MX2011008956A

MX2011008956A - Metodo para incrementar el contenido de almidon en mazorcas de plantas.

Info

Publication number: MX2011008956A
Application number: MX2011008956A
Authority: MX
Inventors: John Steffens
Original assignee: Syngenta Participations Ag
Priority date: 2009-02-25
Filing date: 2010-02-24
Publication date: 2011-11-02
Also published as: CA2753546A1; EP2401385A4; WO2010099134A8; CL2011002079A1; BRPI1008734A2; CN102405291A; US20140283215A1; EP2401385A1; WO2010099134A1; US20120054915A1; AR075704A1

Abstract

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para incrementar el contenido de almidón en tejidos verdes de una planta. El método comprende regular por disminución la actividad de las enzimas de degradación de almidón en una planta. Las plantas transgénicas resultantes de la invención tiene contenido de almidón incrementado en tejidos de mazorca. En una modalidad, el método involucra manipular una planta monocotiledonoea para regular por disminución la actividad de una enzima de degradación de almidón en tejidos de mazorca las plantas son útiles para mejorar el rendimiento de azucares libres de biomasa de plantas.

Description

METODO PARA INCREMENTAR EL CONTENIDO DE ALMIDON EN MAZORCAS DE PLANTAS Campo de la Invención Esta invención se refiere a biología molecular de plantas, particularmente a métodos y composiciones para aumentar la acumulación de almidón en mazorcas de plantas y al uso de estos tejidos de plantas en aplicaciones comerciales.

Antecedentes de la Invención La biomasa de las plantas está constituida por azúcares y representa la fuente principal de hidrocarburo renovable en la tierra. A diferencia de otras fuentes de energía renovables, la biomasa puede convertirse directamente en combustibles líquidos. Los dos tipos de biocombustibles más comunes son etanol (alcohol etílico) y biodiesel. El etanol es un alcohol que puede ser producido por fermentación de cualquier biomasa rica en carbohidratos (almidones, azúcares o celulosas). Una vez obtenidos azúcares fermentables a partir del material de biomasa, estos azúcares pueden ser luego fermentados para producir etanol a través de un procedimiento similar al de la fabricación de cerveza. Sin embargo, este enorme recurso es infra-utilizado, debido al hecho de que los azúcares están encerrados en polímeros complejos, a los cuales se hace a menudo referencia REF.:223264 colectivamente como lignocelulosa .

La descomposición convencional de la lignocelulosa a monómeros (monosacáridos) requiere que el material que constituye la fuente de biomasa, sea ablandado a través de pre^-tratamientos químicos y/ o físicos. Pueden agregarse también enzimas que hidrolizan las formas poliméricas de los azúcares contenidos en la biomasa a monosacáridos . La fermentación subsiguiente puede ser luego llevada a cabo utilizando a ambos azúcares: el de 6-carbonos y de 5-carbonos, para producir etanol u otros bio-productos deseados. Los azúcares generados a partir de la degradación de biomasa de plantas podrxan proporcionar numerosas materias primas económicamente competitivas para la fermentación en productos químicos, plásticos, aditivos para alimentación y combustibles .

Los carbohidratos constituyen los compuestos orgánicos más abundantes de la tierra. Se encuentran principalmente en plantas como polímeros complejos de glucosa, tanto en forma de. celulosa como de almidón. La celulosa, hemicelulosa y glucanos se convierten en muchos componentes estructurales de la pared celular y tejidos leñosos de plantas . Estos componentes estructurales forman a menudo complejos con otras moléculas, tales como proteínas, grasas y lignina. El almidón es utilizado por la planta como carbohidrato de almacenamiento original en semillas y granos que consisten en polímeros de glucosa ligados, esencialmente puros. Los almidones se encuentran en muchos granos, así como también en tubérculos y raíces. El almidón es un carbohidrato de almacenamiento deseable, debido al hecho de que es composicdonalmente simple y puede ser rápidamente desintegrado por la planta para obtener energía. Comparativamente, el material lignocelulósico está compuesto por glucosa y/ o varios azúcares diferentes que forman complejos con lignina. El almidón es rápidamente hidrolizable a azúcares monoméricos a través de enzimas hidrolizadoras de almidón, eficaces y poco costosas, mientras que el material lignocelulósico no es ni fácilmente hidrolizable , ni relativamente poco costoso de procesar. Los carbohidratos se encuentran también en abundancia en forma del simple disacárido, sacarosa. La sacarosa puede hallarse en plantas de cultivo tales como caña de azúcar, remolacha, y sorgo dulce. A diferencia de la sacarosa, el almidón es estable y puede ser almacenado en forma deshidratada por largos períodos de tiempo.

La mazorca de plantas consiste principalmente de lignocelulosa y generalmente es desechada como residuo en la mayoría de prácticas de agricultura. Por ejemplo las máquinas combinadas que cosechan maíz, separan primero la mazorca de sus granos y luego descargan la mazorca separada, nuevamente dentro del campo, como residuos. La mazorca de maíz es aproximadamente el 15-18% de la biomasa total de la planta de maíz por arriba del suelo. Como el precio actual del maíz ha aumentado, la producción de maíz ha sido muy limitada y ha habido una tendencia a producir combustibles de fuentes no comestibles, · menos costosas, o de productos residuales. Actualmente los EE.UU. producen aproximadamente 8.6 mil millones de galones de etanol por año, siendo la vasta mayoría del etanol derivada de almidón de maíz. Se ha pronosticado que la fermentación celulósica de maíz podría agregar 5 mil millones de galones adicionales de etanol al etanol total producido por los EE.UU. Otras estimaciones pronostican que el uso de mazorca de maíz en fermentaciones puede aumentar el rendimiento total de etanol de maíz en un 11% por bushel o 27% por acre. Sin embargo, la fermentación de mazorca a combustible está limitada por el costo y por métodos menos que eficientes. Las prácticas de fermentación de mazorca actuales requieren que la mazorca sea pre-tratada con una mezcla de enzimas que ayudan a la descomposición de la estructura fibrosa y lignocelulósica de la mazorca. Asimismo, pueden emplearse también condiciones termoquímicas , para ayudar a la descomposición de mazorca (por ejemplo calor elevado, pH básico etc.) A continuación del pre-tratamiento, los azúcares son extraídos de la mazorca pre-tratada y en algunos casos pueden agregarse enzimas adicionales para degradar adicionalmente los azúcares a azúcares menores.

Estos azúcares son luego convertidos a etanol a través de la fermentación de levadura. Los costos actuales de fermentación de mazorca han sido estimados como de aproximadamente $1 más por galón del producto obtenido, en comparación con las fermentaciones comerciales de etanol de almidón de maíz. La composición lignocelulósica estructural de mazorca plantea varias limitaciones a las prácticas actuales de fermentación de mazorca. Una limitación a las prácticas actuales de fermentación de mazorca, puede ser que la necesidad de procesos 'de pre-tratamiento usados para extraer azúcares de la mazorca, pueden ser costosos y consumir mucho tiempo. Otra limitación de las prácticas actuales de fermentación de mazorca puede ser la necesidad de extraer los azúcares apropiados o llevar a cabo tratamientos enzimáticos para degradar adicionalmente azúcares complejos en azúcares simples que puedan ser rápidamente convertidos a etanol, mediante levadura. También puede ser necesario hallar o crear cepas de levadura óptimas, capaces de utilizar perfiles específicos de azúcar derivados de pre-tratamientos e hidrólisis enzimática. Otra limitación puede ser que los métodos de extracción de azúcar de la mazorca, sean ineficientes debido a la densa estructura de la lignocelulosa .

Sería deseable producir tejidos de mazorca que sean beneficiosos para la producción de azúcares monoméricos, en los cuales una proporción más elevada de carbohidrato está en forma de almidón. Se proveen métodos para crear biomasa de mazorca, rica en almidón y métodos para generar azúcares libres y oligosacáridos de biomasa de mazorca, así como también el uso de estos azúcares libres en la producción de productos químicos, plásticos, aditivos para comida y combustibles .

Breve Descripción de la Invención Se proveen composiciones y métodos para aumentar el contenido de almidón en tejidos de mazorca de plantas. Se proveen además, métodos en los cuales puede usarse mazorca que contiene cantidades incrementadas de almidón, en métodos de conversión de biomasa, así como también en aplicaciones de comida para animales . El método involucra regular por disminución, independientemente o conjuntamente, la actividad endógena de las enzimas involucradas en la vía transitoria de degradación del almidón en plantas. La regulación por disminución puede ser direccionada constitutivamente a través de la planta o dentro de tejidos preferidos como objetivo (por ejemplo tallo, hoja, mazorca, etc.). Las plantas transgénicas de la invención tienen un contenido de almidón incrementado en los tejidos de mazorca. Los métodos descritos aquí pueden ser beneficiosos para aumentar el valor del tejido de mazorca de planta en el uso de producción de biocombustibles y aplicaciones en comida para animales. La mazorca obtenida a partir de estas plantas transgénicas puede ser convertida de manera de generar un nivel realzado de azúcares libres, los cuales son útiles en la fermentación corriente abajo, de azúcares libres que se convierten en azúcares para productos químicos, plásticos, aditivos para comida y combustibles. Asimismo se proveen métodos para producir una mazorca de auto-procesamiento con aumento del contenido de almidón, donde la planta o parte de planta expresa una enzima procesadora (por ejemplo alfa-amilasa, glucoamilasa , celulasas, CBHI, etc.) donde la enzima procesadora es direccionada lejos de su sustrato relativo y mediante activación (por ejemplo molienda, adición de agua, pH, ajuste de temperatura) de las enzima (s) de procesamiento (mesofílicas , termofílicas o hipertermofílicas) la planta o parte de planta es capaz de auto-procesar el sustrato sobre el cual actúa, para obtener el resultado deseado.

Descripción Detallada de la Invención Revisión El artículo "un" y "una" se usan aquí para referirse a uno o más de uno (es decir a por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa uno o más elementos. A través de toda la descripción, la palabra "que comprende" o variaciones tales como "comprende" o "comprenden" , se interpretará en el sentido de que implica la inclusión de un elemento manifestado, completo o etapa, o grupo de elementos, completos o etapas, pero no la exclusión de ningún otro elemento, completo o etapa o grupo de elementos, completos o etapas .

Se proveen métodos y composiciones para aumentar el contenido de almidón en tejidos de mazorca de una planta. El método comprende regular por disminución la actividad de las enzimas involucradas en la vía transitoria de degradación del almidón de una planta. Las plantas transgénicas resultantes de la presente invención tienen un contenido de almidón incrementado en los tejidos de mazorca. Se proveen además métodos de uso para plantas con contenido de almidón incrementado en tejidos de mazorca.

Se proveen plantas, semillas, tejidos de plantas y partes de plantas transgénicas. Está reconocido que el procedimiento puede ser controlado mediante el uso de promotores constitutivos, tejidos, temporales o químicamente regulados. La modalidades siguientes pueden ser llevadas a cabo en mazorcas de plantas monocotiledóneas y estructuras análogas que se encuentran en plantas dicotiledóneas.

Un método para aumentar el almidón en tejidos de mazorca puede ser deseable en industrias múltiples, por ejemplo, pero sin limitarlo a etanol, comida para animales, plásticos, productos químicos y otras aplicaciones industriales. Una modalidad de aplicación corriente involucra manipular una planta para regular por disminución la actividad de una o más enzimas cloroplásticas o citosólicas involucradas en la vía transitoria de degradación de almidón, a las que se hace referencia aquí como "enzimas de degradación de almidón" . Las plantas resultantes de la invención tienen un contenido de almidón incrementado en los tejidos de mazorca. Las enzimas de degradación de almidón incluyen, pero no están limitadas a: alfa-amilasa , glucano agua dicinasa, fosfoglucano agua dicinasa, dextrinasa límite, isoamilasa, beta-amilasa, glucano fosforilasa, enzima desproporcionadora, proteína cloroplástica transportadora de maltosa, proteína cloroplástica transportadora de glucosa, proteína cloroplástica transportadora de triosa fosfato, transglucosidasa citosólica, glucano fosforilasa, y hexocinasa .

Los métodos de la invención son útiles en la integración de prácticas actual s para cultivar plantas de cultivo, con el propósito de obtener un material de plantas, comercialmente deseado, con acumulación incrementada de almidón en los tejidos de mazorca de las plantas de cultivo, y el uso de mazorca de plantas de cultivo como fuente de biomasa para la producción de azúcares fer-mentables , o para agricultura y/ o consumo humano. Las plantas y partes de plantas modificadas pueden usarse en la producción de alcohol y para aumentar el rendimiento de etanol, manipulando por ingeniería genética la mazorca de planta para acumular almidón .

Tal como se usa aquí, "planta de cultivo" se refiere a cualquier planta que es cultivada con el propósito de producir material de plantas buscado por el hombre o animal para consumo oral, o bien para utilización en un proceso industrial, farmacéutico o comercial. La invención puede aplicarse a cualquier variedad de plantas, incluyendo, pero sin limitarlo a maíz, trigo, arroz, cebada, soja, algodón, sorgo, granos en general, colza, cañóla, alfalfa, lino, girasol, cártamo, mijo, centeno, caña de azúcar, remolacha, cacao, té, remolacha de azúcar tropical, Brassica, algodón, café, batata, lino, maní, clavo de olor; vegetales tales como lechuga, tomate, cucurbitáceas, mandioca, patata, zanahoria, rábano, arvejas, lentejas, coles, coliflor, brócoli, repollitos de Bruselas, pimientos, y ananá; fruta de árbol tal como cítricos, manzanas, peras, melocotones, albaricoques , nueces, palta, banana y coco; y flores, tales como orquídeas, claveles y rosas. Otras plantas útiles en la práctica de la invención incluyen césped perenne, tal como panizo, pasto de pradera, pasto indio, pasto Big bluestem, miscanthus y similares. Se ha reconocido que pueden usarse mezclas de plantas.

Tal como se usa aquí, el término "cultivo para energía" se refiere a cultivos que pueden ser favorables para usarlos en un método de conversión de biomasa con el propósito de convertir biomasa de plantas a combustibles. Este grupo comprende, pero no está limitado a: caña de azúcar, remolacha, sorgo, panizo, miscanthus, trigo, arroz, avena, cebada y maíz.

Tal como se usa aquí, el término "parte de planta" o "tejido de planta" incluye células de plantas, protoplastos de plantas, cultivos de tejidos de células de plantas a partir de las cuales pueden regenerarse plantas, callos de plantas agrupamientos de plantas y células de plantas que están intactas en plantas o partes de plantas tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, granos, mazorcas, mazorcas, cascaras, tallos, raíces, puntas de raíz, anteras y similares.

En una modalidad, la planta es una planta indeterminada. Estas variedades crecen vegetativamente por períodos indefinidos en regiones templadas. Una planta indeterminada puede ser manipulada para acumular almidón en tejidos de mazorca y puede cultivarse hasta las primeras heladas. En ese momento, la planta podría dejarse secar, cosecharla una vez seca y usarla para comerla, en comida para el ganado o en procedimientos de conversión de biomasa.

Tal como se usa aquí, "biomasa" se refiere a material biológico útil que incluye un producto de interés, cuyo material debe ser cosechado y se destina a un procesamiento posterior para aislar o concentrar el producto de interés. "Biomasa" puede comprender el fruto o partes del mismo o semillas, hojas o tallos, mazorca o raíces, donde estas son las partes de la planta que son de interés particular para propósitos industriales. "Biomasa", en lo que se refiere a material de plantas, incluye cualquier estructura o estructuras de una planta que contienen o representan el producto de interés.

Un incremento en la acumulación de almidón de mazorca puede ser deseable, por ejemplo, en tejido de mazorca que es conservado por ensilaje o secado. En una modalidad, puede ser beneficioso el ensilaje de una planta con incremento del almidón de mazorca. En otra modalidad, puede ser beneficioso manipular una planta con incremento de almidón de mazorca e incremento de almidón de tejido verde y uso de la planta en ensilaje. En otra modalidad puede ser beneficioso producir la planta con incremento del almidón de mazorca, donde la planta ha sido manipulada para expresar o ha sido tratada con una fitasa. En otra modalidad, puede ser beneficioso producir la planta manipulada para expresar fitasa o tratarla con fitasa para manipularla adicionalmente para expresar una amilasa. Tal como se usa aquí, el término "amilasa" abarca enzimas (por ejemplo E.C. clase 3.2.1.1) que tienen actividad de a-amilasa, por ejemplo, a-amilasas capaces de hidrolizar enlaces internos a-1 , 4-glucano en polisacáridos, incluyendo enzimas de amilasa capaces de hidrolizar almidón a azúcares a pHs alcalinos o a pHs ácidos. Estas enzimas han sido también descritas como aquellas que efectúan la exohidrólisis o endohidrólisis de enlaces 1,4-a-D-glucosídicos en polisacáridos que contienen unidades de D-glucosa ligadas a 1,4-a-. Otro término usado para describir estas enzimas es "glicogenasa" . La Publicación de Patente estadounidense 2003/0125534 y Publicación de Patente estadounidense 2004/0018607 (ambas incorporadas aquí como referencia) describen numerosas enzimas de a-amilasa que pueden usarse en varias modalidades de la invención. Métodos para preparar y usar organismos que expresan enzimas de. a-amilasa (por ejemplo, para producir sustratos fermentables para la producción de etanol) se proveen también en la Publicación de Patente estadounidense No. 2003/0135885, la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. El termino "índice de cosecha" tal como se define aquí, se refiere a la relación de rendimiento de biomasa a biomasa acumulativa en la cosecha. Dos de los mejores cultivos para energía hoy en día, caña y remolacha, en términos de índice de cosecha, tienen limitaciones en cuanto a la estabilidad en almacenamiento, y tienen un elevado contenido de humedad en la cosecha. El elevado contenido de humedad tiene varias desventajas, tales como el costo de transporte para la cosecha, que es más elevado debido a que es necesario movilizar una mayor proporción de agua junto con el cultivo. La estabilidad en almacenamiento es un tema significativo, debido a que pueden existir un metabolismo continuado, o contaminaciones microbianas que pueden conducir al deterioro del cultivo y a la pérdida de azúcar. La perécibilidad de la cosecha tiene implicaciones infraestructurales muy diferentes para el movimiento, almacenamiento y utilización de estos tipos de productos agrícolas. Un aumento del contenido de almidón conduciría a un aumento considerable de sustancia seca y estabilidad en almacenamiento.

Una modalidad de la presente solicitud provee un método para aumentar los niveles de almidón en tejidos de mazorca de plantas, que comprende insertar un cásete de expresión dentro de una célula de planta, que comprende un polinucleótido , donde la expresión de la secuencia del polinucleótido disminuye o inhibe la actividad de una o más enzimas de degradación de almidón seleccionadas del grupo formado por alfa amilasa, glucano agua dicinasa, fosfoglucano agua dicinasa, dextrinasa límite, isoamilasa, beta-amilasa , glucano fosforilasa cloroplástica, enzima desproporcionadora, proteína cloroplástica transportadora de maltosa (Mexl) , fosfatasa fosfoglucano (exceso de almidón 4), proteína cloroplástica transportadora de glucosa, y proteína cloroplástica transportadora de triosa fosfato. La regeneración de plantas transgénicas desde la célula de planta comprende un cásete de expresión donde la expresión de la secuencia polinucleotídica disminuye o inhibe la actividad de una o más enzimas de degradación de almidón. El polinucleótido estaría ligado preferiblemente a un promotor operable de tejido de mazorca preferido, tal como, pero sin limitarlo al promotor Oryza sativa MADS-box (OsMADS) tal como se describe en la publicación estadounidense 2007/0006344 que se incorpora aquí como referencia. La mazorca resultante tendrá un nivel incrementado de almidón, teniendo por lo tanto un índice de cosecha y un valor comercial más elevado. En una modalidad preferida, la enzima de degradación de almidón está ligada operablemente a un promotor OsMADS13 (GenBank Número de Acceso AF151693) .

