um tratamento de controle carecendo do coquetel de enzimas (NCt; barras cinza (esquerda)). - As FIGs 7A-7B ilustram os rendimentos em glicose e em xilose, respectivamente, a partir de plantas transgênicas. A FIG. 7A mostra os rendimentos em glicose a partir de plantas de grama de crescimento rápido (switchgrass) transgênicas pré-tratadas, que expressam xilanase A (XynA.pv2015.3c, XynA.pv2015.4c) e de uma planta de grama de crescimento rápido de tipo selvagem pré-tratada (Alamo) seguindo a hidrólise enzimática com o coquetel de enzimas #1 (FCt; cinza (meio)); o coquetel #1 carecendo de xilanase (Ct-Xyn; listras diagonais (direita)); e um tratamento de controle carecendo do coquetel de enzimas (NCt; branco (esquerda)). A FIG. 7B mostra os resultados de rendimentos em xilose a partir de uma planta transgênica de primeira geração pré-tratada, que expressa xilanase A (XynA.2015.05.T0), de uma planta transgênica de segunda geração, que expressa xilanase A (XynA.2015.05.TI) e de uma planta transgênica pré-tratada carecendo de xilanase (TGC.4000.11), seguindo a hidrólise enzimática com o coquetel de enzimas #1 (FCt; cinza (meio)); o coquetel #1 carecendo de xilanase (Ct-Xyn; listras diagonais (direita)); e um tratamento de controle carecendo do coquetel de enzimas (NCt; branco (esquerda)). - As FIGs 8A-8B ilustram os rendimentos em glicose e em xilose, respectivamente, a partir de duas plantas de grama de crescimento rápido transgênicas pré-tratadas, que expressam xilanase A (XynA.pv2015.3c e XynA.pv2015.4c) comparadas a uma planta de grama de crescimento rápido não transgênica de controle (Alamo), seguindo a hidrólise enzimática com o coquetel de enzimas #1 (FCt; cinza (meio)); o coquetel de enzimas #1 carecendo de xilanase (Ct-Xyn; listras diagonais (direita)) e um tratamento de controle carecendo do coquetel de enzimas (NCt; branco (esquerda)). - As FIGs 9A-9B ilustram os rendimentos em glicose e em xilose, respectivamente, a partir de uma planta transgênica pré-tratada (iXynA.2229.110), que expressa XynA modificada com inteína (iXynA), e de uma planta de controle de tipo selvagem pré-tratada (AxB) seguindo a hidrólise enzimática com o coquetel de enzimas #l(FCt; cinza (meio)); coquetel de enzimas #1 carecendo de xilanase (Ct-Xyn; listras diagonais (direita)) e um tratamento de controle carecendo do coquetel de enzimas (NCt; branco (direita)). - A FIG. 10 ilustra o decurso de tempo do rendimento em glicose a partir da hidrólise enzimática de uma planta transgênica pré-tratada, que expressa xilanase A (XynA.2015.5TI; triângulo fechado), e de uma planta transgênica pré-tratada, que expressa xilanase B (Xyn B.2063.17; círculo fechado) versus uma planta de controle transgênica (TGC.2004.8.02; quadrado aberto) usando o coquetel de enzimas #1. - A FIG. 11 ilustra o decurso de tempo de rendimento em glicose a partir da hidrólise enzimática de uma planta transgênica pré-tratada (EGA.2049.10) e de um controle transgênico pré-tratado (TGC.4000.11) usando o coquetel de enzimas #1 (EGA.2049.10.FCt, quadrado fechado; TGC.4000.11.FCt, diamante aberto) e o coquetel de enzimas #1 carecendo de endoglicanase (EGA.2049.10.Ct-EG, triângulo fechado; TGC.4000.11.Ct-EG, círculo aberto). - As FIGs 12A-12B ilustram os decursos de tempo do rendimento em glicose a partir da hidrólise enzimática de uma planta transgênica pré-tratada (EGA/XynA.2242.09) e de uma planta de controle transgênica pré-tratada (TGC.4000.11) usando o coquetel de enzimas completo (EGA/XynA.2242.09.FCt, quadrado fechado; TGC.4000.11 .FCt, diamante aberto) comparadas a tratamentos usando o coquetel de enzimas completo carecendo de endoglicanase (EGA/XynA.2242.09.Ct-EG, círculo fechado; TGC.4000.11.Ct-EG, círculo aberto na FIG. 12A) e o coquetel de enzimas completo carecendo de xilanase (EGA/XynA.2242.09.Ct-Xyn, círculo fechado; TGC.4000.11.Ct-Xyn, círculo aberto). - As FIGs 13A-13B ilustram os decursos de tempo dos rendimentos em glicose e em xilose, respectivamente, a partir de uma planta transgênica pré-tratada, que expressa xilanase A e feruloil esterase B (XynAZAccB.2092.103) e de uma planta de controle transgênica pré- tratada (TGC.4000.11) seguindo a hidrólise enzimática com o coquetel de enzimas completo (XynA/AccB.2092.103.FCt, quadrado fechado; TGC.4000.11.FCt, diamante aberto) e o coquetel de enzimas completo carecendo de xilanase (XynA/AccB.2092.103.Ct- Xyn, triângulo fechado; TGC.4000.11.Ct-Xyn, círculo aberto). - A FIG. 14 ilustra os rendimentos em glicose a partir da hidrólise enzimática de planta transgênica pré-tratada, que expressa as seguintes proteínas: xilanase B (XynB.2063.17), endoglicanase (EGA.2049.10), xilanase A e feruloil esterase B (XynA/Acc.B.2092.103), xilanase A e endoglicanase (EGA/XynA.2242.09), xilanase A modificada com inteína (iXynA.2229.110), comparada a uma planta de controle não transgênica (AxB) e a uma planta de controle transgênica carecendo de enzimas (TGC.4000.11). Os pré-tratamentos foram realizados em temperaturas de 65°C (PT_65) e de 75°C (PT_75). A carga enzimática inclui 0,2 mL de Accellerase® 1500 ou 0,1 ml_ de Accellerase® XY por grama de biomassa e 0,05 μM de β-glicosidase (BGL). As barras acima de cada um dos conjuntos de pré- tratamento em PT_65 e em PT_75 apresentam dados para as plantas transgênica e de controle da esquerda para direita, como se segue: AxB; TGC.4000.11; XynA.2015.05TI; XynB.2063.17; XynA/AccB.2092.103; iXynA.2229.110; EGA.2049.10 eXynA/EGA.2242.09. - A FIG. 15 ilustra os rendimentos em glicose a partir da hidrólise enzimática de grama de crescimento rápido transgênica pré-tratada (EGC.2253.4b, círculo fechado) e de uma grama de crescimento rápido de tipo selvagem (Alamo, quadrado aberto) com o coquetel de enzimas #5. Temperaturas de pré-tratamento: 65°C, 75°C e 95°C. - As FIGs 16A-16B ilustram um efeito de uma temperatura de pré-tratamento e do tempo sobre os rendimentos em glicose (FIG. 16A) e em xilose (FIG. 16B), a partir da hidrólise enzimática de uma planta transgênica pré-tratada, que expressa endoglicanase e xilanase A (EGA/XynA.2342.105; barras pretas (direita)) e de uma planta de controle pré-tratada (TGC.2342.01; barras cinzas (esquerda)). - As FIGs 17A-17B ilustram um efeito de uma temperatura de pré-tratamento sobre os rendimentos em glicose (FIG. 17A) e em xilose (FIG. 17B), a partir das plantas transgênicas EGA/XynA.2242.09.01 e EGA/XynA.2242.09.07, que expressam endoglicanase A e xilanase A, e as plantas de controle: de tipo selvagem AxB e transgênica TGC.4000.11. - A FIG. 18 ilustra um efeito de redução de carga de enzimas externas sobre os rendimentos em glicose a partir das plantas transgênicas pré-tratadas XynA.2015.05T1 (círculo fechado), XynB.2063.17 (triângulo fechado), e planta de controle TGC.2004.8.04 (quadrado fechado), depois de hidrólise com as cargas enzimáticas decrescentes: coquetel #1 completo (FCt), coquetel #1 75 % completo (0,75 FCt), coquetel #1 50 % completo (0,50 FCt), coquetel #1 25 % completo (0,25 FCt), coquetel #1 10 % completo (0,10 FCt) e sem enzimas (0 FCt). - A FIG. 19 ilustra um efeito de redução das cargas de enzimas externas sobre os rendimentos em glicose a partir das plantas transgênicas XynE/EGC/CBHA.2339.03, XynE/EGC/CBHA.2339.04 e XynE/EGC/CBHA.2339.05, e da planta de controle BxA. O pré-tratamento foi realizado usando bissulfito de amónio e carbonato de amónio 0,17 M (pH 8,1) à 75°C, em uma razão de líquido para sólido igual a 10, durante 16 horas. A hidrólise enzimática foi conduzida foi conduzida em teor de sólidos de aproximadamente 2 % com sem enzimas (NCt; branco (esquerda)), coquetel 20 % completo (0,2 FCt; cinza (meio)) e coquetel completo de Accellerase®1500/XY em 0,2ml_ / 0,1 mL de por grama de caules e folhas (FCt; preto (direita)) à 50°C e pH 5,0, durante um período de 3 dias. - As FIGs 20A-20B ilustram os rendimentos em glicose e em xilose, respectivamente, a partir de plantas pré-tratadas, que expressam xilanase A e endoglicanase (XynA/EGA.2309.54 e XynA/EGA2309.107), comparadas a uma planta de controle não transgênica pré-tratada (BxA), depois da hidrólise enzimática com uma carga completa do coquetel de enzimas Accelerase®1500/XY (FCt; preto (direita)), uma carga de 20 % do coquetel (0,2 FCt; cinza (meio na FIG. 20A e direita na FIG. 20B)) e sem enzimas (NCt; branco (esquerda na FIG. 20A)). - As FIGs 21A-21B ilustram um efeito de redução de cargas de enzimas externas sobre os rendimentos em glicose (FIG. 21 A) e em xilose (FIG. 21B) a partir das plantas transgênicas EGA/XynA.2242.09.16, CBHA.2069.01.03 e da planta de controle TGC.4000.11, seguindo a hidrólise enzimática com o coquetel completo em 0,2 mL de Accellerase® 1500 por grama de caules e folhas + 0,1 ml_ de Accellerase® XY por grama de caules e folhas (FCt;), coquetel 80 % completo: 0,16 ml_ de Accellerase® 1500 por grama de caules e folhas + 0,08 ml_ de Accellerase® XY por grama de caules e folhas (0,8 FCt), coquetel 60 % completo: 0,12 ml_ de Accellerase® 1500 por grama de caules e folhas + 0,06 ml_ de Accellerase® XY por grama de caules e folhas (0,6 FCt), coquetel 40 % completo: 0,08 ml_ de Accellerase® 1500 por grama de caules e folhas + 0,04 ml_ de Accellerase® XY por grama de caules e folhas (0,4 FCt), coquetel 20 % completo: 0,04 ml_ de Accellerase® 1500 por grama de caules e folhas + 0,02 ml_ de Accellerase® XY por grama de caules e folhas (0,2 FCt) e sem enzimas (0 FCt). - A FIG. 22 ilustra a produção de etanol a partir de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) de plantas transgênicas pré-tratadas EGA.2049.10 e EGA/XynA.2242.09 contra plantas controle usando 1) o coquetel de enzimas Accellerase® 1500 e Accellerase® XY; e 2) a cepa de levedura Saccharomyces cerevisiae D5A. - A FIG. 23 ilustra a solubilização de biomassa com base na perda de peso em uma planta transgênica, que expressa exoglicanase CBHA (CBHA.2069.3.17; branco) e uma planta de controle de tipo selvagem (AxB; cinza). - As FIGs 24A-24B ilustram o rendimento em ácido acético (HAc) a partir de uma planta de controle não transgênica (AxB; FIG. 24A) e de uma planta transgênica, que expressa exoglicanase CBHA (CBHA.2063.3.17; FIG. 24B). Os tratamentos foram realizados à 75°C durante 16 horas (branco (esquerda)); 85°C durante 7 horas (barras listradas (meio)) e 95°C (quadriculado (direita)). - As FIGs 25A-25B ilustram o rendimento nos produtos de degradação de açúcares hidróxi- metil-furfural (HMF) e furfural, a partir de uma planta de controle não transgênica (AxB; FIG. 25A) e de uma planta transgênica, que expressa exoglicanase CBHA (CBHA.2063.3.17). Os tratamentos, conforme indicados por barras brancas, listradas ou quadriculadas, foram como se segue, da esquerda para direita: branco, HMF_75°C durante 16 horas; listrado, HMF_85°C durante 7 horas; quadriculado, HMF_95°C durante 16 horas; listrado, Furfural_95°C durante 16 horas. - A FIG. 26 ilustra o rendimento em xilose a partir de uma planta transgênica, que expressa xilanase B isoladamente (XynB.2063.15), de uma planta transgênica, que expressa xilanase A e duas enzimas acessórias A e B (XynA/AccA/B.2096.1) e de uma planta de controle não transgênica (WT AxB), seguindo o pré-tratamento com bissulfito de amónio e carbonato de amónio 0,17 M (BSC; pH 8,1) e auto-hidrólise. O rendimento em xilose foi avaliado para xilose como um monômero (preto (direita)) e para xilose como oligossacarídeo (cinza (esquerda)). - A FIG. 27 ilustra os rendimentos em xilose a partir de duas plantas transgênicas, que expressam xilanase B, endoglicanase e CBHB (XynB/EGA/CBHB.2349.56 e XynB/EGA/CBHB.2349.55), de uma planta transgênica, que expressa xilanase B, endoglicanase e CBHA (XynB/EGA/CBHA.2345.116) e de uma planta de controle não transgênica (AxB), seguindo o pré-tratamento com bissulfito de amónio 0,17 M e carbonato de amónio 0,165 M (BSC; pH 8,1) e auto-hidrólise. - As FIGs 28A-28B ilustram os rendimentos em glicose e em xilose, respectivamente, a partir de plantas transgênicas pré-tratadas usando Accellerase® XY. EGA/XynA.2242.09T1 (círculo fechado) expressou simultaneamente endoglicanase e xilanase A, e a planta de controle transgênica era TGC.4000 (quadrado fechado). - As FIGs 28C-28D mostram, respectivamente, os rendimentos em glicose e em xilose a partir de XynB/EGA/CBHB.2349.55 (círculo aberto), XynB/EGA/CBHB.2349.229 (triângulo fechado, apontado para cima), e XynB/EGA/CBHB.2349.56 (triângulo fechado, apontado para baixo), cada uma das quais expressou simultaneamente endoglicanase A, xilanase B e celobioidrolase B, e iXynA.2329.14, que expressou xilanase A modificada com inteína e uma planta e controle de tipo selvagem AxB.
Descrição detalhada das modalidades preferidas
[0013] Certa terminologia é usada na seguinte descrição somente por conveniência e não é limitante. As palavras “direita”, “esquerda”, “topo” e “fundo” designam direções nos desenhos, às quais é feita referência. Os artigos “um” e “uma”, conforme usados nas reivindicações e nas porções correspondentes do relatório descritivo, são definidos como incluindo um ou mais do item referenciado, a menos se afirmado especificamente de outra maneira. Essa terminologia inclui as palavras acima especificamente mencionadas, derivados das mesmas, e palavras de importância similar. A expressão “pelo menos um(a)” seguida por uma lista de dois ou mais itens, tais como “A, B ou C”, significa qualquer um individualmente de A, B ou C, assim como qualquer combinação dos mesmos.
[0014] As modalidades aqui fornecem tecnologias para expressar um portfolio de proteínas que degradam a parece celular (CWD) em uma planta. As proteínas CWD podem ser enzimas CWD ou formas modificadas das enzimas CWD.As formas modificadas podem ser proteínas CWD modificadas com inteína.A planta pode ser milho, sorgo, grama de crescimento rápido ou outra planta. As modalidades aqui propiciam a colheita de biomassa de plantas com proteínas CWD in planta, para uso como uma matéria-prima na produção de açúcares. A expressão de enzimas in planta usa a planta como uma “fábrica” ao invés de fermentação microbiana, para produzir enzimas CWD industriais. Essa estratégia tem uma vantagem de entregar as proteínas diretamente nas matérias-primas de biomassa para produção de açúcares fermentáveis.A biomassa de plantas transgênicas com características hidrolíticas podem não necessitar de pré-tratamentos drásticos para aperfeiçoar a acessabilidade à parede celular de celulose às enzimas exógenas.A expressão de diferentes classes de proteínas CWD em uma única planta pode criar uma plataforma de açúcares de baixo custo para produção de biocombustíveis e de produtos bioquímicos. As modalidades aqui fornecem métodos para produção de açúcares solúveis usando um pré-tratamento químico brando de biomassa lignocelulósica, derivada de plantas geneticamente modificadas para incluir um ou mais tipos de uma proteína CWD.
[0015] Uma modalidade fornece um método para produção de açúcares solúveis a partir de material de planta geneticamente modificado. O método pode incluir o pré-tratamento do material de planta geneticamente modificado através da mistura com uma formulação de formação de polpa, para formar uma mistura. O material de planta geneticamente modificado pode incluir uma primeira sequência de polinucleotídeo, que codifica uma primeira proteína. A primeira proteína pode ser uma enzima CWD.A primeira proteína pode ser uma enzima CWD modificada com inteína.A primeira proteína pode ser uma xilanase, uma endoglicanase, uma exoglicanase, uma feruloil esterase, uma xilanase modificada com inteína, uma endoglicanase modificada com inteína, uma exoglicanase modificada com inteína e uma feruloil esterase modificada com inteína. A primeira proteína pode ser capaz de hidrolisar um componente do material de planta geneticamente modificado. Ser capaz de hidrolisar um componente significa que a primeira proteína catalisa a hidrólise do componente sob condições de hidrólise. No caso de uma primeira proteína modificada com inteína, ser capaz de hidrolisar um componente significa que, depois que a inteína tiver se emendado a partir do peptídeo, a proteína pode hidrolisar o componente sob condições de hidrólise. O método pode incluir adicionalmente o fornecimento de condições de hidrólise. As condições de hidrólise podem ser adequadas para hidrolisar o componente.
[0016] O material de planta geneticamente modificado pode incluir adicionalmente uma segunda sequência de polinucleotídeo, que codifica uma segunda proteína.A segunda proteína pode ser uma proteína CWD.A segunda proteína pode ser uma proteína CWD modificada com inteína.A segunda proteína pode ser uma xilanase, uma endoglicanase, uma exoglicanase, uma feruloil esterase, uma xilanase modificada com inteína, uma endoglicanase modificada com inteína, uma exoglicanase modificada com inteína e uma feruloil esterase modificada com inteína. A proteína selecionada como a segunda proteína pode ser diferente da proteína selecionada como a primeira proteína. A segunda proteína pode ser capaz de hidrolisar um componente do material de planta geneticamente modificado. Ser capaz de hidrolisar um componente significa que a segunda proteína catalisa a hidrólise do componente sob condições de hidrólise. No caso de uma segunda proteína modificada com inteína, ser capaz de hidrolisar um componente significa que, depois que a inteína tiver se emendado a partir do peptídeo, a proteína pode hidrolisar o componente sob condições de hidrólise.
[0017] O material de planta geneticamente modificado pode incluir adicionalmente uma terceira sequência de polinucleotídeo, que codifica uma terceira proteína. A terceira proteína pode ser uma proteína CWD. A terceira proteína pode ser uma proteína CWD modificada com inteína. A terceira proteína pode ser uma xilanase, uma endoglicanase, uma exoglicanase, uma feruloil esterase, uma xilanase modificada com inteína, uma endoglicanase modificada com inteína, uma exoglicanase modificada com inteína e uma feruloil esterase modificada com inteína. A proteína selecionada como a terceira proteína pode ser diferente da proteína selecionada como a primeira proteína. A proteína selecionada como a terceira proteína pode ser diferente da proteína selecionada como a segunda proteína. A terceira proteína pode ser capaz de hidrolisar um componente do material de planta geneticamente modificado. Ser capaz de hidrolisar um componente significa que a terceira proteína catalisa a hidrólise do componente sob condições de hidrólise. No caso de uma terceira proteína modificada com inteína, ser capaz de hidrolisar um componente significa que, depois que a inteína tiver se emendado a partir do peptídeo, a proteína pode hidrolisar o componente sob condições de hidrólise.
