ES2774426T3 - Métodos y composiciones para procesar biomasa con niveles elevados de almidón - Google Patents

Métodos y composiciones para procesar biomasa con niveles elevados de almidón Download PDF

Info

Publication number
ES2774426T3
ES2774426T3 ES13855041T ES13855041T ES2774426T3 ES 2774426 T3 ES2774426 T3 ES 2774426T3 ES 13855041 T ES13855041 T ES 13855041T ES 13855041 T ES13855041 T ES 13855041T ES 2774426 T3 ES2774426 T3 ES 2774426T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
sequence
hours
plant
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES13855041T
Other languages
English (en)
Inventor
Philip A Lessard
Michael Lanahan
Vladimir Samoylov
Oleg Bougri
Jonas Emery
R Michael Raab
Dongcheng Zhang
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Agrivida Inc
Original Assignee
Agrivida Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US13/793,078 external-priority patent/US9598700B2/en
Application filed by Agrivida Inc filed Critical Agrivida Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2774426T3 publication Critical patent/ES2774426T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Una planta genéticamente modificada que comprende un primer ácido nucleico aislado que comprende una secuencia con al menos el 90 % de identidad con una secuencia de SEQ ID NO: 50 y un segundo ácido nucleico aislado que comprende una secuencia con al menos el 90 % de identidad con una secuencia de SEQ ID NO: 86, una secuencia con al menos el 90 % de identidad con una secuencia de SEQ ID NO: 87 y una secuencia con al menos el 90 % de identidad con una secuencia de SEQ ID NO: 90.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para procesar biomasa con niveles elevados de almidón
Referencia cruzada a solicitud relacionada
Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud provisional de los Estados Unidos N.° 61/726.301, presentada el 14 de noviembre de 2012 y de la Solicitud de patente de EE. UU. 13/793.078 presentada el 11 de marzo de 2013.
El Listado de Secuencias titulado "Listado de Secuencias" que tiene un tamaño de archivo de aproximadamente 1.236.591 bytes, se creó el 14 de noviembre de 2013 y es presentada en la presente memoria.
Declaración de apoyo gubernamental
Esta invención se realizó, al menos en parte, con el apoyo del gobierno con el número de adjudicación 2009-10001­ 05118 otorgado por el Instituto Nacional de Alimentos y Agricultura de EE. UU., USDA. El gobierno tiene ciertos derechos sobre la presente invención.
Campo de la invención
La descripción en la presente memoria se refiere a ácidos nucleicos aislados, construcciones genéticas y vectores para modificar plantas por ingeniería con niveles elevados de almidón vegetativo y que expresan enzimas que degradan polisacáridos y plantas genéticamente modificadas. La descripción también se refiere a métodos de procesamiento agrícola y preparación de piensos para animales usando las plantas genéticamente modificadas.
Antecedentes
La glucosa es un azúcar simple que se puede usar en una variedad de alimentos, piensos y aplicaciones químicas. Sin embargo, la disponibilidad y el coste de la glucosa se han convertido recientemente en un factor limitante en la demanda de una materia prima de biocombustibles de bajo coste y una alimentación animal sostenible. La demanda de maíz y caña de azúcar ha aumentado significativamente el precio de este producto. El almidón es un polímero grande compuesto de restos de glucosa repetidos unidos a través de enlaces □U ,4 y □U ,6 (Stitt y Samuel C Zeeman 2012). El almidón es una fuente superior de glucosa debido a su estructura molecular simple (enlaces de glucosa a-1 -4 y a-1 -6) y la relativa facilidad con la que se accede a estos enlaces y se hidrolizan mediante enzimas económicas y altamente eficaces (p. ej.; a-amilasa y glucoamilasa). El almidón derivado de materiales vegetales se puede convertir fácilmente en glucosa bien en el tracto digestivo de los animales (aplicaciones para piensos) o bioquímicamente (por ejemplo, por hidrólisis ácida o hidrólisis enzimática). La hidrólisis de tejidos vegetales con alto contenido de almidón como el grano proporciona glucosa relativamente pura que se transforma de manera eficaz en carne o productos químicos finales.
La glucosa también puede derivar de otros polímeros producidos en plantas, tal como celulosa, □ -glucano o xiloglucanos. Sin embargo, los procesos para liberar la glucosa de estos polímeros son generalmente mucho menos eficaces; los animales rumiantes y monogástricos los digieren con menos facilidad y los medios químicos para liberar la glucosa generalmente implican tratamientos químicos agresivos seguidos de hidrólisis con cócteles enzimáticos caros (Alvira et al. 2010).
La sacarosa, un carbohidrato de almacenamiento soluble, también es una molécula de materia prima derivada de plantas que los organismos fermentativos utilizan fácilmente. Los sistemas de cultivo y procesamiento que utilizan materias primas de sacarosa, como la remolacha azucarera y el sorgo dulce, están limitados por estrechas ventanas de cosecha y limitaciones de almacenamiento y estabilidad. El sorgo dulce debe procesarse de manera similar a la caña de azúcar, pocos días después de su cosecha para limitar la fermentación microbiana de la sacarosa debido al alto contenido de humedad en los materiales cosechados (deterioro). Los períodos de campaña reducen la eficacia general del capital de las instalaciones de procesamiento dedicadas.
Los sustratos lignocelulósicos son materias primas menos atractivas debido a dificultades de procesamiento. La biomasa lignocelulósica contiene una mezcla de hexosas y pentosas y su recalcitración a la hidrólisis (cristalinidad y reticulación a la lignina) dificulta la digestión y la degradación rentable en azúcares utilizables. En la producción de biocombustibles, se están desarrollando costosos tratamientos previos para ayudar en la hidrólisis completa de materiales lignocelulósicos. La plena utilización de las mezclas de azúcares resultantes para la producción de combustible y productos químicos también necesita que los organismos de fermentación especializados transformen los azúcares resultantes en productos finales, tales como etanol, butanol, ácido succínico y otros productos químicos.
Compendio
En un aspecto, la invención se refiere a una planta genéticamente modificada. La planta genéticamente modificada comprende un primer ácido nucleico aislado que codifica un producto que inactiva o inhibe la expresión de al menos un gen que codifica una proteína implicada en la movilización de almidón en una planta. La planta genéticamente modificada también comprende un segundo ácido nucleico aislado que codifica al menos una enzima que degrada polisacáridos. Tras la expresión del primer ácido nucleico, la planta genéticamente modificada tiene un nivel alterado de almidón vegetativo en comparación con el nivel de almidón vegetativo en una planta no modificada genéticamente que tiene el mismo fondo genético que la planta genéticamente modificada pero que carece del primer ácido nucleico aislado.
En un aspecto, la invención se refiere a una construcción genética. La construcción genética incluye un primer ácido nucleico aislado que codifica un producto que inactiva o inhibe la expresión de al menos un gen que codifica una proteína implicada en la movilización de almidón en una planta. La construcción genética también incluye un segundo ácido nucleico aislado que codifica al menos una enzima que degrada polisacáridos.
En un aspecto, la invención se refiere a un método de procesamiento agrícola o preparación de alimento para animales. El método comprende proporcionar una planta genéticamente modificada. La planta genéticamente modificada comprende un primer ácido nucleico aislado que codifica un producto que inactiva o inhibe la expresión de al menos un gen que codifica una proteína implicada en la movilización de almidón en una planta. La planta genéticamente modificada también comprende un segundo ácido nucleico aislado que codifica al menos una enzima que degrada polisacáridos. Tras la expresión del primer ácido nucleico, la planta genéticamente modificada tiene un nivel alterado de almidón vegetativo en comparación con el nivel de almidón vegetativo en una planta no modificada genéticamente.
Breve descripción de los dibujos
La siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas de la presente invención se entenderá mejor cuando se lea junto con los dibujos adjuntos. Con el fin de ilustrar la invención, en los dibujos se muestran realizaciones particulares. Se entiende, sin embargo, que la invención no se limita a las disposiciones e instrumentos precisos mostrados. En los dibujos:
Las FIG. 1A - G ilustran estrategias para expresar ARN de interferencia en plantas transgénicas.
La FIG. 2 ilustra un vector intermedio de ARNi, pAL409.
La FIG. 3 ilustra un diagrama de un microARN de origen natural (osa-MIR528; SEQ ID NO: 159) de arroz. Las secuencias iniciadoras están encuadradas y pueden modificarse para cambiar la especificidad de direccionamiento del microARN (adaptado de Wartmann et al. 2008).
La FIG. 4 ilustra un diagrama de un gen sintético para expresar un solo ARNh.
La FIG. 5 ilustra una construcción genética que incluye casetes de expresión para dos ARNh.
La FIG. 6 ilustra casetes de ARNi dirigidos a genes GWD, DSP e ISA3 de arroz.
La FIG. 7 ilustra la comparación de secuencias entre la Consulta (secuencia superior), una porción de GWD2 [SEQ ID NO: 181], derivada del gen del glucano, agua dicinasa y la Objeto (secuencia inferior), una porción del gen GWD del tomate (Solanum lycopersicon) [SEQ ID NO: 182].
La FIG. 8 ilustra pAL409j SbGWDko2.
La FIG. 9 ilustra la detección de homólogos de ISA3 mediante transferencia Southern.
La FIG. 10 ilustra la alineación de fragmentos de los genes GWD de arroz (OsGWD) [SEQ ID NO: 196 y 200], sorgo (SbGWD) [SEQ ID NO: 197 y 201], maíz (ZmGWD) [SEQ ID NO: 198 y 202] y tomate (S1GWD) [SEQ ID NO: 199 y 203]. También se ilustran los cebadores dgGWup2 [SEQ ID NO: 204] y dgGWdown2 [SEQ ID n O: 205].
La FIG. 11 ilustra la comparación de la longitud relativa y el posicionamiento de intrones dentro del segmento central de homología de genes GWD de arroz, sorgo, Arabidopsis y mijo.
La FIG. 12 ilustra una representación de matriz de puntos de alineaciones BLASTn entre las secuencias genómicas de mijo y de arroz para los genes del glucano agua dicinasa. Eje horizontal, secuencia de mijo; eje vertical, secuencia de arroz. Los segmentos diagonales representan regiones donde las dos secuencias son altamente homólogas.
La FIG. 13 ilustra los niveles de ARNm de GWD entre plantas que portan pAG2100 o pAG2101 y plantas de control de tipo silvestre (TS).
La FIG. 14 ilustra los niveles de ARNm de DSP entre plantas que portan pAG2102 y controles de TS.
La FIG. 15 ilustra los niveles de ARNm de ISA3 entre plantas que portan pAG2103 y plantas de control de TS.
La FIG. 16 ilustra la expresión del gen GDW en el maíz transgénico silenciado con ARNi producido a partir de las construcciones pAG4102 y pAG4103.
Las FIG. 17A - B ilustran almidón elevado entre líneas selectas de arroz (17A) y mijo (17B) que portan construcciones de ARNi.
La FIG. 18 ilustra el contenido de almidón en líneas de arroz transgénico, recolectado aproximadamente 19 semanas después de la siembra.
La FIG. 19 ilustra un cuadro que representa el contenido de almidón (mg de almidón por gramo de peso seco de paja) en poblaciones de plantas de arroz transgénicas, portando cada una de ellas una de 11 construcciones diferentes numeradas secuencialmente de 2107 a 2117. Nipponbarre son líneas de arroz de control no transformadas.
La FIG. 20 ilustra el peso seco de plantas de arroz transgénicas que portan 2116 construcciones y plantas de arroz de control no transformadas (NB).
La FIG. 21 ilustra el rendimiento de glucosa a partir de paja de arroz transgénica (mezcla de Os; barras negras) producida utilizando las construcciones pAG2110, pAG2115 y pAG2116 y mezcla de NB de control no transgénicas (arroz Nipponbarre no transgénico; barras grises) después del tratamiento previo con ácido sulfúrico 0,25 M (ácido) a 95 °C durante 4 o 16 horas o a 120 °C durante 1 hora e hidrólisis enzimática.
La FIG. 22 ilustra la recuperación de glucosa de la mezcla de control de NB (barras blancas) y la mezcla transgénica (barras negras) producidas con las construcciones pAG2110, pAG2115 y pAG2116 después del tratamiento previo con ácido sulfúrico 0,25 M (ácido; pH 1,0), NH4OH al 7,5 % (base; pH 12.0) o (NH4)HSO30,175 M+ (NH4)2CO30,18 M(bisulfito; pH 8,1) a 95 °C durante 4 o 16 horas.
La FIG. 23 ilustra la recuperación de xilosa del control (barras blancas) y la biomasa transgénica (barras negras) después del tratamiento previo con ácido sulfúrico 0,25 M (ácido; pH 1,0), NH4OH al 7,5 % (base; pH 12.0) o (NH4)HSO30,175 M+ (NH4)2CO30,18 M(bisulfito; pH 8,1) a 95 °C durante 4 o 16 horas.
La FIG. 24 ilustra los rendimientos de glucosa a partir de biomasa de plantas de arroz transgénicas individuales 2110_13 (barras negras) y 2110_21 (barras gris oscuro) producidas a partir de la construcción pAG2110 en comparación con la del tejido de control (mezcla de NB; barras blancas) después de tratamiento previos con ácido, base, bisulfito o Ca(OH)2 e hidrólisis enzimática.
La FIG. 25 ilustra el crecimiento de células de levadura medido por el número de unidades formadoras de colonias por ml de volumen de cultivo (UFC/ml) durante la sacarificación y fermentación simultáneas de biomasa de arroz (cuadrado; mezcla transgénica), plantas de control no transgénicas (diamante; mezcla de control NB) y control de glucosa (triángulo).
La FIG. 26 ilustra la liberación y el consumo de glucosa durante la sacarificación y fermentación simultáneas de biomasa de arroz (cuadrado; mezcla transgénica), plantas de control no transgénicas (diamante; mezcla de control NB) y control de glucosa (triángulo).
La FIG. 27 ilustra la producción de etanol durante la sacarificación y fermentación simultáneas de biomasa de arroz (cuadrado; mezcla transgénica), plantas de control no transgénicas (diamante; mezcla de control NB) y control de glucosa (triángulo).
La FIG. 28 ilustra un diagrama de un casete de expresión para una única enzima que degrada la pared celular (CWDE, por sus siglas en inglés).
La FIG. 29 ilustra una construcción compuesta por un casete de expresión para un ARNh y casetes de expresión para tres CWDE.
La FIG. 30 ilustra el contenido de almidón, actividad xilanasa y actividad endoglucanasa entre plantas transgénicas que portan casetes de expresión de pAG4110 y pAG4111 y plantas de control.
La FIG. 31 ilustra los rendimientos de glucosa de plantas transgénicas que portan casetes de expresión de pAG4206, pAG4110 y pAG4111 y controles de TS.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Cierta terminología se usa en la siguiente descripción solo por conveniencia y no es limitante.
"Ácido nucleico aislado" "polinucleótido aislado" "oligonucleótido aislado" "ADN aislado" o "ARN aislado" como se emplea en esta memoria se refiere a un ácido nucleico, polinucleótido, oligonucleótido, ADN o ARN separado del organismo del que se origina o del genoma, ubicación o moléculas de origen natural, con los que normalmente está asociado, o es un ácido nucleico que se produjo a través de un proceso sintético.
"Proteína aislada" "polipéptido aislado" "oligopéptido aislado" o "péptido aislado" como se emplea en esta memoria se refiere a una proteína, polipéptido, oligopéptido o péptido separado del organismo del que se origina o de la ubicación o moléculas de origen natural con las que normalmente está asociado.
Como se emplea en esta memoria, "variante" se refiere a una molécula que conserva una actividad biológica que es igual o sustancialmente similar a la de la secuencia original. La variante puede ser de la misma especie o diferente o ser una secuencia sintética basada en una molécula natural o anterior.
Los ácidos nucleicos, secuencias de nucleótidos, proteínas o secuencias de aminoácidos a las que se hace referencia en esta memoria pueden aislarse, purificarse, sintetizarse químicamente o producirse mediante tecnología de ADN recombinante. Todos estos métodos son bien conocidos en la técnica.
Como se emplea en esta memoria, "operativamente unido" se refiere a la asociación de dos o más biomoléculas en una configuración relativa entre sí de tal manera que se pueda realizar la función normal de las biomoléculas. En relación con las secuencias de nucleótidos, "operativamente unido" se refiere a la asociación de dos o más secuencias de un ácido nucleico en una configuración relativa entre sí de tal manera que se pueda realizar la función normal de las secuencias. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia previa o líder secretora está operativamente unida a una secuencia de nucleótidos para un polipéptido si se expresa como una proteína previa que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia codificante; y un sitio de unión al ribosoma del ácido nucleico está operativamente unido a una secuencia codificante si está posicionado de manera que facilite la unión del ribosoma al ácido nucleico.
Las palabras "un" y "uno" como se usan en las reivindicaciones y en las partes correspondientes de la memoria descriptiva, se definen como que incluyen uno o más de los elementos a los que se hace referencia a menos que se indique específicamente lo contrario. Esta terminología incluye las palabras arriba mencionadas específicamente, derivados de las mismas y palabras de importancia similar. La frase "al menos uno" seguida de una lista de dos o más elementos, tal como "A, B o C", significa cualquiera individual de A, B o C, así como cualquier combinación de los mismos.
El aumento del contenido de almidón de la biomasa puede aumentar el contenido de energía (calorías) en piensos animales o mejorar la extracción de glucosa de la biomasa para la producción de etanol u otros productos bioquímicos.
Una estrategia para aumentar la disponibilidad de glucosa en la biomasa derivada de plantas que se va a utilizar como pienso para animales o como materia prima para productos químicos sería hacer que las plantas acumulen almidón adicional. Tal almidón adicional tanto aumentaría la cantidad total de glucosa presente en la biomasa como haría que una mayor porción de esa glucosa se extrajera fácilmente. Para aumentar la cantidad de almidón que se acumula en la biomasa, particularmente en partes vegetativas (sin semillas) de la planta, se pueden modular los procesos normales por los cuales las plantas sintetizan y renuevan almidón vegetativo.
Las plantas generalmente sintetizan almidón en los tejidos vegetativos durante el día, mientras que por la noche degradan el almidón para movilizar el azúcar resultante con el fin de satisfacer las necesidades energéticas de la planta. Las células vegetales vegetativas expresan una serie de enzimas para iniciar la movilización del almidón transitorio durante la noche (Stitt y Samuel C Zeeman 2012). Entre estas están la Glucano Agua Dicinasa ("GWD"), que fosforila el polímero de almidón y la Fosfoglucano Agua Dicinasa (PWD), que fosforila aún más el almidón. Estas etapas en la renovación de almidón hacen que el polímero de almidón sea accesible para las enzimas que degradan almidón posteriores. Una serie de enzimas que degradan el almidón pueden unirse al polisacárido fosforilado, pero la despolimerización (hidrólisis) del gránulo de almidón no progresa de manera eficaz hasta que el polímero de almidón se desfosforila a través de la acción de enzimas como la proteína fosfatasa de doble especificidad (DSP) u otras fosfoglucano fosfatasas. Posteriormente, enzimas como las beta amilasas (BAM), isoamilasas (tal como ISA3), alfa amilasas (AMY), enzimas de desramificación (DBE), enzimas desproporcionadoras (DPE) y dextrinasas limitantes, convierten el polímero de almidón en glucanos lineales, oligosacáridos cortos tales como maltosa y glucosa. Para desarrollar biomasa que tenga más utilidad y mayor valor como producto alimenticio (p. e j, cuando se formula como ración de pienso o cuando se usa en ensilado) o como materia prima industrial (p. ej., para proporcionar glucosa para la producción fermentativa de etanol u otros productos bioquímicos), se buscó un aumento de la acumulación de almidón en los tejidos vegetativos reduciendo la expresión o actividad de las enzimas clave implicadas en la renovación del almidón transitorio.
Una realización proporciona un método para la alteración de la cantidad de almidón que se acumula en los tejidos vegetativos de las plantas mediante la inhibición de la actividad de las enzimas que normalmente son responsables de movilizar el almidón vegetativo (en adelante denominado "Almidón Verde" o "almidón vegetativo") durante los ciclos día/noche. Los ácidos nucleicos aislados se proporcionan para alterar la cantidad de almidón que se acumula en los tejidos vegetativos de las plantas mediante la inhibición de la actividad de las enzimas que normalmente son responsables de movilizar el almidón Verde. Se proporcionan plantas genéticamente modificadas, que incluyen ácidos nucleicos para la alteración de la cantidad de almidón que se acumula en los tejidos vegetativos de las plantas mediante la inhibición de la actividad de las enzimas que normalmente son responsables de movilizar el almidón Verde. Cualquier planta se puede proporcionar como planta genéticamente modificada.
En una realización, las plantas también pueden ser genéticamente modificadas para expresar enzimas que degradan polisacáridos. Las plantas genéticamente modificadas que tienen niveles elevados de almidón vegetativo también pueden expresar una o más enzimas que degradan polisacáridos. Las enzimas que degradan polisacáridos pueden ser enzimas que degradan almidón. Las enzimas que degradan el almidón pueden ser, pero sin limitación, amilasas (BAM), isoamilasas (tal como ISA3), alfa amilasas (AMY), enzimas de desramificación (DBE), enzimas desproporcionadoras (DPE), dextrinasas límite, glucoamilasas, glucotransferasas, glucosidasas o invertasas. Las enzimas que degradan polisacáridos pueden ser enzimas que degradan la pared celular (CWDE) o CWDE modificadas. Las formas modificadas pueden ser proteínas CWD modificadas por inteína. Las enzimas modificadas por inteína y las condiciones para inducir el corte y empalme de las inteínas, que podría usarse como condiciones de activación, se describieron en la Solicitud de EE.UU. 10/886.393 presentada el 7 de julio de 2004 y en PCT/US10/55746 presentada el 5 de noviembre de 2010 y en PCT/US10/55669 presentada el 5 de noviembre de 2010 y enPCT/US10/55751 presentada el 5 de noviembre de 2010. Una o más enzimas que degradan polisacáridos pueden ser, pero sin limitación, una enzima seleccionada de XynA: Beta-1,4-xilanasa 229B de Dictyoglomus thermophilum (Registro de Uniprot P77853); XynB: Endo-1,4-beta-xilanasa de Thermomyces lanuginosus (Registro de Uniprot O43097); EGA: Endo-beta 1,4-endoglucanasa de Nasutitermes takasagoensis (Registro de Uniprot O77044); EGB: Endo-beta 1,4-endoglucanasa de Acidothermus cellulolyticus (Registro de Uniprot P54583); AccA: Feruloil esterasa A de Apergillus niger (Registro de Uniprot O42807); AccB: Feruloil esterasa B de Aspergillus niger (Número de registro de Uniprot Q8WZI8); AccA/B: Feruloil esterasa A y Feruloil esterasa B de Aspergillus niger; EGC: Endo-beta 1,4-endoglucanasa de Rhodothermus marinus (Registro de Uniprot O33897); P40942: Beta-1,4-xilanasa de Clostridium stereorarium F9 (Número de registro de Uniprot P40942); P40943: Beta-1,4-xilanasa de Geobacillus stearothermophilus T-6 (Bacillus stearothermophilus;Número de registro de Uniprot P40943); O30700: Beta-1,4-xilanasa de Bacillus sp. NG-27(Número de registro de Uniprot O30700); CBHA: celobiohidrolasa A de Clostridium thermocellum (Número de registro de Uniprot O68438); Cb Hb : celobiohidrolasa B (SYT BD22308); o XynE: xilanasa (EU591743).
Las realizaciones en la presente memoria proporcionan cosechar plantas que tienen niveles elevados de almidón y/o enzimas que degradan polisacáridos in plantapara su uso como materia prima en el procesamiento agrícola. La biomasa de plantas genéticamente modificadas que expresan enzimas que degradan polisacáridos pueden no requerir tratamientos previos severos para mejorar la accesibilidad de la pared celular de celulosa a las enzimas exógenas. Los métodos y composiciones para el tratamiento previo consolidado y la hidrólisis de la biomasa de plantas que expresan enzimas que degradan la pared celular se describieron en laSolicitud de Patente de Estados Unidos N.° 13/414.627, presentada el 7 de marzo de 2012; y en la Solicitud de Patente Internacional N.° PCT/US2012/028132, presentada el 7 de marzo de 2012.
En una realización, se proporcionan aplicaciones en piensos p<r< animales que incluyen niveles aumentados de almidón en tejidos vegetativos. Los azúcares fácilmente fermentables disponibles en un proceso de fermentación pueden proporcionarse mediante realizaciones en la presente memoria. La producción de biocombustibles se puede potenciar proporcionando azúcares fácilmente fermentables. Los métodos para proporcionar azúcares fácilmente fermentables y los métodos para potenciar la producción de biocombustibles se proporcionan como realizaciones en la presente memoria.
Los cultivos con niveles elevados de almidón vegetativo tienen una variedad de usos y utilidades. En una realización, se proporciona biomasa de plantas que acumulan niveles elevados de almidón vegetativo en relación con las plantas de tipo silvestre. Estas plantas pueden tener un valor añadido como materia prima para procesos de fermentación o aplicaciones de piensos para animales. Por ejemplo, en un proceso celulósico típico, los polisacáridos tales como la celulosa y las hemicelulosas que están presentes en la biomasa se hidrolizan a azúcares simples, que se pueden fermentar después a etanol, butanol, isobutanol, ácidos grasos u otros hidrocarburos por microorganismos. Debido a la recalcitración de la biomasa, la liberación de azúcares simples a partir de polímeros tales como celulosa y hemicelulosas, con frecuencia necesita el uso de condiciones de tratamiento previo severas e hidrólisis con mezclas de enzimas relativamente caras. Por el contrario, cualquier almidón que esté presente en la biomasa representa una fuente adicional de azúcares simples (a saber, glucosa), que pueden liberarse muy fácilmente y de forma mucho menos costosa con tratamientos con ácido diluido o con hidrólisis por amilasas, que están actualmente disponibles y son mucho menos costosas que las enzimas necesarias para la digestión de celulosa y hemicelulosas. Como resultado, cualquier aumento en la cantidad de almidón presente en la biomasa aumentará simultáneamente la cantidad de azúcar fermentable que se puede recuperar (y, por lo tanto, la cantidad de etanol, butanol, etc. que se puede hacer) con solo un aumento desproporcionadamente pequeño en los costes del proceso (es decir, la adición de una amilasa o un tratamiento previo con ácido de bajo coste). De manera similar, la biomasa que contiene niveles elevados de almidón puede tener mayor valor en las aplicaciones de forraje, donde el material vegetal se utiliza para alimentar al ganado. De nuevo, el exceso de almidón presente en este material es digerido más fácilmente por la mayoría de los animales que el material celulósico, proporcionando más energía por unidad de biomasa que la biomasa con niveles normales de almidón. Las realizaciones incluyen la utilización de una planta transgénica como se establece en la presente memoria para cualquiera de estos métodos.
Los métodos en la presente memoria, incluidos los del párrafo anterior, pueden incluir modificar plantas para crear plantas genéticamente modificadas, cultivar las plantas genéticamente modificadas, cosechar las plantas y procesarlas para aplicaciones de piensos para animales como se haría con otros cultivos forrajeros, o secarlas y tratarlas para su uso en procesos de fermentación similares a la forma de tratamiento que se usa en los procesos celulósicos pero con la adición de un tratamiento tal como hidrólisis ácida o digestión por amilasas para la hidrolización del almidón a sus azúcares componentes. Cualquier etapa, conjunto de etapas, o todas las etapas establecidas en este párrafo se pueden proporcionar en un método en la presente memoria.
Se identificaron genes para la alteración del almidón verde. Cualquier enzima, proteína o el ácido nucleico implicados en el metabolismo del almidón pueden ser objeto de alteración de los niveles de Almidón Verde. En una realización, la alteración se logra mediante la supresión de la expresión génica de genes relacionados con el Almidón Verde. En una realización, la alteración es un aumento en la cantidad de Almidón Verde. Las enzimas particulares que pueden ser dianas incluyen, entre otras, Glucano Agua Dicinasa (también conocida como GWD, R1, sex1); Fosfoglucano Agua Dicinasa (también conocida como PWD); Proteína Fosfatasa de Especificidad Dual (también conocida como DSP, sex4); p-amilasa (BAM), isoamilasa (también conocida como ISA3), dextrinasas límite (también conocidas como LDA); enzima desproporcionadora; y otras enzimas de desramificación. GWD fosforila el almidón, que después es susceptible a las enzimas que degradan el almidón. PWD fosforila el almidón y puede depender de la acción previa de GWD por epistasia. La DSP es reguladora y puede activar enzimas que degradan el almidón. DSP también puede fosforilar almidón. También, se sospecha que DSP tiene actividad endo-amilasa, que puede ser sinérgica con la movilización de almidón por p-amilasa e isoamilasa. BAM (pero no a-amilasa) e ISA3 están implicadas en la movilización del almidón vegetativo. La actividad de BAM depende de GWD y la actividad de ISA3 depende de BAM.
Hay varias estrategias disponibles para interferir con la expresión o acumulación de actividades enzimáticas en las plantas. Entre estas están el ARN antisentido, supresión conjunta e interferencia de ARN (Frizzi & Huang 2010 y Chi-Ham et al. 2010), mutagénesis y estrategias de exploración tal como TILLING (Sikora et al. 2011), inserción de ADN-T y mutagénesis basada en transposones (An et al. 2005), estrategias de edición del genoma que implican nucleasas como las nucleasas de dedos de zinc (Wright et al. 2005), nucleasas efectoras TAL (Christian et al. 2010), o meganucleasas derivadas de inteína (Wehrkamp-Richter et al. 2009).
Se han desarrollado varias estrategias de edición del genoma para introducir cambios estables que bloquean total o parcialmente (es decir, silencian o atenúan) la expresión de genes que codifican enzimas que están implicadas en la movilización del almidón transitorio. Entre estas están eliminar regiones críticas en los promotores, secuencias de codificación, o secuencias terminadoras de los genes o cambiar o eliminar restos de aminoácidos clave en el dominio catalítico de las enzimas para reducir la actividad de la enzima que se expresa. Se pueden introducir cambios introduciendo un transgén que expresa una nucleasa recombinante en plantas transgénicas que expresa una nucleasa recombinante que está diseñada para escindir el gen diana como se describió anteriormente (Puchta et al. 1993; Wright et al. 2005 y Wehrkamp-Richter et al. 2009). El gen diana puede ser en sí mismo, un transgén separado o un gen endógeno natural de la planta. Una vez expresada, la nucleasa introducirá rupturas de ADN bicatenario en la secuencia diana, por ejemplo, eliminando un segmento corto que después se puede reparar parcialmente por los mecanismos de reparación del ADN de la célula, dejando una lesión dentro del gen diana. Una vez que el gen diana se ha escindido, el gen de la nucleasa ya no es necesario. Si el gen de la nucleasa se introdujo en sí mismo como parte de un transgén estable separado, entonces el transgén nucleasa puede haberse integrado en un sitio diferente dentro del genoma del organismo hospedador. En tales casos, el gen de la nucleasa puede eliminarse de las plantas mediante segregación y selección genética. Como alternativa, el gen de la nucleasa se puede introducir como un sistema de expresión transitoria, por ejemplo, como parte del genoma de un virus no integrante según lo descrito por Vainstein et al. 2011. En cualquier caso, si las alteraciones (eliminaciones) en el gen diana son portadas por células en la línea germinal, la progenie de las plantas modificadas portará los genes diana alterados y no expresará la enzima completamente funcional de ese gen diana.
En una realización, las dianas pueden suprimirse utilizando la supresión del ARNi de la expresión génica. Se proporcionan construcciones de ARNi para suprimir la expresión génica de proteínas diana. Las proteínas diana pueden ser enzimas. La enzima diana puede seleccionarse de una enzima implicada en la movilización de Almidón Verde. Se proporcionan construcciones de ARNi que suprimen al menos una de GWD, PWD, DSP, BAM, isoamilasa, LDA, enzimas desproporcionadoras y otras enzimas de desramificación.
Se han desarrollado varias estrategias para expresar ARNi en plantas transgénicas. Véase, por ejemplo, Horiguchi G., RNA silencing in plants: a shortcut to functional analysis (2004) Differentiation 72(2-3): 65-73. Véase también Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijk PA, Green AG, Waterhouse PM, Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs (2000) Nature 407:319-20; Stoutjesdijk Pa , Singh Sp , Liu Q, Hurlstone CJ, Waterhouse PA, Green AG hpRNA-mediated targeting of the Arabidopsis FAD2 gene gives highly efficient and stable silencing (2002) Plant Physiol. 129 (4): 1723-31. Con referencia a las FIG. 1A - G, se ilustran estrategias ejemplares para ARNi. Las realizaciones en la presente memoria incluyen construcciones de ARNi, métodos y plantas transgénicas que implementan una estrategia de ARNi. Los promotores 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107 y 108 pueden permitir la transcripción de ácido nucleico en las construcciones. La estrategia mostrada en la FIG. 1E incluye un promotor 109 sensible a XVE y la estrategia en la FIG. ID incluye fragmentos promotores 110 y 111. También se ilustran los terminadores 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 y 130, como son las secuencias terminadoras transcritas 122a y 123. Los espaciadores 132, 133 y 134 se ilustran para estrategias en las FIG. 1A, 1C e ID y las FIG. 1A y 1C ilustran los separadores transcritos 132a y 133b. Los intrones 140, 141 y 142 y el intrón transcrito 140a se ilustran en las FIG. 1B, 1E y IF. Se muestran los fragmentos de ADNc 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 y 161, así como el ADNc transcrito 150a, 151a, 152a, 153a, 154a y la cadena de ARNbc 154a '. En las FiG. 1E y IF, se ilustran los sitios loxP 170, 171 y 172. Las realizaciones incluyen métodos que utilizan ARN iniciadores separados por un separador de intrones como se ilustra en la FIG. 1B y construcciones de ARNi, vectores, vectores intermedios, vectores de transformación, cebadores y plantas transgénicas para implementar la estrategia de la FIG. 1B. Pero las realizaciones en la presente memoria no están limitadas a la estrategia ilustrada en la FIG. 1B.
En una realización, se proporcionan ácidos nucleicos aislados que tienen una secuencia como se establece en uno cualquiera de los ácidos nucleicos enumerados en la presente memoria o el complemento de los mismos. En una realización, se proporcionan ácidos nucleicos aislados que tienen una secuencia que hibrida con un ácido nucleico que tiene la secuencia de cualquier ácido nucleico enumerado en la presente memoria o el complemento del mismo. En una realización, las condiciones de hibridación son condiciones de baja rigurosidad. En una realización, las condiciones de hibridación son condiciones de rigurosidad moderada. En una realización, las condiciones de hibridación son condiciones de alta rigurosidad. En los siguientes libros se describen ejemplos de protocolos de hibridación y métodos para la optimización de los protocolos de hibridación: Molecular Cloning, T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; y, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith, K. Struhl, Volumen 1, John Wiley & Sons, 2000. Las condiciones moderadas pueden ser las siguientes: los filtros cargados con muestras de ADN se tratan previamente durante 2 - 4 horas a 68 °C en una solución que contiene 6 x solución salina tamponada con citrato (SSC; Amresco, Inc., Solon, OH), dodecilsulfato de sodio al 0,5 % (SDS; Amresco, Inc., Solon, OH), 5X solución de Denhardt (Amresco, Inc., Solon, OH) y esperma de salmón desnaturalizado (Invitrogen Life Technologies, Inc. Carlsbad, CA). La hibridación se realiza en la misma solución con las siguientes modificaciones: EDTA 0,01 M (Amresco, Inc., Solon, OH), 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón y 5 - 20 x 106 cpm de sondas marcadas con 32P o marcadas de forma fluorescente. Los filtros se incuban en una mezcla de hibridación durante 16-20 horas y después se lavan durante 15 minutos en una solución que contiene 2xSSC y SDS al 0,1 %. La solución de lavado se reemplaza por un segundo lavado con una solución que contiene 0,1xSSC y SDS al 0,5 % y se incuba durante 2 horas adicionales a 20 °C a 29 °C por debajo de la Tf (temperatura de fusión en °C). Tf = 81,5 16,61Log1ü([Na+]/(1,0+0,7[Na+]))+0,41(%[G+C])-(500/n)-P-F. [Na+] = Concentración Molar de iones de sodio. % [G C] = porcentaje de bases G C en la secuencia de ADN. N = longitud de la secuencia de ADN en bases. P = una corrección de temperatura para % de pares de bases no coincidentes (~1 °C por 1% de falta de coincidencia). F = corrección para la concentración de formamida (= 0,63 °C por 1 % de formamida). Los filtros se exponen para el desarrollo en un generador de imágenes o por autorradiografía. Las condiciones de baja rigurosidad se refieren a las condiciones de hibridación a bajas temperaturas, por ejemplo, entre 37 °C y 60 °C y el segundo lavado con mayor [Na+] (hasta 0,825 M) y a una temperatura de 40 °C a 48 °C por debajo de la Tf. Alta rigurosidad se refiere a condiciones de hibridación a altas temperaturas, por ejemplo, por encima de 68 °C y el segundo lavado con [Na+] = 0,0165 a 0,0330 M a una temperatura de 5 °C a 10 °C por debajo de la Tf.
En una realización, se proporcionan ácidos nucleicos aislados que tienen una secuencia que tiene al menos 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de identidad a lo largo de su longitud con una porción contigua de un ácido nucleico que tienen cualquiera de las secuencias establecidas en la presente memoria o los complementos de las mismas. La porción contigua puede ser la longitud completa de una secuencia establecida en la presente memoria o el complemento de la misma.
La determinación del porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de los ácidos nucleicos puede incluir alinear y comparar los restos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones correspondientes en las dos secuencias. Si todas las posiciones en dos secuencias están ocupadas por restos de aminoácidos o nucleótidos idénticos, entonces se dice que las secuencias son 100 % idénticas. El porcentaje de identidad puede medirse mediante el algoritmo Smith Waterman (Smith TF, Waterman MS 1981 "Identification of Common Molecular Subsequences", J Mol Biol 147: 195-197).
En una realización, se proporcionan ácidos nucleicos, polinucleótidos u oligonucleótidos aislados que tienen una porción de la secuencia como se establece en cualquiera de los ácidos nucleicos enumerados en la presente memoria o el complemento de la misma. Estos ácidos nucleicos, los polinucleótidos u oligonucleótidos aislados no se limitan a, sino que pueden tener una longitud en el intervalo de 10 a longitud completa, 10 a 3000, 10 a 2900, 10 a 2800, 10 a 2700, 10 a 2600, 10 a 2500, 10 a 2400, 10 a 2300, 10 a 2200, 10 a 2100, 10 a 2000, 10 a 1900, 10 a 1800, 10 a 1700, 10 a 1600, 10 a 1500, 10 a 1400, 10 a 1300, 10 a 1200, 10 a 1100, 10 a 1000, 10 a 900, 10 a 800, 10 a 10 a 600, 10 a 500, 10 a 400, 10 a 300, 10 a 200, 10 a 100, 10 a 90, 10 a 80, 10 a 70, 10 a 60, 10 a 50, 10 a 40, 10 a 35, 10 a 30, 10 a 25, 10 a 20, 10 a 15, o 20 a 30 nucleótidos o 10, 15, 20 o 25 nucleótidos. Un ácido nucleico, polinucleótido u oligonucleótido aislado que tiene una longitud dentro de uno de los intervalos anteriores puede tener cualquier longitud específica dentro del intervalo mencionado, extremos inclusive. La longitud recitada de los nucleótidos puede comenzar en cualquier posición única dentro de una secuencia de referencia (es decir, cualquiera de los ácidos nucleicos en la presente memoria) donde suficientes nucleótidos siguen la posición única para acomodar la longitud recitada. En una realización, una sonda o cebador de hibridación es del 85 al 100 %, 90 al 100 %, 91 al 100 %, 92 al 100 %, 93 al 100 %, 94 al 100 %, 95 al 100 %, 96 al 100 %, 97 al 100 %, 98 al 100 %, 99 al 100 %, o el 100 % complementario a un ácido nucleico con la misma longitud que la sonda o cebador y que tiene una secuencia elegida de una longitud de nucleótidos correspondiente a la longitud de la sonda o cebador dentro de una porción de una secuencia como se establece en cualquier uno de los ácidos nucleicos enumerados en la presente memoria. En una realización, una sonda o cebador de hibridación hibrida a lo largo de su longitud a una longitud correspondiente de un ácido nucleico que tiene la secuencia como se establece en cualquiera de los ácidos nucleicos enumerados en la presente memoria. En una realización, las condiciones de hibridación son de baja rigurosidad. En una realización, las condiciones de hibridación son rigurosidad moderada. En una realización, las condiciones de hibridación son de alta rigurosidad.
Cualquiera de los ácidos nucleicos aislados en la presente memoria puede proporcionarse en un kit. El kit puede usarse para hacer una construcción de ARNi, producir plantas transgénicas, probar una planta para determinar la presencia de un gen de interés, probar una planta para determinar la presencia de una construcción de ARNi como se describe en la presente memoria, o cualquier otro método o propósito descrito en la presente memoria. Un kit puede incluir uno o más vectores en la presente memoria o una o más sondas o cebadores en la presente memoria.
En una realización, se proporciona una planta genéticamente modificada. La planta genéticamente modificada puede derivar de cualquier planta. La planta genéticamente modificada puede derivar de una planta de cultivo energético, una planta de cultivo de forraje o una planta de cultivo de alimentos. La planta de cultivo de energía puede ser, pero sin limitación, una planta de maíz, una planta de mijo, una planta de álamo o una planta de miscanto. La planta de cultivo de forraje puede ser, pero sin limitación, una planta de sorgo. La planta de cultivo de alimentos puede ser, pero sin limitación, una planta de maíz o una planta de tomate. La planta genéticamente modificada puede ser una planta transgénica. La planta transgénica puede incluir una construcción de ARNi. La planta transgénica puede incluir una construcción genética que inactiva o inhibe la expresión de al menos un gen que codifica una proteína implicada en la movilización de almidón en una planta. La planta transgénica también puede incluir un ácido nucleico que codifica una enzima que degrada polisacáridos. La planta puede ser una planta de arroz, una planta de mijo, una planta de sorgo, una planta de maíz o una planta de tomate.