"Operablemente ligado" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un fragmento de ácido nucleico único de manera que la función de uno se afecta por el otro. Por ejemplo, un promotor está operablemente ligado con una secuencia codificante o ARN funcional cuando es capaz de afectar la expresión de tal secuencia codificante o ARN funcional (es decir, que la secuencia codificante o ARN funcional está bajo el control transcripcional del promotor) . Las secuencias codificantes en orientación sentido o antisentido pueden ser operablemente ligadas a secuencias reguladoras .

En algunas modalidades, la materia objeto actualmente descrita se refiere a un cásete de expresión que comprende una secuencia reguladora al extremo 5' y una molécula de ácido nucleico operablemente ligada a la secuencia reguladora al extremo 5', en donde la molécula de ácido nucleico es heteróloga a la secuencia reguladora al extremo 5', y en donde el producto de la expresión de la molécula de ácido nucleico se dirige al tejido de mazorca de una planta. La secuencia reguladora al extremo 5' comprende las siguientes regiones: un promotor, un primer exón, un primer intrón y una porción al extremo 5' de un segundo exón, en donde la secuencia reguladora al extremo 5' ha sido diseñada por ingeniería para incluir un codón de iniciación de la traducción al extremo 3' de la secuencia reguladora al extremo 5', y no contiene codones de inicio de la traducción adicionales corriente arriba del codón de inicio de la traducción. La materia objeto actualmente descrita además se refiere a un cásete de expresión en donde la porción 5' del segundo exón comprende los primeros 15 nucleótidos a partir del extremo 5' del exón y una secuencia Kozak.

En algunas modalidades, la materia objeto actualmetne descrita proporciona un cásete de expresión que comprende la SEC ID NO: 8 operablemente ligada a un gen heterólogo. En un aspecto el cásete de expresión comprende una secuencia reguladora al extremo 5' y una molécula de ácido nucleico operablemente ligadada a la secuencia reguladora .al extremo 5', en donde la molécula de ácido nucleico es heteróloga a la secuencia reguladora al extremo 5'. La secuencia reguladora al extremo 5' puede comprender las siguientes regiones: un promotor, un primer exón, un primer intrón, y una porción al extremo 5' de un segundo exón. La secuencia reguladora al extremo 5' está diseñada por ingeniería para incluir un codón de iniciación de la transducción en su extremo 3', y no contiene codones de iniciación de la traducción adicionales corriente arriba del codón de iniciación de la traducción. El término "porción" como se usa en la presente puede referirse a una secuencia a partir de un intrón o exón, tal como desde el extremo 5' del exón 2, de una longitud deseada como puede ser determinado por la guía proporcionada aquí que incluye los Ejemplos de la presente posteriores. Por medio del ejemplo y sin limitación, la porción al extremo 5' del segundo exón incluida en el cásete puede incluir los primeros 15 nucleótidos a partir del extremo 5' del exón. El producto de la expresión de la molécula de ácido nucleico puede ser dirigido al tejido de mazorca de una planta. El diseño de cásete de expresión es primero descrito en la Solicitud Estadounidense No. 2007/0006344, el cual se incorpora en la presente por referencia .

Biosíntesis y degradación del almidón.

El almidón es uno de los polímeros más abundantes producidos en la naturaleza y es sintetizado como carbohidrato de almacenamiento a través de todo el reino vegetal. En órganos de almacenamiento, sirve como reserva de carbono a largo plazo, mientras que en te idos fotosintéticamente competentes, es acumulado transitoriamente para proveer ambas cosas: carbono y energía reducidos, durante períodos desfavorables para la fotosíntesis. El almidón es un carbohidrato de almacenamiento deseable debido a que es composicionalmente simple en comparación con material celulósico. El material celulósico comprende diversos azúcares diferentes formando un complejo con lignina. La lignocelulosa es extremadamente difícil de descomponerse enzimáticamente . En contraste, el almidón está constituido por glucosa y es rápidamente hidrolizable a azúcares monoméricos a través de enzimas hidrolizadoras de almidón eficaces y poco costosas. La acumulación de almidón en tejidos de mazorca de plantas proporcionaría una fuente rica en azúcares simples en la biomasa de plantas .

La degradación de almidón en tejidos verdes involucra enzimas y transportadores múltiples. El almidón transitorio es convertido esencialmente en el estroma de cloroplasto a glucosa, maltosa y triosa fosfato a través de las acciones de las enzimas de degradación de almidón. Estos azúcares son luego transportados desde el estroma de cloroplasto hasta el citosol a través de transportadores de azúcar. Una vez en el citosol, estos azúcares simples serán luego utilizados en metabolismo celular de plantas. Investigaciones previas se focalizaron en la supresión o inactivación de enzimas y transportadores clave de degradación de almidón dentro del estroma de cloroplasto, para acumular almidón dentro de los tejidos verdes. Sorprendentemente, se ha hallado que la regulación por disminución de enzimas de degradación de almidón en la mazorca, dan como resultado un aumento del almidón en la mazorca. Las plantas exhiben también un fenotipo de exceso de almidón en sus tejidos verdes a través de la potencial expresión dudosa del promotor OsMADs . Mediante "dudosa" se indica que el promotor puede dirigir preferiblemente un gen para expresarlo en un tipo de tejido y no preferiblemente en menor grado dirigir un gen para expresarlo en un segundo tejido. Es conocido en la materia, que muchos promotores exhiben este tipo de perfil de expresión cuando la expresión génica es dirigida a un tejido específico, pero puede expresar el gen en menor grado en otros tipos de tejidos. Un promotor preferido de mazorca de maíz, es cualquier promotor que dirija la expresión de un gen, preferiblemente a la mazorca de una planta de maíz y puede expresar o no, subsiguientemente, al mismo gen en otros tejidos de plantas de maíz, en menor grado o en igual grado. En una modalidad, puede ser deseable usar un promotor constitutivo en el que la enzima de degradación de almidón está regulada por disminución constitutivamente a través de la planta.

El almidón comprende polímeros de glucosa lineales (amilosa) y ramificados (amilopectina) . La amilopectina de muchas, pero no todas las fuentes de plantas, contiene monoésteres de fosfato que están ligados principalmente a las posiciones C6 y C3 de residuos glicosilo. El mecanismo bioquímico de fosforilación de almidón, sin embargo, ha sido solo recientemente elucidado. Plantas de papa transgénicas (Lorberth et al (1998) Nat Biotechnol . 16(5):473-7) y el mutante sexl de Arabidobsis (Yu et al. (2001) Plant Cell 13(8) :1907-18) son deficientes en la proteína asociada a almidón, la cual se denomina aquí Rl, y éstas sintetizan almidón con disminución del contenido de fosfato. La proteína Rl recombinante purificada es capaz de fosforilar c-glucanos (Ritte et al. (2002) Proc Nati Acad Sci U S A 99(10) :7166-71) . Cataliza una reacción de tipo dicinasa, liberando el ?-fosfato de ATP (que da como resultado la liberación de ortofosfato) , pero usando ß-fosfato para fosforilar residuos glucosilo del poliglucano. Debido a esta actividad, la proteína es considerada un glucano, agua dicinasa (GWD) (Ritte et al. (2003) Planta 216 (5) : 798-801) .

La inhibición del gen Rl que codifica para una proteína Rl de papa en plantas transgénicas de papa, da como resultado una reducción del contenido de fosfato del almidón, el cual puede ser aislado de los tubérculos de papa (Lorberth et al.) . Además, Lorberth et al. demostraron que la proteína Rl de Solanum tuberosum es capaz de fosforilar glicógeno bacteriano si el ADNc Rl correspondiente está expresado en E. coli (Lorberth et al., Nature Biotech. 16, (1998), 473-477). Ritte et al. (Plant J. 21, (2000), 387-391) demostraron que la proteína Rl de Solanum tuberosum se une reversiblemente a granos de almidón en plantas de papa, donde la resistencia de unión al grano de almidón depende del estado metabólico de la planta. En forma unida al grano de almidón, la proteína en plantas de papa ocurre principalmente en hojas que se mantienen en la oscuridad. Después de iluminar las hojas, sin embargo, la proteína está principalmente presente en forma soluble no unida a los granos de almidón.

La fosforilación de almidón afecta enormemente su degradabilidad in vivo. Esta actividad está indicada por el fenotipo de exceso de almidón observado en hojas de papa deficientes en GWD o plantas de Arabidopsis (Lorberth et al., 1998, supra; Yu et al., 2001, supra) . Una reducción en la expresión y/o actividad de la proteína Rl y sus homólogos en una planta o célula de planta, da como resultado este fenotipo de exceso de almidón, lo cual significa que una planta deficiente en actividad Rl no es ya capaz de movilizar el almidón sintetizado en sus tejidos fotosintéticos o de almacenamiento (almidón transitorio) .

Por lo tanto, estas plantas muestran una acumulación de almidón en sus tejidos verdes. Mediante "tejidos verdes", se entienden todas las estructuras verdes en una planta, incluyendo hojas, tallos y frutos sin madurar. Sorprendentemente, se ha descubierto que la regulación por disminución de Rl en la mazorca, da como resultado una acumulación de almidón en el tejido de mazorca.

Esta propiedad de exceso de almidón puede ser ensayada, tal como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente estadounidense No. 2006/0236426, que se incorpora aquí como referencia. En particular, las hojas que son la fuente de origen de las plantas se mantienen en la oscuridad por intervalos de tiempo diferentes y luego se tiñen con yodo para determinar su contenido de almidón. Las hojas de plantas que no pueden movilizar el almidón transitorio en la oscuridad muestran una tinción azul, o la tinción azul en estas hojas es más fuerte o la tinción es aparente después de intervalos de tiempo más prolongados en la oscuridad, en comparación con la tinción que puede ocurrir en hojas de plantas de tipo salvaje correspondientes. Métodos similares pueden ser modificados para medir la acumulación de almidón en los tejidos de mazorca.

Además, la acumulación de almidón transitorio en los tejidos de mazorca puede ensayarse también, determinando enzimáticamente el contenido de almidón. Esto puede efectuarse, por ejemplo tal como ha sido descrito por Muller-Rober et al. (EMBO J. 11 (1992), 1229-1238). Los tejidos de mazorca de plantas en los cuales la actividad de una o más enzimas de degradación de almidón es reducida, tienen preferiblemente un contenido de almidón incrementado de por lo menos aproximadamente 50%, de por lo menos aproximadamente 75%, de por lo menos aproximadamente 100%, de por lo menos aproximadamente 150%, de por lo menos aproximadamente 200%, de por lo menos aproximadamente 250%, de por lo menos aproximadamente 300%, de por lo menos aproximadamente 350%, de por lo menos aproximadamente 400%, de por lo menos 600%, o más,, cuando se compara con tejidos de mazorca de las correspondientes plantas de tipo salvaje.

Inhibición de la actividad de la enzima de degradación de almidón En los métodos y composiciones de la presente invención, la acumulación de almidón ocurre en los tejidos de mazorca de plantas en las cuales la actividad de las enzimas de degradación de almidón u homólogos de las mismas, es regulada por disminución. Regulando por disminución la actividad, el nivel de actividad de la proteína o enzima de degradación de almidón en una planta es disminuida o completamente suprimida, en comparación con la actividad en una planta de control correspondiente que no ha sido manipulada para disminuir la actividad de una enzima de degradación de almidón. La actividad de la enzima de degradación de almidón, la proteína que constituye el objetivo, es inhibida, reducida o eliminada si la actividad es de menos de 95%, menos de aproximadamente 90%, menos de aproximadamente 80%, menos de aproximadamente 70%, inferior a aproximadamente 60%, inferior a aproximadamente 50%, inferior a aproximadamente 40%, menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 10%, o es 100% menos de la actividad de la enzima de degradación de almidón en una planta que no es mutante o que no ha sido genéticamente modificada para inhibir la expresión de una enzima de degradación de almidón. La actividad de una enzima de degradación de almidón puede medirse por medición del contenido de almidón en tejido de mazorca de planta. Métodos para la medición del contenido de almidón se encuentran disponibles en la materia. Ver, por ejemplo, Yu et al. (2001) The Plant Cell 13:1907-1918. La actividad de la enzima Rl puede medirse por métodos señalados, por ejemplo, en Ritte et al. (2002) Proc. Nati. Acad. Sci USA 14:7166-7171. Asimismo, los niveles de expresión de las enzimas de degradación de almidón pueden medirse directamente mediante inmunotransferencia, que demuestra una reducción en una enzima de degradación de almidón en la planta, por análisis de Western Blot y similares.

Cualquier método para reducir la actividad de una enzima de degradación de almidón en una planta, puede usarse en la práctica de los métodos de la invención. Por ejemplo, la actividad y/ o el nivel de la proteína Rl puede reducirse o eliminarse mediante la introducción en una planta, de un polinucleótido que inhibe el nivel o actividad de la proteína Rl . El polinucleótido puede inhibir la expresión o la traducción del ARN mensajero. Asimismo, la regulación por disminución puede lograrse mediante transformación de la planta con una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que inhibe la transcripción o traducción de la enzima de degradación de almidón, o que inhibe la actividad de la enzima de degradación de almidón.

Los términos "inhibir," "inhibición," "regulación por disminución" e "inhibiendo" tal como se usan aquí se refieren a cualquier disminución en la expresión o función de un producto génico que constituye el objetivo, incluyendo cualquier decremento relativo en la expresión o función hasta, e incluyendo, anulación completa de la expresión o función del producto . génico que constituye el objetivo. El término "expresión" tal como se usa aquí, en el contexto de un producto génico, se refiere a la biosíntesis de ese producto génico, incluyendo la transcripción y/ o traducción y/ o ensamblado del producto génico. La inhibición de la expresión o función de un producto génico que constituye un objetivo, (es decir un producto génico de interés) puede estar en el contexto de una comparación entre cualquiera de dos plantas, por ejemplo expresión o función de un producto génico que constituye un objetivo en una planta genéticamente alterada, versus la expresión o función de ese producto génico que constituye el objetivo en una planta de tipo salvaje correspondiente. Alternativamente, la inhibición de la expresión o función del producto génico que constituye el objetivo, puede estar en el contexto de una comparación entre células de plantas, organelos, órganos, tejidos o partes de plantas dentro de la misma planta o entre plantas, e incluye comparaciones entre etapas de desarrollo o etapas temporales dentro de la misma planta o entre plantas.

Los métodos para inhibir o eliminar la expresión de un gen en una planta son bien conocidos en la materia, y cualquiera de los métodos puede usarse en los métodos de la presente invención. Pueden utilizarse construcciones antisentido, complementarias de por lo menos una porción del AR mensajero (ARNm) para la secuencia que constituye el objetivo. Se construyen nucleótidos antisentido para hibridarlos con el AR m correspondiente. Las modificaciones de las secuencias antisentido pueden llevarse a cabo con tal que ras—-secuencias se hibriden con, e interfieran con la expresión del ARNm correspondiente. De esta manera, pueden usarse construcciones antisentido que tienen por lo menos una identidad de secuencia de por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85% o más, con las correspondientes secuencias de sentido. Además, pueden usarse porciones de los nucleotidos antisentido para interrumpir la expresión del gen que constituye el objetivo. Generalmente, pueden usarse secuencias de por lo menos aproximadamente 10 nucleotidos, por lo menos aproximadamente 20 nucleotidos, por lo menos aproximadamente 30 nucleotidos, por lo menos aproximadamente 40 nucleotidos, por lo menos aproximadamente 50 nucleotidos, por lo menos aproximadamente 100 nucleotidos, por lo menos aproximadamente 200 nucleotidos, por lo menos aproximadamente 300, por lo menos aproximadamente 400, por lo menos aproximadamente 450, por lo menos aproximadamente 500, por lo menos aproximadamente 550, o más. Son conocidos en la materia los métodos antisentido. Ver, por ejemplo, Sheehy et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 85:8805-8809; y las patentes estadounidenses Nos. 5,107,065; 5,453,566; y 5,759,829); que se incorporan aquí como referencia.

Puede usarse también co-supresión para suprimir la expresión del gen que constituye el objetivo. De esta manera, una secuencia heteróloga de una enzima de degradación de almidón es expresada en una planta de interés en la orientación de sentido para suprimir la expresión del gen endógeno de la enzima de degradación de almidón en la planta. Métodos para co-supresión son conocidos en la materia. Ver, or ejemplo, Taylor (1997) Plant Cell 9:1245; Jorgensen (1990) Trends Biotech. 8 (12) : 340-344 ; Jorgensen et al. (1996) Plant Mol. Biol . 31:957-973; Johansen y Carrington (2001) Plant Physiol. 126:930-938; Broin et al. (2002) Plant Cell 14:1417-1432; Stoutjesdijk et al (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Yu et al. (2003) Phytochemistry 63:753-763; Flavell (1994) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 91:3490-3496; Finnegan et al. (1994) Bio/Technology 12:883-888; Neuhuber et al. (1994) Mol. Gen. Genet . 244:230-241; y las patentes estadounidenses Nos. 5,034,323, 5,283,184, y 5,942,657; todas las cuales se incorporan aquí como referencia.

La cosupresión involucra transformar plantas con un constructo de ADN que comprende un promotor que guía la expresión en una planta ligada operablemente a por lo menos una porción de un polinucleótido que corresponde a la transcripción del gen de interés o del gen que constituye el objetivo. La secuencia nucleotídica es construida o elegida de manera que tenga una identidad de secuencia sustancial con la secuencia de la transcripción del gen endógeno, típicamente superior a aproximadamente 60% de identidad de secuencia, más típicamente superior a aproximadamente 80% de identidad de secuencia, más típicamente superior a aproximadamente 90% de identidad de secuencia, y en algunos casos superior a aproximadamente 95% de identidad de secuencia.

La interferencia del ARN (ARNi) puede usarse también para regular por disminución los genes de enzimas de degradación de—almidón. Ver, en general, Napoli et al. (1990) Plant Cell 2:279-289; Patente estadounidense No. 5,034,323; Sharp (1999) Genes Dev. 13:139-141; Zamore et al. (2000) Cell 101:25-33; y Montgomery et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 95:15502-15507. En ARNi, los ARNs de doble hebra (dsARNs) largos, típicamente >200 nucleótidos, pueden usarse para silenciar la expresión del gen que constituye un objetivo en una planta. En la introducción, los dsARNs largos entran a una vía celular que es comúnmente denominada la vía de interferencia de ARN (ARNi) . Primero, los dsARNs son procesados en ARNs de 20-25 nucleótidos (nt) de pequeña interferencia (siARNs) mediante una enzima de tipo RNasa III. Estas siARNs se ensamblan en complejos que contienen endorribonucleasa , conocidos como complejos silenciadores inducidos por ARN (RlSCs) , desenredados en el procedimiento. Las hebras siARN guían subsiguientemente los RISCs a moléculas de ARN complementarias, donde disocian y destruyen el ARN cognado. La disociación del ARN cognado tiene lugar cerca del medio de la región unida por la hebra del siARN.

De esta manera, puede usarse interferencia de ARN de doble hebra (dsARN) . Para interferencia de dsARN, una molécula de ARN de sentido y una antisen ido que es completamente o parcialmente complementaria a la molécula AR de sentido, se expresan en la misma célula, lo cual da como resultado una inhibición de la expresión del ARN mensajero endógeno correspondiente .

Las moléculas de sentido y antisentido pueden expresarse a partir de un cásete de expresión único o separado. Alternativamente, las líneas de plantas múltiples transformadas con el cásete de expresión o casetes de expresión de interferencia de dsARN son luego rastreadas para identificar las líneas de plantas que muestran la mayor inhibición de expresión de enzima de degradación de almidón. Los métodos para usar interferencia de dsARN para inhibir la expresión de genes de plantas endógenos han sido descritos en Waterhouse et al. (1998) Proc . Nati. Acad. Sci . USA 95:13959-13964, Liu et al. (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743, y WO 99/49029, WO 99/53050, WO 99/61631, y WO 00/49035; cada uno de los cuales se incorpora aquí como referencia.

