CN102405291A - 用于增加植物穗轴中的淀粉含量的方法 - Google Patents

Abstract

提供了用于增加植物的穗轴组织中的淀粉含量的方法和组合物。该方法包括下调植物中的淀粉降解酶的活性。本发明的所得的转基因植物在穗轴组织中具有增加的淀粉含量。在一个实施方案中，该方法牵涉在穗轴组织中操作单子叶植物以下调淀粉降解酶的活性。该植物可用于改善来自植物生物质的游离糖的产率。

Description

用于增加植物穗轴中的淀粉含量的方法

发明领域

本发明涉及植物分子生物学，特别地涉及用于增加植物穗轴中的淀粉积累的方法和组合物及这些植物组织在商业应用中的用途。

发明背景

植物生物质由糖构成，并且代表地球上可再生碳氢化合物的最大来源。与其它可再生能源不同，生物质可以直接转化成液体燃料。两种最常见的生物燃料类型是乙醇(乙基醇)和生物柴油。乙醇是一种醇，其可以通过发酵碳水化合物高的任何生物质(淀粉、糖、或纤维素)来生成。一旦自生物质材料获得可发酵糖，便可以使这些糖发酵以经由与酿造啤酒相似的方法来生成乙醇。然而，此巨大的资源由于糖被锁在复杂的聚合物(其经常统称为木质纤维素)中的实情而利用不足。

将木质纤维素常规分解成单体(单糖)需要经由化学和/或物理预处理来使生物质来源材料软化。也可以添加酶，其将生物质中含有的聚合形式的糖水解成单糖。然后，可以利用6-碳和5-碳糖两者来实施随后的发酵以生成乙醇或其它期望的生物产物。自植物生物质的降解生成的糖可以为发酵成化学品、塑料、饲料添加剂和燃料提供丰富的、有经济竞争力的给料。

碳水化合物构成地球上最丰富的有机化合物。它们主要在植物中作为纤维素或淀粉形式的复杂葡萄糖聚合物找到。纤维素、半纤维素和葡聚糖构成植物细胞壁和木质组织的许多结构组分。这些结构组分经常与其它分子，诸如蛋白质、脂肪和木质素复合。淀粉作为种子和谷物中的主要贮存碳水化合物被植物利用，所述种子和谷粒基本上由纯的连接的葡萄糖聚合物组成。在许多谷物中以及在块茎和根中找到淀粉。淀粉由于如下的实情而成为一种期望的贮存碳水化合物，即它组成简单，而且可以被植物容易地分解以得到能量。比较而言，木质纤维素材料由与木质素复合的葡萄糖和/或数种不同的糖构成。淀粉经由有效且便宜的淀粉水解酶而可容易地水解成单体糖，而木质纤维素材料即不可容易地水解，也不能相对便宜地加工。碳水化合物还以简单的二糖蔗糖形式丰富地找到。可以在诸如甘蔗、甜菜、和甜高梁等作物中找到蔗糖。与蔗糖不同，淀粉是稳定的，而且可以以脱水形式贮存一段很长的时间。

植物穗轴主要由木质纤维素组成，并且一般在大多数农业实践中作为废物丢弃。例如，收获玉米的联合收割机首先对穗轴剥去其仁，然后将剥掉的穗轴作为废物释放回耕地中。玉米穗轴构成地上玉米植物总生物质的约15-18％。随着目前的玉米价格上涨，玉米的供应已经非常有限，而且已经有从不太昂贵的非食物来源或废产物生产燃料的动力。目前，美国每年生产约86亿加仑乙醇，其中大多数乙醇源自玉米淀粉。已经预测到穗轴的纤维素发酵可以使美国的乙醇总产量增加额外的50亿加仑乙醇。其它评估预测在发酵中使用玉米穗轴可以将玉米乙醇总产率提高每蒲式耳11％或每英亩27％。然而，将穗轴发酵成燃料受限于成本和不太有效的方法。目前的穗轴发酵实践需要用帮助分解穗轴的木质纤维素和纤维结构的酶混合物来预处理穗轴。也可以采用热化学条件以帮助分解穗轴(例如高热、碱性pH，等等)。在预处理后，然后从经处理的穗轴提取糖，并且在一些情况中，可以添加额外的酶以将糖进一步降解成更小的糖。然后，经由酵母发酵来将这些糖转化成乙醇。已经评估了目前的穗轴发酵成本比商业玉米淀粉乙醇发酵每生产一加仑多约1美元。穗轴的结构木质纤维素组成对目前的穗轴发酵实践造成数项限制。目前的穗轴发酵实践的一项限制可以是对用于自穗轴提取糖的预处理方法的需要可能是昂贵且适时的(timely)。目前的穗轴发酵实践的另一项限制可以是需要提取合适的糖或者实施酶处理以将复合糖进一步降解成单糖，其可以被酵母容易地转化成乙醇。还可以有必要寻找或创建最佳的酵母菌株，其能够利用源自预处理和酶水解的特定糖谱。另一项限制可以是自穗轴提取糖的方法由于木质纤维素的密集结构而导致效率低。

会期望生成在生产单体糖中有益的穗轴组织，其中较高比例的碳水化合物为淀粉形式。提供了用于创建富含淀粉的穗轴生物质的方法和用于自穗轴生物质生成游离的糖和寡糖的方法以及这些游离糖在生产化学品、塑料、饲料添加剂和燃料中的用途。

发明概述

提供了用于增加植物的穗轴组织中的淀粉含量的组合物和方法。进一步提供了如下的方法，其中含有增加量的淀粉的穗轴可以在生物质转化法中以及在动物饲料应用中使用。该方法牵涉独立地或共同地下调植物暂时性淀粉降解途径中涉及的酶的内源活性。可以遍及整个植物或在优选的靶组织(例如茎、叶、穗轴等)内组成性靶向下调。本发明的转基因植物在穗轴组织中具有增加的淀粉含量。本文中所描述的方法在提高植物穗轴组织在生产生物燃料和动物饲料应用的用途中的价值方面可以是有益的。可以转化自这些转基因植物获得的穗轴以生成水平升高的游离糖，其在将游离糖下游发酵成化学品、塑料、饲料添加剂和燃料中是有用的。还提供了生成具有增加的淀粉含量的自身加工穗轴的方法，其中植物或植物部分表达加工酶(例如alpha-淀粉酶、葡糖淀粉酶、纤维素酶、CBHI，等等)，其中将加工酶靶定得远离其相对底物，而且在活化(例如碾磨、加水、pH、温度调节)加工酶(嗜温性、嗜热性、或超嗜热性)后，植物或植物部分能够自身加工其起作用的底物以获得期望的结果。

发明详述

概述

冠词“一个”和“一种”在本文中用于指一个/种或超过一个/种(即至少一个/种)该冠词的语法对象。举例而言，“一个/种元件”指一个/种或多个/种元件。遍及说明书，词“包含”或变型应当理解为暗示包括规定的元件、整数或步骤，或元件、整数或步骤的组，但是不排除任何其它元件、整数或步骤，或元件、整数或步骤的组。

提供了用于增加植物的穗轴组织中的淀粉含量的方法和组合物。该方法包括下调植物中的短暂性淀粉降解途径中涉及的酶的活性。本发明所得的转基因植物在穗轴组织中具有增加的淀粉含量。进一步提供了在穗轴组织中具有增加的淀粉含量的植物的使用方法。

提供了转基因植物、种子、植物组织和植物部分。认可的是，可以通过使用组成性、组织、时间或化学调节性启动子来控制该过程。可以在单子叶植物的穗轴和单子叶或双子叶植物中找到的类似结构中实施以下实施方案。

一种增加穗轴组织中的淀粉的方法在多个产业(例如但不限于乙醇、动物饲料、塑料、化学品和其它工业应用)间可以是期望的。目前的应用的一个实施方案涉及操作植物以下调短暂性淀粉降解途径中涉及的一种或多种叶绿体或胞质酶(在本文中称为“淀粉降解酶”)的活性。本发明所得的植物在穗轴组织中具有增加的淀粉含量。淀粉降解酶包括但不限于alpha-淀粉酶、葡聚糖水双激酶、磷酸葡聚糖水双激酶、极限糊精酶、异淀粉酶、beta-淀粉酶、葡聚糖磷酸化酶、歧化酶、叶绿体麦芽糖转运蛋白、叶绿体葡萄糖转运蛋白、叶绿体丙糖磷酸转运蛋白、胞质转葡糖苷酶、葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡聚糖磷酸酶(淀粉过量4)和己糖激酶。

本发明的方法在整合目前用于栽培作物植物的实践以获得在作物植物的穗轴组织中具有增加的淀粉积累的商业上期望的植物材料，及作物植物穗轴作为用于生产可发酵糖的生物质来源或用于农业和/或人消耗的用途中得到应用。经修饰的植物和植物部分可以在醇的生产中使用，并通过工程化改造植物穗轴以积累淀粉来产生增加的乙醇。

如本文中所使用的，“作物植物”指为了生成植物材料而栽培的任何植物，所述植物材料是人或动物为了食用，或为了在工业、医药、或商业过程中利用而寻找的。本发明可以适用于任何品种的植物，包括但不限于玉米、小麦、稻、大麦、大豆、棉、高粱、一般的豆、油菜/芸苔、苜蓿、亚麻、向日葵、红花、黍/粟(millet)、黑麦、甘蔗、甜菜、可可(cocoa)、茶、热带甜菜、芸苔属(Brassica)、棉、咖啡、甘薯、亚麻、花生、三叶草(clover)；蔬菜诸如莴苣、番茄、葫芦、木薯、马铃薯、胡萝卜、萝卜、豌豆、小扁豆、甘蓝、花椰菜、花茎甘蓝(broccoli)、孢子甘蓝、胡椒、和凤梨；树果实诸如柑橘、苹果、梨、桃、杏、胡桃、鳄梨、香蕉、和椰子；和花诸如兰花、香石竹(carnation)和蔷薇/玫瑰。可用于实施本发明的其它植物包括多年生草，诸如柳枝稷、北美草原草(prairie grass)、印第安草(Indiangrass)、大须芒草(Big bluestem grass)、芒(miscanthus)等。认可可以使用植物的混合物。

如本文中所使用的，术语“能源作物”指可有利于在生物质转化法中在将植物生物质转化成燃料方面使用的作物。此组包括但不限于甘蔗、甜菜、高粱、柳枝稷、芒、小麦、稻、燕麦、大麦和玉米。

如本文中所使用的，术语“植物部分”或“植物组织”包括植物细胞、植物原生质体、可以使植物再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物块、和植物或植物部分诸如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、穗轴、外皮、茎、根、根尖、花药，等等中完整的植物细胞。

在一个实施方案中，植物是不确定的植物。在温带地区，这些品种无限期地营养生长。不确定的植物可以工程化改造为在穗轴组织中积累淀粉，并且可以在初霜前一直种植。在那时，可以让植物变干，收获干的，并用于食物、家畜饲料、或在生物质转化法中使用。

如本文中所使用的，“生物质”指包括感兴趣的产物的有用的生物学材料，该材料要进行收集，并意图进一步加工以分离或浓缩感兴趣的产物。“生物质”可以包含果实或其部分或种子、叶、或茎、穗轴或根，其中这些是对于产业目的而言特别感兴趣的植物部分。“生物质”在其指植物材料时包括植物中含有或呈现感兴趣的产物的任何一种或多种结构。

穗轴淀粉积累的增加例如在通过青贮(silage)或干燥来保藏的穗轴组织中可以是期望的。在一个实施方案中，青贮具有增加的穗轴淀粉的植物可以是有益的。在另一个实施方案中，工程化改造具有增加的穗轴淀粉和增加的绿色组织淀粉两者的植物诸如记载于美国公开文本US 2009/0119800-A1(通过提及而将其收入本文)的植物及在青贮饲料中使用所述植物可以是有益的。在另一个实施方案中，生成所述具有增加的穗轴淀粉的植物可以是有益的，其中已经将植物工程化改造成表达肌醇六磷酸酶或者已经用肌醇六磷酸酶处理。在另一个实施方案中，生成另外被工程化改造成表达淀粉酶的所述工程化改造成表达肌醇六磷酸酶或者用肌醇六磷酸酶处理的植物可以是期望。如本文中所使用的，术语“淀粉酶”涵盖具有α-淀粉酶活性的酶(例如E.C.3.2.1.1类)，例如能够水解多糖中的内部α-1，4-葡聚糖连接的α-淀粉酶，包括能够在碱性pH或在酸性pH将淀粉水解成糖的淀粉酶酶。这些酶也已经被描述为那些实现对含有1，4-α-连接的D-葡萄糖单元的多糖中的1，4-α-D-葡糖苷连接的外水解或内水解的。用于描述这些酶的另一个术语是“糖原酶”。美国专利公开文本2003/0125534和美国专利公开文本2004/0018607(通过提及而将这两篇收入本文)描述了可以在本发明的多个实施方案中使用的多种α-淀粉酶酶。在美国专利公开文本No.2003/0135885(通过提及而将其完整收入本文)中还提供了用于生成并使用表达α-淀粉酶酶的生物体(例如以生成供生产乙醇用的可发酵底物)的方法。如本文中所定义的，术语“收获指数”指收获时的生物质产率与累积的生物质的比率。目前的两种最好的能源作物，即甘蔗和甜菜就收获指数而言在贮存稳定性方面具有限制，而且在收获时具有高含水量。高含水量具有数项缺点，诸如收获的运输成本较高，因为需要与作物一起移动较高比例的水。贮存稳定性是一项重要的问题，因为可以有持续的代谢，或微生物污染，其可以导致作物酸败和糖损失。作物的腐败性在这些类型的农业产品的移动、贮存、和利用方面具有非常不同的基础设施牵连。淀粉含量的增加会导致干物质和贮存稳定性的相当大的升高。

本申请的一个实施方案提供了一种用于提高植物穗轴组织中的淀粉水平的方法，包括将表达盒插入包含多核苷酸的植物细胞中，其中所述多核苷酸序列的表达降低或抑制一种或多种选自下组的淀粉降解酶的活性：alpha-淀粉酶、葡聚糖水双激酶、磷酸葡聚糖水双激酶、极限糊精酶、异淀粉酶、beta-淀粉酶、叶绿体葡聚糖磷酸化酶、歧化酶、叶绿体麦芽糖转运蛋白(Mex1)、磷酸葡聚糖磷酸酶(淀粉过量4)、叶绿体葡萄糖转运蛋白、和叶绿体丙糖磷酸转运蛋白。自包含表达盒的植物细胞再生转基因植物，其中所述多核苷酸序列的表达降低或抑制一种或多种淀粉降解酶的活性。优选地，所述多核苷酸会与可操作的穗轴组织优选性启动子，诸如但不限于稻(Oryzasativa)MADS框(OsMADS)启动子，诸如记载于公开文本US 2007/0006344(通过提及而将其收入本文)的启动子连接。所得的穗轴会具有水平升高的淀粉，如此具有更高的收获指数和商业价值。在一个优选的实施方案中，淀粉降解酶与OsMADS13启动子(GenBank登录号AF151693)可操作连接。

“可操作连接”指各核酸序列在单一核酸片段上的联合，使得一个的功能受到另一个影响。例如，启动子在其能够影响编码序列或功能性RNA表达时(即，编码序列或功能性RNA在启动子的转录控制下)与所述编码序列或功能性RNA可操作连接。有义或反义取向的编码序列可以与调节序列可操作连接。