[0018] Material de planta geneticamente modificado se refere a uma planta transgênica, à progenia de uma planta transgênica, a um descendente de uma planta transgênica ou a uma parte de qualquer um dos anteriores. Material de planta geneticamente modificado pode incluir uma enzima que degrade a parede celular, que não ocorra naturalmente na planta, ou um gene que codifique a mesma. O material de planta geneticamente modificado pode ser uma planta transgênica que expresse uma proteína CWD, ou qualquer parte da planta transgênica. O material de planta geneticamente modificado pode ser qualquer planta transgênica que expresse uma forma modificada de uma proteína CWD, ou qualquer parte da planta transgênica. A planta transgênica pode ser de qualquer tipo de planta. O tipo de planta de planta transgênica pode ser, mas não está limitado a, milho, beterraba açucareira, cana de açúcar, sorgo, grama de crescimento rápido, miscanto, eucalipto, salgueiro ou álamo. O material de planta geneticamente modificado pode ser uma planta transgênica inteira ou partes da planta. As partes podem ser, mas não estão limitadas as, folhas, troncos, flores, brotos, pétalas, ovários, frutos ou sementes. O material de planta engenheirado pode ser calo a partir de uma planta transgênica. O material de planta geneticamente modificado pode ser regenerado a partir de partes de uma planta transgênica ou de plantas transgênicas. O material de planta geneticamente modificado pode ser um produto de cruzamento sexuado de uma primeira planta transgênica com uma segunda planta transgênica ou com uma planta não transgênica, em que a planta produto retenha uma sequência de polinucleotídeo introduzida na primeira planta transgênica. A planta transgênica pode ser qualquer uma das plantas transgênicas fornecidas aqui.A planta transgênica pode incluir qualquer vetor, cassete de expressão ou ácido nucléico isolado ou fragmento dos mesmos aqui.
[0019] A mistura de material de planta geneticamente modificado com uma formulação de formação de polpa pode ser feita por qualquer combinação do material de planta geneticamente modificado com a formulação de formação de polpa. A mistura pode ser feita por agitação.
[0020] A formulação de formação de polpa pode ser uma substância que decomponha a lignina, que liga as fibras de lignocelulose dentro do material de planta lignocelulósico em conjunto. A substância pode decompor a lignina sem degradar seriamente as fibras de lignocelulose. O pré-tratamento pode conduzir a uma liberação parcial de enzimas expressas nas plantas modificadas geneticamente e à degradação parcial de lignina dentro do material de planta lignocelulósico.
[0021] O método pode incluir a ativação de uma proteína CWD antes, durante ou depois do pré-tratamento. O método pode incluir a ativação de uma proteína CWD antes, durante ou depois do fornecimento das condições de hidrólise. A proteína CWD sendo ativada pode ser uma primeira proteína, uma segunda proteína ou uma terceira proteína, ou qualquer enzima de processamento de lignocelulose adicional. Uma proteína CWD pode ser modificada para incluir uma inteína.A inteína pode ser fundida à enzima CWD em uma extremidade da enzima ou dentro da enzima. A inteína pode ser induzível para se emendar por fornecimento de condições de indução. As condições de indução podem ser uma temperatura particular da mistura. As condições de indução pode ser uma temperatura fornecida antes, durante ou depois de uma das etapas de pré-tratamento ou de fornecimento de hidrólise. Enzimas modificadas com inteína e condições para indução de emenda (splicing) das inteínas, que poderiam ser usadas como condições de ativação, foram descritas no Pedido Norte-Americano de número 10/886,393 depositado em 07 de julho de 2004, e no PCT/USIO/55746 depositado em 05 de novembro de 2010, e no PCT/USIO/55669 depositado em 05 de novembro de 2010 e no PCT/USIO/55751 depositado em 05 de novembro de 2010, os quais são aqui incorporados por referência, como se fossem completamente apresentados.
[0022] O componente pode ser qualquer porção desejada para processamento. O componente pode ser material lignocelulósico. O componente pode ser o substrato para qualquer proteína CWD listada aqui. O componente pode ser o substrato para uma xilanase, uma endoglicanase, uma exoglicanase, uma feruloil esterase. O componente pode ser uma porção incluindo um substrato para qualquer proteína CWD listada aqui. O componente pode ser uma porção incluindo um substrato para uma xilanase, uma endoglicanase, uma exoglicanase, uma feruloil esterase.
[0023] O método também pode incluir a adição de outro material de planta antes, durante ou depois da mistura, do pré-tratamento ou do fornecimento de condições de hidrólise. Outro material de planta pode ser qualquer biomassa de planta, material celulósico ou lignocelulósico diferente do material de planta geneticamente modificado. O outro material de planta pode ser a partir de biorrefinarias. Outro material de planta pode inclui resíduos de florestas e de agricultura. Os resíduos de florestas e de agricultura podem ser, mas não estão limitados a, caules e folhas de milho, bagaços, palha de trigo, madeira residual, aparas de florestas, papel residual e resíduos sólidos municipais (MSW). Outro material de planta pode ser qualquer cultura de energia. A cultura de energia pode ser, mas não está limitada a,grama de crescimento rápido, sorgo, beterraba açucareira, cana de açúcar, miscanto e álamo.
[0024] Uma sequência de polinucleotídeo, que codifica uma primeira proteína, uma segunda proteína, uma terceira proteína ou qualquer enzima adicional pode ser operavelmente conectada a uma sequência reguladora. Nesse contexto, operavelmente conectada significa que o elemento regulador lhe confere função à sequência de polinucleotídeo. No caso de um elemento regulador que seja um promotor, o promotor é capaz de controlar a expressão a partir da sequência de polinucleotídeo, quando eles estiverem operavelmente conectados. No caso de um elemento regulador que seja um terminador, o terminador é capaz de terminar a transcrição a partir de sequência de polinucleotídeo. Exemplos não limitantes de elementos reguladores são fornecidos abaixo.
[0025] Pelo menos uma da primeira proteína, da segunda proteína ou da terceira proteína pode ser, mas não está limitada a, uma enzima selecionada a partir de XynA: Beta-1,4- xilanase 229B a partir de Dictyoglomus thermophilum (Acesso Uniprot P77853); XynB: Endo-1,4-beta-xilanase a partir de Thermomyces lanuginosus (Acesso Uniprot 043097); EGA: Endo-beta-1,4-endoglicanase a partir de Nasutitermes takasagoensis (Acesso Uniprot 077044); EGB: Endo-beta-1,4-endoglicanase a partir de Acidothermus cellulolyticus (Acesso Uniprot P54583); AccA: Feruloil esterase A a partir de Aspergillus niger (Acesso Uniprot 042807); AccB: Feruloil esterase B a partir de Aspergillus niger (Número de Acesso Uniprot Q8WZI8); AccA/B: Feruloil esterase A e Feruloil esterase B a partir de Aspergillus niger, EGC: Endo-beta-1,4-endoglicanase a partir de Rhodothermus marinus (Acesso Uniprot 033897); P40942: Beta-1,4-xilanase a partir de Clostridium stercorarium F9 (Número de Acesso Uniprot P40942); P40943: Beta-1,4-xilanase a partir de Geobacillus stearothermophilus T-6 (Bacillus stearothermophilus-, Número de Acesso Uniprot P40943); 030700: Beta-1,4-xilanase a partir de Bacillus sp. NG-27 (Número de Acesso Uniprot 030700); CBHA: celobioidrolase A a partir de Clostridium thermocellum (Número de Acesso Uniprot 068438); CBHB: celobioidrolase B (SYT BD22308); ou XynE: xilanase (EU591743).
[0026] A primeira proteína pode incluir, consistir essencialmente em ou consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade em relação a uma sequência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1[WT P77853], SEQ ID NO: 2 [AnfaeA], SEQ ID NO: 3 [AnfaeB], SEQ ID NO: 4 [NtEGm], SEQ ID NO: 5 [EU591743], SEQ ID NO: 6 [043097], SEQ ID NO: 7 [P77853:T134-100-101], SEQ ID NO: 8 [P77853:S158-30-108-35], SEQ ID NO: 9 [033897], SEQ ID NO: 10 [068438] e SEQ ID NO: 11 [P54583], A primeira proteína pode incluir, consistir essencialmente em ou consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade em relação à sequência de referência de SEQ ID: 12 [BD22308].
[0027] A segunda proteína pode incluir, consistir essencialmente em ou consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade em relação a uma segunda sequência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1[WT P77853], SEQ ID NO: 2 [AnfaeA], SEQ ID NO: 3 [AnfaeB], SEQ ID NO: 4 [NtEGm], SEQ ID NO: 5 [EU591743], SEQ ID NO: 6 [043097], SEQ ID NO: 7 [P77853:T134-100-101], SEQ ID NO: 8 [P77853:S158- 30-108-35], SEQ ID NO: 9 [033897], SEQ ID NO: 10 [068438] e SEQ ID NO: 11 [P54583]. A segunda proteína pode incluir, consistir essencialmente em ou consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade em relação à sequência de referência de SEQ ID: 12 [BD22308].
[0028] A terceira proteína pode incluir, consistir essencialmente em ou consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade em relação a uma terceira sequência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1[WT P77853], SEQ ID NO: 2 [AnfaeA], SEQ ID NO: 3 [AnfaeB], SEQ ID NO: 4 [NtEGm], SEQ ID NO: 5 [EU591743], SEQ ID NO: 6 [043097], SEQ ID NO: 7 [P77853:T134-100-101], SEQ ID NO: 8[P77853:S158- 30-108-35], SEQ ID NO: 9 [033897], SEQ ID NO: 10 [068438] e SEQ ID NO: 11 [P54583], A terceira proteína pode incluir, consistir essencialmente em ou consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade em relação à sequência de referência de SEQ ID: 12 [BD22308].
[0029] Pelo menos uma da primeira sequência de polinucleotídeo, da segunda sequência de polinucleotídeo ou da terceira sequência de polinucleotídeo pode incluir adicionalmente uma primeira sequência de polinucleotídeo de direcionamento, que codifica um respectivo peptídeo de direcionamento. Para material de planta geneticamente modificado carecendo da terceira sequência de polinucleotídeo, uma primeira sequência de polinucleotídeo de direcionamento pode ser incluída em pelo menos uma da primeira sequência de polinucleotídeo ou da segunda sequência de polinucleotídeo. Para material de planta geneticamente modificado carecendo da segunda sequência de polinucleotídeo e da terceira sequência de polinucleotídeo, uma primeira sequência de polinucleotídeo de direcionamento pode ser incluída na primeira sequência de polinucleotídeo. Cada respectivo peptídeo de direcionamento pode ser independentemente selecionado para cada uma da primeira, da segunda ou da terceira sequência de polinucleotídeo. Um peptídeo de direcionamento pode ser fundido à primeira proteína, à segunda proteína ou à terceira proteína. Cada respectivo peptídeo de direcionamento pode ser independentemente selecionado a partir de, mas não está limitado a, um sinal de direcionamento de amiloplasto, um peptídeo de direcionamento de parede celular, um peptídeo de direcionamento mitocondrial, um sinal de localização em citossol, um sinal de direcionamento de cloroplasto, um peptídeo de direcionamento nuclear e um peptídeo de direcionamento de vacúolo.
[0030] Um primeiro polinucleotídeo de direcionamento pode estar à montante da primeira sequência de polinucleotídeo, da segunda sequência de polinucleotídeo ou da terceira sequência de polinucleotídeo. Um peptídeo de direcionamento pode apresentar pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade em relação a uma de SEQ ID NO: 13 [BAASS], a sequência de aleurona de cevada SEQ ID NO: 14 [HVAlePS], SEQ ID NO: 15 [PR1a], SEQ ID NO: 16 [a sequência de gama-zeína xGZein27ss-02] ou SEQ ID NO: 17 [Glu B4SP],
[0031] Uma primeira sequência de polinucleotídeo de direcionamento, em combinação com uma da primeira sequência de polinucleotídeo, da segunda sequência de polinucleotídeo ou da sequência de polinucleotídeo, em conjunto, podem codificar uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade em relação a sequência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 18 [BAASS:P77853], SEQ ID NO: 19 [BAASS:O33897], SEQ ID NO: 20 [HVAlePS: NtEGm] e SEQ ID NO: 21 [BAAS:P77853:S158-30-108- 35],
[0032] Pelo menos uma da primeira sequência de polinucleotídeo, da segunda sequência de polinucleotídeo ou da terceira sequência de polinucleotídeo pode incluir adicionalmente uma segunda sequência de polinucleotídeo de direcionamento, que codifica um peptídeo de direcionamento de carbóxi. Para material de planta geneticamente modificado carecendo da terceira sequência de polinucleotídeo, uma segunda sequência de polinucleotídeo de direcionamento pode ser incluída em pelo menos uma da primeira sequência de polinucleotídeo ou da segunda sequência de polinucleotídeo. Para material de planta geneticamente modificado carecendo da segunda sequência de polinucleotídeo e da terceira sequência de polinucleotídeo, uma segunda sequência de polinucleotídeo de direcionamento pode ser incluída na primeira sequência de polinucleotídeo. Um peptídeo de direcionamento de carbóxi pode ser selecionado a partir de, mas não estão limitado a, sequência tendo pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade em relação a uma de SEQ ID NO: 22 [SEKDEL], a abreviada SEQ ID NO: 23 [KDEL] ou a sequência determinante de classificação vacuolar de cevada SEQ ID NO: 24 [HvVSD-01]. Um peptídeo de direcionamento de carbóxi pode ser fundido a pelo menos uma da primeira proteína, da segunda proteína ou da terceira proteína.
[0033] Pelo menos uma da primeira proteína, da segunda proteína ou da terceira proteína pode ser fornecida sem o peptídeo de direcionamento para acumulação no citoplasma.
[0034] A primeira sequência de polinucleotídeo de direcionamento e a segunda sequência de polinucleotídeo de direcionamento, em combinação com uma da primeira sequência de polinucleotídeo, da segunda sequência de polinucleotídeo ou da terceira sequência de polinucleotídeo, em conjunto, podem codificar uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade em relação a uma sequência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 25 [BAASS: AnfaeB:SEKDEL], SEQ ID NO: 26 [BAASS: AnfaeA:SEKDEL], SEQ ID NO: 27 [PRIa:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 28 [BAASS: P77853:T134-100-101 :SEKDEL], SEQ ID NO: 29 [HvAleSP:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 30 [BAASS:O43097:SEKDEL] e SEQ ID NO: 31[xGZein27ss-02:BD22308:HWSD-01],
[0035] Pelo menos uma da primeira, da segunda ou da terceira sequências de polinucleotídeo pode codificar uma “variante” de uma proteína CWD. A sequência de aminoácidos de uma variante de uma proteína CWD pode diferir por eliminações, adições, substituições de sequências de aminoácidos, ou outras modificações da proteína CWD. Uma variante de uma proteína CWD pode manter a atividade biológica da proteína CWD. Para manter a atividade biológica, conforme usada aqui, significa que a variante tenha pelo menos 60 % da atividade da proteína CWD, a partir da qual ela seja derivada. A atividade de uma xilanase pode ser avaliada em um ensaio usando substrato Xylazyme AX, conforme descrito aqui, na subseção do Exemplo 1, aqui intitulada “Ensaio com Enzima de Caule e Folhas”. A atividade de uma endoglicanase pode ser avaliada usando substrato Cellazyme, conforme descrito aqui, na subseção do Exemplo 1, aqui intitulada “Ensaio com Enzima de Caule e Folhas”. A atividade de uma exoglicanase pode ser avaliada usando 4-metil- umbeliferil-b-D-lactopiranosídeo (4-MU) fluorescente, conforme descrito em Harrison MD et al. 2011 “Accumulation of recombinant cellobiohydrolase e endoglicanase in the leaves of mature transgenic sugar cane”, Plant Biotechnology Journal 9: 884-896, e aqui incorporado por referência como se fosse completamente apresentado. A atividade de uma feruloil esterase pode ser avaliada usando um ensaio usando ferulato marcado com pNP como um substrato (conforme descrito em Hegde S. et al. 2009 “Single-step synthesis of 4-nitrophenyl ferulate for spectrophotometric assay of feruloyl esterases”, Analytical Biochemistry 387(1): 128-129). Os testes anteriores para atividade de uma xilanase, endoglicanase, exoglicanase ou feruloil esterase podem ser utilizados para determinar se uma sequência com menos do que 100 % de identidade em relação a uma sequência de proteína que degrada CWD aqui é uma variante da proteína que degrada CWD. Variantes de uma proteína CWD aqui podem estar modificadas em uma sequência de aminoácidos versus a proteína CWD com base em similaridade em hidrofobicidade, hidrofilicidade, solubilidade, polaridade de resíduos de aminoácidos. Variantes de uma proteína CWD aqui podem diferir seguindo modificações pós-traducionais. A modificação pós-traducional diferenciadora pode ser, mas não está limitada a glicosilações, acetilações ou fosforilações. Uma variante pode ser desenvolvida por quaisquer meios.Uma variante pode ser desenvolvida através de mutagênese sítio-dirigida ou por mutagênese não direcionada. PCR sujeira a erros pode ser usada para criar mutantes de uma proteína CWD aqui, e qualquer um dos ensaios acima pode ser usado para avaliar se o mutante é uma variante.
[0036] Modalidades incluem pelo menos uma da primeira proteína, da segunda proteína ou da terceira proteína, ou variantes das mesmas, fundidas a variantes de pelo menos um de um peptídeo de direcionamento ou de um peptídeo de direcionamento de carbóxi. Variantes de um peptídeo de direcionamento ou de um peptídeo de direcionamento de carbóxi direcionarão a proteína à qual estejam fundidas ao mesmo local que a sequência de referência para o peptídeo de direcionamento ou o peptídeo de direcionamento de carbóxi.
[0037] Variantes de inteína podem ser fornecidas em uma primeira proteína, uma segunda proteína ou uma terceira proteína. Uma variante de inteína pode se emendar a partir da proteína, à qual ela esteja fundida.
[0038] A determinação da identidade percentual de duas sequências de aminoácidos ou de duas sequências de ácidos nucléicos pode incluir o alinhamento e a comparação dos resíduos de aminoácidos ou dos nucleotídeos em posições correspondentes nas duas sequências. Se todas as posições nas duas sequências estiverem ocupadas por resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos idênticos, então as sequências são ditas como sendo 100 % idênticas. A identidade percentual pode ser medida pelo algoritmo de Smith-Waterman (Smith TF, Waterman MS 1981 “Identification of Common Molecular Subsequences”, J Mol Biol 147: 195 -197, o qual é aqui incorporado por referência como se fosse completamente apresentado.
[0039] Em uma modalidade, uma sequência de polinucleotídeo, que codifica uma proteína tendo menos do que 100 % de identidade em relação à sequência de aminoácidos de referência citada pode codificar uma variante da proteína tendo a sequência de aminoácidos de referência. Em uma modalidade, uma proteína tendo menos do que 100 % de identidade em relação à sequência de aminoácidos de referência citada pode ser uma variante da proteína tendo a sequência de aminoácidos de referência. Em uma modalidade, uma sequência de polinucleotídeo, que codifica uma proteína tendo menos do que 100 % de identidade em relação à proteína codificada pela sequência de aminoácidos de referência citada, pode codificar uma variante da proteína codificada pela sequência de referência.
[0040] Referindo-se à FIG. 1, é ilustrado um método para produção de açúcares solúveis a partir de material de planta geneticamente modificado.A FIG. 1 retrata um fluxograma de processo para pré-tratamento e hidrólise consolidados de material de planta geneticamente modificado. O material de planta geneticamente misturado ou o material de planta geneticamente modificado adicionado sob mistura com outro material de planta pode ser adicionado através do Alimentador 10 ao Reator 20, para pré-tratamento químico e liquefação enzimática; isto é, o processo de conversão de biomassa lignocelulósica sólida em um estado liquefeito, adequado para processamento e hidrólise ulteriores. No reator 20, o material de planta geneticamente modificado ou o material de planta geneticamente modificado adicionado sob mistura com outro material de planta pode ser misturado com a formulação de formação de polpa. A formulação de formação de polpa pode incluir pelo menos uma porção tendo um íon selecionado a partir do grupo consistindo em: sulfito, bissulfito, sulfato, carbonato, hidróxido e óxido. A pelo menos uma porção adicionalmente pode incluir, mas não está limitada a, um contra-íon selecionado a partir do grupo consistindo em: amónio, sódio, magnésio e cálcio. A pelo menos uma porção pode ser um sal.Um sal pode ser, mas não está limitado a, um sulfito (SOs2-), um bissulfito (HSO3-), um óxido (O2-) e um hidróxido (OH j. O sal pode incluir um contra-íon. Um contra-íon pode ser, mas não está limitado a, sódio (Na+), cálcio (Ca2+), hidrogênio, potássio (K+), magnésio (Mg2+) e amónio (NH4+). Uma formulação de formação de polpa pode incluir pelo menos um de óxido de cálcio (CaO), cal ou hidróxido de cálcio (Ca(OH)2), cal agitada.
[0041] Em uma modalidade, uma formulação de formação de polpa pode incluir pelo menos um de bissulfito de amónio e carbonato de amónio. O bissulfito de amónio pode estar em uma concentração de 0,02 M a 0,35 Meo carbonato de amónio pode estar em uma concentração de 0,025 M a 0,25 M. A formulação de formação de polpa pode ser misturada com o material de planta geneticamente modificado ou com o material de planta geneticamente modificado adicionado sob mistura com outro material de planta em uma razão de líquido para sólido ótima em uma mistura. A mistura pode ter uma razão de líquido para sólido selecionada a partir do valor de menos do que ou igual a um de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1, ou qualquer valor em uma faixa entre quaisquer dois dos anteriores (pontos finais, inclusive). Por exemplo, a razão de líquido para sólido pode ser um valor menor do que qualquer número inteiro ou não inteiro selecionado de 3 a 7. A razão de líquido para sólido pode ser igual a 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1, ou qualquer valor em uma faixa entre quaisquer aos dos anteriores (pontos finais, inclusive).Por exemplo, a razão de líquido para sólido pode ser um valor igual a qualquer número inteiro ou não inteiro selecionado de 3 a 7.