En algunas modalidades de la invención, la inhibición de la expresión de una enzima de degradación de almidón puede obtenerse mediante interferencia de ARN horquilla (hpARN) o interferencia de ARN horquilla que contiene intrones (ihpARN) . Un ARN de horquilla corta (shpARN) es una secuencia de ARN que hace una vuelta de horquilla cerrada que puede usarse para silenciar la expresión génica. Estos métodos son sumamente eficientes para inhibir la expresión de genes endógenos. Ver, Waterhouse y Helli ell (2003) Wat. Rev. Genet . 4:29-38 y las referencias allí citadas.

Para interferencia de hpAR , el cásete de expresión está diseñado para expresar una molécula de ARN que se híbrida con sí misma para formar una estructura de horquilla que comprende una región de bucle de una sola hebra y un tallo de apareamiento de bases. La región de tallo de apareamiento de bases comprende una secuencia de sentido que corresponde a la totalidad o parte del ARN mensajero endógeno que codifica el gen cuya expresión debe ser inhibida, y una secuencia antisentido que es totalmente o parcialmente complementaria a la secuencia de sentido. Por lo tanto, la región de tallo de apareamiento de bases de la molécula determina generalmente la especificidad de la interferencia de ARN. Las moléculas de hpARN son altamente eficientes para inhibir la expresión de genes endógenos, y la interferencia de ARN que inducen, es heredada por generaciones subsiguientes de plantas. Ver, por ejemplo, Chuang y Meyerowitz (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk et al. (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; y aterhouse y Helliwell (2003) Wat. Rev. Genet. 4:29-38. Métodos para usar interferencia de hpARN para inhibir o silenciar la expresión de genes han sido descritos, por ejemplo, en Chuang y Meyerowitz (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk et al. (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Waterhouse y Helliwell (2003) Nat . Rev. Genet . 4:29-38; Pandolfini et al . BMC Biotechnology 3:7, y Publicación de la patente estadounidense No. 20030175965; cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia. Un ensayo transitorio para determinar la eficiencia de construcciones de hpARN para silenciar la expresión génica in vivo ha sido descrito por Panstruga et al. (2003) Mol. Biol . Rep. 30:135-140, y se incorpora aquí como referencia.

El ARN de horquilla interférente (ihpARN) puede usarse también en los métodos de la invención. ihpARN tienen la misma estructura general que para hpARN, pero la molécula de ARN comprende adicionalmente un intrón que es capaz de ser empalmado en la célula en la cual se expresa el ihpARN. El uso de un intrón minimiza el tamaño del bucle en la molécula de ARN horquilla a continuación del corte y empalme, aumentando de este modo la eficiencia de la interferencia. Ver, por ejemplo, Smith et al. (2000) Nature 407:319-320. Métodos para usar interferencia de ihpARN para inhibir la expresión de genes endógenos de plantas se describen, por ejemplo, en Smith et al. (2000) Nature 407:319-320; esley et al. (2001) Plant J. 27:581-590; ang y Waterhouse (2001) Curr. Opin. Plant Biol. 5:146-150; Waterhouse y Helliwell (2003) Wat. Rev. Genet. 4:29-38; Helliwell y Waterhouse (2003) Métodos 30:289-295, y en la publicación de patente estadounidense No. 20030180945, cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia. Ver también O 02/00904 donde el hpARN es diseñado de manera que la región de bucle determine la especificidad de la interferencia de ARN.

En algunas modalidades -de la invención, puede usarse interferencia de ARN mediante expresión de un gen que codifica un micro ARN (miARN) . Los miARNs son agentes reguladores que consisten aproximadamente de 22 ribonucleótidos . Los miARN son sumamente eficientes para inhibir la expresión de genes endógenos. Ver, por ejemplo Javier et al. (2003) Nature 425: 257-263, que se incorpora aquí como referencia. Para interferencia de miARN, el. cásete de expresión está diseñado para expresar una molécula de ARN que es modelada en un gen endógeno de miARN. El gen miARN codifica un ARN que forma una estructura de horquilla que contiene aproximadamente una secuencia de 22 nucleótidos que es complementaria de Rl . Por ejemplo, para la supresión de la expresión Rl, la secuencia de 22 nucleótidos se selecciona de una secuencia de transcripción de enzima de degradación de-almidón y contiene 22 nucleótidos de la secuencia de enzima de degradación de almidón en orientación de sentido y 21 nucleótidos de una secuencia antisentido correspondiente que es complementaria a la secuencia de sentido.

Otros métodos para regular por disminución la actividad de una proteína que constituye un objetivo, -incluyen silenciamiento génico inducido por virus (Burton et al. (2000) Plant Cell 12:691-705; y Baulcombe (1999) Cur . Op. Plant Bio. 2:109-113); ribozimas (Steinecke et al. (1992) EMBO J. 11:1525; y Perriman et al. (1993) Antisense Res. Dev. 3:253); modificación direccionada, ¦ intermediada por oligonucleótidos (por ejemplo, WO 03/076574 y WO 99/25853) ; moléculas objetivo de motivo Zn-finger (por ejemplo., WO 01/52620; WO 03/048345; y WO 00/42219); marcado con transposón (Maes et al. (1999) Trends Plant Sci. 4:90-96; Dharmapuri y Sonti (1999) FEMS Microbiol . Lett. 179:53-59; Meissner et al. (2000) Plant J. 22:265-274; Phogat et al. (2000) J. Biosci . 25:57-63; Walbot (2000) Curr. Opin . Plant Biol . 2:103-107; Gai et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:94- 96; Fitzmaurice et al. (1999) Genetics 153:1919-1928; Bensen et al. (1995) Plant Cell 7:75-84; Mena et al. (1996) Science 274:1537-1540; y patente estadounidense No. 5,962,764); cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia.

Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos que reconocen específicamente una proteína de enzima de degradación de almidón u homólogos de la misma, de acuerdo con la invención en una célula de planta, es decir fragmentos o epítopos específicos de la proteína, pueden usarse para inhibir la actividad de esta proteína. Estos anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales o anticuerpos sintéticos, así como también fragmentos de anticuerpos, tales como fragmentos Fab, Fv o scFv etc. Pueden prepararse, por ejemplo, anticuerpos monoclonales mediante las técnicas descritas originalmente en Kohler y Milstein (Nature 256 (1975), 495) y Galfre (Meth. Enzymol . 73 -(1981) 3), que comprenden la fusión de células de mieloma de ratón con células de bazo derivadas de mamíferos inmunizados. Además, anticuerpos o fragmentos de los mismos para los péptidos antes mencionados, pueden obtenerse mediante el uso de métodos que han sido descritos, por ejemplo, en Harlow and Lañe "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. La expresión de anticuerpos o moléculas del tipo de anticuerpos en plantas puede lograrse por métodos bien conocidos en la materia, por ejemplo, anticuerpos de tamaño completo (During, Plant. Mol. Biol. 15 (1990), 281-293; Hiatt, Nature 342 (1989), 469-470; Voss, Mol. Breeding 1 (1995), 39-50), fragmentos Fab (De Nevé, Transgenic Res. 2 (1993) , 227-237) , scFvs (O en, Bio/Technology 10 (1992) , 790-794; Zimmermann, Mol. Breeding 4 (1998), 369-379; Tavladoraki, Nature 366 (1993), 469-472) y dAbs (Benvenuto, Plant Mol. Biol. 17 (1991), 865-874) han sido expresados exitosamente en tabaco, papas (Schouten, FEBS Lett . 415 (1997) , 235-241) o Arabidopsis, alcanzando niveles de expresión tan altos como 6,8% de la proteína total (Fiedler, Immunotechnology 3 (1997) , 205-216) .

Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican una forma mutante de la enzima de acuerdo con la invención pueden usarse para interferir con la actividad de la proteína de tipo salvaje. La forma mutante ha perdido preferiblemente su actividad y puede ser derivada de la proteína de tipo salvaje correspondiente por medio de deleción (es) , sustitución (es) y/ o adiciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la proteína. Las formas mutantes de las proteínas pueden mostrar, además de la pérdida de actividad, una afinidad de sustrato incrementada y/o una estabilidad elevada en la célula, por ejemplo, debido a la incorporación de aminoácidos que estabilizan proteínas en el medio celular. Estas formas mutantes pueden ocurrir en forma natural o, si se prefiere, pueden ser mutantes manipulados por ingeniería genética.

Se ha contemplado además que los métodos de la invención pueden usarse con otros métodos para aumentar y/ o utilizar el contenido del almidón de un tejido de mazorca de planta. Se ha reconocido que cualquier mecanismo de disminución de fosforilación de almidón puede conducir a una acumulación de almidón en tejidos de mazorca, incluyendo inhibición de fosfoglucano agua dicinasa (Kotting et al. (2005) Plant Physiology 137:242-252). Otros métodos incluyen la regulación ascendente de la expresión de enzimas involucradas en la síntesis de almidón, por ejemplo, ADP- glucosa fosforilasa y/ o sintasa de almidón.

Secuencias nucleotídicas de enzimas de degradación de almidón.

Las secuencias nucleotídicas para enzimas de degradación de almidón han sido identificadas en hojas de Arabidopsis. Ver, alfa-amilasa (EC 3.2.1.1), glucano agua dicinasa (EC 2.7.9.4), Fosfoglucano agua dicinasas (EC 2.7.9.4), dextrinasa límite (EC 3.2.1.142), Isoamilasa (EC 3.2.1.68 y EC3.2.1.68), beta-amilasa (EC 3.2.1.2), glucano fosforilasa (EC2.4.1.1) y enzima desproporcionadora (EC 2.4.1.25). Se ha reconocido que estas secuencias pueden usarse para regular por disminución o suprimir la expresión de la proteína que constituye el objetivo en cualquier planta. Sin embargo, si se necesita una secuencia específica de plantas adicional, puede obtenerse por hibridación o por PCR usando las secuencias nucleotídicas indicadas anteriormente .

Las secuencias nucleotídicas para proteínas Rl de otras plantas son conocidas en la materia. Ver, por ejemplo SEC ID NO: 1 de la Publicación de Solicitud Estadounidense No. 2006/0282917 (Zea mays) ; SEC ID NOs : 1 , 4, 5, 6, 7, y 9 de la patente estadounidense 7.122.727 (trigo); que se incorporan aquí como referencia. Se ha reconocido que estas secuencias pueden usarse para regular por disminución o suprimir la expresión de la proteína Rl en cualquier planta.

Sin embargo, si es necesaria una secuencia específica de plantas adicional, (por ejemplo un homólogo de Rl) , puede obtenerse por hibridación o PCR usando secuencias basadas en las secuencias nucleotídicas Rl indicadas anteriormente.

En un método de PCR, pueden diseñarse cebadore-s oligonucleotídicos para usarlos en reacciones PCR para amplificar las secuencias de ADN correspondientes del ADNc o ADN genómico extraídos de cualquier planta de interés. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y clonación por PCR son generalmente conocidos en la materia. Ver, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York) . Ver también, Innis et al., eds . (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); e Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York).

En técnicas de hibridación, la totalidad o parte de un polinucleótido conocido se usa como una sonda que se híbrida selectivamente con otros polinucleótidos correspondientes presentes en una población de fragmentos de ADN clonados genómicos o fragmentos de ADNc (es decir genómicos o genotecas de cADN) de un organismo elegido. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómicos, fragmentos de cADN, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos , y pueden ser rotulados con un grupo detectable tal como 32P, o cualquier otro marcador detectable . Los métodos para la preparación de sondas para hibridación y para constructo de cADN y genotecas genómicas son generalmente conocidos en la materia y están descritos en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York) .

Mediante "hibridado a" o "hibridando específicamente con" se refiere a la unión, duplicidad o hibridación de una molécula solamente con una secuencia nucleotídica particular bajo condiciones rigurosas cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (por ejemplo, celular total) de ADN o ARN. "Se une (n) sustancialmente" se refiere a hibridación complementaria entre un ácido nucleico sonda y un ácido nucleico que constituye un objetivo y abarca malos emparejamientos menores que pueden acomodarse mediante reducción de la rigurosidad del medio de hibridación para lograr la detección deseada de la secuencia de ácido nucleico que constituye el objetivo.

"Condiciones de hibridación rigurosas" y "condiciones de lavado de hibridación rigurosas" en el contexto de experimentos de hibridación de ácido nucleico tales como hibridaciones Southern y Northern, dependen de secuencias, y son diferentes bajo parámetros de medios diferentes. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más altas. Una extensa guía para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I capítulo 2 "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probé assays" Elsevier, Nueva York. En general, se seleccionan condiciones de lavado e hibridación altamente rigurosas que sean de aproximadamente 5°C. menos que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica en una resistencia iónica y pH definidos. Típicamente, bajo "condiciones rigurosas", una sonda se hibridará a su subsecuencia destinada como objetivo, pero no a otras secuencias.

La Tm es la temperatura (bajo resistencia iónica y pH definidos) a la cual el 50% de la secuencia que constituye el objetivo, se híbrida con una sonda perfectamente emparejada. Se seleccionan condiciones muy rigurosas para que sean iguales a la Tm para una sonda particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios en un filtro en un Southern Blot o Northern es de 50% de formamida con 1 mg de heparina a 42°C, siendo llevada a cabo la hibridación durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado sumamente rigurosas es 0.1 5M NaCl a 72 °C. durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas es de 0.2X SSC de lavado a 65 °C durante 15 minutos (ver, Sambrook, infra, para una descripción de buffer SSC) . A menudo, un lavado de alta rigurosidad va precedido de un lavado de baja rigurosidad para remover la señal de sonda básica. Un ejemplo de lavado de rigurosidad mediana para un dúplice de, por ejemplo más de 100 nucleótides, es de IX SSC a 45 °C. durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado de rigurosidad baja para un dúplice de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es de 4-6X SSC a 40°C. durante 15 minutos. Para sondas cortas (por ejemplo de aproximadamente 10 a 50 nucleótidos) , las condiciones rigurosas involucran típicamente concentraciones de sal de menos de aproximadamente ión Na 1.0 M, típicamente aproximadamente concentración de ión Na de aproximadamente 0.01 a 1.0 M (u otras sales) a pH 7.0 hasta 8.3, y la temperatura es típicamente por lo menos de aproximadamente 30°C. También pueden lograrse condiciones rigurosas con adición de agentes desestabilizadores tales como formamida. En general, una relación de señal a ruido de 2X (o más) que la que se observó para una sonda no relacionada, en el ensayo de hibridación particular, indica la detección de una hibridación específica. Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí bajo condiciones rigurosas, son aún sustancialmente idénticos si las proteínas a las cuales codifican son sustancialmente idénticas. Esto ocurre, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico, usando la degeneración máxima de codón, permitida por el código genético.

Los siguientes son ejemplos de grupos de condiciones de hibridación/ lavado que pueden usarse para clonar secuencias nucleotídicas que son homologas de las secuencias nucleotídicas de referencia de la presente invención: una secuencia nucleotídica de referencia se híbrida preferiblemente con la secuencia nucleotídica de referencia en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS) , NaP04 0.5 M, 1 mM de EDTA a 50°C. con lavado en 2X SSC, 0.1% de SDS a 50°C, más deseablemente 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), NaP04 0.5 M, 1 mM de EDTA a 50°C. con lavado en IX SSC, 0.1% de SDS a 50°C, más deseablemente aún en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0.5 M de NaP04 , 1 mM de EDTA a 50 °C. con lavado en 0.5X de SSC, 0.1% de SDS a 50°C. , preferiblemente en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0.5 M de NaP0 , 1 mM de. EDTA a 50°C. con lavado en 0. IX de SSC, 0.1% de SDS a 50°C, más preferiblemente en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0,5 M de NaP04, 1 mM de EDTA a 50°C. con lavado en 0.1X SSC, 0.1% de SDS a 65°C.

Casetes de expresión en plantas Las composiciones de la invención pueden contener adicionalmente secuencias de ácido nucleico para la transformación y expresión en una planta de interés. Las secuencias de ácido nucleico pueden estar presentes en construcciones de ADN o casetes de expresión. "Cásete de expresión" tal como se usa aquí, significa una molécula de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de una secuencia nucleotídica particular en una célula huésped apropiada, que comprende un promotor ligado operablemente a la secuencia nucleotídica de interés (es decir, un polinucleótido inhibidor de Rl) el cual está ligado operablemente a señales de terminación. También comprende típicamente, las secuencias requeridas para una traducción apropiada de la secuencia nucleotídica. La región codificadora usualmente codifica para una proteína de interés, pero puede codificar también para un ARN funcional de interés, por ejemplo ARN antisentido o ARN no traducido, en la dirección de sentido o antisentido. El cásete de expresión que comprende la secuencia nucleotídica de interés puede ser quimérico, lo cual significa que por lo menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a por lo menos uno de sus otros componentes. El cásete de expresión puede ser también uno que ocurra en forma natural, pero que ha sido obtenido en una forma recombinante útil para la expresión heteróloga. Típicamente, sin embargo, el cásete de expresión es heterólogo con respecto al huésped, es decir la secuencia de ADN particular del cásete de expresión no ocurre en forma natural en la célula huésped y debe haber sido introducida en la célula huésped o un ancestro de la célula huésped mediante un evento de transformación. La expresión de la secuencia nucleotídica en el cásete de expresión puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor inducible que inicia la transcripción solamente cuando la célula huésped es expuesta a cierto estímulo externo particular. Adicionalmente , el promotor puede ser también específico para un tejido u órgano o etapa de desarrollo particular.

La presente invención abarca la transformación de plantas con casetes de expresión capaces de expresar polinucleótidos que reducen o eliminan la actividad de una o más enzimas de degradación de almidón. El cásete de expresión incluirá en la dirección de transcripción 5 '-3', una región transcripcional y translacional de iniciación (es decir, un promotor) y un polinucleótido de interés, es decir, un polinucleótido capaz de reducir o eliminar directamente o indirectamente (es decir, a través de la expresión de un producto proteico) la actividad de una o más enzimas de degradación de almidón. El cásete de expresión puede comprender opcionalmente una región de terminación transcripcional y translacional (es decir región de terminación) funcional en plantas. En algunas modalidades, el cásete de expresión comprende un gen marcador seleccionable para permitir la selección para transformantes estables. Las construcciones de expresión de la invención pueden comprender también una secuencia líder y/o una secuencia que permite la expresión inducible del polinucleótido de interés. Ver Guo et al. (2003) Plant J. 34:383-92 y Chen et al. (2003) Plant J. 36:731-40 para ejemplos de secuencias que permiten la expresión inducible.

Las secuencias reguladoras del constructo de expresión están ligadas operablemente al polinucleótido de interés. Mediante "ligado operablemente" se indica un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia en la cual la secuencia promotora inicia y media en la transcripción de la secuencia de ADN que corresponde a la segunda secuencia. En general, ligado operablemente, significa que las secuencias nucleotídicas que están ligadas son contiguas.

Cualquier promotor capaz de dirigir la expresión en la planta de interés puede ser usado en la práctica de la invención. El promotor puede ser natural o análogo o extraño o heterólogo a la. lanta huésped. Los términos "heterólogo" y "exógeno" , cuando se usan aquí para referirse a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo una secuencia de ADN o ARN) o un gen, se refieren a una secuencia que se origina a partir de una fuente extraña a la célula huésped particular o, si es de la misma fuente, está modificada de su forma original. Por lo tanto, un gen heterólogo en una célula huésped incluye un gen que es endógeno a la célula huésped particular, pero que ha sido modificado a través, por ejemplo, del uso de lanzadera de ADN. Los términos incluyen también copias múltiples que no ocurren en forma natural, de una secuencia de ADN que ocurre en forma natural. Por lo tanto, los términos se refieren a un segmento de ADN que es extraño o heterólogo a la célula, u homólogo a la célula, pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula huésped, en la cual no se encuentra comúnmente el elemento. Los segmentos de ADN exógeno se expresan para proporcionar polipéptidos exógenos .

Una secuencia de ácido nucleico "homólogo" (por ejemplo ADN) es una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo ADN o ARN) asociada en forma natural con una célula huésped dentro de la cual es introducida.

La elección de los promotores a incluir depende de diversos factores, incluyendo, pero sin limitarlo a, eficiencia, seleccionabilidad, inducibilidad, nivel de expresión deseado, y. expresión preferencial de célula o tejido. Es un tema rutinario para un experto en la materia, modular la expresión de una secuencia seleccionando y posicionando apropiadamente promotores y otras regiones reguladoras relativas a esa secuencia.