在一些实施方案中，目前公开的主题涉及一种表达盒，其包含5’-调节序列和与所述5’-调节序列可操作连接的核酸分子，其中所述核酸分子对于5’-调节序列而言是异源的，且其中所述核酸分子的表达产物靶定于植物的穗轴组织。5’-调节序列包含下列区域：启动子、第一外显子、第一内含子、第二外显子的5’部分，其中已经工程化改造所述5’-调节序列以在所述5’-调节序列的3’端包括翻译起始密码子，而在所述翻译起始密码子的上游不含其它翻译起始密码子。目前公开的主题进一步涉及一种表达盒，其中所述第二外显子的5’部分包含来自外显子5’端的前15个核苷酸和Kozak序列。

在一些实施方案中，目前公开的主题提供了一种表达盒，其包含与异源基因可操作连接的SEQ ID NO：8。在一方面，表达盒包含5’-调节序列和与5’-调节序列可操作连接的核酸分子，其中所述核酸分子对于5’-调节序列而言是异源的。5’-调节序列可以包含下列区域：启动子、第一外显子、第一内含子、和第二外显子的5’部分。工程化改造5’-调节序列以在其3’端包括翻译起始密码子，而在所述翻译起始密码子的上游不含其它翻译起始密码子。如本文所使用的，术语“部分”可以指具有期望长度的来自内含子或外显子，诸如来自外显子2的5’端的序列，如可以通过本文中所提供的指导(包括下文实施例)来确定的。作为例子而非限制，所述盒中包括的第二外显子的5’部分可以包括来自外显子5’端的前15个核苷酸。核酸分子的表达产物可以靶定植物的穗轴组织。美国申请No.2007/0006344(通过提及而将其收入本文)中第一次披露了表达盒设计。

淀粉生物合成和降解

淀粉是自然界中生成的最丰富的聚合物之一，并且在整个植物界中作为贮存碳水化合物合成。在贮存器官中，它充当长期的碳储备物，而在有光合能力的组织中，它被短暂积累以在对光合作用不利的期间提供降低的碳和能量两者。淀粉由于其与纤维素材料相比在组成上简单而成为一种期望的贮存碳水化合物。纤维素材料包含与木质素复合的数种不同糖。木质纤维素非常难以用酶分解。相反，淀粉由葡萄糖组成，并且经由有效且便宜的淀粉水解酶而可容易地水解成单体糖。植物穗轴组织中的淀粉积累会在植物生物质中提供单糖的丰富来源。

绿色组织中的淀粉降解涉及多种酶和转运蛋白。短暂性淀粉在叶绿体基质中经由淀粉降解酶的作用而基本上被转化成葡萄糖、麦芽糖和丙糖磷酸。然后，这些糖经由糖转运蛋白而从叶绿体基质转运到胞质溶胶。一旦在胞质溶胶中，便会在植物细胞代谢中利用这些单糖。先前的研究聚焦于将叶绿体基质内的关键的淀粉降解酶和转运蛋白阻抑或失活以在绿色组织内积累淀粉。令人惊讶地，已经发现了下调穗轴中的淀粉降解酶导致穗轴中的淀粉增加。植物经由OsMAD启动子的潜在的泄漏表达还在其绿色组织中展现出淀粉过量表型。“泄漏”意为启动子可以优选地指导基因在一种组织类型中表达，而非优选地较小程度地指导基因在第二种组织中表达。本领域中已知的是，许多启动子展现出此类表达谱，其中基因表达针对特定组织，但是可以在其它组织类型中在较小程度上表达基因。玉米“穗轴优先性启动子”指优选对玉米植物的穗轴指导基因表达，并且随后可以在其它玉米植物组织中在较小或相等程度上表达或不表达相同基因的任何启动子。在一个实施方案中，可以期望使用组成性启动子，其中在整个植物中组成性下调淀粉降解酶。

淀粉包含线性(直链淀粉)和分枝(支链淀粉)葡萄糖聚合物两者。来自许多，但是不是所有植物来源的支链淀粉含有磷酸单酯，其主要与糖基残基的C6和C3位置连接。然而，仅最近才已经阐明了淀粉磷酸化的生物化学机制。转基因马铃薯植物(Lorberth等(1998)Nat Biotechnol.16(5)：473-7)和拟南芥属(Arabidobsis)的sex1突变体(Yu等(2001)Plant Cell 13(8)：1907-18)缺乏淀粉有关的蛋白质(其在本文中称为R1)，并且它们合成具有降低的磷酸酯含量的淀粉。自马铃薯纯化的重组R1-蛋白能够使α-葡聚糖磷酸化(Ritte等(2002)Proc Natl Acad Sci U S A 99(10)：7166-71)。它催化双激酶型反应，释放ATP的γ-磷酸(导致正磷酸的释放)，但是使用β-磷酸来使聚葡聚糖的葡糖基残基磷酸化。由于此活性，认为蛋白质是葡聚糖水双激酶(GWD)(Ritte等(2003)Planta 216(5)：798-801)。

在转基因马铃薯植物中抑制编码来自马铃薯的R1蛋白的R1基因导致可以自马铃薯块茎分离的淀粉的磷酸含量降低(Lorberth等)。此外，Lorberth等显示了来自马铃薯(Solanum tuberosum)的R1蛋白能够使细菌糖原磷酸化，若相应的R1 cDNA在大肠杆菌(E.coli)中表达的话(Lorberth等，Nature Biotech.16，(1998)，473-477)。Ritte等(Plant J.21，(2000)，387-391)显示了来自马铃薯的R1蛋白可逆地结合马铃薯植物中的淀粉粒，其中对淀粉粒的结合强度取决于植物的代谢状态。在淀粉粒结合形式中，马铃薯植物中的蛋白质主要存在于黑暗中保持的叶中。然而，在对叶照明后，蛋白质主要以不结合淀粉粒的可溶性形式存在。

淀粉的磷酸化强烈地影响其体内降解性。此活性以GWD缺陷型马铃薯或拟南芥植物的叶中观察到的淀粉过量表型指示(Lorberth等，1998，见上文；Yu等，2001，见上文)。R1蛋白及其同系物在植物或植物细胞中的表达和/或活性的降低导致此淀粉过量表型，这意味着缺乏R1活性的植物不再能够动员其光合或贮存组织中合成的淀粉(短暂性淀粉)。因此，这些植物显示淀粉在其绿色组织中的积累。“绿色组织”意指植物中的所有绿色结构，包括叶、茎、和未成熟的果实。令人惊讶地，已经发现了下调穗轴中的淀粉降解酶导致穗轴组织中的淀粉积累。

可以测定此淀粉过量特性，例如如记载于美国专利申请公开文本No.2006/0236426的，通过提及而将其收入本文。具体地，将植物的来源叶在黑暗中保持不同时间间隔，然后用碘染色以测定其淀粉含量。在黑暗中不能动员短暂性淀粉的植物叶显示蓝色染色，或者与可以在相应的野生型植物的叶中发生的染色相比，这些叶中的蓝色染色更强或者染色在黑暗中更长的时间间隔后是明显的。可以修饰相似的方法以测量穗轴组织中的淀粉积累。

此外，也可以通过酶法测定淀粉含量来测试穗轴组织中的短暂性淀粉的积累。这可以例如如Muller-Rober等(EMBO J.11(1992)，1229-1238)中所描述的那样完成。在与相应的野生型植物的穗轴组织相比时，一种或多种淀粉降解酶的活性被降低的植物的穗轴组织优选地具有增加至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少600％、或更大的淀粉含量。

对淀粉降解酶活性的抑制

在本发明的方法和组合物中，在淀粉降解酶或其同系物的活性受到下调的植物的穗轴组织中发生淀粉积累。通过下调活性，与尚未进行操作以降低淀粉降解酶活性的相应的对照植物中的活性相比，植物中的淀粉降解蛋白或酶的活性水平被降低或完全阻抑。若活性小于95％、小于约90％、小于约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％，或者比不是突变体或者尚未进行遗传修饰以抑制淀粉降解酶表达的植物中的淀粉降解酶活性小100％，则淀粉降解酶，即靶蛋白的活性受到抑制、降低、或消除。可以通过测量植物穗轴组织中的淀粉含量来测量淀粉降解酶的活性。用于测量淀粉含量的方法在本领域中可获得。参见例如Yu等(2001)The Plant Cell 13：1907-1918。可以通过例如在Ritte等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA 14：7166-7171中所列的方法来测量R1酶活性。同样地，可以通过表明植物中的淀粉降解酶减少的免疫印迹，通过Western印迹分析等来直接测量淀粉降解酶的表达水平。

可以在本发明方法的实施中使用降低植物中的淀粉降解酶的活性的任何方法。例如，可以通过将抑制R1蛋白水平或活性的多核苷酸导入植物中来降低或消除R1蛋白的活性和/或水平。多核苷酸可以抑制信使RNA的表达或翻译。同样地，可以通过用编码多肽的核酸序列转化植物来实现下调，所述多肽抑制淀粉降解酶的转录或翻译，或者抑制淀粉降解酶的活性。

如本文中所使用的，术语“抑制”、“下调”指靶基因产物的表达或功能的任何降低，包括表达或功能的任何相对减少，直至且包括完全消除靶基因产物的表达或功能。如本文中所使用的，术语“表达”在基因产物的语境中指所述基因产物的生物合成，包括基因产物的转录和/或翻译和/或装配。抑制靶基因产物(即感兴趣的基因产物)的表达或功能可以在任何两种植物间的比较的语境中，例如经遗传改变的植物中的靶基因产物的表达或功能对相应的野生型植物中的所述靶基因产物的表达或功能。或者，抑制靶基因产物的表达或功能可以在同一植物内或植物间的植物细胞、细胞器、器官、组织、至植物部分间的比较的语境中，并且包括同一植物内或植物间的发育或时间阶段间的比较。

用于抑制或消除植物中的基因表达的方法是本领域中公知的，并且可以在本发明的方法中使用任何此类方法。可以利用至少与靶序列的信使RNA(mRNA)的一部分互补的反义构建体。构建反义核苷酸以与相应的mRNA杂交。可以进行反义序列的修饰，只要该序列与相应的mRNA杂交，并干扰相应的mRNA的表达。如此，可以使用与相应的有义序列具有至少约70％、至少约80％、至少约85％或更高序列同一性的反义构建体。此外，可以使用反义核苷酸的一部分来破坏靶基因的表达。一般地，可以使用至少约10个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约200个核苷酸、至少约300个核苷酸、至少约400个核苷酸、至少约450个核苷酸、至少约500个核苷酸、至少约550、或更大的序列。反义方法是本领域中已知的，参见例如Sheehy等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8805-8809；及美国专利No.5,107,065；5,453,566；及5,759,829)；通过提及而将其收入本文。

也可以使用共阻抑来阻抑靶基因的表达。如此，以有义的取向在感兴趣的植物中表达异源淀粉降解酶序列以阻抑内源淀粉降解酶基因在植物中的表达。用于共阻抑的方法是本领域中已知的。参见例如Taylor(1997)Plant Cell9：1245；Jorgensen(1990)Trends Biotech.8(12)：340-344；Jorgensen等(1996)Plant Mol.Biol.31：957-973；Johansen和Carrington(2001)Plant Physiol.126：930-938；Broin等(2002)Plant Cell 14：1417-1432；Stoutjesdijk等(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Yu等(2003)Phytochemistry 63：753-763；Flavell(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3490-3496；Finnegan等(1994)Bio/Technology 12：883-888；Neuhuber等(1994)Mol.Gen.Genet.244：230-241；及美国专利No.5,034,323，5,283,184，及5,942,657；通过提及而将它们均收入本文。

共阻抑涉及用包含驱动植物中的表达的启动子的DNA构建体转化植物，所述启动子至少与多核苷酸的一部分可操作连接，所述多核苷酸对应于感兴趣的基因或靶基因的转录物。将核苷酸序列构建或选择为与内源基因的转录物的序列具有实质序列同一性，通常大于约60％序列同一性，更通常大于约80％序列同一性，更通常大于约90％序列同一性，且在一些情况中大于约95％序列同一性。

也可以使用RNA干扰(RNAi)来下调淀粉降解酶基因。一般地，参见Napoli等(1990)Plant Cell 2：279-289；美国专利No.5,034,323；Sharp(1999)Genes Dev.13：139-141；Zamore等(2000)Cell 101：25-33；及Montgomery等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：15502-15507。在RNAi中，可以使用长的双链RNA(dsRNA)(通常大于200个核苷酸)来使植物中的靶基因表达沉默。在导入后，长的dsRNA进入细胞途径，其通常称为RNA干扰(RNAi)途径。首先，RNA酶III样酶将dsRNA加工成20-25个核苷酸(nt)的小干扰RNA(siRNA)。这些siRNA装配成称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的含有内切核糖核酸酶的复合物，在该过程中解旋。随后，siRNA链将RISC引导至互补的RNA分子，在那里它们切割并破坏关联的RNA。在被siRNA链结合的区域的中间附近发生对关联RNA的切割。

如此，可以使用双链RNA(dsRNA)干扰。对于dsRNA干扰，可以在同一细胞中表达有义RNA分子和与有义RNA分子完全或部分互补的反义RNA分子，导致对相应的内源信使RNA的表达的抑制。

可以从单一或不同表达盒表达有义和反义分子。或者，然后筛选用一种或多种dsRNA干扰表达盒转化的多个植物品系以鉴定对淀粉降解酶表达显示最大抑制的植物品系。使用dsRNA干扰来抑制内源植物基因表达的方法记载于Waterhouse等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13959-13964，Liu等(2002)Plant Physiol.129：1732-1743，及WO 99/49029，WO 99/53050，WO99/61631，及WO 00/49035；通过提及而将每篇收入本文。

在本发明的一些实施方案中，可以通过发夹RNA(hpRNA)干扰或含有内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰来获得对淀粉降解酶表达的抑制。短发夹RNA(shpRNA)是一种生成可以用于使基因表达沉默的紧密发夹转角的RNA序列。这些方法在抑制内源基因表达方面是高度有效的。参见，Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38及其中引用的参考文献。

对于hpRNA干扰，表达盒设计为表达与自身杂交以形成包含单链环区和碱基配对茎的发夹结构的RNA分子。碱基配对茎区包含与整个或部分编码表达要受抑制的基因的内源信使RNA对应的有义序列和与有义序列完全或部分互补的反义序列。如此，分子的碱基配对茎区一般决定RNA干扰的特异性。hpRNA分子在抑制内源基因的表达方面是高度有效的，并且它们诱导的RNA干扰被植物的后续世代继承。参见例如Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：4985-4990；Stoutjesdijk等(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；及Waterhouse and Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38。使用hpRNA干扰来抑制或沉默基因表达的方法记载于例如Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：4985-4990；Stoutjesdijk等(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Pandolfini等BMC Biotechnology 3：7，及美国专利公开文本No.20030175965；通过提及而将每篇收入本文。Panstruga等(2003)Mol.Biol.Rep.30：135-140(通过提及而将其收入本文)已经描述了hpRNA构建体在体内使基因表达沉默的效率的瞬时测定法。