[0042] O pré-tratamento pode incluir a incubação da mistura durante até 16 horas. A incubação pode ocorrer durante períodos mais longos ou mais curtos pode ser realizada. O pré-tratamento pode incluir a incubação da mistura durante um período de menos do que ou igual a um de 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 hora(s).
[0043] O pré-tratamento pode incluir o fornecimento de uma temperatura de mistura de 40°C a 95°C. Uma temperatura de mistura de 40°C a 95°C pode permitir o rompimento ou a remoção de porções de lignina dentro do material lignocelulósico na mistura, sem desativar as enzimas hidrolíticas. O pré-tratamento pode incluir o fornecimento de uma temperatura de mistura de 55°C, 65°C, 75°C, 95°C, menor do que 55°C, menor do que 65°C, menor do que 75°C, menor do que 95°C, menor do que 100°C, 40°C a 55°C, 40°C a 65°C, 40°C a 75°C, 40°C a 95°C, 40°C a menor do que 100°C, 55°C a 65°C, 55°C a 75°C, 55°C a 95°C, 55°C a menor do que 100°C, 65°C a 75°C, 65°C a 95°C, 65°C a menor do que 100°C, 75°C a 95°C, 75°C a menor do que 100°C ou 95°C a menor do que 100°C.
[0044] O pré-tratamento pode incluir o fornecimento de um pH de mistura variando de 5,0 a 10. O pré-tratamento pode incluir o fornecimento de um pH de mistura dentro de uma faixa de 6,5 a 8,5. O pH de mistura fornecido pode ser de 5,0; 5,5; 6,0; 7,0; 7,5; 8,0; 9,0; 9,5 ou 10, ou um pH dentro de uma faixa entre quaisquer dois dos valores de pH anteriores (pontos finais, inclusive). O pH da mistura durante o pré-tratamento pode depender do tipo de ente químico usado e/ou do tipo de material de planta usado. O fornecimento de um pH de mistura pode incluir a adição de um ente químico que modifique o pH. Um ente químico que modifique o pH pode ser um ácido ou uma base.
[0045] No final da etapa de pré-tratamento, a mistura pode incluir material de planta parcialmente degradado e uma fase líquida chamada de filtrado parcial, que pode incluir entes químicos da formulação de formação de polpa e uma baixa concentração de enzima ou enzimas CWD liberadas a partir material de planta geneticamente modificado. O método pode incluir a separação do filtrado parcial dos sólidos de material de planta parcialmente degradado no Separador 30. A separação pode ser conseguida através de vários processos. A separação pode ser conseguida através de sedimentação, filtração ou centrifugação do filtrado parcial. O método pode incluir pelo menos um de coleta ou reciclagem de pelo menos uma porção do filtrado parcial em rodadas múltiplas de pré- tratamento. Depois da remoção do filtrado parcial, a concentração de sólidos dentro da mistura pode ser aumentada e pode ser de qualquer valor inteiro ou não inteiro dentro de uma faixa de 2 % a 15% (p/v), ou qualquer faixa dentro de dois valores inteiros dentro da faixa de 2 % a 15 % (p/v).
[0046] O método pode incluir a lavagem do material de planta geneticamente modificado pré-tratado com qualquer líquido adequado. O líquido pode ser água deionizada. O líquido pode ser removido por centrifugação.
[0047] O método pode incluir adicionalmente o refino por moagem mecânica, a qual é realizada no Refinador 40, por qualquer método conhecido, tal como, mas que não está limitado a, desfibrilação, moagem ou esmagamento.
[0048] O método pode incluir a transferência de biomassa pré-tratada refinada para o Vaso de Sacarificação 50. A hidrólise por uma enzima CWD liberada a partir do material de planta geneticamente modificado pode ocorrer no Vaso de Sacarificação 5.
[0049] O fornecimento de condições de hidrólise pode incluir o ajuste da mistura até 2 % a25 % em sólidos, até qualquer valor inteiro ou não inteiro dentro de 2 % a 25 % em sólidos (pontos finais, inclusive), ou até qualquer valor inteiro ou não inteiro dentro de uma faixa entre quaisquer dois inteiros dentro de 2 % a 25 % em sólidos. O fornecimento de condições de hidrólise pode incluir a incubação da mistura durante um período de tempo de até 144 horas, um período de tempo selecionado a partir de qualquer um valor inteiro ou não inteiro de até 144 horas, ou um período de tempo dentro de uma faixa entre quaisquer dois valores inteiros maiores do que zero e até 144 horas. O fornecimento de condições de hidrólise pode incluir o fornecimento de uma temperatura de mistura de 100°C ou menos, 65°C ou menos, 50°C ou menos, 48°C a 50°C, 48°C a 65°C, 48°C a menos do que 100°C ou 48°C a 100°C. O fornecimento de condições de hidrólise pode incluir o fornecimento de um pH variando de 4,8 a 5.0, um pH de 4,8, um pH de 4,9 ou um pH de 5,0. Pelo menos um da temperatura, pH ou tempo de tratamento pode ser selecionado com base na atividade específica de uma enzima CWD no material de planta geneticamente modificado.
[0050] Se o material de planta geneticamente modificado incluir múltiplas enzimas CWD, condições ótimas para pelo menos um de expressão, pré-tratamento ou hidrólise por cada uma das múltiplas enzimas CWD podem ser fornecidas sequencialmente. As condições de hidrólise podem incluir o fornecimento de um pH ótimo para a atividade de uma enzima, seguido por um pH ótimo diferente para a atividade de outra enzima. As condições de hidrólise podem incluir o ajuste de temperaturas em diferentes períodos de tempo para a atividade ótima da cada enzima. Por exemplo, uma xilanase pode exigir uma temperatura ou pH diferente do que uma endoglicanase.
[0051] O método pode incluir a adição de uma ou mais enzimas exógenas a pelo menos um do material de planta geneticamente modificado, outro material de planta ou a mistura. As enzimas exógenas podem ser adicionadas antes, durante ou depois do pré-tratamento. As enzimas exógenas podem ser adicionadas antes, durante ou depois do fornecimento das condições de hidrólise. As enzimas exógenas podem ser adicionadas ao Vaso de Sacarificação 50.Uma ou mais enzimas exógenas podem ser fornecidas em um coquetel de enzimas.Um coquetel de enzimas pode incluir uma ou mais enzimas CWD. Uma enzima CWD fornecida em uma modalidade aqui pode ser, mas não está limitada a, uma enzima que degrade lignina, uma enzima que degrade celulose ou uma enzima que degrade hemi- celulose. Uma enzima CWD fornecida em uma modalidade aqui pode ser, mas não está limitada a, uma selecionada a partir de glicosidases, xilanases, celulases, endoglicanases, exoglicanases, celobioidrolases, β-xilosidases, feruloil esterases e amilases. Um coquetel de enzimas pode incluir uma celulase isolada a partir de Tríchoderma reesii. Um coquetel de enzimas pode ser comprador a partir de um vendedor.Um coquetel de enzimas pode ser, mas não está limitado a, Accellerase™ 1000, Accellerase® 1500 e Accellerase® XY disponíveis a partir de Genencor International (Rochester, NY).Um coquetel de enzimas pode ser Cellic. Um coquetel de enzimas pode incluir diferentes classes de enzimas CWD. Podem ser fornecidas condições ótimas para diferentes classes de enzimas CWD em um coquetel. Por exemplo, a temperatura, o pH e o tempo de tratamento para hidrólise podem ser ajustados durante o método para fornecer condições ótimas para diferentes enzimas no coquetel. As condições de hidrólise podem incluir cargas reduzidas de enzimas externas incluídas em um coquetel de enzimas.Cargas reduzidas podem incluir formulações tendo menos de ou carecendo de uma proteína ou de proteínas CWD expressas no material de planta geneticamente modificado.Por exemplo, se uma planta transgênica expressar xilanase e amidoglicanas, essas enzimas podem ser removidas de um coquetel de enzimas formulado para hidrólise de material de planta geneticamente modificado tendo a planta transgênica.
[0052] A eficiência da hidrólise pose ser avaliada por medição da solubilização do material de planta. Métodos para medir a solubilização do material de planta são conhecidos na técnica e podem incluir a determinação das concentrações de monossacarídeos e de dissacarídeos, por exemplo, por cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC). Conforme descrito nos Exemplos aqui, HPLC pode ser realizada usando-se bomba binária Shimadzu LC-20 AD com programa de computador de soluções para Cromatografia líquida (Shimadzu, Kioto, Japão) e a concentração de açúcares pode ser determinada usando uma coluna para açúcares Aminex HPX-87P (Bio-Rad Laboratories). Estão disponíveis outros métodos para medir a solubilização do material de planta, por exemplo, por determinação da perda de peso, da remoção de lignina ou da desacetilação no material de planta pré- tratado.
[0053] O método pode incluir adicionalmente a colocação em contato da mistura e/ou dos produtos de hidrólise com um organismo fermentante, para produzir um produto bioquímico.Depois da hidrólise enzimática, açúcares solúveis podem ser recuperados e usados para produção de um produto bioquímico.Alternativamente, sacarificação e fermentação simultâneas de açúcares solúveis em um produto bioquímico podem ser realizadas no método. Um produto bioquímico pode ser, mas não está limitado a, butano, butano-diol, butadieno, butanol, isobutanol, propano, propano-diol, propileno, propanol, isopropanol, metano, metanol, etanol, fenol, glicerol, etileno, tolueno, etil-benzeno, estireno, xileno, etileno glicol, óxido de etileno, ácido fórmico, dióxido de carbono, formaldeído, acetaldeído, acetona, uma vitamina, etano, pentano, hexano, heptano, octano, benzeno, ácido acético, sorbitol, arabinitol, ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido furano-dicarboxílico, ácido aspático, ácido glicárico, ácido glutâmico, ácido itacônico, ácido levulínico, hidróxi- butirolactona, glicerol, sorbitol, xilitol, arabinitol, ácido glicônico, ácido lático, ácido malônico, ácido propiônico, ácido cítrico, ácido aconítico, ácido xilônico, furfural, levoglucosana, alanina, prolina, lisina, serina ou treonina (Ver T. Werpy e G. Petersen, “Top Value Added Chemicals From Biomass”, Volume 1, Results of Screening for Potential Candidates from Sugars e Synthesis Gas, Agosto de 2004, Report, PNNL & NREL, o qual é aqui incorporado por referência como se fosse completamente apresentado). O método pode incluir sacarificação e fermentação simultâneas de açúcares solúveis para produzir etanol. Sacarificação e fermentação simultâneas para produzir etanol podem incluir o fornecimento de Saccharomyces cerevisiae D5A antes, durante ou depois do pré-tratamento ou do fornecimento das condições de hidrólise.
[0054] A conversão de açúcares em produtos bioquímicos desejados pode ser realizada por qualquer organismo fermentante adequado. O organismo fermentante pode ser selecionado com base no produto bioquímico desejado. O organismo fermentante pode ser uma levedura. A levedura pode ser, mas não está limitada a, uma de Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Yarrowia, Spathaspora ou Scheffersomyces ssp. O organismo fermentante pode ser uma bactéria. Uma bactéria pode ser, mas não está limitada a, Zymomonas, Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, ou Clostridium ssp. O organismo fermentante pode ser um organismo do tipo selvagem ou um organismo recombinante modificado geneticamente.
[0055] Uma modalidade inclui uma planta geneticamente modificada incluindo uma primeira sequência de polinucleotídeo, que codifica uma primeira proteína.A primeira proteína pode ser uma proteína CWD.A primeira proteína pode ser uma proteína CWD modificada com inteína.A primeira proteína pode ser qualquer uma descrita com respeito ao método para produção de açúcares solúveis a partir de material de planta geneticamente modificada. A primeira proteína pode incluir, consistir essencialmente em ou consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade em relação a uma primeira sequência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1 [WT P77853], SEQ ID NO: 2 [AnfaeA], SEQ ID NO: 3 [AnfaeB], SEQ ID NO: 4 [NtEGm], SEQ ID NO: 5 [EU591743], SEQ ID NO: 6 [043097], SEQ ID NO: 7 [P77853:T134-100-101], SEQ ID NO: 8 [P77853:S158- 30-108-35], SEQ ID NO: 9 [033897], SEQ ID NO: 10 [068438] e SEQ ID NO: 11 [P54583]. A primeira proteína pode incluir, consistir essencialmente em ou consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade em relação à sequência de referência de SEQ ID: 12 [BD22308],
[0056] A planta geneticamente modificada pode incluir adicionalmente uma segunda sequência de polinucleotídeo, que codifica uma segunda proteína.A segunda proteína pode ser uma enzima CWD.A segunda proteína pode ser uma proteína CWD modificada com inteína.A segunda proteína pode ser qualquer uma descrita com respeito ao método para produção de açúcares solúveis a partir de material de planta geneticamente modificado. A segunda proteína pode incluir, consistir essencialmente em ou consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade em relação a uma segunda sequência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1 [WT P77853], SEQ ID NO: 2 [AnfaeA], SEQ ID NO: 3 [AnfaeB], SEQ ID NO: 4 [NtEGm], SEQ ID NO: 5 [EU 591743], SEQ ID NO: 6 [043097], SEQ ID NO: 7 [P77853:T134-100-101], SEQ ID NO: 8 [P77853:S158-30-108-35], SEQ ID NO: 9 [033897], SEQ ID NO: 10 [068438], SEQ ID NO: 11 [P54583] e SEQ ID: 12 [BD22308]. A SEQ ID NO selecionada como a segunda sequência de referência pode ser diferente da SEQ ID NO selecionada como a primeira sequência de referência.
[0057] A planta geneticamente modificada pode incluir adicionalmente uma terceira sequência de polinucleotídeo, que codifica uma terceira proteína. A terceira proteína pode ser uma enzima CWD. A terceira proteína pode ser uma proteína CWD modificada com inteína. A terceira proteína pode ser qualquer uma descrita com respeito ao método para produção de açúcares solúveis a partir de material de planta geneticamente modificado. A terceira proteína pode incluir, consistir essencialmente em ou consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade em relação a uma terceira sequência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1 [WT P77853], SEQ ID NO: 2 [AnfaeA], SEQ ID NO: 3 [AnfaeB], SEQ ID NO: 4 [NtEGm], SEQ ID NO: 5 [EU591743], SEQ ID NO: 6 [043097], SEQ ID NO: 7 [P77853:T134-100-101], SEQ ID NO: 8 [P77853:S158-30-108-35], SEQ ID NO: 9 [033897], SEQ ID NO: 10 [068438], SEQ ID NO: 11 [P54583] e SEQ ID: 12 [BD22308]. A SEQ ID NO selecionada como a terceira sequência de referência pode ser diferente da SEQ ID NO selecionada como a primeira sequência de referência. A SEQ ID NO selecionada como a terceira sequência de referência pode ser diferente da SEQ ID NO selecionada como a segunda sequência de referência.
[0058] Pelo menos uma da primeira sequência de polinucleotídeo, da segunda sequência de polinucleotídeo ou da terceira sequência de polinucleotídeo em uma planta geneticamente modificada pode incluir adicionalmente uma primeira sequência de polinucleotídeo de direcionamento, que codifica um respectivo peptídeo de direcionamento. Para uma planta geneticamente modificada carecendo da terceira sequência de polinucleotídeo, uma primeira sequência de polinucleotídeo de direcionamento pode ser incluída em pelo menos uma da primeira sequência de polinucleotídeo ou da segunda sequência de polinucleotídeo. Para uma planta geneticamente modificada carecendo da segunda sequência de polinucleotídeo e da terceira sequência de polinucleotídeo, uma primeira sequência de polinucleotídeo de direcionamento pode ser incluída na primeira sequência de polinucleotídeo. Um respectivo peptídeo de direcionamento pode ser independentemente selecionado a partir de, mas não está limitado a, um sinal de direcionamento de amiloplasto, um peptídeo de direcionamento de parede celular, um peptídeo de direcionamento mitocondrial, um sinal de localização em citossol, um sinal de direcionamento de cloroplasto, um peptídeo de direcionamento nuclear e um peptídeo de direcionamento de vacúolo.
[0059] Cada respectivo peptídeo de direcionamento pode ser fundido à correspondente primeira proteína, segunda proteína ou terceira proteína. Um peptídeo de direcionamento pode ter pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade em relação a uma de SEQ ID NO: 13 [BAASS], SEQ ID NO: 14 [HvAleSP], SEQ ID NO: 1 [PR1a] 5, SEQ ID NO: 16 [xGZein27ss-02] ou SEQ ID NO: 17 [GluB4SP],
[0060] Pelo menos uma da primeira sequência de polinucleotídeo, da segunda sequência de polinucleotídeo ou da terceira sequência de polinucleotídeo em uma planta geneticamente modificada pode incluir adicionalmente uma segunda sequência de polinucleotídeo de direcionamento, que codifica um peptídeo de direcionamento de carbóxi. Para uma planta geneticamente modificada carecendo da terceira sequência de polinucleotídeo, uma segunda sequência de polinucleotídeo de direcionamento pode ser incluída em pelo menos uma da primeira sequência de polinucleotídeo ou da segunda sequência de polinucleotídeo. Para uma planta geneticamente modificada carecendo da segunda sequência de polinucleotídeo e da terceira sequência de polinucleotídeo, uma segunda sequência de polinucleotídeo de direcionamento pode ser incluída na primeira sequência de polinucleotídeo. Um peptídeo de direcionamento de carbóxi pode ser selecionado a partir de, mas não está limitado a, sequência tendo pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade em relação a uma de SEQ ID NO: 22 [SEKDEL], a abreviada SEQ ID NO: 23 [KDEL] ou SEQ ID NO: 24 [a sequência determinante de classificação vacuolar de cevada HvVSD-01]. Um peptídeo de direcionamento de carbóxi pode ser fundido a pelo menos uma da primeira proteína, da segunda proteína ou da terceira proteína.
[0061] Uma planta geneticamente modificada pode incluir pelo menos uma sequência de polinucleotídeo, que codifica uma sequência de aminoácidos incluindo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma sequência com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade em relação a uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 18 [BAASS:P77853], SEQ ID NO: 19 [BAASS:O33897], SEQ ID NO: 20 [HVAlePS:NtEGm], SEQ ID NO: 21 [BAASS:P77853:S158-30-108-35], SEQ ID NO: 25 [BAASS: AnfaeB: SEKDEL], SEQ ID NO: 26 [BAASS:AnfaeA:SEKDEL], SEQ ID NO: 27 [PR1a:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 28 [BAASS: P77853:T134-100-101 :SEKDEL], SEQ ID NO: 29 [HvAleSP:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 30 [BAASS:O43097:SEKDEL] e SEQ ID NO: 31 [xGZein27ss- 02:BD22308:HvVSD-01],
[0062] Uma planta geneticamente modificada pode incluir pelo menos uma sequência de aminoácidos incluindo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma sequência com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade em relação a uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 18 [BAASS:P77853], SEQ ID NO: 19 [BAASS:033897], SEQ ID NO: 20 [HVAIePS:NtEGm], SEQ ID NO: 21 [BAASS:P77853:S158-30-108-35], SEQ ID NO: 25 [BAASS:AnfaeB:SEKDEL], SEQ ID NO: 26 [BAASS:AnfaeA:SEKDEL], SEQ ID NO: 27 [PR1a:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 28 [BAASS:P77853:T134-100-101 :SEKDEL], SEQ ID NO: 29 [HvAleSP:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 30 [BAASS:O43097:SEKDEL] e SEQ ID NO: 31 [xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01],
[0063] A planta geneticamente modificada pode ser uma planta transgênica, uma progenia de uma planta transgênica, um descendente de uma planta transgênica ou qualquer parte dos anteriores. A planta geneticamente modificada pode incluir uma proteína CWD, que não ocorra naturalmente na planta, ou um gene que codifique a mesma. A proteína CWD pode ser uma proteína CWD modificada com inteína.A planta transgênica pode ser qualquer tipo de planta. O tipo de planta transgênica pode ser milho, cana de açúcar, beterraba açucareira, sorgo, grama de crescimento rápido, miscanto, eucalipto, salgueiro ou álamo. A planta transgênica pode ser criada por métodos conhecidos para expressar uma enzima CWD ou proteína CWD em qualquer forma.A planta pode criada por transformação mediada por Agrobacterium usando um vetor que inclua uma sequência de polinucleotídeo, que codifique uma enzima.A planta transgênica pode ser criada por outros métodos para transformação de plantas, por exemplo, bombardeamento com partículas ou assimilação de ADN direta.A planta transgênica pode incluir qualquer ácido nucléico isolado, sequência de aminoácidos, cassete de expressão ou vetor aqui.