Algunos promotores apropiados inician la transcripción únicamente, o predominantemente, en ciertos tipos de células. Por lo tanto, tal como se usa aquí, un promotor preferencial de tejido o tipo de célula, es aquel que guía la expresión preferencialmente en el tejido que constituye el objetivo, pero que puede conducir también a cierta expresión en otros tipos de células o tejidos. Se entiende que algunos promotores que muestran direccionamiento de expresión preferencial en tejidos que constituyen el objetivo, pueden exhibir también expresión "dudosa" en tejidos no preferenciales para direccionamiento. Un ejemplo puede ser un promotor cuyo perfil de expresión muestra expresión preferencial en la semilla de maíz, y sin embargo exhibe también una fuerte expresión en tejido de hoja madura. Los métodos para identificar y caracterizar regiones promotoras en ADN genómico de plantas, incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en las referencia siguientes: Jordano, et al., Plant Cell, 1:855-866 (1989); Bustos, et al., Plant Cell, 1:839-854 (1989); Green, et al., EMBO J. 7, 4035-4044 (1988); Meier, et al., Plant Cell, 3, 309-316 (1991); y Zhang, et al., Plant Physiology 110: 1069-1079 (1996).

Los promotores que muestran actividad preferida en tejido fotosintético con cierta actividad en el tejido de mazorca, pueden ser útiles en algunas modalidades de la invención. El promotor puede conferir la expresión constitutivamente a través de la planta, o diferencialmente con respecto a los tejidos de mazorca de planta, o diferencialmente con respecto a la etapa de desarrollo del tejido de mazorca de planta en el que ocurre la expresión, o como respuesta a estímulos externos.

Los ejemplos de los promotores incluyen los promotores de ribulosa-1 , 5-bisfosfato carboxilasa (RbcS) tales como el promotor RbcS de alerce oriental {Larix laricina) , el promotor pino cab6 (Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35:773-778), el promotor génico Cab-1 del trigo (Fejes et al. (1990) Plant Mol. Biol . 15:921-932), el promotor CAB-1 de la espinaca (Lubberstedt et al. (1994) Plant Physiol. 104:997-1006), el promotor cablR del arroz (Luán et al. (1992) Plant Cell 4:971-981), el promotor piruvato ortofosfato dicinasa (PPDK) del maíz (Matsuoka et al. (1993) Proc Nati Acad Sci USA 90:9586-9590), el promotor Lhcbl*2 del tabaco (Cerdan et al. (1997) Plant Mol. Biol. 33:245-255), el promotor Arabidopsis thaliana SUC2 sacarosa-H+ simporter (Truernit et al. (1995) Planta 196:564-570), y los promotores de proteina de membrana tilakoide de la espinaca (psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, rbcS . Otros promotores que guían la transcripción en tallos, hojas y tejidos verdes han sido descritos en la Publicación de Patente Estadounidense No. 2007/0006346, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

En algunas otras modalidades de la presente invención, pueden desearse promotores inducibles. Los promotores inducibles guían la transcripción como respuesta a estímulos externos tales como agentes químicos o estímulos del medio. Por ejemplo, los promotores inducibles pueden conferir transcripción como respuesta a hormonas tales como ácido giber-élico, o etileno, o como respuesta a la luz o sequía. También pueden usarse promotores senescentes inducibles en la presente invención para suprimir las enzimas de degradación de almidón en etapas de desarrollo específicas de las plantas, de manera que se acumule el almidón en los tejidos de mazorca de la planta en un tiempo específico. Un ejemplo sería inhibir o suprimir la enzima de degradación del almidón en la mazorca de maíz a continuación de la maduración del endosperma de la semilla. Algunos otros ejemplos de promotores inducibles que pueden usarse en diversas modalidades de la invención pueden hallarse en Journal of Experimental Botany 2008 59 (2 ): 377-387. La expresión ectópica inducida por senescencia del gen ipt de A. tumefaciens en el trigo, demora la senescencia de la hoja, aumenta el contenido de citoquinina, la entrada de nitrato, y la actividad de nitrato reductasa, pero no afecta el rendimiento del grano, Blanka SJ'korovál, Gabriela KureSová2 , Sasha Daskalova , * , Marie TrCková2 , Klára Hoyerovál, Ivana Raimanová2, Václav Motykal, Aleña Trávníííkovál , Malcolm C. Elliott3 y Miroslav Kaminekl,† PNAS 4 de diciembre de 2007 vol . 104 no. 49 19631-19636. La senescencia de hoja demorada, induce una tolerancia extrema a la sequía en una planta en floración, y Rosa M. Rivero* , Mikiko Kojimat, Amira Gepsteint , Hitoshi Sakakibarat, Ron Mittler§^| , Shimon Gepsteint , y Eduardo Blumwald, Plant Physiol . (1999) 120:. 1015-1024, incorporados todos aquí como referencia.

Están disponibles una variedad de terminadores transcripcionales para ser usados en casetes de expresión. Estos son responsables de la terminación de transcripción más allá del transgen y corrigen la poliadenilación de AR m. La región de terminación puede ser natural con la región de iniciación transcripcional , puede ser natural con la secuencia de ADN ligada operablemente de interés, puede ser natural con la planta huésped, o puede derivar de otra fuente (es decir, extraña o heteróloga para el promotor, la secuencia de ADN de interés, la planta huésped o cualquier combinación de éstas) . Los terminadores transcripcionales apropiados son aquellos que se sabe que funcionan en plantas e incluyen el terminador CAMV 35S, el terminador tml , el terrainador nopalina sintasa y el terminador rbcs E9 de las arvejas. Estos pueden usarse, tanto en monocotiledones como en dicotiledones. Además, puede usarse un terminador de transcripción natural del gen.

En general el cásete de expresión comprenderá un gen marcador seleccionable para la selección de células transformadas. Los genes marcadores seleccionables son utilizados para la selección de células o tejidos transformados .

Se han hallado numerosas secuencias para realzar la expresión génica desde dentro de la unidad transcripcional y estas secuencias pueden usarse conjuntamente con los genes de esta invención para aumentar su expresión en plantas transgénicas .

Diversas secuencias de intrones han demostrado que realzan la expresión, particularmente en células monocotiledóneas . Por ejemplo, los intrones del gen Adhl del maíz han demostrado que realzan significativamente la expresión del gen de tipo salvaje bajo su promotor cognado, cuando se introducen dentro de células de maíz. Se halló que el intron 1 era particularmente eficaz y de expresión realzada en construcciones de fusión con el gen cloramfenicol acetiltransferasa (Callis et al., Genes Develop. 1: 1183-1200 (1987)) . En el mismo sistema experimental, el intron del gen bronze 1 del maíz tuvo un efecto similar en el realce de expresión. Las secuencias intrónicas han sido incorporadas rutinariamente en vectores de transformación de plantas, típicamente dentro de la líder no traducida.

Es conocido que un número de secuencias líder no traducidas derivadas de virus, realzan la expresión, y que éstas, son particularmente eficaces en células dicotiledóneas. Específicamente las secuencias líder del Virus Mosaico del Tabaco (TMV, la " -secuencia" ) , Virus Clorótico Moteado del Maíz (MCMV) , y Virus Mosaico de la Alfalfa (AMV) han demostrado ser eficaces para aumentar la expresión (por ejemplo Gallie et al. Nucí. Acids Res. 15: 8693-8711 (1987).;. Skuzeski- et , al . Plant Molec. Biol . 15: 65-79 (1990)). Otras secuencias líder conocidas en la materia incluyen, pero no están limitadas a: líderes picomavirus, por ejemplo, líder EMCV (región no codificadora 5' de Encefalomiocarditis) (Elroy-Stein, 0., Fuerst, T. R. , y Moss, B. PNAS USA 86:6126-6130 (1989)); líderes potivirus, por ejemplo, líder TEV (Virus Grabado del Tabaco) (Allison et al., 1986); líder MDMV (Virus Mosaico Enano dle Maíz); Virology 154:9-20); líder de proteína de unión de cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP) , (Macejak, D. G., y Samow, P., Nature 353: 90-94 (1991); líder no traducida del ARNm de proteína de recubrimiento del virus mosaico de la alfalfa (AMV RNA 4), (Jobling, S. A., y Gehrke, L., Nature 325:622-625 (1987); líder del virus mosaico del tabaco (TMV), (Gallie, D. R. et al., Molecular Biology of RNA, páginas 237-256 (1989) ; y líder de Virus del Moteado Clorótico del maíz (MCMV) (Lommel, S. A. et al., Virology 81:382-385 (1991). Ver también, Della-Cioppa et al., Plant Physiology 84:965-968 (1987) .

Se sabe que existen diversos mecanismos para direccionar productos génicos en plantas y las secuencias que controlan el funcionamiento de estos mecanismos han sido caracterizadas con cierto detalle. Por ejemplo, el direccionamiento de productos génicos al cloroplasto, es controlado por una secuencia de señal que se halla en el extremo terminal amino de diversas proteínas, el cual es disociado durante la importación del cloroplasto, para proporcionar la proteína madura (por ejemplo Comai et al. J. Biol . Chem. 263: 15104-15109 (1988)). Estas secuencias de señal pueden estar fusionadas con productos génicos heterólogos para efectuar la importación de productos heterólogos dentro del cloroplasto (van den Broeck, et al. Nature 313: 358-363 (1985)). La codificación de ADN para secuencias de señal apropiadas, puede aislarse a partir el extremo 5' de los cADNs que codifican la proteína RUBISCO, la proteína CAB, la enzima sintasa EPSP, la proteína GS2 y muchas otras proteínas que se sabe que están localizadas en el cloroplasto. Ver también, la sección titulada "Expression With Chloroplast Targeting" en el Ejemplo 37 de la patente estadounidense No. 5,639,949.

Los mecanismos descritos anteriormente para el direccionamiento celular pueden utilizarse no solamente conjuntamente con sus promotores cognados, sino también conjuntamente con promotores heterólogos, de manera de efectuar una acción direccionada a una célula específica bajo regulación transcripcional de un promotor que tiene un patrón de expresión diferente del promotor del cual deriva la señal de direccionamiento .

Para asegurar la localización en los plástidos, es concebible usar uno de los siguientes péptidos de tránsito: de la Ferredoxina plastídica: NADP+ oxidoreductasa (FNR) de espinaca que está contenida en Jansen et al. (Current Genetics 13 (1988) , 517-522) . En particular, puede usarse la secuencia comprendida entre los nucleót idos-171 a 165 de la secuencia de ADNc que se describe allí, que comprende la región 5' no traducida, así como también la secuencia que codifica el péptido de tránsito. Otro ejemplo es el péptido de tránsito de la proteína cerosa del maíz, incluyendo los primeros 34 residuos aminoácidos de la proteína cerosa madura (Klosgen et al., Mol. Gen. Genet . 217 (1989), 155-161). También es posible usar este péptido de tránsito sin los primeros 34 aminoácidos de la proteína madura. Además, pueden usarse los péptidos de señal de la subunidad pequeña ribulosa bisfosfato carboxilasa (Wolter et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850 ; Nawrath et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 (1994), 12760-12764), de la malato deshidrogenasa NADP (Gallardo et al., Planta 197 (1995), 324-332), de la glutationa reductasa (Creissen et al., Plant J. 8 (1995) , 167-175) o de la proteína Rl Lorberth et al. (Nature Biotechnology 16, (1998), 473-477) .

Transformación de Plantas Una vez que la secuencia de ácido nucleico inhibidora de la enzima de degradación ha sido clonada en un sistema de expresión, la misma es transformada a una célula de planta. El receptor y casetes de expresión objetivo de la presente invención, pueden ser introducidos dentro de la célula de planta en una variedad de formas reconocidas en la materia. El término "introducir" en el contexto de un polinucleótido, por ejemplo, un constructo nucleotídico de interés, significa presentar el polinucleótido en la planta, de manera que el polinucleótido obtenga acceso al interior de una célula de la planta. Cuando debe introducirse más de un polinucleótido, estos polinucleótidos pueden ensamblarse, como parte de un único constructo nucleotídico, o como construcciones nucleotídicas separadas, y puede localizarse en los mismos o en diferentes vectores de transformación. Por consiguiente, estos polinucleótidos pueden ser introducidos en la célula huésped de interés en un evento de transformación único, en eventos de transformación separados, o, por ejemplo, en plantas, como parte de un protocolo de reproducción. Los métodos de la invención no dependen de un método particular de introducción de uno o más polinucleótidos dentro de una planta, sino solamente que el polinucleótido (s) gane acceso al interior de por lo menos una célula de la planta. Los métodos para introducir polinucleótidos en plantas son conocidos en la materia, incluyendo, pero sin limitarlo a, métodos de transformación transitoria, métodos de transformación estable, y métodos intermediados por virus.

"Transformación transitoria" en el contexto de un polinucleótido, significa que un polinucleótido es introducido dentro de la planta y no se integra dentro del genoma de la planta Mediante "introducir establemente" o "introducido establemente" en el contexto de un polinucleótido introducido dentro de una planta significa que el polinucleótido introducido es incorporado establemente dentro del genoma de la planta, y que por lo tanto la planta está transformada establemente con el polinucleótido.

"Transformación estable" o "transformada establemente" significa que un polinucleótido, por ejemplo, un constructo nucleotídico descrita aquí, introducida en una planta se integra al genoma de la planta y es capaz de ser heredado por la progenie de la misma, más particularmente, por la progenie de generaciones sucesivas múltiples.

Numerosos vectores de transformación disponibles para transformación de plantas son conocidos por los expertos en la técnica de transformación de plantas y los genes pertinentes para esta invención pueden usarse conjuntamente con cualquiera de los vectores. La selección del vector dependerá de la técnica de transformación preferida y de la especie destinada a la transformación. Para ciertas especies objetivo, pueden preferirse diferentes marcadores de selección de antibióticos o herbicidas. Los marcadores de selección usados rutinariamente en la transformación incluyen el gen nptll, que confiere resistencia a la kanamicina y antibióticos relacionados (Messing & Vierra. Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304:184-187 (1983)), el gen bar, que confiere resistencia al herbicida fosfinotricina (White et al., Nucí. Acids Res 18: 1062 (1990), Spencer et al. Theor. Ap l . Genet 79: 625-631 (1990)), el gen hph, que confiere resistencia al antibiótico higromicina (Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4: 2929-2931), y el gen dhfr, que confiere resistencia a metatrexato (Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983)), el gen EPSPS, que confiere resistencia al glifosato (Patentes Estadounidenses Nos. 4,940,935 y 5,188,642), y el gen manosa-6-fosfato isomerasa, que provee la capacidad de metabolizar mañosa (Pat. estadounidenses Nos. 5,767,378 y 5,994,629).

Los métodos para regeneración de plantas son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, los vectores plásmidos Ti han sido utilizados para liberar ADN extraño, así como también para absorción directa de ADN, liposomas, electroporación, microinyección, y raicroproyectiles . Además, pueden utilizarse bacterias del género Agrobacterium para transformar células de plantas. A continuación hay descripciones de técnicas representativas para transformar plantas, tanto dicotiledóneas como monocotiledóneas , así- como también una técnica representativa de transformación de plás idos .

Se encuentran disponibles muchos vectores para transformación, en los que se usa Agrobacterium tumefaciens . Esto son típicamente portadores de por lo menos una secuencia T-ADN límite e incluyen vectores tales como pBIN19 (Bevan, Nucí. Acids Res. (1984)). Para la construcción de vectores útiles en la transformación de Agrobacterium, ver, por ejemplo, la Publicación de la Solicitud de Patente estadounidense No. 2006/0260011, incorporada aquí como referencia .

La transformación sin el uso de Agrobacterium tumefaciens, circunviene el requisito de secuencias de T-ADN en el vector de transformación elegido y por consiguiente, pueden utilizarse vectores que carecen de estas secuencias, además de aquellos descritos anteriormente, que contienen secuencias de T-ADN. Técnicas de transformación que no se basan en Agrobacterium, incluyen transformación a través de bombardeo de partículas, captación de protoplastos (por ejemplo PEG y electroporación) y microinyección. La elección del vector depende en gran medida de la selección preferida de las especies a transformar. Para la construcción de los vectores, ver, por ejemplo, la Solicitud estadounidense No. 20060260011, incorporada aqui como referencia.

Las técnicas de transformación para dicotiledones-son bien conocidas en la materia e incluyen técnicas basadas en Agrobacterium y técnicas que no requieren Agrobacterium . Las técnicas que no requieren Agrobacterium involucran la absorción de material genético exógeno directamente mediante protoplastos o células. Esto puede lograrse mediante PEG o absorción intermediada por electroporación, liberación por medio de bombardeo de partículas, o microinyección . Ejemplos de estas técnicas han sido descritas por Paszkowski et al., EMBO J. 3: 2717-2722 (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199: 169-177 (1985), Reich et al., Biotechnology 4: 1001-1004 (1986), y Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987). En cada caso, las células transformadas son regeneradas a plantas enteras usando técnicas convencionales conocidas en la materia.

La transformación intermediada por Agrobacterium es una técnica preferida para la transformación de dicotiledones, debido a su alta eficiencia de transformación y a su amplia utilidad con muchas especies diferentes. La transformación de Agrobacterium involucra típicamente la transferencia del vector binario portador de ADN extraño de interés (por ejemplo pCIB200 o pCIB2001) a una cepa de Agrobacterium apropiada que puede depender del complemento de genes vir transportados por la cepa huésped Agrobacterium, ya sea en un plásmido TI co-residente o bien cromosómicamente (por ejemplo la cepa CIB542 para pCIB200 y pCIB2001 (Uknes et al. Plant Cell 5: 159-169 (1993)). La transferencia del vector binario recombinante a Agrobacterium se logra mediante un procedimiento triparental de apareamiento, usando E. coli portador del vector binario recombinante, una cepa auxiliar de E . coli que es portadora de un plásmido tal como pRK2013 y que es capaz de movilizar el vector binario recombinante a la cepa Agrobacterium objetivo. Alternativamente, el vector binario recombinante puede ser transferido a Agrobacterium por transformación de ADN (Hofgen & illmitzer, Nucí. Acids Res . 16 : 9877 (1988) ) .

La transformación de las especies de plantas que constituyen el objetivo, por medio de Agrobacterium recombinante involucra usualmente co-cultivo de Agrobacterium con explantos de la planta y sigue protocolos bien conocidos en la materia. El tejido transformado es regenerado en un medio seleccionable portador del marcador de resistencia al antibiótico o herbicida presente entre los límites del plásmido binario T-ADN. El sistema de transformación In Planta intermediado por Agrobacterium es usado también en forma rutinaria para Arabidopsis (Bechtold et . al. CR Acad.

Sci III. Sci Vie 316:1194-1199 (1993) y puede usarse para Brassica napus (Wang W. C. et . al. Plant Cell Report 22:274-281 (2003) .

Otro método para la transformación de células de plantas con un gen, involucra partículas propulsoras inertes o biológicamente activas en tejidos y células de plantas. Esta técnica se describe en las Pat estadounidenses Nos . 4,945,050, 5,036,006, y 5,100,792, todas de Sanford et al. Generalmente, este procedimiento involucra propulsar partículas inertes o biológicamente activas en las células, bajo condiciones eficaces para penetrar la superficie externa de la célula y proporcionar la incorporación dentro del interior de la misma. Cuando se utilizan partículas inertes, el vector puede ser introducido dentro de la célula mediante recubrimiento de las partículas con el vector que contiene el gen deseado. Alternativamente, la célula objetivo, puede estar rodeada por el vector, de manera que el vector es transportado dentro de la célula mediante el despertar de la partícula. Las partículas biológicamente activas (por ejemplo, células de levadura desecadas, bacteria desecada o un bacteriófago, cada una conteniendo ADN que se busca introducir), pueden ser también propulsadas dentro del tejido de células de plantas.