也可以在本发明的方法中使用干扰发夹RNA(ihpRNA)。ihpRNA与hpRNA具有相同的一般结构，但是该RNA分子另外包含能够在表达ihpRNA的细胞中被剪接的内含子。内含子的使用使剪接后的发夹RNA分子中的环大小最小化，如此提高干扰的效率。参见例如Smith等(2000)Nature407：319-320。使用ihpRNA干扰来抑制内源植物基因表达的方法记载于例如Smith等(2000)Nature 407：319-320；Wesley等(2001)Plant J.27：581-590；Wang和Waterhouse(2001)Curr.Opin.Plant Biol.5：146-150；Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Helliwell和Waterhouse(2003)Methods 30：289-295，及美国专利公开文本No.20030180945，通过提及而将每篇收入本文。还可参见WO 02/00904，其中hpRNA设计为使得环区决定RNA干扰的特异性。

在本发明的一些实施方案中，可以使用通过表达编码微小RNA(miRNA)的基因实现的RNA干扰。miRNA是由约22个核糖核苷酸组成的调节剂。miRNA在抑制内源基因表达方面是高度有效的。参见例如Javier等(2003)Nature 425：257-263，通过提及而将其收入本文。对于miRNA干扰，表达盒设计为表达内源miRNA基因模仿的RNA分子。miRNA基因编码形成发夹结构的RNA，所述发夹结构含有与R1互补的约22个核苷酸的序列。例如，对于阻抑R1表达，22个核苷酸的序列选自淀粉降解酶转录物序列，并且含有有义取向的所述淀粉降解酶序列的22个核苷酸和与有义序列互补的相应的反义序列的21个核苷酸。

用于下调靶蛋白的活性的其它方法包括病毒诱导的基因沉默(Burton等(2000)Plant Cell 12：691-705；及Baulcombe(1999)Curr.Op.Plant Bio.2：109-113)；核酶(Steinecke等(1992)EMBO J.11：1525；及Perriman等(1993)Antisense Res.Dev.3：253)；寡核苷酸介导的靶向修饰(例如WO 03/076574和WO 99/25853)；Zn指靶向性分子(例如WO 01/52620；WO 03/048345；及WO 00/42219)；转座子加标签(Maes等(1999)Trends Plant Sci.4：90-96；Dharmapuri和Sonti(1999)FEMS Microbiol.Lett.179：53-59；Meissner等(2000)Plant J.22：265-274；Phogat等(2000)J.Biosci.25：57-63；Walbot(2000)Curr.Opin.Plant Biol.2：103-107；Gai等(2000)Nucleic Acids Res.28：94-96；Fitzmaurice等(1999)Genetics 153：1919-1928；Bensen等(1995)Plant Cell7：75-84；Mena等(1996)Science 274：1537-1540；及美国专利No.5,962,764)；通过提及而将每篇收入本文。

此外，可以使用编码特异性识别植物细胞中的依照本发明的淀粉降解酶蛋白或其同系物(例如此类蛋白质的特定片段或表位)的抗体的核酸分子来抑制此蛋白质的活性。这些抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体或合成抗体及抗体片段，诸如Fab、Fv或scFv片段等。可以例如通过如最初记载于Kohler和Milstein(Nature 256(1975)，495)和Galfre(Meth.Enzymol.73(1981)3)的技术来制备单克隆抗体，所述技术包括融合小鼠骨髓瘤细胞与源自经免疫哺乳动物的脾细胞。此外，可以通过使用记载于例如Harlow and Lane“Antibodies，A Laboratory Manual”，CSH Press，Cold Spring Harbor，1988的方法来获得针对前述肽的抗体或其片段。可以通过本领域中公知的方法来实现抗体或抗体样分子在植物中的表达，例如已经在烟草、马铃薯(Schouten，FEBS Lett.415(1997)，235-241)或拟南芥中成功表达了全长抗体(full-size antibody)(During，Plant.Mol.Biol.15(1990)，281-293；Hiatt，Nature 342(1989)，469-470；Voss，Mol.Breeding 1(1995)，39-50)、Fab片段(De Neve，Transgenic Res.2(1993)，227-237)、scFvs(Owen，Bio/Technology 10(1992)，790-794；Zimmermann，Mol.Breeding 4(1998)，369-379；Tavladoraki，Nature 366(1993)，469-472)和dAb(Benvenuto，Plant Mol.Biol.17(1991)，865-874)，达到占总蛋白质高达6.8％的表达水平(Fiedler，Immunotechnology 3(1997)，205-216)。

另外，可以使用编码依照本发明的酶的突变体形式的核酸分子来干扰野生型蛋白质的活性。此类突变体形式优选地已经丧失其活性，而且可以通过蛋白质的氨基酸序列中的氨基酸缺失、取代、和/或添加而从相应的野生型蛋白质衍生。在活性丧失外，此类蛋白质的突变体形式可以显示升高的底物亲和力和/或在细胞中升高的稳定性，例如由于掺入使蛋白质在细胞环境中稳定化的氨基酸所致。这些突变体形式可以是天然存在的，或者如优选的，经遗传工程化改造的突变体。

进一步涵盖的是，本发明的方法可以与用于增加和/或利用植物穗轴组织的淀粉含量的其它方法一起使用。应当认可，降低淀粉的磷酸化的任何机制可以导致淀粉在穗轴组织中的积累，包括抑制磷酸葡聚糖水双激酶(Kotting等(2005)Plant Physiology 137：242-252)。其它方法包括上调淀粉合成中涉及的酶，例如ADP-葡萄糖磷酸化酶和/或淀粉合酶的表达。

淀粉降解酶的核苷酸序列

已经在拟南芥叶中鉴定出淀粉降解酶的核苷酸序列。参见alpha-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、葡聚糖水双激酶(EC 2.7.9.4)、磷酸葡聚糖水双激酶(EC 2.7.9.4)、极限糊精酶(EC 3.2.1.142)、异淀粉酶(EC 3.2.1.68和EC3.2.1.68)、beta-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、葡聚糖磷酸化酶(EC2.4.1.1)和歧化酶(EC 2.4.1.25)。应当认可，可以使用这些序列来下调或阻抑靶基因在任何植物中的表达。然而，若需要其它植物特异性序列，则它可以使用上文所述的核苷酸序列通过杂交或PCR来获得。

来自其它植物的R1蛋白的核苷酸序列是本领域中已知的。参见例如美国申请公开文本No.2006/0282917的SEQ ID NO：1(玉蜀黍(Zea mays))；美国专利7,122,727的SEQ ID NO：1、4、5、6、7、和9(小麦)；通过提及而将其收入本文。应当认可，可以使用这些序列来下调或阻抑R1蛋白在任何植物中的表达。然而，若需要其它植物特异性序列(例如R1同系物)，则它可以使用基于上文所述的R1核苷酸序列的序列通过杂交或PCR来获得。

在PCR方法中，可以设计寡核苷酸引物以在PCR反应中使用，从而从自感兴趣的任何植物提取的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法一般是本领域中已知的。参见例如Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Plainview，New York)。还可参见Innis等编(1990)PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand编(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)；及Innis和Gelfand编(1999)PCR Methods Manual(Academic Press，New York)。

在杂交技术中，使用整个或部分的已知多核苷酸作为探针，其与存在于来自选定生物体的克隆基因组DNA片段或cDNA片段的群体(即基因组或cDNA文库)中的其它相应的多核苷酸选择性杂交。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其它寡核苷酸，并且可以用可检测基团诸如³²P，或任何其它可检测标志物来标记。用于制备供杂交用以及供构建cDNA和基因组文库用的探针的方法一般是本领域中已知的，并且披露于Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)中。

“与...杂交”或“与...特异性杂交”指分子仅与特定核苷酸序列在严格条件下在所述序列存在于复杂的混合物(例如总细胞)DNA或RNA中时结合、形成双链体、或杂交。“实质性结合”指探针核酸与靶核酸间的互补杂交，并且包含较少的错配，其可以通过降低杂交介质的严格性以实现靶核酸序列的期望的检测来容纳。

“严格杂交条件”和“严格杂交清洗条件”在核酸杂交实验诸如Southern和Northern杂交的语境中是序列依赖性的，并且在不同环境参数下是不同的。较长的序列在较高温度时特异性杂交。核酸杂交的广泛指导参见Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes第I部分第2章“Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”Elsevier，New York。一般地，高严格杂交和清洗条件选择为比特定序列在限定离子强度和pH的热熔点(T_m)低5℃。通常，在“严格条件下”，探针会与其目标亚序列而非其它序列杂交。

T_m指50％的靶序列与完美匹配的探针杂交的温度(在限定的离子强度和pH)。非常严格的条件选择为等于特定探针的T_m。用于在Southern或Northern印迹中的滤膜上具有超过100个互补残基的互补核酸的杂交的严格杂交条件的例子是于42℃的含1mg肝素的50％甲酰胺，其中实施杂交过夜。高严格清洗条件的例子是0.1 5M NaCl于72℃持续约15分钟。严格清洗条件的例子是0.2X SSC清洗于65℃持续15分钟(关于SSC缓冲液的描述，参见Sambrook，见下文)。经常，高严格性清洗之前有低严格性清洗以除去背景探针信号。针对例如超过100个核苷酸的双链体的典型中等严格性清洗是1X SSC于45℃持续15分钟。针对例如超过100个核苷酸的双链体的典型低严格性清洗是4-6X SSC于40℃持续15分钟。对于短探针(例如约10至50个核苷酸)，严格条件通常涉及小于约1.0M Na离子，通常于pH 7.0至8.3的约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)的盐浓度，并且温度通常是至少约30℃。还可以通过添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现严格条件。一般地，在特定杂交测定法中对无关探针观察到的信噪比的2X(或更高)的信噪比指示特定杂交的检出。在严格条件下彼此不杂交的核酸仍基本上相同，若它们编码的蛋白质基本上相同的话。例如，这在使用遗传密码容许的最大密码子简并性来创建核酸的拷贝时发生。

以下是可以用于克隆作为本发明的参照核苷酸序列的同源物的核苷酸序列的杂交/清洗条件集的例子：参照核苷酸序列优选地在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中于50℃与参照核苷酸序列杂交，在2X SSC，0.1％SDS中于50℃清洗，更期望地在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中于50℃杂交，在1X SSC，0.1％SDS中于50℃清洗，更期望地仍在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中于50℃中杂交，在0.5X SSC，0.1％SDS中于50℃清洗，优选地在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中于50℃杂交，在0.1X SSC，0.1％SDS中于50℃清洗，更优选地在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中于50℃杂交，在0.1X SSC，0.1％SDS中于65℃清洗。

植物表达盒

另外，本发明的组合物可以含有用于在感兴趣的植物中转化和表达的核酸序列。核酸序列可以存在于DNA构建体或表达盒中。如本文中所使用的，“表达盒”指能够指导特定核苷酸序列在合适的宿主细胞中表达的核酸分子，其包含与感兴趣的核苷酸序列(即R1抑制性多核苷酸)可操作连接的启动子，所述感兴趣的核苷酸序列与终止信号可操作连接。它通常还包含核苷酸序列的正确翻译所需要的序列。编码区通常编码感兴趣的蛋白质，但是也可以以有义或反义方向编码感兴趣的功能性RNA，例如反义RNA或非翻译RNA。包含感兴趣的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，这意味着至少一种其构件对于至少一种其其它构件而言是异源的。编码盒也可以是天然存在的，但是已经以可用于异源表达的重组形式获得的。然而，通常，编码盒对于宿主而言是异源的，即表达盒的特定DNA序列不在宿主细胞中天然存在，而且必须已经通过转化事件来导入宿主细胞或宿主细胞的祖先中。表达盒中的核苷酸序列的表达可以在组成性启动子或诱导型启动子的控制下，所述诱导型启动子仅在宿主细胞被暴露于一些特定外部刺激物时才启动转录。另外，启动子对特定组织或器官或发育阶段也可以是特异性的。

本发明涵盖用表达盒转化植物，所述表达盒能够表达降低或消除一种或多种淀粉降解酶的活性的多核苷酸。表达盒在转录的5’-3’方向会包括转录和翻译启动区(即启动子)和感兴趣的多核苷酸，即能够直接或间接(经由蛋白质产物的表达)降低或消除一种或多种淀粉降解酶的活性的多核苷酸。任选地，表达盒可以包含植物中有功能的转录和翻译终止区(即终止区)。在一些实施方案中，表达盒包含选择标志基因以容许选择稳定的转化体。本发明的表达构建体还可以包含前导序列和/或容许感兴趣的多核苷酸诱导型表达的序列。关于容许诱导型表达的序列的例子，参见Guo等(2003)Plant J.34：383-92和Chen等(2003)Plant J.36：731-40。

表达构建体的调节序列与感兴趣的多核苷酸可操作连接。“可操作连接”意指启动子与第二序列间的功能性连接，其中所述启动子序列启动并介导与第二序列对应的DNA序列的转录。一般地，可操作连接意指所连接的核苷酸序列是连续的。

可以在本发明的实施中使用能够在感兴趣的植物中驱动表达的任何启动子。启动子对于植物宿主而言可以是天然的或类似的或外来的或异源的。术语“异源的”和“外源的”在本文中用于提及核酸序列(例如DNA或RNA序列)或基因时指源自对于特定宿主细胞而言外来来源的，或者如果来自相同来源，自其初始形式修饰的序列。如此，宿主细胞中的异源基因包括对于特定宿主细胞而言内源的，但是已经经由例如使用DNA改组来修饰的基因。该术语还包括天然存在的DNA序列的非天然存在的多个拷贝。如此，该术语指对于细胞而言外来的或异源的，或者对于细胞而言同源的，但是在宿主细胞核酸内通常没有找到元件的位置中发现的DNA区段。表达外源DNA区段以产生外源多肽。

“同源”核酸(例如DNA)序列是与其所导入的宿主细胞天然关联的核酸(例如DNA或RNA)序列。

要包括的启动子的选择取决于数项因素，包括但不限于效率、选择性、诱导性、期望的表达水平、和细胞或组织优先性表达。通过相对于序列适当地选择并放置启动子和其它调节区来调节所述序列的表达对于本领域技术人员是常规的事情。

一些合适的启动子仅或主要在某些细胞类型中启动转录。如此，如本文中所使用的，细胞类型或组织优先性启动子是优先在靶组织中驱动表达，但是也可以在其它细胞类型或组织中导致一些表达的。应当理解，在靶组织中优先靶向表达的一些启动子也可以在非优先的靶定组织中展现出“泄露”表达。一个例子可以是如下的启动子，其表达谱在玉米种子中显示优先性表达，然而在成熟的叶组织中也展现出强烈的表达。用于鉴定和表征植物基因组DNA中的启动子区的方法包括例如那些记载于下列参照文献的：Jordano，等，Plant Cell，1：855-866(1989)；Bustos，等，Plant Cell，1：839-854(1989)；Green，等，EMBO J.7，4035-4044(1988)；Meier，等，Plant Cell，3，309-316(1991)；及Zhang，等，Plant Physiology 110：1069-1079(1996)。

在光合组织中显示优选的活性且在穗轴组织中具有一些活性的启动子在本发明的一些实施方案中可以是有用的。启动子可以在整个植物中组成性，或者在植物穗轴组织方面差异地，或者在发生表达的植物穗轴组织的发育阶段方面差异地，或响应外部刺激而赋予表达。