[0064] Em uma modalidade, um cassete de expressão é fornecido, que inclui pelo menos uma da primeira sequência de polinucleotídeo, uma segunda sequência de polinucleotídeo ou uma terceira sequência de polinucleotídeo, que codificam, respectivamente, uma primeira proteína, uma segunda proteína e uma terceira proteína. Qualquer uma ou mais da primeira proteína, da segunda proteína ou da terceira proteína pode ser uma proteína CWD. Qualquer uma ou mais da primeira proteína, da segunda proteína ou da terceira proteína pode ser uma proteína CWD modificada com inteína. Qualquer uma ou mais da primeira proteína, da segunda proteína ou da terceira proteína pode ser uma das proteínas descritas com respeito ao método para produção de açúcares solúveis a partir de material de planta geneticamente modificado ou das plantas geneticamente modificadas. Qualquer uma ou mais da primeira proteína, da segunda proteína ou da terceira proteína pode ser uma xilanase, uma endoglicanase, uma exoglicanase, uma feruloil esterase, uma xilanase modificada com inteína, uma endoglicanase modificada com inteína, uma exoglicanase modificada com inteína e uma feruloil esterase modificada com inteína. A proteína selecionada como a segunda proteína pode ser diferente da proteína selecionada como a primeira proteína. A proteína selecionada como a terceira proteína pode ser diferente da proteína selecionada como a primeira proteína. A proteína selecionada como a terceira proteína pode ser diferente da proteína selecionada como a segunda proteína.
[0065] Pelo menos uma da primeira sequência de polinucleotídeo, da segunda sequência de polinucleotídeo ou da terceira sequência de polinucleotídeo, que codifica uma proteína CWD em um cassete de expressão, pode ser modificada por inserção da sequência de ácidos nucléicos, que codifica uma inteína. Um polinucleotídeo modificado com inteína pode codificar uma proteína modificada com inteína com uma função modificada.Uma função modificada pode ser inativação de uma proteína CWD, enquanto a inteína permanece fundida à ou dentro da proteína CWD.Uma inteína em uma proteína modificada com inteína pode ser indizível à forma de emenda da proteína não modificada com inteína.A condição de indução para emenda pode ser, mas não está limitada a, fornecimento de uma certa temperatura. A temperatura fornecida pode ser aquela fornecida durante pelo menos uma das condições de pré-tratamento ou de hidrólise descritas com respeito ao método para produção de açúcares solúveis, a partir de material de planta geneticamente modificado. A condição de indução pode ser qualquer outra condição de indução que se case com a inteína selecionada. A proteína modificada com inteína pode ser iXynA: isto é, XynA modificada com inteína. A proteína modificada com inteína pode ser P77853 modificada com inteína). A proteína modificada com inteína pode ser P77853:T134-100-101 ou P77853:S158-30-108-35.
[0066] Uma ou mais da primeira proteína, da segunda proteína ou da terceira proteína, em um cassete de expressão, pode incluir, consistir essencialmente em ou consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade em relação a uma sequência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1 [WT P77853], SEQ ID NO: 2 [AnfaeA], SEQ ID NO: 3 [AnfaeB], SEQ ID NO: 4 [NtEGm], SEQ ID NO: 5 [EU 591743], SEQ ID NO: 6 [043097], SEQ ID NO: 7 [P77853:T134-100-101], SEQ ID NO: 8 [P77853:S158-30-108-35], SEQ ID NO: 9 [033897], SEQ ID NO: 10 [068438] e SEQ ID NO: 11 [P54583], Uma ou mais da primeira proteína, da segunda proteína ou da terceira proteína pode incluir, consistir essencialmente em ou consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade em relação à sequência de referência de SEQ ID: 12 [BD22308].
[0067] Pelo menos uma da primeira sequência de polinucleotídeo, da segunda sequência de polinucleotídeo ou da terceira sequência de polinucleotídeo, em um cassete de expressão, pode incluir adicionalmente uma primeira sequência de polinucleotídeo de direcionamento, que codifica um respectivo peptídeo de direcionamento. Para um construto de expressão carecendo da terceirasequência de polinucleotídeo, uma primeira sequência de polinucleotídeo de direcionamento pode ser incluída em pelo menos uma da primeira sequência de polinucleotídeo ou da segunda sequência de polinucleotídeo. Para um construto de expressão carecendo da segunda sequência de polinucleotídeo e da terceira sequência de polinucleotídeo, uma primeira sequência de polinucleotídeo de direcionamento pode ser incluída na primeira sequência de polinucleotídeo. Cada respectivo peptídeo de direcionamento pode ser independentemente selecionado para cada uma da primeira sequência de polinucleotídeo, da segunda sequência de polinucleotídeo ou da terceira sequência de polinucleotídeo. Um peptídeo de direcionamento pode ser fundido à primeira proteína, da segunda proteína ou da terceira proteína. Cada respectivo peptídeo de direcionamento pode ser independentemente selecionado a partir de, mas não está limitado a, um sinal de direcionamento de amiloplasto, um peptídeo de direcionamento de parede celular, um peptídeo de direcionamento mitocondrial, um sinal de localização em citossol, um sinal de direcionamento de cloroplasto, um peptídeo de direcionamento nuclear e um peptídeo de direcionamento de vacúolo. Um primeiro polinucleotídeo de direcionamento pode estar à montante da primeira sequência de polinucleotídeo, da segunda sequência de polinucleotídeo ou da terceira sequência de polinucleotídeo. Um peptídeo de direcionamento pode ter pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade em relação a uma de BAASS (SEQ ID NO: 13), a sequência de aleurona de cevada HVAlePS (SEQ ID NO: 14), PR1a (SEQ ID NO: 15), a sequência de gama-zeína xGZein27ss-02 (SEQ ID NO: 16) ou GluB4SP (SEQ ID NO: 17). Uma primeira sequência de polinucleotídeo de direcionamento, em combinação com uma da primeira sequência de polinucleotídeo, da segunda sequência de polinucleotídeo ou da terceira sequência de polinucleotídeo, em conjunto, pode codificar uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade em relação a uma sequência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 18 [BAASS:P77853], SEQ ID NO: 19 [BAASS:033897], SEQ ID NO: 20 [HVAlePS:NtEGm] e SEQ ID NO: 21 [BAAS:P77853:S158-30-108-35],
[0068] Pelo menos uma da primeira sequência de polinucleotídeo, da segunda sequência de polinucleotídeo ou da terceira sequência de polinucleotídeo, em um cassete de expressão, pode incluir adicionalmente uma segunda sequência de polinucleotídeo de direcionamento, que codifica um peptídeo de direcionamento de carbóxi. Para um construto de expressão carecendo da terceira sequência de polinucleotídeo, uma segunda sequência de polinucleotídeo de direcionamento pode ser incluída em pelo menos uma da primeira sequência de polinucleotídeo ou da segunda sequência de polinucleotídeo. Para um construto de expressão carecendo da segunda sequência de polinucleotídeo e da terceira sequência de polinucleotídeo, uma segunda sequência de polinucleotídeo de direcionamento pode ser incluída na primeira sequência de polinucleotídeo. Um peptídeo de direcionamento de carbóxi pode ser selecionado a partir de, mas não está limitado a, sequência tendo pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade em relação a uma de SEKDEL (SEQ ID NO: 22), a abreviada KDEL (SEQ ID NO: 23) ou a sequência determinante de classificação vacuolar de cevada HvVSD- 01 (SEQ ID NO: 24). Um peptídeo de direcionamento de carbóxi pode ser fundido a pelo menos uma da primeira proteína, da segunda proteína ou da terceira proteína.
[0069] Um cassete de expressão pode ser configurado, tal que pelo menos uma da primeira proteína, da segunda proteína ou da terceira proteína seja fornecida sem o peptídeo de direcionamento para acumulação no citoplasma.
[0070] Em um cassete de expressão, a primeira sequência de polinucleotídeo de direcionamento e a segunda sequência de polinucleotídeo de direcionamento, em combinação com uma da primeira sequência de polinucleotídeo, da segunda sequência de polinucleotídeo ou da terceira sequência de polinucleotídeo, em conjunto, podem codificar uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade em relação a uma sequência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 25 [BAASS:AnfaeB:SEKDEL], SEQ ID NO: 26 [BAASS:AnfaeA:SEKDEL], SEQ ID NO: 27 [PR1a:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 28 [BAASS:P77853:T134-100-101 :SEKDEL], SEQ ID NO: 29 [HvAleSP:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 30 [BAASS:O43097:SEKDEL] e SEQ ID NO: 31 [xGZei n27ss-02: BD22308: H vVSD-01 ].
[0071] Modalidades incluem um cassete de expressão, que codifica pelo menos uma da primeira proteína, da segunda proteína ou da terceira proteína, ou variantes das mesmas, fundidas a variantes de pelo menos um de um peptídeo de direcionamento ou um peptídeo de direcionamento de carbóxi.
[0072] Em uma modalidade, uma sequência de polinucleotídeo, que codifica uma proteína em um cassete de expressão e tendo menos do que 100 % de identidade em relação à sequência de aminoácidos de referência citada, pode codificar uma variante da proteína tendo a sequência de aminoácidos de referência. Em uma modalidade, uma proteína, tendo menos do que 100 % de identidade em relação à sequência de aminoácidos de referência citada, pode ser uma variante da proteína tendo a sequência de aminoácidos de referência. Em uma modalidade, uma sequência de polinucleotídeo, que codifica uma proteína tendo menos do que 100 % de identidade em relação à proteína codificada pela sequência de ácidos nucléicos de referência citada, pode codificar uma variante da proteína codificada pela sequência de referência.
[0073] Em um cassete de expressão, pelo menos uma da primeira sequência de polinucleotídeo, da segunda sequência de polinucleotídeo ou da terceira sequência de polinucleotídeo pode ser capaz de se hibridizar com uma sequência de referência, que codifica uma proteína CWD ou uma proteína CWD modificada com inteína, sob condições de um de baixo, moderado ou elevado rigor, com um ácido nucléico consistindo em uma sequência de referência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 32 [WT P77853], SEQ ID NO: 33 [AnfaeA], SEQ ID NO: 34 [AnfaeB], SEQ ID NO: 35 [NtEGm], SEQ ID NO: 36 [EU591743], SEQ ID NO: 37 [043097], SEQ ID NO: 38 [P77853:T134-100-101], SEQ ID NO: 39 [P77853:S158-30-108-35], SEQ ID NO: 40 [033897], SEQ ID NO: 41 [068438], SEQ ID NO: 42 [P54583] e SEQ ID NO: 43 [BD22308], Um cassete de expressão pode incluir uma sequência de polinucleotídeo capaz de se hibridizar sob condições de um de baixo, moderado ou elevado rigor, com um ácido nucléico consistindo em uma sequência de referência selecionada a partir do grupo de sequências consistindo em: SEQ ID NO: 52 [BAASS: P77853], SEQ ID NO: 53 [BAASS:O33897], SEQ ID NO: 54 [HVAlePS:NtEGm], SEQ ID NO: 55 [BAASS: P77853:S158-30-108-35], SEQ ID NO: 56 [BAASS:AnfaeB:SEKDEL], SEQ ID NO: 57 [BAASS:AnfaeA:SEKDEL], SEQ ID NO: 58 [PR1a:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 59 [BAASS: P77853:T134-100-101 :SEKDEL], SEQ ID NO: 60 [HvAleSP:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 61 [BAASS:O43097:SEKDEL] e SEQ ID NO: 62 [xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01].
[0074] Um cassete de expressão aqui pode incluir um elemento regulador.
[0075] Em uma modalidade, é fornecido um vetor incluindo qualquer ácido nucléico isolado, sequência de polinucleotídeo ou cassete de expressão aqui.Modalidades aqui incluem um plasmídeo, cromossoma, ADN mitocondrial, ADN de plastídeo, fragmento de ácido nucléico ou vírus tendo pelo menos um cassete de expressão aqui nele incorporado.Uma modalidade fornece um vetor para expressão de proteínas CWD em uma planta.Uma modalidade fornece um vetor de transformação de planta. O vetor de transformação de planta pode ser, mas não está limitado a, um vetor de T-ADN, um vetor binário ou um vetor cointegrado. O vetor de transformação pode incluir qualquer ácido nucléico isolado, sequência de polinucleotídeo ou cassete de expressão aqui.
[0076] Uma modalidade inclui um vetor de expressão incluindo uma sequência de polinucleotídeo capaz de se hibridizar sob condições de baixo, moderado ou elevado rigor com ácido nucléico consistindo em uma sequência incluindo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 63 [pAG 2015], SEQ ID NO: 64 [pAG2048], SEQ ID NO: 65 [pAG2049], SEQ ID NO: 66 [pAG2063], SEQ ID NO: 67 [pAG2069], SEQ ID NO: 68 [pAG2091], SEQ ID NO: 69 [pAG2092], SEQ ID NO: 70 [pAG2096], SEQ ID NO: 71 [pAG2201], SEQ ID NO: 72 [pAG2229], SEQ ID NO: 73 [pAG2233], SEQ ID NO: 74 [pAG2234], SEQ ID NO: 75 [pAG2242], SEQ ID NO: 76 [pAG2252], SEQ ID NO: 77 [pAG2253], SEQ ID NO: 78 [pAG2309], SEQ ID NO: 79 [pAG2310], SEQ ID NO: 80 [pAG2339], SEQ ID NO: 81 [pAG2342], SEQ ID NO: 82 [pAG2345] e SEQ ID NO: 83 [pAG2349].
[0077] Uma modalidade inclui um vetor de expressão incluindo uma sequência de polinucleotídeo tendo pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % de identidade em relação a uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 63 [pAG 2015], SEQ ID NO: 64 [pAG2048], SEQ ID NO: 65 [pAG2049], SEQ ID NO: 66 [pAG2063], SEQ ID NO: 67 [pAG2069], SEQ ID NO: 68[pAG2091], SEQ ID NO: 69 [pAG2092], SEQ ID NO: 70 [pAG2096], SEQ ID NO: 71[pAG2201], SEQ ID NO: 72 [pAG2229], SEQ ID NO: 73 [pAG2233], SEQ ID NO: 74[pAG2234], SEQ ID NO: 75 [pAG 2242], SEQ ID NO: 76 [pAG2252], SEQ ID NO: 77[pAG2253], SEQ ID NO: 78 [pAG2309], SEQ ID NO: 79 [pAG2310], SEQ ID NO: 80[pAG2339], SEQ ID NO: 81 [pAG2342], SEQ ID NO: 82 [pAG2345] e SEQ ID NO: 83 [pAG2349],
[0078] Métodos de hibridização e condições de rigor são conhecidos na técnica e são descritos nos seguintes livros: Molecular Cloning, T. Maniatis, E.F. Fritsch e J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, e Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Siedman, J.A. Smith, K. Struhl, Volume 1, John Wiley & Sons, 2000, os quais são aqui incorporados por referência como se fossem completamente apresentados.
[0079] Condições moderadas podem ser como se segue: filtros carregados com amostras de ADN são pré-tratados durante 2-4 horas, à 68°C, em uma solução contendo salina tamponada com citrato 6 x (SSC; Amresco, Inc., Solon, OH), dodecil-sulfato de sódio à 0,5 % (SDS; Amresco, Inc., Solon, OH), solução de Denhardt 5 x (Amresco, Inc., Solon, OH) e esperma de salmão desnaturado (Invitrogen Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA). A hibridização é realizada na mesma solução com as seguintes modificações: EDTA 0,01 M (Amresco, Inc., Solon, OH), 100 μg/mL de ADN de esperma de salmão e 5 - 20 x 106 cpm de sondas marcadas com 32P ou marcadas de maneira fluorescente. Os filtros são incubados na mistura de hibridização durante 16-20 horas e, então, lavados durante 15 minutos em uma solução contendo SSC 2 x e SDS à 0,1 %. A solução de lavagem é substituída, para uma segunda lavagem, por uma solução contendo SSC 0,1 x e SDS à 0,5 % SDS e incubou-se um adicional de 2 horas à 20°C até 29°C abaixo de Tm (temperatura de fusão em °C). Tm = 81,5°+16,61Logio([Na<+>]/(1,0+0,7[Na<+>]))+0,41(%[G+C])- (500/n)-P-F. [Na+] = Concentração molar de íons sódio. %[G+C] = Percentagem de bases G+C na sequência de ADN. N = Comprimento da sequência de AND em bases. P = uma Correção de Temperatura para pares de bases mal pareadas % (~1°C por 1 % de mal pareamento). F = Correção para concentração de formamida (=0,63°C por 1 % de formamida). Os filtros são expostos para revelação em um formador de imagens ou por autorradiografia. Condições de baixo rigor se referem às condições de hibridização em baixas temperaturas, por exemplo, entre 37°C e 60°C, e com a segunda lavagem com [Na+] mais elevada (até 0,825 M) e em uma temperatura de 40°C até 48°C abaixo da Tm. Elevado rigor se refere às condições de hibridização em temperaturas elevadas, por exemplo, acima de 68°C, e com a segunda lavagem com [Na+] = 0,0165 até 0,0330 M em uma temperatura 5°C até 10°C abaixo da Tm.
[0080] Uma modalidade fornece uma sequência de ácidos nucléicos isolada tendo uma sequência, que se hibridiza, sob condições de baixo, moderado ou elevado rigor, um ácido nucléico consistindo em uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 32 [WT P77853], SEQ ID NO: 33 [AnfaeA], SEQ ID NO: 34 [AnfaeB], SEQ ID NO: 35 [NtEGm], SEQ ID NO: 36 [EU591743], SEQ ID NO: 37 [043097], SEQ ID NO: 38 [P77853:T134-100-101] e SEQ ID NO: 39 [P77853:S158-30-108-35], de SEQ ID NO: 40 [033897], SEQ ID NO: 41 [068438], SEQ ID NO: 42 [P54583], e SEQ ID: 43 [BD22308], SEQ ID NO: 52 [BAASS:P77853], SEQ ID NO: 53 [BAASS:O33897], SEQ ID NO: 54 [HVAlePS:NtEGm], SEQ ID NO: 55 [BAASS: P77853:S158-30-108-35], SEQ ID NO: 56 [BAASS:AnfaeB:SEKDEL], SEQ ID NO: 57 [BAASS:AnfaeA:SEKDEL], SEQ ID NO: 58 [PR1a:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 59 [BAASS: P77853:T134-100-101 :SEKDEL], SEQ ID NO: 60 [HvAleSP:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 61 [BAASS:O43097:SEKDEL] e SEQ ID NO: 62 [xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01], SEQ ID NO: 63 [pAG2015], SEQ ID NO: 64 [pAG2048], SEQ ID NO: 65 [pAG2049], SEQ ID NO: 66 [pAG2063], SEQ ID NO: 67 [pAG2069], SEQ ID NO: 68 [pAG2091], SEQ ID NO: 69 [pAG2092], SEQ ID NO: 70 [pAG2096], SEQ ID NO: 71 [pAG2201], SEQ ID NO: 72 [pAG2229], SEQ ID NO: 73 [pAG2233], SEQ ID NO: 74 [pAG2234], SEQ ID NO: 75 [pAG 2242], SEQ ID NO: 76 [pAG2252], SEQ ID NO: 77 [pAG2253], SEQ ID NO: 78 [pAG2309], SEQ ID NO: 79 [pAG2310], SEQ ID NO: 80 [pAG2339], SEQ ID NO: 81 [pAG2342], SEQ ID NO: 82 [pAG2345] e SEQ ID NO: 83 [pAG2349] ou o complemento das mesmas.
[0081] Uma modalidade fornece um fragmento de qualquer um dos ácidos nucléicos isolados acima. O fragmento pode ser uma sonda ou iniciador de hibridização. A sonda ou o iniciador pode ter qualquer tamanho. A sonda ou o iniciador pode ter 6,10,15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 nucleotídeos de comprimento, ou ter um comprimento em uma faixa entre quaisquer dois dos comprimentos anteriores (pontos finais, inclusive). Um fragmento pode ter um comprimento menor do que o comprimento completo e/ou incluir substituições ou de eliminações em comparação à sequência de referência citada. O fragmento pode ser uma variante da sequência de referência citada. Um peptídeo codificado por um fragmento pode ter um comprimento menor do que o comprimento completo e/ou incluir substituições ou de eliminações em comparação à sequência de aminoácidos codificada pela sequência de referência citada. O peptídeo com um comprimento menor do que o comprimento completo pode ser uma variante da sequência de aminoácidos codificada pela sequência de referência citada.
[0082] Um cassete de expressão pode ser gerado de maneira recombinante por métodos conhecidos.Um cassete de expressão pode incluir uma série de elementos de ácidos nucléicos especificados, que permitam a transcrição de um ácido nucléico em particular em uma célula de planta ou em um tecido de planta. O cassete de expressão pode incluir uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma proteína. A proteína pode ser uma enzima CWD ou uma enzima CWD modificada com inteína.A enzima CWD pode ser selecionada a partir da lista de enzimas CWD consistindo em: xilanases, endoglicanases, exoglicanases, xilosidases, glicosidases e feruloil esterases.