La transformación de la mayoría de especies de monocotiledones se ha convertido ahora en rutinaria. Las técnicas preferidas incluyen transferencia directa del gen dentro de protoplastos , usando PEG o bien técnicas de electroporación, y bombardeo de partículas dentro del tejido de callos. Las transformaciones pueden ser llevadas a cabo con una especie de ADN única o múltiples especies de ADN (es decir, co-transformación) y ambas técnicas son apropiadas para uso en esta invención. La co-transformación puede tener la ventaja de evitar una construcción completa del vector y de generar plantas transgénicas con lugares no ligados para el gen de interés y el marcador seleccionable , lo cual permite la remoción del marcador seleccionable en generaciones subsiguientes, si eso se considerase deseable. Sin embargo, una desventaja del uso de co-transformación es la frecuencia inferior al 100% con la cual están integradas especies separadas de ADN en el genoma (Schocher et al. Biotechnology 4: 1093-1096 (1986)).

Las Solicitudes de patente EP 0 292 435, EP 0 392 225, y WO 93/07278 describen técnicas para la preparación de callos y protoplastos a partir de una línea de maíz endogámica de élite, transformación de protoplastos usando PEG o electroporación, y la regeneración de plantas de maíz a partir de protoplastos transformados. Gordon-Kamm et al. (Plant Cell 2: 603-618 (1990)) y Fromm et al. (Biotechnology 8: 833-839 (1990)) tienen técnicas publicadas para la transformación de la línea de maíz derivada de A188, usando bombardeo de partículas. Además, O 93/07278 y Koziel et al. (Biotechnology 11: 194-200 (1993)) describen técnicas para la transformación de líneas de maíz endogámicas de élite por bombardeo de partículas. Esta técnica utiliza embriones de maíz inmaduros de 1.5-2.5 mm de longitud, extirpados de una mazorca de maíz 14-15 días después de polinización y un dispositivo PDS-1000He Biolistics para bombardeo.

La transformación de arroz puede ser también llevada a cabo mediante técnicas de transferencia génica directa utilizando protoplastos o bombardeo de partículas. La transformación intermediada por protoplastos ha sido descrita por tipos de Japónica y tipos de Indica (Zhang et al. Plant Cell Rep 7: 379-384 (1988); Shimamoto et al. Nature 338: 274-277 (1989); Datta et al. Biotechnology 8: 736-740 (1990)). Ambos tipos son también rutinariamente transformables usando bombardeo de partículas (Christou et al. Biotechnology 9: 957-962 (1991)). Además, la WO 93/21335 describe técnicas para la transformación de arroz a través de electroporación .

La Solicitud de Patente EP 0 332 581 describe técnicas para la generación, transformación y regeneración de protoplastos Pooideae . Estas técnicas permiten la transformación de Dactylis y trigo. Además, la transformación de trigo ha sido descrita por Vasil et al. (Biotechnology 10: 667-674 (1992)) usando bombardeo de partículas en células de callo regenerable a largo plazo tipo C, y también por Vasil et al. (Biotechnology I 11: 1553- 1558 (1993)) y Weeks et al. (Plant Physiol. 102: 1077- 1084 (1993)) utilizando bombardeo de partículas de embriones inmaduros y callos derivados de embriones inmaduros . Una técnica preferida para transformación de trigo, sin embargo, involucra la transformación de trigo mediante bombardeo de partículas de embriones inmaduros e incluye una etapa de alto contenido de sacarosa o bien una etapa de alto contenido de maltosa con anterioridad a la liberación génica. Antes del bombardeo, cualquier cantidad de embriones (0,75-1 mm de longitud) son depositados sobre un medio S con 3% de sacarosa (Murashiga & Skoog, Physiologia Plantarum 15: 473-497 (1962)) y 3 mg/1 de 2,4-D para inducción de embriones somáticos, lo cual se deja proseguir en la oscuridad. En el día elegido para el bombardeo, los embriones son removidos del medio de inducción y se colocan en el osmoticum (es decir, medio de inducción con sacarosa o maltosa agregado en la concentración deseada, típicamente de 15%) . Los embriones se dejan plasmolizar durante 2-3 horas y luego son bombardeados. Lo típico son veinte embriones por placa objetivo, aunque no es crítico. Un plásmido portador de genes apropiado (tal como pCIB3064 o pSOG35) es precipitado sobre partículas de oro de tamaño micrónico usando procedimientos convencionales. Cada placa de embriones es bombardeada con el dispositivo de helio DuPont BIOLISTICS®, usando una presión de explosión de aproximadamente 1000 psi, empleando un tamiz de malla 80 standard. Después del bombardeo, los embriones se colocan nuevamente en la oscuridad para recuperarlos durante aproximadamente 24 horas (todavía en el osmoticum) . Después de 24 hrs , los embriones son removidos del osmoticum y se colocan nuevamente sobre el medio de inducción donde permanecen durante aproximadamente un mes antes de la regeneración. Aproximadamente un mes después, los explantos de embriones con callos embriogénicos en desarrollo, son transferidos a un medio de regeneración (MS+1 mg/litro NAA, 5 mg/litro GA) , que contiene además el agente de selección apropiado (10 mg/1 de basta en el caso de pCIB3064 y 2 mg/1 de metotrexato en el caso de pSOG35) . Después de aproximadamente un mes, los brotes desarrollados son transferidos a contenedores estériles más grandes conocidos como "GA7s" que contienen MS de resistencia media, 2% de sacarosa, y la misma concentración de agente de selección.

La transformación de monocotiledones usando Agrobacterium¦ ha sido también descrita. Ver, WO 94/00977 y patente estadounidense No. 5,591,616, (ambas incorporadas aquí como referencia) . Ver también, Negrotto et al., Plant Cell Reports 19: 798-803 (2000), incorporada aquí como referencia .

Por ejemplo, puede usarse arroz (Oryza sativa) para generar plantas transgénicas . Pueden usarse diversos cultivares de arroz (Hiei et al., 1994, Plant Journal 6:271-282; Dong et al., 1996, Molecular Breeding 2:267-276; Hiei et al., 1997, Plant Molecular Biology, 35:205-218). Asimismo, puede variar la cantidad de, o bien pueden sustituirse, los diversos constituyentes del medio descritos a continuación. Se inician respuestas embriogénicas y/o se establecen cultivos a partir de embriones maduros, cultivando en un medio MS-CIM (MS sales básales, 4.3 g/litro; vitaminas B5 (200X) , 5 ml/litro; Sacarosa, 30 g/litro; prolina, 500 mg/ litro; glutamina, 500 mg/ litro; hidrolizado de caseína, 300 mg/ litro; 2,4-D (1 mg/ml) , 2 mi/ litro; ajuste de pH a 5.8 con KOH 1 N; Phytagel, 3 g/litro) . Embriones maduros en las etapas iniciales de respuesta del cultivo, o bien líneas de cultivo establecidas, son inoculados y co-cultivados con la cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Agrobacterium) que contiene la construcción de vector deseada. El Agrobacterium es cultivado a partir de cargas de glicerol sobre un medio YPC sólido (100 mg/L de espectinomicina y cualquier otro antibiótico apropiado) durante aproximadamente dos días, a 28°C. El Agrobacterium es re-suspendido en un medio de MS-CIM líquido. El cultivo de Agrobacterium es diluido jasta una DO600 de 0.2-0.3 y se agrega acetosiringona hasta una concentración final de 200 uM. Se agrega acetosiringona antes de mezclar la solución con los cultivos de arroz para inducir Agrobacterium para transferencia de ADN a células de plantas.

Para inoculación, los cultivos de plantas son sumergidos en la suspensión bacteriana. La suspensión bacteriana líquida es removida y los cultivos inoculados son colocados en un medio de co-cultivo y son incubados a 22 °C. durante dos días. Los cultivos son luego transferidos a un medio MS-CIM con Ticarcilina (400 mg/litro) para inhibir el crecimiento de Agrobacterium. Para construcciones que utilizan el gen marcador seleccionable P I (Reed et al., (2002) In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 37:127-132), los cultivos son transferidos a un medio de selección que contiene Mañosa como fuente de carbohidrato (MS con 2% de Mañosa, 300 mg/litro de Ticarcilina) después de 7 días, y se cultivan durante 3-4 semanas en la oscuridad. Las colonias resistentes son luego transferidas a un medio de inducción de regeneración (MS sin 2,4-D, 0.5 mg/litro de IAA, 1 mg/litro de zeatina, 200 mg/litro de timentina 2% de Mañosa y 3% de Sorbitol) y se cultivan en la oscuridad durante 14 días. Las colonias proliferantes son luego transferidas a otra ronda de medio de inducción de regeneración y se pasan al recinto de desarrollo con luz . Los brotes regenerados son transferidos a contenedores GA7 con un medio GA7-1 (MS sin hormonas y 2% de Sorbitol) durante 2—semanas y luego se pasan a un invernadero cuando son suficientemente grandes y tienen las raíces apropiadas. Las plantas son transplantadas al suelo en el invernadero (Para generación) cultivadas hasta maduración y se cosecha la semilla, T1.

Las plantas obtenidas por transformación con una secuencia de ácido nucleico de la presente invención, pueden ser cualquiera de una amplia variedad de especies de plantas; sin embargo, las plantas usadas en el método de la invención están seleccionadas preferiblemente de la lista de cultivos objetivo importantes agronómicamente, que se ha establecido supra. La expresión de un gen de la presente invención, en combinación con otras características importantes para la producción y calidad, puede incorporarse en las líneas de plantas a través de mejora genética. Los métodos y técnicas de mejora genética son conocidos en la materia. Ver, por ejemplo, elsh J. R. , Fundamentáis of Plant Genetics and Breeding, John Wiley & Sons, NY (1981); Crop Breeding, Wood D. R. (Ed.) American Society of Agronomy Madison, Wis. (1983); Mayo 0., The Theory of Plant Breeding, Segunda Edición, Clarendon Press, Oxford (1987); Singh, D. P., Breeding for Resistance to Diseases and Insect Pests, Springer-Verlag, NY (1986) ; ? Wricke and Weber, Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding, Walter de Gruyter y Co. , Berlín (1986) .

Para la transformación de plástidos, se dejan germinar semillas de Nicotiana tabacum c.v. "Xanthienc" a razón de siete por placa en una disposición circular de 1' 1 en un medio de T agar y se bombardean durante 12-14 días después de la siembra con partículas de tungsteno de 1 um (MIO, Biorad, Hercules, Calif.) recubiertas con ADN de plásmidos pPH143 y pPH145 esencialmente tal como se ha descrito (Svab, Z. y Maliga, P. (1993) PNAS 90, 913-917) . Las plántulas bombardeadas son incubadas en un medio T durante dos días después de lo cual se cortan hojas y se colocan abaxialmente hacia arriba en luz brillante (350-500 umol fotones/m2/s) en placas de un medio RMOP (Svab, Z., Hajdukiewicz, P. y Maliga, P. (1990) PNAS 87, 8526-8530) que contienen 500 ug/ml de diclorhidrato de espectinomicina (Sigma, St . Louis, Mo.). Los brotes resistentes que aparecen por debajo de las hojas blanqueadas, tres a ocho semanas después del bombardeo, son subclonados sobre el mismo medio selectivo, se dejan formar callos, y los brotes secundarios se aislan y se subclonan. La segregación completa de copias de genomas plástidos transformados (homoplasmicidad) en subclones independientes, se verifica mediante técnicas convencionales de Southern Blot (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) . ADN celular total digerido con BamHl/ EcoRI (Mettler, I. J. (1987) Plant Mol Biol Repórter 5, 346349) se separa en 1% de Tris-borato de geles de agarosa (TBE) , se transfiere a membranas de nailon (Amersham) y se sondea con secuencias de ADN cebadas al azar sup .32P-rotuladas , que corresponden a 0.7 kb de fragmento de ADN BamHl/HindIII de pC8 que contiene una porción de la secuencia de direccionamiento al rps 7/l2plástido . Brotes homoplásmicos son enraizados asépticamente en un medio MS/IBA que contiene espectinomicina (McBride, K. E. et al. (1994) PNAS 91, 7301-7305) y son transferidos al invernadero.

Las propiedades genéticas manipuladas por ingeniería dentro de las semillas y plantas transgénicas descritas anteriormente, son transmitidas por reproducción sexual o crecimiento vegetativo y de esta manera pueden mantenerse y propagarse en plantas de progenie. Generalmente, en el mantenimiento y propagación se usan métodos conocidos en agricultura, desarrollados para adaptarlos a propósitos específicos tales como a labrar, sembrar o cosechar.

El uso de las propiedades genéticas ventajosas de las plantas y semillas transgénicas de acuerdo con la invención, puede efectuarse además en la mejora genética de plantas. Dependiendo de las propiedades deseadas, se toman medidas de mejora genética diferentes. Las técnicas relevantes son bien conocidas en la materia e incluyen, pero no están limitadas a hibridación, endogamia, haploide doble, mejora genética por cruce de un híbrido de primera generación con uno de sus padres, cría multi-linaj e , mezcla de variedades, hibridación interespecífica, técnicas aneuploides, etc. Por lo tanto las semillas y plantas transgénicas de acuerdo con la invención, pueden usarse para la mejora genética de líneas de plantas mejoradas que, por ejemplo, aumentan la eficacia de métodos convencionales, tales como tratamiento con herbicidas o pesticidas o permiten que uno prescinda de los métodos, debido a sus propiedades genéticas modificadas.

Conversión de biomasa Las plantas transformadas de acuerdo con la presente invención, proveen medios para incrementar el rendimiento de etanol, reducir el costo de pretratamiento, reducir los requisitos de pretratamiento con ácido/calor para la sacarificación de biomasa; y o reducir la producción de otras plantas y los costos de procesamiento, tal como permitiendo multi-aplicaciones y aislación de sub-productos comercialmente valiosos.

Recientemente se han desarrollado en la materia, métodos de recolección de mazorca. Por ejemplo, la mazorca entera más el grano son recolectados mediante una maquina combinada modificada. La máquina combinada puede ser modificada para ambas cosas: cosechar mazorca y además separar y almacenar la mazorca y la semilla en tolvas separados dentro de la máquina combinada. Otro método puede ser que la máquina combinada recoja mazorca entera más grano y separar luego el grano y la mazorca en las instalaciones de producción de etanol. Otra opción podría ser usar una máquina combinada convencional que descarga mazorca separada en la bancada que acompaña al camión. Puede separarse la mazorca entera del grano en la instalación para conversión de biomasa, donde la semilla de maíz en una actual es fraccionada dentro de sus componentes relativos (por ejemplo endosperma, fibra, germen) . Después, estos componentes de semilla de maíz pueden ser adicionalmente procesados para producir productos comerciales. Por ejemplo, el endosperma de semilla de maíz fraccionado puede ser utilizado en una fermentación de levadura comercial para producir etanol . La mazorca puede ser dirigida a una segunda actual, donde puede ser o no, pretratada y luego fermentada para producir un producto comercial favorable (por ejemplo etanol, butanol) . Otro método puede ser el de fermentar mazorca entera más grano, en una sola tanda. Una modalidad de la siguiente invención puede ser, usar una mazorca con incremento de almidón de cualquiera de los métodos mencionados anteriormente. Otra modalidad puede ser permitir la conversión de la mazorca entera más el grano, a un producto comercial (por ejemplo, etanol) a través de un proceso de una sola tanda, donde la mazorca entera con niveles incrementados de almidón y grano, es triturada y además sacarificada y fermentada en una conversión de biomasa. Otra modalidad puede ser procesar mazorca entera con niveles incrementados de almidón y grano para usarla como comida para animales . Otra modalidad puede ser cosechar las partes enteras de plantas que están por arriba del suelo, que contienen un nivel incrementado de . almidón, mazorca que contiene un nivel incrementado de almidón y semilla de maíz las cuales serán luego utilizadas en un método de conversión de biomasa. En una modalidad, puede ser deseable practicar la invención en una veriedad de maíz de mazorcas múltiples. En aún otra modalidad, la mazorca con contenido incrementado de almidón puede ser usada como un tejido para expresar grandes cantidades de enzima para la producción de enzimas comerciales. Por ejemplo, la expresión de una celulasa o amilasa podría ser expresada a niveles elevados en la mazorca que contiene cantidades elevadas de almidón seguida por procesamiento para extraer la enzima para distribución comercial a partir de la mazorca. Además, el amidón puede agregar valor adicional en una aplicación de conversión de biomasa .

Pretratamiento. Los métodos convencionales incluyen pretratamientos físicos, químicos y/ o biológicos. Por ejemplo, las técnicas de pretratamiento físico pueden incluir uno o más de diversos tipos de molienda, trituración, irradiación, vaporización/ explosión de vapor, e hidrotermólisis . Las técnicas de pretratamiento químico pueden incluir ácido, álcali, solvente orgánico, amoníaco, dióxido de azufre, dióxido de carbono e hidrotermólisis de pH controlado. Las técnicas de pretratamiento biológico pueden involucrar la aplicación de microorganismos solubilizadores de lignina. (T.-A. Hsu, "Handbook on Bioethanol . Production and Utilization" , C. E. yman (Ed.), 1996, Taylor & Francis: Washington, D.C., 179-212; P. Ghosh and A. Singh, A., Adv. Appl. Microbiol., 1993, 39: 295-333; J. D. McMillan, en "Enzymatic Conversión of Biomass for Fuels Production", M. Himmel et al., (Eds.), 1994, Capítulo 15, ACS Symposium Series 566, American Chemical Society: B. Hahn-Hagerdal , Enz . Microb. Tech., 1996, 18: 312-331; y L. Vallander y K. E. L. Eriksson, Adv. Biochem. Eng . /Biotechnol . , 1990, 42: 63-95). El propósito de la etapa de pretratamiento consiste en descomponer la estructura de lignina y carbohidrato para hacer que la fracción de celulosa sea accesible a las enzimas celulolíticas . Una modalidad de la solicitud puede ser la de acortar o evitar la etapa de pretratamiento de mazorca mediante el uso de mazorca con niveles de almidón incrementados. Otra modalidad puede ser la de expresar una enzima de procesamiento en mazorca o semilla que luego descompondría moléculas complejas en azúcares simples para ser usados en un método de conversión de biomasa. Otra modalidad, puede ser expresar una enzima de procesamiento de mazorca o semilla que pretrate moléculas complejas para una conversión más rápida en un azúcar fermentable para ser usado en un método de conversión de biomasa. Por ejemplo, uno puede manipular por ingeniería genética, una planta de maíz transgénica en la cual la mazorca de la planta de maíz transgénica tiene un nivel incrementado de almidón, mediante regulación por disminución de una enzima de degradación de almidón, donde la planta transgénica es además manipulada para expresar una enzima procesadora (por ejemplo, alfa-amilasa, celulasa) en la mazorca o semilla de maíz, donde o bien la mazorca entera más la semilla, o la semilla separada de la mazorca, son fermentadas esencialmente tal como se describió anteriormente. La enzima procesadora puede ser activada mediante molienda y condiciones de procesamiento. Otra modalidad puede ser la de manipular por ingeniería genética mazorca baja en lignina, tal como se describió en U.S. 2006/0260011 incorporada aquí como referencia, para que tenga un nivel incrementado de almidón. Mazorca de bajo contenido de lignina con cantidades elevadas de almidón puede ser útil en ensilaje, métodos conversión de biomasa y en comida para animales.

Sacarificación. En la sacarificación (o hidrólisis enzimática) , la lignocelulosa es convertida a azúcares fermentables mediante las enzimas lignocelulolíticas presentes en el material pretratado o exógenamente agregado. La sacarificación se lleva a cabo generalmente en reactores de tanque agitado o en termentadores bajo condiciones de pH, temperatura y mezcla controladas. Una etapa de sacarificación puede durar hasta 200 horas. La sacarificación puede llevarse a cabo a temperaturas de desde aproximadamente 30 grados C hasta aproximadamente 65 grados C, en particular de alrededor de 50 grados C, y a un pH en el rango de entre aproximadamente 4 y aproximadamente 5, en particular, alrededor de un pH de 4,5. La sacarificación puede llevarse a cabo en el material pretratado entero. Una modalidad de la solicitud puede ser además, manipular por ingeniería genética una mazorca con almidón incrmentado para expresar una o más enzimas procesadoras para acelerar la sacarificación o para hacer más eficiente el procedimiento. Otra modalidad puede ser la de un procedimiento en el que se usa mazorca entera con contenido de almidón incrementado, más grano intacto, para expresar una o más enzimas procesadoras en la semilla de maíz y efectuar la sacarificación de la mazorca entera más grano. La enzima de procesamiento puede ser activada mediante molienda y condiciones de procesamiento.