Una planta genéticamente modificada se refiere a una planta transgénica o una planta mutante, progenie de una planta transgénica o una planta genéticamente modificada, un descendiente de una planta transgénica o una planta genéticamente modificada, o una parte de cualquiera de las anteriores. Una planta transgénica puede incluir una construcción genética. La construcción genética puede incluir un primer ácido nucleico que codifica un producto que puede inactivar o inhibir la expresión de al menos un gen que codifica una proteína implicada en la movilización de almidón en una planta. La construcción genética también puede incluir un segundo ácido nucleico aislado que codifica al menos una enzima que degrada polisacáridos, que no se produce naturalmente en la planta. Tras la expresión del primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico, la planta genéticamente modificada puede tener un nivel alterado de almidón vegetativo en comparación con el nivel de almidón vegetativo en una planta no modificada genéticamente del mismo fondo genético que la planta genéticamente modificada pero que carece de la construcción genética. La planta genéticamente modificada puede expresar al menos una enzima que degrada polisacáridos. La planta genéticamente modificada puede incluir más de una construcción genética. La planta genéticamente modificada puede incluir una primera construcción que comprende un primer ácido nucleico aislado que codifica un producto que puede inactivar o inhibir la expresión de al menos un gen que codifica una proteína implicada en la movilización de almidón en una planta. La planta genéticamente modificada también puede incluir una segunda construcción genética que comprende un segundo ácido nucleico que codifica al menos una enzima que degrada polisacáridos. Las construcciones genéticas pueden integrarse en un genoma de la planta. Las construcciones genéticas pueden expresarse transitoriamente en la planta. Como se emplea en esta memoria, el fondo genético se define como una pluralidad de todos los genes en una planta. Por lo tanto, las plantas de la misma especie o variedad pueden denominarse plantas que tienen los mismos genes o el mismo fondo genético. Una planta genéticamente modificada puede incluir la construcción o las construcciones genéticas descritas en la presente memoria y, de otro modo, puede tener los mismos genes que una planta no modificada genéticamente del mismo fondo genético.
Una realización incluye una planta genéticamente modificada. La planta genéticamente modificada puede ser cualquiera de las descritas en la presente memoria. La planta genéticamente modificada puede ser una planta transgénica que tiene un nivel alterado de almidón vegetativo, o cualquier parte de la planta transgénica. La planta genéticamente modificada puede ser una planta transgénica que expresa una enzima que degrada polisacáridos, o cualquier parte de la planta transgénica. La planta genéticamente modificada puede ser cualquier planta transgénica que tenga un nivel alterado de almidón vegetativo y/o que exprese una enzima que degrada polisacáridos, o cualquier parte de la planta transgénica. La planta genéticamente modificada puede incluir un primer ácido nucleico aislado que codifica un producto que inactiva o inhibe la expresión de al menos un gen que codifica una proteína implicada en la movilización de almidón en una planta y un segundo ácido nucleico aislado que codifica al menos una enzima que degrada polisacáridos. El primer ácido nucleico aislado puede ser como se describe a continuación. El segundo ácido nucleico aislado puede ser como se describe a continuación. Tras la expresión del primer ácido nucleico, la planta genéticamente modificada puede tener un nivel alterado de almidón vegetativo en comparación con el nivel de almidón vegetativo en una planta no modificada genéticamente que tiene el mismo fondo genético que la planta genéticamente modificada pero que carece del primer ácido nucleico aislado. El nivel alterado puede ser un nivel aumentado.
Una planta genéticamente modificada puede ser un mutante convencional que tiene una o más mutaciones en una secuencia del ácido nucleico de un gen que da como resultado la inhibición de la expresión del gen que codifica una enzima implicada en la movilización de almidón en una planta. Las mutaciones pueden ser eliminaciones, inserciones o sustituciones de ácidos nucleicos en una secuencia de genes diana. El mutante convencional puede tener un nivel alterado de almidón vegetativo en comparación con una planta no mutante del mismo fondo genético. El mutante convencional puede adicionalmente modificarse genéticamente para incluir un ácido nucleico que codifica una enzima que degrada polisacáridos. El mutante convencional que tiene un nivel alterado de almidón vegetativo puede ser también una planta transgénica que expresa una enzima que degrada polisacáridos.
La planta genéticamente modificada puede ser de cualquier tipo de planta. La planta genéticamente modificada puede ser, pero sin limitación, maíz, soja, arroz, caña de azúcar, remolacha azucarera, sorgo, mijo, miscanto, eucalipto, sauce o álamo. Una planta genéticamente modificada puede ser una planta transgénica o una planta mutante completa o partes de la planta. Las partes pueden ser, pero sin limitación, hojas, tallos, flores, brotes, pétalos, ovarios, frutas o semillas. Una planta genéticamente modificada puede ser callo de una planta transgénica o una planta mutante. Una planta genéticamente modificada puede regenerarse a partir de partes de una planta transgénica o una planta o plantas mutantes. Una planta genéticamente modificada puede ser un producto del cruce sexual de una primera planta transgénica y una segunda planta transgénica o una planta no transgénica donde la planta producto conserva una secuencia de polinucleótidos introducida en la primera planta transgénica. Una planta genéticamente modificada puede ser un producto del cruce sexual de una primera planta mutante y una segunda planta no mutante donde la planta producto conserva una mutación introducida en la primera planta mutante. La planta transgénica o la planta mutante pueden ser cualquiera de las plantas transgénicas o plantas mutantes proporcionadas en la presente memoria.
Una realización proporciona una construcción genética diseñada para implementar una estrategia para modificar los niveles de almidón vegetativo en plantas. La construcción genética puede incluir un primer ácido nucleico aislado que codifica un producto que inactiva o inhibe la expresión de uno o más genes que codifican una proteína implicada en la movilización de almidón en una planta. El producto puede ser, pero sin limitación, una construcción de ARNi, un ARNh, un miARN, una enzima de restricción o una meganucleasa. La proteína puede ser, pero sin limitación, Glucano Agua Dicinasa (GWD), Fosfoglucano Agua Dicinasa (PWD), Proteína Fosfatasa de Especificidad Dual (DSP), dextrinasa límite (LDA), enzima desproporcionadora, una enzima de desramificación, p-amilasa (BAM) e isoamilasa. La construcción genética puede incluir un segundo ácido nucleico aislado que codifica una o más enzimas que degradan polisacáridos.
La construcción genética puede incluir además un complemento invertido del primer ácido nucleico aislado y un espaciador contiguo con y entre el primer ácido nucleico aislado y el complemento invertido. La expresión "complemento invertido" se refiere a una secuencia complementaria a otra secuencia en la misma cadena de un ácido nucleico. Por ejemplo, un complemento invertido del primer ácido nucleico aislado está en la misma cadena que el primer ácido nucleico aislado. A modo de ejemplo adicional, un complemento invertido de una secuencia de ácido nucleico de OsDSP1:
TATG G TTG A C A A G CTTGT GC A G TT T GCT A A T C A C AGC AG G AAG C C TC AATC G C
A A A T C A A A A G C A TC A A A A TC C C TA A TTTC G G C A C G A C A G TG C TC TA TA TC TTT
AC A TTG TA G AC A A T A T T CTT G A A T GGC AC A G ATG T C A A C T C C A A A A T A T T C A A
GGT CTGG ATC TT GCTGCAGGC AG A A T A C T G IT 1 T I A C A C C A A T G TCCCTAAG TT
TATC AACATCAAG TG G G C TCTG TAAG C AG G AG C C C AC G ATC AAG TC TG G G C G T
A T G A AATTG TA G TTC ATTCC AA G C TC ATG TC TATA C G T C AA C ACTG CT CCCAT A
GCTT GCGTCATGTTGGTG CT GT AC GTATCGG ATTTCTCCGTGCCCGCCTCCACT
GCG CCACTCTGGGCGCT AG A A G T AG AC GCCC CGG AT G CG GTTTTGAC AG TG TT
TGATCG G CG ACTCCCG CCACG AACCATCG TCAG ATTG AG CG G CG AG G G CCG C
CT CATGG ACCTGG ATCCCACGATTGGAGGCTCCTTGAGC AGGTTCTGGAGGCA
G T T C A T (SEQ ID NO: 40) es la siguiente secuencia:
AT GAACTGCCTCC AGAACCT GCT C AAGGAGCCTCC AATCGT GGGATCC AGGT C
CATGAGGCGGCCCTCGCCGCTCAATCTGACGATGGTTCGTGGCGGGAGTCGCC
GATCAAACACTGTCAAAACCGCATCCGGGGCGTCTACTTCTAGCGCCCAGAGT
GGCGCAGTGGAGGCGGGCACGGAGAAATCCGATACGTACAGCACCAACATGA
CGC AAGCT ATGGGAGC AGT GTTGACGT AT AGAC AT GAGCTT GGAAT GAACT A
CAATTTCATACGCCCAGACTTGATCGTGGGCTCCTGCTTACAGAGCCCACTTG
AT GTT G AT AAACTT AGGG AC ATT GGT GT AAAAAC AGT ATT CTGC CT GC AGC AA
G ATCC AG AC CTT G AAT ATTTT GG AGTT G AC ATCTGT GCC ATT C AAG AAT ATT GT
CT AC AAT GT AAAG AT AT AG AGC ACT GT C GT GC CG AA ATT AGGG ATTTT G AT GC
TTTT G ATTTGCG ATT G AGGCTT C CTGCT GT G ATT AGC AAACT GC AC A AGCTT GT
CAACCATA (SEQ ID NO: 172).
Una secuencia del complemento invertido puede ser capaz de hibridar con una secuencia del primer ácido nucleico aislado. La secuencia del complemento invertido puede ser capaz de hibridar con la secuencia del primer ácido nucleico aislado en condiciones in situ en una planta genéticamente modificada. La secuencia del complemento invertido puede ser capaz de hibridar con la secuencia de la primera secuencia de ácido nucleico en condiciones de baja, moderada o alta rigurosidad.
La construcción genética también puede incluir un espaciador contiguo con y entre el primer ácido nucleico aislado y el complemento invertido. El espaciador puede estar operativamente unido al primer ácido nucleico aislado y al complemento invertido y puede proporcionar una conexión entre el primer ácido nucleico aislado y el complemento invertido de manera que las secuencias de ARN transcritas desde el primer ácido nucleico aislado y el complemento invertido pueden hibridar entre sí. El primer ácido nucleico aislado puede estar cadena arriba y contiguo al espaciador y el espaciador puede estar cadena arriba y contiguo al complemento invertido. El complemento invertido puede estar cadena arriba y contiguo al espaciador y el espaciador puede estar cadena arriba y contiguo al primer ácido nucleico. Un espaciador operativamente unido puede ser un intrón. El intrón puede empalmar las secuencias del primer ácido nucleico aislado y el complemento invertido.
La construcción genética puede incluir un promotor operativamente unido al primer ácido nucleico aislado, al complemento invertido y al espaciador. El promotor operativamente unido puede permitir la transcripción del primer ácido nucleico aislado, del complemento invertido y del espaciador. La transcripción del primer ácido nucleico aislado, del complemento invertido y del espaciador pueden denominarse expresión del primer ácido nucleico aislado, del complemento invertido y del espaciador. T ras la expresión del primer ácido nucleico aislado, del complemento invertido y del separador, la secuencia de ARN transcrita del primer ácido nucleico aislado y la secuencia de ARN transcrita del complemento invertido pueden ser capaces de hibridar entre sí. Las transcripciones de ARN hibridadas del primer ácido nucleico aislado y del complemento invertido pueden ser capaces de inhibir la expresión del gen. Una planta transgénica puede incluir más de un tipo de construcción de ARNi. Cada tipo diferente de construcción de ARNi puede dirigirse a inhibir un gen diferente que expresa una proteína diana diferente. El gen diana puede seleccionarse de uno o más genes que codifican una proteína implicada en la movilización de almidón en una planta. La proteína puede ser, pero sin limitación, Glucano Agua Dicinasa (GWD), Fosfoglucano Agua Dicinasa (PWD), Proteína Fosfatasa de Especificidad Dual (DSP), dextrinasa límite (LDA), enzima desproporcionadora, una enzima de desramificación, pamilasa (BAM) o isoamilasa.
En una realización, un primer ácido nucleico aislado y una repetición invertida pueden codificar un producto que puede ser un ARNh. El ARNh puede ser homólogo a una porción de un ARN mensajero que codifica una proteína implicada en la movilización de almidón en una planta. El ARNh puede ser homólogo a una porción de un ARN mensajero que codifica las secuencias 5 'UTR o 3' UTR para una proteína implicada en la movilización de almidón en una planta. Las secuencias que son complementarias de un ARN mensajero se denominan "secuencias iniciadoras".
En una realización, un primer ácido nucleico aislado puede codificar un producto que puede ser una construcción de ARNi. La construcción de ARNi puede diseñarse para implementar cualquier estrategia con ARNi, incluyendo, pero sin limitación, los ilustrados en la FIG. 1A - G. Una construcción de ARNi puede incluir un primer ácido nucleico aislado que tiene una secuencia complementaria a una porción de un gen en la planta genéticamente modificada que codifica una proteína diana implicada en la movilización del almidón vegetativo. El primer ácido nucleico aislado puede ser una primera secuencia iniciadora. El primer ácido nucleico aislado puede tener al menos un 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % de identidad a lo largo de la longitud del ácido nucleico aislado con una porción de un gen en la planta genéticamente modificada que codifica una proteína diana implicada en la movilización del almidón vegetativo. La longitud del primer ácido nucleico puede ser cualquier longitud adecuada para proporcionar un efecto de ARNi. La construcción de ARNi puede incluir un complemento invertido del primer ácido nucleico aislado. El complemento invertido puede ser una segunda secuencia iniciadora.
El primer ácido nucleico aislado puede incluir una porción que tiene al menos un 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % de identidad con una secuencia del gen diana. La identidad se puede medir a lo largo de toda la secuencia del gen diana. El gen diana puede seleccionarse del uno o más genes que codifican una proteína implicada en la movilización de almidón vegetativo en una planta. El gen diana puede ser cualquier gen implicado en la movilización de almidón vegetativo en una planta. Puede haber más de un gen diana. La longitud de la porción del primer ácido nucleico aislado puede ser igual a la longitud del gen diana. La longitud de la porción puede tener, pero sin limitación, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 505, 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695 o 700 nucleótidos de longitud, o cualquier longitud dentro de un intervalo entre dos cualquiera de las longitudes anteriores.
En una realización, un primer ácido nucleico aislado puede codificar el producto que puede ser un miARN capaz de dirigirse a un ARN mensajero transcrito a partir del gen diana. El primer ácido nucleico aislado puede tener de 18 a 25 nucleótidos de longitud. El primer ácido nucleico aislado puede tener 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295 o 300 nucleótidos de longitud, o cualquier longitud dentro de un intervalo entre dos de las longitudes anteriores.
En una realización, un primer ácido nucleico aislado puede codificar un producto que puede ser una enzima de restricción capaz de cortar una secuencia del gen diana. La enzima de restricción puede ser, pero sin limitación, una meganucleasa, una nucleasa con dedos de zinc, o una nucleasa efectora TAL. La meganucleasa puede ser I-CreI, I-DmoI, I-SceI, E-Dmel o DmoCre. Se pueden usar otras meganucleasas conocidas.
La construcción genética puede incluir un primer ácido nucleico aislado que codifica un producto que tiene cualquier secuencia adecuada para afectar la expresión de un gen que codifica una proteína diana. La secuencia puede ser adecuada para afectar el ARNi de un gen que codifica una proteína diana. El primer ácido nucleico aislado puede incluir una secuencia con al menos un 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 38 [amiRNA1wmd3 de OsGWD], SEQ ID NO: 39 [micro ARN de OsGWD osa-MR809aM1], SEQ ID NO: 40 [OsDSP1], SEQ ID NO: 41 [OsDSP2], SEQ ID NO: 42 [OsGWD1], SEQ ID NO: 43 [OsGWD2], SEQ ID NO: 44[OsPWD1], SEQ ID NO: 45 [OsPWD2], SEQ ID NO: 46 [sec. flanqueantes SbGWD- SbGWDko2b], SEQ ID NO: 47 [SbGWD1], SEQ ID NO: 48 [SbGWD2], SEQ ID NO: 49 [ZmGWD1], SEQ ID NO: 50 [ZmGWD2], SEQ ID NO: 179 [GWD1], SEQ ID NO: 180 [GWD2], SEQ ID NO: 183 [DSP1], SEQ ID NO: 184 [ISA3], SEQ ID NO: 209 [PvGWDko2] y SEQ ID NO: 216 [sec. flanqueantes SbGWDko2a]. La identidad se puede medir a lo largo de toda la longitud de la secuencia de referencia. La longitud del primer ácido nucleico aislado puede ser igual a la longitud de la secuencia de referencia.
La construcción de ARNi puede incluir un primer ácido nucleico aislado capaz de hibridar con un ácido nucleico que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 38 [amiRNA1wmd3 de OsGWD], SEQ ID NO: 39 [micro ARN de OsGWD osa-MR809aM1], SEQ ID NO: 40 [OsDSP1], SEQ ID NO: 41 [OsDSP2], SEQ ID NO: 42 [OsGWD1], SEQ ID NO: 43 [OsGWD2], SEQ ID NO: 44[OsPWD1], SEQ ID NO: 45 [OsPWD2], SEQ ID NO: 46 [sec. flanqueantes SbGWD-SbGWDko2b], SEQ ID NO: 47 [SbGWD1], SEQ ID NO: 48 [SbGWD2], SEQ ID NO: 49 [ZmGWD1], SEQ ID NO: 50 [ZmGWD2], SEQ ID NO: 179 [GWD1], SEQ ID NO: 180 [GWD2], SEQ ID NO: 183 [DSP1], SEQ ID NO: 184 [ISA3], SEQ ID n O: 209 [PvGWDko2] y SEQ ID NO: 216 [sec. flanqueantes SbGWDko2a], o el complemento de las mismas en condiciones de baja, moderada o alta rigurosidad.
La construcción de ARNi puede incluir la secuencia de un complemento invertido capaz de hibridar con la secuencia del primer ácido nucleico aislado en condiciones in situ en la planta genéticamente modificada. La construcción de ARNi puede incluir la secuencia del complemento invertido capaz de hibridar con la secuencia del primer ácido nucleico aislado en condiciones de una de baja, moderada o alta rigurosidad.
La construcción de ARNi puede incluir un complemento invertido que tiene al menos un 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % de identidad con el complemento invertido de una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 40 [OsDSP1], SEQ ID NO: 41 [OsDSP2], SEQ ID NO: 42 [OsGWD1], SEQ ID NO: 43 [OsGWD2], SEQ ID NO: 44[OsPWD1], SEQ ID NO: 45 [OsPWD2], SEQ ID NO: 46 [sec. flanqueantes SbGWD-SbGWDko2b], SEQ ID NO: 47 [SbGWD1], SEQ ID NO: 48 [SbGWD2], SEQ ID NO: 49 [ZmGWD1], SEQ ID NO: 50 [ZmGWD2], SEQ ID NO: 179 [GWD1], SEQ ID NO: 180 [GWD2], SEQ ID NO: 183 [DSP1], SEQ ID NO: 184 [ISA3], SEQ ID n O: 209 [PvGWDko2] y SEQ ID NO: 216 [sec. flanqueantes SbGWDko2a]. La identidad puede medirse a lo largo de la longitud del complemento invertido de la secuencia de referencia. La longitud del complemento invertido puede ser igual a la longitud del complemento invertido de la secuencia de referencia.
El espaciador puede ser cualquier secuencia. El espaciador puede ser un intrón. El intrón puede ser cualquier intrón. El intrón puede ser el intrón OsUbi. La secuencia del intrón OsUbi se puede encontrar en la secuencia de pAL409 que tiene la SEQ ID NO: 185 con referencia a la FIG. 2 que ilustra pAL409 con el intrón OsUbi entre las posiciones 4519 -566. La numeración de nucleótidos en la SEQ ID NO: 185 puede variar de la etiquetada en la FIG. 2, pero la comparación de secuencias históricas (p. ej., sitios de restricción) entre la FIG. 2 y SEQ ID NO: 185 permite la identificación de cualquier secuencia específica de un pAL409 característico. La secuencia del intrón OsUbi dentro de la secuencia de la s Eq ID NO: 185 puede identificarse basándose en los sitios de restricción para las enzimas de restricción BspE1 y AgeI. La secuencia del intrón OsUbi puede ubicarse dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 185 entre las secuencias CCTAGG, el sitio de restricción para BspE1 y ACCGGT, el sitio de restricción para AgeI. El intrón puede tener una secuencia que tenga al menos un 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % de identidad con el intrón OsUbi. El intrón puede tener una secuencia que tenga al menos un 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 51 [ZmAdhli6], SEQ ID NO; 52 [OsAdhli], SEQ ID NO: 53 [SbAdh1-2i] y SEQ ID NO: 54 [SbGWDi]. El intrón puede tener una secuencia que hibrida con el intrón OsUbi, o un complemento del mismo en condiciones de baja, moderada o alta rigurosidad. El intrón puede tener una secuencia que hibrida con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 51 [ZmAdhli6], SEQ iD NO; 52 [OsAdhli], SEQ ID NO: 53 [SbAdh1-2i] y SEQ ID NO: 54 [SbGWDi], o el complemento de las mismas en condiciones de baja, moderada o alta rigurosidad.
Una proteína implicada en la movilización de almidón en una planta puede ser una proteína diana. La proteína diana puede ser cualquier proteína implicada en la regulación del Almidón Verde. Por ejemplo, la proteína diana puede ser una Glucano Agua Dicinasa, Fosfoglucano Agua Dicinasa, Proteína fosfatasa de Especificidad Dual, p-amilasa, isoamilasa, dextrinasa límite, enzima desproporcionadora o una enzima de desramificación. El gen diana puede codificar la proteína diana. El gen diana puede seleccionarse del uno o más genes que codifican una proteína implicada en la movilización de almidón en una planta. El gen diana que codifica la proteína diana puede tener una secuencia con al menos un 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 5 [sec. codificante de SbGWD], SEQ ID NO: 6 [sec.codificante de ZmGWD], s Eq iD NO: 7 [secuencia codificante de OsGWD], SEQ ID NO: 8 [gen SbGWD], SEQ ID NO: 9 [gen ZMGWD], SeQ ID NO: 10 [5'UTR y promotor del gen SbGWD], s Eq ID 11 NO: [5'UTR y promotor del gen ZmGWD], SEQ ID NO: 12 [3'UTR del gen SbGWD], SEQ ID NO: 13 [3'UTR del gen ZmGWD], SEQ ID NO: 17 [sec. codificante de SbPWD], SeQ ID NO: 18 [sec. codificante de ZmPWD], SEQ ID NO: 19 [sec. codificante de OsPWD], SEQ ID NO: 20 [gen SbPWD], SEQ ID NO: 21 [gen ZmPWD]. SEQ ID NO: 22 [5'UTR y promotor del gen SbPWD], SEQ ID NO: 23 [3'UTR del gen SbPWD], SEQ ID NO: 24 [3'UTR del gen ZmPWD], SEQ ID NO: 29 [secuencia codificante de ZmDSP], SEQ ID NO: 30 [secuencia codificante de SbDSP], SEQ ID NO: 31 [secuencia codificante de OsDSP], SEQ ID NO: 32 [gen ZmDSP], SEQ ID NO: 33 [gen SbDSP], SeQ ID NO: 34 [5'UTR y promotor del gen ZmDSP], SEQ ID NO: 35 [5'UTR y promotor del gen SbDSP], SEQ ID NO: 36 [3'UTR de ZmDSP], SEQ ID NO: 37 [3'UTR del gen SbDSP], SEQ ID NO: 173 [gen OsGWD], SEQ ID NO: 174 [gen DSP], SEQ ID NO: 175 [gen ISA3], SEQ ID NO: 176 [secuencia codificante de OsGWD], SEQ ID NO: 177 [secuencia codificante de DSP], SEQ ID NO: 178 [secuencia codificante de ISA3], SEQ ID NO: 182 [porción del gen S1GWD], SEQ ID NO: 191 [gen SbGWD-1], SEQ ID NO: 192 [gen SbGDW-2], SEQ ID NO: 206 [PvGWD-2], SEQ ID NO: 207 [PvGWD-5], SEQ ID NO: 208 [PvGWD-1] y SEQ ID NO: 215 [secuencia fusionada de mijo]. La identidad se puede medir a lo largo de toda la longitud de la secuencia de referencia. La longitud de la secuencia del gen diana puede ser igual a la longitud de la secuencia de referencia.
El gen diana que codifica la proteína diana puede tener una secuencia que hibrida con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 5 [sec. codificante de SbGWD], SEQ ID NO: 6 [sec.codificante de ZmGWD], SEQ iD n O: 7 [secuencia codificante de OsGWD], SEQ ID NO: 8 [gen SbGWD], SEQ ID NO: 9 [gen ZMGWD], s Eq ID NO: 10 [5'Ut R y promotor del gen SbGWD], SeQ ID 11 NO: [5'UTR y promotor del gen ZmGWD], SEQ ID NO: 12 [3'UTR del gen SbGWD], SEQ ID NO: 13 [3'UTR del gen ZmGWD], SEQ ID NO: 17 [sec. codificante de SbPWD], SEQ ID NO: 18 [sec. codificante de ZmPWD], SEQ ID NO: 19 [sec. codificante de OsPWD], SEQ ID NO: 20 [gen SbPWD], SEQ ID NO: 21 [gen ZmPWD]. SEQ ID NO: 22 [5'UTR y promotor del gen SbPWD], SEQ ID NO: 23 [3'UTR del gen SbPWD], SEQ ID NO: 24 [3'UTR del gen ZmPWD], SEQ ID NO: 29 [secuencia codificante de ZmDSP], SEQ ID NO: 30 [secuencia codificante de SbDSP], SEQ ID NO: 31 [secuencia codificante de OsDSP], SEQ ID NO: 32 [gen ZmDSP], SeQ ID NO: 33 [gen SbDSP], SEQ ID NO: 34 [5'UTR y promotor del gen ZmDSP], SEQ ID NO: 35 [5'UTR y promotor del gen SbDSP], SEQ ID NO: 36 [3'UTR de ZmDSP], SEQ ID NO: 37 [3'UTR del gen SbDSP], SEQ ID NO: 173 [gen OsGWD], SEQ ID NO: 174 [gen DSP], SEQ ID NO: 175 [gen ISA3], SEQ ID NO: 176 [secuencia codificante de OsGWD], SEQ ID NO: 177 [secuencia codificante de DSP], SEQ ID NO: 178 [secuencia codificante de ISA3], SEQ ID NO: 182 [porción del gen SlGWD], SEQ ID NO: 191 [gen SbGWD-1], SEQ ID NO: 192 [gen SbGDW-2], SEQ ID NO: 206 [PvGWD-2], SEQ ID NO: 207 [PvGWD-5], SEQ ID NO: 208 [PvGWD-1] y SEQ ID NO: 215 [secuencia fusionada de mijo], o el complemento de las mismas en condiciones de baja, moderada o alta rigurosidad.
En una realización, la construcción genética puede incluir el primer ácido nucleico aislado que codifica un producto que inactiva o inhibe la expresión de uno o más genes que codifican una proteína implicada en la movilización de almidón en una planta y el segundo ácido nucleico aislado que codifica una o más enzimas que degradan polisacáridos. Una planta transgénica puede incluir más de un tipo de construcción genética. Cada tipo diferente de construcción genética puede dirigirse a inhibir un gen diferente que expresa una proteína diana diferente y que expresa una enzima que degrada polisacáridos diferente. Una construcción genética puede incluir el primer ácido nucleico aislado. Otra construcción genética puede incluir el segundo ácido nucleico aislado. El gen diana puede seleccionarse de uno o más genes que codifican una proteína implicada en la movilización de almidón en una planta. La al menos una enzima que degrada polisacáridos puede ser, pero sin limitación, una xilanasa, una endoglucanasa, una exoglucanasa, una amilasa, una xilanasa modificada con inteína, una endoglucanasa modificada con inteína, una exoglucanasa modificada con inteína y una amilasa modificada con inteína.
En una realización, el segundo ácido nucleico puede tener al menos un 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 86 [O43097], SEQ ID NO: 87 [BD22308], SEQ ID NO: 88 [BD25243], SEQ ID NO: 89 [EU591743], SEQ ID NO: 90 [NtEGm], SEQ ID NO: 91 [P0C2S1], SEQ ID NO: 92 [P77853], SEQ ID NO: 93 [O68438], SEQ ID NO: 94 [O33897], SEQ ID NO: 164 [amilasa 19862], SEQ ID NO: 165 [glucoamilasa 20082], SEQ ID NO: 166 [glucoamilasa 20707], SEQ ID NO: 167 [amilasa 21853], SEQ ID NO: 168 [AmyS], SEQ ID NO: 170 [GlaA], SEQ ID NO: 104 [EU591743:AS146-7], SEQ ID NO: 105 [P77853: S158-30-108-35] y SEQ ID NO: 106 [P77853:T134-101-100]. La identidad se puede medir a lo largo de toda la longitud de la secuencia de referencia. La longitud de la secuencia del segundo ácido nucleico puede ser igual a la longitud de la secuencia de referencia.
En una realización, el segundo ácido nucleico aislado puede codificar una "variante" de una enzima que degrada polisacáridos. La secuencia de aminoácidos de una variante de una enzima que degrada polisacáridos puede diferir por eliminaciones, adiciones, sustituciones de secuencias de aminoácidos u otras modificaciones de la enzima que degrada polisacáridos. Una variante de una enzima que degrada polisacáridos puede mantener la actividad biológica de la enzima que degrada polisacáridos. Mantener la actividad biológica como se emplea en esta memoria significa que la variante tiene al menos el 60 % de la actividad de la enzima que degrada polisacáridos de la que deriva. La actividad de una xilanasa y una endoglucanasa puede evaluarse en un ensayo usando sustrato Xylazyme AX y sustrato Cellazyme, respectivamente, como se describe en la Solicitud de EE.UU. 10/886.393 presentada el 7 de julio de 2004 y PCT/US10/55746 presentada el 5 de noviembre de 2010 y PCT/US10/55669 presentada el 5 de noviembre de 2010 y PCT/US10/55751 presentada el 5 de noviembre de 2010. La actividad de una exoglucanasa puede evaluarse usando 4-metilumbeliferil-b-D-lactopiranósido fluorescente (4-MU) como se describe en Harrison MD et al.
2011 "Accumulation of recombinant cellobiohydrolase and endoglucanase in the leaves of mature transgenic sugar cane", Plant Biotechnology Journal 9: 884-896. La actividad de una feruloil esterasa puede evaluarse usando un ensayo que usa ferulado marcado con pNP como sustrato (como se describe en Hegde S. et al. 2009 "Single-step synthesis of 4-nitrophenyl ferulate for spectrophotometric assay of feruloyl esterases", Analytical Biochemistry 387(1): 128-129). Las pruebas anteriores para determinar la actividad de una xilanasa, endoglucanasa, exoglucanasa o feruloil esterasa se pueden utilizar para determinar si una secuencia con menos del 100 % de identidad con una secuencia de enzima que degrada polisacáridos en la presente memoria es una variante de la enzima que degrada polisacáridos. Las variantes de una enzima que degrada polisacáridos en la presente memoria pueden modificarse en la secuencia de aminoácidos frente a la enzima que degrada polisacáridos basándose en la similitud en la hidrofobicidad, hidrofilicidad, solubilidad, polaridad de restos de aminoácidos. Las variantes de una enzima que degrada polisacáridos en la presente memoria pueden diferir después de modificaciones postraduccionales. Las diferentes modificaciones postraduccionales pueden ser, sin limitación, glicosilaciones, acetilaciones o fosforilaciones. Una variante puede desarrollarse por cualquier medio. Se puede desarrollar una variante mediante mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis no dirigida. Se puede usar PCR propensa a error para crear mutantes de una enzima que degrada polisacáridos en la presente memoria y se puede usar cualquiera de los ensayos anteriores para evaluar si el mutante es una variante.
Las realizaciones incluyen al menos una de las enzimas que degradan polisacáridos, o variantes de las mismas, unida con variantes de al menos uno de un péptido de direccionamiento, o un péptido de direccionamiento carboxi. Las variantes de un péptido de direccionamiento o un péptido de direccionamiento carboxi dirigirán la proteína con la que se une a la misma ubicación que la secuencia de referencia para el péptido de direccionamiento o el péptido de direccionamiento carboxi.
Se pueden proporcionar variantes de una inteína en una secuencia de la enzima que degrada polisacáridos. Una variante de inteína puede empalmarse con la proteína a la que está unida.
En una realización, una construcción genética puede incluir una secuencia con al menos un 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ iD n O: 59 [OsUbi3P: amiRNA1wmd3 de OsGWD], SEQ ID NO: 60 [Os Ubi3P: osa-MIR809aM1 de OsGWD], SEQ ID NO: 61 [OsUbi3P:ARNh de OsDSP1], SEQ ID NO: 62 [OsUbi3P:ARNh de OsDSP2], SEQ ID NO: 63 [OsUbi3P:ARNh de OsGWD1], SEQ ID NO: 64 [OsUbi3P:ARNh de OsGWD2], SEQ ID NO: 65 [OsUbi3P: ARNh de OsPWD1], SEQ ID NO: 66 [OsUbi3P:ARNh de OsPWD2], SEQ ID NO: 67 [OsUbi3P:ARNi de SbGWD], SEQ ID NO: 68 [ZmPepCP: ARNi de SbGWD1], SEQ ID NO: 69 [ZmPepCP:ARNi de SbGWD2], SEQ ID NO: 70 [ZmPepCP:ARNi de ZmGWD1], SEQ ID NO: 71 [ZmPepCP:ARNi de ZmGWD2], SEQ ID NO: 72 [OsDSP1 y OsGWD2], SEQ ID NO: 73 [OsPWD2 y OsGWD1], SEQ ID NO: 74 [OsDSP2 y OsPWD1], SEQ ID NO: 119 [ZmUbi1P:xGZein27ss:BD22308:xHvVSD], SEQ ID NO: 120 [ZmPepCP: xGZein27ss:BD25243:SEKDEL], SEQ ID NO: 121 [OsUbi3P:EU591743], SEQ ID NO: 122 [ZmUbi1P:EU591743: AS146-7:SEKDEL], SEQ ID NO: 123 [ZmUbi1p: HvAle:NtEGm: SEKDEL], SEQ ID NO: 124 [ZmPepCP: HvAle:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 125 [OsUbi3P:HvAle:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 126 [OsUbi3P:BAASS: O33897), SEQ ID NO: 127 [ZmPepCP:BAASS:O43097:SEKDEL], SEQ ID NO: 128 [OsUbi3P:068438], SEQ ID NO: 129 [OsUbi3P:P0C2S1], SEQ ID NO: 130 [ZmUbi1 P:ZmUBQm:BAASS:P77853:S158-30-108-35], SEQ ID NO: 131 [ZmUbi1:BAASS:P77853:T134-100-101 :SEKDEL], SEQ ID NO: 132 [casete 2379 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 133 [casete 2380 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 134 [casete 4106 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 135 [casete 4107 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 136 [casete 4108 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 137 [casete 4109 - -3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 138 [casete 4110 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 139 [casete 4111 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 140 [casete 4112 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 141 [casete 4113 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 142 [casete 4114 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 143 [casete 4115 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 144 [casete 4116 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 145 [casete 4117 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 146 [casete 4120 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 147 [casete 4121 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 148 [casete 4124 - 2 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 149 [casete 4125 - 2 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 150 [casete 4514 - 3 CWDE y 1 ARNh] y SEQ ID NO: 151 [casete 4515 - 3 CWDE y 1 ARNh]. La identidad se puede medir a lo largo de toda la longitud de la secuencia de referencia. La longitud de la secuencia puede ser igual a la longitud de la secuencia de referencia.
La construcción genética puede incluir además una secuencia reguladora (también denominada elemento regulador) operativamente conectada a un primer ácido nucleico aislado o a un segundo ácido nucleico aislado. En este contexto, conectado operativamente significa que la secuencia reguladora imparte su función al ácido nucleico o la secuencia de polinucleótidos. En el caso de una secuencia reguladora que es un promotor, el promotor es capaz de controlar la expresión del ácido nucleico o de la secuencia de polinucleótidos cuando están conectados operativamente. El promotor puede estar operativamente unido al primer ácido nucleico aislado. El promotor puede estar operativamente unido al segundo ácido nucleico aislado. El promotor operativamente unido puede ser cualquier tipo de promotor. El promotor operativamente unido puede ser un promotor inducible. El promotor operativamente unido puede ser un promotor constitutivo. El promotor puede ser un promotor inducible, que inicia la transcripción de las secuencias de polinucleótidos solo cuando se expone a un estímulo químico o ambiental particular. Ejemplos de promotores inducibles incluyen, pero sin limitación, aquellos que son un promotor inducible por alcoholes, un promotor inducible por tetraciclina, un promotor inducible por esteroides, o un promotor inducible por hormonas. El promotor puede ser un promotor constitutivo. El promotor puede ser un promotor constitutivo, que proporciona la transcripción de los ácidos nucleicos o secuencias de polinucleótidos en toda la planta en la mayoría de las células, tejidos y órganos y durante muchas pero no necesariamente todas las etapas de desarrollo. El promotor puede ser específico para una etapa de desarrollo, órgano o tejido particular. Un promotor específico de tejido puede ser capaz de iniciar la transcripción en un tejido vegetal particular. El tejido vegetal que puede diana de un promotor específico de tejido puede ser, pero sin limitación, hojas, tricomas, anteras o semillas. Un promotor constitutivo en la presente memoria puede ser el promotor de Ubiquitina 3 de arroz (OsUbi3P) o el promotor de fosfoenolpiruvato carboxilasa de maíz (ZmPepCP). Se pueden usar otros promotores constitutivos conocidos, e incluyen, pero sin limitación, el promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (CAMV), el promotor del Virus del Rizado de Hoja Amarilla del (CMP) o la versión corta de CMP (CMPS), el promotor de la subunidad pequeña de Rubisco, el promotor de acción del arroz (OsAct1 P) y el promotor de ubiquitina de maíz (ZmUbi1P). El promotor específico de tejido puede incluir el promotor específico de semilla. El promotor específico de semilla puede ser, pero sin limitación, el promotor GluB4 del arroz o el promotor de zeína de maíz. El promotor puede ser el promotor P-OsUbi. La secuencia del promotor P-OsUbi se puede encontrar en la secuencia de pAL409 que tiene la s Eq ID NO: 185 con referencia a la FIG. 2, que ilustra pAL409 con el promotor P-OsUbi entre las posiciones 3574 - 4507. La numeración de nucleótidos en la SEQ ID NO: 185 puede variar de la etiquetada en la FIG.
2, pero la comparación de secuencias históricas (p. ej., sitios de restricción) entre la FIG. 2 y SEQ ID NO: 185 permite la identificación de cualquier secuencia específica de un pAL409 característico. La secuencia del promotor P-OsUbi puede identificarse basándose en los sitios de restricción para las enzimas de restricción PacI y AvrII. La secuencia del promotor P-OsUbi puede ubicarse entre las secuencias TTAATTAA, el sitio de restricción para PacI y CCTAGG, el sitio de restricción para AvrII. El promotor puede incluir una secuencia con al menos un 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % de identidad con el promotor P-OsUbi. El promotor puede incluir una secuencia que hibrida con el promotor P-OsUbi o el complemento del mismo en condiciones de baja rigurosidad. El promotor puede incluir una secuencia que hibrida con el promotor P-OsUbi o el complemento del mismo en condiciones de moderada rigurosidad. El promotor puede incluir una secuencia que hibrida con el promotor P-OsUbi o el complemento del mismo en condiciones de alta rigurosidad.
En el caso de un elemento regulador que sea un terminador, el terminador es capaz de terminar la transcripción del ácido nucleico o de la secuencia de polinucleótidos. Se puede incluir una secuencia de terminación en el extremo 3' de una unidad transcripcional del casete de expresión. El terminador puede derivar de una variedad de genes vegetales. El terminador puede ser una secuencia de terminación de los genes de nopalina sintasa (NOS) u octopina sintasa (OCS) de Agrobacterium tumefaciens. La secuencia de terminación puede ser el terminador CaMV 35S de CaMV, o cualquiera de las secuencias 3'UTR que se muestra que terminan la transcripción transgénica en plantas. Por ejemplo, se puede utilizar el terminador PepC de maíz (3'UTR).
En una realización, un primer ácido nucleico aislado o el segundo ácido nucleico aislado pueden incluir además una secuencia de polinucleótidos de direccionamiento que codifica un péptido de direccionamiento. Un péptido de direccionamiento puede fusionarse con una o más enzimas que degradan polisacáridos. Cuando un segundo ácido nucleico aislado codifica más de una enzima que degrada polisacáridos, se puede seleccionar independientemente un péptido de direccionamiento para cada una de las enzimas que degradan polisacáridos. Se puede seleccionar un péptido de direccionamiento de, pero sin limitación, una señal de direccionamiento a amiloplastos, un péptido de direccionamiento a la pared celular, un péptido de direccionamiento a mitocondrias, una señal de localización en el citosol, una señal de direccionamiento a cloroplastos, un péptido de direccionamiento nuclear y un péptido de direccionamiento a vacuolas. Un polinucleótido de direccionamiento puede estar cadena arriba del primer ácido nucleico aislado o del segundo ácido nucleico aislado. Un péptido de direccionamiento puede tener al menos un 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % de identidad con uno de BAASS (SEQ ID NO: 107), péptido señal Se KDe L (SEQ ID NO: 108), señal de direccionamiento xHvVSD (SEQ ID NO: 109), la fusión traduccional ZmUBQm (SEQ ID NO: 110), xGZein27ss (SEQ ID NO: 111) o la señal HvAle (SEQ ID NO: 112).
En una realización, se puede insertar una construcción genética en un vector apropiado para la modificación genética de una planta. Los vectores que incorporan una construcción genética en la presente memoria también pueden incluir elementos genéticos adicionales tales como múltiples sitios de clonación para facilitar la clonación molecular y marcadores de selección para facilitar la selección. Un marcador seleccionable que puede incluirse en un vector puede ser un gen de fosfomanosa isomerasa (PMI) de Escherichia coli, lo que confiere a la célula transformada la capacidad de utilizar manosa para el crecimiento. Los marcadores seleccionables que pueden incluirse en un vector incluyen, sin limitación, un gen de neomicina fosfotransferasa (npt), que confiere resistencia a kanamicina, un gen de higromicina fosfotransferasa (hpt), que confiere resistencia a higromicina y un gen de enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa, que confiere resistencia a glifosato.
Una realización incluye un vector que tiene cualquier construcción genética en la presente memoria. El vector puede ser un vector intermedio. El vector puede ser un vector de transformación. El constructo de construcción genética en el vector puede tener cualquier ácido nucleico o polinucleótido aislado descrito en la presente memoria.
Un vector en la presente memoria puede configurarse para la expresión en un hospedador que tiene el gen dirigido por la construcción genética. La construcción genética puede ser una construcción de ARNi. Tras la expresión, una secuencia de ARN transcrita a partir del primer ácido nucleico aislado y una secuencia de ARN transcrita a partir del complemento invertido pueden ser capaces de hibridar entre sí y provocar la inhibición de la expresión del gen en el hospedador.