[0083] Uma sequência de polinucleotídeo em um cassete de expressão, ácido nucléico isolado, vetor ou qualquer outro construto de ADN aqui, ou utilizada em um método aqui pode ser operativamente conectada a um ou mais elementos reguladores. Um elemento regulador incluído pode ser um promotor. O promotor pode ser um promotor constitutivo, que forneça transcrição das sequências de polinucleotídeo ao longo de toda a planta na maioria das células, tecidos e órgãos e durante muitos, mas não necessariamente todos, estágios de desenvolvimento. O promotor pode ser um promotor induzível, que inicie a transcrição das sequências de polinucleotídeo somente quando exposto a um ente químico ou estímulo ambiental em particular. O promotor pode ser específico em relação a um estágio de desenvolvimento, órgão ou tecido em particular. Um promotor específico quanto ao tecido pode ser capaz de iniciar a transcrição em um tecido de planta em particular. O tecido de planta que pode ser alvo de um promotor específico quanto ao tecido pode ser, mas não está limitado a, um tronco, folhas, tricomas, anteras ou sementes. Um promotor constitutivo aqui pode ser o promotor de Ubiquitina 3 do arroz (OsUbi3P) ou o promotor de Actina 1 do arroz. Outros promotores constitutivos conhecidos podem ser usados, e incluem, mas não estão limitados a, o promotor 35S do Vírus do Mosaico da Couve-Flor (CAMV), o promotor do Vírus Enrolador de Folhas Amarelo do Cestrum (CMP) ou a versão curta do CMP (CMPS), o promotor da subunidade pequena do Rubisco e o promotor de ubiquitina do milho. O promotor específico quanto ao tecido pode incluir o promotor específico quanto à semente. O promotor específico quanto à semente pode ser, mas não está limitado a, o promotor GluB4 do arroz ou o promotor de zeína do milho. Outro elemento regulador, que pode ser fornecido, é uma sequência de terminador, que termina a transcrição. Uma sequência de terminador pode ser incluída na extremidade 3’ de uma unidade transcricional do cassete de expressão. O terminador pode ser derivado a partir de uma variedade de genes de plantas. O terminador pode ser uma sequência de terminador a partir dos genes de nopalina sintase ou de octopina sintase de Agrobacterium tumefaciens.
[0084] Vetores que incorporam um cassete de expressão aqui também podem incluir elementos genéticos adicionais, tais como múltiplos sítios de clonagem, para facilitar a clonagem molecular, e marcadores de seleção, para facilitar a seleção. Um marcador selecionável, que pode ser incluído em um vetor, pode ser um gene de fosfomanose isomerase (PMI) de Escherichia coli, que confere à célula transformada a capacidade de utilizar manose para o crescimento.Marcadores selecionáveis, que podem ser incluídos em um vetor, incluem, mas não estão limitados a, um gene de neomicina fosfotransferase (npt), que confere resistência à kanamicina, um gene de higromicina fosfotransferase (hpt), que confere resistência à higromicina, e um gene de enol-piruvil-shikimato-3-fosfato sintase, que confere resistência ao glifosato.
[0085] Em uma modalidade, o vetor pode ser construído para incluir sequências de polinucleotídeo, que codifica múltiplas enzimas CWD. Um vetor aqui pode incluir adicionalmente uma sequência de polinucleotídeo, projetado para silenciar um gene ou genes em uma planta.
[0086] Um vetor de expressão pode ser introduzido em células, tecidos, órgãos e/ou organismos de hospedeiros adequados.Hospedeiros adequados podem ser plantas dicotiledôneas (dicots) ou monocotiledôneas (monocots).
[0087] Modalidades adequadas aqui podem ser formadas por suplementação de uma modalidade com um ou mais elementos a partir de qualquer um ou mais outras modalidades aqui, e/ou substituição de um ou mais elementos a partir de uma modalidade com um ou mais elementos a partir de um ou mais outras modalidades aqui.Modalidades adicionais aqui podem ser descritas por referência a qualquer uma das reivindicações apensas seguindo a reivindicação 1 e por leitura da reivindicação escolhida a depender de qualquer uma ou mais reivindicações precedentes.
Exemplos
[0088] Os seguintes exemplos não limitantes são fornecidos para ilustrar modalidades particulares.As modalidades no seu todo podem ser suplementadas com um ou mais detalhes a partir de um ou mais exemplos abaixo, e/ou um ou mais elementos a partir de uma modalidade podem ser substituídos por um ou mais detalhes a partir de um ou mais exemplos abaixo.
Exemplo 1- Materiais e métodos Vetores
[0089] Um projeto de vetor aqui se baseia no plasmídeo intermediário pSB11, disponível a partir de Japan Tobacco e nos Pedidos Internacionais de números PCT/USIO/55746 depositado em 05 de novembro de 2010, PCT7USI0/55669 depositado em 05 de novembro de 2010 e PCT/USIO/55751 depositado em 05 de novembro de 2010, os quais são aqui incorporados por referência como se fossem completamente apresentados. De maneira breve, o plasmídeo pSB11 usado para clonagem é conjugado com o vetor aceptor de pSB1, plasmídeo Ti desarmado, através de recombinação homóloga usando sítios de cos e de ori presentes tanto em pSB11 quanto em pSB1. O vetor integrado contém genes de virulência, tais como virB, virC e virG, necessários para transferência de T-ADN e que podem ser usados para transformação de plantas. O vetor de transformação de base inclui um cassete de expressão contendo um gene man A, que codifica PMI sob o controle do promotor de CPMS mais tarde substituído pelo promotor de OsUbi3P. Esse vetor de base foi usado para se obter os vetores listados abaixo, que são usados para transformação de plantas e expressão de enzimas que degradam a parede celular in planta-. - pAG2015(SEQ ID NO: 63): Osllbi3P:P77853; - pAG2048 (SEQ ID NO: 64): OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm entre o promotor Ubi3 de arroz fundido a vacúolo; - pAG2049 (SEQ ID NO: 65): OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL; - pAG2063 (SEQ ID NO: 66): Osllbi3P:BAASS:O43097:SEKDEL; - pAG2069 (SEQ ID NO: 67): OsUbi3P:O68438; - pAG2091 (SEQ ID NO: 68): OsUbi3P: BAASS: AnfaeA:SEKDEL OsUbi3P:BAASS:P77853; 2. pAG2092 (SEQ ID NO: 69): OsUbi3P:BAASS:AnfaeB:SEKDEL OsUbi3P:BAASS:P77853; -pAG2096 (SEQ ID NO: 70): OsUbi3P:BAASS:AnfaeA:SEKDEL Osllbi3P:BAASS:AnfaeB:SEKDEL + OsUbi3P: BAASS: P77853; - pAG2201 (SEQ ID NO: 71): Osllbi3P:ZmUBQm:P77853; - pAG2229 (SEQ ID NO: 72): Osllbi3P:BAASS:P77853:T134-100-101 :SEKDEL (xilanase modificada com inteína); - pAG2233 (SEQ ID NO: 73) Osllbi3P:P77853:S158-30-108-35; - pAG2234(SEQ ID NO: 74) Osllbi3P:BAASS:P77853:S158-30-108-35; - pAG2242 (SEQ ID NO: 75): OsUbi3P:PR1aSP:NtEGm:SEKDEL + OsUbi3P:ZmUBQm:P77853; - pAG2252 (SEQ ID NO: 76): Osllbi3P:O33897 (endoglicanase); - pAG2253 (SEQ ID NO: 77): Osllbi3P:BAASS:O33897; - pAG2309 (SEQ ID NO: 78): OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm + Osllbi3P:P77853; - pAG2310 (SEQ ID NO: 79): Osllbi3P:EU591743 (xilanase); - pAG2339 (SEQ ID NO: 80): OsUbi3P:O68438 + OsUbi3P:BAASS:O33897 + OsUbi3P:EU591743; - pAG2342 (SEQ ID NO: 81): OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL + Osllbi3P:P77853; - pAG2345 (SEQ ID NO: 82): OsUbi3P:O68438 + OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL + OsUbi3P:BAASS:O43097:SEKDEL; - pAG2349 (SEQ ID NO: 83): ZmUbi1P:ZmKozak:xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01 + OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL + OsUbi3P:BAASS:O43097:SEKDEL; - pAG2042 (SEQ ID NO: 84): P54583 (endoglicanase EGB)
Produção de plantas de milho transgênicas
[0090] Os métodos para transformação de milho e de grama de crescimento rápido foram descritos nos Pedidos Internacionais de números PCT/USIO/55746 depositado em 05 de novembro de 2010, PCT/USI0/55669 depositado em 05 de novembro de 2010 e PCT/USIO/55751 depositado em 05 de novembro de 2010, e em Gray et al., 2011 Plant Biotech J 9:1100, os quais são aqui incorporados por referência como se fossem completamente apresentados. De maneira breve, calo embrionário a partir de milho AxB de tipo selvagem foi inoculado com células de Agrobacterium LBA4404 abrigando o plasmídeo de transformação apropriado. A transformação mediada por Agrobacterium de embriões de milho imaturos foi realizada conforme descrito previamente (Negrotto D et al., 2000 Plant Cell Rep 19: 798; Ishida Y et al., 1996 Nat Biotech 14: 745). Os cassetes de expressão para genes de enzimas foram clonados nos sítios Kpnl-EcoRI do vetor pAG2004 (SEQ ID NO: 85), para gerar um vetor intermediário capaz de se recombinar com o vetor pSB1 em pareamento triparental em cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 usando os procedimentos relatados previamente (Ishida Y et al., 1996 Nat Biotech 14: 745; Hiei Y et al., 1994 Plant J 6: 271; Hiei Y e Komari T 2006 Plant Cell Tissue Organ Cult. 85:27; Komari T et al., 1996 Plant J 10: 165). Plantas de estoque de milho (cultivares de Zea mays Hill, A188 ou B73) foram cultivadas em uma estufa, sob 16 horas de luz do dia à 28°C. Embriões zigóticos imaturos foram isolados a partir dos miolos e inoculados com a solução de Agrobacterium contendo os genes de interesse. Depois de inoculação de embriões imaturos foram cultivados em um processo de cultura de tecidos durante 10-12 semanas. Mudas bem desenvolvidas, com folhas e raízes, foram amostradas para análise por PCR, para identificar plantas transgênicas contendo os genes de interesse. Plantas positivas em PCR e enraizadas foram enxaguadas com água para remover por lavagem o meio de agar, e foram transplantadas para solo e cultivadas na estufa, para gerar sementes e caules e folhas.
[0091] Refere-se a plantas transgênicas em particular aqui por uma designação de enzima (por exemplo; “P77853”, “P40942”, “030700”, “NtEGm” etc.) ou controle transgênico (por exemplo; “TGC” etc.) seguida por um número na casa dos milhares, que designa o plasmídeo usado para criar a planta transgênica (por exemplo; “2014”, “2015”, “2229”, “2092”, etc.). Caracteres adicionais são inseridos ocasionalmente, mas i) a enzima ou o controle e ii) a designação do plasmídeo são claros no contexto. Os plasmídeos, aos quais se refere, são denominados pAGXXXX. Por exemplo, as designações “2229”, “2252”, “2253”, “2092”, “2096” ou “2042”, no nome de uma planta transgênica, significa que a planta transgênica foi feita por transformação com “pAG2229”, “pAG2252”, “pAG2253”, “pAG2092”, “pAG2096” ou “pAG2042”, respectivamente. Pode ser feita referência às sequências incorporadas, marcadas com os nomes de plasmídeo, para determinar sequências usadas para fazer uma planta transgênica em particular.
[0092] Para geração de plantas de crescimento rápido transgênicas, sementes a partir de Panicum virgatum, cultivar Alamo, foram usadas para iniciar linhagens de calo embrionário, subsequentemente usadas para transformação usando Agrobacterium LBA4404 abrigando o plasmídeo pSB1. A presença do gene de interesse foi confirmada por PCR, usando iniciadores específicos quanto ao gene.
[0093] As seguintes plantas transgênicas foram usadas para pré-tratamento e hidrólise consolidados: - Plantas de milho de tipo selvagem usada como controles negativos (AxB; BxA); - Plantas de milho transformadas com um vetor vazio usadas como controles negativos (TGC.4000.12; TGC.4000.11; TGC.2004.8.02; TGC.2004.8.04; TGC.2243.01); - Uma planta de milho transgênica XynA.2015.05 feita por transformação com pAG2015 e que expressa xilanase XynA (P77853); - Uma planta de milho transgênica de segunda geração XynA.2015.5TI feita por transformação com pAG2015 e que expressa xilanase XynA (P77853); - Uma planta de milho transgênica XynB.2063.17 feita por transformação com pAG2063 e que expressa xilanase XynB (043097); - Plantas de milho transgênicas EGA.2049.02 e EGA.2049.10 feitas por transformação com pAG2049 e que expressam endoglicanase EGA (NtEG); - Uma planta de milho transgênica EGB.2042.03 feita por transformação com pAG2042 e que expressa endoglicanase EGB (P54583); - Uma planta de milho transgênica EGC.2253.4b feita por transformação com pAG2253 e que expressa endoglicanase EGC (033897); - Uma planta de milho transgênica EGA/XynA.2242.09 feita por transformação com pAG2242 e que expressa endoglicanase EGA (NtEG) e xilanase XynA (P77853); - Uma planta de milho transgênica de segunda geração da planta 9, acima, chamada EGA/XynA.2242.09.16T1, e que expressa endoglicanase EGA (NtEG) e xilanase XynA (P77853); - Uma planta de milho transgênica XynA/AccB.2092.103 feita por transformação com pAG2092 e que expressa xilanase XynA (P77853) e feruloil esterase B a partir de Aspergillus niger, - Plantas de milho transgênicas XynA/AccA/B.2096.01 e XynA/AccA/B.2096.05 feitas por transformação com pAG2096 e que expressam xilanase XynA (P77853), feruloil esterase A, a partir de Aspergillus niger, e feruloil esterase B, a partir de Aspergillus niger, - Uma planta de milho transgênica CBHA.2069.3.17 feita por transformação com pAG2069 e que expressa exoglicanase CBH (068438); - Plantas de grama de crescimento rápido transgênicas XynA.pv2015.3c e XynA.pv2015.4c feitas por transformação com pAG2015 e que expressam xilanase XynA (P77853); - Uma planta de milho transgênica iXynA.2229.110 feita por transformação com pAG2229 e que expressa xilanase modificada com inteína XynA (P77853); - Plantas de milho transgênicas XynA/EGA.2309.54 e XynA/EGA.2309.107 feitas por transformação com pAG2309 e que expressam XynA (P77853), endoglicanase EGA(NtEGm); - Uma planta de milho transgênica XynA/EGA.2342.105 feita por transformação com pAG2342 e que expressa XynA (P77853) e EGA(NtEGm); - Plantas de milho transgênicas XynE/EGC/CBHA.2339.03, XynE/EGC/CBHA.2339.04 e XynE/EGC/CBHA.2339.05 feitas por transformação com pAG2339 e que expressam XynE (EU591743), endoglicanase EGC(O33897) e CBHA (068438); - Uma planta de milho transgênica XynB/EGA/CBHA.2345.116 feita por transformação com pAG2345 e que expressa XynB (043097), endoglicanase EGA(NtEGm) e CBHA (068438); - Plantas de milho transgênicas XynB/EGA/CBHB.2349.55 e XynB/EGA/CBHB.2349.56 feitas por transformação com pAG2349 e que expressam XyanB (043097), endoglicanase EGA(NtEG), CBHB (BD22308) e ZmUbi1P:ZmKozak:xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD- 01:NosT.
Caules e folhas (stover) de plantas
[0094] Caules e folhas de milho de estufa colhidos foram secados em um circulador de ar à 37°C, durante 1-2 semanas. Depois da secagem, os caules e as folhas foram cortados manualmente em pedaços de 1,0-1,5 polegadas e, então, moídos usando-se um moinho UDY (Modelo 014, UDY Corporation, Fort Collins, CO) com uma peneira de 0,5 mm.
Preparação de extratos de proteínas de plantas
[0095] Grãos esmagados individuais ou 20 mg de caules e folhas moídos foram ressuspensos em tampão de extração de proteína, que inclui fosfato de sódio 100 mM (pH 6,5), ácido etilenodiamino-tetracético (EDTA; 1 mM), Triton X-100 (0,1 %, v/v) e fluoreto de fenil-metano-sulfonila (PMSF; 0,1 mM). As amostras de tecidos ressuspensas foram completamente misturadas e o material insolúvel foi, então, sedimentado por centrifugação.A proteína solúvel contendo líquido sobrenadante foi transferida para um novo tubo.
Entes químicos e enzimas
[0096] Padrões de açúcares (glicose, xilose, arabinose, galactose, manose e celobiose) foram adquiridos de Acros Organics (Morris Plains, NJ).Todos os outros entes químicos usados neste estudo foram adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).Endoglicanase (C8546), β-glicosidase (49291) e endoxilanase (X2753), para preparação do coquetel doméstico (in house), foram todas adquiridas de Sigma (St. Louis, MO).A celobioidrolase (CBHI) (EC 3.2.1.91) e a β-xilosidase (EC 3.2.1.37) foram adquiridas de Megazyme (Wicklow, Irlanda).Accellerase® 1500 e Accellerase® XY foram doações generosas de Genencor International (Rochester, NY).A levedura Saccharomyces cerevisiae, cepa D5A, foi obtida a partir de American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA).
Ensaios com enzimas de caules e folhas
[0097] Proteína foi extraída a partir de 15 mg de caules e folhas em 500 μL de tampão de extração (tampão de fosfato de sódio 100 mM, pH 6.5; NaOAc, pH 4,5; ou Tris, pH 8,0, EDTA (10 mM) e Triton X-100 (0,1 %), depois de incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente. Os caules e as folhas foram precipitados por centrifugação. O sobrenadantes foi coletado e transferido para um novo tubo de Eppendorf. Para os ensaios com enzimas, 50 μL de extrato de proteína foram ressuspensos em um tampão. Tipicamente, o tampão incluía Xylazyme em fosfato de sódio 100 mM, pH 6,5, ou Cellazyme em NaOAc 100 mM, pH 4,5. Tabletes de Xylazyme AX ou Cellazyme foram usados conforme era apropriado para cada tubo de ensaio com enzima. As reações foram incubadas na temperatura de ensaio (usualmente, aproximadamente 50-60°C, dependendo da enzima sendo testada) até que uma cor azul fosse visível no líquido sobrenadante. A quantidade de corante azul foi quantificada por medição de absorbância da reação em 590 nm.Os controles para essa reação incluíram enzimas e extratos cultivados microbianamente a partir de plantas de tipo selvagem. Os substratos de hidrólise também podem ser determinados por uso de substrato conjugado a AZCL (Megazyme) ao invés dos tabletes de Xylazyme AX e de Cellazyme. O uso do substrato conjugado a AZCL propicia a otimização tanto do volume de caules e folhas sendo testados quanto da concentração de substrato.
Detecção de atividade de xilanase
[0098] Proteínas solúveis foram ensaiadas usando-se Xylazyme AX (Megazyme, Bray, Co., Wicklow, Irlanda) como um substrato, em reações de 0,5 ml_ à 50°C, em tampão HEPES (100 mM, pH 8,0) para BSX, ou em fosfato de sódio (100 mM, pH 6,5) para XynB. para interromper as reações de Xylazyme AX, foi adicionado 1 ml_ de base Tris à 2 % (p/v) às reações. O material insolúvel a partir da reação de Xylazyme AX foi sedimentado por centrifugação, e a absorbância da reação em 100 μL do sobrenadante foi medida em triplicata espectrofotometricamente à 590 nm. Para quantificação dos níveis de acumulação de BSX ou de XynB, curvas de calibração foram construídas por incubação de quantidades conhecidas de BSX ou de XynB cultivadas microbianamente, purificadas, diluídas em tampão de ensaio com tabletes de Xylazyme AX concorrente com os ensaios com Xylazyme AX usando-se material de planta transgênico.
[0099] A Tabela 1, abaixo, demonstra as atividades de enzimas detectadas em plantas transgênicas.Conforme indicado, as atividades de enzimas foram detectadas para várias xilanases, endoglicanases, celobioidrolases e feruloil esterases. Para cada evento transgênico, a atividade de enzima detectada também foi confirmada por análise Western blot. “N/A” se refere à análise ainda não realizada.Tabela 1
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Análise de composição em carboidratos da biomassa
[0100] Antes da análise de composição em carboidratos, duplicatas de 3,0 g de caules e folhas moídos secos ao ar foram refluxados com etanol à 90 % (v/v) usando-se um sistema de extração Soxhlet de vidro (Fisher Scientific, Pittsburg, PA), para remover os materiais removíveis por etanol, seguindo-se os padrões NREL (NREL/TP-510-42619). Os extratos contendo etanol foram evaporados sob vácuo usando-se um evaporador rotativo equipado com um banho de água ajustado para 40°C (Heidolph LR4000 G5B, IL, EUA). O teor em extrato foi determinado pelo peso dos sólidos no frasco depois de secagem em forno à 50°C, durante 48 horas.