Fermentación. En la etapa de fermentación, los azúcares liberados de la lignocelulosa como resultado de las etapas de pretratamiento e hidrólisis enzimática, son fermentados a una o más sustancias orgánicas, por ejemplo etanol, mediante un microorganismo termentador, tal como levaduras y/ o bacterias. La fermentación puede llevarse también a cabo simultáneamente con hidrólisis enzimática en los mismos recipientes, nuevamente bajo condiciones de pH, temperatura y mezcla controladas. Cuando la sacarificación y fermentación se llevan a cabo simultáneamente en el mismo recipiente, el proceso es generalmente denominado sacarificación y fermentación simultáneas o SSF. SSF para azúcar C6, SSCF o sacarificación y cofermentación simultáneas para azúcar C5 y C6 , pueden combinarse.

Son conocidos en la materia, microorganismos de fermentación y métodos para su uso en etanol (Sheehan, "The road to Bioethanol : A strategic Perspective of the US Department of Energy' s National Ethanol Program" En: "Glucosyl Hydrolases For Biomass Conversión" , ACS Symposium Series 769, 2001, American Chemical Society: Washington, D.C.) . Métodos de producción de etanol existentes que utilizan granos de maíz como biomasa, involucran típicamente el uso de levadura, particularmente cepas de Saccharomyces cerevisiae. Las cepas pueden utilizarse en los métodos de la invención. Aunque las cepas pueden preferirse para la producción de etanol a partir de glucosa que deriva de la degradación de celulosa y/ o almidón, los métodos de la presente invención no dependen del uso de un microorganismo particular, o de una cepa del mismo, o de cualquier combinación particular de los microorganismos y las cepas.

Típicamente, se agregan levadura u otros microorganismos al hidrolizado, y la fermentación se deja proseguir durante 24-96 horas, tal como 35-60 horas. La temperatura de fermentación está típicamente comprendida entre 26-40 grados C, tal como 32 grados C, y a un pH de entre 3 y 6, tal como aproximadamente pH 4-5.

Puede usarse un estimulador de fermentación para mejorar adicionalmente el proceso de fermentación, en particular, el rendimiento del microorganismo de fermentación, tal como, el aumento de la velocidad y rendimiento de etanol . Los estimuladores de fermentación para crecimiento incluyen vitaminas y minerales. Ejemplos de vitaminas incluyen multivitamina , biotina, pantotenato, ácido nicotínico, meso-inositol , tiamina, piridoxina, ácido para-aminobenzoico, ácido fólico, riboflavina y vitaminas A,B,C,D, y E (Alfenore et al., "Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process", 2002, Springer-Verlag) . Ejemplos de minerales incluyen minerales y sales minerales que pueden proveer nutrientes que comprenden fosfato, potasio, manganeso, azufre, calcio, hierro, zinc, magnesio y cobre .

Recuperación. A continuación de la fermentación (o SSF) , la mezcla molida es destilada para extraer el etanol. Puede obtenerse etanol con una pureza superior a 96% en vol .

Hidrólisis de Almidón e Hidrólisis de Material Celulolítico Combinadas. Las plantas y partes de plantas transgénicas descritas aquí pueden usarse en métodos que involucran hidrólisis combinada de almidón y de material celulósico para aumentar el rendimiento de etanol. Además de proveer rendimiento de etanol mejorado, estos métodos pueden llevarse a cabo en instalaciones de procesamiento de etanol a base de almidón existentes.

El almidón es un polímero de glucosa que. es fácilmente hidrolizado a moléculas de glucosa individuales para la fermentación. La hidrólisis de almidón puede llevarse a cabo en presencia de un microorganismo amilolítico o enzimas tales como enzimas de amilasa. En ciertas modalidades de la invención, se lleva a cabo la hidrólisis de almidón en presencia de por lo menos una enzima de amilasa. Ejemplos de enzimas de amilasa apropiadas incluyen alfa-amilasa (que disocia aleatoriamente enlaces alfa (1-4) glicosídicos de amilosa, para proporcionar moléculas de dextrina, maltosa o glucosa) y glucoamilasa (que disocia los enlaces .alfa. (1-4) y .alfa. (1-6) glicosídicos de amilosa y amilopectina para proporcionar glucosa) .

En los métodos de la invención, la hidrólisis de almidón y la hidrólisis de material celulósico, pueden llevarse a cabo simultáneamente (es decir al mismo tiempo) bajo condiciones idénticas (por ejemplo, bajo condiciones usadas comúnmente para hidrólisis de almidón) . Alternativamente, las reacciones hidrolíticas pueden llevarse a cabo consecutivamente (por ejemplo la hidrólisis de lignocelulosa puede llevarse a cabo antes de la hidrólisis de almidón) . Cuando el almidón y el material celulósico son hidrolizados simultáneamente, preferiblemente, se seleccionan las condiciones para promover la degradación de almidón y para activar las enzima (s) lignocelulolíticas para la degradación de lignocelulosa . Los factores que se pueden variar para optimizar las condiciones incluyen procesamiento físico de las plantas o partes de plantas y las condiciones de reacción tales como pH, temperatura, viscosidad, tiempos de procesamiento y adición de enzimas de amilasa para hidrólisis de almidón.

Los métodos pueden usar plantas (o partes de plantas) transgénicas solas, o una mezcla de plantas (o partes de plantas) no transgénicas y plantas (o partes de plantas) transformadas, de acuerdo con la presente invención. Plantas apropiadas incluyen cualquier planta que pueda emplearse en la producción de etanol a base de almidón (por ejemplo, maíz) . Por ejemplo, los métodos de la presente invención pueden usarse para incrementar el rendimiento de etanol de mazorca de maíz.

Las plantas de la invención se usan en métodos de conversión de biomasa para producir azúcares o biocombustibles a partir de biomasa de plantas. Aquí, el término "biocombustibles" se refiere a cualquier combustible derivado de partes de plantas cosechadas. Los biocombustibles comprenden, pero no están limitados a, biodiesel, aceites vegetales, bioalcoholes (es decir etanol, metanol, propanol, butanol, etc) y biogases (es decir metano) . Las plantas de la invención son manipuladas por ingeniería genética, para acumular concentraciones más elevadas de almidón en sus tejidos de mazorca, proporcionando de este modo una fuente rica en carbohidratos, los cuales son luego convertidos a biocombustibles . Aquí, el término "azúcares libres" define cualquier carbohidrato derivado de biomasa de plantas que pueda ser adicionalmente procesado para producir azúcares fermentables , productos químicos, biocombustibles, plásticos, aditivos para comida o cualquier otro producto comercialmente importante. Una modalidad de la presente solicitud, provee un método para mejorar el rendimiento de azúcares libres a partir de biomasa de mazorca de plantas, que comprende manipular una planta para regular por disminución la actividad de una o más enzimas de degradación de almidón en mazorca. La mazorca de planta resultante contendrá niveles incrementados de almidón que luego pueden convertirse a azúcares libres en un método convencional de conversión de biomasa. Aquí, el término "método de conversión de biomasa" define cualquier procedimiento que convierte partes de plantas en azúcares fermentables , biocombustibles, productos químicos, plásticos, aditivos para comida o cualquier otro producto comercialmente importante. Los métodos de conversión de biomasa pueden contener también una subcategoría denominada aquí "método de conversión de biomasa que no es para comida de animales" . Método de conversión de biomasa que no es para comida de animales, define cualquier procedimiento que convierte partes de plantas en azúcares fermentables , biocombustibles , productos químicos y plásticos no destinados al consumo animal .

Las composiciones y métodos de la invención son útiles en la producción de dextrosa para jarabes de fructosa, azúcares especiales, y en alcohol y otros productos finales (por ejemplo ácido orgánico, ácido ascórbico, y aminoácidos), producción de fermentación de almidón (G. M. A van Beynum et al., Eds . (1985) Starch Conversión Technology, Marcel Dekker Inc. NY) . La producción de alcohol de la fermentación de almidón derivado de tejidos de mazorca de la plantas de la invención, puede incluir la producción de alcohol carburante o alcohol potable.

En ciertas modalidades preferidas, el alcohol será etanol . En particular, los procedimientos de producción de alcohol por fermentación están caracterizados como procedimientos de molienda en húmedo o molienda en seco. En algunas modalidades, las plantas son sometidas a un procedimiento de fermentación por molienda en húmedo y, en otras modalidades, se usa un procedimiento de molienda en seco. En ciertas modalidades, puede producirse etanol usando un método de hidrólisis de almidón crudo. Otra modalidad puede ser mazorca entera con aumento del contenido de almidón más grano, utilizado en una hidrólisis de almidón crudo. Otra modalidad puede ser la adición de una o más enzimas de procesamiento, en una hidrólisis de almidón crudo que contiene mazorca entera con contenido incrementado de almidón y grano. En otras modalidades mazorca triturada con incremento del contenido de almidón, que expresa una enzima de procesamiento de interés, puede ser triturada y vendida como aditivo, para comida para animales o para usarla en un método de conversión de biomasa.

La molienda de grano seco involucra una cantidad de etapas básicas, que generalmente incluyen: trituración, cocción, licuefacción, sacarificación, fermentación y separación de líquido y sólidos para producir alcohol y otros co-productos . Se tritura material de plantas y particularmente granos de cereal enteros, tales como maíz, sorgo, trigo o centeno. En algunos casos, el grano puede ser fraccionado primero en las partes componentes. El material de planta triturado, puede ser molido para obtener partículas gruesas o finas. El material vegetal triturado, se mezcla con líquido en un tanque para suspensión. La suspensión es sometida a altas temperaturas en un quemador a chorro junto con enzimas licuantes (por ejemplo alfa amilasas) a solubles y se hidroliza el almidón en el cereal, a dextrinas . La mezcla se enfría y se trata luego con enzimas sacarificantes para producir glucosa. La mezcla molida que contiene glucosa es luego fermentada durante aproximadamente 24 hasta 120 horas en presencia de microorganismos de fermentación, tales como microorganismos productores de etanol y particularmente levadura (Saccharomyces spp) . Los sólidos en la mezcla molida son separados de la fase líquida y se obtienen alcohol tal como etanol y co-productos útiles tales como granos de destilería. En una modalidad, la adición de mazorca con almidón incrementado, a una instalación de molido en seco, pudo aumentar la calidad de DDGS con respecto a comida para animales y nutrientes disponibles.

En algunas modalidades, la etapa de sacarificación y la etapa de fermentación se combinan y el procedimiento se denomina sacarificación y fermentación simultáneas o sacarificación, propagación de levadura y fermentación simultáneas .

En otras modalidades, la etapa de cocción o exposición del sustrato que contiene almidón de mazorca, a temperaturas por arriba de la temperatura de gelatinización del almidón en el sustrato, puede ser eliminada. Estos procesos de fermentación en algunas modalidades, incluyen molienda de grano de cereal o grano fraccionado y combinación del grano de cereal triturado con líquido para formar una suspensión, la cual se mezcla luego en un recipiente único, con amilasas, glucoamilasas y/u otras enzimas que tienen actividad hidrolizadora de almidón granulado y levadura para producir etanol y otros co-productos (Pat. estadounidense No. 4,514,496, WO 04/081193 y O 04/080923). En algunas modalidades, las enzimas útiles para procedimientos de fermentación incluyen alfa amilasas, proteasas, pululanasas, isoamilasas, celulasas, hemicelulasas , xilanasas, ciclodextrina glicotransferasas , lipasas, fitasas, laccasas, oxidasas, esterasas, cutinasas, enzima hidrolizadora de almidón granulado y otras glucoamilasas .

En otra modalidad, la invención está dirigida a una planta transformada cuyo genoma es aumentado con un polinucleótido recombinante que codifica por lo menos una enzima de procesamiento ligada operablemente a una secuencia promotora, donde la secuencia del polinucleótido es optimizada para expresión en la planta. Puede ser beneficioso crear una planta con almidón de mazorca incrementado, que ha sido adicionalmente modificada para expresar una enzima de procesamiento que, cuando es activada, será capaz de auto-procesamiento del sustrato sobre el cual actúa, para obtener el resultado deseado tal como se describe en US 20030135885 y US 7102057 incorporadas aquí como referencia. Aquí, una mazorca con almidón incrementado y adicionalmente modificada con una enzima procesadora se denomina "mazorca auto-procesada con contenido de almidón incrementado" . Se proveen métodos de producción de mazorca auto-procesadora con contenido de almidón incrementado, donde la planta o parte de planta expresa una enzima procesadora (por ejemplo alfa-amilasa, glucoamilasa, celulasas, CBHI, etc.) donde la enzima de procesamiento es direccionada lejos de su sustrato relativo y que luego de la activación (por ejemplo molienda, adición de agua, pH) de las enzima (s) procesadoras (mesofílica, termofílica o hipertermofílica) la planta o parte de planta es capaz de auto-procesar el sustrato luego de lo cual actúa para obtener el resultado deseado. En algunas modalidades, la enzima procesadora puede expresarse en otras partes de plantas (por ejemplo semilla o tejido verde) de la planta de maíz con almidón de mazorca incrementado. En otra modalidad puede ser deseable expresar una o más enzimas de procesamiento en una planta de cultivo y regular por disminución una enzima de degradación de almidón en una planta de maíz para producir una mazorca con contenido de almidón incrementado. Estas materias primas podrían mezclarse luego en un método de conversión de biomasa donde las enzimas de procesamiento estarán en contacto con su respectivo sustrato y se activaran mediante procesamiento, por ejemplo moliendo y mezclando las dos materias primas en una licuefacción única.

De acuerdo con la presente invención, una planta o parte de planta "auto-procesadora" ha incorporado a la misma un polinucleótido aislado, que codifica una enzima de procesamiento capaz de procesar, por ejemplo, modificar, almidones, polisacáridos , lípidos, proteínas y similares en plantas, donde la enzima procesadora puede ser mesofílica, termofílica o hipertermofílica, y puede ser activada por trituración, adición de agua, calentamiento u otra forma que provee condiciones favorables para la función de la enzima. El polinucleótido aislado que codifica la enzima de procesamiento está integrado en una planta o parte de planta para expresión en la misma. Mediante expresión y activación de la enzima de procesamiento, la planta o parte de planta de la presente invención procesa el sustrato después de lo cual actúa la enzima de procesamiento. Por lo tanto, la planta o partes de planta de la presente invención son capaces de auto-procesar el sustrato de la enzima mediante activación de la enzima de procesamiento contenida en la misma, en ausencia de, o con fuentes externas reducidas normalmente requeridas para procesar estos sustratos. De este modo, las plantas transformadas, células de plantas transformadas y partes de plantas transformadas, tienen capacidades de procesamiento "construidas" para procesar los sustratos deseados a través de enzimas incorporadas allí de acuerdo con esta invención. Preferiblemente, el polinucleótido codificador de enzima de procesamiento es "genéticamente estable" , es decir el polinucleótido es mantenido establemente en la planta o partes de planta transformadas de la presente invención y establemente heredado por la progenie a través de generaciones sucesivas .

De acuerdo con la presente invención, los métodos que emplean las plantas y partes de plantas pueden eliminar la necesidad de moler o descomponer de otra manera físicamente la integridad de partes de plantas antes de la recuperación de productos derivados de almidón. Por ejemplo la invención provee métodos mejorados para procesar mazorca para recuperar productos derivados de almidón. La invención provee también un método que permite la recuperación de gránulos de almidón que contienen niveles de enzimas degradadoras de almidón, en o sobre los gránulos, que son adecuados para la hidrólisis de enlaces específicos dentro del almidón sin los requisitos de agregar enzimas hidrolizadoras de almidón producidas exógenamente . La invención provee también productos mejorados de la planta o partes de planta auto procesadoras, obtenidas por los métodos de la invención.

Además, la parte de planta transformada "auto procesadora" por ejemplo, mazorca, y la planta transformada, evitan problemas mayores de la tecnología existente, es decir las enzimas procesadoras son típicamente producidas por fermentación de microbios, lo cual requiere aislar las enzimas de los sobrenadantes de cultivo, lo cual cuesta dinero; la enzima aislada necesita ser formulada para la aplicación particular, y deben desarrollarse procedimientos y maquinaria para agregar, mezclar y hacer reaccionar la enzima con su sustrato. La planta transformada de la invención o una parte de la misma, es también una fuente de la enzima de procesamiento misma, así como también sustratos y productos de esa enzima, tales como azúcares, aminoácidos, ácidos grasos y almidón y polisacáridos que no son de almidón. La planta de la invención puede emplearse además para preparar plantas de progenie tales como híbridos y endogámicos.

La planta puede ser una monocotiledónea tal como maíz. Preferiblemente, la planta es un cultivo energético o una planta cultivada comercialmente . Aquí, el término "enzima de procesamiento" se selecciona del grupo formado por a-amilasa, glucoamilasa , glucosa isomerasa, glucanasa, ß-amilasa, a-glucosidasa, isoamilasa, pululanasa, neo-pululanasa, iso-pululanasa , amilopululanasa, celulasa, exo-1,4- ß -celobiohidrolasa , exo—1 , 3- -D-glucanasa , ß-glucosidasa, endoglucanasa , L-arabinasa, a-arabinosidasa, galactanasa, galactosidasa, mananasa, manosidasa, xilanasa, xilosidasa, proteasa, glucanasa, esterasa, fitasa y lipasa. Preferiblemente, la enzima procesadora es una enzima procesadora de almidón seleccionada del grupo formado por OÍ-amilasa, glucoamilasa, glucosa isomerasa, ß-amilasa, OÍ-glucosidasa, isoamilasa, pululanasa, neo-pululanasa, iso-pululanasa y amilopululanasa. Más preferiblemente la enzima está seleccionada entre -amilasa, celulasa, glucoamilasa, glucosa isoraerasa, a-glucosidasa y pululanasa. La enzima procesadora es además, preferiblemente hipertermofílica . De acuerdo con este aspecto de la invención, la enzima puede ser una enzima no degradadora de almidón seleccionada del grupo formado por proteasa, glucanasa, xilanasa, esterasa, fitasa, y lipasa. Las enzimas pueden ser además hipertermofílicas . En una modalidad preferida, la enzima se acumula en la vacuola, retículo endoplásmico, apoplasto, vacuola de proteina de almacenamiento, mitocondrios , cloroplasto, gránulo de almidón, semilla o pared celular de una planta. Además en otra modalidad, el genoma de la planta puede ser aumentado además con un segundo polinucleótido recombinante que comprende una enzima no hipertermofílica . En otra modalidad, puede ser deseable aumentar el tamaño del gránulo de almidón en una mazorca con almidón incrementado, por medio de regulación por disminución de sintasa de almidón IV y/ o fosforilasa de almidón, usando métodos tales como aquellos referenciados en WO 2005/097999. En otra modalidad, puede ser deseable modificar el almidón de mazorca para producir perfiles de azúcar únicos.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la descripción son indicativas del nivel de pericia de los expertos en la materia a la cual pertenece la invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan aquí como referencia en el mismo grado que si cada publicación individual o solicitud de patente estuviera específicamente e individualmente indicada para ser incorporada como referencia.

Aunque la invención que precede, ha sido descrita detalladamente por medio de ilustración y ejemplos con propósitos de claridad de comprensión, será obvio que pueden llevarse a la práctica ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

EJEMPLOS La invención se describirá además mediante los ejemplos siguientes, los cuales de ninguna manera pretenden limitar el alcance de la invención.