此类启动子的例子包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RbcS)启动子诸如来自北美落叶松(eastern larch，Larix laricina)的RbcS启动子、松cab6启动子(Yamamoto等(1994)Plant Cell Physiol.35：773-778)、来自小麦的Cab-1基因启动子(Fejes等(1990)Plant Mol.Biol.15：921-932)、来自菠菜的CAB-1启动子(Lubberstedt等(1994)Plant Physiol.104：997-1006)、来自稻的cab1R启动子(Luan等(1992)Plant Cell 4：971-981)、来自玉米的丙酮酸正磷酸双激酶(PPDK)启动子(Matsuoka等(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90：9586-9590)、烟草Lhcb1*2启动子(Cerdan等(1997)Plant Mol.Biol.33：245-255)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)SUC2蔗糖-H+同向转运体启动子(Truernit等(1995)Planta 196：564-570)、和来自菠菜的类囊体膜蛋白启动子(psaD，psaF，psaE，PC，FNR，atpC，atpD，cab，rbcS)。在茎、叶和绿色组织中驱动转录的其它启动子记载于美国专利公开文本No.2007/0006346，通过提及而将完整收入本文。

在本发明的一些其它实施方案中，诱导型启动子可以是期望的。诱导型启动子响应外部刺激诸如化学剂或环境刺激而驱动转录。例如，诱导型启动子可以响应激素诸如赤霉酸或乙烯，或者响应光或干旱而赋予转录。也可以在本发明中使用衰老诱导型启动子以在植物的特定发育阶段阻抑淀粉降解酶，从而淀粉在特定时间在植物穗轴组织中积累。一个例子会是在种子胚乳成熟后在玉米穗轴中抑制或阻抑淀粉降解酶。可以在本发明的多个实施方案中使用的诱导型启动子的一些其它例子可以参见Journal of ExperimentalBotany 200859(2)：377-387；根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)ipt基因在小麦中的衰老诱导的异位表达延迟叶衰老，提高细胞分裂素含量、硝酸盐流入、和硝酸盐还原酶活性，但是不影响谷粒产率，Blanka S korová1，Gabriela Kure ová2，Sasha Daskalova3，*，Marie Tr ková2，Klára Hoyerová1，Ivana Raimanová2，Václav Motyka1，Alena Trávní ková1，Malcolm C.Elliott3和Miroslav Kamínek1，PNAS 2007年12月4日第104卷no.49 19631-19636 Delayed leaf senescenceinduces extreme drought tolerance in a flowering plant，及Rosa M.Rivero*，Mikiko Kojima

Amira GepsteinHitoshi Sakakibara

Ron Mittler§

ShimonGepstein

和Eduardo Blumwald，Plant Physiol.(1999)120：1015-1024，通过提及而将它们都收入本文。

多种转录终止子可用于在表达盒中使用。这些负责终止转基因外的转录，并改正mRNA聚腺苷酸化。终止区对于转录起始区而言可以是天然的，对于可操作连接的感兴趣的DNA序列可以是天然的，对于植物宿主而言可以是天然的，或者可以源自另一种来源(即对于启动子、感兴趣的DNA序列、植物宿主、或其任意组合而言是外来或异源的)。合适的转录终止子是那些已知在植物中发挥功能的，并且包括CAMV 35S终止子、tml终止子、胭脂氨酸合酶终止子和豌豆rbcs E9终止子。这些可以在单子叶植物和双子叶植物两者中使用。另外，可以使用基因的天然转录终止子。

一般地，表达盒会包含用于选择经转化的细胞的选择标志基因。利用选择标志基因来选择经转化的细胞或组织。

已经发现了许多序列增强来自转录单元内的基因表达，并且这些序列可以与本发明的基因一起使用以提高其在转基因植物中的表达。

已经显示了多种内含子序列增强表达，特别在单子叶植物细胞中。例如，已经发现了玉米Adhl基因的内含子在其关联的启动子下在导入玉米细胞中时显著提高野生型基因的表达。发现内含子1是特别有效的，并且在具有氯霉素乙酰转移酶基因的融合构建体中增强表达(Callis等，Genes Develop.1：1183-1200(1987))。在相同的实验系统中，来自玉米bronze 1基因的内含子在增强表达方面具有相似的效果。已经将内含子序列常规地掺入植入转化载体中，通常在非翻译前导内。

还已知源自病毒的许多非翻译前导序列增强表达，并且这些在双子叶植物细胞中是特别有效的。具体地，已经显示了来自烟草花叶病毒(TMV，“W-序列”)、玉米褪绿斑点病毒(MCMV)、和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列在增强表达方面是有效的(例如Gallie等Nucl.Acids Res.15：8693-8711(1987)；Skuzeski等Plant Molec.Biol.15：65-79(1990))。本领域中已知的其它前导序列包括但不限于：小RNA病毒前导，例如EMCV前导(脑心肌炎5’非编码区)(Elroy-Stein，O.，Fuerst，T.R.，和Moss，B.PNAS USA 86：6126-6130(1989))；马铃薯Y病毒组前导，例如TEV前导(烟草蚀刻病毒)(Allison等，1986)；MDMV前导(玉米矮缩花叶病毒)；Virology 154：9-20)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导(Macejak，D.G.，和Samow，P.，Nature 353：90-94(1991)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻译前导(Jobling，S.A.，和Gehrke，L.，Nature 325：622-625(1987)；烟草花叶病毒前导(TMV)，(Gallie，D.R.等，Molecular Biology of RNA，第237页-第256页(1989)；和玉米褪绿斑点病毒前导(MCMV)(Lommel，S.A.等，Virology 81：382-385(1991)。还可参见Della-Cioppa等，Plant Physiology 84：965-968(1987)。

已知用于靶向基因产物的多种机制存在于植物中，而且已经相当详细地表征了控制这些机制发挥功能的序列。例如，对叶绿体靶向基因产物受多种蛋白质的氨基端末端处找到的信号序列控制，所述信号序列在叶绿体输入期间被切割以产生成熟的蛋白质(例如Comai等J.Biol.Chem.263：15104-15109(1988))。这些信号序列可以与异源基因产物融合以实现异源产物向叶绿体中的输入(van den Broeck，等Nature 313：358-363(1985))。可以自编码RUBISCO蛋白、CAB蛋白、EPSP合酶酶、GS2蛋白和已知定位于叶绿体的许多其它蛋白质的cDNA的5’端分离编码合适的信号序列的DNA。还可参见，美国专利No.5,639,949的实施例37中题目为“Expression WithChloroplast Targeting”的部分。

上文所描述的细胞靶向机制不仅可以与其关联的启动子一起利用，而且还可以与异源启动子一起利用，从而在启动子的转录调节下实现特定细胞靶向目标，所述启动子与靶向信号来源的启动子具有不同表达样式。

为了确保在质体中的定位，想到使用下列转运肽之一：菠菜的质体铁氧还蛋白：NADP+氧化还原酶(FNR)的，其包含在Jansen等(Current Genetics 13(1988)，517-522)中。具体地，可以使用范围为其中所披露的cDNA序列的核苷酸-171至165的序列，其包含5’非翻译区及编码转运肽的序列。另一个例子是玉米蜡样蛋白的转运肽，包括成熟蜡样蛋白的前34个氨基酸残基(Klosgen等，Mol.Gen.Genet.217(1989)，155-161)。也有可能使用没有成熟蛋白质的前34个氨基酸的此转运肽。此外，可以使用二磷酸核酮糖羧化酶小亚基(Wolter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)，846-850；Nawrath等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(1994)，12760-12764)、NADP苹果酸脱氢酶(Galiardo等，Planta 197(1995)，324-332)、谷胱甘肽还原酶(Creissen等，Plant J.8(1995)，167-175)或R1蛋白(Lorberth等Nature Biotechnology 16，(1998)，473-477)的信号肽。

植物转化

一旦将抑制淀粉降解酶的核酸序列克隆到表达系统中，便将其转化入植物细胞中。可以以多种本领域公认的方式将本发明的受体和靶标表达盒导入植物细胞中。术语“导入”在多核苷酸(例如感兴趣的核苷酸构建体)的语境中意图指以使多核苷酸进入植物细胞内部的方式对植物呈现多核苷酸。在要导入超过一种多核苷酸的情况中，这些多核苷酸可以作为单一核苷酸构建体的一部分，或者作为不同核苷酸构建体装配，而且可以位于同一或不同转化载体上。因而，可以在单一转化事件中、在不同转化事件中，或者例如在植物中作为育种方案的一部分将这些多核苷酸导入感兴趣的宿主细胞中。本发明的方法不依赖于用于将一种或多种多核苷酸导入植物中的特定方法，只要多核苷酸进入植物的至少一个细胞的内部。用于将多核苷酸导入植物中的方法是本领域中已知的，包括但不限于瞬时转化方法、稳定转化方法、和病毒介导的方法。

“瞬时转化”在多核苷酸的语境中意图指将多核苷酸导入植物中，并且其不整合到植物的基因组中。

“稳定导入”在导入植物中的多核苷酸的语境中意图将导入的多核苷酸稳定地掺入植物基因组中，并且如此用多核苷酸稳定地转化植物。

“稳定转化”意图指导入植物中的多核苷酸，例如本文中所描述的核苷酸构建体整合到植物的基因组中，而且能够被其后代，更特别是，多个连续世代的后代继承。

多种可用于植物转化的转化载体是植物转化领域中的普通技术人员已知的，并且属于本发明的基因可以与任何此类载体一起使用。载体的选择会取决于优选的转化技术和供转化用的靶标物种。对于某些靶标物种，不同抗生素或除草剂选择标志可以是优选的。转化中常规使用的选择标志包括nptll基因(其赋予对卡那霉素或相关抗生素的抗性)(Messing和Vierra.Gene 19：259-268(1982)；Bevan等，Nature 304：184-187(1983))、bar基因(其赋予对除草剂草胺膦的抗性)(White等，Nucl.Acids Res 18：1062(1990)，Spencer等Theor.Appl.Genet 79：625-631(1990))、hph基因(其赋予对抗生素潮霉素的抗性)(Blochinger和Diggelmann，Mol Cell Biol 4：2929-2931)、和dhfr基因(其赋予对甲氨蝶呤的抗性)(Bourouis等，EMBO J.2(7)：1099-1104(1983))、EPSPS基因(其赋予对草甘膦的抗性)(美国专利No.4,940,935和5,188,642)、和甘露糖-6-磷酸异构酶基因(其提供代谢甘露糖的能力)(美国专利No.5,767,378和5,994,629)。

用于再生植物的方法也是本领域中公知的。例如，已经利用Ti质粒载体来递送外来DNA，以及直接的DNA摄取、脂质体、电穿孔、微注射、和微粒。另外，可以利用来自土壤杆菌属(Agrobacterium)的细菌来转化植物细胞。下文是用于转化单子叶植物和双子叶植物两者的代表性技术及代表性质粒转化技术的描述。

许多载体可用于使用根癌土壤杆菌的转化。这些通常携带至少一个T-DNA边界序列，并且包括诸如pBIN19的载体(Bevan，Nucl.Acids Res.(1984))。对于构建可用于根癌土壤杆菌的载体，参见例如美国专利申请公开文本No.2006/0260011，通过提及而将其收入本文。

在不使用根癌土壤杆菌的情况下的转化回避对选定转化载体中的T-DNA序列的需要，因此在诸如含有T-DNA序列的上文所描述的载体外，可以利用缺乏这些序列的载体。不依赖于土壤杆菌的转化技术包括经由颗粒轰击、原生质体摄取(例如PEG和电穿孔)和微注射的转化。载体的选择很大程度上取决于所转化的物种的优选的选择。对于构建此类载体，参见例如美国申请No.20060260011，通过提及而将其收入本文。

用于双子叶植物的转化技术是本领域中公知的，并且包括基于土壤杆菌的技术和不需要土壤杆菌的技术。非土壤杆菌技术涉及原生质体或细胞直接摄取外源遗传物质。这可以通过PEG或电穿孔介导的摄取、颗粒轰击介导的递送、或微注射来实现。Paszkowski等，EMBO J.3：2717-2722(1984)，Potrykus等，Mol.Gen.Genet.199：169-177(1985)，Reich等，Biotechnology 4：1001-1004(1986)，及Klein等，Nature 327：70-73(1987)描述了这些技术的例子。在每种情况中，使用本领域中已知的标准技术将经转化的细胞再生成全植物。

土壤杆菌介导的转化由于其较高的转化效率及其对许多不同物种的宽效用而成为一种用于转化双子叶植物的优选的技术。土壤杆菌转化通常涉及将携带感兴趣的外来DNA的二元载体(例如pCIB200或pCIB2001)转移到合适的土壤杆菌菌株，其可以依赖于由宿主土壤杆菌菌株在共驻留的Ti质粒上或染色体携带的vir基因的互补物(例如对于pCIB200和pCIB2001为菌株CIB542(Uknes等Plant Cell 5：159-169(1993))。对土壤杆菌转移重组二元载体使用携带重组二元载体的大肠杆菌、辅助大肠杆菌菌株(其携带质粒诸如pRK2013，而且其能够使重组二元载体移动到靶标土壤杆菌菌株)通过三亲本杂交规程来实现。或者，可以通过DNA转化来将重组二元载体转移到土壤杆菌(Hofgen和Willmitzer，Nucl.Acids Res.16：9877(1988))。

通过重组土壤杆菌来转化靶标植物物种通常涉及共培养土壤杆菌与来自植物的外植体，并遵循本领域公知的方案。在选择培养基上再生经转化的组织，其携带存在于二元质粒T-DNA边界间的抗生素或除草剂抗性标志物。土壤杆菌介导的原位(In Planta)转化系统也对拟南芥(Arabidopsis)常规使用(Bechtold等CR Acad.Sci III.Sci Vie 316：1194-1199(1993)，而且可以对欧洲油菜(Brassica napus)使用(Wang W.C.等Plant Cell Report 22：274-281(2003)。

用基因转化植物细胞的另一种方法涉及在植物组织和细胞处推进惰性或生物学活性颗粒。此技术披露于均为Sanford等的美国专利No.4,945,050、5,036,006、和5,100,792。一般地，此规程涉及在有效穿透细胞外膜并在其内部内提供掺入的条件下在细胞处推进惰性或生物学活性颗粒。在利用惰性颗粒时，可以通过用含有期望基因的载体包被颗粒来将载体导入细胞中。或者，靶细胞可以被载体环绕，从而通过激发颗粒来将载体携带到细胞中。也可以将生物学活性颗粒(例如干的酵母细胞、干的细菌或噬菌体，其各自含有设法导入的DNA)推入植物细胞组织中。

大多数单子叶植物物种的转化现在也已经变得常规。优选的技术包括使用PEG或电穿孔技术来对原生质体进行直接基因转移，和对愈伤组织的颗粒轰击。可以用单一DNA种类或多个DNA种类(即共转化)来进行转化，并且这两种技术都合适于与本发明一起使用。共转化可以具有避免完整载体构建和生成在感兴趣的基因和选择标志方面具有未连接的基因座(使选择标志能够在随后的世代中被除去，若这被认为是期望的话)的转基因植物的优点。然而，使用共转化的缺点在于不同DNA种类整合入基因组中的小于100％的频率(Schocher等Biotechnology 4：1093-1096(1986))。