[0101] Os caules e as folhas livres de extrato foram submetidos a uma hidrólise ácida em duas etapas (NREL/TP-510-42618), os quais foram primeiro hidrolisados à 30°C com 1,5 mL de H2SO4 à 72 % (p/p) por 0,16-0,18 g (peso seco em ar) durante 60 minutos, seguido por 121°C durante 1 hora com suplementação de 42,0 mL de água. Depois da hidrólise ácida, foram adicionados hidróxido de sódio e hidróxido de cálcio, para ajustar o pH para entre 4,0 e 9,0 e todas as amostras foram filtradas através de filtros de PVDF de 0,2 μm (Fisher Scientific, Pittsburg, PA) para análise por cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC).
Processo consolidado com pré-tratamento e sacarificação moderados
[0102] Para avaliar o efeito das enzimas CWD expressas em plantas sobre a hidrólise de caules e folhas, foi desenvolvido um processo consolidado, que inclui um pré-tratamento brando seguindo por hidrólise enzimática sem o interestágio de lavagem da biomassa / desintoxicação. O processo consolidado remove quaisquer etapas de lavagem / separação / desintoxicação e permite um processo de pré-tratamento e de sacarificação e de fermentação simultâneas (SSF) integrado.
[0103] Pré-tratamento moderado - Um pré-tratamento brando eficiente foi desenvolvido, com o qual se pode conseguir alguns efeitos de pré-tratamento sobre biomassa, mas que não desativa as enzimas hidrolíticas dentro da planta. O ente químico de pré-tratamento era uma mistura de bissulfito de amónio 0,02 M - 0,18 M e de carbonato de amónio 0,025 M-0,20 M com pH entre 5,0 e 9,0, de preferência, em torno de 8,10. Para avaliar a hidrólise de caules e folhas de plantas, 20,0 mg de caules e folhas de milho moídos foram adicionados a tubos de microcentrífugas de 2 mL, com solução química de pré-tratamento em uma razão de licor para sólido (L/S) de 10 ou menos (de preferência, 3 - 6). O pré- tratamento foi incubado em um agitador à 350 rpm e em uma temperatura de 40°C - 95°C durante 0-16 horas. Para caules e folhas moídos e não moídos, um refino mecânico ou desfibrilação seguiu o pré-tratamento com entes químicos. Além disso, o material pré- tratado foi submetido à hidrólise enzimática sem lavagem interestágios.
[0104] Hidrólise enzimática - Os caules e as folhas pré-tratados foram submetidos à hidrólise enzimática em politampão de Britton-Robinson (fosfato 40 mM, acetato 40 mM, borato 40 mM) com azida de sódio. A hidrólise enzimática foi conduzida em teor em sólidos de 2 % (p/v), pH 4,9, 50°C, em um agitador New Brunswick (New Brunswick Scientific, New Jersey EUA) à 250 rpm, durante um tempo variável (0-144 horas). O coquetel #1 foi carregado como endoglicanase 0,5 μM, celobioidrolase (CBHI) 0,1 pM, β-glicosidase 0,05 pM e endoxilanase 0,5 pM, com base em 10,0 mg de caules e folhas com volume de reação de 1 mL. O coquetel #5 era o coquetel #1 com β-xilosidase 0,1 pM adicionada. Em conjunção, três tipos de hidrólise enzimática foram realizadas em paralelo: sem coquetel de enzimas (NCt), um coquetel de enzimas completo (FCt) e um coquetel de enzimas carecendo da enzima expressa in planta (Ct-PE), por exemplo, um coquetel de enzimas carecendo de endoxilanase (Ct-Xyn) ou de endoglicanase (Ct-EG) ou de ambas (Ct-EG- Xyn) dependendo da enzima expressa nas plantas. Accellerase® 1500 foi carregada em 0,2 mL/g de massa seca e Accellerase® XY foi carregada em 0,1 mL/g de massa seca. Os rendimentos em glicose e em xilose (% do teórico) foram expressos como uma percentagem de glicose e de xilose total em cada substrato. Barras de erro nas FIGs acompanhantes são o desvio padrão da média de ensaios em replicata.
Sacarificação e fermentação simultâneas (SSF)
[0105] O inoculo foi preparado por cultivo da cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae D5A até uma DOβoo de 0,5 em YPD (10 g/L de extrato de lêvedo, 20 g/L de peptona e 20 g/L de dextrose) à 30°C e 250 rpm. As células foral coletadas por centrifugação (3.000 g durante 5 minutos) e novamente suspensas em um meio YP 1X (10 g/L de extrato de lêvedo e 20 g/L de peptona).
[0106] Foram realizados experimentos de SSF em duplicata em frascos de vidro Erlenmeyer de 250 mL com um volume de trabalho de 50 mL, consistindo em 3,0- 4,0 g (peso seco) de biomassa pré-tratada, tampão de Britton-Robinson, YP 10 X (100 g/L de extrato de lêvedo e 200 g/L de peptona), inóculos e enzimas hidrolíticas. Os frascos foram selados por uma rolha de borracha com um bloqueio de ar. Os experimentos foram iniciados por adição de inóculos de levedura e enzimas (Accellerase® 1500 à 10 FPU/g de massa seca e Accellerase® XY à 0,1 mL/g de massa seca), e foram incubados à 35°C e 120 rpm durante 7 dias. Amostras foram retiradas depois de 0, 24, 48, 72, 144 e 168 horas e analisadas para etanol e açúcares.
Análise de açúcares fermentáveis e etanol
[0107] As amostras de hidrolase foram aquecidas à 90°C durante 20 minutos e, então, centrifugadas à 10.000 g, depois do quê os sobrenadantes foram clarificados por passagem através de filtros de PVDF de 0,20 μm (Cat. #: 09-910-13, Fisher Scientific, Pittsburg, PA). As concentrações de monossacarídeos de dissacarídeos foram determinadas por cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC), usando-se uma bomba binária Shimadzu LC-20 AD com programas de computador para soluções de CL (Shimadzu, Kioto, Japão). As concentrações de açúcares foram determinadas usando-se uma coluna para açúcares Aminex HPX-87P (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) operando em 0,6 mL/min e 80°C, com água desgaseificada como a fase móvel. A concentração em etanol no caldo de fermentação foi analisada usando-se uma coluna para ácido Aminex HPX-87H Column (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) operando em 0,6 mL/min, 60°C com ácido sulfúrico 0,004 M como a fase móvel. As áreas dos picos para todas as amostras, analisadas com um detector de RI (RID 10AD), foram integradas e os valores foram comparados às curvas padrão para quantificação.
Exemplo 2 - Análise de composição em carboidratos nos caules e nas folhas de plantas
[0108] Os caules e as folhas de plantas transgênicas foram caracterizados em termos de sua composição em carboidratos estruturais e do teor em açúcares, para examinar quaisquer mudanças significativas causadas por modificação genética. A Tabela 2 mostra resultados da análise em carboidratos estruturais de eventos em milho e em grama de crescimento rápido transgênicos e não transgênicos amostrados de maneira aleatória.Os teores em glicana e em xilana a partir de um conjunto de plantas transgênicas, sejam expressando uma única ou múltiplas enzimas CWD, sejam carecendo de um transgene, que codifique uma enzima CWD (controle transgênico TGC), são similares às plantas de controle de tipo selvagem (AxB).Tabela 2. Teor em glicana e em xilana de plantas transgênicas (expressando CWD ou TGC) versus plantas (AxB) de controle de tipo selvagem.
Figure img0003
[0109] Um teste t de Student dos dados apresentados na Tabela 2 mostra não haver diferença significativa na quantidade de glicana entre eventos de milho transgênico, que expressa enzimas CWD e milho AxB de tipo selvagem, ou entre eventos de milho transgênico, que expressa enzimas CWD e eventos de controle transgênico, que não expressam uma enzima CWD com um valor P de 0,90 e de 0,14, respectivamente. Os valores P correspondentes, a partir de um teste t no teor em xilana, são de 0,57 e de 0,36, respectivamente.
[0110] Portanto, a expressão in planta de enzimas fornece uma oportunidade para produção não somente de enzimas de baixo custo, mas, também, de matérias-primas de biomassa com características hidrolíticas para produção barata de açúcares fermentáveis. Exemplo 3 - Efeito de enzimas CWD expressas em plantas na hidrólise de biomassa Metodologia para avaliação de hidrólise de biomassa em plantas
[0111] Um dos objetivos da expressão de enzimas CWD in planta é eliminar ou reduzir a severidade das condições de pré-tratamento químico para o processamento de biomassa lignocelulósica.
[0112] Para avaliar os efeitos de enzimas CWD expressas em plantas sobre a hidrólise de biomassa, um processo consolidado com pré-tratamento químico moderado (pH 5,0 - 9,0, 55°C, durante 16 horas) seguido por uma hidrólise enzimática (pH 4,9, 50°C, durante 72 horas) sem lavagem interestágios, foi desenvolvido e escolhido como um procedimento padrão para a seleção inicial de caules e folhas de plantas. Nesse processo, coquetéis de enzimas domésticos (coquetel #1 e coquetel #5) foram usados para avaliação. O coquetel doméstico é uma combinação de componentes de enzima individuais, que permite a omissão de qualquer componente que dependa da identidade da(s) enzima(s) expressa(s) in planta. Para cada conjunto de caules e folhas de plantas transgênicas e caules e folhas de plantas de tipo selvagem ou de controle transgênicas, os seguintes tratamentos para hidrólise enzimática foram realizados em paralelo: sem coquetel de enzimas (NCt), coquetel completo (FCt) e coquetel carecendo da enzima expressa in planta (Ct-PE; por exemplo, coquetel carecendo de xilanase (Ct-Xyn), coquetel carecendo de endoglicanase (Ct-EG) ou coquetel carecendo tanto de xilanase quanto de endoglicanase (Ct-Xyn-EG)).
[0113] Para determinar qual enzima ou enzimas suportam bom desempenho de hidrólise, dois critérios foram usados para avaliar as características de processamento de eventos transgênicos, que expressam enzimas CWD, na seleção inicial: - Rendimento em açúcares total a partir da hidrólise com coquetel completo (FCt) (altura (1)nas FIGs 2A-2b). - Diferença de rendimentos em açúcares entre hidrólises envolvendo o coquetel completo (FCt) e o coquetel de enzimas sem a enzima que é expressa in planta ((Ct-PE) (altura (2) nas FIGs 2A-2B).
[0114] Os açúcares totais produzidos (altura (1)) a partir do processamento é um critério a ser considerado porque eles afetam diretamente o rendimento em produtos finais, a produtividade e o custo operacional. Com a expressão in planta de enzimas CWD, foi demonstrado que plantas transgênicas que expressam enzimas alcançaram melhor hidrólise global do que uma planta de controle sob as mesmas condições de processamento, o que foi demonstrado a partir dos rendimentos em glicose e em xilose totais, na FIG. 2. O segundo critério, a diferença de rendimentos em açúcares entre FCt e Ct-PE (altura (2)) representa um efeito de enzimas expressas em plantas sobre a hidrólise. Quando se usa essas plantas transgênicas como matérias-primas de biomassa, observou- se que enzimas externas no coquetel de enzimas podem ser parcialmente ou completamente substituídas por uma enzima CWD ou enzimas CWD expressas em plantas transgênicas, embora alcançando hidrólise similar ou igual, o que é indicado por uma mudança menor ou nenhuma diferença em rendimento em açúcares entre hidrólise FCt e Ct-PE (FIG. 2B).
Avaliação da hidrólise de caules e folhas de plantas
[0115] Usando-se os dois critérios de seleção identificados acima, a hidrólise enzimática de amostras de caules e folhas com o coquetel doméstico foi feita para selecionar o desempenho de diferentes plantas de milho transgênicas diferentes expressando enzimas CWD. Com base nos resultados dessa seleção, os eventos de plantas transgênicas de melhor desempenho foram identificados e incluíram plantas transgênicas que expressam xilanase XynA.2015.05 e XynB.2063.17; plantas transgênicas que expressam endoglicanase EGA.2049.10 e EGB.2042.03 e plantas transgênicas que expressam múltiplas enzimas - XynA/AccA/B.2096.01, XynA/AccB.2092.103, EGA/XynA.2242.09, XynB/EGA/CBHA.2345.116, XynB/EGA/CBHB.2349.55 XynB/EGA/CBHB. 2349.56 e XynB/EGA/CBHB.2349.229.
[0116] A FIG. 2 ilustra os rendimentos em glicose (FIG. 2A) e em xilose (FIG. 2B) depois da hidrólise de material a partir de uma planta transgênica que expressa xilanase A (XynA; XynA.2015.05) e de uma planta de controle transgênica TGC.4000.12, que não expressa uma enzima CWD (TGC.4000.12). Os dados sobre rendimentos em açúcares a partir do evento transgênico XynA.2015.05 e do controle transgênico, depois da hidrólise enzimática por FCt (coquetel #5 doméstico), NCt e Ct-Xyn (coquetel #5 doméstico carecendo de xilanase A) foram avaliados usando-se os critérios de seleção listados acima. O valor de um rendimento em glucose total depois de tratamento com FCt (critério 1) mostrou-se comosendo mais elevado do que a diferença em valores de rendimento em glicose entre tratamentos com FCt e com Ct-Xyn (critério 2), tanto para XynA.2015.05 quanto para TGC.4000.12. O valor dos rendimentos em glicose e em xilose para todos os tratamentos foi mais elevado para o evento transgênico XynA.2015.05 do que para a planta de controle TGC.4000.12. De maneira interessante, a diferença em rendimentos em glicose e em xilose, depois dos tratamentos com um coquetel de enzimas completo e com um coquetel de enzimas sem a xilanase A expressa em planta foi muito pequena. Com base nesses resultados, a xilanase A expressa em uma planta foi quase tão eficiente em hidrolisar os caules e as folhas de plantas quanto a xilanase A fornecida em um coquetel completo. Com base nos critérios de seleção 1 e 2, o evento transgênico XynA.2015.05, mostrado na FIG.
2, foi identificado como tendo um bom desempenho para hidrólise. Plantas que expressam xilanase
[0117] Sabe-se que a xilana é a hemicelulose dominante em madeira dura, resíduos agrícolas, biomassa e gramas perenes. Xilana é um biopolímero heteropolimérico, que consiste em uma cadeia principal repetitiva de xilose com ligações β-1,4, decorada com grupos de ramificação e que pode estar reticulada para formar lignina por ésteres aromáticos (Dodd D e Cann IO 2009 Glob Change Biol Bioenergy 1: 2). A destruição e a remoção de xilana beneficia a hidrólise de celulose em açúcares fermentáveis.Em urn coquetel de enzimas hidrolíticas típico, as xilanases são uma classe principal de enzimas CWD necessárias para hidrolisar polímeros de hemicelulose, uma vez que elas desempenham um papel chave em tornar a celulose mais acessível à hidrólise enzimática. Referindo-se a FIG. 3B, FIGs 5B - 5D e FIG. 7B, os eventos de plantas transgênicas, que expressam XynA ou XynB (XynB.2063.17, XynA/Acc/A/B.2096.01 e XynA.2015.05TI) demonstraram conversão de xilana 29,80 - 172,1 % mais elevada a partir de hidrólise com Ct-Xyn do que as plantas de controle, indicando o efeito intensificado de xilanase expressa in planta sobre a hidrólise de xilana de biomassa. Igualmente, essas plantas transgênicas também exibem conversão de glicana 50,1 - 95,5 % mais elevada a partir de hidrólise com Ct-Xyn do que as plantas de controle.
[0118] As FIGs 3A-3B ilustram os rendimentos em glicose (FIG. 3A) e em xilose (FIG. 3B) a partir de um tecido de planta transgênica pré-tratado, que expressa xilanase B (XynB.2063.17) e de um controle de tipo selvagem (AxB) depois da hidrólise pelo coquetel #1 (FCt) doméstico, pelo coquetel #1 carecendo de xilanase B (Ct-Xyn) e por nenhum coquetel (NCt). Os resultados do tratamento com Ct-Xyn demonstraram rendimento em glucose 63,2 % mais elevado e rendimento em xilose 109,4 % mais elevado a partir do evento transgênico XynB.2063.17, do que a partir da planta de controle AxB. A hidrólise de xilana aperfeiçoada do evento XynB.2063.17 foi também evidente a partir da pequena diferença de valores de rendimento em xilose entre o tratamento com o FCt e com o Ct-Xyn (critério 2).
[0119] Esses resultados mostram desempenho surpreendentemente bom de xilanase B expressa in planta na hidrólise de caules e folhas em comparação com a enzima fornecida no coquetel completo.
Plantas que expressam celulose
[0120] Biomassa lignocelulósica é conhecida a ser composta de uma matriz com múltiplos biopolímeros interligados (celulose, hemicelulose, lignina e extrativos), o que exige várias diferentes classes de enzimas em grandes quantidades para liberar, de maneira eficiente, açúcares fermentáveis. Dentre elas, a celulase é a enzima chave. Três tipos de celulases - endoglicanase, exoglicanase e β-glicosidase - trabalham em conjunto para hidrolisar a celulose em glicose. No processo de hidrólise, a endoglicanase rompe as ligações cruzadas entre as cadeias de celulose, enquanto que a exoglicanase hidrolisa as cadeias de glicana individuais e a β-glicosidase degrada os produtos da exoglicanase para formar monômeros de glicose (Sticklen MB 2008 Nature Reviews Genetics 9:433).
[0121] As FIGs 4A-4B mostram os resultados da hidrólise para as plantas transgênicas que expressam endoglicanases. Essas figuras ilustram o rendimento em glicose a partir dos eventos transgênicos EGA.2049.02 e EGA.2049.10, que expressam endoglicanase A (EGA), e a planta de controle transgênica TGC.4000.12, que carece da enzima (FIG. 4A). Essas figuras também ilustram o rendimento em glicose a partir do evento transgênico EGB.2042.03, que expressa a endoglicanase B (EGB), e a planta de controle transgênica TGC.2004.8.02 (FIG. 4B). Os tratamentos de hidrólise ocorreram com o coquetel de enzimas #1 completo (FCt), com o coquetel de enzimas carecendo de endoglicanase (Ct- EG) e sem enzimas (NCt). Para eventos de milho que expressam EGA, tanto EGA.2049.02 quanto EGA.2049.10 alcançaram conversão de glicana 48,9-126,9 % mais elevada comparada à planta de controle transgênica (TGC.4000.12) (FIG. 4A). A diferença de rendimentos em glicose entre as hidrólises com Ct-EG e FCt é desprezível para EGA.2049.10, e é cerca de 29,1 % mais baixa para TGC.4000.12. Observações similares com base no critério 2 foram feitas para o evento transgênico EGA.2049.02. Referindo-se à FIG. 4B, a planta transgênica que expressa EGB (EGB.2042.0) mostra conversão de glicana 63,6 % mais elevada a partir de hidrólise com Ct-EG do que o controle transgênico TGC.2004.8.02. De maneira surpreendente, o rendimento em glucose a partir da hidrólise com Ct-EG de EGB.2042.03 é somente 12,2 % mais baixo do que a partir da hidrólise com FCt comparada ao valor mais baixo de 23,0 % a partir dos tratamentos correspondentes para TGC.2004.8.02. Esses dados mostram hidrólise cerca de 50,0 % melhor a partir da planta que expressa EGB do que a partir da planta de controle.
Plantas que expressam múltiplas enzimas
[0122] Para desenvolver um sistema de produção de enzimas eficiente e barato para despolimerização de biomassa rápida e menos cara, várias enzimas usadas no coquetel de enzimas hidrolíticas forma expressas em milho.
[0123] As FIGs 5A-5D e as FIGs 6A-6B mostram os resultados a partir da hidrólise das plantas transgênicas XynA/AccA/B.2096.05, XynA/AccA/B. 2096.01, EGA/XynA.2242.09, XynB/EGA/CBHB.2349.56, XynB/EGA/CBHB.2349.55 e XynB/EGA/CBHA.2345.116, que expressam múltiplas enzimas.
[0124] As FIGs 5A-5B ilustram dados a partir da hidrólise enzimática das plantas de milho transgênicas pré-tratadas XynA/AccA/B.2096.01, XynA/AccA/B.2096.05, que expressam xilanase A (XynA) e enzimas acessórias (Acc) e da planta de controle transgênica TGC.2004.8.02, seguindo os tratamentos com o coquetel #1 completo (FCt), com o coquetel #1 sem xilanase (Ct-Xyn) e sem coquetel (NCt). O rendimento em glicose (FIG. 5A) a partir da hidrólise com Ct-Xyn dos eventos transgênicos XynA/AccA/B.2096.01, XynA/AccA/B.2096.05, é, respectivamente, 80,4 % e 93,5% mais elevado do que a partir da planta de controle TGC.2004.8.02.
[0125] Referindo-se à FIG 5C, o rendimento em glicose surpreendentemente mais elevado a partir da hidrólise com Ct-Xyn-EG de EGA/XynA.2242.09 pode ser explicado por um efeito hidrolítico sinergístico. Igualmente, a eficiência da conversão de xilana com base no rendimento em xilose (FIG. 5B), a partir da hidrólise com CT-Xyn dos tecidos transgênicos a partir de XynA/AccA/B.2096.01, XynA/AccA/B.2096.05, é, respectivamente, 143,4 % e 172,1 % do que aquele a partir da planta de controle TGC.2004.8.02. A elevada eficiência observada da conversão de xilana para esses eventos transgênicos também pode ser atribuída a um efeito sinergístico de múltiplas enzimas.