Un vector en la presente memoria puede tener una secuencia que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 187 [pAG2100], SEQ ID NO: 188 [pAG2101], SEQ ID NO: 189 [pAG2102], SEQ ID NO: 190 [pAG2103], SEQ ID NO: 195 [pAG2106] y SEQ ID NO: 218 [pAL409jSbGWDko2].
Un vector en la presente memoria puede tener una secuencia que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en una secuencia que tiene al menos un 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 185 [pAL409] y SEQ ID NO: 186 [pAG2004].
Una realización proporciona un método para producir una planta genéticamente modificada. Una planta genéticamente modificada puede construirse mediante cualquier método de ingeniería genética. Una planta genéticamente modificada puede ser una planta transgénica. Una planta transgénica puede transformarse por cualquier método conocido de transformación. Se puede utilizar la transformación mediada por Agrobacterium. La planta transgénica puede crearse por otros métodos para transformar una planta, por ejemplo, bombardeo con partículas o captación directa de ADN. La planta puede ser cualquier tipo de planta. La planta puede ser una planta de cultivo energético, una planta de cultivo de alimentos o una planta de cultivo de forraje. La planta puede ser una planta de arroz, una planta de mijo, una planta de sorgo, una planta de maíz o una planta de tomate. La transformación puede realizarse con cualquier vector adecuado que incluya o consista en uno o más construcciones genéticas en la presente memoria. La planta transgénica puede crearse mediante transformación mediada por Agrobacterium usando un vector que incluye un primer ácido nucleico que codifica un producto que inactiva o inhibe uno o más genes que codifican una proteína implicada en la movilización de almidón en una planta y un segundo ácido nucleico aislado que codifica al menos una enzima que degrada polisacáridos. La transformación mediada por Agrobacterium puede utilizar cualquier vector de transformación adecuado que albergue una cualquiera o más construcciones de ARNi en la presente memoria. La transformación mediada por Agrobacterium se puede hacer con un vector que tenga una secuencia con al menos un 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % de identidad con una secuencia seleccionada de grupo que consiste en la SEQ ID NO: 187 [pAG2100], SEQ ID NO: 188 [pAG2101], SEQ ID NO: 189 [pAG2102], SEQ ID NO: 190 [pAG2103], SEQ ID NO: 195 [pAG2106] y SEQ ID NO: 218 [pAL409jSbGWDko2]. La planta transgénica puede incluir cualquier ácido nucleico aislado, secuencia de aminoácidos, construcción genética, o vector descrito en la presente memoria.
La planta mutante se puede crear realizando mutagénesis de semillas de plantas; p. ej., mediante mutagénesis química (EMS) o radiación y seleccionando los mutantes mediante amplificación por PCR y secuenciación del producto de PCR mutante. La planta mutante puede crearse usando mutagénesis y estrategias de exploración tales como Localización en Genomas de Lesiones Locales Inducidas (TILLING, por sus siglas en inglés; Sikora et al. 2011), inserción de ADN-T y mutagénesis basada en transposones (An et al. 2005), estrategias de edición del genoma que implican nucleasas tal como las nucleasas de dedos de zinc (Wrigyt et al. 2005), nucleasas efectoras TAL (Christian et al. 2010), o meganucleasas derivadas de inteína (Wehrkamp-Richter et al. 2009).
En una realización, la planta genéticamente modificada puede incluir cualquier secuencia del ácido nucleico aislada, secuencia de aminoácidos, una o más construcciones genéticas, o uno o más vectores descritos en la presente memoria.
Una realización incluye un método para alterar los niveles de almidón vegetativo en una planta. El método puede incluir expresar un ácido nucleico aislado en la planta. La expresión del ácido nucleico aislado en la planta puede alterar la actividad de al menos una enzima relacionada con el metabolismo del almidón en la planta. La planta puede ser cualquier planta genéticamente modificada en la presente memoria. La planta genéticamente modificada puede incluir una cualquiera o más construcciones genéticas descritas en la presente memoria.
Cualquier planta genéticamente modificada en la presente memoria puede proporcionarse en un método de procesamiento agrícola o qplicaciones de piensos para animales. La planta genéticamente modificada puede incluir una cualquiera o más construcciones genéticas descritas en la presente memoria. Un primer ácido nucleico aislado que codifica un producto que inactiva o inhibe la expresión de al menos un gen que codifica una proteína implicada en la movilización de almidón en una planta y un segundo ácido nucleico aislado que codifica al menos una enzima que degrada polisacáridos en la planta genéticamente modificada pueden expresarse en cualquier punto del método. El primer ácido nucleico aislado y el segundo ácido nucleico aislado pueden expresarse antes de la etapa de procesamiento de la planta. La primera secuencia aislada y la segunda secuencia aislada pueden expresarse durante la etapa de procesamiento de la planta. La expresión puede ser inducida. Tras la expresión del primer y el segundo ácido nucleico, la planta genéticamente modificada puede tener un nivel alterado de almidón vegetativo en comparación con el nivel de almidón en una planta no modificada genéticamente del mismo fondo genético pero que carece de una o más construcciones genéticas.
Una etapa para proporcionar la planta genéticamente modificada puede incluir obtenerla de otra parte que la produjo. Una etapa para proporcionar puede incluir producir la planta transgénica. Una etapa para proporcionar puede incluir producir la planta mutante. La etapa para proporcionar puede incluir la modificación genética de la planta poniendo en contacto la planta con cualquiera de las construcciones genéticas de la presente memoria. La etapa para proporcionar puede incluir una transformación estable de la planta por cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria, o métodos conocidos. La etapa para proporcionar puede incluir la modificación genética de la planta escindiendo un gen que codifica una proteína implicada en el metabolismo del almidón en un sitio de escisión reconocido por una enzima de restricción expresada transitoriamente en la planta después de poner en contacto la planta con una construcción genética que comprende un primer ácido nucleico que codifica la enzima de restricción. La etapa para proporcionar también puede incluir regenerar la planta genéticamente modificada a partir de un tejido de la planta transgénica o mutante que tiene un nivel alterado de almidón vegetativo. La etapa para proporcionar puede incluir la obtención de una progenie de plantas genéticamente modificadas como resultado de la autopolinización o polinización cruzada entre la planta genéticamente modificada y la planta no modificada genéticamente. La planta genéticamente modificada puede usarse en una variedad de métodos o usos posteriores. La etapa para proporcionar puede incluir la adquisición de la planta genéticamente modificada. La etapa de proporcionar puede incluir hacer que la planta genéticamente modificada esté disponible para otras etapas de procesamiento.
La planta genéticamente modificada puede proporcionarse en un método de procesamiento agrícola como materia prima diseñada con niveles elevados de almidón y/o expresar una o más enzimas que degradan polisacáridos. La materia prima puede incluir cualquier planta genéticamente modificada en la presente memoria sola o en combinación con otros componentes. Los otros componentes pueden incluir otro material vegetal. El procesamiento agrícola es la manipulación o conversión de cualquier materia prima agrícola para un producto o uso en particular. El procesamiento agrícola puede incluir secar la planta genéticamente modificada. El procesamiento agrícola puede incluir fermentar la planta genéticamente modificada. El procesamiento agrícola puede incluir hidrolizar la planta genéticamente modificada por una o más enzimas exógenas para obtener un producto bioquímico.
La planta genéticamente modificada puede proporcionarse en un método de preparación de piensos para animales. La preparación de piensos para animales puede incluir la combinación de la planta genéticamente modificada con granos destiladores. La preparación de piensos para animales puede incluir la granulación de la planta genéticamente modificada en gránulos de pienso. La preparación de piensos para animales puede incluir el ensilado de la planta genéticamente modificada para hacer ensilado.
La preparación de piensos para animales puede incluir la mezcla de la planta genéticamente modificada con una fuente de fibra comestible.
El procesamiento agrícola o la preparación de piensos para animales también pueden incluir al menos una de las operaciones de recolección, empacado, molienda, trituración, corte, reducción de tamaño, aplastado, extracción de un componente de la materia prima, purificación de un componente o porción de la materia prima, extracción o purificación del almidón, hidrolización de polisacáridos en oligosacáridos o monosacáridos, conversión química o catálisis química de la materia prima.
En una realización del método de procesamiento agrícola, la planta genéticamente modificada puede usarse para producir un producto químico. El método puede incluir el tratamiento previo de una planta genéticamente modificada con una formulación química para formar una mezcla. La formulación química puede incluir uno o más restos que incluyen pero sin limitación, un ion de sulfito, bisulfito, sulfato, carbonato, hidróxido u óxido. La formulación química puede incluir además uno o más contraiones que incluyen, pero sin limitación, amonio, sodio, magnesio o calcio.
En una realización, la formulación química puede incluir, pero sin limitación, un compuesto seleccionado de un ácido sulfúrico, una base, bisulfito de amonio y carbonato de amonio. El bisulfito de amonio puede estar a una concentración de 0,02 M a 0,35 M. El carbonato de amonio puede estar a una concentración de 0,025 M a 0,25 M. El ácido sulfúrico puede estar a una concentración de 0,25 M. La base puede ser hidróxido de amonio al 7,5 %.
En una realización, la formulación química y la planta genéticamente modificada pueden mezclarse con otro material vegetal en una proporción óptima de líquido a sólido en una mezcla. La mezcla puede tener una relación líquida a sólido seleccionada del valor menor que o igual a uno de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1, o cualquier valor en un intervalo entre dos cualquiera de los anteriores (extremos inclusive).
El tratamiento previo puede incluir incubar la mezcla durante cualquier período de tiempo. El tratamiento previo puede incluir incubar la mezcla durante hasta 16 horas. La incubación se puede producir por períodos más largos o más cortos. El tratamiento previo puede incluir incubar la mezcla durante un período de menos que o igual a uno de 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 hora(s).
El tratamiento previo puede incluir proporcionar una temperatura de mezcla de 40 °C a 150 °C. Una temperatura de la mezcla de 40 °C a 95 °C puede permitir la ruptura o eliminación de porciones de lignina dentro del material lignocelulósico en la mezcla sin desactivar las enzimas hidrolíticas. El tratamiento previo puede incluir proporcionar una temperatura de mezcla de 40 °C, 55 °C, 65 °C, 75 °C, 95 °C, 150 °C, menos de 55 °C, menos de 65 °C, menos de 75 °C, menos de 95 °C, menos de 150 °C, 40 °C a 55 °C, 40 °C a 65 °C, 40 °C a 75 °C, 40 °C a 95 °C, 40 °C a menos de 150 °C, 55 °C a 65 °C, 55 °C a 75 °C, 55 °C a 95 °C, 55 °C a menos de 150 °C, 65 °C a 75 °C, 65 °C a 95 °C, 65 °C a menos de 150 °C, 75 °C a 95 °C, 75 °C a menos de 150 °C, o 95 °C a menos de 150 °C.
El tratamiento previo puede incluir proporcionar un pH de mezcla que varía de 1,0 a 12,0. El tratamiento previo puede incluir proporcionar un pH de mezcla dentro de un intervalo de 6,5 a 8,5. El pH de mezcla proporcionado puede ser 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 7,0, 7,5, 8,0, 9,0, 9,5, 10, 10,5, 11,0, 11,5 o 12,0, o un pH dentro de un intervalo entre dos cualquiera de los valores de pH anteriores (extremos incluidos). El pH de la mezcla durante el tratamiento previo puede depender del tipo de sustancia química utilizada y/o del tipo de material vegetal utilizado. Proporcionar un pH de mezcla puede incluir agregar una sustancia química modificadora de pH. Una sustancia química modificadora de pH puede ser un ácido o un álcali.
En una realización, el método de procesamiento agrícola puede incluir además la hidrolización de la mezcla. La hidrolización puede incluir incubar la mezcla durante un período de 144 horas, 140 horas, 130 horas, 120 horas, 110 horas, 100 horas, 90 horas, 80 horas, 70 horas, 60 horas, 50 horas, 40 horas, 30 horas, 20 horas, 10 horas, 9 horas, 8 horas, 7 horas, 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas, 1 hora, menos de 144 horas, menos de 140 horas, menos de 130 horas, menos de 120 horas, menos de 110 horas, menos de 100 horas, menos de 90 horas, menos de 80 horas, menos de 70 horas, menos de 60 horas, menos de 50 horas, menos de 40 horas, menos de 30 horas, menos de 20 horas, menos de 10 horas, menos de 9 horas, menos de 8 horas, menos de 7 horas, menos de 6 horas, menos de 5 horas, menos de 4 horas, menos de 3 horas, menos de 2 horas o menos de 1 hora.
En una realización, la etapa de hidrolización puede incluir proporcionar una temperatura de mezcla de 100 °C o menos, 65 °C o menos, 50 °C o menos, 48 °C a 50 °C, 48 °C a 65 °C, 48 °C a menos de 100 °C, o 48 °C a 100 °C. La etapa de hidrolización puede incluir proporcionar un pH que varía de 4,8 a 5,0, un pH de 4,8, un pH de 4,9, o un pH de 5,0. Al menos uno de la temperatura, pH o tiempo de tratamiento, puede seleccionarse en función de la actividad específica de una enzima que degrada polisacáridos en la planta genéticamente modificada.
Si la planta genéticamente modificada incluye múltiples enzimas que degradan polisacáridos, la etapa de hidrolización puede proporcionar secuencialmente condiciones óptimas para al menos una de expresión, tratamiento previo o hidrólisis por cada una de las múltiples enzimas que degradan polisacáridos. La etapa de hidrolización puede incluir proporcionar un pH óptimo para la actividad de una enzima, seguido de un pH óptimo diferente para la actividad de otra enzima. La etapa de hidrolización puede incluir ajustar las temperaturas en diferentes períodos de tiempo para una actividad óptima de cada enzima. Por ejemplo, una celobiohidrolasa puede necesitar una temperatura o pH diferente que una xilanasa.
El método de procesamiento agrícola puede incluir añadir una o más enzimas exógenas a al menos una de las plantas genéticamente modificadas, otro material vegetal, o la mezcla. Las enzimas exógenas se pueden añadir antes, durante o después del tratamiento previo. Las enzimas exógenas se pueden añadir antes, durante o después de la etapa de hidrolización. Se pueden proporcionar una o más enzimas exógenas en un cóctel de enzimas. Un cóctel de enzimas puede incluir una o más enzimas que degradan polisacáridos. Una enzima que degrada polisacáridos proporcionada en una realización en la presente memoria puede ser, pero sin limitación, una enzima que degrada lignina, una enzima que degrada celulosa, o una enzima que degrada hemicelulosa. Una enzima que degrada polisacáridos proporcionada en una realización en la presente memoria puede ser, pero sin limitación, una seleccionada entre glucosidasas, xilanasas, celulasas, endoglucanasas, exoglucanasas, celobiohidrolasas, p-xilosidasas, feruloil esterasas, pglucosidasas y amilasas. Un cóctel de enzimas puede incluir una celulasa aislada de Trichoderma reesii. Un cóctel de enzimas se puede adquirir de un vendedor. Un cóctel de enzimas puede ser, pero sin limitación, Accellerase® 1000, Accellerase® 1500, Accelerase® TRIO ™ y Accellerase® XY disponibles de Genencor International (Rochester, NY). Un cóctel de enzimas puede ser Cellic, CTEC, HTEC disponibles de Novozymes (Dinamarca). Un cóctel de enzimas puede incluir diferentes clases de enzimas que degradan polisacáridos. Un cóctel de enzimas puede incluir enzimas que degradan el almidón. Un cóctel de enzimas puede incluir una amilasa o una invertasa. Se pueden proporcionar condiciones óptimas para diferentes clases de enzimas que degradan polisacáridos en un cóctel. Por ejemplo, la temperatura, el pH y el tiempo de tratamiento para la hidrólisis pueden ajustarse durante el método para proporcionar condiciones óptimas para diferentes enzimas en el cóctel.
El método de procesamiento agrícola puede incluir además poner en contacto la mezcla y/o los productos de hidrólisis con un organismo fermentador para producir un producto químico. Después de la hidrólisis enzimática, los azúcares solubles pueden recuperarse y usarse para la producción de un producto químico. El producto químico puede ser glucosa. Como alternativa, en el método, se pueden realizar la sacarificación y la fermentación simultáneas de azúcares solubles en un producto químico. Un producto químico puede ser, pero sin limitación, butano, butanodiol, butadieno, butanol, isobutanol, propano, propanodiol, propileno, propanol, isopropanol, metano, metanol, etanol, fenol, glicerol, etileno, tolueno, etilo, benceno, estireno, xileno, etilenglicol, óxido de etileno, ácido fórmico, dióxido de carbono, formaldehído, acetaldehído, acetona, una vitamina, etano, pentano, hexano, heptano, octano, benceno, ácido acético, sorbitol, arabinitol, ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido furano dicarboxílico, ácido aspártico, ácido glucárico, ácido glutámico, ácido itacónico, ácido levulínico, hidroxibutirolactona, glicerol, sorbitol, xilitol, arabinitol, ácido glucónico, ácido láctico, ácido malónico, ácido propiónico, ácido cítrico, ácido aconítico, ácido xilónico, furfural, levoglucosano, alanina, prolina, lisina, serina o treonina (Véase T. Werpy y G. Petersen, op Value Added Chemicals From Biomass, Volumen 1, Results of Screening for Potential Candidates from Sugars and Synthesis Gas, Agosto de 2004, Artículo, PNNL y NREL).
La conversión de azúcares en un producto químico se puede realizar por cualquier organismo termentador adecuado. El organismo termentador puede seleccionarse basándose en el producto químico deseado. El organismo termentador puede ser levadura. La levadura puede ser, pero sin limitación a uno de especies de Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Yarrowia, Spathasporao Scheffersomyces. El organismo termentador puede ser una bacteria. Una bacteria puede ser, pero sin limitación una especie de Zymomonas, Escherichia, Bacilo, Lactobacillus o Clostridium. El organismo termentador puede ser un organismo de tipo silvestre o un organismo recombinante genéticamente modificado. El organismo termentador puede ser una colección de organismos aislados de un animal rumiante. El organismo termentador puede ser un acetógeno.
El método de procesamiento agrícola puede incluir sacariticación y termentación simultáneas de azúcares solubles para producir etanol. La sacariticación y termentación simultáneas para producir etanol pueden incluir proporcionar Saccharomyces cerevisiae D5A antes, durante o después del tratamiento previo o de proporcionar condiciones de hidrólisis.
Una realización proporciona un método para preparar la planta genéticamente moditicada para utilizarse como pienso para animales. El método puede incluir una etapa de poner en contacto la planta genéticamente moditicada con líquido para tormar una mezcla e incubar la mezcla a una temperatura de 40 °C a 100 °C durante un tiempo suticiente para producir azúcares solubles a partir de material lignocelulósico en la mezcla. El líquido puede ser agua. Una temperatura de la mezcla de 40 °C a 95 °C puede permitir la rotura o eliminación de la lignina dentro del material lignocelulósico en la mezcla sin desactivar una o más CWDE incluidas en la planta genéticamente moditicada.
En una realización, el método de preparación de piensos para animales puede incluir además poner en contacto la mezcla con una sustancia química alcalina. La sustancia química alcalina puede ser, pero sin limitación, óxido de calcio, hidróxido de calcio, hidróxido potásico, hidróxido sódico, hipoclorito, peróxido de hidrógeno y amoníaco. La etapa de poner en contacto puede producirse en un vaso puede incluir la molienda giratoria y mecánica de la mezcla en el vaso.
En una realización, el método de preparación de piensos para animales puede incluir además añadir a la mezcla una o más enzimas para la hidrólisis enzimática de material lignocelulósico. Las enzimas añadidas pueden ser, pero sin limitación, una seleccionada de amilasas, proteasas, titasas, enzimas hidrolíticas, celulasas, glucanasas, hemicelulasas, xilanasas, amilasas, esterasas, lacasas, mananasas y peroxidasas.
En una realización, el método de preparación de piensos para animales puede incluir combinar la mezcla con una tuente de tibra comestible. La tuente de tibra comestible puede ser, pero sin limitación, maíz, sorgo, trigo, centeno, semillas de soja, mijo, hierbas, grano de maíz, grano de sorgo, grano de trigo, paja de trigo, grano de centeno, tibra de maíz, rastrojo de maíz, hojas de maíz, harina de soja, harina de maíz, aceite de maíz, germen de trigo, germen de maíz, o combinación de los mismos.
En una realización, el método de preparación de piensos para animales puede incluir combinar la mezcla con granos destiladores. Los granos destiladores se pueden crear en destilerías como subproductos en cervecerías y plantas productoras de etanol. Los granos destiladores pueden usarse como torraje para el ganado.
En una realización, el método de preparación de piensos para animales puede incluir la granulación de las plantas genéticamente moditicadas en gránulos de pienso. La granulación puede realizarse por cualquier método conocido. En una realización, las plantas genéticamente moditicadas se pueden triturar en trituradoras tradicionales utilizadas en la tabricación de gránulos. El material triturado como subproductos en cervecerías y plantas productoras de etanol. Los granos destiladores pueden usarse como torraje para el ganado.
En una realización, el método de preparación de piensos para animales puede incluir la granulación de las plantas genéticamente moditicadas en gránulos de pienso. La granulación puede realizarse por cualquier método conocido. En una realización, las plantas genéticamente moditicadas se pueden triturar en trituradoras tradicionales utilizadas en la tabricación de gránulos. El material triturado se puede moler aún más para producir partículas que varían en tamaño de 0,5 pulgadas a 6 pulgadas. Las partículas pueden usarse para producir gránulos.
En una realización, el método de preparación de piensos para animales puede incluir ensilar las plantas genéticamente moditicadas para hacer ensilado. Como se emplea en esta memoria, el ensilado es un torraje termentado de alta humedad que puede alimentar a los animales rumiantes, en particular al ganado lechero, ovejas y caballos. El ensilado se puede hacer colocando partes verdes de plantas en un silo y apilándolas en un montón cubierto por una película de plástico. El ensilado conserva más nutrientes que las plantas secas, heno o rastrojo. El ensilado pasa por un proceso de termentación bacteriana que da como resultado la producción de ácidos grasos volátiles y una mejor digestibilidad para los animales rumiantes. El método también puede incluir la adición de agentes de ensilado para mejorar la estabilidad o la digestibilidad de la planta genéticamente moditicada ensilada. El agente de ensilado puede ser, pero sin limitación, azúcares, ácido láctico o inoculantes.
En una realización del método de preparación de piensos para animales, las plantas genéticamente moditicadas se pueden utilizar para obtener una materia prima digerible. El método también puede incluir alimentar a un animal con una materia prima digerible que comprenda las plantas genéticamente moditicadas para promover el crecimiento del animal. El animal puede ser, pero sin limitación, pollos, cerdos o vacas.
Párrafos
Los siguientes párrafos son parte de la descripción.
1. Una construcción genética que comprende:
i) un primer ácido nucleico aislado que codifica un producto que inactiva o inhibe la expresión de uno o más genes que codifican una proteína implicada en la movilización de almidón en una planta, en donde la proteína se selecciona del grupo que consiste en Glucano Agua Dicinasa, Fosfoglucano Agua Dicinasa, Proteína fosfatasa de Especificidad Dual, dextrinasa límite, enzima desproporcionadora, una enzima de desramificación, p-amilasa e isoamilasa; y
ii) un segundo ácido nucleico aislado que codifica una o más enzimas que degradan polisacáridos.
2. La construcción genética del párrafo 1 que incluye además un complemento invertido del primer ácido nucleico y un espaciador contiguo con y entre el primer ácido nucleico y el complemento invertido y en donde una secuencia del complemento invertido es capaz de hibridar con una secuencia del primer ácido nucleico aislado en condiciones de rigurosidad moderada.
3. La construcción genética de uno cualquiera o más de los párrafos 1 - 2, en donde el producto es un ARNh.
4. La construcción genética de uno cualquiera o más de los párrafos 1 - 2, en donde el producto es una construcción de ARNi.
5. La construcción genética del párrafo 1, en donde el producto es un miARN capaz de dirigirse a un ARN mensajero transcrito a partir de uno o más genes.
6. La construcción genética del párrafo 5, en donde el producto tiene una longitud de 18 a 25 nucleótidos.
7. La construcción genética del párrafo 1, en donde el primer ácido nucleico aislado codifica una enzima de restricción capaz de cortar una secuencia de uno o más genes.
8. La construcción genética del párrafo 7, en donde la enzima de restricción se selecciona del grupo que consiste en: una meganucleasa, una nucleasa con dedos de zinc y una nucleasa efectora TAL.
9. La construcción genética del párrafo 9, en donde la meganucleasa se selecciona del grupo que consiste en I-Crel, I-Dmol, I-SceI, E-Dmel y DmoCre.
10. La construcción genética de una cualquiera o más de las realizaciones 1 - 9, en donde el primer ácido nucleico aislado incluye una secuencia con al menos un 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 5 [secuencia codificante de SbGWD], SEQ ID NO: 6 [secuencia codificante de ZmGWD], SEQ ID NO: 7 [secuencia codificante de OsGWD], SEQ ID NO: 8 [gen SbGWD], SEQ ID NO: 9 [gen ZMGWD], SEQ ID NO: 10 [5'UTR y promotor del gen SbGWD], SEQ ID 11 NO: [5'UTR y promotor del gen ZmGWD], SEQ ID NO: 12 [3'UTR del gen SbGWD], SEQ ID NO: 13 [3'UTR del gen ZmGWD], SEQ ID NO: 17 [sec. codificante de SbPWD], SEQ ID NO: 18 [sec. codificante de ZmPWD], SEQ ID NO: 19 [sec. codificante de OsPWD], SEQ ID NO: 20 [gen SbPWD], SEQ ID NO: 21 [gen ZmPWD]. SEQ ID NO: 22 [5'UTR y promotor del gen SbPWD], SEQ ID NO: 23 [3'UTR del gen SbPWD], SEQ ID NO: 24 [3'UTR del gen ZmPWD], SEQ ID NO: 29 [secuencia codificante de ZmDSP], SEQ ID NO: 30 [secuencia codificante de SbDSP], SEQ ID NO: 31 [secuencia codificante de OsDSP], SEQ ID NO: 32 [gen ZmDSP], SEQ ID NO: 33 [gen SbDSP], SEQ ID NO: 34 [5'UTR y promotor del gen ZmDSP], SEQ ID NO: 35 [5'UTR y promotor del gen SbDSP], SEQ ID NO: 36 [3'UTR de ZmDSP], SEQ ID NO: 37 [3'UTR del gen SbDSP], SEQ ID NO: 173 [gen OsGWD], SEQ ID NO: 174 [gen DSP], SEQ ID NO: 175 [gen ISA3], s Eq ID NO: 176 [secuencia codificante de OsGWD], SeQ ID NO: 177 [secuencia codificante de DSP], SEQ ID NO: 178 [secuencia codificante de ISA3], SEQ ID NO: 182 [porción del gen S1GWD], SEQ ID NO: 191 [gen SbGWD-1], SEQ ID NO: 192 [gen SbGDW-2], SEQ ID NO: 206 [PvGWD-2], SEQ ID NO: 207 [PvGWD-5], SEQ ID NO: 208 [PvGWD-1] y SEQ ID NO: 215 [secuencia fusionada de mijo].
11. La construcción genética de una cualquiera o más de las realizaciones 1 - 10, en donde el primer ácido nucleico tiene al menos un 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ iD n O: 38 [amiRNA1wmd3 de OsGWD], SEQ ID NO: 39 [micro ARN de OsGWD osa-MR809aM1], SEQ ID NO: 40 [OsDSP1], SEQ ID NO: 41 [OsDSP2], SEQ ID NO: 42 [OsGWD1], SEQ ID NO: 43 [OsGWD2], SEQ ID NO: 44[OsPWD1], SEQ ID NO: 45 [OsPWD2], SEQ ID NO: 46 [sec. flanqueantes SbGWD- SbGWDko2b], SEQ ID NO: 47 [SbGWD1], SEQ ID NO: 48 [SbGWD2], SEQ ID NO: 49 [ZmGWD1], SEQ ID NO: 50 [ZmGWD2], SEQ ID NO: 179 [GWD1], SEQ ID NO: 180 [GWD2], SEQ ID NO: 183 [DSP1], SEQ ID NO: 184 [ISA3], SEQ ID NO: 209 [PvGWDko2] y SEQ ID NO: 216 [sec. flanqueantes SbGWDko2a].
12. La construcción genética de uno cualquiera o más de los párrafos 2 - 11, en donde el complemento invertido tiene una secuencia con al menos un 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % de identidad con un complemento invertido de una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 40 [OsDSP1], SEQ ID NO: 41 [OsDSP2], SEQ ID NO: 42 [OsGWD1], SEQ ID NO: 43 [OsGWD2], SEQ ID NO: 44[OsPWD1], SEQ ID NO: 45 [OsPWD2], SEQ ID NO: 46 [sec. flanqueantes SbGWD- SbGWDko2b], SEQ ID NO: 47 [SbGWDI], SEQ ID NO: 48 [SbGWD2], SEQ ID NO: 49 [ZmGWDI], SEQ ID NO: 50 [ZmGWD2], SEQ ID NO: 179 [GWD1], SEQ ID NO: 180 [GWD2], SEQ ID NO: 183 [DSP1], SEQ ID NO: 184 [ISA3], SEQ ID NO: 209 [PvGWDko2] y SEQ iD NO: 216 [sec. flanqueantes SbGWDko2a].
13. La construcción genética de uno cualquiera o más de los párrafos 2 - 12, en donde el espaciador comprende un intrón que tiene al menos un 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada de grupo que consiste en: SEQ ID NO: 51 [ZmAdhli6], SEQ ID NO; 52 [OsAdhli], SEQ ID NO: 53 [SbAdh1-2i] y SEQ ID NO: 54 [SbGWDi].
14. La construcción genética de uno cualquiera o más de los párrafos 1 - 13, en donde la una o más enzimas que degradan polisacáridos se seleccionan de un grupo que consiste en: una xilanasa, una endoglucanasa, una exoglucanasa, una amilasa, una xilanasa modificada con inteína, una endoglucanasa modificada con inteína, una exoglucanasa modificada con inteína y una amilasa modificada con inteína.
15. La construcción genética de uno cualquiera o más de los párrafos 1 a 14, en donde el segundo ácido nucleico aislado tiene al menos un 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada de grupo que consiste en: SeQ ID NO: 86 [O43097], SEQ ID NO: 87 [BD22308], SEQ ID NO: 88 [BD25243], SEQ ID NO: 89 [EU591743], SEQ ID NO: 90 [NtEGm], SEQ ID NO: 91 [P0C2S1], SEQ ID NO: 92 [P77853], SEQ ID NO: 93 [O68438], SEQ ID NO: 94 [O33897], SEQ ID NO: 164 [amilasa 19862], SEQ ID NO: 165 [glucoamilasa 20082], SEQ ID NO: 166 [glucoamilasa 20707], SEQ ID NO: 167 [amilasa 21853], SEQ ID NO: 168 [AmyS], SEQ ID NO: 170 [GlaA], SEQ ID NO: 104 [EU591743:AS146-7], SEQ ID NO: 105 [P77853: S158-30-108-35] y SEQ ID NO: 106 [P77853:T134-101-100].
16. Una construcción genética que comprende una secuencia del ácido nucleico aislado con al menos un 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: s Eq ID NO: 59 [OsUbi3P: amiRNA1wmd3 de OsGWD], SEQ ID NO: 60 [Os Ubi3P: osa-MIR809aM1 de OsGWD], SEQ ID NO: 61 [OsUbi3P:ARNh de OsDSP1], SEQ ID NO: 62 [OsUbi3P:ARNh de OsDSP2], SEQ ID NO: 63 [OsUbi3P:ARNh de OsGWD1], SEQ ID NO: 64 [OsUbi3P:ARNh de OsGWD2], SEQ ID NO: 65 [OsUbi3P: ARNh de OsPWD1], SEQ ID NO: 66 [OsUbi3P:ARNh de OsPWD2], SEQ ID NO: 67 [OsUbi3P:ARNi de SbGWD], SEQ ID NO: 68 [ZmPepCP: ARNi de SbGWD1], SEQ ID NO: 69 [ZmPepCP:ARNi de SbGWD2], SEQ ID NO: 70 [ZmPepCP:ARNi de ZmGWD1], SEQ ID NO: 71 [ZmPepCP:ARNi de ZmGWD2], SEQ ID NO: 72 [OsDSP1 y OsGWD2], SEQ ID NO: 73 [OsPWD2 y OsGWD1], SEQ ID NO: 74 [OsDSP2 y OsPWD1], SEQ ID NO: 119 [ZmUbi1P:xGZein27ss:BD22308:xHvVSD], SEQ ID NO: 120 [ZmPepCP: xGZein27ss:BD25243:SEKDEL], SEQ ID NO: 121 [OsUbi3P:EU591743], SEQ ID NO: 122 [ZmUbi1P:EU591743: AS146-7:SEKDEL], SEQ ID NO: 123 [ZmUbi1p: HvAle:NtEGm: SEKDEL], SEQ ID NO: 124 [ZmPepCP: HvAle:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 125 [OsUbi3P:HvAle:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 126 [OsUbi3P:BAASS: O33897), SEQ ID NO: 127 [ZmPepCP:BAASS:O43097:SEKDEL], SEQ ID NO: 128 [OsUbi3P:068438], SEQ ID NO: 129 [OsUbi3P:P0C2S1], SEQ ID NO: 130 [ZmUbi1 P:ZmUBQm:BAASS:P77853:S158-30-108-35], SEQ ID NO: 131 [ZmUbi1:BAASS:P77853:T134-100-101 :SEKDEL], SEQ ID NO: 132 [casete 2379 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 133 [casete 2380 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 134 [casete 4106 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 135 [casete 4107 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 136 [casete 4108 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 137 [casete 4109 - -3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 138 [casete 4110 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 139 [casete 4111 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 140 [casete 4112 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 141 [casete 4113 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 142 [casete 4114 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 143 [casete 4115 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 144 [casete 4116 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 145 [casete 4117 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 146 [casete 4120 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 147 [casete 4121 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 148 [casete 4124 - 2 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 149 [casete 4125 - 2 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 150 [casete 4514 - 3 CWDE y 1 ARNh] y SEQ ID NO: 151 [casete 4515 - 3 CWDE y 1 ARNh].
17. Una planta genéticamente modificada que comprende una construcción genética de uno cualquiera o más de los párrafos 1 a 16 y 77 a 87.
18. Una planta genéticamente modificada de uno cualquiera o más de los párrafos 1 a 16 y 77 a 87, en donde la planta tiene un nivel disminuido de al menos una proteína diana en comparación con una planta de control no modificada genéticamente.
19. La planta genéticamente modificada del párrafo 18, en donde la planta genéticamente modificada es una planta seleccionada del grupo que consiste en: maíz, soja, arroz, caña de azúcar, remolacha azucarera, sorgo, mijo, miscanto, eucalipto, sauce y álamo.
20. La planta genéticamente modificada de uno cualquiera o más de los párrafos 18 - 19, en donde la construcción genética está integrada en un genoma de la planta genéticamente modificada.
21. Un método para procesar biomasa vegetal que comprende: obtener una planta genéticamente modificada que incluye una construcción genética que comprende i) un primer ácido nucleico aislado que codifica un producto que inactiva o inhibe la expresión de uno o más genes que codifican una proteína implicada en la movilización de almidón en una planta, en donde la proteína se selecciona del grupo que consiste en Glucano Agua Dicinasa, Fosfoglucano Agua Dicinasa, Proteína fosfatasa de Especificidad Dual, dextrinasa límite, enzima desproporcionadora, una enzima de desramificación, p-amilasa e isoamilasa; y ii) un segundo ácido nucleico aislado que codifica una o más enzimas que degradan polisacáridos.
22. Un método para procesar biomasa vegetal que comprende:
modificar genéticamente una planta poniendo en contacto la planta con una construcción genética, en donde la construcción genética comprende i) un primer ácido nucleico aislado que codifica un producto que inactiva o inhibe la expresión de uno o más genes que codifican una proteína implicada en la movilización de almidón en una planta, en donde la proteína se selecciona del grupo que consiste en Glucano Agua Dicinasa, Fosfoglucano Agua Dicinasa, Proteína fosfatasa de Especificidad Dual, dextrinasa límite, enzima desproporcionadora, una enzima de desramificación, p-amilasa e isoamilasa; y ii) un segundo ácido nucleico aislado que codifica una o más enzimas que degradan polisacáridos; y
regenerar una planta genéticamente modificada que tiene un mayor nivel de almidón en comparación con una planta de control no modificada genéticamente.
23. El método del párrafo 22, en donde la etapa de modificación genética comprende poner en contacto la planta con una construcción genética de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 16
24. El método del párrafo 22, en donde la etapa de modificación genética comprende la transformación estable de la planta.
25. El método del párrafo 22, en donde la etapa de modificación genética comprende expresar una construcción genética en la planta de manera transitoria.
26. El método del párrafo 22, en donde la planta genéticamente modificada es una planta de uno cualquiera o más de los párrafos 17 - 20 y 66 - 76.
27. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 21 - 26, en donde la planta genéticamente modificada se usa para producir una sustancia química.
28. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 21 - 27 incluye además el tratamiento previo de la planta genéticamente modificada con una formulación química para formar una mezcla.
29. El método del párrafo 28, en donde la formulación química incluye al menos un resto que comprende un ion seleccionado del grupo que consiste en: sulfito, bisulfito, sulfato, carbonato, hidróxido y óxido.
30. El método del párrafo 29, en donde el al menos un resto incluye además un contraión seleccionado del grupo que consiste en: amonio, sodio, magnesio y calcio.
31. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 28 - 30, en donde la formulación química incluye un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: un ácido sulfúrico, una base, bisulfito de amonio y carbonato de amonio. 32. El método del párrafo 31, en donde el bisulfito de amonio está a una concentración de 0,02 M a 0,35 M.
33. El método del párrafo 31, en donde el carbonato de amonio está a una concentración de 0,025 M a 0,25 M. 34. El método del párrafo 31, en donde el ácido sulfúrico está a una concentración de 0,25 M.
35. El método del párrafo 31, en donde la base es hidróxido de amonio al 7,5 %.
36. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 28 - 35, en donde la mezcla tiene una relación líquida a sólido seleccionada del valor de menor que o igual a uno de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1.
37. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 28 - 36, en donde el tratamiento previo incluye incubar la mezcla durante un período de menos de o igual a uno de 16 horas, 15 horas, 14 horas, 13 horas, 12 horas, 11 horas, 10 horas, 9 horas, 8 horas, 7 horas, 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas o 1 hora.
38. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 28 - 37, en donde el tratamiento previo incluye proporcionar una temperatura de mezcla de 40 °C a 120 °C.
39. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 28 - 38, en donde el tratamiento previo incluye proporcionar una mezcla a un pH que varía de 1,0 a 12,0.
40. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 28 - 39 que comprende además la hidrolización de la mezcla.
41. El método del párrafo 40, en donde la etapa de hidrolización incluye incubar la mezcla durante un período de menos de o igual a uno de 144 horas, 140 horas, 130 horas, 120 horas, 110 horas, 100 horas, 90 horas, 80 horas, 70 horas, 60 horas, 50 horas, 40 horas, 30 horas, 20 horas, 10 horas, 9 horas, 8 horas, 7 horas, 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas o 1 hora.
42. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 40 - 41, en donde la etapa de hidrolización incluye incubar la mezcla a una temperatura de 100 °C o menos.
43. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 40 - 41, en donde la temperatura es 65 °C o menos.
44. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 40 - 43, en donde la temperatura es de 48 °C a 50 °C.
45. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 40 - 44, en donde la etapa de hidrolización incluye incubar la mezcla a un pH de 4,8 a 5,0.
46. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 40 - 45 que comprende además poner en contacto la mezcla con un organismo fermentador para producir una sustancia química.
47. El método del párrafo 46, en donde el organismo fermentador es una levadura seleccionada del grupo que consiste en: Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Yarrowia, Spathaspora y Scheffersomyces.
48. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 21 - 47 que incluye además la adición de una o más enzimas exógenas.
49. El método del párrafo 48, en donde la una o más enzimas incluyen una endoglucanasa, una celobiohidrolasa, una glucosidasa, una p-xilosidasa, celulasa aislada de Trichoderma reesii, una xilanasa, una amilasa y una invertasa. 50. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 27 - 49, en donde la sustancia química es glucosa.
51. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 21 - 26, en donde la planta genéticamente modificada se usa para producir un pienso para animales.
52. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 21 - 26 y 51 que incluye además poner en contacto una planta genéticamente modificada con líquido para formar una mezcla e incubar la mezcla a una temperatura menor que o igual a 100 °C durante un tiempo suficiente para producir azúcares solubles a partir de material lignocelulósico en la mezcla.
53. El método del párrafo 52, en donde el líquido es agua.
54. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 52 - 53, que además pone en contacto la mezcla con una sustancia química alcalina.
55. El método del párrafo 54, en donde la sustancia química alcalina se selecciona del grupo que consiste en: óxido de calcio, hidróxido de calcio, hidróxido potásico, hidróxido sódico, hipoclorito, peróxido de hidrógeno y amoníaco.
56. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 52 - 55, que además pone en contacto la mezcla con una o más enzimas.
57. El método del párrafo 56, en donde la una o más enzimas se selecciona del grupo que consiste en: proteasas, fitasas, enzimas hidrolíticas, glucanasas, celulasas, hemicelulasas, xilanasas, amilasas, esterasas, lacasas, mananasas y peroxidasas.
58. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 52 - 57 que incluye además combinar la mezcla con una fuente de fibra comestible.
59. El método del párrafo 58, en donde la fuente de fibra comestible se selecciona del grupo de plantas que consiste en: maíz, sorgo, trigo, centeno, semillas de soja, grano de maíz, grano de sorgo, grano de trigo, grano de centeno, harina de soja, harina de maíz, aceite de maíz y germen de maíz.
60. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 52 - 57 que comprende además combinar la mezcla con granos destiladores.
61. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 51 - 57 que comprende además la granulación de la planta genéticamente modificada en gránulos de pienso.
62. El método del párrafo 51 que comprende además ensilar la planta genéticamente modificada para hacer ensilado.
63. El método del párrafo 51, en donde la planta genéticamente modificada se usa para obtener una materia prima digerible.
64. El método del párrafo 63 que comprende además alimentar a un animal con la materia prima digerible para promover el crecimiento del animal.