专利申请EP 0292435、EP 0392225、和WO 93/07278描述了自玉米的良种近交系制备愈伤组织和原生质体、使用PEG或电穿孔来转化原生质体、和自经转化的原生质体再生玉米植物的技术。Gordon-Kamm等(Plant Cell 2：603-618(1990))和Fromm等(Biotechnology 8：833-839(1990))已经发表了使用颗粒轰击来转化A188衍生的玉米系的技术。此外，WO 93/07278和Koziel等(Biotechnology 11：194-200(1993))描述了通过颗粒轰击来转化玉米良种近交系的技术。此技术利用自传粉后14-15天的玉米穗切出的1.5-2.5mm长度的未成熟的玉米胚和PDS-1000He生物射弹装置进行轰击。

稻的转化也可以利用原生质体或颗粒轰击通过直接基因转移技术来进行。已经对Japonica型和Indica型描述了原生质体介导的转化(Zhang等PlantCell Rep 7：379-384(1988)；Shimamoto等Nature 338：274-277(1989)；Datta等Biotechnology 8：736-740(1990))。这两种类型也是使用颗粒轰击常规可转化的(Christou等Biotechnology 9：957-962(1991))。此外，WO 93/21335描述了经由电穿孔来转化稻的技术。

专利申请EP 0332581描述了生成、转化和再生早熟禾亚科(Pooideae)原生质体的技术。这些技术容许转化鸭茅属(Dactylis)和小麦。此外，Vasil等(Biotechnology 10：667-674(1992))已经描述了使用对C型长期可再生愈伤组织的细胞进行颗粒轰击，以及Vasil等(Biotechnologyl 11：1553-1558(1993))和Weeks等(Plant Physiol.102：1077-1084(1993))也描述了使用未成熟胚和未成熟胚衍生的愈伤组织的颗粒轰击进行的小麦转化。然而，小麦转化的优选技术涉及通过未成熟胚的颗粒轰击来转化小麦，并且包括在基因投递前的高蔗糖或高麦芽糖步骤。在轰击前，将任何数目的胚(长0.75-1mm)铺板到具有3％蔗糖(Murashiga和Skoog，Physiologia Plantarum 15：473-497(1962))和3mg/l 2，4-D的MS培养基上以诱导体细胞胚，这容许在黑暗中进行。轰击的选定日当天，从诱导培养基取出胚，并将其铺板到渗压剂(即具有以期望的浓度，通常为15％添加的蔗糖或麦芽糖的诱导培养基)上。让胚进行质壁分离2-3小时，然后轰击。每个目标平板20个胚是通常的，尽管不是至关重要的。使用标准的规程将合适的携带基因的质粒(诸如pCIB3064或pSOG35)沉淀到微米大小的金颗粒上。使用约1000psi的爆破压力使用标准的80目筛用DuPont氦装置来射击胚的每个平板。轰击后，将胚放回到黑暗中以恢复约24小时(仍在渗压剂上)。24小时后，从渗压剂取出胚，并将其放回到诱导培养基上，在那里它们保持约1个月，之后再生。约1个月后，将具有形成中的胚发生愈伤组织的胚外植体转移到再生培养基(MS+1mg/升NAA，5mg/升GA)，其进一步含有合适的选择剂(在pCIB3064的情况中为10mg/l Basta及在pSOG35的情况中为2mg/l甲氨蝶呤)。在约1个月后，将形成的枝转移到称为“GA7s”的更大的无菌容器，其含有半强度MS、2％蔗糖、和相同浓度的选择剂。

使用土壤杆菌来转化单子叶植物也已经得到描述。参见WO 94/00977和美国专利No.5,591,616，通过提及而将这两篇都收入本文。还可参见Negrotto等，Plant Cell Reports 19：798-803(2000)，通过提及而将其收入本文。

例如，可以使用稻(Oryza sativa)来生成转基因植物。可以使用多种稻栽培种(Hiei等，1994，Plant Journal 6：271-282；Dong等，1996，Molecular Breeding2：267-276；Hiei等，1997，Plant Molecular Biology，35：205-218)。还有，下文所描述的多种培养基组分可以在数量上有所变化或者被替代。通过在MS-CIM培养基(MS基础盐，4.3g/升；B5维生素(200X)，5ml/升；蔗糖，30g/升；脯氨酸，500mg/升；谷氨酰胺，500mg/升；酪蛋白水解产物，300mg/升；2，4-D(1mg/ml)，2ml/升；用1N KOH将pH调节至5.8；植物凝胶，3g/升)上培养来启动胚发生响应和/或从成熟的胚建立培养物。将培养物响应的初始阶段的成熟胚或建立的培养系接种，并与含有期望的载体构建体的根癌土壤杆菌菌株LBA4404(土壤杆菌)共培养。于28℃从甘油贮液在固体YPC培养基(100mg/L大观霉素和任何其它合适的抗生素)上将土壤杆菌培养约2天。将土壤杆菌在液体MS-CIM培养基中重悬。将土壤杆菌培养物稀释到OD600为0.2-0.3，并添加乙酰丁香酮至终浓度200uM。在混合溶液与稻培养物前添加乙酰丁香酮以诱导土壤杆菌将DNA转移到植物细胞。对于接种，将植物培养物浸入细菌悬浮液中。取出液体细菌悬浮液，并将接种的培养物放置于共培养培养基上，并于22℃温育2天。然后，将培养物转移到具有替卡西林(400mg/升)的MS-CIM培养基以抑制土壤杆菌的生长。对于利用PMI选择标志基因的构建体(Reed等，(2002)In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 37：127-132)，在7天后，将培养物转移到含有甘露糖作为碳水化合物来源的选择培养基(具有2％甘露糖、300mg/升替卡西林的MS)，并在黑暗中培养3-4周。然后，将抗性菌落转移到再生诱导培养基(没有2，4-D，具有0.5mg/升IAA、1mg/升玉米素、200mg/升特美汀、2％甘露糖和3％山梨糖醇的MS)，并在黑暗中培养14天。然后，将增殖的菌落转移到另一轮再生诱导培养基，并移到光生长室。将再生的枝转移到具有GA7-1培养基(无激素而具有2％山梨糖醇的MS)的容器达2周，然后在它们足够大并具有足够的根时移到温室。将植物移植到温室中的土壤(以生成)，培养至成熟，并收获T₁种子。

经由用本发明的核酸序列进行的转化获得的植物可以是极其多种植物物种之任一种；然而，在本发明的方法中使用的植物优选地选自上文所列的农艺学上重要的目标作物的列表。可以经由育种将与对于产量和质量重要的其它特征组合的本发明的基因的表达掺入植物品系中。育种方法和技术是本领域中已知的。参见例如Welsh J.R.，Fundamentals of Plant Genetics andBreeding，John Wiley&Sons，NY(1981)；Crop Breeding，Wood D.R.(编)American Society of Agronomy Madison，Wis.(1983)；Mayo O.，The Theory ofPlant Breeding，第二版，Clarendon Press，Oxford(1987)；Singh，D.P.，Breedingfor Resistance to Diseases and Insect Pests，Springer-Verlag，NY(1986)；及Wricke and Weber，Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding，Walter deGruyter and Co.，Berlin(1986)。

对于质体的转化，在T琼脂培养基上的1”环形阵列中以每平板7个使烟草(Nicotiana tabacum)“Xanthienc”栽培种的种子发芽，并在播种后12-14天用经来自质粒pPH143和pPH145的DNA包被的1um钨颗粒(M10，Biorad，Hercules，Calif.)轰击，基本上如描述的(Svab，Z.和Maliga，P.(1993)PNAS 90，913-917)。将经轰击的幼苗在T培养基上温育2天，之后切下叶，并将其在亮光(350-500umol光子/m2/s)中在含有500ug/ml二盐酸大观霉素(Sigma，St.Louis，Mo.)的RMOP培养基(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.和Maliga，P.(1990)PNAS 87，8526-8530)的平板上背轴侧向上放置。将轰击后3-8周出现在漂白的叶下面的抗性枝亚克隆到相同的选择培养基上，容许其形成愈伤组织，并将二级枝分离并亚克隆。通过Southern印迹的标准技术(Sambrook等，(1989)MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor)来评估独立亚克隆中的经转化的质体基因组拷贝的完全分离(同质性)。将经BamHI/EcoRI消化的总细胞DNA(Mettler，I.J.(1987)Plant Mol BiolReporter 5，346349)在1％Tris-硼酸盐(TBE)琼脂糖凝胶上分离，转移到尼龙膜(Amersham)，并用经³²P标记的随机引物DNA序列探查，所述随机引物DNA序列对应于来自含有rps 7/12质体靶向序列的一部分的pC8的0.7kbBamHI/HindIII DNA片段。将同质性枝在含有大观霉素的MS/IBA培养基(McBride，K.E.等(1994)PNAS 91，7301-7305)上在无菌条件下生根，并转移到温室。

通过有性生殖或营养生长来传递工程化改造入上文所描述的转基因种子和植物中的遗传特性，并且如此可以在后代植物中得到维持并增殖。一般地，维持和增殖利用为了满足特定目的而开发的已知农业方法诸如耕作、播种或收获。

可以在植物育种中进一步利用依照本发明的转基因植物和种子的有益遗传特性。根据期望的特性，采用不同育种措施。相关技术是本领域中公知的，并且包括但不限于杂交、近交、双单倍体、回交育种、多系育种、品种混和、种间杂交、非整倍体技术等。如此，可以使用依照本发明的转基因种子和植物来培育改良的植物品系，其例如提高常规方法诸如除草剂或杀虫剂处理的效率或者由于其经修饰的遗传特性而容许省去所述方法。

生物质转化

依照本发明转化的植物提供一种提高乙醇产率、降低预处理成本的手段，其通过降低生物质糖化的酸/热预处理需要；和/或降低其它植物生成和加工成本，诸如通过容许商业上有价值的副产物的多应用和分离来进行。

最近已经在本领域中开发了收集穗轴的收获方法。例如，通过经改良的联合收割机来收集加有仁的全穗轴。联合收割机可以修改为既收获穗轴又进一步在该联合收割机内的不同储存箱中剥离并贮存穗轴和种子。另一种方法可以是用联合收割机来收集加有仁的全穗轴，然后在乙醇生产厂分离仁和穗轴。另一种选项可以是使用常规的联合收割机，其将剥离的穗轴释放到附随的卡车床中。可以在生物质转化厂将完全的穗轴剥离仁，在生物质转化厂中将一条流(stream)中的玉米种子分级成其相对组分(例如胚乳、纤维、胚芽)。然后，可以将这些玉米种子组分进一步加工以生产商业产品。例如，可以在商业酵母发酵中利用经分级的玉米种子胚乳以生产乙醇。穗轴可以指向第二条流，在那里其可以进行或不进行预处理，然后进行发酵以生成有利的商业产品(例如乙醇、丁醇)。另一种方法可以是在单一批次中发酵加有仁的全穗轴。以下发明的实施方案可以是在上文所提及的任何方法中使用具有增加的淀粉的穗轴。另一个实施方案可以是使加有仁的全穗轴能够经由单一批次方法而转化成商业产品(例如乙醇)，其中研磨具有升高水平的淀粉和仁的全穗轴，并将其在生物转化中进一步糖化并发酵。另一个实施方案可以是加工要在动物饲料中使用的具有水平升高的淀粉和仁的全穗轴。另一个实施方案可以是收获要在生物质转化法中进一步利用的含有水平升高的淀粉的整个地上植物部分、含有水平升高的淀粉的穗轴和玉米种子。在一个实施方案中，可以期望在多穗玉米品种中实施本发明。在又一个实施方案中，可以使用具有增加的淀粉含量的穗轴作为表达大量酶的组织以生成商业酶。例如，可以在含有提高量的淀粉的穗轴中以高水平表达纤维素酶或淀粉酶，接着进行加工以从所述穗轴提取供商业销售的酶。另外，淀粉可以在生物质转化应用中添加额外的价值。

预处理。常规的方法包括物理、化学、和/或生物预处理。例如，物理预处理技术可以包括多种类型的碾磨、碾碎、照射、蒸/蒸汽爆发、和水热解之一种或多种。化学预处理技术可以包括酸、碱、有机溶剂、氨水、二氧化硫、二氧化碳、和pH受控的水热解。生物预处理技术可以涉及应用木质素溶解性微生物(T.-A.Hsu，“Handbook on Bioethanol.Production and Utilization”，C.E.Wyman(编)，1996，Taylor和Francis：Washington，D.C.，179-212；P.Ghosh和A.Singh，A.，Adv.Appl.Microbiol.，1993，39：295-333；J.D.McMillan，于“Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production”，M.Himmel等，(编)，1994，第15章，ACS Symposium Series 566，American Chemical Society：B.Hahn-Hagerdal，Enz.Microb.Tech.，1996，18：312-331；及L.Vallander和K.E.L.Eriksson，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.，1990，42：63-95)。预处理步骤的目的是分解木质素和碳水化合物结构以使纤维素级分接近纤维素分解酶。本申请的一个实施方案可以是通过使用具有升高的淀粉水平的穗轴来缩短或摆脱穗轴预处理步骤。另一个实施方案可以是在穗轴或种子中表达加工酶，其会将复杂的分子进一步加工成要在生物质转化法中使用的单糖。另一个实施方案可以是在穗轴或种子中表达加工酶，其预处理复杂的分子以更快地转化成要在生物质转化法中使用的可发酵糖。例如，可以工程化改造转基因玉米植物，其中转基因玉米植物的穗轴具有通过下调淀粉水解酶实现的水平升高的淀粉，将转基因植物进一步工程化改造成在穗轴或玉米种子中表达加工酶(例如alpha-淀粉酶、纤维素酶)，其中基本上如上文所描述的那样发酵加有种子的全穗轴或自穗轴分离的种子。可以在碾磨和加工条件后活化加工酶。另一个实施方案可以是如U.S.2006/0260011(通过提及而将其收入本文)中所描述的那样工程化改造低木质素穗轴以具有水平升高的淀粉。具有提高量的淀粉的低木质素穗轴在青贮饲料、生物质转化法中及在动物饲料中可以是有用的。

糖化。在糖化(或酶促水解)中，通过存在于预处理材料中或外源添加的木质纤维素分解酶来将木质纤维素转化成可发酵糖。糖化一般在搅拌罐反应器或发酵罐中在受控的pH、温度、和混合条件下进行。糖化步骤可以持续多达200小时。糖化可以于约30℃至约65℃，特别是50℃左右的温度，以及在范围为约4和约5之间，特别是pH 4.5左右的pH实施。可以对全部预处理材料进行糖化。本申请的实施方案可以是进一步工程化改造具有增加的淀粉的穗轴以表达一种或多种加工酶，从而加速糖化或使该方法更有效。另一个实施方案可以是在方法中使用加有完整的仁的具有增加的淀粉含量的全穗轴以在玉米种子中表达一种或多种加工酶，并进行加有仁的全穗轴的糖化。可以在碾磨和加工条件后活化加工酶。

发酵。在发酵步骤中，通过发酵微生物诸如酵母和/或细菌将由于预处理和酶促水解步骤而自木质纤维素释放的糖发酵成一种或多种有机物质，例如乙醇。也可以在相同容器中，再次在受控的pH、温度和混合条件下与酶促水解同时实施发酵。在相同容器中同时实施糖化和发酵时，方法一般称作同时糖化和发酵或SSF。可以组合C6糖的SSF、C5和C6糖的SSCF或同时糖化和共发酵。