[0126] A FIG. 5 ilustra os rendimentos em glicose (FIG. 5C) e em xilose (FIG. 5D) a partir do evento de milho transgênico EGA/XynA.2242.09, que expressa, simultaneamente, endoglicanase A (EGA) e xilanase A (XynA), seguindo os tratamentos enzimáticos com o coquetel #1 completo (FCt), com o coquetel #1 carecendo de xilanase (Ct-Xyn), com o coquetel #1 carecendo de endoglicanase (Ct-EG) e com o coquetel #1 carecendo de xilanase e de endoglicanase (Ct-Xyn-EG). A expressão in planta de XynA resulta nos rendimentos aperfeiçoados em glicose e em xilose para EGA/XynA.2242.09 depois da hidrólise. Por exemplo, para os eventos transgênicos de tratamento com Ct-Xyn, foi demonstrada eficiência 50,1 % mais elevada de conversão em glicana (FIG. 5C) e eficiência 29,8 % mais elevada de conversão de xilana (FIG. 5D) em relação àquelas da planta de controle. A expressão in planta de EGA resulta em uma eficiência aperfeiçoada da hidrólise de glicana, evidente a partir da diferença de rendimentos em glicose entre os tratamentos com FCt, Ct-EG e Ct-Xyn-EG.
[0127] As FIGs 6A-6B ilustram os rendimentos em glicose (FIG. 6A) e em xilose (FIG. 6B) a partir de 1) eventos transgênicos que expressam simultaneamente três enzimas CWD (XynB/EGA/CBHB.2349.56 e XynB/EGA/CBHB.2349.55, que expressam simultaneamente xilanase B, endoglicanase A (EGA), celobioidrolase B, e XynB/EGA/CBHA.2345.116, que expressa simultaneamente xilanase B, endoglicanase A (EGA) e celobioidrolase A) e 2) planta AxB de controle de tipo selvagem. Os resultados de tratamentos com coquetel completo (FCt) e sem coquetel de enzimas (NCt) são mostrados. O pré-tratamento incluiu bissulfito de amónio e carbonato de amónio 0,17 M (BSC), uma razão de líquido para sólido igual a 10, à 55°C durante 17 horas. A hidrólise enzimática dos caules e das folhas foi realizada à 50°C, pH 5,0, durante três dias, usando 0,2/0,1 mL de Accellerase® 1500/XY por grama de caules e folhas. Referindo-se à FIG. 6, os resultados mostram que os rendimentos em glicose e em xilose a partir das plantas transgênicas que expressam três enzimas CWD foram muito maiores do que aqueles a partir da planta de controle do tipo selvagem. De maneira surpreendente, o evento de melhor desempenho XynB/EGA/CBHB.2345.56 exibiu rendimento em glicose 43,6 % mais elevado e rendimento em xilose 117,6 % mais elevado do que aqueles do controle negativo (AxB), depois de um pré-tratamento químico muito moderado.
Plantas de segunda geração que expressam enzimas CWD
[0128] A planta XynA.2015.05 de primeira geração (T0) foi identificada como uma boa candidata à hidrólise. Para avaliar adicionalmente esse evento e o construto de enzima (XynA) correspondente, sementes a partir deste evento foram plantadas para gerar a progenia de segunda geração T1. Os resultados da avaliação da hidrólise para T0 e T1 de plantas XynA.2015.05 são mostradas na FIG. 7B.
[0129] Os dois critérios usados para a avaliação das plantas T0 foram também aplicados para avaliar a eficiência da hidrólise para as plantas produzidas em T1, para demonstrar que as enzimas podem ser efetivas através das espécies. A FIG. 7B mostra os rendimentos em glicose (FIG. 7A) a partir de plantas de crescimento rápido feitas usando-se pAG2015, e rendimentos em xilose (FIG. 7B) a partir do evento transgênico T0 XynA.2015.05T0, que expressa xilanase A, do evento transgênico T1 XynA.2015.05TI, que expressa xilanase A, e a planta de controle transgênica carecendo da enzima TGC.4000.11. A hidrólise foi feita em conjunto com os tratamentos com o coquetel completo (FCt), com o coquetel carecendo de xilanase (Ct-Xyn) e sem coquetel de enzimas (NCt). Para o tratamento com Ct-Xyn, o evento transgênico de primeira geração XynA.2015.05TI demonstrou hidrólise de glicana55,3 % mais elevada e hidrólise em xilana 101,6% mais elevada, conforme avaliado por rendimentos em glicose e em xilose similares àqueles do evento de primeira geração XynA.2015.05T0 e mais elevados do que rendimentos em açúcares para a planta de controle TGC.4000.12.
[0130] Esses dados mostram que enzimas expressas in planta são herdáveis e preservam atividade em gerações subsequentes de plantas transgênicas.
Diversas espécies de plantas
[0131] Em adição aos eventos de milho transgênico, plantas de grama de crescimento rápido, que expressam xilanase A, foram obtidas através de transformação com o vetor pAG2015. Quando xilanase A, a partir de um milho com bom desempenho em hidrólise XynA.2015.05, foi expressa em grama de crescimento rápido por transformação com o mesmo construto (pAG2015), a grama de crescimento rápido transgênica resultante XynA.pv2015.3c também demonstra melhor conversão de glicana e de xilana em relação à grama de crescimento rápido Alamo. A FIG. 8 ilustra os rendimentos em glicose (FIG. 8A) e em xilose (FIG. 8B), seguindo a hidrólise dos eventos de grama de crescimento rápido transgênicos pré-tratados XynA.pv2015.3c, XynA.pv2015.4c, e da planta de grama de crescimento rápido de controle de tipo selvagem (Alamo), no tratamento com o coquetel completo (FCt), com o coquetel de enzimas carecendo de xilanase (Ct-Xyn) e sem enzimas (NCT). Ambos os eventos transgênicos XynA.pv2015.3c e XynA.pv2015.4c mostram melhor hidrólise do que a grama de crescimento rápido de controle (Alamo). O evento de melhor desempenho XynA.pv2015.3c demonstrou eficiência de conversão de glicana cerca de 30,0 % mais elevada e de conversão em xilana cerca de 50,0 % mais elevada, comparadas àquelas da planta de controle. Esses dados mostram que a mesma característica hidrolítica pode ser conservada através da espécie que expressa enzimas in planta.
Plantas que expressam enzimas modificadas com inteína
[0132] Para evitar efeitos prejudiciais da acumulação in planta de enzimas CWD sobre o crescimento da planta, enzimas modificadas com inteína foram desenvolvidas e expressas em plantas, para se conseguir desempenho desejável na hidrólise sem causar anormalidades fenotípicas nas plantas. A FIG. 9 ilustra os rendimentos em glicose (FIG. 9A) e em xilose (FIG. 9B), seguindo a hidrólise de uma planta transgênica pré-tratada iXynA.2229.110, que expressa XynA modificada com inteína e de uma planta AxB de controle de tipo selvagem em tratamentos com FCt, Ct-Xyn e NCt. A temperatura de pré- tratamento mais elevada do que 50°C induziu a emenda de inteína em iXynA.2229.110. A hidrólise com Ct-Xyn demonstra eficiência 66,0 % mais elevada de conversão de glicana e eficiência 57,3 % mais elevada de conversão de xilana para iXynA.2229.110, do que para a planta AxB de controle. As plantas transgênicas iXynA.2229.110 eram todas normais.
[0133] Os dados a partir da análise de composição em carboidratos não mostraram diferença significativa nas quantidades de glicana e de xilana entre as plantas transgênicas, que expressam enzima ou enzimas hidrolíticas e as plantas de controle. Os resultados da hidrólise demonstraram que plantas transgênicas, que expressam enzimas CWD, alcançaram rendimento em glicose até 141 % mais elevado e rendimento em xilose até 172 % mais elevado, comparadas às plantas de controle a partir da hidrólise enzimática sob as condições experimentais.
Exemplo 4 - Decurso de tempo da hidrólise
[0134] Para melhor avaliar o efeito de enzimas expressas in planta sobre a hidrólise, foi conduzida uma avaliação do decurso de tempo da hidrólise para plantas transgênicas candidatas. A FIG. 10 compara os decursos de tempo para hidrólise com coquetel completo (FCt) de uma planta transgênica XynB, 2063.17, XynA.2015.05T1, e a planta de controle TGC.2004.8.02. A cinética da hidrólise segue um perfil típico: uma rápida hidrólise inicial é seguida por uma lenta fase de elevação e um platô final. A hidrólise se desacelera em 24 horas e se nivela depois de 48 horas. As plantas transgênicas que expressam xilanases in planta demonstram hidrólise consistentemente melhor do que a planta de controle ao longo do decurso de tempo, conforme é evidente a partir dos rendimentos em glicose 30,0-40,0 % mais elevados durante uma hidrólise de 3 dias. A expressão de xilanase in planta pode ser considerada como um pré-tratamento com enzima para aperfeiçoar tanto a hemicelulose da biomassa quanto a hidrólise com celulose.
[0135] A FIG. 11 ilustra o decurso de tempo da hidrólise enzimática da planta transgênica EGA.2049.10, que expressa endoglicanase A (EGA) comparada à planta de controle transgênica TGC.4000.11, usando FCt e Ct-EG. O efeito da endoglicanase A expressa in planta sobre a hidrólise foi demonstrado pela diferença de rendimentos em glicose a partir dessas plantas ao longo de totó o decurso de tempo da hidrólise com Ct-EG. Ao longo de todo o decurso de tempo, as plantas que expressam endoglicanase EGA.2049.10 demonstraram conversão de glicana consistentemente mais elevada de 48,9 % e de 63,6 % a partir da hidrólise com Ct-EG do que o fizeram as plantas de controle TGC.4000.11. Surpreendentemente, uma hidrólise mais eficiente e mais rápida foi alcançada a partir das plantas transgênicas com expressão de endoglicanase.
[0136] A FIG. 12 ilustra o decurso de tempo da hidrólise enzimática do evento transgênico EGA/XynA.2242.09, que expressa EGA e XynA, e da planta de controle transgênica TGC.4000.11. O evento transgênico EGA/XynA.2242.09 demonstra rendimentos em glucose (FIG. 12A) e rendimentos em xilose (FIG. 12B) consistentemente mais elevados usando FCt, Ct-EG e Ct-Xyn, comparados àqueles da planta de controle TGC.4000.11. Os dados demonstram que esses rendimentos em açúcares elevados resultam da expressão simultânea de endoglicanase e xilanase nas plantas.
[0137] A FIG. 13 ilustra o decurso de tempo da hidrólise enzimática da planta transgênica XynA/AccB.2092.103, que expressa XynA e uma enzima acessória (Aspergillus nigerFAE B) e da planta de controle transgênica TGC.4000.11, usando tratamentos com FCt e Ct- Xyn. A hidrólise com Ct-Xyn, dos caules e das folhas pré-tratados a partir da planta transgênica XynA/AccB.2092.103, alcançou eficiência mais do que 30 % mais elevada em conversão de glicana (FIG. 13A) e eficiência mais do que 24 % mais elevada em conversão de xilana (FIG. 13B) do que uma planta de controle transgênica ao longo de todo o decurso de tempo.
[0138] Referindo-se à FIG. 12 e à FIG. 13, a melhor hidrólise de plantas transgênicas, que expressam múltiplas enzimas, também foi observada em termo de rendimentos em glicose e em xilose ao longo de todo o decurso de tempo da hidrólise de XynA/AccB.2092.103 e de EGA/XynA.2242.09. A melhor hidrólise pode ser explicada por um efeito sinergístico da ação de múltiplas enzimas.
[0139] Referindo-se às FIGs. 10, 11, 12A e 13A, os resultados mostram que, em adição aos rendimentos de hidrólise mais elevados alcançados através da expressão de enzimas CWD em plantas, os perfis cinéticos dos eventos transgênicos, que expressam enzimas CWD durante o decurso de tempo da hidrólise, mostram uma inclinação inicial mais elevada na mudança de rendimentos em glicose comparada àquela de plantas de controle, indicando uma hidrólise inicial mais rápida.
[0140] Referindo-se à FIG. 10, em adição à melhor hidrólise, as plantas transgênicas, que expressam enzimas hidrolíticas, também mostram hidrólise inicial mais rápida do que a planta de controle (FIG. 10). Depois da expressão in planta, as enzimas hidrolíticas têm sido acumuladas dentro das células de plantas. Durante o processamento, elas podem começar a funcionar imediatamente in situ, sem a necessidade de transporte e difusão de longa distância. Portanto, espera-se que a eficiência dessas enzimas seja elevada, por causa de baixa resistência de transferência de massa e de uma diminuição esperada de ligação não seletiva das enzimas in planta à lignina ou a outras moléculas não alvo. A superexpressão de enzimas que degradam biomassa de plantas em plantas não parece resultar em uma diminuição de celulose, mas, ao invés disso, de intercalação de xiloglicana afrouxada, seguida por uma modificação de parede irreversível.Todos esses fatores podem contribuir para uma hidrólise mais rápida para plantas que expressaram enzima.
Exemplo 5 - Aperfeiçoamentos em hidrólise por aumento da temperatura de pré- tratamento
[0141] Com os entes químicos de pré-tratamento, uma temperatura relativamente elevada para o pré-tratamento tipicamente entrega mais efeitos de pré-tratamento sobre a hidrólise. Para examinar o efeito da temperatura de pré-tratamento, aquelas identificadas que apresentam os melhores desempenhos em hidrólise foram submetidas a pré-tratamentos à 65°C e 75°C. Os rendimentos em hidrólise de glicose dessas plantas são mostrados na FIG. 14.
[0142] Constatou-se que a estabilidade térmica de algumas enzimas CWD, incluindo endoglicanase A (077044), pode melhorar quando expressas em plantas. A estabilidade térmica de enzimas altamente termoestáveis, tais como uma família de 12 endoglicanases C (033897), pode ser adicionalmente aperfeiçoada depois de expressão em plantas, fornecendo oportunidades para se aplicar temperaturas de pré-tratamento elevadas durante o processamento, para se alcançar hidrólise aperfeiçoada. A FIG. 14 ilustra o efeito de temperaturas de pré-tratamento sobre o rendimento em glicose a partir dos eventos transgênicos de melhor desempenho XynB.2063 (que expressa xilanase B), XynA.2015.05TI (que expressa xilanase A), EGA.2049.10 (que expressa endoglicanase A), XynA/AccB.2092.103 (que expressa xilanase A e enzima acessória B), XynA/EGA.2242.09 (que expressa xilanase A e endoglicanase A) e iXynA.2229.110 (que expressa uma xilanase A modificada com inteína) versus a planta AxB de controle de tipo selvagem e a planta de controle transgênica carecendo de enzima TGC.4000.11. A hidrólise das plantas foi realizada usando FCt em uma temperatura de 65°C ou de 75°C. Foi demonstrado que, aumentando-se uma temperatura de pré-tratamento de 65°C para 75°C, melhoraram os rendimentos em hidrólise de glicose para as plantas AxB de controle e para TGC.4000.11, mas não para as plantas transgênicas, que expressam enzimas. Esse fato pode ser explicado por saturação das enzimas expressas in planta em substrato de biomassa disponível. Com uma temperatura de pré-tratamento de 65°C, todas as plantas transgênicas, que expressam enzimas, mostraram hidrólise 11,0-33,4 % mais elevada, comparadas à planta AxB de controle de tipo selvagem e ao controle transgênico TGC.4000.11, alcançando 80-84 % do rendimento em glicose teórico.
[0143] A FIG. 15 ilustra o rendimento em glicose a partir da planta de grama de crescimento rápido EGC.2253.4b, que expressa uma endoglicanase A (EGC) altamente termoestável, seguindo o pré-tratamento com temperaturas de 65°C, 75°C e 95°C e hidrólise enzimática. Conforme mostrado, o rendimento em glicose a partir do evento transgênico EGC.2253.4b foi consistentemente mais elevado do que aquele a partir da planta de controle Alamo, alcançando velocidades de conversão respectivas de 89,4 % e de 71,4 % de um pré- tratamento em 95°C.
[0144] As FIGs 16A-16B ilustram um efeito da temperatura de pré-tratamento e do tempo sobre os rendimentos em glicose (FIG. 16A) e em xilose (FIG. 16B), a partir do evento transgênico XynA/EGA.2342.05 e da planta de controle transgênica carecendo de enzimas TGC.2243.01, seguindo a hidrólise enzimática. Os pré-tratamentos foram realizados usando-se bissulfito de amónio e carbonato de amónio 0,175 M, em um pH de pH 8.1 e em temperaturas de 55°C, 60°C e 75°C, durante 2, 4, 6 e 16 horas, em cada temperatura, e à 3.000 rpm. A hidrólise enzimática foi realizada usando-se 0,2 mL de Accellerase® 1500 / g de caules e folhas pré-tratados e 0,1 mL de Accellerase® XY / g de caules e folhas, em teor em sólidos de 2 %, pH ~5,0, Politampão de Britton-Robinson 1 X (BR; pH final de 4,9), azida de sódio à 0,02 %, à 50°C durante 72 horas, à 250 rpm. Conforme mostrado, para todas as temperaturas de tratamento e períodos de tempo, o evento transgênico XynA/EGA.2342.105, que expressa xilanase A e endoglicanase A, teve desempenho consistentemente melhor do que a planta de controle TGC.2243.01. Esses dados também mostram que, estendendo-se o tempo de pré-tratamento, aumenta-se os rendimentos tanto em glicose quanto em xilose, a partir das plantas quase que linearmente, e que o pré- tratamento durante 16 horas melhora, de maneira significativa, a hidrólise a partir de plantas transgênicas e de controle.
[0145] As FIGs 17A-17B ilustram um efeito da temperatura de pré-tratamento sobre os rendimentos em glicose (FIG. 17A) e em xilose (FIG. 17B), a partir dos eventos transgênicos XynA/EGA.2242.09.01 e XynA/EGA.2242.09.07 (que expressam xilanase A e endoglicanase A) e das plantas AxB de controle de tipo selvagem e transgênicas TGC.4000.11. As plantas foram submetidas à hidrólise enzimática usando-se coquetel de enzimas Accellerase completo, às temperaturas de 55°C até 65°C e de 75°C. As cargas de enzimas incluíram 0,2 mL de Accellerase® 1500 por grama de caules e folhas pré-tratados e 0,1 mL Accellerase® XY por grama de caules e folhas pré-tratados. Plantas transgênicas, que expressam enzimas CWD, alcançaram rendimento em glicose de até 83,5-89,1 % e rendimento em xilose de até 50,0-64,3 %, comparadas às plantas de controle, que alcançaram rendimento em glicose de somente 63,0-76,6 % e rendimento em xilose de somente 35,7-45,3 %.
[0146] Hidrólise significativa pode ser conseguida quando se aumenta a temperatura de pré-tratamento para 65°C. Para alguns caules e folhas de milho, o aumento da temperatura para 75°C melhorou a hidrólise para as plantas de controle, mas não para as plantas transgênicas, que expressam enzimas. Referindo-se à FIG. 15, para a grama de crescimento rápido EGC.2253.4b, que expressa endoglicanase C (EGC) altamente termoestável, constatou-se, de maneira surpreendente, a que a hidrólise aperfeiçoada é significativamente mais elevada com a temperatura de pré-tratamento aumentada, especialmente à 95°C, do que para a planta de controle Alamo.
[0147] Acima de tudo, o pré-tratamento de caules e folhas a partir das plantas transgênicas com os melhores desempenhos em elevadas temperaturas (65°C e 75°C) alcançaram rendimentos em hidrólise de glicose acima de 80 %, o que é hidrólise 25 % mais elevada, comparadas às plantas de controle, que não expressam enzimas hidrolíticas heterólogas. Portanto, a expressão in planta de enzimas hidrolíticas altamente termoestáveis fornecerá mais oportunidades para se conseguir a hidrólise de componentes alvo.
Exemplo 6 - Redução da carga de enzimas e fermentabilidade
[0148] Uma vez que as plantas transgênicas que expressam enzimas CWD demonstraram rendimentos em hidrólise mais elevados e cinéticas mais rápidas durante a hidrólise, comparadas às plantas de controle, sob condições de processamento similares, foi testada a redução de cargas de enzimas exógenas. A FIG. 18 ilustra os rendimentos em glicose a partir das plantas transgênicas XynB.2063.17, que expressa xilanase B, XynA.2015.5TI, que expressa xilanase A, e da planta de controle TGC.2004.8.4, seguindo os tratamentos de hidrólise usando-se o coquetel #1 doméstico com cargas variáveis, tais como o coquetel completo (FCt), o coquetel 75 % completo (0,75 FCt), o coquetel 50 % completo (0,50 FCt), o coquetel 25 % completo (0,25 FCt), o coquetel 10 % completo (0,10 FCt) e sem enzimas (0 FCt). Os dados demonstram a factibilidade de se reduzir as cargas de enzimas exógenas por aplicação do material transgênico, que expressa enzimas CWD, sem se reduzir os rendimentos em açúcares. Por exemplo, o evento transgênico XynA.2015.15T1 alcançou conversão de glicana de mais do que 60 % usando carga de 0,75 FCt, o que é similar à conversão de glicana de aproximadamente 65 % alcançada usando carga de FCt. Em contraste, o controle transgênico TGC.2004.8.4 alcançou conversão de glicana de aproximadamente 50,0 % usando carga de FCt e conversão de glicana de aproximadamente 40 % usando carga de 0,75 FCt. Esses dados mostram que a hidrólise de plantas, que expressam enzimas CWD, foi mais eficiente do que aquela a partir de plantas de controle e cargas mais baixas de enzimas externas.