65. El método del párrafo 64, en donde el animal se selecciona del grupo que consiste en: pollos, cerdos y vacas.
66. Una planta genéticamente modificada que comprende un primer ácido nucleico aislado que codifica un producto que inactiva o inhibe la expresión de al menos un gen que codifica una proteína implicada en la movilización de almidón en una planta y un segundo ácido nucleico aislado que codifica al menos una enzima que degrada polisacáridos, en donde tras la expresión del primer ácido nucleico, la planta genéticamente modificada tiene un nivel alterado de almidón vegetativo en comparación con el nivel de almidón vegetativo en una planta no modificada genéticamente que tiene el mismo fondo genético que la planta genéticamente modificada pero que carece del primer ácido nucleico aislado.
67. La planta genéticamente modificada del párrafo 66 que comprende además un promotor operativamente unido a al menos uno del primer ácido nucleico aislado o del segundo ácido nucleico aislado.
68. La planta genéticamente modificada de uno cualquiera o más de los párrafos 66 - 67 que comprende además un complemento invertido del primer ácido nucleico aislado y un espaciador contiguo con y entre el primer ácido nucleico aislado y el complemento invertido, en donde una secuencia del complemento invertido es capaz de hibridar con una secuencia del primer ácido nucleico aislado en condiciones de rigurosidad moderada.
69. La planta genéticamente modificada de uno cualquiera o más de los párrafos 66 - 67, en donde el producto es un miARN capaz de dirigirse a un ARN mensajero transcrito a partir de un gen diana seleccionado de al menos un gen.
70. La planta genéticamente modificada de uno cualquiera o más de los párrafos 66 - 67, en donde el producto es una enzima de restricción capaz de cortar una secuencia de un gen diana seleccionado de al menos un gen.
71. La planta genéticamente modificada de uno cualquiera o más de los párrafos 66 - 69, en donde el primer ácido nucleico aislado comprende una secuencia con al menos un 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 38 [amiRNA1wmd3 de OsGWD], SEQ ID NO: 39 [micro ARN de OsGWD osa-MR809aM1], SEQ ID NO: 40 [OsDSP1], SEQ ID NO: 41 [OsDSP2], SEQ ID NO: 42 [OsGWD1], SEQ ID NO: 43 [OsGWD2], SEQ ID NO: 44[OsPWD1], SEQ ID NO: 45 [OsPWD2], SEQ ID NO: 46 [sec. flanqueantes SbGWD- SbGWDko2b], SEQ ID NO: 47 [SbGWD1], SEQ ID NO: 48 [SbGWD2], SEQ ID NO: 49 [ZmGWD1], SEQ ID NO: 50 [ZmGWD2], SEQ ID NO: 179 [GWD1], SEQ ID NO: 180 [GWD2], SEQ ID NO: 183 [DSP1], SEQ ID NO: 184 [ISA3], SEQ ID NO: 209 [PvGWDko2] y SEQ ID NO: 216 [sec. flanqueantes SbGWDko2a].
72. La planta genéticamente modificada de uno cualquiera o más de los párrafos 66 - 71, en donde el al menos un gen comprende una secuencia con al menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 5 [secuencia codificante de SbGWD], SEQ ID NO: 6 [secuencia codificante de ZmGWD], SEQ ID NO: 7 [secuencia codificante de OsGWD], SEQ ID NO: 8 [gen SbGWD], SEQ ID NO: 9 [gen ZMGWD], SEQ ID NO: 10 [5'UTR y promotor del gen SbGWD], SEQ ID 11 NO: [5'UTR y promotor del gen ZmGWD], SEQ ID NO: 12 [3'UTR del gen SbGWD], SEQ ID NO: 13 [3'UTR del gen ZmGWD], SEQ ID NO: 17 [sec. codificante de SbPWD], SEQ ID NO: 18 [sec. codificante de ZmPWD], SEQ ID NO: 19 [sec. codificante de OsPWD], SEQ ID NO: 20 [gen SbPWD], SEQ ID NO: 21 [gen ZmPWD]. SEQ ID NO: 22 [5'UTR y promotor del gen SbPWD], SEQ ID NO: 23 [3'UTR del gen SbPWD], SEQ ID NO: 24 [3'UTR del gen ZmPWD], SEQ ID NO: 29 [secuencia codificante de ZmDSP], SEQ ID NO: 30 [secuencia codificante de SbDSP], SEQ ID NO: 31 [secuencia codificante de OsDSP], SEQ ID NO: 32 [gen ZmDSP], SEQ ID NO: 33 [gen SbDSP], SEQ ID NO: 34 [5'UTR y promotor del gen ZmDSP], SEQ ID NO: 35 [5'UTR y promotor del gen SbDSP], SEQ ID NO: 36 [3'UTR de ZmDSP], SEQ ID NO: 37 [3'UTR del gen SbDSP], SEQ ID NO: 173 [gen OsGWD], SEQ ID NO: 174 [gen DSP], SEQ ID NO: 175 [gen ISA3], s Eq ID NO: 176 [secuencia codificante de OsGWD], SeQ ID NO: 177 [secuencia codificante de DSP], SEQ ID NO: 178 [secuencia codificante de ISA3], SEQ ID NO: 182 [porción del gen S1GWD], SEQ ID NO: 191 [gen SbGWD-1], SEQ ID NO: 192 [gen SbGDW-2], SEQ ID NO: 206 [PvGWD-2], SEQ ID NO: 207 [PvGWD-5], SEQ ID NO: 208 [PvGWD-1] y SEQ ID NO: 215 [secuencia fusionada de mijo].
73. La planta genéticamente modificada de uno cualquiera o más de los párrafos 66 - 71, en donde la proteína se selecciona del grupo que consiste en: Glucano Agua Dicinasa, Fosfoglucano Agua Dicinasa, Proteína fosfatasa de Especificidad Dual, p-amilasa, isoamilasa, dextrinasa límite, una enzima desproporcionadora y una enzima de desramificación
74. La planta genéticamente modificada de uno cualquiera o más de los párrafos 66 - 73, en donde la al menos una enzima que degrada polisacáridos se selecciona de un grupo que consiste en: una xilanasa, una endoglucanasa, una exoglucanasa, una amilasa, una xilanasa modificada con inteína, una endoglucanasa modificada con inteína, una exoglucanasa modificada con inteína y una amilasa modificada con inteína.
75. La planta genéticamente modificada de uno cualquiera o más de los párrafos 66 - 74, en donde el segundo ácido nucleico aislado comprende una secuencia con al menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 86 [O43097], SEQ ID NO: 87 [BD22308], SEQ ID NO:88 [BD25243], SEQ ID NO: 89 [EU591743], SEQ ID NO: 90 [NtEGm], SEQ ID NO: 91[P0C2S1], SEQ ID NO: 92 [P77853], SEQ ID NO: 93 [O68438], SEQ ID NO: 94 [O33897], SEQ ID NO: 164 [amilasa 19862], SEQ ID NO: 165 [glucoamilasa 20082], SEQ ID NO: 166 [glucoamilasa 20707], SEQ ID NO: 167 [amilasa 21853], SEQ ID NO: 168 [AmyS], SEQ ID NO: 170 [GlaA], SEQ ID NO: 104 [EU591743:AS146-7], SEQ ID NO: 105 [P77853: S158-30-108-35] y SEQ ID NO: 106 [P77853:T134-101-100].
76. La planta genéticamente modificada de uno cualquiera o más de los párrafos 66 - 67, en donde el primer ácido nucleico aislado y el segundo ácido nucleico aislado están dentro de una construcción genética que comprende una secuencia con al menos un 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o un 100 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 59 [OsUbi3P: amiRNA1wmd3 de OsGWD], SEQ ID NO: 60 [Os Ubi3P: osa-MIR809aM1 de OsGWD], SEQ ID NO: 61 [OsUbi3P:ARNh de OsDSP1], SEQ ID NO: 62 [OsUbi3P:ARNh de OsDSP2], SEQ ID NO: 63 [OsUbi3P:ARNh de OsGWD1], SEQ ID NO: 64 [OsUbi3P:ARNh de OsGWD2], SEQ ID NO: 65 [OsUbi3P: ARNh de OsPWD1], SEQ ID NO: 66 [OsUbi3P:ARNh de OsPWD2], SEQ ID NO: 67 [OsUbi3P:ARNi de SbGWD], SEQ ID NO: 68 [ZmPepCP: ARNi de SbGWD1), SEQ ID NO: 69 [ZmPepCP:ARNi de SbGWD2], SEQ ID NO: 70 [ZmPepCP:ARNi de ZmGWD1], SEQ ID NO: 71 [ZmPepCP:ARNi de ZmGWD2], SEQ ID NO: 72 [OsDSP1 y OsGWD2], SEQ ID NO: 73 [OsPWD2 y OsGWD1], SEQ ID NO: 74 [OsDSP2 y OsPWD1], SEQ ID NO: 119 [ZmUbi1 P:mZ27:BD22308:HvVSD], SEQ ID NO: 120 [ZmPepCP:m27:BD25243:SEKDEL], SEQ ID NO: 121 [OsUbi3P:EU591743], SEQ ID NO:122 [ZmUbi1P:EU591743: AS146-7:SEKDEL], SEQ ID NO: 123 [ZmUbilp:NvAle:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 124 [ZmPepCP: HvAle:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 125 [OsUbi3P:HvAle:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 126 [OsUbi3P:BAASS:O43097:SEKDEL], SEQ ID NO: 127 [ZmPepCP:BAASS:O43097], SEQ ID NO: 128[OsUbi3P:068438], SEQ ID NO: 129 [OsUbi3P:P0C2S1], SEQ ID NO: 130 [ZmUbi1 P:Zm:BAASS:P77853:S158-30-108-35], SEQ ID NO: 131 [ZmUbi1:BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL], SEQ ID NO: 132 [casete 2379 -3CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 133 [casete 2380 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 134 [casete 4106 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 135 [casete 4107 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 136 [casete 4108 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 137 [casete 4109 - -3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 138 [casete 4110 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 139 [casete 4111 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 140 [casete 4112 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 141 [casete 4113 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 142 [casete 4114 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 143 [casete 4115 -3CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 144 [casete 4116 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 145 [casete 4117 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 146 [casete 4120 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 147 [casete 4121 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 148 [casete 4124 - 2 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 149 [casete 4125 - 2 CWDE y 1ARNh], SEQ ID NO: 150 [casete 4514 - 3 CWDE y 1 ARNh] y SEQ ID NO: 151 [casete 4515 - 3 CWDE y 1 ARNh].
77. Una construcción genética que comprende un primer ácido nucleico aislado que codifica un producto que inactiva o inhibe la expresión de al menos un gen que codifica una proteína implicada en la movilización de almidón en una planta y un segundo ácido nucleico aislado que codifica al menos una enzima que degrada polisacáridos.
78. La construcción genética del párrafo 77 que comprende además un promotor operativamente unido a al menos uno del primer ácido nucleico aislado o del segundo ácido nucleico aislado.
79. La construcción genética de uno cualquiera o más de los párrafos 77 - 78 que incluye además un complemento invertido de la secuencia del primer ácido nucleico aislado y un espaciador contiguo con y entre el primer ácido nucleico aislado y el complemento invertido, en donde una secuencia del complemento invertido es capaz de hibridar con una secuencia del primer ácido nucleico aislado en condiciones de rigurosidad moderada.
80. La construcción genética de uno cualquiera o más de los párrafos 77 - 78, en donde el producto es un miARN capaz de dirigirse a un ARN mensajero transcrito a partir de un gen diana seleccionado de al menos un gen.
81. La construcción genética de uno cualquiera o más de los párrafos 77 - 78, en donde el producto es una enzima de restricción capaz de cortar una secuencia de un gen diana seleccionado de al menos un gen.
82. La construcción genética de uno cualquiera o más de los párrafos 77 - 78, en donde el primer ácido nucleico aislado comprende una secuencia con al menos un 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 38 [amiRNA1wmd3 de OsGWD], SEQ ID NO: 39 [OsGWD osa-MR809aM1microRNA], SEQ ID NO: 40 [OsDSP1], SEQ ID NO: 41 [OsDSP2], SEQ ID NO: 42[OsGWD1], SEQ ID NO: 43 [OsGWD2], SEQ ID NO: 44[OsPWD1], SEQ ID NO: 45[OsPWD2], SEQ ID NO: 46 [sec. flanqueantes SbGWD -SbGWDko2b], SEQ ID NO: 47 [SbGWD1], SEQ ID NO: 48 [SbGWD2], SEQ ID NO: 49 [ZmGWD1] y SEQ ID NO: 50 [ZmGWD2], SEQ ID NO: 179 [GWD1], SEQ ID NO: 180 [GWD2], SEQ ID NO: 183 [DSP1], SEQ ID NO: 184 [ISA3], SEQ ID NO: 209 [PvGWDko2] y SEQ ID NO: 216 [sec. flanqueantes SbGWDko2a].
83. La construcción genética de uno cualquiera o más de los párrafos 77 - 82, en donde el al menos un gen comprende una secuencia con al menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 5 [sec. codificante de SbGWD], SEQ ID NO: 6 [sec.codificante de ZmGWD], SEQ ID NO: 7 [secuencia codificante de OsGWD], SEQ ID NO: 8 [gen SbGWD], SEQ iD NO: 9 [gen ZMGWD], SEQ ID NO: 10 [5'UTR y promotor del gen SbGWD], SeQ ID 11 NO: [5'UTR y promotor del gen ZmGWD], SEQ ID NO: 12 [3'UTR del gen SbGWD], SEQ ID NO: 13 [3'UTR del gen ZmGWD], SEQ ID NO: 17 [sec. codificante de SbPWD], SeQ ID NO: 18 [sec. codificante de ZmPWD], SEQ ID NO: 19 [sec. codificante de OsPWD], SEQ ID NO: 20 [gen SbPWD], SEQ ID NO: 21 [gen ZmPWD]. SEQ ID NO: 22 [5'UTR y promotor del gen SbPWD], SEQ ID NO: 23 [3'UTR del gen SbPWD], SEQ ID NO: 24 [3'UTR del gen ZmPWD], SEQ ID NO: 29 [secuencia codificante de ZmDSP], SEQ ID NO: 30 [secuencia codificante de SbDSP], SEQ ID NO: 31 [secuencia codificante de OsDSP], SEQ ID NO: 32 [gen ZmDSP], SEQ ID NO: 33 [gen SbDSP], SEQ ID NO: 34 [5'UTR y promotor del gen ZmDSP], SEQ ID NO: 35 [5'UTR y promotor del gen SbDSP], SEQ ID NO: 36 [3'UTR de ZmDSP], SEQ ID NO: 37 [3'UTR del gen SbDSP], SEQ ID NO: 173 [gen OsGWD], SEQ ID NO: 174 [gen DSP], SEQ ID NO: 175 [gen ISA3], SEQ ID NO: 176 [secuencia codificante de OsGWD], SEQ ID NO: 177 [secuencia codificante de DSP], SEQ ID NO: 178 [secuencia codificante de ISA3], SEQ ID NO: 182 [porción del gen SlGWD], SEQ ID NO: 191 [gen SbGWD-1], SEQ ID NO: 192 [gen SbGDW-2], SEQ ID NO: 206 [PvGWD-2], SEQ ID NO: 207 [PvGWD-5], SEQ ID NO: 208 [PvGWD-1] y SEQ ID NO: 215 [secuencia fusionada de mijo].
84. La construcción genética de uno cualquiera o más de los párrafos 77 - 83, en donde la proteína se selecciona del grupo que consiste en: Glucano Agua Dicinasa, Fosfoglucano Agua Dicinasa, Proteína fosfatasa de Especificidad Dual, p-amilasa, isoamilasa, dextrinasa límite, una enzima desproporcionadora y una enzima de desramificación
85. La construcción genética de uno cualquiera o más de los párrafos 77 - 84, en donde la al menos una enzima que degrada polisacáridos se selecciona de un grupo que consiste en: una xilanasa, una endoglucanasa, una exoglucanasa, una amilasa, una xilanasa modificada con inteína, una endoglucanasa modificada con inteína, una exoglucanasa modificada con inteína y una amilasa modificada con inteína.
86. La construcción genética de uno cualquiera o más de los párrafos 77 - 84, en donde el segundo ácido nucleico aislado comprende una secuencia con al menos un 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % de identidad con la secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 86 [O43097], SEQ ID NO: 87 [BD22308], SEQ ID NO: 88 [BD25243], SEQ ID NO: 89 [EU591743], SEQ ID NO: 90 [NtEGm], SEQ ID NO: 91 [P0C2S1], SEQ ID NO: 92 [P77853], SEQ ID NO: 93 [O68438], SEQ ID NO: 94 [O33897], SEQ ID NO: 164 [amilasa 19862], SEQ ID NO: 165 [glucoamilasa 20082], SEQ ID NO: 166 [glucoamilasa 20707], SEQ ID NO: 167 [amilasa 21853], SEQ ID NO: 168 [AmyS], SEQ ID NO: 170 [GlaA], SEQ ID NO: 104 [EU591743:AS146-7], SEQ ID NO: 105 [P77853: S158-30-108-35] y SEQ ID NO: 106 [P77853:T134-101 -100].
87. La construcción genética de uno cualquiera o más de los párrafos 77 - 78 que comprende una secuencia con al menos un 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o un 100 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 59 [OsUbi3P: amiRNA1wmd3 de OsGWD], SEQ ID NO: 60 [Os Ubi3P: osa-MIR809aM1 de OsGWD], SEQ ID NO: 61 [OsUbi3P:ARNh de OsDSP1], SEQ ID NO: 62 [OsUbi3P:ARNh de OsDSP2], SEQ ID NO: 63 [OsUbi3P:ARNh de OsGWD1], SEQ ID NO: 64 [OsUbi3P:ARNh de OsGWD2], SEQ ID NO: 65 [OsUbi3P: ARNh de OsPWD1], SEQ ID NO: 66 [OsUbi3P:ARNh de OsPWD2], SEQ ID NO: 67 [OsUbi3P:ARNi de SbGWD], SEQ ID NO: 68 [ZmPepCP: ARNi de SbGWD1), SEQ ID NO: 69 [ZmPepCP:ARNi de SbGWD2], SEQ ID NO: 70 [ZmPepCP:ARNi de ZmGWD1], SEQ ID NO: 71 [ZmPepCP:ARNi de ZmGWD2], SEQ ID NO: 72 [OsDSP1 y OsGWD2], SEQ ID NO: 73 [OsPWD2 y OsGWD1], SEQ ID NO: 74 [OsDSP2 y OsPWD1], SEQ ID NO: 119 [ZmUbi1 P:mZ27:BD22308:HvVSD], SEQ ID NO: 120 [ZmPepCP: m27:BD25243:SEKDEL], SEQ ID NO: 121 [OsUbi3P:EU591743], SEQ ID NO: 122 [ZmUbi1P:EU591743: AS146-7:SEKDEL], SEQ ID NO: 123 [ZmUbilp:NvAle:NtEGm: SEKDEL], SEQ ID NO: 124 [ZmPepCP: HvAle:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 125 [OsUbi3P:HvAle:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 126 [OsUbi3P:BAASS: O43097:SEKDEL], SEQ ID NO: 127 [ZmPepCP:BAASS:O43097], SEQ ID NO: 128 [OsUbi3P:068438], SEQ ID NO: 129 [OsUbi3P:P0C2S1], SEQ ID NO: 130 [ZmUbi1 P:Zm:BAASS:P77853:S158-30-108-35], SEQ ID NO: 131 [ZmUbi1:BAASS:P77853:T134-100-101 :SEKDEL], SEQ ID NO: 132 [casete 2379 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 133 [casete 2380 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 134 [casete 4106 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 135 [casete 4107 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 136 [casete 4108 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 137 [casete 4109 - -3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 138 [casete 4110 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 139 [casete 4111 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 140 [casete 4112 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 141 [casete 4113 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 142 [casete 4114 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 143 [casete 4115 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 144 [casete 4116 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 145 [casete 4117 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 146 [casete 4120 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 147 [casete 4121 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 148 [casete 4124 - 2 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 149 [casete 4125 - 2 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 150 [casete 4514 - 3 CWDE y 1 ARNh] y SEQ ID NO: 151 [casete 4515 - 3 CWDE y 1 ARNh].
88. Un método de procesamiento agrícola o preparación de piensos para animales que comprende proporcionar una planta genéticamente modificada que comprende un primer ácido nucleico aislado que codifica un producto que inactiva o inhibe la expresión de al menos un gen que codifica una proteína implicada en la movilización de almidón en una planta y un segundo ácido nucleico aislado que codifica al menos una enzima que degrada polisacáridos, en donde tras la expresión del primer ácido nucleico, la planta genéticamente modificada tiene un nivel alterado de almidón vegetativo en comparación con el nivel de almidón vegetativo en una planta no modificada genéticamente.
89. El método del párrafo 88, en donde la planta genéticamente modificada comprende además un promotor operativamente unido a al menos el primer ácido nucleico aislado o el segundo ácido nucleico aislado.
90. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 88 - 89, en donde la planta genéticamente modificada comprende además un complemento invertido del primer ácido nucleico aislado y un espaciador contiguo con y entre el primer ácido nucleico aislado y el complemento invertido y en donde una secuencia del complemento invertido es capaz de hibridar con una secuencia del primer ácido nucleico aislado en condiciones de rigurosidad moderada.
91. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 88 - 89, en donde el producto es un miARN capaz de dirigirse a un ARN mensajero transcrito a partir de un gen diana seleccionado del al menos un gen.
92. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 88 - 89, en donde el producto es una enzima de restricción capaz de cortar una secuencia de un gen diana seleccionado del al menos un gen.
93. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 88 - 89, en donde el primer ácido nucleico aislado comprende una secuencia con al menos un 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 38 [amiRNA1wmd3 de OsGWD], SEQ ID NO: 39 [micro ARN de OsGWD osa-MR809aM1], SEQ ID NO: 40 [OsDSP1], SEQ ID NO: 41 [OsDSP2], SEQ ID NO: 42 [OsGWD1], SEQ ID NO: 43 [OsGWD2], SEQ ID NO: 44[OsPWD1], SEQ ID NO: 45 [OsPWD2], SEQ ID NO: 46 [sec. flanqueantes SbGWD- SbGWDko2b], SEQ ID NO: 47 [SbGWD1], SEQ ID NO: 48 [SbGWD2], SEQ ID NO: 49 [ZmGWD1], SEQ ID NO: 50 [ZmGWD2], SEQ ID NO: 179 [GWD1], SEQ ID NO: 180 [GWD2], SEQ ID NO: 183 [DSP1], SEQ ID NO: 184 [ISA3], SEQ ID NO: 209 [PvGWDko2] y SEQ ID NO: 216 [sec. flanqueantes SbGWDko2a].
94. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 88 - 92, en donde el al menos un gen comprende una secuencia con al menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 5 [secuencia codificante de SbGWD], SEQ ID NO: 6 [secuencia codificante de ZmGWD], SEQ ID NO: 7 [secuencia codificante de OsGWD], SEQ ID NO: 8 [gen SbGWD], SEQ ID NO: 9 [gen ZMGWD], SEQ ID NO: 10 [5'UTR y promotor del gen SbGWD], SEQ ID 11 NO: [5'UTR y promotor del gen ZmGWD], SEQ ID NO: 12 [3'UTR del gen SbGWD], SEQ ID NO: 13 [3'UTR del gen ZmGWD], SEQ ID NO: 17 [sec. codificante de SbPWD], SeQ ID NO: 18 [sec. codificante de ZmPWD], SEQ ID NO: 19 [sec. codificante de OsPWD], SEQ ID NO: 20 [gen SbPWD], SEQ ID NO: 21 [gen ZmPWD]. SEQ ID NO: 22 [5'UTR y promotor del gen SbPWD], SEQ ID NO: 23 [3'UTR del gen SbPWD], SEQ ID NO: 24 [3'UTR del gen ZmPWD], SEQ ID NO: 29 [secuencia codificante de ZmDSP], SEQ ID NO: 30 [secuencia codificante de SbDSP], SEQ ID NO: 31 [secuencia codificante de OsDSP], SEQ ID NO: 32 [gen ZmDSP], SEQ ID NO: 33 [gen SbDSP], SeQ ID NO: 34 [5'UTR y promotor del gen ZmDSP], SEQ ID NO: 35 [5'UTR y promotor del gen SbDSP], SEQ ID NO: 36 [3'UTR de ZmDSP], SEQ ID NO: 37 [3'UTR del gen SbDSP], SEQ ID NO: 173 [gen OsGWD], SEQ ID NO: 174 [gen DSP], SEQ ID NO: 175 [gen ISA3], SEQ ID NO: 176 [secuencia codificante de OsGWD], SEQ ID NO: 177 [secuencia codificante de DSP], SEQ ID NO: 178 [secuencia codificante de ISA3], SEQ ID NO: 182 [porción del gen S1GWD], SEQ ID NO: 191 [gen SbGWD-1], SEQ ID NO: 192 [gen SbGDW-2], SEQ ID NO: 206 [PvGWD-2], SEQ ID NO: 207 [35; PvGWD-5], SEQ ID NO: 208 [PvGWD-1 ] y SEQ ID NO: 215 [secuencia fusionada de mijo].
95. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 88 - 94, en donde la proteína se selecciona del grupo que consiste en: Glucano Agua Dicinasa, Fosfoglucano Agua Dicinasa, Proteína fosfatasa de Especificidad Dual, pamilasa, isoamilasa, dextrinasa límite, una enzima desproporcionadora y una enzima de desramificación.
96. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 88 - 95, en donde la al menos una enzima que degrada polisacáridos se selecciona de un grupo que consiste en: una xilanasa, una endoglucanasa, una exoglucanasa, una amilasa, una xilanasa modificada con inteína, una endoglucanasa modificada con inteína, una exoglucanasa modificada con inteína y una amilasa modificada con inteína.
97. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 88 - 95, en donde el segundo ácido nucleico comprende una secuencia con al menos un 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SeQ ID NO: 86 [O43097], SEQ ID NO: 87 [BD22308], SEQ ID NO: 88 [BD25243], SEQ ID NO: 89 [EU591743], SEQ ID NO: 90 [NtEGm], SEQ ID NO: 91 [P0C2S1], SEQ ID NO: 92 [P77853], SEQ ID NO: 93 [O68438], SEQ ID NO: 94 [O33897], SEQ ID NO: 164 [amilasa 19862], SEQ ID NO: 165 [glucoamilasa 20082], SEQ ID NO: 166 [glucoamilasa 20707], SEQ ID NO: 167 [amilasa 21853], SEQ ID NO: 168 [AmyS], SEQ ID NO: 170 [GlaA], SEQ ID NO: 104 [EU591743:AS146-7], SEQ ID NO: 105 [P77853: S158-30-108-35] y SEQ ID NO: 106 [P77853:T134-101-100].
98. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 88 - 89, en donde el primer ácido nucleico aislado y el segundo ácido nucleico aislado están dentro de una construcción genética que comprende una secuencia con al menos un 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o un 100 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: s Eq ID NO: 59 [OsUbi3P:amiRNA1wmd3 de OsGWD], SEQ ID NO: 60 [Os Ubi3P: osa-MIR809aM1 de OsGWD], SEQ ID NO: 61 [OsUbi3P:ARNh de OsDSP1], SEQ ID NO: 62 [OsUbi3P: OsDSP2 ARNh], SEQ ID NO: 63 [OsUbi3P:ARNh de OsGWD1], SEQ ID NO: 64 [OsUbi3P:ARNh de OsGWD2], SEQ ID NO: 65 [OsUbi3P: ARNh de OsPWD1], SEQ ID NO: 66 [OsUbi3P:ARNh de OsPWD2], SEQ ID NO: 67 [OsUbi3P:ARNi de SbGWD], SEQ ID NO: 68 [ZmPepCP: ARNi de SbGWD1), SEQ ID NO: 69 [ZmPepCP:ARNi de SbGWD2], SEQ ID NO: 70 [ZmPepCP:ARNi de ZmGWD1], SEQ ID NO: 71 [ZmPepCP:ARNi de ZmGWD2], SEQ ID NO: 72 [OsDSP1 y OsGWD2], SEQ ID NO: 73 [OsPWD2 y OsGWD1], SEQ ID NO: 74 [OsDSP2 y OsPWD1], SEQ ID NO: 119 [ZmUbi1 P:mZ27:BD22308:HvVSD], SEQ ID NO: 120 [ZmPepCP: m27:BD25243:SEKDEL], SEQ ID NO: 121 [OsUbi3P:EU591743], SEQ ID NO: 122 [ZmUbi1P:EU591743: AS146-7:SEKDEL], SEQ ID NO: 123 [ZmUbilp:NvAle:NtEGm: SEKDEL], SEQ ID NO: 124 [ZmPepCP: HvAle:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 125 [OsUbi3P:HvAle:NtEGm:SEKDEL], SEQ ID NO: 126 [OsUbi3P:BAASS: O43097:SEKDEL], SEQ ID NO: 127 [ZmPepCP:BAASS:O43097], SEQ ID NO: 128 [OsUbi3P:068438], SEQ ID NO: 129 [OsUbi3P:P0C2S1], SEQ ID NO: 130 [ZmUbi1 P:Zm:BAASS:P77853:S158-30-108-35], SEQ ID NO: 131 [ZmUbi1P:BAASS:P77853:T134-100101 :SEKDEL], SEQ ID NO: 132 [casete 2379 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 133 [casete 2380 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 134 [casete 4106 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 135 [casete 4107 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 136 [casete 4108 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 137 [casete 4109 - -3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 138 [casete 4110 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 139 [casete 4111 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 140 [casete 4112 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 141 [casete 4113 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 142 [casete 4114 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 143 [casete 4115 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 144 [casete 4116 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 145 [casete 4117 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 146 [casete 4120 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 147 [casete 4121 - 3 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 148 [casete 4124 - 2 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 149 [casete 4125 - 2 CWDE y 1 ARNh], SEQ ID NO: 150 [casete 4514 - 3 CWDE y 1 ARNh] y SEQ ID NO: 151 [casete 4515 - 3 CWDE y 1 ARNh].
99. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 88 - 98, en donde la planta genéticamente modificada es la planta genéticamente modificada de cualquiera de los párrafos 17 - 20 o 66 - 76.
100. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 88 - 99 que comprende además el tratamiento previo de la planta genéticamente modificada con una formulación química para formar una mezcla.
101. El método del párrafo 100, en donde la formulación química incluye al menos un resto que comprende un ion seleccionado del grupo que consiste en: sulfito, bisulfito, sulfato, carbonato, hidróxido y óxido.
102. El método del párrafo 101, en donde el al menos un resto incluye además un contraión seleccionado del grupo que consiste en: amonio, sodio, magnesio y calcio.
103. El método del párrafo 100, en donde la formulación química incluye un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: un ácido sulfúrico, una base, bisulfito de amonio y carbonato de amonio.
104. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 100 - 103, en donde la mezcla tiene una relación líquida a sólido seleccionada del valor de menor que o igual a uno de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1.
105. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 100 - 104, en donde el tratamiento previo incluye incubar la mezcla durante un período de menos de o igual a uno de 16 horas, 15 horas, 14 horas, 13 horas, 12 horas, 11 horas, 10 horas, 9 horas, 8 horas, 7 horas, 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas o 1 hora.
106. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 100 - 105, en donde el tratamiento previo incluye proporcionar una temperatura de mezcla de 40 °C a 120 °C.
107. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 100 - 106, en donde el tratamiento previo incluye proporcionar una mezcla a un pH que varía de 1,0 a 12,0.
108. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 100 - 107 que comprende además la hidrolización de la mezcla.
109. El método del párrafo 108, en donde la etapa de hidrolización incluye incubar la mezcla durante un período de menos de o igual a uno de 144 horas, 140 horas, 130 horas, 120 horas, 110 horas, 100 horas, 90 horas, 80 horas, 70 horas, 60 horas, 50 horas, 40 horas, 30 horas, 20 horas, 10 horas, 9 horas, 8 horas, 7 horas, 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas o 1 hora.
110. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 108 - 109, en donde la etapa de hidrolización incluye incubar la mezcla a una temperatura de 100 °C o menos.
111. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 108 - 110 que comprende además la hidrolización de la planta genéticamente modificada con una o más enzimas exógenas.
112. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 108 - 111 que comprende además exponer la planta genéticamente modificada a un organismo fermentador en condiciones de fermentación para producir un producto químico.
113. El método del párrafo 112, en donde la una o más enzimas exógenas se selecciona del grupo que consiste en: una glucosidasa, una endoglucanasa, una celobiohidrolasa, una glucosidasa, una p-xilosidasa, una celulasa, una xilanasa, una amilasa, una invertasa, una proteasa, una fitasa, una enzima hidrolítica, una glucanasa, una hemicelulasa, una esterasa, una lacasa, una mananasa y una peroxidasa.
114. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 88 - 111 que comprende además al menos una etapa seleccionada del grupo que consiste en: secar la planta genéticamente modificada, granular la planta genéticamente modificada en gránulos de pienso, ensilar la planta genéticamente modificada para hacer ensilado y combinar la planta genéticamente modificada con granos destiladores o con una fuente de fibra comestible.
115. El método del párrafo 114, en donde la fuente de fibra comestible se selecciona del grupo de plantas que consiste en: maíz, sorgo, trigo, centeno, semillas de soja, grano de maíz, grano de sorgo, grano de trigo, grano de centeno, harina de soja, harina de maíz, aceite de maíz y germen de maíz.
116. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 88 - 111 y 114 - 115 que comprende además alimentar a un animal con la planta genéticamente modificada para promover el crecimiento del animal.
117. El método del párrafo 116, en donde el animal se selecciona del grupo que consiste en: pollos, cerdos y vacas.
118. El método de uno cualquiera o más de los párrafos 88 - 117, en donde la etapa de proporcionar incluye producir la planta genéticamente modificada usando transformación mediada por Agrobacterium-con la construcción genética.
119. El método del párrafo 118, en donde la planta genéticamente modificada se selecciona del grupo que consiste en: maíz, soja, arroz, caña de azúcar, remolacha azucarera, sorgo, mijo, miscanto, eucalipto, sauce y álamo.
120. Uso de una cualquiera o más de las plantas modificadas genéticamente de los párrafos 17 - 20 y 66 - 76 para procesar la biomasa vegetal mediante un método de uno cualquiera o más de los párrafos 21 - 65 y 88 - 119.
121. El uso del párrafo 120, en donde una o más de las plantas genéticamente modificadas incluyen una cualquiera o más de las construcciones genéticas de los párrafos 1 - 16 y 77 - 87.
122. Uso de uno cualquiera o más de las construcciones genéticas de los párrafos 1 - 16 y 77 - 87 en un método de procesamiento de biomasa vegetal en uno cualquiera o más de los párrafos 21 - 65 y 88 - 119.
123. El uso del párrafo 122, en donde la una cualquiera o más de las construcciones genéticas se usaron para obtener una cualquiera o más de las plantas genéticamente modificadas de los párrafos 17 - 20 y 66 - 76.
Ejemplo 1. identificación de los genes diana
Las bibliotecas de inserción de ADN-T a partir de diferentes organismos pueden investigarse para localizar genes en aquellos organismos relacionados con la regulación del almidón. Basándose en el descubrimiento de tales genes, se puede realizar una búsqueda para encontrar genes similares en una planta de interés. Los genes de interés pueden usarse en construcciones de la presente memoria para afectar la alteración en la regulación del almidón.
Se han desarrollado otros métodos para generar o identificar alelos nulos entre genes. Entre estos están TILLING (Till BJ, Cooper J, Tai TH, Colowit P, Greene EA, Henikoff S, Comai L Discovery of chemically induced mutations in rice by TILLING (2007) BMC Plant Biol. 7:19) y el etiquetado de genes con retrotransposones Tos17 o transposones Ac y Ds/dSpm de maíz (Zea mays) modificado (Krishnan A, Guiderdoni E, An G, Hsing YI, Han CD, Lee MC, Yu SM, Upadhyaya N, Ramachandran S, Zhang Q, Sundaresan V, Hirochika H, Leung H, Pereira A. 2009. Mutant resources in rice for functional genomics of the grasses. Plant Physiol. 149:165-70 y referencias en el mismo). Estos métodos pueden usarse para generar o identificar alelos nulos entre genes relacionados con la regulación del almidón.