发酵微生物及其在乙醇生产中的使用方法是本领域中已知的(Sheehan，“The road to Bioethanol：A strategic Perspective of the US Department ofEnergy’s National Ethanol Program”于：“Glucosyl Hydrolases For BiomassConversion”，ACS研讨会系列769，2001，美国化学学会：Washington，D.C.)。利用玉米粒作为生物质的现有乙醇生产方法通常涉及使用酵母，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株。可以在本发明的方法中利用此类菌株。虽然此类菌株对于从源自降解纤维素和/或淀粉的葡萄糖生成乙醇可以是优选的，但是本发明的方法不依赖于特定微生物或其菌株，或所述微生物和所述菌株的任何特定组合的使用。

通常将酵母或其它微生物添加至水解产物，并让发酵进行24-96小时，诸如35-60小时。发酵温度通常在26-40℃之间，诸如32℃，并在3和6之间的pH，诸如约pH 4-5。

可以使用发酵刺激物来进一步改善发酵方法，特别是发酵微生物的性能，诸如速率增强和乙醇产率。供生长用的发酵刺激物包括维生素和矿物质。维生素的例子包括多种维生素、生物素、泛酸盐、烟酸、内消旋肌醇、硫胺、吡哆醇、对氨苯甲酸、叶酸、核黄素、和维生素A、B、C、D、和E(Alfenore等，“Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae bya vitamin feeding strategy during fed-batch process”，2002，Springer-Verlag)。矿物质的例子包括矿物质和矿物盐，其可以供应包含磷酸盐、钾、锰、硫、钙、铁、锌、镁和铜的营养物。

回收。在发酵(或SSF)后，将醪液蒸馏以提取乙醇。可以获得具有大于96体积％的纯度的乙醇。

组合的淀粉水解和纤维素分解材料水解。可以在涉及组合的淀粉和纤维素材料水解的方法中使用本文中所公开的转基因植物和植物部分以实现增加的乙醇产率。在提供提高的乙醇产率外，可以在现有的基于淀粉的乙醇加工厂中进行这些方法。

淀粉是一种容易被水解成供发酵用的个别葡萄糖分子的葡萄糖聚合物。淀粉水解可以在存在淀粉分解微生物或酶诸如淀粉酶的情况中进行。在本发明的某些实施方案中，淀粉水解在存在至少一种淀粉酶的情况中进行。合适的淀粉酶的例子包括alpha-淀粉酶(其随机切割直链淀粉的alpha(1-4)糖苷连接以产生糊精、麦芽糖或葡萄糖分子)和葡糖淀粉酶(其切割直链淀粉和支链淀粉的.alpha.(1-4)和.alpha.(1-6)糖苷连接以产生葡萄糖)。

在发明方法中，淀粉的水解和纤维素材料的水解可以在相同条件下(例如在淀粉水解常用的条件下)同时地(即在同时)进行。或者，水解反应可以序贯进行(例如木质纤维素的水解可以在淀粉水解前进行)。在同时水解淀粉和纤维素材料时，条件优选地选择为促进淀粉降解，并活化木质纤维素分解酶以降解木质纤维素。可以改变以优化此类条件的因素包括对植物或植物部分的物理加工，和淀粉水解的反应条件诸如pH、温度、粘度、加工次数、和淀粉酶的添加。

该方法可以使用单独的转基因植物(或植物部分)或者非转基因植物(或植物部分)和依照本发明转化的植物(或植物部分)的混合物。合适的植物包括可以在基于淀粉的乙醇生产中采用的任何植物(例如玉米)。例如，可以使用本发明方法来提高来自玉米穗轴的乙醇产率。

本发明的植物在从植物生物质生成糖或生物燃料的生物质转化法中得到应用。在本文中，术语“生物燃料”指源自收获的植物部分的任何燃料。生物燃料包含但不限于生物柴油、植物油、生物醇(即乙醇、甲醇、丙醇、丁醇，等等)和沼气(即甲烷)。工程化改造本发明的植物以在其穗轴组织中积累更高浓度的淀粉，如此提供碳水化合物的丰富来源，然后可以将所述碳水化合物转化成生物燃料。在本文中，术语“游离糖”定义为源自植物生物质的任何碳水化合物，其可以进一步加工以生成可发酵糖、化学品、生物燃料、塑料、饲料添加剂或任何其它商业上重要的产品。本申请的一个实施方案提供了一种改善来自植物穗轴生物质的游离糖的产率的方法，包括操作植物以下调穗轴中的一种或多种淀粉降解酶的活性。所得的植物穗轴会含有水平升高的淀粉，然后可以在常规的生物质转化法中将其转化成游离糖。在本文中，术语“生物质转化法”定义为将植物部分转化成可发酵糖、生物燃料、化学品、塑料、饲料添加剂、或任何其它商业上重要的产品的任何方法。生物质转化法还可以包括本文中称为“非动物饲料生物质转化法”的亚种类。非动物饲料生物质转化法定义为将植物部分转化成不是以动物消耗为目的的可发酵糖、生物燃料、化学品和塑料的任何方法。

本发明的组合物和方法可用于为果糖浆、特制糖生产右旋糖，及可用于通过淀粉发酵生成醇和其它终产物(例如有机酸、抗坏血酸、和氨基酸)(G.M.A van Beynum等编(1985)Starch Conversion Technology，Marcel DekkerInc.NY)。通过源自本发明植物的穗轴组织的淀粉的发酵实现的醇生成可以包括生成燃料醇或饮用醇。

在某些优选的实施方案中，醇会是乙醇。具体地，醇发酵生产方法以湿磨或干磨方法表征。在一些实施方案中，植物进行湿磨发酵方法，而在其它实施方案中，使用干磨方法。在某些实施方案中，可以使用粗淀粉水解方法来生成乙醇。另一个实施方案可以是在粗淀粉水解中利用的具有增加的淀粉含量且加有仁的全穗轴。另一个实施方案可以是在粗淀粉水解中添加一种或多种加工酶，所述粗淀粉水解含有具有增加的淀粉含量和仁的全穗轴。在其它实施方案中，可以将具有增加的淀粉含量且表达感兴趣的加工酶的经研磨穗轴研磨，并以供动物饲料用或在生物质转化法中使用的添加剂出售。

谷粒干磨涉及许多基础步骤，其通常包括：研磨、煮、液化、糖化、发酵及液体和固体的分离以生成醇和其它共产物。研磨植物材料且特别是全谷物颗粒，诸如玉米、高粱、小麦或黑麦。在一些情况中，可以首先将谷粒分级成组分部分。可以碾磨经研磨的植物材料以获得粗的或细的颗粒。将经研磨的植物材料与浆罐中的液体混合。将浆体与液化酶(例如alpha淀粉酶)一起在喷射式蒸煮锅中进行高温以将谷物中的淀粉溶解并水解成糊精。将混合物冷却，并用糖化酶进一步处理以生成葡萄糖。然后，在存在发酵微生物诸如乙醇生成微生物且特别是酵母(酵母属的种)的情况中将含有葡萄糖的醪液发酵约24至120小时。从液相分离醪液中的固体，并获得醇诸如乙醇和有用的共产物诸如酒糟(distillers’grains)。在一个实施方案中，对干磨厂添加具有增加的淀粉的穗轴可以在动物饲料和可用的营养物方面提高DDGS的质量。

在一些实施方案中，组合糖化步骤和发酵步骤，并且该方法称为同时糖化和发酵或同时糖化、酵母增殖和发酵。

在其它实施方案中，可以消除煮步骤或将含有穗轴淀粉的底物暴露于在底物中的淀粉的凝胶化温度上的温度。在一些实施方案中的这些发酵方法包括碾磨谷物颗粒或分级的谷粒，并组合经研磨的谷物颗粒与液体以形成浆体，然后将其在单一容器中与淀粉酶、葡糖淀粉酶、和/或具有颗粒状淀粉水解活性的其它酶和酵母混合以生成乙醇和其它共产物(美国专利No.4,514,496、WO 04/081193和WO 04/080923)。在一些实施方案中，可用于发酵方法的酶包括alpha淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、环糊精糖基转移酶、脂肪酶、肌醇六磷酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角质酶(cutinase)、颗粒状淀粉水解酶和其它葡糖淀粉酶。

在另一个实施方案中，本发明涉及经转化的植物，其基因组用与启动子序列可操作连接的编码至少一种加工酶的重组多核苷酸提升(argument)，该多核苷酸的序列为了在植物中表达而进行优化。创建具有增加的穗轴淀粉的植物可以是有益的，所述植物已经进行过进一步的修饰以表达加工酶，其在活化时会能够自我加工其起作用的底物以获得期望的结果，如记载于US20030135885和US7102057的，通过提及而将其收入本文。在本文中，具有增加的淀粉并用加工酶进一步修饰的穗轴称为“具有增加的淀粉含量的自我加工的穗轴”。提供了生成具有增加的淀粉含量的自我加工穗轴的方法，其中植物或植物部分表达加工酶(例如alpha-淀粉酶、葡糖淀粉酶、纤维素酶、CBHI，等等)，其中在加工酶(嗜温性、嗜热性、或超嗜热性)的活化(例如碾磨、加水、pH)后，植物或植物部分能够自我加工其起作用的底物以获得期望的结果。在一些实施方案中，可以在具有增加的穗轴淀粉的玉米植物的其它植物部分(例如种子或绿色组织)中表达加工酶，其中与具有增加的淀粉的穗轴一起加工所述其它植物部分，如此使酶在加工后与穗轴淀粉接触。在另一个实施方案中，可以期望在一种作物植物中表达一种或多种加工酶，并在玉米植物中下调淀粉降解酶以生成具有增加的淀粉含量的穗轴。然后，可以将这些给料在生物质转化法中混合，其中加工酶会与其各自的底物接触，并在将两种给料加工(例如碾磨和混合)成单一液化后活化。

依照本发明，“自我加工”植物或植物部分已经将分离的多核苷酸掺入其中，所述分离的多核苷酸编码能够加工，例如修饰植物中的淀粉、多糖、脂质、蛋白质等的加工酶，其中加工酶可以是嗜温性、嗜热性或超嗜热性的，而且可以通过研磨、加水、加热、或在其它情况中提供对于酶功能有利的条件来活化。将编码加工酶的分离的多核苷酸整合入植物或植物部分中以在其中表达。在表达并活化加工酶后，本发明的植物或植物部分加工加工酶起作用的底物。因此，本发明的植物或植物部分能够在没有或具有减少的加工这些底物通常所需要的外部来源的情况中在活化其中含有的加工酶后自我加工酶的底物。因此，经转化的植物、经转化的植物细胞、和经转化的植物部分具有经由依照本发明掺入其中的酶来加工期望的底物的“嵌入的”加工性能。优选地，编码加工酶的多核苷酸是“遗传稳定的”，即多核苷酸在本发明的经转化的植物或植物部分中得到稳定维持，并经由连续世代被后代稳定继承。

依照本发明，采用此类植物和植物部分的方法可以消除在回收淀粉来源的产物前对碾磨或以其它方式物理破坏植物部分的完整性的需要。例如，本发明提供了用于加工穗轴以回收淀粉来源的产物的改良的方法。本发明还提供了一种容许回收淀粉颗粒的方法，所述淀粉颗粒在颗粒中或上含有足以在不需要添加外源生成的淀粉水解酶的情况中水解淀粉内的特定键的淀粉降解酶水平。本发明还提供了来自通过本发明的方法获得的自我加工植物或植物部分的改善的产物。

另外，“自我加工的”经转化的植物部分(例如穗轴)和经转化的植物避免关于现有技术的主要问题，即加工酶通常是通过微生物发酵生成的，这需要花钱自培养物上清液分离酶；分离的酶需要针对特定应用进行配制，并且必须开发添加酶、使酶与其底物混合和起反应的方法和仪器。本发明的经转化的植物或其部分也是加工酶自身及所述酶的底物和产物诸如糖、氨基酸、脂肪酸和淀粉和非淀粉多糖的来源。也可以采用本发明的植物来制备后代植物诸如杂种和近交物。

植物可以是单子叶植物，诸如玉米。优选地，植物是能源作物或商业上种植的植物。在本文中，术语“加工酶”选自下组：α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖异构酶、葡聚糖酶、β-淀粉酶、α-葡糖苷酶、异淀粉酶、支链淀粉酶、新支链淀粉酶(neo-pullulanase)、异支链淀粉酶、淀粉支链淀粉酶(amylopullulanase)、纤维素酶、外-1，4-β-纤维素生物水解酶、外-1，3-β-D-葡聚糖酶、β-糖苷酶、内切葡聚糖酶、L-阿拉伯糖酶、α-阿拉伯糖苷酶、半乳聚糖酶、半乳糖苷酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、木糖苷酶、蛋白酶、葡聚糖酶、酯酶、肌醇六磷酸酶、和脂肪酶。优选地，加工酶是一种选自下组的淀粉加工酶：α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖异构酶、β-淀粉酶、α-葡糖苷酶、异淀粉酶、支链淀粉酶、新支链淀粉酶、异支链淀粉酶、和淀粉支链淀粉酶。更优选地，该酶选自α-淀粉酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖异构酶、α-葡糖苷酶、和支链淀粉酶。加工酶进一步优选地是超嗜热的。依照本发明的此方面，酶可以是选自下组的非淀粉降解酶：蛋白酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、酯酶、肌醇六磷酸酶、和脂肪酶。此类酶可以进一步是超嗜热的。在一个优选的实施方案中，酶在植物的液泡、内质网、质外体、蛋白质贮存液泡、线粒体、叶绿体、淀粉粒、种子或细胞壁中积累。此外，在另一个实施方案中，可以用包含非超嗜热酶的第二重组多核苷酸来进一步提升植物的基因组。在另一个实施方案中，可以期望使用诸如WO2005/097999中提及的那些方法通过下调淀粉合酶IV和/或淀粉磷酸化酶来提高具有增加的淀粉的穗轴中的淀粉粒大小。在另一个实施方案中，可以期望修饰穗轴淀粉以生成独特的糖谱。

说明书中提及的所有出版物和专利申请指明本发明所属领域中的技术人员的技术水平。通过提及而将所有出版物和专利申请收入本文，其程度就像明确且个别指明通过提及而收入每篇个别的出版物或专利申请一样。

虽然为了理解清楚，已经通过例示和例子相当详细地描述了前述发明，但是应当明显的是，可以在所附权利要求书的范围内实施某些变化和修饰。

实施例

本发明会通过以下实施例来进一步描述，所述实施例并不意图以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：

转基因玉米植物的生成

构建8种RNAi盒来进行植物表达。这些盒设计为在玉米穗轴组织中下调酶α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡聚糖水双激酶(R1)、磷酸葡聚糖水双激酶(PWD)、和叶绿体α-淀粉酶(AMY3)。α-淀粉酶(Genbank登录号L25805)、β-淀粉酶(Genbank登录号Z25871)和α-葡聚糖水双激酶(R1，Genbank登录号CD973834)的玉蜀黍cDNA序列获自NCBI。基于针对玉米基因组序列的序列同源性来生成拟南芥叶绿体磷酸葡聚糖水双激酶(GenBank登录号AJ635427)的玉米直向同系物。同样地，基于针对玉米基因组序列的序列同源性来生成拟南芥Amy3(GenBank登录号NM105651)的玉米直向同系物。来自各基因的编码区的3’端的RNAi片段(495bp的α-淀粉酶，SEQ ID NO：1；500bp的β-淀粉酶，SEQ ID NO：2；330bp的R1，SEQ ID NO：3；320bp的PWD，SEQ ID NO：4；和320bp的AMY3，SEQ ID NO：5)是由Geneart(Geneart AG)合成的。在合成过程中，分别将attB1和attB2位点添加至这8种RNAi序列的5’和3’端。另外，在相对于RNAi序列的相应链上合成来自稻蔗糖合酶-1(RSs1)基因的内含子以在通过与相应的RNAi片段配对形成的发夹环中充当间隔物，如此为酶切丁酶(dicer)提供结合区。使用来自