Ej emplo 1 : Generación de Plantas de Maíz Transgénicas Se construyeron ocho casetes AR i para expresión de la planta. Estos casetes se designaron para regular por disminución las enzimas a-amilasa, ß-amilasa, glucano agua dicinasa (Rl) , dicinasa agua fosfoglucano (PWD) , y una a-amilasa cloroplástica (AMY3) en tejido de mazorca de maíz. Las secuencias de ADNc de Zea mays para -amilasa (Acceso Genbank L25805) , ß-amilasa (Acceso Genbank Z25871) y a-glucano agua dicinasa (Rl, Acceso Genbank CD973834) fueron obtenidas en NCBI . Se generó maíz ortólogo para dicinasa agua fosfoglucano cloroplast ídica de Arabidopsis thaliana (GenBank Acceso AJ635427) con base en la homología de secuencia contra la secuencia genómica de maíz. Del mismo modo, un maíz ortólogo para el Amy3 de Arabidopsis thaliana (GenBank Acceso NM105651) se generó con base en la homología de secuencia -contra la secuencia genómica de maíz. Fragmentos ARNi (495pb de a-amilasa, SEC ID NO: 1; 500pb de ß-amilasa, SEC ID NO: 2; 330pb de Rl , SEC ID NO: 3) de los extremos 3' de las regiones codificadoras de estos genes fueron sintetizados por Geneart (Geneart AG) . Durante la síntesis, se agregaron los sitios attBl y attB2 a los extremos 5' y 3' de estos tres fragmentos de secuencia codificante, respectivamente. Además se sintetizó un intrón a partir del gen de sintasa-1 de sacarosa de arroz (RSsl) , en la hebra correspondiente con relación a la secuencia de ARNi para actuar como el espaciador en el bucle de horquilla formado por el apareamiento de los fragmentos de ARNi correspondientes, de este modo proporcionando una región de unión para la enzima dicer. Los ocho casetes de expresión de ARNi se recombinaron en pDONR221 usando la reacción BP ¦ de Gateway® Cloning Technology (Invitrogen Life Science) .

El vector de destinación 15910 es un vector binario que contiene un gen de fosfomanosa isomerasa (PMI) que permite la selección de células transgénicas con mañosa. El vector 15910 provee también un método para preparar un cásete de ARNi usando Gateway® Cloning Technology (Invitrogen Life Science) . El vector 15910 contiene un intensificador transcripcional doble ( intensificador del virus del mosaico de la escrofularia (FMV) ) , así como también un intensificador del virus del mosaico de la coliflor 35s. El vector 15910 permite un medio para cambiar en varios promotores los cuales accionan la expresión de los casetes de AR i en tejido de mazorca de maíz. Los promotores usados en este estudio fueron el promotor MADS-box 13 de Oryza sativa (OsMADS 13) , el promotor de la subunidad alfa sintasa de triptofano de maíz (TrpA) , el promotor MADS-box 14 (OsMADS14) y el promotor de maíz Zm015970. El promotor MADS-box 13 de Oryza sativa (OsMADS 13) el cual es además descrito en la publicación Estadounidense 2007/0006344 y representado en la SEC ID NO: 6, ha sido mostrado por expresar preferiblemente genes en tejido de mazorca de maíz. El promotor de la subunidad alfa sintasa de triptofano de maíz (TrpA) como se describe en Plant Mol Biol (1995) 27:1183-1188 y como se representa en la SEC ID N0:7, se espera accione la expresión preferiblemente en la médula y hojas jóvenes de plantas de maíz. El promotor 0sMADS14 como se describe en la publicación Estadounidense 2007/0006344 y representa en la SEC ID N0:9, preferiblemente acciona la expresión de transgenes en tejido de mazorca de maíz. El promotor de maíz Zm015970 como se representa en la SEC ID NO: 8, se identificó por ser un fuerte promotor preferido de mazorca con base en los datos de microarreglos de maíz. La relación del nivel de expresión de un gen accionado por Zm015970 en mazorca de maíz comparado con tejido no de mazorca de maíz, fue aproximadamente 7.9. La secuencia promotora del Zm015970 está compuesta de 2009pb de la 5'UTR,- 510pb del primer exón del gen, 132pb del primer intrón, y 19pb del segundo exón del clon genómico de Zm015970.

Los casetes de ARNi Gateway Entry (SEC ID #s 10-17) creados por . Geneart fueron recombinados en el vector 15910 usando LR Reaction (Gateway® LR Clonase® Enzyme Mix, Invitrogen) , creando vectores binarios. Los vectores binarios fueron verificados por digestión por restricción y secuenciamiento .

La transformación de embriones de maíz inmaduros se lleva a cabo esencialmente tal como se describió en Negrotto et al, Plant Cell Reports 19:798-803 (2000). Diversos constituyentes del medio descritos allí pueden ser sustituidos .

La cepa Agrobacterium LBA4404 (Invitrogen) que contiene el plásmido de transformación vegetal es cultivada en YEP (extracto de levadura (5 g/L) , peptona (lOg/L) , NaCl (5g/L) , 15g/l agar, pH 6.8) medio sólido durante 2 a 4 días a 28 °C. Aproximadamente 0.8X 109 Agrobacterias están suspendidas en el medio LS-inf suplementado con 100 µ? de acetosiringona (As) (medio LSAs) (Negrotto et al., Plant Cell Rep 19:798-803 (2000)) . Las bacterias son pre-inducidas en este medio durante 30-60 minutos.

Los embriones inmaduros, de la línea de maíz, A188, u otros genotipos de maíz apropiados, son extirpados de espigas de 8 -12 días, en LS-inf líquido + 100 |iM As (LSAs) . Los embriones son sometidos a vórtice durante 5 segundos y se enjuagan una vez con un medio de infección fresco. El medio de infección es removido y luego se agrega solución de Agrobacterium y los embriones se someten a vórtice durante 30 segundos y se dejan sedimentar con las bacterias durante 5 minutos. Los embriones son luego transferidos con el órgano escutiforme hacia arriba a medio LSAs y se cultivan bajo oscuridad durante dos a tres días. Subsiguientemente, entre 20 y 25 embriones por placa petri son transferidos a un medio LSDc suplementado con cefotaxima (250 mg/1) y nitrato de plata (1.6 mg/1) (Negrotto et al., Plant Cell Rep 19:798-803 (2000)) y se cultivan en la oscuridad a 28°C durante 10 días.

Embriones inmaduros que producen callos embr iogénicos , son transferidos a un medio de LSD1M0.5S (LSDc con 0.5 mg/1 2,4-D en vez de Dicamba, 10g/l de mañosa, 5 g/1 de sacarosa y sin nitrato de plata) . Los cultivos se seleccionan en este medio durante 6 semanas con una etapa de subcultivo a las 3 semanas. Los callos sobrevivientes son transferidos a un medio LSD1M0.5S para que se hinchen o al medio Regí (tal como se ha descrito en Negrotto et al. , Plant Cell Rep 19:798-803 (2000) ) . A continuación del cultivo bajo luz (régimen de 16 horas de luz/ 8 horas de oscuridad), los tejidos verdes son luego transferidos a un medio Reg2 sin reguladores de crecimiento (tal como se describe en Negrotto et al., Plant Cell Rep 19:798-803 (2000)) y se incuban durante 1-2 semanas. Las plántulas son transferidas a cajas Magenta GA-7 (Magenta Corp, Chicago III.) que contienen un medio Reg3 (tal como se describió en Negrotto et al. (2000)) y se cultivan bajo luz. Las plantas que fueron positivas por PCR para PMI y iOsSHlil-01 (bucle) y negativas para Espectinomicina fueron transferidas al suelo y cultivadas en invernadero. Se cultivaron un total de 148 plantas T° hasta madurar (Tabla 2) . Se recogieron muestras de plantas de eventos seleccionados, para la tinción de Lugol, análisis de almidón y análisis de fermentación.

Tabla 1: Constructos para Expresión de Casetes de ARNi en Tejido de Mazorca de Maíz Tabla 2: Número de eventos T° llevados a cabo en el invernadero hasta madurez.

*Taqman® PCR número de copias, L-baja copia, M-copia me Ejemplo 2: Recolección de Muestra y Prerrastreo de Eventos de Maíz Transgénicos Se tomaron muestras de mazorca de plantas maduras de maíz T°, 10 días después de la polinización. Las mazorcas frescas entonces se congelaron a -80°C. Después, las semillas se removieron de la mazorca congelada usando un raspador de pintura. El congelamiento de las mazorcas permite mejor remoción de las semillas de maíz para análisis de las mazorcas. Después de la remoción de las semillas de la mazorca, cada mazorca entonces se rebajó a menos de 1/4 de pulgada (8 milímetros) de espesor. Dos de las rebanadas (una de la mitad y una del extremo) se usaron para teñido de yodo Lugol . Las plantas de control pueden generarse usando plantas T° transformadas con vectores binarios vacíos que no contienen casetes de ARNi según lo descrito en el Ejemplo 1.

El prerrastreo de la acumulación de almidón en eventos de maíz T° se llevó a cabo usando una solución de tinción Lugol . La solución de Lugol tiñe selectivamente el almidón azul oscuro a negro, y puede ser observado visualmente bajo un microscopio. El grado de tinción con relación a controles nulos, permitió una preselección visual rápida de eventos con aumento de almidón en tejidos de mazorca que deben ser llevados a un análisis de almidón y a estudios de fermentación adicionales.

El prerrastreo del evento de tejido de mazorca, se llevó a cabo colocando secciones de mazorca en un tubo cónico de centrifuga de 50 mi y agregando 5 mi de una solución de Yodo de Lugol al 5% a cada muestra, asegurándose que la muestra entera quedase cubierta. Luego las muestras se tiñeron durante tres horas a temperatura ambiente. La solución de Lugol fue luego removida y se lavaron las muestras con agua destilada, dejando reposar las muestras en agua, cambiando a menudo el agua hasta que no pudo observarse ninguna mancha más en el agua de lavado. Las secciones de mazorca se colocaron en una laminilla de microscopio y se dejaron secar previo a los eventos de registro. Una vez seca, las muestras de mazorca se visualizaron en una base blanca y se investigaron contra una muestra de control para determinar la cantidad de tinción del almidón. La investigación se llevó a cabo asignando un valor numérico a cada muestra (1-5, donde 1= baja acumulación de almidón, 5= elevada acumulación de almidón) en base a la intensidad de tinción que reflejó el contenido de almidón/acumulación; y se registró fotográficamente. Los resultados relativos de investigación con Lugol se señalan en las Tablas 3-5. Las investigaciones visuales se usaron para determinar cuáles eventos debían someterse a otro análisis de almidón y a experimentos de fermentación. Se halló sorprendentemente en el laboratorio que la acumulación de almidón en tejido de mazorca de plantas de maíz, tal como lo indicó la tinción de almidón, se incrementó significativamente en plantas de maíz donde la alfa-amilasa, beta-amilasa o Rl han sido reguladas por disminución en comparación con controles.

Tabla 3: Constructo 17303 de Tinción de Lugol almidón de mazorca (promotor OsMADS13 + AR i de alfa-amilasa) Tabla 4: Constructo 17304 Tinción de Lugol almidón de mazorca (promotor OsMADS13 + ARNi de beta-amilasa) Tabla 5: Constructo 17305 Tinción de Lugol de almidón de mazorca (promotor OsMADS13 + ARNi de glucano agua dicinasa (Rl) ) Tabla 6: Constructo 18278 de Tinción de Lugol dón de mazorca (promotor OsMADS13 + ARNi de P D) ID de Planta Puntuación de Teñido de Lugol Control 2 ZBF093523A048A 3 MZBF093523B049A 2 ZBF093523A045A 2 MZBF093523B004A 2 ZBF093523A051A 3 Tabla 7: Constructo 18222 Tinción de Lugol almidón de mazorca (promotor OsMADS13 + ARNi de AMY3) ID de Planta Puntuación de Teñido de Lugol ' Control 2 MZBF093606A040A 3 MZBF093606B045A 3 ZBF093606B008A 3 MZBF093606A054A 3 MZBF093606A005A 3 Tabla 8: Constructo 18286 Tinción de Lugol almidón de mazorca (promotor TrpA + ARNi Rl) ID de Planta Puntuación de Teñido de Lugol Control 2 MZBF093527A043B 4 MZBF093527A005A 4 MZBF093527A030A 4 MZBF093527A013A 5 ZBF093527C032A 5 Tabla 9: Cónstructo 18288 Tinción de Lugol dón de mazorca (promotor Zm015970 + AR i Rl) Ejemplo 3: Estimación de Almidón y Azúcar en Muestras de Tejido de Mazorca de Maíz Se usó el siguiente procedimiento de ensayo para estimar la cantidad de azúcar y almidón total en muestras de maíz en una base en peso seco. Este método emplea el Ensayo de Almidón Total de Megazyme (MEGAZYME, Wicklow, Irlanda) (AOAC Método 996.11 y AACC Método 76.13) el cual involucra completa digestión de la muestra de almidón a D-glucosa libre por una hidrólisis de alfa-amilasa y amiloglucosidasa, seguido por una reacción de glucosa oxidasa-peroxidasa y medición colorimétrica de D-glucosa libre liberada de la muestra. La cantidad de almidón en la muestra puede ser calculada a través de una conversión simple de la cantidad de medición de D-glucosa liberada. Los azúcares son extraídos con agua y la cantidad se analiza por HPAEC (Cromatografía de Intercambio de Anión de Alta Resolución) .

Preparación de Muestra de Mazorca Mazorcas frescas se congelaron a 80°C, fotografiaron, y las semillas se removieron usando un raspador de pintura. Cada mazorca fue entonces rebanada en rebanadas de menos de 1/4 de pulgada (8 milímetros) de espesor. Las rebanadas para cada mazorca se colocaron en un bote de peso y se secaron usando un liofilizado . Dos de las rebanadas (una de la mitad y una del extremo) se dejaron de lado para teñido con yodo de Lugol (como se representa en el Ejemplo 2) . Las rebanadas de mazorca restantes se trituraron usando un molino centrífugo. Para lograr la especificación de tamaño molido requerido para fermentación de etanol, la mazorca molida además se trituró por dos ciclos de vibración por 30 segundos usando una máquina Kleco (García Manufacturing, Visalia, CA, Modelo no. KLECO 8200) .

Preparación de Muestra Molida Seca Las muestras se secaron antes del análisis por liofilización por al menos 8 horas. Las muestras se molieron para pasar a través de un tamiz de 0.5 mm. Las muestras secas se cortaron en piezas manejables y trituraron en un Molino de Disco Perten® 3600 (ajuste 1; Perten Instruments AB; Huddinge, Suecia) . El procedimiento de trituración fue ligeramente variado dependiendo de la muestra para triturar muestras a una consistencia razonablemente fina previo al análisis.

Extracción de Azúcar con agua Las muestras de mazorca finamente en polvo se pesaron exactamente (100 - 130 mg) en tubos de 15 mL . Se prepararon experimentos duplicados con cada muestra. A cada tubo se agregó ddH20 a una concentración final de 10 mg de muestra de mazorca/1 mi de agua. Las muestras se incubaron por 1 hora a temperatura ambiente con rotación uniforme. Después, los tubos se centrifugaron por 15 min a 4,000 rpm. Después, se transfirieron 0.8 mi de sobrenadante transparente a un filtro giratorio mientras la pelotilla se mantuvo para análisis total de almidón. El sobrenadante filtrado se centrifugó a 5,000 rpm por 15 minutos y después se almacenó a -20°C hasta el análisis de azúcar por HPAEC.

Análisis de Azúcar por HPAEC Las muestras filtradas almacenadas a -20°C se descongeló y diluyó 20 veces (10 pL de muestra + 190 pL de ddH20) en 200 ]xL de viales o placa de HPLC. Se usó la mezcla de azúcar estándar [Glucosa + Fructuosa + Sacarosa] a diferentes concentraciones [0(H20) , 0.01, 0.02, 0.04, 0.10 mg/mL] como estándares para componentes de azúcar esperados . Se corrió la HPAEC con el siguiente programa: Columna: Carbohidrato Carbopac PA200 Velocidad de flujo: 0.4 ml/mL Volumen de muestra inyectado: 10 µL Reactivo: A: Agua; B: 1M NaOH; C: 1M NaAc Gradiente : 0 min: 100 mM NaOH 30 min: 100 mM NaOH + 80 mM NaAc 32.5 min: 100 mM NaOH + 900 mM NaAc 35 min: 100 mM NaOH 45 min: 100 mM NaOH El % de cada azúcar y la suma de los tres azúcares en las muestras secas se calculó por comparación de los picos integrados con. aquellos de los estándares.

Remoción de Azúcares Solubles de la Pelotilla por Análisis de Almidón A cada pelotilla de muestra se agregó 10 mL de etanol al 80% y sometió a vórtices para suspender completamente la pelotilla. La pelotilla suspendida entonces se incubó en un baño María a 80-85°C por 5 min. Después, la pelotilla suspendida se centrifugó a 3,000rpm por 10 min a temperatura ambiente y el sobrenadante se desechó. Se repitió una etapa adicional de lavado de etanol una vez más para remover completamente algunos residuos de azúcar solubles.

Digestión de Almidón del Tejido de Planta 3 mL de una dilución 1:30 de a-amilasa termoestable (MEGAZYME, icklo , Irlanda) en 50mM de amortiguador MOPS (pH 7.0) se agregó a la pelotilla de la muestra. La pelotilla en cada tubo fue completamente suspendida sometiéndola a vórtices o pipeteándola arriba y abajo varias veces. La digestión catalizada por amilasa se llevó a cabo en un baño María a 100°C por 12 min, sometiéndola a vórtices cada 4 minutos. Los tubos de reacción se transfirieron a un baño maría a 50°C. Se agregaron a cada muestra 4 mL de 200 mM de amortiguador NaOAc a pH=4.5, seguido por la adición de 0.1 mL de amiloglucosidasa (Megazyme) . Los tubos de reacción se invirtieron periódicamente a contenidos de la mezcla y se dejaron incubar en un baño María a 50 °C por 30 min. El volumen de la muestra se ajustó a 10 mL con agua en un tubo de 15 mL seguido por centrifugación a 3,000 rpm por 10 min a temperatura ambiente. Este sobrenadante contiene los azúcares solubilizados que se digirieron de la muestra.

Ensayo de Glucosa de Digestiones de Almidón 20 L de sobrenadante de digestión de almidón se pipeteó a una cavidad de placa de ensayo de 96 cavidades por triplicado para replicado. Los estándares de glucosa [0 (Agua, = blanco), 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mg/mL] también se agregaron a la misma placa de ensayo de 96 cavidades. Se agregó reactivo de glucosa oxidasa (200 L) a cada cavidad y la incubación se llevó a cabo a 37°C por 20 min. Se leyó la absorbancia a 500 nm. Las muestras con OD mayor de 1.0 se diluyeron 2X veces [10 \ih de sobrenadantes de digestión de almidón + 10 µ? de agua] y el ensayo de glucosa se repitió con los estándares. Las concentraciones de glucosa en las muestras se calcularon con base en la curva estándar. Se pueden usar los siguientes cálculos: La cantidad total de glucosa (mg) = concentración de glucosa (mg/mL) x 10 mL.

La cantidad total de almidón (mg) = cantidad total de glucosa (mg) x 164/182.

La cantidad total de almidón (% en peso seco) = cantidad total de almidón (mg) /peso de muestra (mg) x 100%.