Una vez que se identificaron los genes que codifican enzimas clave implicadas en la renovación del almidón transitorio en los cultivos de ejemplo, se identificaron genes candidatos en arroz, maíz y sorgo que codifican enzimas implicadas en la renovación del almidón por su homología con genes que codifican las enzimas correspondientes en especies que se han estudiado mejor. Por ejemplo, las alineaciones de aminoácidos con CLUSTAL entre secuencias hipotéticas de glucano agua dicinasa (GWD) que se han inferido a partir de secuencias de genoma propuestas de sorgo (SbGWD; SEQ ID NO: 1), maíz (ZmGWD; SEQ ID NO: 2) y arroz (OsGWD; SEQ ID NO: 3) y la secuencia de la enzima GWD conocida de patata (StGWD; SEQ ID NO: 4) muestran una extensa homología entre estos polipéptidos:
Alineación de secuencias múltiples con CLUSTAL 2.1
SbGWD ----------MTGFSAAASAAAAAERCALAIRARPAASSPAKRQQQSASLRRSGGQRRPT 50
ZmGWD----------------------------------------------------------------OsGWD-----------------------------------------------------------PAATT 5
StGWD
MSNSLGNNLLY QGFLTST VLEHKSRISPPC V GGNSLFQQQ VISKSPLSTEFRGNRLK VQK 60
SbGWD
TLAASRRSPVVVPRAIATSADRASHDLVGKFTLDSNSELLVAVNPAPQGLVSVIGL EVTN 110
ZmGWD--------------------------------------------------------------OsGWD TLAVSRRS-LLAPRAIAASTGRASPGLVGRFTLDANSELKVTLNPAPQGSVVEINLEATN 64 StGWD
KKIPMEKKRAF S S SPH AVLTTDT S SEL AEKF SLGGNIELQ VD VRPPT S GD V SF VDF QVTN 120
SbGWD TSGSLILHWGVLRPDKRDWILPSRQPDGTTVYKNRALRTPFVKSGDNSTLRIEIDD PAVQ 170
ZmGWD--------------------------PDGTTVYKNRALRTPFVKSGDNSTLRIEIDDPGVH 35
OsGWD TSGSLILHWGALRPDRGEWLLPSRKPDGTTVYKNRALRTPFIKSGDNSTLKIEIDDP AVQ 124
StGWD GSDKLFLHWGAVKFGKETWSLPNDRPDGTKVYKNKALRTPFVKSGSNSILRLEIR DTAIE 180
SbGWD AIEFLIFGETQNKWFKNNGQNFQIQLQSSRHQGNGASGASSSATSTLVPEDLVQIQ AYLR230
ZmGWD AIEFLIFDETQNKWFKNNGQNFQVQFQSSRHQGTGASGASSSATSTLVPEDLVQIQ AYLR 95
OsGWD AIEFLIFDEARNNWYKNNGQNFQIQLQASQYQGQGTSTATS— STVVPEDL V QIQ S YLR 181
StGWD AIEFLIYDEAHDKWIKKNGGNFRVKLSRKEIRGP------------D V S VPEEL VQIQ S YLR 230
SbGWD WERKGKQSYTPEQEKEEYEAARAELIEELNRGVSLEKLRAKLTKTPEAPESDERK SPASR290
ZmGWD
WERRGKQSYTPEQEKEEYEAARAELIEEVNRGVSLEKLRAKLTKAPEAPESDESK SSASR 155
OsGWD WERKGKQSYTPEQEKEEYEAARTELIEELNKGVSLEKLRAKLTKTPEATDSNAPA SEST- 240
StGWD WERKGKQNYPPEKEKEEYEAARTYLQEEIARGASIQDIRARLTKTNDKSQSKEEP LHVT- 289
SbGWD
MP VDKLPEDL V Q V Q AYIRWEKAGKPN YPPEKQL VELEE ARKELQ AEVDKGISIDQ LRQKI 350
ZmGWD
VPIGKLPEDLV Q V QAYIRWEQAGKPNYPPEKQLVEFEE ARKELQ AEVDKGISIDQL RQKI215
OsGWD -VTTKVPEELVQVQAYIRWEKAGKPNYAPEKQLVEFEEARKELQSELDKGTSVEQ LRNKI 299
StGWD -KSDIPDDLAQAQAYIRWEKAGKPNYPPEKQIEELEEARRELQLELEKGITLDELRK TI 347
SbGWD LKGNIESKVSKQLKNKKYFSVERIQRKKRDIMQLLSKHKHT VMEEKVEYAPKQPTVLD 408
ZmGWD LKGNIE SKV SKQLKNKKYF S VERIQRKKRDIT QLL SKHKHT VMEDKVEVVPKQPTVLD 273
OsGWD LKGNIETKV SKQLKDKKYFS VERIQRKKRDIV QLLKKHKPT -VMEAQVET-PKQPTVLD 356
StGWD TKGEIKTKVEKHLK-RS SF AVERIQRKKRDF GHLINKYTS SPAV Q V QKVLEEPP ALSKIK 406
SbGWD
LFTKSLHEKDGCE VLSRKLFKF GDKEIL AISTKV QNKTEVHL ATNHTEPLILHWSL AKKA468
ZmGWD LFTKSLHEKDGCEVLSRKLFKFGDKEILAISTKVQNKTEVHLATNHTDPLILHWSL AKNA 333
OsGWD LFTKSLQEQDNCEVLSRKLFKFGDKEILGITTVALGKTKVHLATNYMEPLILHWA
5 LSKEN416
StGWD LYAKEKEEQIDDPILNKKIFKYDDGELLYLVAKSSGKTKYHLATDLNQPITLHWA LSKSP 466
SbGWD GEWKAPPSNILPSGSKLLDMACETEFTRSELDGLC— YQVVEIELDDGGYKGMPFVLRSG 526
ZmGWD GEWKAPSPNILPSGSTLLDKACETEFTKSELDGLH--I o YQVVEIELDDGGYKGMPFVLRSG 391
OsGWD GEWQAPPSSILPSGSSLLDKACETSFSEYELNGLH— CQVVEIELDDGGYKRMPFVLRSG 474
StGWD GEWMVPPSSILPPGSIILDKAAETPFSASSSDGLTSKVQSLDIVIEDGNFVGMPFVLL SG 526
SbGWD ETWIKNNGSDFFLDFSTRDTRNIK—
15 LKDNGDAGKGTAKALLERIADLEEDAQRSLMHRF 584
ZmGWD ETWIKKNGSDFFLDFSTHDVRNIKAILKDNGDAGKGTSKALLERIADLEEDAQRSL MHRF451
OsGWD ETWMKNNGSDFYLDFSTKVAKNTK—
DT GD AGKGT AKALLERI ADLEED AQRSLMHRF 530
StGWD EKWIKNQGSDFYVGFSAASKLALK------AAGDGSGTAKSLLDKIADMESEAQKSFMHRF 581
20
SbGWD
NIAADEADEARDAGFFGIVGFFVWIRFMATRQFTWNKNYNVKPREISKAQDRFT DDLENM 644
ZmGWD NIAADPADQARDAGFFGIVGEFVWIRFMATRQFTWNKNYNVKPREISKAQDRFT DDFENM 511
OsGWD NIAADFVDQARDNGFFGIIGIFVWIRFMATRQFIWNKNYNVKPREISKAQDRFTD DEENM 590
StGWD NIAADEIEDATSAGEEGFAGIEVWMRFMATRQEIWNKNYNVKPREISKAQDRETD EEQNA641
SbGWD
YRT YPQ YREIFRMIM AAV GRGGEGD VGQRIRDEIF VIQRNNDCKGGMMEEWHQ KLHNNTS 704
ZmGWD
YKTYPQYREILRMIMAAVGRGGEGDVGQRIRDEIL VIQRNNDCKGGMMEEWHQ KLHNNTS 571
OsGWD YRTYPQYQEIFRMIMSAVGRGGEGDVGQRIRDEIFVIQRNNDCKGGMMEEWHQK FHNNTS 650
StGWD
FTSHPQ YREIERMIMSTVGRGGEGD VGQRIRDEIF VIQRNNDCKGGMMQEWHQK FHNNTS 701
SbGWD PDDVVICQAFIDYIKNDFDISVYWDTFNKNGITKERFFSYDRAIHSEPNFRSEQKEG FER 764
ZmGWD PDDVVICQAFIDYIKSDFDISVYWDTFNKNGITKERLFSYDRAIHSEPNFRSEQKAG FER 631
OsGWD PDDVVICQAFFDYIKSDFDIGVYWDTFKKDGITKERFFSYDRPIHSEPNFRSEQKD GFFR710
StGWD
PDDVVICQALIDYIKSDFDLGVYWKTLNENGITKERLLSYDRAIHSEPNFRGDQKG GLLR 761
SbGWD
DLGNYMRSLKAVHS GADLES AI AT CMGYKSEGEGFMV GV QINP VKGLPSGFPEL LEFVLD 824
ZmGWD
DLGNYMRSLKAVHSGADLESAIASCMGYKSEGEGFMVGVQINPVKGLPSGFPELL EFVLE 691
OsGWD
DLGNYMRSLKAVHSGADLESAIATCMGYKSEGEGFMVGVQINPVKGLPSGFPKL LEFVLD 770
StGWD
DLGHYMRTLKAVHSGADLESAIANCMGYKTEGEGFMVGVQINPVSGLPSGFQDL LHFVLD 821
SbGWD
HVEDKSAEPLLEGLLEARVDLRPLLLDSPERMKDLIFLDIALDSTFRTAIERSYEEL NDA 884
ZmGWD
HVEDKSAEPLPEGLLEARVELRPLLLDSRERMKDLIFLDIALDSTFRTAIERSYEEL NDA 751
OsGWD
HVEDKSAEPLLEGLLEARAELHPLLLGSPERMKDLIFLDIALDSTFRTAVERSYEEL NNV830
StGWD
HVEDKNVETLLERLLEAREELRPLLLKPNNRLKDLLFLDIALDSTVRTAVERGYEE LNNA881
SbGWD
APEKIMYFISLVLENLAFSIDDNEDILYCLKGWNQALEMAKQKDDQWALYAKAF LDRIRL 944
ZmGWD
APEKIMYFISLVLENLALSIDDNEDILYCLKGWNQALEMAKQKDDQWALYAKAF LDRNRL 811
OsGWD
EPEKIMYFISLVLENLALSTDDNEDILYCLKGWNQALEMAKQKKNQWALYAKAF LDRTRL 890
StGWD
NPEKIMYFISLVLENLALSYDDNEDLVYCLKGWNQALSMSNGGDNHWALFAKA VLDRTRL 941
SbGWD
ALASKGEQYHNMMQPSAEYLGSLLSIDKWAVNIFTEEIIRGGSAATLSALLNRFDP VLRN 1004
ZmGWD
ALASKGEQYHNMMQPSAEYLGSLLSIDQWAYNIFTEEIIRGGSAATLSALLNRFDP YLRN 871
OsGWD
ALASKGEQYYNLMQPSAEYLGSLLNIDQWAVNIFTEEIIRGGSAATLSALLNRIDP VLRN 950
StGWD
ALASKAEWYHHLLQPSAEYLGSILGVDQWALNIFTEEIIRAGSAASLSSLLNRLDP VLRK 1001
* * * * * '* * : : : : * * * * * * * * N ^ : * : * * : * * * * * * * * ^ * * * * : * * : * * * * : * * * * * :
SbGWD
VANLGSWQVISPVEVSGYVVVVDELLAVQNKSYDKPTILVAKSVKGEEEIPDGVV GVITP 1064
ZmGWD
VAHLGSWQVISPVEVSGYVVVVDELLAVQNKSYDKPTILVAKSVKGEEEIPDGVV GVITP 931
OsGWD
VAQLGSWQVISPVEVSGYIVVVDELLAVQNKSYDKPTILVAKSVKGEEEIPDGVV GVITP 1010
StGWD
TANLGSWQIISPVEAVGYVVVVDELLSVQNEIYEKPTILVAKSVKGEEEIPDGAVA LITP 1061
Figure imgf000036_0001
SbGWD DMPDVLSHVSVRARNSKVLFATCFDHTTLSELEGYDQKLLSFKPTSADITYREITE SELQ 1124
ZmGWD DMPDVLSHVSVRARNSKVLFATCFDHTTLSELEGYDQKLFSFKPTSADITYREITE SELQ 991
OsGWD DMPDVLSHVSVRARNCKVLFATCFDPNTLSELQGHDGKVFSFKPTSADITYREIPE SELQ 1070
StGWD DMPDYLSHYSYRARNGKYCFATCFDPNILADLQAKEGRILLLKPTPSDIIYSEYNEI ELQ 1121
SbGWD QSSSPNAEVGHAVPSISLAKKKFLGKYAISAEEFTEEMVGAKSRNIAYLKGKVPS WVGVP 1184
ZmGWD QSSSPNAEVGHAVPSISLAKKKFLGKYAISAEEFSEEMVGAKSRNIAYLKGKVPSW VGVP 1051
OsGWD -SGSLNAEAGQAVPSVSLVKKKFLGKYAISAEEFSEEMVGAKSRNVAYLKGKVPS WVGVP 1129
StGWD -S S SNL VE AETS ATLRL VKKQFGGC YAIS ADEFTSEM V GAKSRNIAYLKGKVPS S V GIP 1179
SbGWD TSVAIPFGTFEKVLSDGLNKEVAQTIEKLKIRLAQEDFSALGEIRKAVLNLTAPMQ LVNE 1244
ZmGWD TSVAIPFGTFEKVLSDGLNKEVAQSIEKLKIRLAQEDFSALGEIRKVVLNLTAPMQL VNE l i l i
OsGWD
TSVAIPFGTFEKVLSDEINKEVAQTIQMLKGKLAQDDFSALGEIRKTVLNLTAPTQ LIKE 1189
StGWD
TSVALPFGVFEKVLSDDINQGVAKELQILMKKLSEGDFSALGEIRTTVLDLSAPAQ FVKE 1239
SbGWD
LKERMLGSGMPWPGDEGNRRWEQAWMAIKKVWASKWNERAYFSTRKVKLNH EYFSMAVFV 1304
ZmGWD
FKERMFGSGMPWPGDEGDKRWEQAWMAIKKVWASKWNERAYFSTRKVKFDH EYFSMAVFV 1171
OsGWD
FKEKMFGSGMPWPGDEGDQRWEQAWMAIKKVWASKWNERAYFSTRKVKFDH DYLSMAVLV 1249
StGWD
LKEKMQGSGMPWPGDEGPKRWEQAWMAIKKVWASKWNERAYFSTRKVKLDH DYLCMAVLV 1299
SbGWD
QEVVNADYAFVIHTTNPSSGDSSEIYAEVVKGLGETLVGAYPGRAMSFVCKKDDL DSPKL 1364
ZmGWD
QEVVNADYAFVIHTTNPSSGDSSEIYAEVVKGLGETLVGAYPGRAMSFVCKKDDL DSPKL 1231
OsGWD
QEIVNADYAFVIHTTNPSSGDSSEIYAEVVKGLGETLVGAYPGRAMSFVCKKNDL D SPK V 1309
StGWD
QEIINAD Y AF VIHTTNPS SGDDSEIY AEV VRGLGETLV GAYPGRALSFICKKKDLN S PQV 1359
SbGWD
LGYPSKPIGLFIRRSIIFRSDSNGEDLEGYAGAGLYDSVPMDEEDEVVLDYTTDPLI VDR 1424
ZmGWD
LGYPSKPIGLFIRQSIIFRSDSNGEDLEGYAGAGLYDSVPMDEEDEVVLDYTTDPLI VDR 1291
OsGWD
LGFPSKPIGLFIKRSIIFRSDSNGEDLEGYAGAGLYDSVPMDEEDEVILDYTTDPLIT DQ 1369
StGWD
LGYPSKPIGLFIKRSIIFRSDSNGEDLEGYAGAGLYDSVPMDEEEKVVIDYSSDPLIT DG 1419
SbGWD
GFRNSILSSIARAGHAIEELYGSPQDVEGVVKDGKIYVVQTRPQM 1469 (SEQ ID NO: 1)
ZmGWD
GFRSSILSSIARAGHAIEELYGSPQDVEGVVKDGKIYVVQTRPQM 1336 (SEQ ID NO: 2)
OsGWD
GFQKSILSSIARAGHAIEELYGSPQDVEGAVKEGKLYVVQTRPQM 1414 (SEQ ID NO: 3)
StGWD NFRQTILSNIARAGHAIEELYGSPQDIEGVVRDGKIYVVQTRPQM
1464 (SEQ ID NO: 4)
Basándose en esta homología, es posible identificar secuencias de genes (incluyendo secuencias codificantes que no habían sido previamente anotadas en bases de datos públicas) que corresponden a las enzimas GWD de los genomas de las respectivas especies. Estas secuencias incluyen secuencias (codificantes) de ADNc de GWD supuestas de sorgo (SEQ ID NO: 5), maíz (SEQ ID NO: 6) y arroz (SEQ ID NO: 7), los genes correspondientes a partir de los cuales se transcriben los ARNm de GWD para GWD de sorgo (SEQ ID NO: 8) y maíz (SEQ ID NO: 9). Además, a partir de esta información, también se pueden inferir las secuencias de las regiones 5' no traducidas (UTR por sus siglas en inglés) y los promotores de los respectivos genes GWD en sorgo (SEQ ID NO: 10) y maíz (SEQ ID NO: 11), así como las 3' UTR de los respectivos genes de GWD en sorgo (SEQ ID NO: 12) y maíz (SEQ ID NO: 13). El gen SbGWD se encuentra en el cromosoma 10 de sorgo en el sorgo y consiste en una secuencia de 12128 pb (ATG para parar), mientras que el gen ZmGWD de 11693 pb se encuentra en el cromosoma 6 de maíz. La identidad de secuencia completa entre los dos genes es del 78,3 %, mientras que las secuencias de ADNc inferidas son 95,6 % idénticas. Cada gen está compuesto por 32 exones de idéntica longitud interrumpidos por 31 intrones, que no difieren en tamaño de forma considerable. Las proteínas ZmGWD de 1471 aminoácidos (AA) y SbGWD de 1469AA deducidas comparten una identidad de secuencia del 94,4 % a nivel de aminoácidos. Ambas proteínas se caracterizan por la presencia del dominio PPDK_N (Piruvato fosfato dicinasa, unión a PEP/piruvato) en la región 1267-1470AA de ZmGWD y 1265-1468AA de SbGWD. La otra característica notable de las dos proteínas es la presencia de un resto de His conservado en 1074AA en ZmGWD y en 1072AA en SbGWD, que se necesita para la actividad de fosforilación.
Se pueden usar estrategias similares para identificar secuencias de genes para otras enzimas diana en sorgo y maíz. Se usó alineación CLUSTAL de la siguiente manera para identificar las proteínas diana PWD candidatas de sorgo (SbPWD; SEQ ID NO: 14) y maíz (ZmPWD; SEQ ID n O: 15) basándose en su similitud con la proteína PWD conocida de Arabidopsis thaliana (AtPWD; Se Q ID NO: 16).
Alineación de secuencias múltiples con CLUSTAL 2.1
SbPWD MASLRPFDPSLAARPGPPPPARPAARRPVPAPPLAAPFASALIFPVRPRIPGRTRGT GVA60
ZmPWD---------------------------------------------------------------AtPWD ------- MESIGSHCCSSPFTFITRNSSSSLPRLVN— ITHRVNLSHQSHRLRNSNSRLT 51
SbPWD ASTKHITRTKEEKQTDPSKQDIVRLHVCLDHQVMFGEHVGIIGSAKELGSWKSPV EMDWT 120
ZmPWD---------------------------------------------------------------AtPWD
RT ATS S STIEEQRKKKDGSGTKVRLNVRLDHQ VNF GDHVAMFGS AKEIGS WKKK SPLNWS 111
SbPWD PNGWVCQLDLPGETLLEFKFVVFLNRGKDKIWEDGDNRVVNLPKNGSFDMACH W NKTKEP180
ZmPWD---------------------------------------------------------------AtPWD ENGWVCELELDGGQVLECKFVIVKNDG-SLS WESGDNRVLKVPNSGNFS VVCHWDATRET 170
SbPWD LNLLGTS-EIKLSGDTEKEKDEDAKLSRNIALEEMGNISNAGDGDLTPKLESSTLGGLWQ 239 ZmPWD---------------------------------------------------------------AtPWD LDLPQE V GNDDD V GDGGHERDNHD V GDDRVVGSENG------------AQLQKSTLGGQWQ 219
SbPWD GSDTVFMRSNEHRNNESDRKWDMTGLDAVSLKLVEGDKASRNWWRKLELVRG LVSEYVHD 299
ZmPWD------------------------------------------------------------AtPWD
GKDASFMRSNDHGNREVGRNWDTSGLEGTALKMVEGDRNSKNWWRKLEMVR EVIVGSVER 279
SbPWD
QSHLEALTYSAIYLKWIYTGQIPCFEDGGHHRPNKHAEISRQIFREIERIYYGENTS AQD 359
ZmPWD---------------------------------------------------------------AtPWD
EERLKALIYSAIYLKWINTGQIPCFEDGGHHRPNRHAEISRLIFRELEHICSKKDATP EE 339
SbPWD
LLYIRKIHPCLPSFKSEFTASYPLTRIRDIAHRNDIPHDLKQEIKHTIQNKLHRNAGP ED 419
ZmPWD---------------------------------------------------------------AtPWD
VLVARKIHPCLPSFKAEFTAAVPLTRIRDIAHRNDIPHDLKQEIKHTIQNKLHRNAG PED 399
SbPWD
LIATEAMLARITKTPGEYSEAFVEQFKTFYSELKDFFNAGSLLEQVQSIEQSLDESG LEA 479
ZmPWD------------------------------------------- LLEQLESIEQSLNESGLEA 19
AtPWD
LIATEAMLQRITETPGKYSGDFVEQFKIFHNELKDFFNAGSLTEQLDSMKISMDDR GLSA 459
Figure imgf000040_0001
SbPWD
LSSFLKTKKNLDQLEDAKDLDENGGVQVLLKTLLSLSYLRSILMKGLESGLRNDA PDSAI 539
ZmPWD
LSSFLKTKKNLDQLEDAKDLDENGGVHVLLKTLLSLSYLRSILMKGLESGLRNDA PDSAI 79
AtPWD LNLFFECKKRLDTSG------ESSNVLELIKTMHSLASLRETIIKELNSGLRNDAPDTAI 513
=* í í * * * . * * * * * * . # *
SbPWD AMRQKWRLCEIGLED Y SFVLL SRYINALE ALGGS ASL AEGLPT -NTSLWDDALDALVIGI 598
ZmPWD AMRQKWRLCEIGLEDYSFVLLSRYINALEALGGSASLAEGLPT-NTSLWDDALDALIIGI138
AtPWD
AMRQKWRLCEIGLED YFFVLLSRFLNALETMGGADQLAKDVGSRNVASWNDPL DALVLGY 573
s): sj: :j: _ ,, !§. !§. s|-.. - . ^^ ^ ^ . iji ^ í í ■ ■ 4 ■
SbPWD NQVSFSGWKPNECTAIVNELLSWKQKGLSEFEGSEDGKYIWALRLKATLDRSRRL TEEYS 658
ZmPWD NQVCFSGWKPNECSAIVNELLSWKQKGLSEFEGNEDGKYIWALRLKATLDRTGR LTEEYS 198
AtPWD HQVGLSGWKQEECLAIGNELLAWRERDLLEKEGEEDGKTIWAMRLKATLDRAR RLTAEYS 633
SbPWD EALLSIFPEKVKVLGKALGIPENSVRTYTEAEIRAGVIFQVSKLCTVLLKATRAVLG SSV718
ZmPWD EALLSIFPEKVKVLGKALGIPENSVRTYTEAEIRASVIFQVSKLCTVLLKATRAVLG SSV 258
AtPWD DLLLQIFPPNVEILGKALGIPENSVKTYTEAEIRAGIIFQISKLCTVLLKAVRNSLGSE
G 693
Figure imgf000041_0001
SbPWD WDVLVPGVAHGALIQVERIAPGSLPSSIKEPVVLVVNKADGDEEVKAAGDNIVGV ILLQE 778
ZmPWD
WDVLVPGVAHGALIQVERIAPGSLPSSMKEPVVLVVNKADGDEEVKAAGDNIVG VVLLQE 318
AtPWD WDVVVPGSTSGTLVQVESIVPGSLPATSGGPIILLVNKADGDEEVSAANGNIAGV MLLQE 753
»fi. bfe jf! . .4 .444 4 44.. 4 - - 4 . : 4 .■+: 4 444 44 4 .4 4
SbPWD FPHFSHFGVRARQEKVVFVTCEDDDTIKNTRFFEGKYVRFGASSNNVDFSVVSN KDECAA 838
ZmPWD LPHLSHLGVRARQEKVVFVTCEDDDTIKNMRLLEGKHVRLGASSNNVDLSVVSN KDDCAA 378
AtPWD LPHLSHLGVRARQEKIVFVTCDDDDKVADIRRLVGKFVRLEASPSHVNLILST— EGRS 810
Figure imgf000042_0001
SbPWD MSSELSSGGNLFAQQFSLPLTTDKKLELSEQRS------------YTSGANIMSGVLELSE 887
ZmPWD MSSEPSAGGDLFAQQFSL-LTTDKKLELSEQKS-------------YTSVANGMSGVLELSE 426
AtPWD RTSKSSATKKTDKNSLSKKKTDKKSLSIDDEESKPGSSSSNSLLYSSKDIPSGGIIAL AD 870
Figure imgf000042_0002
SbPWD ASIESSGAKAAACGTLSVLSSVSNKVYNDQGTPAAFRVPAGAVIPFGSMEDAFKK SGSLK947
ZmPWD ASIESSGAKAAACGTLSVLSSMSNKVYNDQGTPAAFRVPAGAVIPFGSMEDALKK SGSLK486
AtPWD ADYPTSGSKSAACGLLASLAEASSKYHSEHGYPASFKYPTGYYIPFGSMELALKQ NNSEE 930
4 _ .44 .4 .4 - 4 - 4 44 - f +4- -+ -+ - 4 .4 - 44 4444 4 4 - 4 - 4 SbPWD
SYTNLLERIETAQIENGELDSLSAELQATVSLLSPSEEIIESLKRIFDQNVRLIVRSTA
N 1007
ZmPWD
SYTNLLERIETAQIENGELDSLSSKLQATYSLLSPSEEIIESLKKTFDQNVRLIVRSTA
N 546
AtPWD
KFASLLEKLETARPEGGELDDICDQIHEVMKTLQVPKETINSISKAFLKDARLIVRS SAN 990
Figure imgf000043_0001
SbPWD
VEDLAGMSAAGLYESIPNVSLSDPSSFCAAVGQVWASLYTRRAILSRRAAGVPQR DAKMA 1067
ZmPWD
VEDLAGMSAAGLYESIPNVSLSDPRSFGAAVGQVWASLYTRRAILSRRAAGVPQR DAKMA 606
AtPWD
VEDLAGMSAAGLYESIPNVSPSDPLVFSDSVCQVWASLYTRRAVLSRRAAGVSQR EASMA 1050
SbPWD
VLVQEMLQPDLSFVLHTVSPVDHDPKLVEAEVAPGLGETLASGTRGTPWRLSCH KFDGKV 1127
ZmPWD
VLVQEMLQPDLSFVLHTISPVDHDPKLVEAEVAPGLGETLASGTRGTPWRLSCHK LDGKV 666
AtPWD
VLVQEMLSPDLSFVLHTVSPADPDSNLVEAEIAPGLGETLASGTRGTPWRLASGK LD G IV 1110
Figure imgf000043_0002
4 4444 A- A 4 ■ 44 4- 4 * 44444 - 4444444444444444444 4 -44 4
SbPWD
TTLAFANFSEEMVVLNSGPTDGEVTRRTVDYSKKPLSVDATFRGQFGQRLAAIGQ YLEQK 1187
ZmPWD
TTLAFANFSEELMVLNSGPTDGEMSRRTVDYSKKPLSVDATFREQFGQRLAAIGQ
YLEQK 726
AtPWD
QTLAFANFSEELLVSGTGPADGKYVRLTVDYSKKRLTVDSVFRQQLGQRLGSVGF
FFERN 1170
Figure imgf000044_0001
SbPWD FGSAQDVEGCLVGQDIFIVQSRPQP- 1212 (SEQ ID NO: 14)
ZmPWD FGSAQDVEGCLVGPDIFIVQSRPQPQ 752 (SEQ ID NO: 15)
AtPWD FGCAQDVEGCLVGEDVYIVQSRPQPL 1196 (SEQ ID NO: 16)
Basándose en esta homología, fue posible identificar secuencias de genes (incluidas secuencias codificantes que no habían sido previamente anotadas en bases de datos públicas) que corresponden a las enzimas PWD de los genomas de las respectivas especies. Estas secuencias incluyen secuencias (codificantes) de ADNc de PWD supuestas de sorgo (SEQ ID NO: 17), maíz (SEQ ID NO: 18) y arroz (SEQ ID NO: 19) y los genes correspondientes de los cuales se transcriben los ARNm de pW d para PWD de sorgo (SeQ ID NO: 20) y maíz (SEQ ID NO: 21). Además, a partir de esta información, también se pueden inferir las secuencias de las regiones 5' no traducidas (UTR) y los promotores del gen PWD en sorgo (SEQ ID NO: 22), así como las 3' UTR de los respectivos genes PWD en sorgo (SEQ ID NO: 23) y maíz (SEQ ID NO: 24). El gen SbPWD de 24,3 kb se encuentra en el cromosoma 4 de sorgo. La secuencia de proteína deducida de la SbPWD (1212AA) tiene una identidad de secuencia del 57 % en toda su longitud con respecto a la proteína PWD de 1196AA de Arabidopsis funcionalmente caracterizada (AY747068). Sin embargo, solo la parte C-terminal de la proteína SbPWD (374AA) tiene homología de secuencia con secuencias genómicas de maíz localizadas en el cromosoma 10. Esta secuencia de proteína parcial de ZmPWD de maíz tiene el 58 % de identidad de secuencia con AtPWD y el 93 % de identidad de secuencia con SbPWD. La alineación de secuencias de las secuencias compiladas para los últimos 13 exones de los genes SbPWD y ZmPWD demostró una identidad de secuencia del 95,2 % a nivel de nucleótidos entre las regiones codificantes. Sin embargo, cuando las secuencias genómicas enteras para esta parte de la PWD de maíz y sorgo están alineadas, solo está presente un 31 % de identidad de secuencia. Las diferencias en las secuencias intrónicas entre los dos genes podrían explicar esta situación. Por ejemplo, el intrón número 11 en SbPWD tiene 5,3 kb y el intrón número 13 tiene 0,8 kb, mientras que sus homólogos en ZmPWD tienen 17 kb y 5 kb de largo. La situación opuesta se encontró para el intrón número 16, que tiene 3,6 kb en SbPWD y solo 248 pb en ZmPWD. El análisis de secuencia de la 3' Ut R de 252 pb de SbPWD y ZmPWD demostró una identidad de secuencia del 78 % interrumpida por numerosas interrupciones en la homología.
Se usó la alineación de secuencia con CLUSTAL de la siguiente manera para identificar las proteínas diana DSP candidatas de maíz (ZmDSP; SEQ ID NO: 25) y sorgo (SbDSP; SEQ ID NO: 26) basándose en su similitud con la proteína DSP conocida de Arabidopsis thaliana (AtDSP; SEQ ID NO: 27). De manera similar, fue posible identificar una proteína DSP de arroz candidata (OsDSP; SEQ ID NO: 28) entre las listas de proteínas hipotéticas de arroz.
Alineación de secuencias múltiples con CLUSTAL 2.1 ZmDSP, SbDSP y AtDSP
ZmDSP MNCLQNLLKE—PPIVGSRSMRR—PSPLNLAMVRGGSRRSNTVKT—
LQAPGASTSG 52
SbDSP MNCLQNLLKE-PPIVGSRSMRR—PSPLNLAMVRGGSRRSNTVKT—
LQAPGASTSG 52
AtDSP
MN CLQNLPRC S Y SPLLGF GCIQRDHSS S S S SLKMLISPPIKANDPKSRL YLHAY SES
KSS60
ZmDSP
AESSAVEMGTEKSEVYSTNMTQAMGAALTYRHELGMNYNFIRPDLIVGSCLQSPL DVDKL 112
SbDSP
AESSAVEMGTEKSEVYSTNMTHAMGAALTYRHELGMNYNFIRPDLIVGSCLQSPL DVDKL 112
AtDSP
SEMSGVAKDEEKSDEYSQDMTQAMGAVLTYRHELGMNYNFIRPDLIVGSCLQTP EDVD KL120
+ 4 4 4 444 - 4 4 - 44 - 4-444 44444444 4444 44 444 444 44444 *4 44444
ZmDSP
RKIGVKTVFCLQQDSDLEYFGVDIRAIQDYSLQFKDIVHCRAEIRDFDAFDLRLRL PAVV 172
SbDSP
RKIGVKTVFCLQQDSDLEYFGVDIGAIQDYSLQFKDIMHCRAEIRDFDAFDLRLRL PAVV 172
AtDSP
RKIGVKTIFCLQQDPDLEYFGVDISSIQAYAKKYSDIQHIRCEIRDFDAFDLRMRLP AVV 180
Figure imgf000045_0001
ZmDSP
SKLHKLINCNGGVTYIHCTAGLGRAPAVALAYMFWILGYSLNEGHRLLQSKRACF PKLEA 232
SbDSP
SKLHKLVNCNGGVTYIHCTAGLGRAPAVALAYMFWILGYSLNEGHQLLQSKRAC FPKLEA 232
AtDSP
GTLYKAVKRNGGVTYVHCTAGMGRAPAVALTYMFWVQGYKLMEAHKLLMSK RSCFPKLDA 240
Figure imgf000045_0002
ZmDSP
IKLATADILTGLSKNTITLKWEADGSSSVEISGLDIGWGQRIPLTYDEEKGAWFLEK ELP 292
SbDSP
IKLAT ADILT GLSKNTITLKWEDDGS S S VEISGLDIGWGQRIPLTYDEERGA WFLEK
ELP 292
AtDSP
IRNATIDILTGLKRKTVTLTLKDKGFSRVEISGLDIGWGQRIPLTLDKGTGFWILKR ELP 300
Figure imgf000046_0001
ZmDSP
EGRYEYKYVVDGKWLCNEHELITKPNADGHVNNYVQVSRDGTSDEEKELRERLT GPDPDL 352
SbDSP
EGRYEYKYIVDGKWLCNEHEMLTKPNADGHVNNYVQVSRDGTSDEEKELRERL TGPDPVL 352
AtDSP EGQFEYKYIIDGEWTHNEAEPFIGPNKDGHTNNYAKVVDDPTS-VDGTTRERLSSEDPEL 359
Figure imgf000046_0002
ZmDSP TDQERLMIREYLEQYADAAER 373 (SEQ ID NO: 25)
SbDSP TDEERLMIREYLEQYADAGER 373 (SEQ ID NO: 26)
AtDSP LEEERSKLIQFLETCSEAEV- 379 (SEQ ID NO: 27)
Figure imgf000046_0003
Basándose en esta homología, fue posible identificar secuencias de genes (incluidas secuencias codificantes que no habían sido previamente anotadas en bases de datos públicas) que corresponden a las enzimas DSP de los genomas de las respectivas especies. Estas secuencias incluyen secuencias (codificantes)de ADNc de DSP supuestas de maíz (SEQ ID NO: 29), sorgo (SEQ ID NO: 30) y arroz (SeQ ID NO: 31), los genes correspondientes a partir de los cuales se transcriben los ARNm de DSP para DSP de maíz (SEQ ID NO: 32) y sorgo (SEQ ID NO: 33). Además, a partir de esta información, también se pueden inferir las secuencias de las regiones 5' no traducidas (UTR) y los promotores del gen DSP en maíz (SEQ ID NO: 34) y sorgo (SEQ ID NO: 35), así como las 3' UTR de los respectivos genes DSP en maíz (SEQ ID NO: 36) y sorgo (SeQ ID NO: 37). Los genes DSP de 5 kb y 6 kb se localizan en los cromosomas 1 de los genomas de sorgo y maíz, respectivamente. La estructura del gen DSP es muy similar tanto en maíz como en sorgo, conteniendo cada gen 14 exones de longitud idéntica y 13 intrones de tamaño ligeramente diferente. La alineación deducida de la secuencia de proteínas entre Arabidopsis, maíz y sorgo demuestran un 58,8 % de identidad, mientras que entre las proteínas SbDSP y ZmDSP hay una identidad de secuencia del 96,5 % a nivel de aminoácidos. La identidad de secuencia entre los exones compilados de los genes SbDSP y ZmDSP es del 95,5 %, mientras que cuando se incluyen los intrones, la identidad entre los dos genes se reduce al 65,3 %. Hay 50-60 % de identidad de secuencia en las regiones 5 '/3' UTR. Ambas proteínas SbDSP y ZmDSP contienen el dominio DSPc (fosfatasa de especificidad dual, dominio catalítico) en 130-227AA con el sitio activo en el resto C190.
Ejemplo 2. Supresión de la expresión, acumulación o actividad de las enzimas diana en plantas
Una vez que los genes que codifican cada una de las enzimas diana se han identificado en una especie dada, el siguiente objetivo era suprimir la expresión, acumulación o actividad de esa enzima en plantas.
Los genes diana se inhibieron usando una estrategia de interferencia con ARN. Un enfoque para la supresión génica a través de la interferencia con ARN era modificar una secuencia de microARN de origen natural de modo que sus secuencias de direccionamiento naturales se alteraren para que reconozcan una secuencia diana diferente y después expresar este microARN modificado de acuerdo con Wartmann et al. 2008.
Un ejemplo de microARN de origen natural de arroz se ilustra en la FIG. 3. Se introdujeron secuencias de nucleótidos de amiRNA1wmd3 de OsGWD (SEQ ID NO: 38) y osa-MIR809aM1 de OsGWD (Se Q ID NO: 39), como se muestran en la FIG. 3, que codifican microARN dirigidos a un ARN mensajero que codifica la proteína Gw D de arroz en un casete de expresión para la supresión de la expresión de una enzima diana.
Como alternativa, se suprimió la expresión de una enzima diana mediante la expresión de un ARN de horquilla diseñado adecuadamente (''ARNh'') que incluye copias invertidas de una secuencia de ARN que es homóloga a una porción del ARNm, la 5 'UTR, o la 3' UTR para una enzima diana, según Horiguchi 2004. Las secuencias homólogas al ARNm diana se denominan "secuencias iniciadoras". Las secuencias de ADN que codifican secuencias iniciadoras de ARN individuales que se usaron para crear ARNh incluyen OsDSP1 (SEQ ID NO: 40), OsDSP2 (SEQ ID NO: 41): OsGWD1 (SEQ ID NO: 42), OsGWD2 (SEQ ID NO: 43), OsPWD1 (SEQ ID NO: 44), OsPWD2 (SEQ ID NO: 45), SbGWD (SEQ ID NO: 46), SbGWD1 (SEQ ID NO: 47), SbGWD2 (SEQ ID NO: 48), ZmGWD1 (SEQ ID NO: 49) y ZmGWD2 (SEQ ID NO: 50).
La estrategia para expresar secuencias iniciadoras invertidas fue transcribirlas de manera que las copias invertidas estuvieran separadas por una secuencia espaciadora. Este espaciador en sí correspondía a un intrón. Intrones que se utilizaron incluyen el intrón de alcohol deshidrogenasa de Zea mays (ZmAdhli6; SEQ ID NO: 51), el intrón de alcohol deshidrogenasa de Oryza sativa (OsAdhli; SEQ ID NO: 52), el intrón de alcohol deshidrogenasa de Sorgo bico/or(SbAdh1-2i: SEQ ID NO: 53) y el intrón de glucano agua dicinasa de Sorgo bicolor(SbGWDi; SEQ ID NO: 54). En un casete de expresión, para dirigir la transcripción del microARN o ARNh, se unió una secuencia iniciadora al promotor de ubiquitina de Z. mays (ZmUbi1P; SEQ ID NO: 55), al promotor de fosfoenolpiruvato carboxilasa de Z. mays (ZmPepCP: SEQ ID NO: 56) o al promotor de ubiquitina de 0. sativa (OsUbi3P; s Eq ID NO: 57). Se usó na señal de poliadenilación (terminador NOS; SEQ ID NO: 58) terminador de la transcripción.
La FIG. 4 ilustra un casete de expresión único compuesto por un gen sintético que codifica uno de tales ARNh. Esta figura muestra el casete de expresión que incluye (1) un elemento promotor, (2) un conjunto de las secuencias iniciadoras (negro) colocadas en orientaciones opuestas de modo que el transcrito de ARN sea autocomplementario en estas regiones, (3) un intrón o un elemento espaciador y (4) un terminador de transcripción/señal de poliadenilación. Ejemplos de tales casetes de expresión incluyen SEQ ID n O: 59 [OsUbi3P: amiRNA1wmd3 de OsGWD], SEQ ID NO: 60 [OsUbi3P: osa-MIR809aM1 de OsGWD], SEQ ID NO: 61 [OsUbi3P: OsDSP1 hpRNA), SEQ ID NO: 62 [OsUbi3P:ARNh de OsDSP2], SEQ ID NO: 63 [OsUbi3P:ARNh de OsGWD1], SEQ ID NO: 64 [OsUbi3P: ARNh de OsGWD2], SEQ ID NO: 65 [OsUbi3:ARNh de OsPWD1], SEQ ID NO: 66 [OsUbi3:ARNh de OsPWD2], SEQ ID NO: 67 [OsUbi3P:ARNi de SbGWD], SEQ ID NO: 68 [ZmPepCP:ARNi de SbGWD1], SEQ ID NO: 69 [ZmPepCP:ARNi de SbGWD2], SEQ ID NO: 70 [ZmPepCP:ARNi de ZmGWD1] y SEQ ID NO: 71 [ZmPepCP:ARNi de ZmGWD2].
Puede unirse múltiples casetes para diferentes ARNh en una sola construcción para ser introducidos en plantas transgénicas de modo que dos ARNh se expresen simultáneamente. La FIG. 5 ilustra un ejemplo de tal una construcción. Esta figura muestra (1) el primer elemento promotor, (2) un primer conjunto de secuencias iniciadoras (negro) colocadas en orientaciones opuestas de modo que el transcrito de ARN será complementario en estas regiones, (3) un primer intrón o un elemento separador, (4) un primer terminador de transcripción/señal de poliadenilación, (5) un segundo elemento promotor; (6) un segundo conjunto de secuencias iniciadoras (negro), (7) un segundo intrón o un elemento espaciador y (8) un segundo terminador de transcripción/señal de poliadenilación.
Se proporcionan ejemplos de construcciones con múltiples casetes de expresión de ARNh como la SEQ ID NO: 72 [OsDSP1 y OsGWD2], SEQ ID NO: 73 [OsPWD2 y OsGWD 1] y SEQ ID NO: 74 [OsDSP2 y OsPWD1].
Ejemplo 3. Vectores
Pueden proporcionarse secuencias de cualquier gen relacionado con la regulación del almidón en un vector intermedio de ARNi, un vector de transformación, o en una planta transgénica en la presente memoria.
Vector pAL409 de ARNi
Un ejemplo de un vector intermedio de ARNi es pAL409, que se ilustra en la FIG. 2. Tal como se muestra en la FIG.
2, las copias invertidas de segmentos de una región transcrita de un gen a ser dirigido pueden introducirse en pAL409 en el sitio AvrII 220(posición 4507) y en el sitio BspEI 210(posición 4519) y nuevamente en el sitio Agel 295 (posición 566) y en el sitio NheI 290 (posición 620). Cuando se transcriben desde el promotor 230 de ubiquitina de arroz (P-OsUbi3), las copias invertidas de los segmentos (las secuencias iniciadoras) permiten que el ARN resultante forme una horquilla en la que el intrón 200 de OsUbi3 sirve como un espaciador entre los elementos repetidos. Una señal de poliadenilación 280 (3' NOS) sirve como terminador transcripcional. El casete de expresión completo (desde el promotor hasta el terminador) se puede extraer de este plásmido como un fragmento PacI-XmaI mediante digestión en el sitio PacI 240 (posición 3574) y en el sitio XmaI 270 (posición 911). pAL409 también incluye un ColEI, origen de replicación 260 de E. coli; y un marcador de resistencia a ampicilina bla 250. La secuencia de pAL409 se proporciona a continuación, pero la numeración y orientación de nucleótidos difiere de la representada en la FIG. 2. El experto en la materia será capaz de alinear la secuencia a continuación con el mapa vectorial de la FIG. 2 dados los puntos de referencia del vector. Se puede usar un vector de ARNi intermedio como pAL409 para introducir, copias invertidas en tándem de prácticamente cualquier secuencia iniciadora.