克隆技术(Invitrogen Life Science)的BP反应将所有8种RNAi表达盒重组入pDONR221中。

目的载体15910是一种含有磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因的二元载体，所述磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因容许用甘露糖选择转基因细胞。载体15910还提供了使用

克隆技术(Invitrogen Life Science)来生成RNAi盒的方法。另外，目的载体15910含有双转录增强子(玄参花叶病毒(FMV)增强子)及花椰菜花叶病毒35s增强子。载体15910容许改变多种驱动RNAi盒在玉米穗轴组织中表达的启动子的手段。用于此研究的启动子是稻MADS-框13(OsMADS 13)启动子、玉米色氨酸合酶alpha亚基(TrpA)启动子、MADS-框14(OsMADS14)启动子和玉米Zm015970启动子。已经显示了进一步记载于公开文本US 2007/000634并在SEQ ID NO：6中描述的稻MADS-框13(OsMADS 13)启动子优选地在玉米穗轴组织中表达基因。预期如记载于Plant Mol Bio(1995)27：1183-1188的并如SEQ ID NO：7中所描述的玉米色氨酸合酶alpha亚基(TrpA)启动子优选在玉米植物的木髓和幼叶中驱动表达。如公开文本U.S.2007/0006344中所描述的并在SEQ I.D.NO：9中所描述的OsMADS14启动子优选地驱动转基因在玉米穗轴组织中的表达。基于玉米微阵列数据将如SEQID NO：8中所描述的玉米启动子Zm015970鉴定为穗轴优选性强启动子。与非穗轴组织相比由玉米穗轴中的Zm015970驱动的基因表达水平的比率是约7.9。Zm015970的启动子序列由Zm015970基因组克隆的2009bp 5’UTR、510bp的基因第一外显子、132bp的第一内显子、和19bp的第二外显子组成。

使用LR反应(

LR酶混合物，Invitrogen)来将由Geneart创建的Gateway进入RNAi盒(SEQ ID#s 10-17)重组入载体15910中，创建二元载体。通过限制性消化和测序来证实二元载体。

进行未成熟玉米胚的转化，基本上如记载于Negrotto等，Plant CellReports 19：798-803(2000)的。可以替换其中所描述的多种培养基组分。

于28℃将含有植物转化质粒的土壤杆菌菌株LBA4404(Invitrogen)在YEP(酵母提取物(5g/L)、胨(10g/L)、NaCl(5g/L)、15g/l琼脂，pH 6.8)固体培养基上培养2至4天。将约0.8X 109(0.8X 10⁹)个土壤杆菌在补充有100mM乙酰丁香酮(As)的LS-inf培养基(LSAs培养基)(Negrotto等，Plant Cell Rep19：798-803(2000))中悬浮。将细菌在此培养基中预诱导30-60分钟。

从8-12天龄穗切出来自玉米系A188或其它合适的玉米基因型的未成熟胚，进入液体LS-inf+100mMAs(LSAs)。将胚涡旋振荡5秒，并用新鲜的感染培养基漂洗一次。除去感染培养基，然后添加土壤杆菌溶液，并将胚涡旋振荡30秒，并容许其与细菌一起沉降5分钟。然后，将胚在盾片侧向上的情况中转移到LSAs培养基，并在黑暗中培养2-3天。随后，将每块培养板20-25个胚转移至补充有头孢噻肟(250mg/l)和硝酸银(1.6mg/l)的LSDc培养基(Negrotto等，Plant Cell Rep 19：798-803(2000))，并于28℃在黑暗中培养10天。

将生成胚发生愈伤组织的未成熟胚转移至LSD1M0.5S培养基(具有替换麦草畏(Dicamba)的0.5mg/l 2，4-D、10g/l甘露糖、5g/l蔗糖而无硝酸银的LSDc)。在此培养基上选择培养物达6周，其中在3周时进行传代培养步骤。将存活的愈伤组织转移至要扩大的LSD1M0.5S培养基或Reg1培养基(如记载于Negrotto等，Plant Cell Rep 19：798-803(2000)的)。在光(16小时光/8小时黑暗方案)中培养后，然后将绿色组织转移至没有生长调节剂的Reg2培养基(如记载于Negrotto等，Plant Cell Rep 19：798-803(2000)的)，并温育1-2周。将小植物转移至含有Reg3培养基(如记载于Negrotto等(2000)的)的MagentaGA-7盒(Magenta Corp，Chicago Ill.)，并在光中培养。将在PMI和iOsSH1i1-01(环)方面呈PCR阳性和在大观霉素方面呈阴性的植物转移至土壤，并在温室中培养。将总共267个T⁰植物种植至成熟(表2)。收集选定事件的植物样品以进行Lugol氏染色、淀粉分析和发酵分析。

表1：在玉米穗轴组织中表达RNAi盒的构建体

构建体	表达盒(启动子和基因)
		17303	OsMADS 13+alpha-淀粉酶
17304	OsMADS 13+beta-淀粉酶
		17305	OsMADS13+R1
18278	OsMADS13+PWD
		18222	OsMADS13+AMY3
18286	TrpA+R1
		18364	OsMADS14+R1
18288	Zm015970+R1

表2：带到温室至成熟的T⁰事件的数目。

构建体	转移至温室的T0的数目
		17303	40(38L+2M)
17304	39(38L+1M)
		17305	37(26L+11M)
18278	29(4N+10L+7M+8H)
		18222	50(5N+18L+16M+11H)
18286	44(7N+28L+9M)
		18288	28(3N+6L+7M+12H)

PCR拷贝数目，N-空值(null)，L-低拷贝，M-中等拷贝，H-高拷贝

实施例2：

样品收集和转基因玉米事件的预筛选。

传粉后10天从成熟的T⁰玉米植物采集穗轴样品。然后，于-80℃将新鲜的穗轴冷冻。之后，使用刮漆刀(paint scrapper)自冷冻的穗轴取出种子。使穗轴冷冻容许更好地取出玉米种子以进行穗轴分析。在取出穗轴种子后，然后，将每个穗轴切成厚小于1/4英寸的薄片。使用两个切片(一个来自中间，而一个来自末端)来进行Lugol氏碘染色。可以使用如实施例1中所描述的方法通过使用经不含RNAi盒的空二元载体转化的T⁰植物来生成对照植物。

使用Lugol氏染色溶液来实施T⁰玉米事件中的淀粉积累的预筛选。Lugol氏溶液将淀粉选择性染色为深蓝至黑色，而且可以在显微镜下视觉观察。相对于空值对照的染色程度容许在要进行进一步淀粉分析和发酵研究的穗轴组织中具有增加的淀粉的事件的快速视觉于预选择。

如下实施事件穗轴组织的预筛选，即将穗轴切片放置在50-mL锥形离心管中，并将5mL 5％Lugol氏碘溶液添加至每份样品，确保整个样品得到覆盖。然后，于室温将样品染色3小时。然后，除去Lugol氏溶液，并如下用蒸馏水清洗样品，即容许样品在水中放置，经常更换水，直至在清洗水中不再可看到染色。将穗轴横截面放置于显微镜载玻片上，并容许干燥，之后进行评分事件。一旦干燥，将穗轴样品在白色背景上显现，并相对于对照样品在淀粉染色量方面视觉评分。基于反映淀粉含量/积累的染色强度通过将数值归入每个样品(1-5，其中1＝低淀粉积累，5＝高淀粉积累)来实施评分；并以照片方式记录。表3-9中概述了相对Lugol染色得分。使用视觉得分来确定哪些事件实施进一步淀粉分析和发酵实验。令人惊讶地，在实验室中发现了与对照穗轴相比，玉米植物的穗轴组织中的淀粉积累(如通过淀粉染色指示的)在alpha-淀粉酶、beta-淀粉酶、R1、PWD、或AMY3在穗轴组织中已经受到下调的玉米植物中显著升高。

表3：构建体17303穗轴淀粉Lugol氏染色(OsMADS13启动子+alpha-淀粉酶RNAi)

植物ID	Lugol氏染色评分
		对照1	1
对照2	1
		MZBF080319A015A	3
MZBF080319A027A	1-2
		MZBF080319A040A	3-4
MZBF080319A052A	3-4
		MZBF080319A068A	3

表4：构建体17304穗轴淀粉Lugol氏染色(OsMADS13启动子+beta-淀粉酶RNAi)

植物ID	Lugol氏染色评分
		对照1	1
对照2	1
		MZBF080321A001A	3-4
MZBF080321A010A	2-3
		MZBF080321A013A	2-3
MZBF080321A014A	2-3
		MZBF080321A030A	1

表5：构建体17305穗轴淀粉Lugol氏染色(OsMADS13启动子+葡聚糖水双激酶(R1)RNAi)

植物ID	Lugol氏染色评分
		对照1	1
对照2	1
		MZBF080322A007A	5
MZBF080322A013A	2-3
		MZBF080322A035A	5
MZBF080322A038A	5
		MZBF080322A072A	5

表6：构建体18278穗轴淀粉Lugol氏染色(OsMADS13启动子+PWDRNAi)

植物ID	Lugol氏染色评分
		对照	2
MZBF093523A048A	3
		MZBF093523B049A	2
MZBF093523A045A	2
		MZBF093523B004A	2
MZBF093523A051A	3

表7：构建体18222穗轴淀粉Lugol氏染色(OsMADS13启动子+AMY3RNAi)

植物ID	Lugol氏染色评分
		对照	2
MZBF093606A040A	3
		MZBF093606B045A	3
MZBF093606B008A	3
		MZBF093606A054A	3
MZBF093606A005A	3

表8：构建体18286穗轴淀粉Lugol氏染色(TrpA启动子+R1RNAi)

植物ID	Lugol氏染色评分
		对照	2
MZBF093527A043B	4
		MZBF093527A005A	4
MZBF093527A030A	4
		MZBF093527A013A	5
MZBF093527C032A	5

表9：构建体18288穗轴淀粉Lugol氏染色(Zm015970启动子+R1RNAi)

植物ID	Lugol氏染色评分
		对照	2
MZBF093516C003A	3
		MZBF093516C002A	3
MZBF093516B006A	3
		MZBF093516B010A	3
MZBF093516A005A	4

实施例3：

玉米穗轴组织样品中的淀粉和糖评估

使用以下测定规程来评估穗轴样品中按干重计的糖和总淀粉的量。此方法采用Megazyme总淀粉测定法(MEGAZYME，Wicklow，Ireland)(AOACMethod 996.11和AACC法76.13)，其涉及通过alpha-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶水解来将样品淀粉完全消化成游离的D-葡萄糖，接着进行葡萄糖氧化酶-过氧化物酶反应和自样品释放的游离的D-葡萄糖的比色测量。可以经由释放的D-葡萄糖测量的量的简单转化来计算样品中的淀粉量。用水提取糖，并通过HPAEC(高效阴离子交换层析)来分析量。

穗轴样品制备

将新鲜的穗轴于-80℃冷冻，拍摄照片，并使用刮漆刀来取出种子。然后，将每个穗轴切成厚小于1/4英寸的薄片。将每个穗轴的切片放置于称重船(weigh boat)中，并使用冻干仪来干燥。将两个切片(一个来自中间，而一个来自末端)储存以备Lugol氏碘染色用(如实施例2中所描述的)。使用离心碾磨机来研磨剩余的穗轴切片。为了达到乙醇发酵所需要的研磨大小规格，使用Kleco仪(Garcia Manufacturing，Visalia，CA，型号KLECO 8200)来将经碾磨的穗轴进一步研磨两个30秒的振动循环。

干燥的经研磨的样品制备

在分析前通过冻干将样品干燥至少8小时。将样品碾磨以通过0.5mm筛。将干燥的样品切割成易处理的块，并在

3600圆盘式碾磨机(设置1；Perten Instruments AB；Huddinge，Sweden)上研磨。研磨规程随样品而略有变化，从而以细得适度的一致性研磨样品，之后进行分析。

用水提取糖

在15mL管中精确地称出细粉状的穗轴样品(100-130mg)。用每份样品准备一式两份实验。向每管添加ddH₂O至终浓度10mg穗轴样品/1ml水。将样品在温和旋转的情况中于室温温育1小时。然后，将管以4,000rpm离心15分钟。接着，将0.8ml澄清的上清液转移至旋转滤器，同时保留沉淀物以进行总淀粉分析。将过滤的上清液以5,000rpm离心15分钟，然后于-20℃贮存，直至通过HPAEC进行糖分析。

通过HPAEC进行的糖分析

将于-20℃贮存的过滤样品融化，并在200μL HPLC小瓶或平板中稀释20倍(10μL样品+190μL ddH₂O)。使用不同浓度[0(H₂O)、0.01、0.02、0.04、0.10mg/mL]的标准糖[葡萄糖+果糖+蔗糖]混合物作为预期糖组分的标准品。以下列程序运行HPAEC：

柱：Carbopac PA200碳水化合物柱

流速：0.4ml/mL

注射的样品体积：10μL

试剂：A：水；B：1M NaOH；C：1M NaAc

梯度：

0分钟：100mM NaOH

30分钟：100mM NaOH+80mM NaAc

32.5分钟：100mM NaOH+900mM NaAc

35分钟：100mM NaOH

45分钟：100mM NaOH

通过比较整合峰与标准品的整合峰来计算干样品中的每种糖的％和三种糖的和。

自沉淀物取出可溶性糖以进行淀粉分析

向每个样品沉淀物添加10mL 80％乙醇，并涡旋振荡以完全悬浮沉淀物。然后，将悬浮的沉淀物在80-85℃的水浴中温育5分钟。接着，将悬浮的沉淀物于室温以3,000rpm离心10分钟，并弃去上清液。再重复额外的乙醇清洗步骤以完全除去任何可溶性糖残留。

植物组织的淀粉消化

将50mM MOPS缓冲液(pH 7.0)中的3mL 1∶30稀释的热稳定性α-淀粉酶(MEGAZYME，Wicklow，Ireland)添加至样品沉淀物。通过涡旋振荡或上下移液数次来将每管中的沉淀物完全悬浮。将经淀粉酶催化的消化在100℃水浴中实施12分钟，每4分钟涡旋振荡。将反应管转移至50℃水浴。将4mL 200mMNaOAc缓冲液pH＝4.5添加至每份样品，接着添加0.1mL淀粉葡糖苷酶(Megazyme)。将反应管周期性倒转以混合内容物，并容许在50℃水浴中温育30分钟。在15mL管中用水将样品体积调节至10mL，接着于室温以3,000rpm离心10分钟。此上清液含有样品消化出的溶解糖。

淀粉消化的葡萄糖测定法

将20μL淀粉消化上清液以每个重复一式三份移液至96孔测定板孔。还将葡萄糖标准品[0(水，＝空白)、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL]添加至同一96孔测定板。将葡萄糖氧化酶试剂(200μL)添加至每孔，并于37℃实施温育达20分钟。读取500nm的吸光度。将具有大于1.0的OD的样品稀释2X倍[10μL淀粉消化上清液+10μL水]，并用标准品重复葡萄糖测定法。基于标准曲线来计算样品中的葡萄糖浓度。可以使用以下计算：