[0149] A FIG. 19 ilustra os rendimentos em glucose a partir das plantas transgênicas XynE/EGC/CBHA.2339.03, XynE/EGC/CBHA.2339.04 eXynE/EGC/CBHA.2339.05 (que expressam xilanase E, endoglicanase C e celobioidrolase A) e a planta BxA de controle de tipo selvagem, seguindo a hidrólise enzimática com tratamentos com o coquetel completo (FCt), com o coquetel 20 % completo (0,2 FCt) e sem enzimas (NCt). Os dados mostram que rendimentos em glucose de 50-70 % podem ser alcançados a partir das plantas transgênicas XynE/EGC/CBHA.2339.03, XynE/EGC/CBHA.2339.04 e XynE/EGC/CBHA.2339.05 usando-se cargas de somente 20 % do coquetel completo, o que é 35-77 % mais elevado do que os das plantas de controle.
[0150] De maneira surpreendente, o rendimento em glicose a partir do evento transgênico XynE/EGC/CBHA.2339.03, seguindo a hidrólise com carga de somente 20 % do coquetel completo era ainda 15 % mais elevado do que o rendimento em glicose a partir da planta de controle BxA, depois do tratamento de hidrólise usando o coquetel completo.
[0151] As FIGs 20A-20B ilustram o efeito da redução de cargas de enzimas externas sobre o rendimento em glucose, a partir dos eventos transgênicos XynA/EGA.2309.54 e XynA/EGA.2309.107 (que expressam xilanase A e endoglicanase A) e das plantas de controle BxA, depois da hidrólise com o coquetel completo (FCt), com o coquetel 20 % completo (0,2 FCt) e sem enzimas (NCt). Rendimentos em glicose de 60-70 %, a partir das plantas transgênicas, que expressam enzimas, foram alcançados por uso de cargas de 20 % de coquetéis completos comparados aos rendimentos em glicose de cerca de 80 % alcançados com o coquetel completo. Em contraste, as plantas de controle negativo forneceram somente 53 % de glicose no tratamento com 0,2 FCt e 70 % de glicose no tratamento com FCt. Referindo-se à FIG. 20B, rendimentos em xilose de aproximadamente 38 % foram alcançados a partir das plantas transgênicas, que expressam enzimas CWD, no tratamento com 0,2 FCt comparados aos rendimentos em xilose de aproximadamente 47 % xilose no tratamento com FCt e com os rendimentos em xilose muito menores para as plantas de controle negativo nos tratamentos tanto com FCt quanto com 0,2 FCt. Rendimento em glicose com FCt de 20 % de XynA/EGA.2309.54 e XynA/EGA.2309.107 pode alcançar rendimentos em glucose 16-29,3 % mais elevados, assim como rendimentos em xilose 27,6-31 % mais elevados do que o controle negativo.
[0152] As FIGs 21A-21B ilustram o efeito da redução de cargas de enzimas externas sobre os rendimentos em glicose (FIG. 21 A) e em xilose (FIG. 21B), a partir das plantas transgênicas EGA/XynA.2242.09.16 (que expressam endoglicanase CBHA.2069.1.3) e do controle transgênico TGC.4000.11, depois da hidrólise sem enzimas (0), com o coquetel 20 % completo (0,2 FCt), com o coquetel 40 % completo (0,4 FCt), com o coquetel 60 % completo (0,6 FCt), com o coquetel 80 % completo (0,8 FCt) e com o coquetel completo (Accellerase® 1500/XY). O pré-tratamento foi realizado usando bissulfito de amónio e carbonato de amónio 0,25 M (pH 8,56), em uma razão de líquido para sólido igual a 7, à 75°C durante 20 horas. A hidrólise enzimática foi realizada usando-se teor em sólidos de aproximadamente 2 %, pH 5,0, à 50°C durante três dias. De maneira surpreendente, os dados mostram que hidrólise com 60 % de FCt pode alcançar 80 % do rendimento teórico em glicose e aproximadamente 60 % do rendimento teórico em xilose para ambas as plantas transgênicas, que expressam enzimas, embora somente 60 % e 49 %, respectivamente, para o controle negativo TGC.4000.11.
[0153] Esses resultados demonstram o potencial para redução de cargas de enzimas externas e, simultaneamente, alcançando hidrólise eficiente de caules e folhas de plantas, por utilização das plantas transgênicas, que expressam enzimas CWD.
[0154] para avaliar a fermentabilidade dos hidrolisados, que são produzidos a partir de plantas transgênicas que expressam enzimas CWD, foi realizado um experimento de sacarificação e de fermentação simultâneas (SSF) usando Saccharomyces cerevisiae D5A. A FIG. 22 ilustra a produção de etanol durante a SSF, a partir das plantas transgênicas EGA.2049.10 (que expressam endoglicanase A) e EGA/XynA.2242.09 (que expressa endoglicanase A e xilanase A) e das plantas de controle AxB e TGC.4000.11, em um teor de sólidos de biomassa de 6 %. Esses dados mostram que conversão de celulose cerca de 77,8 % mais elevada foi alcançada usando as plantas transgênicas, que expressam enzimas CWD, comparadas às plantas de controle. Além disso, com a biomassa moderadamente pré-tratada, SSF das plantas que expressam enzimas EGA.2049.10 e EGA/XynA.2242.09 produziram etanol em uma concentração de 8,0 g/L ou em rendimento em etanol de 65 %, comparada aos 4,5 g/L, ou rendimento em etanol de 42 %, para as plantas de controle, o que corresponde a um aperfeiçoamento de 55 % na produção de etanol.
[0155] A hidrólise aperfeiçoada tem o potencial para ser traduzida em redução de carga de enzimas exógenas, embora ainda mantendo hidrólise similar, conforme mostrado nas FIGs 18-21.A expressão de enzimas CWD in planta demonstrou a oportunidade de produzir açúcar a baixo custo a partir de culturas ou de biomassa, que expressam enzimas CWD, para a produção de biocombustíveis, produtos bioquímicos e biomateriais. O benefício da hidrólise inicial rápida também fornece um potencial para se alcançar hidrólise similar ou melhor em menor tempo de operação, uma vantagem para um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (FIG. 22), e uma oportunidade para diminuir a necessidade de capacidade de equipamentos e custo operacional. A produção in planta de enzimas que degradam a parede celular é um meio para baixar os custos associados com a produção de açúcares fermentáveis a partir de biomassa, através da hidrólise direta de plantas transgênicas.
Exemplo 7 - Efeito termoquímico: solubilização de biomassa a partir de pré- tratamento moderado
[0156] A FIG. 23 ilustra a solubilização de biomassa a partir de pré-tratamento moderado, com base na perda de peso em uma planta transgênica, que expressa exoglicanase CBHA (CBHA.2069.3.17), e de uma planta de controle de tipo selvagem (AxB), depois de pré- tratamento com água deionizada (Dl); com ácido sulfúrico diluído 0,06 M ou 0,25 M (DSA); ou com bissulfito de amónio 0,25 M e carbonato de amónio 0,23 M (BSC; pH 8,1). O pré- tratamento foi realizado em uma temperatura a temperatura de 75°C, em uma razão de líquido para sólido de igual a 8, durante 16 horas. Essa figura destaca os dados de perda de peso para amostras de caules e folhas de milho secados em forno derivados a partir da planta transgênica e da planta de controle de tipo selvagem.As medições foram conduzidas seguindo os procedimentos de lavagem e de centrifugação da biomassa pré-tratada. Comparado ao pré-tratamento com Dl, o pré-tratamento com BSC 0,25 M (pH 8,1) resulta em mais 17,5 % de perda de peso de biomassa para a planta transgênica (CBHA.2069.3.17) e em mais 12,2 % de perda de peso para a planta de controle não transgênica (AxB). A planta transgênica, que expressa exoglicanase (CBHA.2069.3.17) mostra mais perda de peso de biomassa, a partir de todos os pré-tratamentos, comparada à planta de controle não transgênica.
Exemplo 8 - Efeito termoquímico: perda de peso de biomassa e remoção de lignina a partir de pré-tratamento moderado
[0157] A perda de peso de biomassa e a remoção de lignina foi determinada para amostras de caules de folhas secados em forno, a partir de uma planta de controle transgênica TGC.2209, depois do pré-tratamento com água deionizada (Dl) e bissulfito de amónio 0,17 M com carbonato de amónio 0,165 M (BSC) em pH 8,1, uma razão de líquido para sólido igual a 8, em uma temperatura de 75°C, durante 16 horas, medições foram conduzidas seguindo os procedimentos de lavagem e de centrifugação da biomassa pré-tratada. A Tabela 3 mostra que o pré-tratamento com BSC 0,17 M (pH 8,1) resulta em mais perda de biomassa e em mais remoção de lignina comparado ao pré-tratamento com água Dl.Tabela 3: Perda de peso de biomassa depois de pré-tratamento e lignina insolúvel em ácido em biomassa pré-tratada
Figure img0004
Exemplo 9 - Efeito termoquímico: desacetilação a partir de pré-tratamento moderado
[0158] As FIGS. 24A-24B ilustram o efeito de da temperatura e do tempo sobre a desacetilação de biomassa de plantas avaliada para os caules e as folhas de milho secados em forno derivados a partir de uma planta não transgênica, que expressa celobioidrolase A (CBHA.2063.3.17) e de uma planta de controle não transgênica (AxB). Os pré-tratamentos incluíram água deionizada (Dl), ácido sulfúrico diluído 0,06 M (DSA), DAS 0,25 M ou bissulfito de amónio 0,25 M com carbonato de amónio 0,23 M (BSC) e foram realizados em pH 8,1, em uma razão líquido para sólido igual a 8, em temperaturas de 75°C ou de 95°C, durante 16 horas, ou de 85°C, durante 7 horas. A concentração de ácido acético (HAc) foi determinada por análise por HPLC das amostras de filtrado obtidas a partir da biomassa pré-tratada usando coluna de ácido HPX-87H Column (Bio-RadLaboratories, Hercules, CA) operando em 0,6 mL/min, 60°C com ácido sulfúrico 0,004 M como a fase móvel. O pré- tratamento com BSC 0,25 M BSC (pH 8,1) resultou em desacetilação significativa, comparado ao pré-tratamento com água Dl e DAS 0,06 M.
Exemplo 10 - Efeito termoquímico: pouca/nenhuma degradação de açúcares (furfural e HMF) a partir de pré-tratamento moderado
[0159] As FIGs 25A-25B ilustram rendimentos em produtos de degradação de açúcar hidróxi-metil-furfural (HMF) e furfural em amostra de caules e folhas de milho secados em forno a partir de uma planta transgênica, que expressa exoglicanase CBHA (CBHA.2069.3.17) e de uma planta de controle não transgênica (AxB), depois de pré- tratamento com água deionizada (Dl), ácido sulfúrico diluído 0,06 M (DSA), 0,25 DSA ou bissulfito de amónio 0,25 M e carbonato de amónio 0,23 M (BSC; pH 8,1). O pré-tratamento foi realizado em temperaturas de 75°C e de 95°C, durante 16 horas, e de 85°C, durante 7 horas. As concentrações de HMF e furfural no filtrado da biomassa pré-tratada foram medidas por análise com HPLC usando coluna ácida HPX-87H Column (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) operando em 0,6 mL/min, 60°C com ácido sulfúrico 0,004 M como a fase móvel.
[0160] Os dados mostram que pouco até nenhum HMF ou furfural foram encontrados nas amostras a partir de uma planta transgênica que expressa exoglicanase CBHA (CBHA.2069.3.17) ou da planta de controle não transgênica (AxB), depois do pré- tratamento com BSC 0,25 M (pH 8,1) em comparação ao pré-tratamento com água deionizada (Dl), ácido sulfúrico diluído 0,06 M (DSA) ou DAS 0,25 M, que conduziu à degradação de açúcares e à detecção de HMF e furfural nas amostras.
Exemplo 11 - Auto-hidrólise a partir de enzimas in planta
[0161] Exemplos de auto-hidrólise de plantas, que expressam enzimas que degradam a parede celular são mostrados na FIG. 26. Essa figura ilustra resultados em uma planta de milho pré-tratada, que expressa XynB (XynB.2063.15) isoladamente e uma planta, que expressa simultaneamente três enzimas; XynA e enzimas acessórias A e B (XynA/AccA/B.2096.01). Os resultados são comparados a uma planta de controle não transgênica (AxB). O pré-tratamento foi realizado usando-se bissulfito de amónio 0,17 M e carbonato de amónio 0,165 M (pH 8,1), razão líquido para sólido (L/S) igual a 10, e à 55°C durante 16 horas. A hidrólise enzimática conseguida por enzimas produzidas in planta em teor em sólidos de 2 % sem coquetel de enzimas externo (NCt) e em uma temperatura de 50°C, pH 5,0 durante 3 dias. Pós hidrólise ácida foi realizada em pH menor do que 1,0 e em temperatura de 121°C durante 60 minutos. Ambas as plantas transgênicas, que expressam xilanase, mostram rendimento em xilose 3-5 vezes maior, a partir da auto- hidrólise, comparados à planta de controle AxB.
[0162] A FIG. 27 ilustra resultados de auto-hidrólise para uma planta de milho, que expressa, simultaneamente, xilanase B, endoglicanase e CHBA (XynB/EGA/CBHA.2345.116) e uma planta, que expressa xilanase B, endoglicanase e CBHB (XynB/EGA/CBHB.2349.55) comparadas a uma planta de controle não transgênica (AxB). As plantas foram pré-tratadas com bissulfito de amónio 0,17 M e carbonato de amónio 0,165 M BSC (pH 8,1) com L/S igual a 10, à 55°C durante 16 horas. Nenhum procedimento de lavagem intermediário foi aplicado entre o pré-tratamento e a hidrólise com enzimas expressas in planta. A hidrólise foi conseguida sob as seguintes condições: teor em sólios de 2 %, sem coquetel (NCt), 50°C e pH 5,0 durante 3 dias. As plantas transgênicas, que expressam xilanase e outras celulases mostram rendimento em xilose significativamente mais elevado a partir de auto-hidrólise comparadas à planta de controle AxB.
Exemplo 12 - Efeito de desfibrilação mecânica sobre o processamento de caules e folhas não moídos
[0163] Dados do efeito de desfibrilação mecânica sobre os rendimentos em glicose e em xilose a partir do processamento de caules e folhas não moídos são mostrados nas FIGs 28A-28B. os dados foram derivados a partir de experimentos com uma planta transgênica pré-tratada, que expressa endoglicanase e xilanase A (EGAZXynA.2242.09TI) versus uma planta de controle transgênica TGC.4000. O pré-tratamento foi realizado usando bissulfito de amónio 0,25 M com carbonato de amónio 0,23 M (pH 8,56, L/S igual a 8, 75°C, durante 16 horas, seguido por desfibrilação mecânica (teor em sólidos de 6 %). A hidrólise enzimática foi conseguida por enzimas produzidas in planta em teor em sólidos de 4 % usando Accelerase® 1500/XY (0,2/0,1 ml por g de caules e folhas) em uma temperatura de 50°C durante até 3 dias e em pH 5,0. A planta de milho transgênica que expressa simultaneamente endoglicanase e xilanase mostra rendimentos em glicose e em xilose consistentemente mais elevados, comparados à planta de controle TGC.4000 através do decurso de tempo, alcançando rendimentos em glicose em xilose de 83 % e de 63 %, respectivamente, durante hidrólise de 3 dias.
[0164] As referências citadas ao longo de todo esse relatório descritivo são incorporadas aqui para todas as finalidades evidentes e nas próprias referências como se cada referência fosse completamente apresentada. Para a finalidade de apresentação, referências específicas dessas referências são citadas em locais particulares aqui. Uma citação de uma referência em um local particular indica maneira(s), na(s) qual(is) os ensinamentos da referência são incorporados. No entanto, uma citação de uma referência em um local particular não limita a maneira, na qual todos os ensinamentos da referência citada são incorporados para todas as finalidades.
[0165] Portanto, entende-se que essa invenção não está limitada às modalidades particulares reveladas, mas entende-se que cubra todas as modificações que estejam dentro do espírito e do escopo da invenção conforme definida pelas reivindicações apensas; pela descrição acima e/ou mostrada nos desenhos anexos.

Claims (25)

1. Método para produção de açúcares solúveis a partir de material de planta geneticamente modificado, caracterizado por compreender: o pré-tratamento por mistura do material de planta geneticamente modificado com uma formulação de formação de polpa incluindo bisulfito de amônio e carbonato de amônio, para formar uma mistura a um pH na faixa de 5,0 a 9,0 e uma temperatura de 40°C a 95°C, sendo que o material de planta geneticamente modificado inclui uma primeira proteína e uma segunda proteína e em que a primeira proteína compreende uma sequência de aminoácidos com uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, e SEQ ID NO: 8, e a segunda proteína inclui uma sequência de aminioácidos selecionada a partir do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, e SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12; eo fornecimento de condições de hidrólise à mistura.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente uma terceira proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12.
3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por pelo menos uma da primeira sequência de proteína, da segunda sequência de proteína ou da terceira sequência de proteína compreender um respectivo primeiro peptídeo de direcionamento independentemente selecionado para cada uma da primeira sequência de proteína, da segunda sequência de proteína ou da terceira sequência de proteína em que a sequência de aminoácidos do primeiro peptídeo de direcionamento é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 17.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a sequência de o primeiro peptídeo de direcionamento em combinação com pelo menos uma da primeira sequência de proteína, da segunda sequência de proteína ou da terceira sequência de proteína, em conjunto, compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21.
5. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a planta compreender adicionalmente um segundo peptídeo de direcionamento de carbóxi selecionado a partir do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24, sendo que o segundo peptídeo de direcionamento de carbóxi está fundido a pelo menos uma da primeira proteína, da segunda proteína ou da terceira proteína.
6. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o primeiro peptídeo de direcionamento e a segunda sequência de pepitídeo de direcionamento de carbóxi, em combinação com uma da primeira sequência de proteína, da segunda sequência de proteína ou da terceira sequência de proteína, em conjunto, compreenderem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o bissulfito de amônio estar em uma concentração de 0,02 mol L-1 a 0,35 mol L-1 e o carbonato de amônio estar em uma concentração de 0,025 mol L-1 a 0,25 mol L-1.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a mistura apresentar uma razão de líquido para sólido selecionada a partir do valor de menos do que ou igual a um de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o pré-tratamento incluir a incubação da mistura durante um período de menos do que ou igual a um de 16 horas, 15 horas, 14 horas, 13 horas, 12 horas, 11 horas, 10 horas, 9 horas, 8 horas, 7 horas, 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas ou 1 hora.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por compreender adicionalmente o refino da mistura por moagem mecânica.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as condições de hidrólise incluírem 2 % a 25 % de sólidos.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por as condições de hidrólise incluírem a incubação da mistura durante um período de até 144 horas.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por as condições de hidrólise incluírem uma temperatura de mistura de 100 °C ou menor.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a temperatura de mistura é de 65 °C ou menor.
15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por as condições de hidrólise incluírem um pH de mistura de 4,8 a 5,0.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por compreender adicionalmente a colocação da mistura em contato com um organismo fermentador para produzir um produto bioquímico.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o organismo fermentador ser uma levedura selecionada a partir do grupo consistindo em: Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Yarrowia, Spathaspora e Scheffersomyces.
18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por incluir adição de uma ou mais enzimas exógenas, em que uma ou mais enzimas exógenas incluírem uma endoglicanase, uma celobioidrolase, uma glicosidase e uma xilanase.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a uma ou mais enzimas exógenas incluírem adicionalmente uma β-xilosidase.
20. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por a uma ou mais enzimas exógenas incluem ainda uma celulase isolada a partir de Trichoderma reesei.
21. Cassete de expressão, caracterizado por compreender: uma primeira sequência de polinucleotídeo selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39; e uma segunda sequência de polinucleotídeo selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 e SEQ ID: 43.
22. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por compreender adicionalmente uma terceira sequência de polinucleotídeo selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 e SEQ ID: 43, sendo que a SEQ ID NO selecionada como a terceira sequência de referência é diferente da SEQ ID NO selecionada como a segunda sequência de referência.
23. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 21 ou 23, caracterizado por a primeira sequência de polinucleotídeo, a segunda sequência de polinucleotídeo ou a terceira sequência de polinucleotídeo inclui adicionalmente uma sequência de polinucleotídeo de direcionamento, selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 51.
24. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por compreender uma sequência de polinucleotídeo selecionada a partir do grupo de sequências consistindo em: SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 e SEQ ID NO: 62.
25. Cassete de expressão, caracterizado por compreender uma sequência de polinucleotídeo selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82 e SEQ ID NO: 83.
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