> secuencia de pAL409
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAG CTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAG CCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTAT GCGGC AT C AGAGC AGATT GT ACT GAGAGT GC ACC ATAT GCGGTGT GAAAT AC CGC AC AG AT GCGT AAGG AG A A A A T AC C GC AT C AGGC GCC ATT C GCC ATT C AG GCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCC AGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGG GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGGGCGGTTAA TTAACTAATCGACTCTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTAATTCGGCTT GTCGACCACCCAACCCCATATCGACAGAGGATGTGAAGAACAGGTAAATCAC GC AG AAG AAC C C AT CTCTG AT AGC AGCT ATCG ATT AG AAC AAC G AAT C C AT AT TGGGTCCGTGGGAAATACTTACTGCACAGGAAGGGGGCGATCTGACGAGGCC CCGCCACCGGCCTCGACCCGAGGCCGAGGCCGACGAAGCGCCGGCGAGTACG GCGCCGCGGCGGCCTCTGCCCGTGCCCTCTGCGCGTGGGAGGGAGAGGCCGC GGTGGTGGGGGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCAGCTGGTGCGGCGGCGCGGGGG TCAGCCGCCGAGCCGGCGGCGACGGAGGAGCAGGGCGGCGTGGACGCGAACT T CCG AT CGGTT GGT C AG AGT GC GCG AGTT GGGCTT AGCC A A TT AGGT CT C AAC AATCTATTGGGCCGTAAAATTCATGGGCCCTGGTTTGTCTAGGCCCAATATCC CGTTCATTTCAGCCCACAAATATTTCCCCAGAGGATTATTAAGGCCCACACGC AGCTTATAGCAGATCAAGTACGATGTTTCCTGATCGTTGGATCGGAAACGTAC GGT CTTG A T C AGGC A T GC CG ACTTCGT C A AAG AG AGGC GGC AT G ACCTG AC GC GGAGTTGGTTCCGGGCACCGTCTGGATGGTCGTACCGGGACCGGACACGTGTC GCGCCTCC AACTACAT GGAC ACGTGT GGT GCT GCC ATT GGGC CGT ACGCGTGG CGGTGACCGCACCGGATGCTGCCTCGCACCGCCTTGCCCACGCTTTATATAGA GAGGTTTTCTCTCCATTAATCGCATAGCGAGTCGAATCGACCGAAGGGGAGGG GGAGCGAGAGCTTTGCGTTCTCTAATCGCCTCGTCAAGCCTAGGTGTGTGTCC GGAGTCAAGGTAACTAATCAATCACCTCGTCCTAATCCTCGAATCTCTCGTGG T GC CC GT CT A A T CTCGC G ATTTT G AT GCTCGT GGT GG AAAGCGT AGG AGG AT C CCGTGCGAGTTAGTCTCAATCTCTCAGGGTTTCGTGCGATTTTAGGGTGATCCA C C TC TT A A T C G AGTT ACGGTTTCGT GC G ATTTT AGGGT A A T C CTCTT A A T CTCT CATTGATTTAGGGTTTCGTGAGAATCGAGGTAGGGATCTGTGTTATTTATATCG ATCTAATAGATGGATTGGTTTTGAGATTGTTCTGTCAGATGGGGATTGTTTCGA TATATTACCCTAATGATGTGTCAGATGGGGATTGTTTCGATATATTACCCTAAT GATGTGTCAGATGGGGATTGTTTCGATATATTACCCTAATGATGGATAATAAG AGT AGTT C AC AGTT AT GTTTT G AT C CT GCC AC AT AGTTT G AGTTTT GT G AT C AG ATTT AGTTTT ACTT ATTT GT GCTT AGTTCGG AT GGG ATT GTT CT G AT ATT GTTCC AATAGATGAATAGCTCGTTAGGTTAAAATCTTTAGGTTGAGTTAGGCGACACA TAGTTTATTTCCTCTGGATTTGGATTGGAATTGTGTTCTTAGTTTTTTTCCCCTG GATTTGGATTGGAATTGTGTGGAGCTGGGTTAGAGAATTACATCTGTATCGTG TACACCTACTTGAACTGTAGAGCTTGGGTTCTAAGGTCAATTTAATCTGTATTG TATCTGGCTCTTTGCCTAGTTGAACTGTAGTGCTGATGTTGTACTGTGTTTTTTT ACCCGTTTTATTTGCTTTACTCGTGCAAATCAAATCTGTCAGATGCTAGAACTA GGTGGCTTTATTCTGTGTTCTTACATAGATCTGTTGTCCTGTAGTTACTTATGTC AGTTTT GTT ATT AT CTG AAG AT ATTTTT GGTT GTT GCTTGTT G AT GT GGT GT G A GCT GT G AGC AGC GCTCTT AT G ATT A A T G ATGCT GT C C A A TT GT AGT GT AGT AT GATGTGATTGATATGTTCATCTATTTTGAGCTGACAGTACCGATATCGTAGGAT CTGGTGCCAACTTATTCTCCAGCTGCTTTTTTTTACCTATGTTAATTCCAATCCT TTCTTG C C TC TTC C AG G G ATC C AC C G G TC C G ATC G AG C TTAC TG AAAAAATTA ACATCTCTTG CTAAG CTG G G AG CG CTAG CTCCCCG AATTTCCCCG ATCGTTCA A A C A T T T GGC A A T A A A G T T T CTT A A G A T T G A A T C CT GTT GCC GGTCTT GCG A T G A T T A T C A T A T A A T T T CT GTT G A A TT ACG TT A AGC A T GT A A T A A T T A A C A T GT A A TG C A TG A C G TTA TTTA TG A G A TG G G TTTTTA TG A TTA G A G TC C C G C A A TTA TA C A T T T A A T ACGCG A T A G A A A A C A A A A T A T AGC GCGC A A A C T AG G A T A A A T T A T CGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAATTGGCGAGCTCGCCCGGG CG G G CG AAG CTTG G CG TAATCATG G TCATAG CTG TTTCCTG TG TG AAATTG TT ATCCGCTC A C A A TTC C A C A C A A C A T ACG AG CCG G AAG C A T A A A G T G TAAAG C CTGGGGT GCCT A A T GAGT GAGCT A A C T C AC A T T A A T T GCGTTGCGCT C A C T GC CCG CTTTCCAG TCG G G AAACCTG TCG TG CCAG CTG CATTAATG AATCG G CCAA CGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCAC TGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAA AGGCGGT A A T ACGGTT ATCC A C A G A A T CAG G G G ATAACG C A G G A A A G A A C A T G TG AG C AAAAG G C C AG C AAAAG G C C AG G AAC C G TAAAAAG G C C G C G TTG C TG G CG TTTTTCCATAG G CTCCG CCCCCCTG ACG AG CATCACAAAAATCG ACG CTC A AG TC AG AG G TG G C G AAAC C C G AC AG G AC TATAAAG ATAC C AG G C G TTTC C C CCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATAC CT GTC CGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTT CT C A T AG CT CACGCT GT AGGTATCTCAG TTCG G TG TAG G TCG TTCG CTCCAAG CTG G G CTG TG TG CACG A ACCCCCCG TTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTC CAACCCG G TAAG ACACG ACTTATCG CCACTG G CAG CAG CCACTG G TAACAG G A TTA G C AG AG C G AG G TAT GT AGGCGGT GCT AC AG AG TTC TT G AAG T GGTGGCC T A A C T ACGGCTAC AC T A G AAG G AC A G T A T T T G GTATCT GCGCT CT GCT GAAGC C AG TT ACCTTC G G A A A A A G A G TTG G T AG CT CTTG AT CC GGC A A A C A A A C C ACC G C TG G TAG C G G TG G TTTTTTTG TTTG C AAG C AG C AG ATTAC G C G C AG AAAAAA A G G A T CT C A A G A A G A TC C TTT G AT C TTTTCT ACGGGGT CT G AC GCT C AG T GG A ACG A A A A C T C AC GTT AA G G G A TTTT GGT C A T G A G A T T A T C A A A A A G G A T C T T C A C C T A G A T C C T T T T A A A T T A A A A A T G A A G T T T T A A A T C A A T C T A A A G T A T A T A TG AG TAAAC TTG G TC TG AC AG TTAC C AATG C TTAATC AG TG AG G C AC C TATC T CAG CG ATCTG TCTATTTCG TTCATCCATAG TTG CCTG ACTCCCCG TCG TG TAG A TAACTACG ATACG G G AG G G CTTACCATCTG G CCCCAG TG CTG CAATG ATACCG CGAGACCCACGCT CACCGGCT CC A G A T T T A T CAGC A A T A A A C C AGCCAGCCGG AAG G G CCG AG CG CAG AAG TG G TCCTG CAACTTTATCCG CCTCCATCCAG TCTA
TT AATT GTT GCCGGG AAGCT AG AGT AAGT AGTTCGC C AGTT AAT AGTTT GC GC
AACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATG
GCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCAT
GTT GT GC AAAAAAGC GGTT AGCTCCTT C GGT C CTCC G ATCGTT GT C AG AAGT A
AGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTA
Figure imgf000050_0001
CATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATA
CGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAA
ACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTT
CGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCA
GCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAAT
AAGGGC G AC AC GG AAAT GTT G AAT ACT C AT ACT CTTCCTTTTT C AAT ATT ATT G
AAGC ATTT AT C AGGGTT ATT GT CT C AT G AGCGG AT AC AT ATTT G AAT GT ATTT A
GAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCT
G ACGT CT AAG AAAC C ATT ATT AT C AT G AC ATT AACCT AT AAAAAT AGGCGT AT
CACGAGGCCCTTTCGTC [SEQ ID NO: 185]
Las realizaciones en la presente memoria proporcionan vectores de ARNi intermedios que se replican a elevadas copias en E. coli, tienen baja complejidad y varios sitios de restricción convenientes. pAL409 tiene estas características. Los vectores con tales características serían útiles para ensamblar casetes de expresión de ARNi que después pueden transferirse a un vector de transformación de Agrobacterium.
Vectores de transformación
Un vector de transformación ejemplar, pAG2004 se ilustra en la FIG. 6. pAG2004 [SEQ ID NO: 186]. pAG2004 incluye un intrón 300 de ubiquitina de arroz (intrón de OsUbi3), un promotor 330 de ubiquitina de arroz (P-OsUbi3), un sitio PacI 340 (posición 155), un sitio XmaI 370 (posición 214), una señal de poliadenilación 3' NOS 380 y un origen de replicación ColE1 360 deE. coli. pAG2004 también incluye un gen 390 de fosfomanosa isomerasa (PMI, por sus siglas en inglés), un RB 391, un st AT 392 y un aadA 393. pAG2004 o vectores similares pueden transferirse desde E. coli a Agrobacterium tumefaciens LBA4404 por transferencia por conjugación, durante la cual el plásmido se integrará en pSB1 (un plásmido Ti residente) mediante recombinación homóloga. El cultivo conjunto de la cepa de Agrobacteriumrecombinante resultante con células vegetales puede dar como resultado la transferencia del ADN derivado de pAG2004 al genoma de la planta. Las realizaciones en la presente memoria incluyen un vector de transformación que tiene cualquier secuencia iniciadora relacionada con dianas para la alteración del Almidón Verde. Las realizaciones en la presente memoria incluyen un vector de transformación que tiene un fragmento de pAL409 que incluye secuencias iniciadoras relacionadas con dianas para la alteración del Almidón Verde. Las realizaciones en la presente memoria incluyen un vector de transformación que tiene un fragmento PacI-XmaI de pAL409 que incluye secuencias iniciadoras relacionadas con dianas para la alteración del Almidón Verde en lugar del fragmento PacI-XmaI de pAG2004.
Los vectores de transformación de plantas se ensamblaron insertando los casetes de expresión o las construcciones descritas en la presente memoria, entre las secuencias de borde derecho e izquierdo de ADN-T de Agrobacterium de un plásmido adecuado tal como pAG2005 o pAG4003 descrito a continuación. Las siguientes son descripciones de varios pAG2005, pAG4003 y vectores plasmídicos recombinantes derivados que pueden usarse para generar plantas transgénicas a través de la transformación mediada por Agrobacterium:
pAG2005 (SEQ ID NO: 75) es un plásmido que porta un marcador de resistencia a la espectinomicina, un origen de replicación bacteriano, un borde derecho (RB, por sus siglas en inglés) del ADN-T de Agrobacterium y un borde izquierdo (LB, por sus siglas en inglés) del ADN-T de Agrobacterium. Entre el RB y el LB hay un sitio multiclonal (MCS, por sus siglas ne inglés) y un marcador seleccionable de planta compuesto por un promotor Ubi3 de arroz (OsUbi3P), la secuencia codificante de la fosfomanosa isomerasa y el terminador NOS; este plásmido también porta un promotor Ubi3 de arroz añadido (OsUbi3P) y un terminador NOS en el MCS, entre los que se pueden añadir secuencias codificantes adicionales, microARN o unidades de transcripción de ARNh.
pAG2107 es pAG2005 con un microARN amiRNA1wmd3 de OsGWD (SEQ ID NO: 38) entre el promotor de Ubi3 de arroz (OsUbi3P) y el terminador NOS.
pAG2108 es pAG2005 con un microARN osa-MIR809aM1 de OsGWD (SEQ ID NO: 39) entre el promotor Ubi3 de arroz (OsUbi3P) y el terminador NOS.
pAG2109 es pAG2005 con un casete-1 de silenciamiento de ARNh de OsDSP1 (SEQ ID NO: 40) entre el promotor Ubi3 de arroz (OsUbi3P) y el terminador NOS.
pAG2110 es pAG2005 con un casete-1 de silenciamiento de ARNh de OsGWD1 (SEQ ID NO: 42) entre el promotor Ubi3 de arroz (OsUbi3P) y el terminador NOS.
pAG2111 es pAG2005 con un casete-2 de silenciamiento de ARNh de OsGWD2 (SEQ ID NO: 43) entre el promotor Ubi3 de arroz (OsUbi3P) y el terminador NOS.
pAG2112 es pAG2005 con un casete-2 de silenciamiento de ARNh de OsPWD2 (SEQ ID NO: 45) entre el promotor Ubi3 de arroz (OsUbi3P) y el terminador NOS.
pAG2113 es pAG2005 con un casete-2 de silenciamiento de ARNh de OsDSP2 (SEQ ID NO: 41) entre el promotor Ubi3 de arroz (OsUbi3P) y el terminador NOS.
pAG2114 es pAG2005 con un casete-1 de silenciamiento de ARNh de OsPWD1 (SEQ ID NO: 44) entre el promotor Ubi3 de arroz (OsUbi3P) y el terminador NOS.
pAG2115 es pAG2111 con un casete-1 de silenciamiento de ARNh de OsDSP1 adicional; los casetes en tándem para la expresión de los ARNh de OsGWD2 y OsDSP1 se proporcionan como la SEQ ID NO: 72.
pAG2116 es pAG2110 con un casete-2 de silenciamiento de ARNh de OsPWD2 adicional; los casetes en tándem para la expresión de los ARNh de OsGWD 1 y OsPWD2 se proporcionan como la SEQ ID NO: 73.
pAG2117 es pAG2114 con un casete-2 de silenciamiento de ARNh de OsDSP2 adicional; los casetes en tándem para la expresión de los ARNh Ode sPWD1 y OsDSP2 se proporcionan como la SEQ ID NO: 74;
pAG4003 (SEQ ID NO: 76) es un plásmido que porta un marcador de resistencia a la espectinomicina, un origen de replicación bacteriano, un borde derecho (RB) del ADN-T de Agrobacterium y un borde izquierdo (LB) del ADN-T de Agrobacterium. Entre el RB y el LB hay un sitio multiclonal (MCS) y un marcador seleccionable de plantas compuesto por un promotor de ubiquitina de maíz (ZmUbi1P), la secuencia codificante de la fosfomanosa isomerasa y el terminador NOS.
pAG4101 es pAG4003 con un ARNi de SbGWD entre el promotor Ubi3 de arroz (OsUbi3P) y el terminador NOS (SEQ ID NO: 67).
pAG4102 es pAG4003 con un ARNi de ZmGWD 1 entre el promotor ZmPepC de maíz (ZmPepCP) y el terminador NOS (SEQ ID NO: 70).
pAG4103 es pAG4003 con un ARNi de ZmGWD2 entre el promotor ZmPepC de maíz y el terminador NOS (SEQ ID NO: 71).
pAG4104 es pAG4003 con un ARNi de SbGWD1 entre el promotor ZmPepC de maíz y el terminador NOS (SEQ ID NO: 68).
pAG4105 es pAG4003 con un ARNi de SbGWD2 entre el promotor ZmPepC de maíz y el terminador NOS (SEQ ID NO: 69).
Secuencias de las proteínas diana, genes, elementos de los casetes de expresión y vectores utilizados en la presente memoria se enumeran en la Tabla 1.
Tabla 1. Descripción de Secuencias.
Figure imgf000051_0001
continuación
Figure imgf000052_0001
continuación
Figure imgf000053_0001
continuación
Figure imgf000054_0001
continuación
Figure imgf000055_0001
continuación
Figure imgf000056_0001
continuación
Figure imgf000057_0001
continuación
Figure imgf000058_0001
continuación
Figure imgf000059_0001
continuación
Figure imgf000060_0001
continuación
Figure imgf000061_0001
Ejemplo 4. Construcciones de ARNi de arroz
Tres genes ejemplares que se dirigen a la interferencia de ARN en el arroz son GWD, DSP e ISA3. Las SEQ ID NOS: 173 [os06 g30310 del gen GWD] - 175 [os09 g29404 del gen ISA3] enumeran las secuencias para los genes GWD, DSP e ISA3 de arroz, respectivamente. Las SEQ ID NOS: 176 [secuencia codificante de GWD] - 178 [secuencia codificante de ISA3] enumeran las secuencias codificantes previstas para los genes GWD, DSP e ISA3, respectivamente. Las secuencias de los genes GWD, DSP e ISA3 son de la base de datos RiceGE: números de registro Os06 g30310 (GWD); Os03 g01750 (DSP); y Os09 g29404 (ISA3).
Basándose en las secuencias codificantes en las SEQ ID NO: 176 [secuencia codificante de GWD] - 178 [secuencia codificante de ISA3], se sintetizaron ADNc artificiales y proporcionaron un recurso para expresar las proteínas correspondientes en sistemas heterólogos (p. ej., E. coli o levaduras), lo que a su vez permitiría generar anticuerpos para su uso en el análisis de las plantas transgénicas deseadas.
Los ADN plasmídicos que portan las secuencias codificantes completas de las SEQ ID NOS: 176 [secuencia codificante de GWD] - 178 [secuencia codificante de ISA3] se usaron como plantillas en las reacciones de PCR para preparar secuencias iniciadoras para su uso en las construcciones de ARNi. Para el gen GWD, se prepararon dos secuencias iniciadoras separadas.
> Secuencia iniciadora GWD1 (una copia)
TAGCGCTAAGGAAGGGAGAGATATCCATCCGGATCCCGGAAGCCGAAT
CCATCCATCCATCCATCCCATACTGCCCTTACGATCGAGCTGTTTGATA
TTCGTGCAGATGAGCGGATTCTCCGCGGCAGCTGCTGCGGCCGAGCGC
TTGTCGGAAGGTTCACCCTGGATGCCAACTCCGAGCTTAAGGTGACATT
GAACCC AGC ACCGC AGGGTTCGGT GGT GGAGAT C AAT CT AGAGGC AAC
TAACACCAGCGGCTCCCTGATACTGCATTGGGGCGCCCTTCGCCCGGAT
AGAGGAGAATGGCTCCTACCAT [SEQ ID NO: 179]
> Secuencia iniciadora GWD2 (una copia)
AGC AG AT CT AGTT G ACC AAGC AAG AG AT AAT GG ATT ATT GGGT ATT AT
T GG AATTTTT GTTT GG ATT AGGTT C AT GGCT AC AAGGC AACT AAT AT GG
AAC AAGAACT AC AATGT GAAGCC ACGT GAGAT AAGC AAAGC AC AAGA
T AGGTTT AC AG AT G AT CTT G AG AAT AT GT AC AG AACTT ACCC AC AAT AT
C AGG AG ATCTT AAG AAT G AT AAT GTCTGCTGTT GGTCGGGG AGGT G AA
GGT G AT GTTGGT C A ACGC ATTCGT G AT GAGAT ATT AGT AATCC AGAGA
AAT AAT G ACT GC AAAGGT GG AAT G AT GG AGG AGT GGC ACC AG AA ACT
GC AC AAC AAT AC AAGC CC AG AT G AT GT AGT G ATCTGC C AGGCC CT ACT
T G ATT AT AT C AAG AGT G ATTTT G AT ATT GGT GTTT ACTGGG AC ACCTT G
AAAAAAG AT GGT AT A AC AAAAG AGC GTCT ATT G AGCT AT G AT C G AC CG
ATT C ATT C AG AGC C AAATTT C AGG AGT G AAC AG AAAG AT GGCTT ACT C
CGT G ACTT GGGC AATT AT AT G AG AAGC CT C AAG AT GG AGGGT ACCC
[SEQ ID NO: 180]
GWD1 deriva de una región cerca del extremo 5' de la secuencia codificante de GWD. La segunda secuencia iniciadora de GWD, GWD2 deriva de una región más cercana a la mitad de la secuencia codificante de GWD, que corresponde a una región de conservación de secuencia relativamente más alta entre los genes GWD de especies divergentes. Véase la FIG. 7, que ilustra una comparación entre GWD2, derivada del gen de la glucano agua dicinasa de arroz y del gen GWD del tomate (Solanum lycopersicon). Inesperadamente, El análisis BLAST [Zhang Z, Schwartz S, Wagner L y Miller W, A greedy algorithm for aligning DNA sequences (2000) J Comput Biol 2000; 7(1-2):203-14] de estas dos secuencias revela una extensa homología, a pesar de la distancia filogenética que separa estas dos especies (el arroz es una monocotiledónea, mientras que el tomate es una dicotiledónea). Esto sugiere que esta porción del gen GWD serviría como una diana ampliamente aplicable para la interferencia con ARN. En la FIG. 7, la Consulta (secuencia superior) es una porción de la secuencia iniciadora de GWD2 de arroz [SEQ ID NO: 181; y la Objeto (secuencia inferior) es la secuencia de ADNc de GWD de tomate [SEQ ID NO: 182]. Debido a la homología de secuencia en esta región, es posible que una construcción de ARNi dirigida contra esta región en el gen del arroz también pueda ser útil para suprimir la expresión de genes GWD homólogos en otras especies de plantas. Las realizaciones incluyen métodos, vectores y plantas transgénicas que incluyen secuencias para ARNi dirigidas a GWD.
También se seleccionaron porciones de los genes DSP e ISA3 del arroz para servir como secuencias iniciadoras.
> Secuencia iniciadora DSP1
CTCCAATCGTGGGATCCAGGTCCATGAGGCGGCCCTCGCCGCTCAATCT
GACGATGGTTCGTGGCGGGAGTCGCCGATCAAACACTGTCAAAACCGC
ATCCGGGGCGT CT ACTTCT AGCGCCGAGAGTGGCGC AGT GGAGGCGGG
CACGGAGAAATCCGATACGTACAGCACCAACATGACGCAAGCTATGGG
AGC AGT GTT G AC GT AT AG AC AT G AGCTT GG AAT G A ACT AC AATTT C AT
ACGCCCAGACTTGATCGTGGGCTCCTGCTTACAGAGCCCACTTGATGTT
GAT AAACTT AGGG AC ATT GGTGT AAAAAC AGT ATT CT GCCT GC AGC AA
GATCC AGACCTT GAATATTTT GGAGTT GAC ATCTGT GCC ATT [SEQ ID
NO: 1831
> Secuencia iniciadora ISA3
CTAGCGAATACACTGAACTGCAACCATCCTGTTGTCAAGGAGCTCATTC
TT GAC AGCTT G AG AC ACTGGGTT G AGG AGT AT C AC AT AG AT GG ATTT C
GATTT GACCTT GC AAGTGTTCTTTGTCGT GGACC AGAT GGTT GTCCT CTT
GAT GC AC CTC C ACTC AT C AAGG AAATT GCC AAAG AT GCT GT ATT AT CT A
GATGTAAGATCATTGCTGAACCTTGGGATTGCGGCGGCCTTTATCTCGT
AGGGCGTTTCCCTAACTGGGACAGGTGGGCTGAATGGAACGGCAAATA
C AG AG AT GAT CTTC G AAG ATTT ATT AAGGGT G ACCCTGGT AT G AAGGG
GGT GTTT GC G ACTCGT GT GT CT GG AT CTGCT GAT CTCT AT C AGGT G AAC
G AGC GG AAGCCTT ACC AT GGT GT AAATTTT GT G ATTGC AC AT GAT GG AT
TT ACTTT AT GT GACCTT GTTT CTT AC AACTT AA AGC AC A AT GAT GCT AAT
GGAGAAGGTGGCTGTGATGGATC [SEQ ID NO: 184]
Las secuencias iniciadoras GWD1, GWD2, DSP1 e ISA3 se amplificaron cada una por PCR de modo que cada una estaba flanqueada por sitios de reconocimiento de enzimas de restricción (p. ej., NheI y XmaI). Los fragmentos se unieron primero en pCRBlunt II TOPO (Invitrogen), confirmado mediante múltiples productos de digestión de enzimas de restricción y secuenciación, después se cortaron (usando enzimas de restricción que escinden los sitios flanqueantes introducidos) y se unieron primero a los sitios BspEI y AvrII y después a los sitios NheI y Agel de pAL409 (Figura 2), que colocaron las dos copias en orientaciones opuestas. Los casetes de ARNi resultantes se cortaron de los derivados de pAL409 como fragmentos PacI-XmaI y se unieron a pAG2004 (figura 6), dando como resultado los plásmidos pAG2100, pAG2102 e pAG2103. La FIG. 6 muestra casetes de ARNi dirigidos a genes GWD, DSP e ISA3 de arroz, donde los dos segmentos superiores derivan del gen GWD, el medio de DSP y el inferior de los genes ISA3. Cada uno de los elementos iniciadores se representa como copias invertidas duplicadas separadas y próximas al intrón de OsUbi3. A la izquierda se enumeran los nombres de las construcciones que se ensamblaron en el plásmido pAL409. A la derecha se enumeran los nombres de los plásmidos que resultaron cuando los casetes de ARNi se cortaron de pAL409 como fragmentos PacI-XmaI y se insertaron en pAG2004.
Todavía en referencia a la FIG. 6, la construcción pAL409-GWDko1 incluye el promotor 331 de P-OsUbi, secuencia iniciadora 310 de GWD1, intrón OsUbi 301, secuencia iniciadora 311 de GWD1 invertida y secuencia de poliadenilación 381 3' NOS. La construcción pAL409-GWDko2 incluye el promotor 332 de P-OsUbi, secuencia iniciadora 312 de GWD2, intrón OsUbi 302, secuencia iniciadora 313 de GWD2 invertida y secuencia de poliadenilación 382 3' NOS. La construcción pAL409-DSPko1 incluye el promotor 333 de P-OsUbi, secuencia iniciadora 314 de DSP1, intrón OsUbi 303, secuencia iniciadora 315 de DSP1 invertida y secuencia de poliadenilación 3833' NOS. La construcción pAL409-ISA3ko1 incluye el promotor 334 de P-OsUbi, secuencia iniciadora 316 de ISA3, intrón OsUbi 304, secuencia iniciadora 317 de ISA3 invertida y secuencia de poliadenilación 3843' NOS. El reemplazo del fragmento PacI-XmaI de pAG2004 con los fragmentos PacI-XmaI de las construcciones pAL409-GWDko1, pA-L409-GWDko2, pAL409-DSPko1 y pAL409-ISA3ko1 produjo los plásmidos pAG2100 [SEQ ID NO: 187], pAG2101 [SEQ ID NO: 188], pAG2102 [SEQ ID NO: 189] y pAG2103 [SEQ ID NO: 190], respectivamente.
Ejemplo 5. Construcción de ARNi de sorgo
Se obtuvo una propuesta de la secuencia genómica correspondiente al supuesto gen GWD de Sorghum bicolor [SEQ ID NO: 191] a través de la página de inicio del Joint Genome Institute (JGI) Sorghum bicolor (http://genome.jgi psf.org/Sorbil /Sorbil.home.html). De esta secuencia, se identificó una región que corresponde aproximadamente a la región GWD2 del gen del arroz [SEQ ID NO: 192]. En sorgo, las secuencias codificantes en esta región están interrumpidas por uno o más intrones, según lo identificado por el JGIy los intrones están en aproximadamente los nucleótidos 140-342, nucleótidos 507-628 y nucleótidos 723-795 en [Se Q ID NO: 192]. Se utilizó un intrón natural derivado del genoma del sorgo para ensamblar un casete de ARNi para reducir la expresión del gen GWD de sorgo. Se amplificó una porción del gen GWD de sorgo. La porción amplificada incluía un exón completo (basado en la predicción del JGI) en la región media altamente conservada (descrita anteriormente, véase la FiG. 7, el intrón adyacente y 10 bases del exón posterior (para conservar el límite 3' intrón/exón). Se incorporó un sitio Xmal cadena arriba del primer exóny se incorporaron sitios Agel y Nhel cadena abajo del segundo exón truncado durante la amplificación por PCR de este producto. Este producto (SbGWDko2a) se unió primero en pCRBluntlI TOPO (Invitrogen)y su composición se confirmó a través de múltiples productos de digestión de enzimas de restricción y secuenciación.> SbGWDko2a (con sitios de restricción flanqueantes)
GGTT C AAT AACC CGGG AGT G AG AT AAGC AA AGC AC AAG AT AGGTTT AC
AG AT G ATCTT G AG AAT AT GT AC AG AACTT ATCCT C AGT AC AG AG AG AT
ACT AAG AAT G AT AAT GGCTGCT GTT GGTCGT GG AGGT G AAGGT G AC GT
T GGT C AACGC ATTCGT G AT G AG AT ATT AGT AAT AC AGGT AAAACT G AT
GGTCCTT GGT G AAT AT AC AGTT ATTTTCGTT C ATT GCTCTGCT G AATT G A
GC AGTT GGT AGT GCT C ATCC AAA ACGT AG AC ATT GT C AAC AAT AAAAT
GTTT GGT GT GTT AC AG AG AAAT AC CGGT GC AAAGCT AGC AT G AT GG AA
GAATGG [SEQ ID NO: 193]
Un segundo producto de PCR (SbGWDko2b), que corresponde solo al primer exón mencionado anteriormente, también se amplificó por PCR con sitios flanqueantes Nhel y Xmal introducidos en los extremos 5' y 3' (en relación con la dirección de transcripción) y se unió a pCRBluntlI TOPO. La composición de este fragmento también se confirmó mediante múltiples productos de digestión de enzimas de restricción y secuenciación.
> SbGWDko2b (con sitios de restricción flanqueantes)
GGTT C A AT AAGCT AGC AGT G AG AT AAGC AAAGCAC AAG AT AGGTTT AC
AG AT G ATCTT G AG AAT AT GT ACAG AACTT ATCCT C AGT AC AG AG AG AT
ACT AAG AAT G AT AAT GGCTGCT GTT GGTCGT GG AGGT G AAGGT G AC GT
TGGTCAACGCATTCGTGATGAGATATTAGTAATACAGCCCGGGCTGAT
GGTCC [SEQ ID NO: 194]
A continuación, se cortó SbGWDko2b de pCRBlunt II como un fragmento Nhel-Xmal y se unió a los sitios Nhel y Agel del plásmido que portaba SbGWDko2a, colocando SbGWDko2b cadena abajo del intrón y en la orientación opuesta de SbGWDko2a. En esta orientación, las secuencias en la porción sbGWDko2b del plásmido se presentan como un complemento invertido de las secuencias dentro de la porción sbGWDko2a. Con referencia a la FIG. 8, todo este casete se cortó como un fragmento Xmal-Nhel y se unió a pAL409j, dando como resultado el plásmido pAL409j SbGWDko2 [SEQ ID NO: 218]. pAL409j porta un casete de ARNi dirigido al gen GWD de Sorghum bicolor. La secuencia iniciadora 510 (sbGWDko2a) se ilustra en la FIG. 8 cadena arriba del intrón 520 (sbGWDi), que se ilustra cadena arriba de la secuencia iniciadora 530 (sbGWDko2b). pAL409j difiere de pAL409 solo en que la unión entre el promotor de OsUbi3 y el intrón de OsUbi3i se ha modificado para reflejar su contexto nativo en el genoma del arroz. Como tales, esta orientación puede preservar las funciones potenciadoras de OsUbi3i con respecto al promotor de OsUbi3. Tal como se muestra en la FIG. 8, las dos secuencias iniciadoras invertidas, homólogas derivadas de un exón dentro del gen GWD de sorgo (GWDex) están separadas por un exón de GWD de sorgo natural (SbGWDi). Otros elementos se nombran como en la FIG. 2.
El casete completo de ARNi de pAL409j SbGWDko2 se cortó después como un fragmento Pacl-Xmal y se unió a los sitios Pacl y Xmal de pAG2004, produciendo el vector de transformación de Agrobacterium pAG2106 [SEQ ID NO: 195] de una manera similar a la descrita en referencia a la FIG. 6. Se usó una cepa de E. coli que portaba pAG2106 para la conjugación con Agrobacterium y la posterior transformación del sorgo.
Ejemplo 6. Secuenciación del o de los genes GWD de mijo
Se detectaron homólogos para GWD e ISA3 en el genoma de mijo y se estimó el número de homólogos presentes para cada uno utilizando una estrategia de transferencia Southern. Los resultados con la transferencia Southern usando la sonda de ISA3 de arroz se muestran en la FIG. 9. La FIG. 9 muestra la detección de homólogos de ISA3 mediante transferencia Southern. Se extrajo el ADN genómico de arroz, sorgo, maíz y mijo, se digirió con HindIII y se separó por electroforesis en gel de agarosa. Posteriormente, los ADN se transfirieron a membranas de nailon mediante transferencia capilar y las transferencias se sondearon con ADN marcado con DIG derivado del gen ISA3 de arroz clonado. Mientras que la sonda se hibridó a fragmentos únicos en arroz y sorgo, la misma sonda se hibridó a 3-5 fragmentos en los genomas de maíz y mijo. El control era ADN plasmídico que portaba la secuencia codificante de ISA3 de arroz; y el marcador era patrones de peso molecular de ADN. Se obtuvieron resultados similares cuando se usó el fragmento de GWD2 de arroz como sonda (no se muestra). Se determinó que, a diferencia del arroz y el sorgo, que contienen solo copias individuales de GWD e ISA3, el mijo contiene múltiples homólogos de cada uno de estos genes.
Se identificó una porción del gen GWD de mijo y se clonó utilizando un enfoque de PCR degenerada. La PCR degenerada emplea cebadores oligonucleotídicos con una o más bases ambiguas que permiten a los cebadores emparejarse con las secuencias plantilla para las cuales solo se dispone de información de secuencia aproximada. Es decir, en regiones de fuerte conservación de secuencia entre genes de especies ampliamente divergentes, se puede inferir el intervalo de posibles secuencias que podrían estar presentes en el gen correspondiente de una especie poco caracterizada tal como el mijo. Entonces se pueden diseñar cebadores degenerados que se emperajarán con las secuencias previstas, permitiendo la amplificación por PCR y la clonación de una porción del gen en cuestión.
Siguiendo la estrategia de PCR degenerada, se alinearon las porciones de los genes GWD derivados de arroz, sorgo, maíz y tomate. Las alineaciones más fuertes se produjeron en la región de los genes GWD que se describió en la FIG.
7. Se seleccionaron regiones cortas (~40 nt) cerca de los extremos de estas regiones de homología para realizar una comparación de secuencia más detallada (FIG. 10). La FIG. 10 ilustra la alineación de fragmentos de los genes GWD de arroz (OsGWD) [SEQ ID NO: 24 (arriba) y 28 (abajo)], sorgo (SbGWD) [SEQ ID NO: 25 (arriba) y 29 (abajo)], maíz (ZmGWD) [SEQ iD NO: 198 (arriba) y 202 (abajo)] y tomate (S1GWD) [SeQ ID NO: 199 (arriba) y 203 (abajo)]. Las posiciones de nucleótidos que se conservan en al menos dos de las cuatro secuencias están resaltadas en gris claro y subrayadas. Debajo de cada conjunto se presenta la secuencia de consenso para la cual se diseñaron los cebadores degenerados (dgGWDup2 y dgGWDdown2 [SEQ ID NO: 204 y 205, respectivamente]) para la amplificación por PCR. Téngase en cuenta que solo está disponible una secuencia parcial para el homólogo de maíz, con una región de secuencia desconocida representada por Ns. Las cuatro secuencias alineadas en el segmento superior corresponden a la porción de las secuencias codificantes de GWD que se pueden encontrar a partir de los nucleótidos 1803-1840 de la secuencia codificante de tomate (como se define en la FIG. 7), mientras que las alineaciones en el segmento inferior corresponden a los nucleótidos 2208-2249 de la secuencia del tomate. Las abreviaturas de nucleótidos para nucleótidos degenerados son las siguientes: Y, C o T; W, A o T; K, G o T; R, A o G, M, A o C; H, A o C o T; S, G o C; D, A o G o T. A partir de esta información, se diseñaron cebadores degenerados (dgGWDup2:5'-TGGAATTYTTGTWTGGATKAGRTTCATGGCTACMAGGCA-3' [SEQ ID NO: 204] y dgGWDdown2:5'GGYTCWGAATGRATMGSWCGRTCA TARCTCAADAGACGCTCT-3' [SEQ ID NO: 205]). El ADN genómico que se había aislado del sorgo se utilizó después como plantilla en las reacciones de PCR con estos cebadores. La PCR degenerada con ADN genómico de sorgo como plantilla dio lugar a un producto de PCR de aproximadamente 800 pb. La secuenciación de este producto de PCR reveló que este coincidía estrechamente con la secuencia prevista para el gen GWD de sorgo por la base de datos del JGI (véase anteriormente), lo que indicaba que los cebadores degenerados amplificarían de manera confiable un segmento del gen GWD.
Después se usaron los mismos cebadores en reacciones de PCR que usaron ADN genómico de mijo (ecotipo Alamo) como plantilla. Estas reacciones produjeron productos de PCR discretos de aproximadamente 1100 pb. Estos productos se unieron a pCRBluntlI TOPO y se secuenciaron cinco de los plásmidos resultantes. De estas cinco secuencias, se determinó que:
• Cada producto de PCR clonado deriva de un gen con una homología muy fuerte con el gen GWD de arroz
• Entre los cinco productos secuenciados, claramente había tres clases de secuencias (altamente homólogas), sugiriendo que los clones derivaron de tres homólogos diferentes de GWD dentro del genoma de mijo. Esta observación concuerda con los datos de las transferencias Southern que sugirieron que dentro del genoma de mijo residen múltiples genes GWD.
• Las principales diferencias en los tamaños de los productos que surgieron de la PCR degenerada de sorgo y mijo se pueden atribuir a diferencias en las longitudes de los supuestos intrones en cada uno de los respectivos genes.
Con referencia a la FIG. 11, se ilustra una comparación de la longitud relativa y el posicionamiento de los intrones dentro del segmento de homología central de los genes GWD de arroz, sorgo, Arabidopsis y mijo. Las cajas oscuras representan exones y las cajas claras representan intrones. Las secuencias de exones están muy bien conservadas y se reconocen fácilmente. Si bien las posiciones relativas de cada uno de los intrones también están bien conservadas entre especies, la longitud y secuencia de los intrones no está bien conservada. Las longitudes de los intrones y exones se indican en pb dentro de cada elemento.
Como se muestra a continuación, una alineación de las secuencias de tres de los productos de PCR degenerada derivados de mijo, demuestra que relativamente pocos cambios de un solo nucleótido y dos inserciones/deleciones algo más largas distinguen estos tres homólogos de GWD en esta región. Estos tres productos son PvGWD-2 [SEQ ID NO: 206], PvGWD-5 [SEQ ID NO: 207] y PvGWD-1 [SEQ ID NO: 208]
Alineación de secuencias múltiples con CLUSTAT 2.0.10
PvGW D-2 TGGAATTCTTGTTTGGATGAGATT CATGGCTACCAGGCAACTAACATGGAATAAGAACTA 60
PvGW D-5 TGGAATTCTTGTTTGGATTAGGTTCATGGCTACCAGGCAACTAACATGGAATAAGAACTA 60 PvGWD-1 TGGAATTTTTGTTTGGATGAGATTCATGGCTACAAGACAACTGACATGGAATAAGAACTA 60
PvGW D-2 TAATGTGAAGCCCCGGTATATACCTGTCTTTATCATTTACTTCAGTGATGTTTACTCTCT 120
PvGW D-5 TAATGTGAAGCCCCGGTATATACCTGTCTTTATCATTTACTTCAGTGATGTTTACTCTCT 120
PvGWD-1 TAATGTGAAGCCACGGTATATACCTGTCTTTATTATTTACTTCAGTAATGTTTACTCTCT 120
PvGW D-2 G CTTAAAAATTTAAAGAATCTGAAGCTGTCCTTTTCTTTTGTGCGGGAACATAATTGAGA 180
PvGW D-5 GCTTAAAAATTTAAAGAATCTGAAGCTGTCCTTTTCTTTTGTGCGGGAACATATTTGAGA 180 pv G W D-l GCTTTAAAAGTTAAAGAATCAGAAGTTGTCCCTTTCTTTTGTGCGGGAACATAATTGAAA 180
PvGW D-2 AATTGGTGTTTTTGCCACTACTTCATGATGCAATTGTAATTTTTCCCTCATTTTTTTCAA 240
PvGW D-5 A A TTGGTGTTTTTGCCACTACTTCATGATGCAATTGTAATTTTTCCCTCATTTTTTTCAA 240
PvGWD-1 AGTTGGTGTTCTT GCC ACTAC--------------------------------------------- 201
PvGW D-2 CTTTGTGATTTTGCCCTTTACTATTCACAAGTCAACGCAATTTTGCTCCTGTTTTGACCG 300
PvGW D-5 CTTTGTGATTTTGCCCTTTACTATTCACAAGTCAACGCAATTTTGCTCCTGTTTTGACCG 300
PvGWD-1 -------------------------------- AAGTCAACGCGATTTTACCCCT-CGTCAACGG 232
PvGW D-2 TTGACTGAG-GGAAAAATCGCGTTAACTTGTGAATAGTAAGTGCAAAATTGCAAAGTTGA 359
PvüW D -5 TTG A CTG A ü-G G A A A A A TC G C G TTA A C TTG TüA A TA G TA A G TG C A A A A TTüC A A A G TTG A 359 PvGWD-1 TCAAAACAGTAGCAAAATCGCGTTGACTTGTGAATAGTAAGGGCAAA-TCACAAAGTTGG 291
PvGW D-2 AAAAAACAAGGACAAAATCACAATTGCACTGCAAAGTAGGGGTGGAAACACAAATGCCCC 419 PvG W D -5 A A A A A A C A A G G A C A A A A T C A C A A T T G C A C T G C A A A G T A G G G G T G G A A A C A C A A A T G C C C C 41 < PvG W D -1 A A A A A A C A A G G A C A A A A T C A C A A T T G C A C T G C A A A G T A G T C G C G G A A A C A C A A A T G C C C C 351
PvG W D -2 A A A A T A A T T T G G C T G T T T G T C C T G A T A G A A A A C A A T A C A A T T C A G T A C T C A G A G A A T A T T 479 PvG W D -5 A A A A T A A T T T G G C T G T T T G T C C T G A T A G A A A A C A A T A C A A T T C A G T A C T A A G A G A A T A T T 479 PvG W D -1 A A A A T A A T T T G G C T G T T T G T C C T G A T A A A A A A C A A T A C A A T T C A G T A C T C A G A G A A T A T T 411
PvG W D -2 A T A T T T C T A T A A A T G A A A A A C A T A A C T C A T G T C A C A T T C T T T --------- G G C A T C T C A T 531 PvG W D -5 A T A T T T C T A T A A A T G A A A A A C A T A A C T C A T G T C A C A T T C T T T --------- G G C A T C T C A T 531 PvG W D -1 A T A T T T C T A T A A A T G A A A A A C A T A A C T C A T G T C G C A T T C T T T C A T T C T T T G G C A T C T C A T 471
PvG W D -2 A T C G A T C A A T A A C T A T G C A G T G A G A T A A G C A A A G C A C A A G A T A G G T T T A C A G A T G A T C T T 591 PvG W D -5 A T C G A T C A A T A A C T A T G C A G T G A G A T A A G C A A A G C A C A A G A T A G G T T T A C A G A T G A T C T T 591 PvG W D -1 A T T G A T T A A T A A C T A C G C A G T G A G A T A A G C A A A G C A C A A G A T A G G T T T A C A G A T G A T C T T 531
PvG W D -2 G A G A A C A T G T A C A A A G C T T A T C C T C A G T G C A G A G A G A T A T T A A G A A T G A T A A T G G C T G C T 651 PvG W D -5 G A G A A C A T G T A C A A A G C T T A T C C T C A G T G C A G A G A G A T A T T A A G A A T G A T A A T G G C T G C T 651 PvG W D -1 G A G A A C A T G T A C A A A G C T T A T C C T C A G T A C A G A G A G A T A T T A A G A A T G A T A A T G G C T G C T 591
PvG W D -2 G T T G G T C G T G G A G G T G A A G G T G A T G T T G G T C A A C G T A T T C G T G A T G A G A T A T T A G T A A T A 711 PvG W D -5 G T T G G T C G T G G A G G T G A A G G T G A T G T T G G T C A A C G T A T T C G A G A T G A G A T A T T A G T A A T A 711 PvG W D -1 G T T G G T C G T G G A G G T G A A G G T G A T G T T G G T C A A C G T A T T C G T G A T G A G A T A T T A G T A A T A 651
PvG W D -2 C A G G T A A A A T T A A T G G T C C T A G G T G A A T A T A C A C T T A C T T T T A T T C A T T G C T T C A C C G A A 771 PvG W D -5 C A G G T A A A A T T A A T G G T C C T A G G T G A A T A T A C A C T T A C T T T T A T T C A T T G C T T C A C T G A A 771 PvG W D -1 C A G G T A A A A T T A A T G G T C C T A G G T G A A T A T A C A C C T A C T T T T A T T C A T T G C T T C A C T G A A 711 PvG W D -2 T T A T A C G G T T G G T A G T T C T C A T C C A A A A G A T A G A C A T T G T G A A T A A T A A T A A A A T G C T T G 831
PvGW D-5 TT A TA C G G T T G G T A G T T C T C A T C C A A A A G A T A G A C A T T G T G A A T A A T A A T A A A A T G C T T G 831
PvGW D-1 T T A T A C G G T T G G T A G T T C T G A T C C A A A A G A T A G A C A T T G T G A A T A A T A A T A A A A T G C T T G 771
PvG W D -2 C T G C T T T A A T A G A G A A A T A A T G A C T G C A A A G G T G G A A T G A T G G A A G A A T G G C A C C A G A A A 891
PvGW D-5 C T G C T T T A A T A G A G A A A T A A T G A C T G C A A A G G T G G A A T G A T G G A A G A A T G G C A C C A G A A A 891
PvGW D-1 C TG C TT TTA T A G A G A A A T A A T G A C T G C A A A G G T G G A A T G A T G G A A G A A T G G CA C C A G A A A 831
PvG W D -2 TT G C A C A A C A A T A C A A G C C C A G A T G A TG TA G T G A T A T G CC A G G T A A T G G A T A T T T T G A A T 951
PvGW D-5 TT G C A C A A C A A T A C A A G C C C A G A T G A TG TA G T G A T A T G CC A G G T A A T G G A T A T T T T G A A T 951
PvGW D-1 T T G C A C A A C A A T A C A A G C C C A G A T G A T G T A G T G A T A T G C C A G G T A T T G G A T A T T T T G A A T 891
PvG W D -2 T C T T A A T A C A G T A A G T A T T T A A G C A T T G A G G T T T T C A T G G T T A T G T C T C T C C T T G G G C A G 1011
PvGW D-5 T C T T A A T A C A G T A A G T A T T T A A G C A T T G A G G T T T T C A T G G T T A T G T C T C T C C T T G G G C A G 1011
PvGW D-1 TC T T A A T A C T G T A A G T A T T T A A G C A T T G A G G T T T T T A T G G T T A T G T C T C T C C T T G G G C A G 951
PvG W D -2 G C A C T A A T T G A T T A T A T C A A G A G T G A T T T T G A T A T A A G T G T T T A C T G G G A C A C C T T G A A C 1071
PvGW D-5 G C A C T A A T T G A T T A T A T C A A G A G T G A T T T T G A T A T A A G T G T T T A C T G G G A C A C C T T G A A C 1071
PvGW D-1 G C A T T A A T T G A T T A T A T C A A G A G T G A T T T T G A T A T A A G T G T T T A C T G G G A C A C C T T G A A C 1011
PvG W D -2 A A A A A T G G C A T A A C C A A A G A G C G T CT C TT G A G C T A T G A T C G A G -C T A TC C A TT C A G A A C C 1130
PvGW D-5 A A A A A T G G C A T A A CC A A A G A G C G T CT A TT G A G TTA T G A CC G T C -C G A T C CA T TC C A G A C C 1130
PvGW D-1 A A A A A T G G C A T A A CC A A A G A G C G T C TT TTG A G C T A T G A T C G TTG C T AT CC A TT C A G A A C C 1071
Las secuencias de los exones de los genes GWD de mijo se infirieron de la información anterior. Las secuencias inferidas se usaron para (1) desarrollar una construcción de ARNi que se dirija a esta región central de uno o de la totalidad de los genes GWD de mijo y (2) determinar más de la secuencia genómica para cada uno de estos (al menos tres) homólogos de GWD en mijo.