葡萄糖的总量(mg)＝葡萄糖浓度(mg/mL)×10mL。

淀粉的总量(mg)＝葡萄糖的总量(mg)×164/182。

淀粉的总量(％干重)＝淀粉的总量(mg)/样品重量(mg)×100％。

结果

与空值穗轴的平均淀粉含量相比，来自包含来自构建体17305、18222、18278，18286和1828的RNAi盒的T1事件的穗轴组织显示淀粉含量(％/mg干重)的平均增加(参见表10-15)。观察到空值穗轴具有每mg干重0.89％淀粉的平均淀粉含量(表10)。比较而言，令人惊讶地，来自构建体18286(TrpA-R1)的事件相对于空值穗轴组织显示2.8X增加的淀粉，其中18286事件具有每mg干重约2.51％的平均淀粉含量测量(表14)。来自构建体18288(Zm015970-R1)的T1事件显示第二高的淀粉增加，相对于空值穗轴组织在穗轴中淀粉增加约2.1X，其中18288事件具有每mg干重约1.90％的平均淀粉含量测量(表15)。自构建体17305(OsMADS13-R1)生成的穗轴组织含有每mg干样品1.79％淀粉，比空值穗轴事件增加2X(表11)。使用构建体18278(OsMADS14-PWD)生成的T1事件显示每mg干样品1.59％的平均淀粉含量，比空值穗轴在淀粉方面增加1.79X(表13)。使用构建体18222(OsMADS13-AMY3)生成的T1事件显示每mg干样品1.27％的平均淀粉含量，比空值穗轴在淀粉方面增加1.43X(表12)。令人惊讶地，在与空值穗轴相比时，下调玉米内源淀粉降解酶的所有构建体显示淀粉的积累增加。引人注意地，适合于下调穗轴组织中的R1的构建体导致穗轴中的最高量的淀粉积累。与空值对照相比，在R1已经受到下调的穗轴样品中观察到的总糖含量或个别糖(葡萄糖、果糖、和蔗糖)的量没有显著差异(P＝0.33)(参见表11)。

表10：来自T1空值事件的穗轴样品中的总淀粉评估

表11：来自具有17305构建体的T1事件的穗轴样品中的总淀粉评估

表12：来自具有18222构建体的T1事件的穗轴样品中的总淀粉评估

表13：来自具有18278构建体的T1事件的穗轴样品中的总淀粉评估

表14：来自具有18286构建体的T1事件的穗轴样品中的总淀粉评估

表15：来自具有18288构建体的T1事件的穗轴样品中的总淀粉评估

表16：来自具有17305构建体的T1事件的穗轴样品中的糖评估

实施例4：

玉米穗轴组织样品的发酵

以下乙醇发酵方法包括高温糖化步骤，其中添加如Megazyme的总淀粉试剂盒(MEGAZYME，Wicklow，Ireland)所提供的那样使用的热稳定性α-淀粉酶：(3,000U/mL，于pH＝6.5和40℃)(试剂盒中的瓶1)，使用50mM MOPS缓冲液将1mL酶稀释至3mL)和淀粉葡糖苷酶(3,300U/mL，于pH＝4.5和40℃)(试剂盒中的瓶2)。以20％固体实施发酵达17小时。

穗轴样品制备：

如先前的实施例中所描述的那样制备穗轴。将新鲜的穗轴于80℃冷冻，拍摄照片，并使用刮漆刀来取出种子。然后，将每个穗轴切成厚小于1/4英寸的薄片。将每个穗轴的切片放置于称量船中，并使用冻干仪来干燥。将两个切片(一个来自中间，而一个来自末端)储存以备Lugol氏碘染色用。使用离心碾磨机来研磨剩余的穗轴切片。为了达到乙醇发酵所需要的研磨大小规格，使用Kleco仪(Garcia Manufacturing，Visalia，CA，型号KLECO 8200)来将经碾磨的穗轴进一步研磨两个30秒振动循环。

酵母制备

在每次实验设置前，制备来自Fermentis(S.I.Lesaffre的FERMENTIS部门，France)的乙醇红色酵母以进行发酵。将1g固体酵母；5g 1％葡萄糖溶液称重，进入50ml锥形管。在涡旋上轻轻拍打管，直至将所有酵母悬浮。然后，将混合物于30℃在以120rpm不断摇动的情况中温育30分钟。将酵母轻轻地涡旋振荡，取出，并用DI水稀释至5X。

干燥的经研磨的样品制备

将样品碾磨以通过0.5mm筛。将干燥的样品切割成易处理的块，并在

3600圆盘式碾磨机(设置1；Perten Instruments AB；Huddinge，Sweden)上研磨。研磨规程随样品略有变化以便以细得适度的一致性研磨样品，之后进行发酵。

玉米植物组织样品的发酵

对每份个别样品(包括对照(空值))标记两个15ml一次性离心管。将750mg经研磨的样品称重，进入每个管，并记录重量用于计算。将单一2mm金属球添加至每管，并将每管再盖上盖子，直至开始发酵。如下将每份样品清洗三次，即添加5ml 50mM MOPS缓冲液，涡旋振荡30秒，然后以3000rpm离心5分钟。每次弃去3ml来自顶部的上清液，并在每次清洗间添加另外的3ml新鲜缓冲液。在第三次清洗后，取出3ml上清液，并留出管。为仅有培养基(无酶，无酵母)检验样品设置一管。通过将水添加至每管来以20％固体实施发酵。每次发酵的终体积是约3ml。涡旋振荡每管以重悬固体，并用密封。使用16.5号针来刺出每管顶部中的小孔。通过在30℃温育室中的组织培养转子(CEL-GRO，LAB-LINE)中以设置于4的速度使管旋转来启动发酵。实施发酵反应，如下文表12中所描述的。

表12：发酵反应的制备

如下在温育17小时后自每个反应管对发酵取样，即以3000rpm将管离心5分钟，并取出100μL样品。

对乙醇产率的HPLC分析

经由微量保护阳离子-H再充填筒30x 4.6mm(Bio-Rad，产品目录编号125-0119)和Aminex HPX-87H离子排阻柱300x 7.8mm(Bio-Rad，产品目录编号125-0140)来分离来自发酵培养基的样品中的乙醇，并使用高效液相层析(HPLC，Waters Alliance)用RI检测仪来检测。

将过滤的T0样品和17小时样品转移至适当的HPLC小瓶。将0.12μL 25mM H₂SO₄添加至每个小瓶中的88μL样品以从HPLC分析除去阴性峰。分析5个HPLC标准品(0％、0.25％、0.5％、0.75％和1％乙醇)以产生标准曲线，其用于测定样品中的EtOH含量。

结果

观察到来自玉米R1已经受到下调的T1穗轴样品的淀粉发酵的乙醇产率是使用空值穗轴样品观察到的产率的约2倍或比使用空值穗轴样品观察到的产率高(参见表13)。

表13：发酵17小时时的净乙醇产率

从表1中所显示的乙醇产率来计算发酵以生成乙醇的淀粉的量(发酵淀粉，％每g穗轴样品干重)。使用Megazymes的总淀粉测定试剂盒来评估淀粉含量(评估的淀粉含量，％每克穗轴样品干重)(参见表14)。

表14：T1穗轴样品中评估的发酵淀粉

Claims (43)

1.一种用于增加玉米植物的穗轴组织中的淀粉含量的方法，包括：

a)将表达盒插入玉米植物细胞中，所述玉米植物细胞包含与确保在玉米穗轴组织中转录的调节元件可操作连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸的表达降低玉米穗轴组织中的一种或多种内源淀粉降解酶的活性；

b)自a)的玉米植物细胞再生转基因玉米植物；并

c)生成具有增加的淀粉含量的所述穗轴组织。

2.权利要求1的方法，其中所述内源淀粉降解酶选自下组：alpha-淀粉酶、葡聚糖水双激酶、磷酸葡聚糖水双激酶、极限糊精酶、异淀粉酶、beta-淀粉酶、叶绿体葡聚糖磷酸化酶、歧化酶、叶绿体麦芽糖转运蛋白(Mex1)、叶绿体葡萄糖转运蛋白和叶绿体丙糖磷酸转运蛋白。

3.权利要求1的方法，其中所述内源淀粉降解酶选自下组：alpha-淀粉酶、葡聚糖水双激酶、PWD、AMY3和beta-淀粉酶。

4.权利要求1的方法，其中所述内源淀粉降解酶是葡聚糖水双激酶。

5.权利要求1的方法，其中所述内源淀粉降解酶是alpha-淀粉酶。

6.权利要求1的方法，其中所述降低一种或多种淀粉降解酶活性的多核苷酸是RNAi。

7.权利要求1的方法，其中所述多核苷酸与穗轴组织优选性启动子可操作连接。

8.权利要求7的方法，其中所述多核苷酸与OsMADS启动子可操作连接。

9.权利要求8的方法，其中所述多核苷酸与选自下组的启动子之任一种可操作连接：OsMADS13启动子、OsMADS14启动子、TrpA启动子或Zm015970启动子。

10.权利要求7的方法，其中在动物饲料中使用所述具有增加的淀粉含量的穗轴。

11.一种改善来自供生物质转化法用的植物生物质的游离糖的产率的方法，所述方法包括：

a)将表达盒插入玉米植物细胞中，所述玉米植物细胞包含与确保在玉米穗轴组织中转录的调节元件可操作连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸的表达降低玉米穗轴组织中的一种或多种内源淀粉降解酶的活性；

b)自a)的玉米植物细胞再生转基因玉米植物；并

c)在所述多核苷酸得到表达的条件下种植所述转基因玉米植物，其中所述多核苷酸的表达导致所述植物的穗轴组织中的淀粉含量增加，并

d)在生物质转化法中使用所述转基因玉米植物。

12.权利要求11的方法，其中所述内源淀粉降解酶选自下组：alpha-淀粉酶、葡聚糖水双激酶、磷酸葡聚糖水双激酶、极限糊精酶、异淀粉酶、beta-淀粉酶、叶绿体葡聚糖磷酸化酶、歧化酶、叶绿体麦芽糖转运蛋白(Mex1)、叶绿体葡萄糖转运蛋白和叶绿体丙糖磷酸转运蛋白。

13.权利要求11的方法，其中所述内源淀粉降解酶选自下组：alpha淀粉酶、葡聚糖水双激酶、PWD、AMY3和beta-淀粉酶。

14.权利要求11的方法，其中所述内源淀粉降解酶是葡聚糖水双激酶。

15.权利要求11的方法，其中所述内源淀粉降解酶是alpha-淀粉酶。

16.权利要求11的方法，其中所述多核苷酸与穗轴组织优选性启动子可操作连接。

17.权利要求16的方法，其中所述多核苷酸与OsMADS启动子可操作连接。

18.权利要求17的方法，其中所述多核苷酸与选自下组的启动子之任一种可操作连接：OsMADS13启动子、OsMADS14启动子、TrpA启动子或Zm015970启动子。

19.权利要求11的方法，其中所述植物细胞进一步包含与确保在植物细胞中转录的调节元件可操作连接的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸的表达编码加工酶，并且表达所述加工酶，使得它不与其底物接触。

20.权利要求11的方法，其中所述植物进一步包含与确保在植物细胞中转录的调节元件可操作连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸的表达降低植物绿色组织中的一种或多种内源淀粉降解酶的活性，其中所述绿色组织具有增加的淀粉含量。

21.权利要求11的方法，其中所述生物质转化法是非动物饲料生物质转化法。

22.权利要求20的方法，其中所述非动物饲料生物质转化法将碳水化合物转化成一种或多种生物燃料。

23.一种生成具有增加的淀粉的自我加工穗轴的方法，包括：

a)将第一多核苷酸插入玉米植物细胞中，所述玉米植物细胞包含与确保在玉米穗轴组织中转录的调节元件可操作连接的第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸的表达降低穗轴组织中的一种或多种内源淀粉降解酶的活性；

b)将第二多核苷酸插入所述玉米植物细胞中，所述玉米植物细胞包含与确保在植物细胞中转录的调节元件可操作连接的第二多核苷酸，其中所述多核苷酸的表达编码加工酶；

c)自b)的植物细胞再生转基因植物；并

d)生成所述具有增加的淀粉的自我加工穗轴。

24.权利要求23的方法，其中所述内源淀粉降解酶选自下组：alpha-淀粉酶、葡聚糖水双激酶、磷酸葡聚糖水双激酶、极限糊精酶、异淀粉酶、beta-淀粉酶、叶绿体葡聚糖磷酸化酶、歧化酶、叶绿体麦芽糖转运蛋白(Mex1)、叶绿体葡萄糖转运蛋白和叶绿体丙糖磷酸转运蛋白。

25.权利要求23的方法，其中所述内源淀粉降解酶选自下组：alpha-淀粉酶、葡聚糖水双激酶、PWD、AMY3和beta-淀粉酶。

26.权利要求23的方法，其中所述内源淀粉降解酶是葡聚糖水双激酶。

27.权利要求23的方法，其中所述内源淀粉降解酶是α-淀粉酶。

28.权利要求23的方法，其中所述加工酶选自下组：alpha-淀粉酶和纤维素酶。

29.权利要求23的方法，其中在生物质转化法中使用所述穗轴组织。

30.权利要求23的方法，其中所述加工酶与穗轴优选性启动子可操作连接。

31.权利要求23的方法，其中所述加工酶与种子优选性启动子可操作连接。

32.权利要求23的方法，其中所述加工酶与绿色组织优选性启动子可操作连接。

33.权利要求23的方法，其中所述第一和第二多核苷酸位于同一表达盒上。

34.权利要求23的方法，其中所述第一和第二多核苷酸位于分开的表达盒上。

35.一种用于生成青贮饲料的方法，包括：

a)将表达盒插入植物细胞中，所述植物细胞包含与确保在植物细胞中转录的调节元件可操作连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸的表达降低穗轴组织中的一种或多种内源淀粉降解酶的活性；

b)自b)的植物细胞再生转基因植物；并

c)生成具有增加的淀粉含量的穗轴组织；

d)青贮所述具有增加的淀粉含量的穗轴组织以制成青贮饲料。

36.权利要求35的方法，其中所述青贮饲料作为动物饲料使用。

37.权利要求35的方法，其中所述青贮饲料在生物质转化法中使用。

38.权利要求35的方法，其中所述植物进一步包含与确保在植物细胞中转录的调节元件可操作连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸的表达降低植物绿色组织中的一种或多种内源淀粉降解酶的活性，其中所述绿色组织具有增加的淀粉含量。

39.权利要求35的方法，其中所述穗轴进一步包含加工酶。

40.权利要求35的方法，其中所述穗轴进一步包含肌醇六磷酸酶。

41.一种穗轴优选性启动子，其与SEQ ID NO：14具有至少70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性。

42.一种分离的玉米(Zm015970)启动子序列，其由SEQ ID NO：14组成。

43.一种用于指导靶基因在玉米穗轴组织中表达的方法，该方法包括：

使玉米植物与靶基因接触，所述靶基因与包含SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：14或其活性片段的Zm015970启动子序列可操作连接；并将靶基因导入所述植物中，所述靶基因与包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14或其活性片段的Zm015970启动子序列可操作连接，其中所述Zm015970启动子指导所述靶基因在玉米穗轴组织中的表达。