Resultados El tejido de mazorca de eventos TI que comprende casetes de ARNi de los constructos 17305, 18222, 18278, 18286 y 18288 mostró un incremento promedio en el contenido de almidón (%/mg de peso seco) comparado con el contenido de almidón promedio de mazorcas nulas (véase Tablas 10-15). Las mazorcas nulas se observaron por tener un contenido de almidón promedio de 0.89% de almidón por mg de peso seco (Tabla 10) . En comparación, eventos del constructo 18286 (TrpA-Rl) mostraron sorprendentemente un incremento 2.8X de almidón sobre el tejido de mazorca nulo con 18286 eventos que tienen un contenido de almidón promedio midiendo aproximadamente 2.51% por mg de peso seco (Tabla 14) . Los eventos TI del constructo 18288 (Zm015970-Rl) mostraron el segundo incremento más alto en almidón a aproximadamente un incremento 2. IX de almidón en mazorcas sobre tejidos de mazorcas nulas con eventos de 18288 que tienen un contenido de almidón de mazorca promedio midiendo aproximadamente 1.90% por mg en peso seco (Tabla 15) . El te ido de mazorca generado a partir del constructo 17305 (OsMADS13 -Rl ) contiene 1.79% de almidón por mg de muestra seca, un incremento 2X sobre los eventos de mazorca nulos (Tabla 11) . Eventos TI generados usando el constructo 18278 (OsMADSH-PWD) mostraron un contenido de almidón promedio de 1.59% por mg de muestra seca, un incremento 1.79X en almidón sobre mazorcas nulas (Tabla 13) . Los eventos TI generados usando el constructo 18222 (OsMADS 13-AMY3) mostraron un contenido de almidón promedio de 1.27% por mg de muestras secas, un incremento 1.43X en almidón sobre mazorcas nulas (Tabla 12) . De manera sorprendente, todos los constructos que regulan descendentemente una enzima de degradación de almidón de maíz endógena mostraron una acumulación incrementada de almidón cuando se comparan con mazorcas nulas. Notablemente, constructos adecuados para la regulación descendente de Rl en tejido de mazorca resultaron en acumulación de cantidad de almidón más alta en mazorcas. No hubo diferencia significante (P=0.33) en el contenido de azúcar total o en la cantidad de azúcares individuales (glucosa, fructuosa y sacarosa) observados en muestras de mazorca en donde Rl ha sido regulado descendentemente comparado con controles nulos (véase Tabla 11) .

Tabla 10. Estimación de almidón total en muestras de mazorca de eventos nulos TI Tabla 11. Estimación de almidón total en muestras de mazorca de eventos TI con constructo 17305 Tabla 12. Estimación de almidón total en muestras de mazorca de eventos TI con constructo 18222 Tabla 13. Estimación de almidón total en muestras de mazorca de eventos TI con constructo 18278 Contenido de almidón [%/mg en peso seco] Rep 1 Rep 2 promedio MZBF093523A002A heterocigoto 2.00% 2.03% 2.01% MZBF093523A032A heterocigoto 1.32% 1.38% 1.35% MZBF093523A048A heterocigoto 2.54% 2.36% 2.45% MZBF093523B049A heterocigoto 1.60% 1.58% 1.59% ZBF093523A045A heterocigoto 1.11% 1.06% 1.09% MZBF093523A034A heterocigoto 1.15% 1.25% 1.20% MZBF093523A018A heterocigoto 1.43% 1.55% 1.49% MZBF093523B004A heterocigoto 1.53% 1.58% 1.56% Tabla 14 . Estimación de almidón total en muestras mazorca de eventos TI con constructo 18286 Tabla 15 . Estimación de almidón total en muestras de mazorca de eventos TI con constructo 18288 Tabla 16 . Estimación de almidón total en muestras de mazorca de eventos TI con constructo 17305 MZBF080332A100A-06 heterocigoto 5.87% 8.75% 2.94% 17.73% MZBF080332A072A-01 heterocigoto 5.54% 7.75% 1.58% 14.93% MZBF080332A072A-21 heterocigoto 6.33% 7.98% 1.32% 14.86% MZBF080332A100A-20 heterocigoto 2.99% 3.78% 1.35% 7.76% MZBF080332A035A-15 cero 2.04% 4.90% 1.60% 8.30% MZBF080332A035A-24 cero 2.94% 3.17% 0.51% 6.20% MZBF080332A072A-10 cero 6.61% 7.2% 3.27% 17.52% MZBF080332A072A-31 cero 6.11% 7.87% 3.74% 18.37% MZBF080332A100A-04 cero 4.66% 5.85% 3.21% 13.72% MZBF080332A100A-09 cero 2.56% 3.21% 1.11% 6.61% Ejemplo 4: Fermentación de Muestras de Tejido de Mazorca de Maíz El siguiente método de fermentación de etanol incluye una etapa de sacarificación a alta temperatura con la adición de a-amilasa termoestable : (3,000 U/mL a pH=6.5 y 40°C) (botella 1 en el kit) . Se diluyó 1 mL de la enzima a 3 mL usando 50 mM de amortiguador MOPS) y amiloglucosidasa (3,300 U/mL a pH=4.5 · y 40°C) (botella 2 en el kit) usados como se proporciona con el Kit de Almidón Total de Megazyme (MEGAZYME, Wicklow, Irlanda) . Las fermentaciones se llevaron a cabo a 20% de sólidos por 17 horas.

Preparación de Muestra de Mazorca: Las mazorcas se prepararon como se describe en los ejemplos previos. Las mazorcas frescas se congelaron a 80°C, se fotografiaron, y las semillas se removieron usando un raspador de pintura. Cada mazorca se rebanó entonces en rebanadas de menos de 1/4 de pulgada (8 milímetros) de espesor. Las rebanadas para cada mazorca se colocaron en un bote de peso y se secaron usando el liofilizador . Dos de las rebanadas (una de la mitad y una del extremo) se dejaron de lado para teñido con yodo de Lugol . Las rebanadas de mazorca restantes se trituraron usando un molino centrífugo. Para lograr la especificación de tamaño de trituración requerido para fermentación de etanol, la mazorca molida además se trituró por dos ciclos de vibración por 30 segundos usando una máquina Kleco (García Manufacturing, Visalia, CA, Modelo no. KLECO 8200) .

Preparación de Levadura La levadura roja de etanol de Fermentis (FERMENTIS División of S . I . Lesaffre , France) se preparó para fermentación previo a cada serie experimental . lg de levadura de sólido; 5 g de solución de glucosa al 1%, se pesó en un tubo cónico de 50 mi. El tubo se golpeó ligeramente sobre un vórtice hasta que toda la levadura se suspendió. La mezcla entonces se incubó a 30°C por 30 minutos con sacudimiento continuo a 120 rpm. La levadura se sometió ligeramente a vórtices, se removió y diluyó con 5X con agua DI.

Preparación de Muestra Triturada en Seco Se molieron muestras para pasar a través de un tamiz de 0.5 mm. Las muestras secas se cortaron en piezas manejables y se trituraron en un Molino de Disco Perten® 3600 (ajuste 1; Perten Instruments AB; Huddinge, Suecia) . El procedimiento de trituración se varió ligeramente dependiendo de la muestra para triturar muestras a una consistencia razonablemente fina previo a la fermentación.

Fermentación de Muestras de Tejido de Planta de Maíz Se etiquetaron dos tubos centrífugos disponibles de 15 mi para cada muestra individual, incluyendo el control (nulo) . Se pesaron 750 mg de muestra triturada en cada tubo y los pesos se registraron para cálculos. Se agregó una bola de metal individual de 2 mm a cada tubo y cada tubo se golpeó nuevamente hasta que se inició la fermentación. Cada muestra se lavó tres veces agregando 5 mi de 50 mM de amortiguador MOPS, sometiéndola a vórtices por 30 segundos, y después centrifugando a 3000 rpm por 5 minutos. Se desecharon 3 mi de sobrenadante de la cima cada vez y otros 3 mi de amortiguador fresco se agregaron entre cada lavado. Después del tercer lavado, se removieron 3 mi del sobrenadante y los tubos se dejaron de lado. Un tubo se ajustó para una media solamente (sin enzima, ni levadura) de muestra de verificación. Las fermentaciones se llevaron a cabo a 20% de sólidos agregando agua a cada tubo. El volumen final para cada fermentación fue aproximadamente 3 mi . Cada tubo se sometió a vórtices para resuspender los sólidos y se selló con Paraflim®. Un pequeño agujero en la cima de cada tubo se picó usando una aguja de calibre 16.5. La fermentación se inició rotando los tubos a una velocidad de ajuste de 4 en el rotor de cultivo de tejidos (CEL-GRO, LAB-LINE) en el cuarto de incubación a 30°C. Las reacciones de fermentación se llevaron a cabo como se representa en la Tabla 17 abajo.

Tabla 17: Preparación de Reacciones de Fermentación Sólidos Harina 750 (mg) Adición a-amilasa 519.25 µ]_, 1 termoestable diluida Calentado a 100 °C por 12 minutos en un baño María.

Sometido a vórtices cada 4 minutos Adición Amiloglucosidasa 200 uL 2 Calentado a 50 °C por 30 minutos en un baño María.

Sometido a vórtices cada 10 minutos Adición YP, 10X (YE 100 g/L, 300 i 3 Peptona 200 g/L) Tetraciclina 0.75 L (10 mg/mL) Los tubos se sometieron a vórtices y centrifugaron descendentemente a 3000 rpm por 5 minutos. 100 µ? de sobrenadante se removió y colocó en una columna de centrifugación de filtro de 0.4 µt? por datos de punto de tiempo cero (T0) . Las alícuotas de 10 horas se centrifugaron descendentemente en la columna de centrifugación a 6000 rpm por 10 minutos. Las muestras de hora T0 se colocaron en un refrigerador a 4°C. Los tubos restantes se resuspendieron y llevaron a una Adición 4 agregando levadura Adición 4 Levadura 20 µ? Las fermentaciones se dejaron proceder por 17 horas a 30°C Las fermentaciones se muestrearon para cada tubo de reacción después de 17 horas de incubación por tubos de centrifugación por 5 minutos a 3000 rpm y se removieron 100 ¦\iL, de muestra.

Análisis por HPLC de Rendimiento de Etanol El etanol, en una muestra de caldo de fermentación, se separó a través de Cartuchos de Relleno de Catión-H Micro-Guard de 30 x 4.6 mm (Bio-Rad, Cat no. 125-0119) y Columna de Exclusión de I n Aminex HPX-87H de 300 x 7.8 mm (Bio-Rad, Cat no. 125-0140) y se detectó con un detector RI usando Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC, Waters Alliance) .

Las muestras T0 filtradas y muestras de 17 horas se transfirieron a los viales de HPLC apropiados. 0.12 pL de 25 mM de H2S04 se agregaron a 88 \iL de muestra en cada vial para remover el pico negativo del análisis por HPLC. Cinco estándares de HPLC (0%, 0.25%, 0.5%, 0.75% y 1% de etanol) se analizaron para crear una curva estándar, la cual se usó para determinar el contenido de EtOH en la muestra.

Resultados Los rendimientos de etanol a partir de la fermentación de almidón con muestras de mazorca TI en donde el maíz Rl ha sido regulado por disminución se observaron por ser aproximadamente dos veces o superior que aquellos rendimientos observados usando muestras de mazorca nula (Véase Tabla 18) .

Tabla 18: Rendimiento Neto de Etanol a 17 horas de fermentación La cantidad de almidón (almidón fermentado, % por g en peso seco de la muestra de mazorca) fermentado para producir etanol se calculó a partir del rendimiento de etanol mostrado en la Tabla 1. El contenido de almidón (contenido de almidón estimado, % por gramo en peso seco de la muestra de mazorca) se estimó usando el Kit de Ensayo de Almidón Total de Megazymes (véase Tabla 19) .

Tabla 19: Almidón Fermentado Estimado en Muestras de Mazorca TI Almidón Almidón Contenido fermentado* fermentado* de almidón (%/g) (%/g, estimado # promedio) (%/g) Control MZYE013 1.00 0.94 NA nullo 0.89 17305 MZBF080322A100A-6 2.49 2.38 2.07 evento I 2.28 17305 ZBF080322A072A-11 2.00 1.90 2.01 evento II 1.81 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para incrementar el contenido de almidón en tejidos de mazorca de una planta de maíz caracterizado porque comprende: a) insertar un c sete de expresión en una célula de planta de maíz que comprende un polinucleótido ligado operablemente a un elemento regulador que asegura la transcripción en tejido de mazorca de maíz, donde la expresión del polinucleótido disminuye la actividad de una o más enzimas endógenas de degradación de almidón en tejidos de mazorca de maíz; b) regenerar plantas de maíz transgénicas de célula de planta de maíz de a) ; y c) producir el tejido de mazorca con un contenido de almidón incrementado.

2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima endógena de degradación de almidón está seleccionada del grupo formado por alfa-amilasa , glucano agua dicinasa, fosfoglucano agua dicinasa, dextrinasa límite, isoamilasa, beta-amilasa , glucano fosforilasa cloroplástica , enzima desproporcionadora , proteína cloroplástica transportadora de maltosa (Mex 1) , proteína cloroplástica transportadora de glucosa y proteína cloroplástica transportadora de triosa fosfato.

3. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima endógena de degradación de almidón está seleccionada del grupo formado por alfa amilasa, glucano agua dicinasa, PWD, AMY3 y beta-amilasa .

4. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima endógena de degradación de almidón es una glucano agua dicinasa.

5. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima endógena de degradación de almidón es una alfa-amilasa .

6. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido que disminuye la actividad de una o más enzimas de degradación de almidón es AR i .

7. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido está ligado. operablemente a un promotor preferido de tejido de mazorca.

8. Método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el polinucleótido está ligado operablemente a un promotor OsMADS .

9. Método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el polinucleótido está ligado operablemente a cualquiera de los promotores que consisten del grupo que copnsiste de un promotor 0sMADS13, un promotor 0sMADS14, un promotor TrpA o un promotor Zm015970.

10. Método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la mazorca con contenido incrementado de almidón se usa en comida para animales.

11. Un método para mejorar el rendimiento de azúcares libres de biomasa de plantas para un método de conversión de biomasa, caracterizado porque comprende: a) insertar un cásete de expresión en una célula de planta de maíz que comprende un polinucleótido ligado operablemente a un elemento regulador que asegura la transcripción de un tejido de mazorca de maíz donde la expresión del polinucleótido disminuye la actividad de una o más enzimas endógenas de degradación de almidón en tejido de mazorca de maíz; b) regenerar plantas de maíz transgénicas a partir de la célula de planta de maíz de a) ; y c) cultivar las plantas de maíz transgénicas bajo condiciones en las cuales el polinucleótido es expresado, donde la expresión del polinucleótido da como resultado un incremento del contenido de almidón en tejidos de mazorca de la planta y, d) usar la planta de maíz transgénica en un método de conversión de biomasa.

12. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la enzima endógena de degradación de almidón está seleccionada del grupo formado por alfa-amilasa , glucano agua dicinasa, fosfoglucano agua dicinasa, dextrinasa límite, isoamilasa, beta-amilasa, glucano fosforilasa cloroplástica , enzima desproporcionadora, proteína cloroplástica transportadora de maltosa (Mex 1) , proteína cloroplástica transportadora de glucosa y proteína cloroplástica transportadora de triosa fosfato.

13. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la enzima endógena de degradación de almidón está seleccionada del grupo formado por alfa-amilasa, glucano agua dicinasa, P D, AMY3 y beta-amilasa.

14. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la enzima endógena de degradación de almidón es una glucano agua dicinasa.

15. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la enzima endógena de degradación de almidón es alfa-amilasa .

16. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el polinucleótido está ligado operablemente a un promotor preferido de tejido de mazorca.

17. Método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el polinucleótido está ligado operablemente a un promotor OsMADS .

18. Método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el polinucleótido está ligado operablemente a cualquiera de los promotores a partir del grupo que consiste de un promotor 0sMADS13, un promotor 0sMADS14, un promotor TrpA o un promotor Zm015970. ·

19. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la célula de planta comprende además un segundo polinucleótido ligado operablemente a un elemento regulador que asegura la transcripción en células de plantas, donde la expresión del segundo polinucleótido codifica una enzima de procesamiento y la enzima de procesamiento es expresada de manera que no entra en contacto con su substrato.

20. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la planta comprende además un polinucleótido ligado operablemente a un elemento regulador que asegura la transcripción en células de plantas, donde la expresión del polinucleótido disminuye la actividad de una o más enzimas endógenas de degradación de almidón en tejido verde de plantas donde el tejido verde tiene un contenido de almidón incrementado.

21. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el método de conversión de biomasa es un método de conversión de biomasa que no es para comida de animales .

22. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el método de conversión de biomasa que no es para comida de animales, convierte carbohidratos a uno o más bio-combustibles .

23. Un método para producir una mazorca . auto-procesable con almidón incrementado caracterizado porque comprende : a) insertar un primer polinucleótido en una célula ? de planta de maíz que comprende un primer polinucleótido ligado operablemente a un elemento regulador que asegura la transcripción en un tejido de mazorca de maíz donde la expresión del primer polinucleótido disminuye la actividad de una o más enzimas endógenas de degradación de almidón en tejidos de mazorca; b) insertar un segundo polinucleótido en la célula de planta de maíz que comprende un segundo polinucleótido ligado operablemente a un elemento regulador que asegura la transcripción en células de plantas, donde la expresión del polinucleótido codifica una enzima de procesamiento; c) regenerar plantas transgénicas de la célula de planta de b) ; y d) producir la mazorca de auto-procesamiento con almidón incrementado.

24. Método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la enzima endógena de degradación de almidón está seleccionada del grupo formado por alfa-amilasa, glucano agua dicinasa, fosfoglucano agua dicinasa, dextrinasa límite, isoamilasa, beta-amilasa , glucano fosforilasa cloroplástica, enzima desproporcionadora, proteína cloroplástica transportadora de maltosa (Mex 1) , proteína cloroplástica transportadora de glucosa y proteína cloroplástica transportadora de triosa fosfato.

25. Método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la enzima endógena de degradación de almidón está seleccionada del grupo formado por alfa-amilasa, glucano agua dicinasa, PWD, AMY3 y beta-amilasa.

26. Método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la enzima endógena de degradación de almidón es una glucano agua dicinasa.

27. Método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la enzima endógena de degradación de almidón es una alfa-amilasa .

28. Método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la enzima de procesamiento está seleccionada del grupo formado por alfa-amilasa y celulasas.

29. Método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el tej ido de mazorca se usa en un método de conversión de biomasa.

30. Método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la enzima de procesamiento está ligada operablemente a un promotor preferido de mazorca.

31. Método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la enzima de procesamiento está ligada operablemente a un promotor preferido de semilla.

32. Método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la enzima de procesamiento está ligada operablemente a un promotor preferido de tejido verde.

33. Método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque los primer y segundo polinucleótidos están situados en el mismo cásete de expresión.

34. Método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque los primer y segundo polinucleótidos están situados en casetes de expresión separados.

35. Un método para preparar ensilaje, caracterizado porque comprende : a) insertar un cásete de expresión en una célula de planta que comprende un polinucleótido ligado operablemente a un elemento regulador que asegura la transcripción en células de plantas, donde la expresión del polinucleótido disminuye la actividad de una o más enzimas endógenas de degradación de almidón en te ido de mazorca; b) regenerar plantas transgénicas de la célula de planta de b) ; y c) producir tejido de mazorca con incremento del contenido de almidón; d) ensilar el tejido de mazorca con contenido de almidón incrementado para preparar ensilaje.

36. Método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el ensilaje se usa en comida para animales.

37. Método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el ensilaje se usa en un método de conversión de biomasa.

38. Método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la planta comprende además un polinucleótido ligado operablemente a un elemento regulador que asegura la transcripción en células de plantas, donde la expresión del polinucleótido disminuye la actividad de una o más enzimas endógenas de degradación de almidón en tejido verde de plantas donde el tejido verde tiene contenido de almidón incrementado.

39. Método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la mazorca comprende además una enzima procesadora .

40. Método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la mazorca comprende además una fitasa.

41. Un promotor preferido de mazorca caracterizado porque tiene al menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%. 99% o 100% de identidad de secuencia con la SEC ID NO : 14.

42. Una secuencia aislada promotora de Maíz (Zra015970) caracterizada porque consiste de la SEC ID NO.14.

43. Un método para dirigir la expresión de un gen objetivo en tejido de mazorca de maíz, caracterizado porque comprende : poner en contacto una planta de maíz con un gen objetivo en enlace operativo con una secuencia promotora Zm015970 que comprende ya sea la SEC ID NO : 8 , SEC ID NO: 14, o un fragmento activo de la misma; e introducir en la planta el gen objetivo en enlace operativo con una secuencia promotora Zm015970 que comprende ya sea la SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 14 o un fragmento activo de la misma, en donde el promotor Zm015970 dirige la expresión del gen objetivo en tejido de mazorca de maíz.