Para desarrollar una construcción de ARNi, se usó PCR para amplificar porciones de dos de los exones abarcados en los productos de PCR degenerada descritos anteriormente. Estos dos productos se fusionaron después mediante SOE PCR (Horton RM, Hunt HD, Ho S.N., Pullen J.K., Pease L.R., Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension (1989) Gene 77(1 ):61 -8)). Los productos fusionados incluían una secuencia contigua que se esperaba que coincidiera más estrechamente con uno o más de los ARNm de GWD de mijo. Los sitios NheI y XmaI se incorporaron a los extremos del producto fusionado para permitir la posterior clonación en pAL409. La secuencia de este producto (llamada "PvGWDko2" junto con los sitios de restricción flanqueantes) se muestra a continuación.
> Secuencia iniciadora del ARNi de PvGWDko2
GGCT AGCG AGATAAGC AAAGC AC AAGAT AGGTTT AC AGAT GATCTT GA
G AAC AT GT AC AAAGCTT ATCCTC AGT AC AG AG AG AT ATT AAG AAT G AT
AAT GGCTGCT GTT GGTCGTGG AGGT G A AGGT G AT GTT GGT C AAC GT ATT
CGTGATGAGATATTAGTAATACAGGAGAAATAATGACTGCAAAGGTGG
AATGATGGAAGAATGGCACCAGAAATTGCACAACAATACAAGCCCAG
ATGATGTAGTGATATGCCCGGGAGG [SEQ ID NO: 209]
Se unió una copia de este elemento a los sitios AvrII y BspEI de pAL409, después, se unió una segunda copia en los sitios NheI y Agel del plásmido resultante, produciendo el casete pAL409 PvGWDko2 del ARNi, que tenía los elementos dispuestos en orientaciones opuestas, separados por el intrón de OsUbi3, como se describe en referencia a la FIG. 6. El casete del ARNi se cortó de este plásmido como un fragmento PacI-XmaI y se unió a los sitios PacI y XmaI de pAG2004 (FIG. 6). El vector de transformación de Agrobacterium resultante se denominó pAG2104 [SEQ ID NO: 210]. Se usó una cepa de E. coli que portaba este plásmido para la conjugación con Agrobacterium y la posterior transformación de mijo.
Al aprender las secuencias genómicas completas de cada uno de los genes GWD en mijo, puede ser posible la identificación de las secuencias potencialmente exclusivas (regiones 5 'y 3' no traducidas) que pueden flanquear a cada uno de estos genes. Con esta información, puede ser posible diseñar construcciones de ARNi que se dirijan específicamente a uno u otro de estos genes.
Para identificar más de las secuencias asociadas con cada uno de los homólogos de GWD, se siguió una estrategia que empleaba PCR inversa (iPCR) así como PCR degenerada. El ADN genómico de mijo se digirió con EcoRI, HindIII o Bgl II. Después se sometieron a autounión, se diluyeron aproximadamente 100 veces y se usaron como plantillas en reacciones de PCR inversa. Las secuencias de los primeros cebadores utilizados en las reacciones de iPCR se resumen en la Tabla 2.
Tabla 2. Secuencias de cebadores utilizados para PCR inversa
Figure imgf000069_0001
Las reacciones de PCR inversa con los cebadores PvGWDi-1 y PvGWDi-2 o con los cebadores PvGWDi-3 y PvGWDi-4 se llevaron a cabo utilizando las plantillas digeridas con EcoRI o HindIII (y autounidas). Estas reacciones dieron lugar a una pequeña cantidad de productos claros, que se purificaron a partir de geles de agarosa y se unieron a pCRBluntII-TOPO. El análisis de secuencia de los plásmidos resultantes permitió extender la secuencia conocida de los genes GWD de mijo tanto en los extremos 5 ' como 3' a un total de 3,4kb. De nuevo, las secuencias de clones individuales diferían en aproximadamente un 1-2 %, coherente con la idea de que los productos de PCR clonados derivaban de homólogos de GWD separados pero muy similares en el genoma de mijo. Este ejercicio se repitió con cebadores de nuevo diseño, incorporando tanto PCR inversa como PCR degenerada para extender aún más la secuencia conocida. Se identificaron aproximadamente 7 kb de secuencias de GWD de mijo.
Se proporciona una secuencia fusionada que representa las secuencias del gen GWD de mijo descubiertas en la presente memoria. La secuencia presentada no incluye todas las variaciones identificadas entre los homólogos. Por lo tanto, la secuencia podría verse como una quimera de estos homólogos. Esta secuencia abarca un segmento de aproximadamente 1-2 kb para el que no hay datos de secuencia. Este segmento se representa como una cadena de Ns. Con referencia a la FIG. 12, se ilustra una representación de matriz de puntos de alineaciones BLASTn entre las secuencias genómicas de mijo y arroz para los genes del glucano agua dicinasa. El eje horizontal representa la secuencia de mijo; y el eje vertical representa la secuencia de arroz. Los segmentos diagonales representan regiones donde las dos secuencias son altamente homólogas. Este diagrama muestra la similitud de la secuencia de mijo a continuación con la secuencia correspondiente del gen GWD de arroz.
> homólogos de GWD de mijo
GGAACGACAGTGTACAAGAACAGGGCTCTTCGGACGCCTTTTCTAAAG
GT C AG TCTT GTT AC ATT A T GG ATCTCTTT GTT AC C AC AG AAC AG T CT GG
TT AGC AG T A A T GT C C A T AACT GT GC AGTC AGG AGGT G A T AACTCC ACG
CTT AG A A T T G AG A T AG A T G ATC CT GC GGT GC AAG CT ATT G AA TTT CT C A
TCTTT G ATG AG AC AC AG AAC A A A T GGT AACC C AGCTGTTTT C GTT ACC A
T GT AGC ACT GTTT GTTT GTTT G A A T GC AAAA G G T A T A T A A A C T A T G CAA
AACTCTAC ATTG C ACAG G TTTAAAAATAATG G CC AG AATTTTC AAATTC
AGCTCCAATCGAGCCACCATCATGGTAGTGGCGCATCTGGTGCCTCATC
TTCTGCT ACTT CTGCCTT GGT GC C AG AGG AT CTTGT GCAGATCC AAG CT
T AC CT ACGGT GGG A A AG A A A T GG AAAG C AG T C A T AC AC AC CGG AGC A
AG AAAAG G AAAG CTTTTAG TTG TTTTTTTTTATCTTCAG TCTG G AAG G A
ACTCA ATGT ACT AAG TTG ATT AAAAATAAG AG G TG G TG T ATTTTTTCTC
C AGG AGG AG T A T G AAGCTGC AC G AGCT G AG TT A A T AG AAG A A T T A A A T
AG AGGTG TTTCTTTG GAGAAGCTTCGAG CTAAATTGACAAAAGCACCT
GAAGTGCCCGACTCAGATG AAAATGATTCTCCTG CATCTCAAATTACTG
TT G A T A A A A T T C C AG AGG AC CTTGT AC AA G T C C AGGCTT A T A T AAG G T G
GGAGAAAGCAGGCAAGCCAAACTATCCTCCTGAGAAGCAACTGG TAAT
GC A TT G A TT C A A T AGC GT A A A A T AC CTT GTTGGCTTT AC ACTTT A T GG A
GGTTCTT A T CT C AC A A T T C GCT AGGTCG AG TTT G AGG AAGC AAG G AAG
G AAC T GC AGGCT G AGGTGG AC AAGGG A A T CT CG A TT G AT C AG TT G AGG
AAG AAG ATTTTG AAAG G AAACATTG AG AG TAAAG TTTCG AAG CAG CTG
A A G A A T A A G A AG T ACTT CTCT GT AG AAAG G ATTC AGCGC A A A A A G AG A
G ATATCATG CAG ATTCTTAG TAAACATAAG CATACTG TCATAG AAG AG
CAAGCAGAGGTTGCACCAAAACAACTAACTGTTCTTGATCTCTTCACCA
A TT C A TT AC AG AAG G A T GGCTTTG AAG TT CT A AGC A A A A A A C T GTT C A
AG TTCG G TG ATAAACAGATCCTGGTTAGGATCCTTAAGATATTCTTTGT
ATCTCCAGATCTTTTTCTACCATGCTAATTAAGCTTCTCTCTTCTT AAGG
C A A T CTCC AC C A AGGTTCT A A A C A A A T C AA A A G TTT ACTTGGC AAC A A
A T C A T AC GG AGC C ACTT A T CCTT C ACTGGT C ACT AG CG A AAAAG G CTG
G AG AG T GG AAG G TT A A A T T T C A A A A T T GTTT C C AG T AG TT AAAGCC AC
AAACTCAG CAG CTTTTTTAAACACTG CTATCAG TACCAATG CG G TG TTA
TTT AACTG T GC AGGC ACCTCCTT C AA AC A T ATT GCC ATCTGGTT C A A A A
TT GTTAGAC AT GGC ATGC G AAAC TG AATTTAC TAAG T CT GAATTGGAT G
GTTTG CATTATCAG G TG G AAATAACATCTTCAACCTG TTATTTTATTCTT
ATTTTTATTAGCCCTCCTGCTATCTCAAGGCTCTTAATTTCCAGGTTGTT
GAGAT AGAGCTT G AT G AT GG AGGAT AT AAAGGG ATGC C ATT C GTT CTT CGGTCTGGTGAAATGTGGATAAAAAATAATGGCTCTGATTTTTACCTTG ATCTCAGCACCCGTGATACCAGAAATATTAAGGCAAGTGTTTCTGTCCA TTTT AC CTTT C AAACTTT AAACT ATT GT CTTT GTTTT GT CT AT GC AACT A GTCGCT AAATT GT GAAGT AACC GATCTGTTCTT AATT GAAGG AC ACT GG T G ATGCTGGT AAAGGT ACT GCT AAGGC ATT GCT GGAAAGAAT AGC AGA GCT GGAGGAAGAT GC CC AGC GAT CTCTT ATGC AC AGGT C AGGC ACT AA AAT ATCC AT AATAAT AT GACT G AATTTT AC AT GGAAAATT CTCCT AAAC T ACTTCT ACTCCTT GACAGATT CAAC ATT GC AGC AGAT CTAGTT GACC A AGC C AG AG AT GCT GG ACT ATT GGGT ATTGTT GG ACTTTTT GTTT GGATT AGATTCATGGCTACAAGACAACTGACATGGAATAAGAACTATAATGTG AAGCCACGGTATATACCTGTCTTTATTATTTACTTCAGTAATGTTTACTC TCTGCTTTAAAAGTTAAAGAATCAGAAGTTGTCCCTTTCTTTTGTGCGG GAAC ATAATT G AAAAGTT GGT GTT CTTGC C ACT AC AAGT C AACGCG ATT TTACCCCTCGTCAACGGTCAAAACAGTAGCAAAATCGCGTTGACTTGTG AAT AGT AAGGGC AAAT C AC AAAGTT GGAAAAAAC AAGGAC AAAAT C A CAATT GC ACT GCAAAGTAGTCGCGGAAACAC AAATGCCCC AAAAT AAT TTGGCTGTTT GTCCT GAT AAAAAAC AAT AC AATT C AGT ACT C AG AGAAT ATT AT ATTT CT AT AAAT GAAAAAC AT AACT C AT GT C GC ATT CTTT C ATT C TTT GGC AT CT C AT ATT GATT AAT AACT ACGC AGT GAGAT A AGC AAAGC A CAAGATAGGTTTACAGATGATCTTGAGAACATGTACAAAGCTTATCCTC AGT ACAGAGAGATATTAAGAAT GAT AAT GGCT GCT GTT GGT CGT GGAG GT GAAGGT GAT GTT GGT C AACGT ATTCGT GAT GAGAT ATT AGT AAT ACA GGT AAAATT AAT GGTCCT AGGT GAAT AT AC AC CT ACTTTT ATT C ATT GC TTC ACTGA ATT AT AC GGTT GGT AGTT CT GAT C C AAAAGAT AG AC ATT GT GAATAATAATAAAATGCTTGCTGCTTTTATAGAGAAATAATGACTGCA AAGGT GGAAT G ATGGAAGAAT GGC AC CAG AAATT GC AC AAC AAT ACA AGCCCAGATGATGTAGTGATATGCCAGGTATTGGATATTTTGAATTCTT AAT ACT GT AAGT ATTT AAGC ATT G AGGTTTTT AT GGTT AT GT CTCTCCTT GGGC AGGC ATT AATT G ATT AT AT C AAGAGT G ATTTTG AT AT AAGT GTTT ACTGGGACACCTTGAACAAAAATGGCATAACCAAAGAGCATCTCTTGA GCT AT GATCGT GC GATT C ATT CAG AAC C AAATTT CAG AAGT GAAC AGA AGGAGGGTTT ACTCC AT GACCT GGGT AATT AC AT GAGAAGC CT GAAGG T AT GT AAAAC ACTT AAT ATGGAT AT AAAAAAAGGC AT GC AAAAAAAT C T GT GC ATT ATCTTT GAAATT G AGT AT GGT ATTTT CT AAAGAAAAC AT AG AAAAACACATATTGCCCTTTCAGTTCCGGAAAAAAATGATCTGCCATA AAGAGCATACAGTCAACTCATGTATTAGCACTCGCCTTTTCTGCTAATG GTATGTTGTGTTGTGTTCTGTTCTATTCAATATATGCTTTCAGTAATAAT ATT CT AGT GTT GAC AAC ATC ATT GCT C AC AAC AT AC AGAAACTGT AGT A TGCCCGGTACAGTATGAACTTGTCCTTGAGTCTCCTCATTTTTTCCTTAT T C ACGT C AC AGCTTT AT AT CCTTCC AATGAAT AAT GAT C AACTT GGAAA T C ATT GGC AT CT AC AGT GAAC CGTCC ATT GT ATT CT GATTTT GAAC AAC TTTTTTTCCCCTCAGAACACACAGTAATAGCCAAGTATAACGACCTTAC
AT GGCCAAAACAAC AACCTT ACAT GGCC AAAATAGCC AGGTAAGGGAC AGAAGAAGAGAGAGGGTTGCCCTGCGGCAGATGTGGACAATGACTGAT GATGTGGCTGTCCCAGTTATCAAAACAGGCAAATCCACTGTTCATGTGG CCNAAGCCAGTAATGAGCTGGTTTTGGGAAACCCTGGGGGATTGAGTA AACAATTAGAGGGTTATGTGGATTTGGTCATAGTTGGGGGTAGGAATTT GGAAATTT CCCTTTTGCTT GAT A ATT ATGTT AGT C AAGAGATT AGAC AA GT ATT GTT AGGAGTTT GTTT C AGCT GGTT GAGATT GGATTT GGTTTCTT A GGTGATTGGTTAGTGCTACCCTTGCTCTATAATTGGGGATTTGCTTTTAA TAAAGAAAGCAGAAATAAACCCAATCCTTCTCCGGTTCTCCCTCTTTTG T CCGAT GTTTGCAGAT GCGGCC ACT GAT AAGGTCCAGGTCC ATGTCCT C CCATCAACCACACACACATACAGCCTAAGATCTAATTCACCCCAGGAC ACCCAAGCTCGTGAAAATATACCATGTCATCCCACTATTCATACTTTTT TTAAAAAAATCCCACTAATCCTGCAAATGTCCTAATATAAGAACAACA T C ATTTT C AGT C AT GTT GT ACCTTTT CTT GGT G ACAAAAAGAAGAC AT C C ATTT C AT CT CTTTTT AAGGGGC ATTTT CT C AT C GTTTCTGC AATT GAAT ATT CTTTCCCT GAT GT AAT CTTT GAAT GAATGCT ATT GT G ATTT GCTC AT TCTGTTAGGCTGTGCATTCTGGTGCTGATCTTGAGTCTGCTATAGCAAC TTGC AT GGG AT AC AAAT C GGAGGT AT C ATT CT C ATTCCTTTT C ATT C CG CT AG AATT CTTT AGAT AC CT GT GCTC AT AT CT AAT G AACT AACTTTT GG GTACAGGGTGAAGGTTTCATGGTCGGTGTTCAGATCAATCCAGTGAAG GGTTT GCC ATCTGGATTTCCT GT AAAAATCCCTC ACCTTCTTTT CT CAAC ACAT GT ACTTT CT AAGTTT CTT AT ACTT GT GAC ATTT AC CTTT AT AGG AA TTGCT C AAATTT GT GCTT G ACC AT GTT GAGG AC AAGT C AGC GGAACC AC TTCTTGAGGTCAGTGATATAATCGAAGTTCCTGTTTGTAATAAAACGAA GAGAAGAAGCT GGGTTTTT C AT C AC AACT C AAAT AAT C AG ATCTC AC AT AGCTGATT GAATTTTT AAAC C AC C ATTTTTT GC GGNT ACT AT GN GAAT C ACTTGTTGCTAACAAAATGCTACCTTGNAGGGGNNGGTGGAAGCTCNA GTTGAACTCCNCCCTNNNCTTCNTGNTTCACCNGNACGCATGAAAGAA NNT ATTTTTTT GGN C ATT GCNCCTGATT CNACTTTT AN G AC AGCTATN G AAAGGNCATATGANGAGCTCCNCCATGGANNCCCCGANGNTGGGCNCC CNAATATTGNCCCCATGATNNGNNXNANGNNNAGNNCCNNNANNNNN NNCNNNNNNNNNNTNNNNNANANNNNGNNTNNNNNANNNNNNNNNN NNGNNNNNNNNCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAN NNNNNNNNNNNNNANNNCCNNNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNAN NNNNNNNNNNNNNNNNNCNNNNNNAANNNNNNNNNATNCNNNNNNN
Figure imgf000073_0001
NGANNNNNNNNNNNNNNNNAGNNNTNNNANNNNNCNNNNNNNNNNG NNNTNNNNNNNNNNNNN GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTNNNN NNNNNNNNNNNNN GNNNNNNTNNNNNNNN GNNNNNNNN CNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNTNACNNNNNNNNNNNNNTCNCNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGCNTNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNANNNNNCNNNNNNNNNNCNNN NNNNNNNNNNTNNNNNNCNNNNNCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNOTsíTGNNNNNNCNNNNNNNNNNNNCANNNCNNNNG N AGAT CTCGGAG AGT GAACTT C AGC AAT C AAGTTCTC CGGAT GC AG AA GCT GGC C AT GC AGT ACC ATCT ATTT C ATT GGT C AAT AAGAAGTTT CTTG GAAAAT AT GC AAT AT C AGCT GAAGAATT CTCT G AGGAAAT GGTT AGT A AT AT AAAATTTT GCATTAGGAAATCT GCC ATTCGTAAGGAAGTCTT GAT GAAACCAATTGTTATTATGCTGGTTTCCTTTTCTTTTGGCCTTGTGCTTC
T AGT ACTC ACTTTT AT GTTTT C AGGTT GGGGCT AAGTCTC GG AAT AT AG
C AT ACCT C AAAGGAAAAGT ACCTTCGTGGGTT GGTGTCCC AAC AT C AGT
T GCGAT ACC ATTT GGC ACTTTT GAGAAGGTTTT ATC AGATGGGCTT AAT
AAGGTTGGTT GGTGGTTT ATTTT G AT GT AT AT ACTT G AAT AAT AG AACT
GC AT GGTTCTT GG AG AAGT C AG ATT CTTT AAC AT GTTT G AAAT AC ACT A
CT GGGAAGGT AAC AACGTGC AATTT AATGTCC ACC AAT ATCTAAAC AG
CC ATTTTTGGC ATT C A ATT C ACT AT AT ATTTT ATTT C AT G AGCCT GCTCT
AT AAGT AGCGT CTT C AGT AGTT GT AGCTC AT AGCTT C AT AGTCTC ATT C
T ACC AT GAACT AATTTTGCTAACTT AC AT CT ACT CTT GAAAT AAGT AAT
ACTT GT AT ATT ATT AT CTTT G ATT GT AAAAG AACTT C CCTT GCTCGTTT G
T C AAGGT GTCTTTT AG AC AGG AG ATGG AATT G ACT GTT AT C AAAGC AA
AT G AT AAC AAG AAAC CTCTT GTT G ATT GGTT G AGC AGTTT C AACT AAT C
C ATTTTTTTTTCTTTTT GGC AT GT G AT CTTT GT ATT ATT GGCC C AAAT G A
AATTCT ATTT CTCC C ATT AAC C ACC C AC AAT GGC AGGTTT GGGT AC AT A
T AGGCC AACC AT GGGT AGGT GGCTT A AAAGTT G AGT AAAGC AT AATT G
GGG AT AAGGT GC AC AT AGGC ACGG AC C AC CC AC AG AC AAAGT GCTTGC
AGGC ACT ACT AAT AC ATT ATT CT AT C ACC AT C AGG ATT C AATT CT AAC A
T GT ACTGTTT CTTCTTTTTCTTCTTT GT AC AGTT C CTGT AT AG ACC CTTTT
GT AC AGTTTCCT AAC AAATGAAAAAGATC AGTAGGAGACCCTCTT CTCC
TGTTCCACAAAAAATGTTAAAATGGTCTTTCTAATATTTGATTGTTCTTT
CTTTTATGGCAGGAAGAGCGCAAAACATAGAAAAGCTT [SEQ ID NO:
215]
Ejemplo 7. Clonación de casetes de silenciamiento ZmGWDI RNAi y ZmGWD2RNAi
Las repeticiones invertidas específicas de gen dentro de los casetes de silenciamiento ZmGWDI y ZmGWD2 en los vectores iniciales pAG4102 y pAG4103 se seleccionaron en dos regiones independientes del ADNc de ZmGWD de maíz (GDB de maíz, número de registro GRMZM2G412611). La secuencia de repetición de ZmGWD1 de 497 pb, que se usó en la construcción del vector pAG4102, corresponde a la posición 389-885 nt en el extremo 5' del ADNc de GWD de maíz previsto. La ZmGWD1 tiene dos faltas de coincidencia de nucleótidos (posiciones 449 y 483) en comparación con el ADNc de ZmGWD, que derivan del ensamblaje de la etiqueta de secuencia expresada (EST) TC458260 (The Gene Index Database) que representa la secuencia expresada GWD de maíz. ZmGWD1 (SEQ ID NO: 49)
TCCTCCCGTC CAGAAAACCT GAT GGAACGA CAGTGTACAA
GAACAGGGCTCTCAGGACAC 60
CTTTTGTAAA GTCAGGTGAT AACTCCACTC TAAGGATTGA GATAGATGAT
CCTGGGGTGC 120
ACGCCATTGA GTTCCTCATC TTTGACGAGA CACAGAACAA ATGGTTTAAA
AACAATGGCC 180
AGAATTTTCA GGTTCAGTTC CAGTCGAGCC GCCATCAGGG TACTGGTGCA
TCTGGTGCCT 240
CCTCTTCTGC TACTTCTACC TTGGTGCCAG AGGATCTTGT GCAGATCCAA
GCTTACCTTC 300
GGTGGGAAAG AAGGGGAAAG C AGT C AT ACA CACCAGAGCA
AGAAAAGGAG GAGTATGAAG 360
CTGCACGAGC TGAGTTAATA GAGGAAGTAA ACAGAGGTGT TTCTTTAGAG AAGCTTCGAG 420
CTAAATTGAC AAAAGCACCT GAAGCACCCG AGTCGGATGA AAGTAAATCT TCTGCATCTC 480
GAGTGCCCAT CGGTAAA 497
La secuencia de repetición de ZmGWD2 de 540 pb, que se usó en la construcción del vector pAG4103, corresponde a la posición 2986-3525 nt del ADNc de GWD de maíz previsto. La secuencia ZmGWD2 se extiende sobre un triplete de nucleótidos que codifica Hys1072 que se ha propuesto que es un resto de aminoácido crucial en la actividad de fosforilación de la proteína g Wd (Mikkelsen, 2004). ZmGWD2 (SEQ ID NO: 50)
CTTCTGAACC GATTTGATCC TGTTTTAAGG AATGTTGCTC ACCTCGGAAG
TTGGCAGGTT 60
ATAAGCCCGG TTGAAGTATC AGGTTATGTG GTTGTGGTTG ATGAGTTACT
TGCTGTCCAG 120
AACAAATCTT ATGATAAACC AACCATCCTT GTGGCAAAGA GTGTCAAGGG AGAGGAAGAA 180
AT AC C AG AT G GAGTAGTTGG TGTAATTACA CCTGATATGC CAGATGTTCT
GTCTCATGTG 240
TCAGTCCGAG CAAGGAATAG CAAGGTACTG TTTGCGACCT GTTTTGACCA
CACCACTCTA 300
TCTGAACTTG AAGGATATGA TCAGAAACTG TTTTCCTTCA AGCCTACTTC
TGCAGATATA 360
ACCTATAGGG AGATCACAGA GAGTGAACTT CAGCAATCAA GTTCTCCAAA TGCAGAAGTT 420
GGCCATGCAG TACCATCTAT TTCATTGGCC AAGAAGAAAT TTCTTGGAAA
ATATGCAATA 480
TCAGCCGAAG AATTCTCTGA GGAAATGGTT GGGGCCAAGT CTCGGAATAT
AGCATACCTC 540
Antes de la construcción de los vectores pAG4102 y pAG4103, ambas secuencias ZmGWDI y ZmGWD2 se verificaron para determinar posibles sitios de empalme de intrones con solo uno de esos sitios identificado en ZmGWD1 (AAAGGAGGAGT: SEQ ID NO: 152). Esta secuencia se dejó intacta para la construcción del vector pAG4102.
La región espaciadora ZmAdhli6 en los casetes de silenciamiento ZmGWD1RNAi y ZmGWD2RNAi (vectores correspondientes pAG4102 y pAG4103) representa la secuencia de 342 pb del intrón 6 previsto del gen Adh1 de maíz (Número de registro de Gene Bank X04049). Esta secuencia intrónica se clonó en casetes de silenciamiento con su gen natural que codifica secuencias flanqueantes que consisten en 11 pb en el extremo 5' o 10 pb en el extremo 3' del intrón. Las secuencias flanqueantes se incluyeron para asegurar un empalme de intrones postranscripcional eficaz. Las secuencias de flanqueo se muestran en mayúsculas en ZmAdhli6.
ZmAdh1i6 (SEQ ID NO: 51)
ATTCGAAGAA Ggtacagtac acacacatgt atatatgtat gatgtatccc ttcgatcgaa 60
ggcatgcctt ggtataatca ctgagtagtc attttattac tttgttttga caagtcagta 120
gttcatccat ttgtcccatt ttttcagctt ggaagtttgg ttgcactggc acttggtcta 180
ataactgagt agtcatttta ttacgttgtt tcgacaagtc agtagctcat ccatctgtcc 240
cattttttca gctaggaagt ttggttgcac tggccttgga ctaataactg attagtcatt 300
ttattacatt gtttcgacaa gtcagtagct catccatctg tcccattttt cagCTAGGAA 360
GTT 363
Las partes de los casetes de silenciamiento ZmGWD1 RNAi y ZmGWD2RNAi que contienen repeticiones invertidas con la secuencia espaciadora ZmAdhli6, se sintetizaron como fragmentos BamHI-AvrII por el GenScript CRO. Los fragmentos sintetizados se clonaron entre el promotor PepC de maíz y las secuencias terminadoras del gen de nopalina sintasa (NOS) de Agrobacterium tumefaciens para producir los vectores de silenciamiento pAG4102 y pAG4103.
Ambos casetes ZmGWD1 RNAi y ZmGWD2RNAi se usaron posteriormente para generar vectores apilados más complejos mediante la clonación de casetes de silenciamiento en regiones del ADN-T de los vectores que ya tenían varios casetes de expresión para la producción de las enzimas que degradan la pared celular (CWDE).
Ejemplo 8. Generación de plantas transgénicas
Se utilizaron cepas de E. coli que portan pAG2104, pAG2105, pAG2100, pAG2101, pAG2102, pAG2103, pAG2104, pAG2106, pAG4003, pAG4102, pAG4103 o vectores de transformación basados en plásmidos que portan las construcciones 2379, 2380, 4106, 4107, 4108, 4109, 4110, 4111,4112, 4113, 4114, 4115, 4116, 4117, 4120, 4121, 4124, 4125, 4514 o 4515 para la conjugación con Agrobacterium y posterior transformación del arroz, maíz, sorgo y mijo.
Ejemplo 9. Supresión de ARNm de genes implicados en la movilización del almidón vegetativoh
Para determinar si los vectores de ARNi descritos anteriormente estaban ejerciendo un efecto sobre los ARNm dirigidos en plantas transgénicas, se aisló el ARN de varias plantas de control y transgénicas y se utilizó PCR de transcriptasa inversa en tiempo real (RT-PCR en tiempo real, también conocida como PCR cuantitativa en tiempo real, RT-qPCR) para medir la abundancia relativa de especies de ARNm (FIG. 13, 14 y 15). Estos resultados confirmaron que el ARNi puede usarse para reducir el nivel de ARNm naturales en el arroz transgénico.
Con referencia a las FIG. 13, 14 y 15, estas figuras ilustran que los vectores de ARNi suprimen la acumulación de ARNm dirigidos en el arroz transgénico. Se empleó RT-PCR en tiempo real para medir la abundancia de diferentes especies de ARNm en relación con la de los genes de referencia ("genes constitutivos" que se expresan nominalmente de forma constitutiva en el arroz). En varias de las líneas transgénicas, se encontró que los niveles de los ARNm dirigidos estaban muy por debajo de los observados entre las plantas de control. FIG. 13, niveles de ARNm de GWD entre plantas que portan pAG2100 o pAG2101 debilitados y controles de tipo silvestre (TS); FIG. 14, niveles de ARNm de DSP entre plantas que portan pAG2102 y controles de TS; FIG. 15, niveles de ARNm de ISA3 entre plantas que portan pAG2103 y controles de t S.
La eficacia del silenciamiento del gen GWD en plantas de maíz transgénicas transformadas con las construcciones de silenciamiento pAG4102 o pAG4103 se evaluó de manera similar mediante RT-qPCR. El material de la hoja verde de las plantas de maíz transgénicas y no transformadas se muestreó al anochecer, cuando se observan los niveles de expresión más altos del gen GWD en monocotiledóneas (datos no publicados de Agrivida). El material foliar recogido se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y se transfirió a un congelador a -80 °C para el almacenamiento antes del aislamiento del ARN. El aislamiento de ARN total se realizó a partir de 0,1 - 0,2 g de los tejidos de la hoja de maíz congelados usando reactivo TRIZol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante con modificaciones menores. Para eliminar cualquier cantidad residual del ADN genómico del maíz en las preparaciones de ARN, posteriormente, se digirieron 10 microgramos del ARN total que se extrajo con TRIZol de cada muestra con DNasa usando el kit sin ADN TURBO (Applied Biosystems/Ambion). Las muestras de ARN tratadas con DNasa se purificaron adicionalmente con el kit de limpieza RNeasy MinElute (QIAGEN) y 1 microgramo del ARN purificado se sometió a síntesis de ADNc usando la transcriptasa inversa iScript (Bio-Rad) como se describe en el protocolo proporcionado por el fabricante. Todas las muestras de ADNc se diluyeron 1:50 con agua sin nucleasas. Un microlitro de la muestra de ADNc diluida (equivalente a 1 ng del ARN total que se utilizó para la síntesis del ADNc) se sometió al ensayo de qPCR con iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) como se especifica en el protocolo suministrado. La expresión del gen GWD en las plantas que se evaluaron se normalizó frente a la expresión de dos genes de referencia internos de maíz, tales como beta-Actina (Número de registro de GenBank U60508) y gliceraldehído-3-fosfatodeshidrogenasa (GADPH, Número de registro de GenBank X07156.1). Los cebadores utilizados en el análisis RT-qPCR se diseñaron con el software Primer3 que está disponible en línea. Los cebadores de PCR se enumeran en la Tabla 3:
Tabla 3. Lista de los cebadores utilizados en RT-qPCR para el análisis de la expresión de GWD de maíz
Figure imgf000077_0001
Todos los cebadores de PCR para ensayos de expresión de GWD se habían validado previamente mediante RT-PCR regular seguida de electroforesis en gel de agarosa para verificar la especificidad de los cebadores. Además, los cebadores seleccionados se validaron mediante los análisis de Calibración de Curva Patrón y Punto de Fusión para garantizar resultados de amplificación reproducibles. Las reacciones de amplificación por PCR en tiempo real se realizaron en un volumen de 12,5 microlitros en placas de 96 pocillos en un instrumento CFX-96 (Bio-Rad). Se ejecutó un ADNc de control que representa la planta no transformada número 37 (línea AxB de maíz de tipo silvestre) con cada placa experimental para asegurar la disponibilidad de una referencia cruzada entre diferentes ejecuciones de qPCR. También se incluyó un control sin plantilla (NTC, por sus siglas en inglés) con cada ejecución para cada gen. Cada muestra experimental se ejecutó por triplicado. El perfil térmico de la reacción de PCR fue de 95 °C durante 3 minutos de activación y desnaturalización, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 10 segundos, 55 °C durante 20 segundos y 72 °C durante 30 segundos. El software CFX Manager (Versión 2.1) calculó automáticamente el valor del ciclo de cuantificación (Cq) para cada reacción. La expresión observada del gen GWD en la planta de control no transformada número 37 se ajustó a "1" y la expresión de GWD en cada planta transgénica analizada se comparó con este valor para generar datos relativos de expresión génica.
Resultados del análisis de expresión de GWD en maíz transgénico
Los casetes de silenciamiento ZmGWD1 RNAi y ZmGWD2RNAi proporcionaron niveles significativos de supresión de la expresión del gen GWD alcanzando una reducción de nivel de transcripción de más de 13 veces en plantas transgénicas individuales, en comparación con la planta de maíz no transformada número 37. La expresión del gen GWD no se suprimió en una sola planta (4102.64) entre todas las plantas transgénicas analizadas. La eficacia de silenciamiento de GWD observada fue del 95,8-100%, con una reducción del nivel de transcripción de más de 3 veces en cada planta transgénica analizada en relación con el nivel de GWD en maíz no transformado (Tabla 4 y FIG. 16).
Tabla 4. Eficacia del silenciamiento de GWD en maíz transgénico por los casetes ZmGWDI RNAi y ZmGWD2RNAi
Figure imgf000078_0001
Ejemplo 10. Las plantas modificadas acumulan niveles elevados de almidón y de glucosa total más altos
Se recogieron tejidos de plantas de control, así como plantas de arroz y mijo que portan copias integradas de los transgenes de ARNi descritos anteriormente. Estos tejidos se secaron después y se molieron hasta obtener un polvo fino. El contenido de almidón de estos tejidos se determinó después por métodos convencionales (Smith AM y Zeeman SC, Quantification of starch in plant tissues (2006) Nat. Protocols 1:1342-1345). Con referencia a la FIG. 17, se muestra almidón elevado entre líneas seleccionadas de arroz y mijo para aquellas líneas que portan construcciones de ARNi. Los resultados de Nipponbarre y Alamo (líneas de control no transformadas para arroz y mijo, respectivamente) representan los promedios de varias plantas diferentes. Otros resultados representan datos duplicados de 2-3 veces de plantas transgénicas individuales. Las plantas transgénicas se identifican de acuerdo con el gen de movilización de almidón dirigido. las plantas OsGWD-1 portan el vector de ARNi pAG2100; Las plantas OsGWD-2 portan pAG2101; Las plantas OsDSP portan pAG2102; las plantas OsISA3 portan pAG2103; las plantas PvGWD portan pAG2104, un vector de expresión de ARNi que se dirige específicamente a transcritos de GWD de mijo que se asemejan a las secuencias descritas anteriormente (véase la FIG. 12). Como se muestra en la FIG. 17, se identificaron varias líneas transgénicas de arroz y mijo que acumulan almidón por encima de los niveles observados entre las plantas de control. En estos ejemplos, el almidón se acumuló a niveles tan altos como un 6 % entre las líneas de arroz transgénico, mientras que solo se acumuló hasta aproximadamente un 3 % en la mayor de las líneas de control. En mijo, la línea más alta de Alamo acumuló aproximadamente un 2 % de almidón, mientras que la línea transgénica más alta acumuló aproximadamente un 3,5 % de almidón en peso seco.
Con referencia a la FIG. 18, se encontró que el contenido de almidón en varias plantas de arroz aproximadamente 5 semanas mayor que las representadas en la FIG. 17 era 2 a 3 veces mayor que la observada en plantas más jóvenes. La FIG. 18 ilustra el contenido de almidón en líneas de arroz transgénico, recolectado aproximadamente 19 semanas después de la siembra. La nomenclatura de las plantas es como en la FIG. 17. Entre estas, una línea que expresa un ARNi que se dirige a GWD acumuló almidón a ~16 % de peso seco, mientras que las líneas de control no acumularon más de ~8 % de almidón.
Para generar plantas transgénicas adicionales que expresen los microARN o ARNh descritos anteriormente, se introdujeron construcciones en los vectores plasmídicos para la transformación de plantas mediada porAgrobacterium pAG2005 (SEQ ID NO: 75) y pAG4003 (SEQ ID NO: 76).
Se generaron plantas de arroz transgénicas y se cultivaron en invernaderos hasta la madurez, después de lo cual se cosecharon semillas y paja seca. El contenido de almidón de plantas individuales se midió mediante un ensayo de almidón total (Megazyme, Rebuznar, Condado de Wicklow, Irlanda). La FIG. 19 ilustra el contenido de almidón que se observó entre varios individuos de poblaciones que portaban cada una de las 11 construcciones diferentes, en donde las construcciones corresponden a las SEQ ID de la siguiente manera: 2107 (SEQ ID NO: 59), 2108 (SEQ ID NO: 60), 2109 (SEQ ID NO: 61), 2110 (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 63), 2111 (SEQ ID NO: 64), 2112 (SEQ ID NO: 66), 2113 (SEQ ID NO: 62), 2114 (SEQ ID NO: 65), 2115 (SEQ ID NO: 72), 2116 (SEQ ID NO: 73) y 2117 (SEQ ID NO: 74). Estos resultados indican que la supresión de la expresión de enzimas, tal como GWD, PWD y DSP, que participan en la renovación del almidón transitorio produce que las plantas acumulen almidón y que este almidón pueda persistir en la biomasa después de la senescencia.
Se recogieron muestras molidas de la paja de cada una de varias plantas transgénicas producidas a partir de pAG2110, pAG2115 y pAG2116 que acumulan > 8 % (> 80 mg/g) de almidón y estas se agruparon para preparar una "mezcla transgénica". Esta mezcla transgénica tenía un contenido de almidón total promedio de aproximadamente un 9,2 % (92 mg de almidón por gramo de peso seco). De manera similar, se agruparon muestras de paja de plantas de Nipponbarre para preparar una "mezcla de control NB" que tenía un contenido de almidón aproximado del 0,8% (8 mg de almidón por gramo de peso seco). Después se tomaron muestras de estas mezclas y se usó la hidrólisis ácida total para examinar su composición total de carbohidratos para determinar si la acumulación de almidón afectaba el contenido general de carbohidratos. Aproximadamente 0,20 g de tejido molido de cada mezcla se trató con ácido sulfúrico al 72 % a 30 °C durante 1 hora. El ácido se diluyó después al 4 % de concentración y las muestras se esterilizaron en autoclave a 121 °C durante 1 hora. Después del enfriamiento, el pH de las muestras se ajustó a pH 5­ 8. El análisis se realizó por HPLC y las concentraciones de azúcar se calcularon en relación con los patrones de azúcar puro. Los resultados de este análisis se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5. Composición de carbohidratos de paja de control y de arroz transgénico.
Figure imgf000079_0001
Estos resultados confirman que el contenido adicional de almidón de la biomasa transgénica da como resultado un aumento en el contenido total de glucosa del material y no se produce a expensas de, por ejemplo, glucosa derivada de celulosa.
Ejemplo 11. Las plantas transgénicas que acumulan almidón vegetativo tienen una mayor biomasa aérea
Para determinar si el fenotipo de acumulación de almidón afectó el rendimiento de biomasa entre plantas transgénicas, se cultivaron 20 progenie de una sola planta de arroz que portaba la construcción 2116 y 9 progenie de plantas de control de tipo silvestre (NB) en un invernadero hasta la madurez, se recolectó la semilla y se cosechó, se secó y se pesó la biomasa total aérea (excluyendo semillas y panículas) (FIG.20). Con referencia a la FIG. 20, los pesos secos promedio de las plantas de la población de 2116 es un 17 % mayor que los de la población de control.
Ejemplo 12. Recuperación de glucosa después de la hidrólisis enzimática
En lugar de utilizar una hidrólisis ácida total para extraer glucosa de la biomasa lignocelulósica, con frecuencia se usa un tratamiento previo con ácido diluido para tratar previamente la biomasa con el fin de alterar la cristalinidad de los polímeros de carbohidratos que están presentes en el material vegetal y después se añaden cócteles de enzimas hidrolíticas (celulasas, hemicelulasas, etc.) para la hidrolización de los polímeros en sus azúcares componentes. Para determinar si la biomasa con alto contenido de almidón permitiría recuperar más glucosa durante dicho procedimiento de hidrólisis enzimática, se trataron previamente 20 mg de tejido molido de cada una de las muestras mezcladas (mezcla de control NB y mezcla transgénica) con ácido sulfúrico 0,25 M (pH 1,0) a 95 °C durante 4 o 16 horas, o a 120 °C durante 1 hora. Después de ajustar el pH de las muestras tratadas previamente, se realizó la hidrólisis enzimática con un cóctel enzimático disponible comercialmente, Accellerase® (Genencor, Palo Alto CA). La hidrólisis con una mezcla de Accellerase de "cóctel completo" (FCt) implica 200 pl de Accellerase® 1500 y 100 pl de Accellerase® XY por gramo de biomasa a 50 °C, pH 5,0, durante 72 horas. Después de la hidrólisis, el rendimiento de glucosa se midió usando HPLC (figura 21). Refiriéndose a esta figura, se observó, que en las tres condiciones de tratamiento previo e hidrólisis, se recuperó más glucosa libre de la biomasa transgénica con alto contenido de almidón, de la que podría recuperarse de la biomasa de control.
Para determinar si se puede recuperar el aumento de glucosa de la paja transgénica cuando se emplearon métodos alternativos de tratamiento previo de biomasa, las muestras de la mezcla de control NB y la biomasa de la mezcla transgénica se sometieron a tres estrategias de tratamiento previo diferentes. Se trataron previamente 20 mg de tejido molido con un tratamiento previo con ácido diluido (ácido sulfúrico 0,25 M a pH 1,0), un tratamiento previo con base (NH4OH al 7,5 % a pH 12,0) o un tratamiento previo con bisulfito (NH4HSO3 0,175 M (NH4) 2CO30,18 M; bisulfito a pH 8,1). Después del tratamiento previo, las muestras se hidrolizaron con un cóctel de enzimas como se describió anteriormente. Las cantidades de glucosa y xilosa que se liberaron después de cada tratamiento previo e hidrólisis se cuantificaron por HPLC (FIG. 22 y 23). Como se puede observar en la FIG. 22, para cada tratamiento previo se recuperó más glucosa de la biomasa transgénica que la recuperada de la biomasa de control. Por el contrario, como se puede observar en la FIG. 23, en cada condición de tratamiento previo, los rendimientos de xilosa de la biomasa transgénica fueron muy similares o ligeramente inferiores a los rendimientos de xilosa de la biomasa de control, reflejando el hecho de que la biomasa transgénica tenía un contenido de xilosa ligeramente más bajo por gramo en peso seco, como se determinó anteriormente a partir del análisis de composición total (véase la Tabla 5).
Estas observaciones indican que aumentar el contenido de almidón de la biomasa permite la recuperación de más glucosa por unidad de biomasa. Además, la comparación del rendimiento de glucosa de la muestra de la mezcla de control NB tratada previamente con ácido (95 °C 16 h) con el rendimiento de glucosa de la muestra de mezcla transgénica de bisulfato tratada previamente (95 °C 16 h) como se muestra en la FIG. 22 indica que, aunque un tratamiento previo leve, tal como el tratamiento previo con bisulfato descrito anteriormente, podría liberar glucosa de manera menos eficaz que un tratamiento previo ácido o básico, se puede recuperar tanta o más glucosa de la biomasa transgénica incluso con un tratamiento previo suave que la que se puede recuperar de la biomasa de control después de un tratamiento previo ácido o básico duro. El uso de un tratamiento previo suave permitiría instalaciones de procesamiento con equipos de capital menos costosos; por el contrario, el uso del material transgénico en un tratamiento previo más severo aumentaría los rendimientos de glucosa, mejorando el retorno de la inversión de ese equipo.
En un experimento similar, las muestras de dos plantas de arroz transgénicas individuales 2110_13 y 2110_21 y la mezcla de control NB se trataron previamente en cuatro condiciones diferentes, después se sometieron a hidrólisis enzimática (FIG. 24). Se trataron veinte miligramos de tejido molido con un tratamiento previo con ácido (ácido sulfúrico 0,25 M a pH 1,0), un tratamiento previo con base (NH4OH al 7,5 % a pH 12,0), un tratamiento previo con bisulfito (NH4HSO3 0,175 M (NH4)2CO3 0,18 M a pH 8,1 ), o un tratamiento previo con hidróxido de calcio [Ca (OH)2 saturado] a 120 °C durante 1 hora con una relación de líquidos a sólidos de 10, seguido de digestión enzimática como se describió anteriormente. Los rendimientos de glucosa se cuantificaron por HPLC. Con referencia a la FIG. 24, el rendimiento general de los tratamientos previos difiere notablemente, pero en cada caso se recuperó más glucosa de la biomasa de arroz transgénico que la recuperada de la biomasa de control. Estos resultados también muestran que el beneficio del aumento de la acumulación de almidón en las plantas transgénicas se puede ver en la biomasa derivada de una sola línea de plantas y no necesita implicar una mezcla de biomasa de múltiples líneas de plantas independientes.
Ejemplo 13. Sacarificación y fermentación simultáneas de biomasa
Se pueden producir etanol, ácidos orgánicos u otros productos bioquímicos a partir de biomasa lignocelulósica a través de la sacarificación y fermentación simultáneas (SSF, por sus siglas en inglés). Este proceso utiliza tratamiento previo de biomasa, como se describió anteriormente, seguido de la hidrólisis de la biomasa con cócteles enzimáticos en presencia de levaduras u otros microorganismos, que metabolizarán los azúcares resultantes para producir etanol, ácidos orgánicos y/o productos bioquímicos adicionales.
Para determinar si la biomasa del arroz transgénico con alto contenido de almidón apoyaría la producción de más etanol en relación con la biomasa de control a través de SSF, se trataron previamente 3 g de biomasa de la mezcla de control NB o de la mezcla transgénica con H2SO40,25 M pH 1,0 a 120 °C durante 1 hora en una olla a presión. La hidrólisis se realizó a un pH 4,9 a 50 °C con el cóctel completo de Accellerase (FCt). FCt contiene 200 gl de Accellerase® 1500 por 1 g de biomasa y 100 gl de Accellerase® XY por 1 g de biomasa. Se añadió medio YP (10 g/l de extracto de levadura, 20 g/l de peptona) al hidrolizado para ayudar al crecimiento de las levaduras y después se añadió un inóculo de células de levadura D5A de una solución madre congelada. También se preparó una muestra de "control de glucosa" que empleaba glucosa pura (aproximadamente 20-22 g/l) en el medio en lugar de la biomasa hidrolizada.
La FIG. 25 ilustra los cambios en los títulos de cultivo de levaduras (UFC/ml) durante la sacarificación y fermentación simultáneas de biomasa transgénica (cuadrado; mezcla transgénica), plantas de control no transgénicas (diamante: mezcla de control NB) y control de glucosa (triángulo). Como se puede observar en la FIG. 25, las tres muestras apoyaron el crecimiento del organismo fermentador, levadura en este ejemplo. La glucosa pura fomentó el crecimiento más rápido de la levadura y el crecimiento de la levadura alcanzó una meseta antes cuando se cultivó con glucosa pura que cuando se cultivó en los hidrolizados de biomasa. En 24 horas, la biomasa transgénica fomentó el crecimiento de más levadura que la biomasa de control.
La FIG. 26 ilustra la liberación y el consumo de glucosa durante la SSF y fermentación de biomasa transgénica, planta de control no transgénica y control de glucosa. Con referencia a la FIG. 26, se observó esa sacarificación; es decir, la hidrólisis de los polisacáridos en la biomasa a sus azúcares componentes, se produce al mismo tiempo que las células de levadura crecen durante la SSF y las concentraciones de glucosa en los hidrolizados de biomasa aumentan inicialmente, mientras que las concentraciones de glucosa en el medio de "control de glucosa" disminuyen inmediatamente. A medida que las poblaciones de levadura aumentan y la biomasa se agota, las concentraciones de glucosa comienzan a disminuir en medios que también contienen biomasa.
La FIG. 27 ilustra la producción de etanol durante la sacarificación y fermentación simultáneas de biomasa de arroz, plantas de control no transgénicas y control de glucosa. De acuerdo con el consumo rápido de glucosa visto en cultivos que contienen el "control de glucosa", los cultivos de control también producen etanol antes que los cultivos cultivados sobre hidrolizados de biomasa. En 48 horas, sin embargo, ambos tipos de hidrolizados de fomentan la producción de cantidades significativas de etanol. De acuerdo con un mayor contenido de almidón fácilmente hidrolizado, la biomasa de la mezcla transgénica fomenta una producción más rápida de etanol, así como una mayor concentración final de etanol (concentración final: 17,1 g de etanol/100 g de biomasa) que la biomasa de la mezcla de control NB (concentración final: 14,2 g de etanol/100 g de rastrojo).
Según las cantidades iniciales de glucosa que estaban presentes en cada cultivo como polímeros de glucano en las muestras de biomasa, es posible calcular el rendimiento eficaz de etanol en glucosa, usando la Ecuación 1:
[EtOH]f - [EtOH]0
%Conversíón de celulosa = -r-r-— -r-rr-.-------- r $ 100 % 0,51 * f [bíomasa]
donde el [EíOH]f es la concentración final de etanol (g/l), [EtOHjo es la concentración inicial de etanol (g/l), 0,51 es el factor de conversión de glucosa a etanol basado en la bioquímica estequiométrica de la levadura, f es la fracción de glucano (polisacárido de glucosa) de la biomasa seca y [Biomasa] es la concentración inicial (g/l) de la biomasa seca en la muestra. Usando esta ecuación, hubo una mayor tasa de conversión de etanol de la biomasa transgénica que de la biomasa de control, tal como se muestra en la Tabla 6.
Tabla 6. Tasas de conversión de etanol de biomasa control y transgénica.
Figure imgf000081_0001
Se observó que la tasa de conversión de etanol en la biomasa transgénica era más cercana que la observada en glucosa pura, indicando que la fermentación de etanol puede proceder más eficazmente de biomasa transgénica, con alto contenido de almidón que de la biomasa de control.
Ejemplo 14. Combinación de acumulación de almidón con la expresión de enzimas que degradan polisacáridos
Si bien la mayor acumulación de almidón en la biomasa transgénica permite la liberación de más glucosa de la biomasa durante la hidrólisis o SSF, es posible convertir aún más glucano disponible en glucosa produciendo enzimas que degradan polisacáridos en la biomasa mientras las plantas crecen al mismo tiempo que se acumula el almidón. Las paredes celulares de las plantas están compuestas de numerosos polisacáridos, incluyendo polímeros de glucano tales como celulosa, p-glucano y xiloglucanos, así como otros polisacáridos complejos tal como hemicelulosas (heteroxilanos), pectinas, etc. Expresar enzimas que degradan estos polisacáridos hará posible descomponer estos polisacáridos en sus azúcares componentes más fácilmente, proporcionando así un beneficio adicional a la biomasa con alto contenido de almidón para piensos para animales o aplicaciones de fermentación, en la que los azúcares fermentables o digeribles se recuperan más eficazmente tanto del almidón vegetativo como de los polisacáridos estructurales.
Se pueden emplear varias enzimas que degradan polisacáridos para este objetivo. Se proporcionan ejemplos de estas enzimas que degradan polisacáridos como la SEQ ID NO: 77 (xilanasa 043097), SEQ ID NO: 78 (celobiohidrolasa BD22308), SEQ ID NO: 79 (endoglucanasa BD25243), SEQ ID NO: 80 (xilanasa EU591743), SEQ ID NO: 81 (endoglucanasa de NtEGm), SeQ ID NO: 82 (celobiohidrolasa P0C2S1), SeQ ID NO: 83 (xilanasa P77853), SEQ ID NO: 84 (celobiohidrolasa 068438), SEQ ID n O: 85 (endoglucanasa 033897), SEQ ID NO: 160 (amilasa 19862), SEQ ID NO: 161 (glucoamilasa 20082), SEQ ID NO: 162 (glucoamilasa 20707), SEQ ID NO: 163 (amilasa 21853), SEQ ID NO: 169 (AmyS) y SEQ ID NO: 171 (GlaA). Estas enzimas pueden codificarse mediante secuencias de Ad N SEQ ID NO: 86 (xilanasa 043097), SEQ ID No : 87 (celobiohidrolasa BD22308), SEQ ID NO: 88 (endoglucanasa BD25243), SEQ ID NO: 89 (xilanasa EU591743), SEQ ID NO: 90 (endoglucanasa de NtEGm), SEQ ID NO: 91 (celobiohidrolasa P0C2S1), SEQ ID NO: 92 (xilanasa P77853), SEQ ID NO: 93 (celobiohidrolasa 068438), SEQ ID NO: 94 (endoglucanasa 033897), SEQ ID NO: 164 (amilasa 19862), SEQ ID NO: 165 (glucoamilasa 20082), SEQ ID NO: 166 (glucoamilasa 20707), SEQ ID NO: 167 (amilasa 21853), SEQ ID NO: 168 (AmyS) y SEQ ID NO: 170 (GlaA).
Debido a que la actividad de las enzimas que degradan los polisacáridos en los tejidos de las plantas vivas puede interferir con el crecimiento o desarrollo de las plantas, puede ser útil expresar enzimas como precursores inactivos, por ejemplo, como proenzimas modificadas con inteína que pueden activarse después de que la biomasa se haya recolectado mediante la regulación de las condiciones bajo las cuales pueden activarse las inteínas (véanse las siguientes referencias para proenzimas modificadas con inteína que pueden utilizarse en la presente memoria. Solicitud de patente PCT PCT/US03/00432 presentada el 01/07/2003, PCT/US2010/055669 presentada el 11/05/2010, PCT/US2010/055751 presentada el 11/05/2010, PCT/US2010/055746 presentada el 11/05/2010, Patente de EE. UU. 8.247.647 expedida el 21/08/2012 y Solicitud de patente de EE. UU. 12/590.444 presentada el 11/06/2009). Se proporcionan ejemplos de inteínas que pueden emplearse para este propósito como los polipéptidos SEQ ID NO: 95 (polipéptido de inteína AS146-7), SEQ ID NO: 96 (S158-30-108-35) y SEQ ID NO: 97 (T134-100-101), que pueden codificarse mediante las secuencias de ADN SEQ ID NO: 98 (AS 146-7), SEQ ID NO: 99 (S158-30-108-35) y SEQ ID NO: 100 (T134-100-101). Se proporcionan ejemplos de enzimas que incorporan tales inteínas como las SEQ ID NO: 101 (EU591743:AS146-7), SEQ ID NO: 102 (P77853:S158-30-108-35) y SEQ ID NO: 103 (P77853:T134-100-101), que pueden codificarse mediante las secuencias de ADN proporcionadas como la SEQ ID NO: 104 (EU591743:AS146-7), SEQ ID NO: 105 (P77853:S158-30-108-35) y SEQ ID NO; 106 (P77853:T134-100-101).
Los casetes de expresión pueden construirse de tal manera que la transcripción de CWDE esté dirigida por un promotor adecuado. Se proporcionan ejemplos de tales promotores como la SEQ ID NO: 55 (ZmUbi1 P), SEQ Id NO: 56 (ZmPepCP) y SEQ ID NO: 57 (0sUbi3P). La transcripción de estos casetes se puede terminar empleando una señal de poliadenilación adecuada. Se proporciona un ejemplo de tal señal como la SEQ ID NO: 58 (terminador NOS). Además, la acumulación, la estabilidad y/o el direccionamiento subcelular de una enzima que degrada polisacáridos dada puede modificarse expresándolas como fusiones con polipéptidos N-terminales o C-terminales adecuadamente elegidos. Se proporcionan ejemplos de tales polipéptidos como la SEQ ID NO: 107 (péptido señal BAASS), SEQ ID NO: 108 (péptido señal Se Kd EL), SEQ ID NO: 109 (señal de direccionamiento xHvVSD), SEQ ID NO: 110 (fusión traduccional ZmUBQm), SEQ ID NO: 111 (xGZein27ss) y SEQ ID NO: 112 (señal HvAle), que puede codificarse mediante secuencias de ADN proporcionadas como SEQ ID NO: 113 (BAASS), SEQ ID NO: 114 (SEKDEL), SEQ ID NO: 115 (xHvVSD), SEQ ID NO: 116 (ZmUBQm), SEQ ID NO: 117 (xGZein27ss) y SEQ ID NO: 118 (HvAle).
La FIG. 28 ilustra la organización de un casete de expresión de CWDE que incluye (1) un elemento promotor, (2) péptido señal N-terminal, (3) una secuencia codificante para CWDE (negro), (4) péptido C-terminal y (5) un terminador transcripcional/señal de poliadenilación. En este ejemplo, la CWDE (negro) se expresa como una fusión traduccional con un péptido señal N-terminal así como con un péptido C-terminal.
Se proporcionan ejemplos de otros casetes de expresión de CWDE como la SEQ ID NO: 119 (ZmUbi1P:xGZein27ss:BD22308:xHvVSD, SEQ ID NO: 120 (ZmPepCP: xGZein27ss:BD25243:SEKDEL), SEQ ID NO: 121 (OsUbi3P:EU591743), SEQ ID NO: 122 (ZmUbi1 P:EU591743:AS146-7:SEKDEL), SEQ ID NO: 123 (ZmUbi1 P:HvAle:NtEGm:SEKDEL), SEQ ID NO: 124 (ZmPepCP:HvAle:NtEGm:SEKDEL), SEQ ID NO: 125 (OsUbi3P: HvAle:NtEGm:SEKDEL), SEQ ID NO: 126 (OsUbi3P:BAASS:O33897), SEQ ID NO: 127 (ZmPepCP: BAASS:O43097:SEKDEL), SEQ ID NO: 128 (OsUbi3P:O68438), SEQ ID NO: 129 (OsUbi3P:P0C2S1), SEQ ID NO: 130 (ZmUbi1 P: ZmUBQm:BAASS:P77853:S158-30-108-35 y SEQ ID NO: 131 (ZmUbi1P:BAASS:P77853:T134-100-101 :SEKDEL).
Se pueden expresar múltiples CWDE y ARNh simultáneamente en plantas transgénicas mediante la construcción de un vector de transformación que tenga múltiples casetes de expresión unidos en tándem.
La FIG. 29 ilustra una de tales construcciones. La construcción incluye (1) un primer elemento promotor, (2) un conjunto de secuencias iniciadoras colocadas en orientaciones opuestas de modo que el transcrito de ARN sea autocomplementario en estas regiones, (3) un intrón o un elemento espaciador, (4) un primer terminador transcripcional/señal de poliadenilación, (5) un segundo elemento promotor, (6) un primer péptido señal N-terminal, (7) una secuencia codificante para una primera CWDE, (8) un primer péptido señal C-terminal, (9) un segundo terminador transcripcional/señal de poliadenilación, (10) un tercer elemento promotor, (11) un segundo péptido señal N-terminal, (12) una secuencia codificante para una segunda CWDE, (13) un tercer terminador transcripcional/señal de poliadenilación, (14) un cuarto elemento promotor, (15) una proteína de fusión N-terminal/ secuencia líder, (16) un tercer péptido señal N-terminal, (17) una secuencia codificante para una tercera CWDE y (18) un cuarto terminador transcripcional, señal de poliadenilación.
A continuación se encuentran descripciones de vectores que pueden usarse para introducir las construcciones descritas anteriormente en las células vegetales a través de la transformación mediada por Agrobacterium.
pAG4003 (SEQ ID NO: 76) es un plásmido que porta un marcador de resistencia a la espectinomicina, un origen de replicación bacteriano, un borde derecho (RB) del ADN-T de Agrobacterium y un borde izquierdo (LB) del ADN-T de Agrobacterium. Entre el RB y el LB hay un marcador seleccionable de planta compuesto por un promotor de ubiquitina de maíz (ZmUbi1 P), la secuencia codificante de la fosfomanosa isomerasa y el terminador NOS.
pAG4106 es un derivado de pAG4003 (SEQ ID NO: 76) que porta una construcción de apilamiento cuádruple (SEQ ID NO: 134) con ZmPepCP:ARNi de ZmGWD1 ZmUbi1P:xGZein27ss:BD22308:xHvVSD OsUbi3P:HvAle:NtEGm:SEKDEL ZmUbi1 P:ZmUBQm :BAASS:P77853:S158-30-108-35
pAG4107 es un derivado de pAG4003 (SEQ ID NO: 76) que porta una construcción de apilamiento cuádruple (SEQ ID NO: 135) con ZmPepCP:ARNi de ZmGWD2 ZmUbi1P:xGZein27ss:BD22308:xHvVSD OsUbi3P:HvAle:NtEGm:SEKDEL ZmUbilP:ZmUBQm:BAASS:P77853:S158-30-108-35
pAG4108 es un derivado de pAG4003 (SEQ ID NO: 76) que porta una construcción de apilamiento cuádruple (SEQ ID NO: 136) con ZmPepCP:ARNi de SbGWD1+ ZmUbilP:xGZein27ss:BD22308:xHvVSD OsUbi3P:HvAle:NtEGm:SEKDEL ZmUbilP:ZmUBQm:BAASS:P77853:S158-30-108-35
pAG4109 es un derivado de pAG4003 (SEQ ID NO: 76) que porta una construcción de apilamiento cuádruple (SEQ ID NO: 137) con ZmPepCP:ARNi de SbGWD2+ ZmUbilP:xGZein27ss:BD22308:xHvVSD OsUbi3P:HvAle:NtEGm:SEKDEL ZmUbilP:ZmUBQm:BAASS:P77853:S158-30-108-35
pAG4110 es un derivado de pAG4003 (SEQ ID NO: 76) que porta una construcción de apilamiento cuádruple (SEQ ID NO: 138) con ZmPepCP:ARNi de ZmGWD1 ZmUbi1P:xGZein27:BD22308:xHvVSD OsUbi3P:HvAle:NtEGm:SEKDEL:NOST ZmPEPCP:BAASS:043097:SEKDEL
pAG4111 es un derivado de pAG4003 (SEQ ID NO: 76) que porta una construcción de apilamiento cuádruple (SEQ ID NO: 139) con ZmPepCP:ARNi de ZmGWD2 ZmUbi1 P:xGZein27:BD22308:xHvVSD OsUbi3P:HvAle:NtEGm:SEKDEL:NOST ZmPepCP:BAASS:O43097:SEKDEL
pAG4112 es un derivado de pAG4003 (SEQ ID NO: 76) que porta una construcción de apilamiento cuádruple (SEQ ID NO: 140) con ZmPepCP:ARNi de ZmGWD1 ZmUbi1P:xGZein27:BD22308:xHvVSD ZmUbi1 P:HvAle:NtEGm:SEKDEL ZmUbi1 P:BAASS:EU591743:AS146-7:SEKDEL
pAG4113 es un derivado de pAG4003 (SEQ ID NO: 76) que porta una construcción de apilamiento cuádruple (SEQ ID NO: 141) con ZmPepCP:ARNi de ZmGWD2 ZmUbi1 P:xGZein27:BD22308:xHvVSD ZmUbi1 P:HvAle:NtEGm:SEKDEL ZmUbi1 P:BAASS:EU591743:AS146-7:SEKDEL
pAG4114 es un derivado de pAG4003 (SEQ ID NO: 76) que porta una construcción de apilamiento cuádruple (SEQ ID NO: 142) con ZmPepCP:ARNi de ZmGWD1 ZmUbi1 P:xGZein27:BD22308:xHvVSD ZmPepCP:xGZein27ss:BD25243:SEKDEL ZmUbi1 P:BAASS:EU591743:AS146-7:SEKDEL
pAG4115 es un derivado de pAG4003 (SEQ ID NO: 76) que porta una construcción de apilamiento cuádruple (SEQ ID NO: 143) con ZmPepCP:ARNi de ZmGWD2 ZmUbi1 P:xGZein27:BD22308:xHvVSD ZmPepCP:xGZein27ss:BD25243:SEKDEL ZmUbi1 P:BAASS:EU591743:AS146-7:SEKDEL
pAG4116 es un derivado de pAG4003 (SEQ ID NO: 76) que porta una construcción de apilamiento cuádruple (SEQ ID NO: 144) con ZmPepCP:ARNi de ZmGWD1 ZmUbi1P:xGZein27:BD22308:xHvVSD OsUbi3P:HvAle:NtEGm:SEKDEL ZmUbi1 P:BAASS:EU591743:AS146-7:SEKDEL
pAG4117 es un derivado de pAG4003 (SEQ ID NO: 76) que porta una construcción de apilamiento cuádruple (SEQ ID NO: 145) con ZmPepCP:ARNi de ZmGWD2 ZmUbi1 P:xGZein27:BD22308:xHvVSD OsUbi3P:HvAle:NtEGm:SEKDEL ZmUbi1 P:BAASS:EU591743:AS146-7:SEKDEL
pAG4120 es un derivado de pAG4003 (SEQ ID NO: 76) que porta una construcción de apilamiento cuádruple (SEQ ID NO: 146) con ZmPepCP:ARNi de ZmGWD1 OsUbi3P:P0C2S1 OsUbi3P:HvAleSp:NtEGm:SEKDEL ZmUbi1 P:ZmUBQm: BAASS:P77853-T134-100-101 :SEKDEL
pAG4121 es un derivado de pAG4003 (SEQ ID NO: 76) que porta una construcción de apilamiento cuádruple (SEQ ID NO: 147) con ZmPEPCP:ARNi de ZmGWD2 OsUbi3P:P0C2S1 OsUbi3P:HvAleSp:NtEGm:SEKDEL ZmUbi1 P:ZmUBQm: BAASS:P77853-T134-100-101 :SEKDEL
pAG4124 es un derivado de pAG4003 (SEQ ID NO: 76) que porta una construcción de apilamiento triple (SEQ ID NO: 148) con ZmPepCP:ARNi de ZmGWD1 ZmPepCP:xGZein27ss:BD25243:SEKDEL ZmUbi1 P:BAASS:EU591743:AS146-7:SEKDEL
pAG4125 es un derivado de pAG4003 (SEQ ID NO: 76) que porta una construcción de apilamiento triple (SEQ ID NO: 149) con ZmPepCP:ARNi de ZmGWD2 ZmPepCP:xGZein27ss:BD25243:SEKDEL ZmUbi1 P:BAASS:EU591743:AS146-7:SEKDEL
pAG4206 es un derivado de pAG4003 que porta una construcción de apilamiento triple (SEQ ID NO: 219) con ZmUbi1 P:xGZein27:BD22308:xHvVSD OsUbi3P:HvAle:NtEGm:SEKDEL:NosT+ZmPepCP:BAASS:O43097:SEKDEL
pAG4514 es un derivado de pAG4003 (SEQ ID NO: 76) que porta una construcción de apilamiento cuádruple (SEQ ID NO: 150) con ZmPepCP:ARNi de ZmGWD1 ZmUbi1P:xGZein27:BD22308:xHvVSD ZmPepCP:HvAle:NtEGm:SEKDEL ZmUbi1 P:BAASS:EU591743:AS146-7:SEKDEL
pAG4515 es un derivado de pAG4003 (SEQ ID NO: 76) que porta una construcción de apilamiento cuádruple (SEQ ID NO: 151) con ZmPepCP:ARNi de ZmGWD2 ZmUbi1P:xGZein27:BD22308:xHvVSD ZmPepCP:HvAle:NtEGm:SEKDEL ZmUbi1 P:BAASS:EU591743:AS146-7:SEKDEL
Ejemplo 15. Se puede recuperar más glucosa de las plantas transgénicas que acumulan almidón y expresan enzimas que degradan la pared celular
Las plantas de control individual y de maíz transgénico que portaban la construcción 4110 o 4111 se cultivaron hasta la madurez en un invernadero. Se cosecharon hojas y tallos de las plantas maduras, senescentes,se secaron y se molieron. Se analizaron muestras de cada una para determinar el contenido de almidón, actividad de xilanasa y actividad de endoglucanasa usando (respectivamente) el Kit de ensayo de Almidón Total, sustratos cromogénicos Xylazyme y Cellazyme de Megazyme (Bray, Condado de Wicklow, Irlanda). Tal como se muestra en la FIG. 30, la biomasa de las plantas que portan las construcciones 4110 y 4111 acumulan más almidón que la planta de control, mientras que también expresa las enzimas xilanasa y endoglucanasa. Cuando la biomasa de estas plantas se trató previamente e hidrolizó como se describió anteriormente, fue posible recuperar más glucosa de las plantas transgénicas. Además, las plantas que acumularon almidón y enzimas que degradan la pared celular produjeron más glucosa que las plantas que solo expresaron las enzimas que degradan la pared celular, tal como se muestra en la FIG. 31.
Se entiende, por lo tanto, que esta invención no se limita a las realizaciones particulares descritas, pero está destinada a cubrir todas las modificaciones que están dentro del alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas; la descripción anterior; y/o se muestra en los dibujos adjuntos.
Referencias
Alvira, P et al., 2010. Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: A review. Bioresource technology, 101(13), págs.4851-61. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20042329 [Consultado el 18 de julio de 2012].
An, G et al., 2005. Reverse genetic approaches for functional genomics of rice. Plant molecular biology, 59(1), págs.111-23. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16217606 [Consultado el 25 de julio de 2012].
Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K, 2000. Current Protocols in Molecular Biology Volumen 1, John Wiley & Sons.
Charles Abbas, Wuli Bao, Kyle Beery, Mike Cecava, Perry H. Doane, James L. Dunn, D.P.H., 2008. Solicitud de Patente Estadounidense de Abbas 2008 US20080220125.pdf., págs. 1-17.
Chi-Ham CL et al., 2010. The intellectual property landscape for gene suppression technologies in plants. Nature Biotechnology, 28 (1):32-36.
Christian, M et al., 2010. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics, 186(2), págs.757-61. Disponible en: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2942870&tool=pmcentre z&rendertype=abstract [Consultado el 14 de julio de 2012].
Frizzi A & Huang S, 2010. Tapping RNA silencing pathways for plant biotechnology. Plant biotechnology journal, 8(6), págs.655-77. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20331529 [Consultado el 24 de julio de 2012].
Horiguchi G, 2004. RNA silencing in plants: a shortcut to functional analysis. Differentiation; research in biological diversity, 72(2-3), págs.65-73. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15066186.
Horton RM, Hunt HD, Ho SN, Pullen J y Pease LR, 1989. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene 77(1 ):61 -68.
Kavakli IH et al., 2002. Generation, characterization, and heterologous expression of wild-type and up-regulated forms of Arabidopsis thaliana leaf ADP-glucose pyrophosphorylase. Planta, 215(3), págs.430-9. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12111225 [Consultado el 25 de julio de 2012].
Kottin, O et al., 2009. STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana. The Plant cell, 21(1), págs.334-46. Disponible en: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2648081&tool=pmcentre z&rendertype=abstract [Consultado el 25 de julio de 2012].
Krishnan A, Guiderdoni E, An G, Hsing YI, Han CD, Lee MC, Yu SM, Upadhyaya N, Ramachandran S, Zhang Q, Sundaresan V, Hirochika H, Leung H y Pereira A, 2009. Mutant resources in rice for functional genomics of the grasses. Plant Physiol. 149:165-70.
Maniatis T, Fritsch EF y J. Sambrook J, 1982. Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory.
Obana Y et al., 2006. Enhanced turnover of transitory starch by expression of up-regulated ADP-glucose pyrophosphorylases in Arabidopsis thaliana. Plant Science, 170(1), págs.1 -11. Disponible en: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0168945205002670 [Consultado el 25 de julio de 2012].
Puchta H, Dujon B y Hohn B, 1993. Homologous recombination in plant cells is enhanced by in vivo induction of double strand breaks into DNA by a site-specific endonuclease. Nucleic acids research, 21(22), págs.5034-40. Disponible en: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=310614&tool=pmcentrez &rendertype=abstract.
Sikora P et al., 2011. Mutagenesis as a tool in plant genetics, functional genomics, and breeding. International journal ofplant genomics, 2011, p.314829. Disponible en: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3270407&tool=pmcentre z&rendertype=abstract [Consultado el 25 de julio de 2012].
Smith AM y Zeeman SC, 2006. Quantification of starch in plant tissues. Nat. Protocols 1:1342-1345
Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijk PA, Green AG y Waterhouse PM, 2000. Total silencing by intron-spliced hairpin RNA., Nature 407:319-20.
Smith TF, Waterman MS, 1981. Identification of Common Molecular Subsequences. J Mol Biol 147: 195 -197.
Stitt M & Zeeman, Samuel C, 2012. Starch turnover: pathways, regulation and role in growth. Current opinion in plant biology, 15(3), págs.282-92. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22541711 [Consultado el 16 de julio de 2012].
Stoutjesdijk PA, Singh SP, Liu Q, Hurlstone CJ, Waterhouse PA y Green AG, 2002. hpRNA-mediated targeting of the Arabidopsis FAD2 gene gives highly efficient and stable silencing. Plant Physiol. 129 (4): 1723-31.
Till BJ, Cooper J, Tai TH, Colowit P, Greene EA, Henikoff S, Comai L, 2007 Discovery of chemically induced mutations in rice by TILLING. BMC Plant Biol. 7:19.
Vainstein A et al., 2011. Permanent genome modifications in plant cells by transient viral vectors. Trends in biotechnology, 29(8), págs.363-9. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21536337 [Consultado el 30 de julio de 2012].
Warthmann N et al., 2008. Highly specific gene silencing by artificial miRNAs in rice. PloS one, 3(3), p.e1829. Disponible en: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2262943&tool=pmcentre z&rendertype=abstract [Consultado el 25 de julio de 2012].
Wehrkamp-Richter S et al., 2009. Characterisation of a new reporter system allowing high throughput in planta screening for recombination events before and after controlled DNA double strand break induction. Plant physiology and biochemistry: PPB/ Société frangaise de physiologie végétale, 47(4), págs.248-55. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19136269 [Consultado el 17 de julio de 2012].
Wright D et al., 2005. High-frequency homologous recombination in plants mediated by zinc-finger nucleases. The Plant journal: for cell and molecular biology, 44(4), págs.693-705. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16262717 [Consultado el 19 de julio de 2012].
Yu TS et al., 2001. The Arabidopsis sex1 mutant is defective in the R1 protein, a general regulator of starch degradation in plants, and not in the chloroplast hexose transporten The Plant cell, 13(8), págs.1907-18. Disponible en: =abstract. Zhang Z, Schwartz S, Wagner L y Miller W, 2000. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. J Comput Biol 2000; 7(1-2):203-14.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Una planta genéticamente modificada que comprende un primer ácido nucleico aislado que comprende una secuencia con al menos el 90 % de identidad con una secuencia de SEQ ID NO: 50 y un segundo ácido nucleico aislado que comprende una secuencia con al menos el 90 % de identidad con una secuencia de SEQ ID NO: 86, una secuencia con al menos el 90 % de identidad con una secuencia de SEQ ID NO: 87 y una secuencia con al menos el 90 % de identidad con una secuencia de SEQ ID NO: 90.
2. La planta genéticamente modificada de la reivindicación 1 que comprende además un promotor operativamente unido a al menos uno del primer ácido nucleico aislado o del segundo ácido nucleico aislado.
3. Una construcción genética que comprende un primer ácido nucleico aislado que comprende una secuencia con al menos el 90 % de identidad con una secuencia de SEQ ID NO: 50 y un segundo ácido nucleico aislado que comprende una secuencia con al menos el 90 % de identidad con una secuencia de SEQ ID NO: 86, una secuencia con al menos el 90 % de identidad con una secuencia de SEQ ID NO: 87 y una secuencia con al menos el 90 % de identidad con una secuencia de SEQ ID NO: 90.
4. La construcción genética de la reivindicación 3 que comprende además un promotor operativamente unido a al menos uno del primer ácido nucleico aislado o del segundo ácido nucleico aislado.
5. Un método de procesamiento agrícola o preparación de piensos para animales que comprende proporcionar una planta genéticamente modificada que comprende un primer ácido nucleico aislado que comprende una secuencia con al menos el 90 % de identidad con una secuencia de SEQ ID NO: 50 que codifica un producto de ácido ribonucleico que inactiva o inhibe la expresión de al menos un gen que codifica una proteína implicada en la movilización de almidón en una planta y un segundo ácido nucleico aislado que comprende una secuencia con al menos el 90 % de identidad con una secuencia de SEQ ID NO: 86, una secuencia con al menos el 90 % de identidad con una secuencia de SEQ ID NO: 87 y una secuencia con al menos el 90 % de identidad con una secuencia de SEQ ID NO: 90.
6. El método de la reivindicación 5, en donde la planta genéticamente modificada comprende además un promotor operativamente unido a al menos el primer ácido nucleico aislado o el segundo ácido nucleico aislado.
7. El método de una de las reivindicaciones 5 a 6, que comprende además tratar previamente la planta genéticamente modificada con una formulación química para formar una mezcla, preferiblemente,
en donde la mezcla tiene una relación líquida a sólido seleccionada del valor menor que o igual a uno de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1; y/o
en donde el tratamiento previo incluye incubar la mezcla durante un período de menos que o igual a uno de 16 horas, 15 horas, 14 horas, 13 horas, 12 horas, 11 horas, 10 horas, 9 horas, 8 horas, 7 horas, 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas o 1 hora; y/o en donde el tratamiento previo incluye proporcionar una temperatura de mezcla de 40 °C a 120 °C.
8. El método de la reivindicación 7, en donde la formulación química incluye al menos un resto que comprende un ion seleccionado del grupo que consiste en: sulfito, bisulfito, sulfato, carbonato, hidróxido y óxido; y/o en donde el tratamiento previo incluye proporcionar una mezcla a un pH que varía de 1,0 a 12,0.
9. El método de la reivindicación 8, en donde el al menos un resto incluye además un contraión seleccionado del grupo que consiste en: amonio, sodio, magnesio y calcio.
10. El método de la reivindicación 7, en donde la formulación química incluye un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: un ácido sulfúrico, una base, bisulfito de amonio y carbonato de amonio.
11. El método de la reivindicación 7 que comprende además la hidrolización de la mezcla, preferiblemente,
en donde la etapa de hidrolización incluye incubar la mezcla durante un período de menos de o igual a uno de 144 horas, 140 horas, 130 horas, 120 horas, 110 horas, 100 horas, 90 horas, 80 horas, 70 horas, 60 horas, 50 horas, 40 horas, 30 horas, 20 horas, 10 horas, 9 horas, 8 horas, 7 horas, 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas o 1 hora; y/o
en donde la etapa de hidrolización incluye incubar la mezcla a una temperatura de 100 °C o menos.
12. El método de la reivindicación 11 que comprende además la hidrolización de la planta genéticamente modificada con una o más enzimas exógenas.
13. El método de la reivindicación 12, que comprende además la exposición de la planta genéticamente modificada a un organismo fermentador en condiciones de fermentación para producir un producto químico, preferiblemente, en donde la una o más enzimas exógenas se selecciona del grupo que consiste en: una glucosidasa, una endoglucanasa, una celobiohidrolasa, una glucosidasa, una p-xilosidasa, una celulasa, una xilanasa, una amilasa, una invertasa, una proteasa, una fitasa, una enzima hidrolítica, una glucanasa, una hemicelulasa, una esterasa, una lacasa, una mananasa y una peroxidasa.
14. El método de la reivindicación 5 que comprende además al menos una etapa seleccionada del grupo que consiste en: secar la planta genéticamente modificada, granular la planta genéticamente modificada en gránulos de pienso, ensilar la planta genéticamente modificada para hacer ensilado y combinar la planta genéticamente modificada con granos destiladores o con una fuente de fibra comestible, preferiblemente, en donde la fuente de fibra comestible se selecciona del grupo de plantas que consiste en: maíz, sorgo, trigo, centeno, semillas de soja, grano de maíz, grano de sorgo, grano de trigo, grano de centeno, harina de soja, harina de maíz, aceite de maíz y germen de maíz.
15. El método de la reivindicación 5, que comprende además alimentar a un animal con la planta genéticamente modificada para promover el crecimiento del animal, preferiblemente, en donde el animal se selecciona del grupo que consiste en: pollos, cerdos y vacas.
16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 5 - 15, en donde la etapa de proporcionar incluye producir la planta genéticamente modificada usando transformación mediada por Agrobacterium-con la construcción genética.
17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 16, en donde la planta genéticamente modificada se selecciona del grupo que consiste en: maíz, soja, arroz, caña de azúcar, remolacha azucarera, sorgo, mijo, miscanto, eucalipto, sauce y álamo.
ES13855041T 2012-11-14 2013-11-14 Métodos y composiciones para procesar biomasa con niveles elevados de almidón Active ES2774426T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261726301P 2012-11-14 2012-11-14
US13/793,078 US9598700B2 (en) 2010-06-25 2013-03-11 Methods and compositions for processing biomass with elevated levels of starch
PCT/US2013/070184 WO2014078588A1 (en) 2012-11-14 2013-11-14 Methods and compositions for processing biomass with elevated levels of starch

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2774426T3 true ES2774426T3 (es) 2020-07-21

Family

ID=50731700

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES13855041T Active ES2774426T3 (es) 2012-11-14 2013-11-14 Métodos y composiciones para procesar biomasa con niveles elevados de almidón

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP2920311B1 (es)
CN (1) CN104981543A (es)
AU (1) AU2013344666B2 (es)
BR (1) BR112015011152A2 (es)
ES (1) ES2774426T3 (es)
WO (1) WO2014078588A1 (es)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107075526B (zh) * 2014-09-29 2022-07-08 谷万达公司 具有工程内源基因的植物
TW201617451A (zh) * 2014-11-11 2016-05-16 陶氏農業科學公司 合成雙向植物啓動子
CN111534537B (zh) * 2020-04-09 2022-05-03 中山大学 OsLAC20基因在提高水稻产量中的应用

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS18304A (en) * 2001-08-27 2006-10-27 Syngenta Participations Ag. Self processing plants and plant parts
CA2805007C (en) 2002-01-08 2015-09-08 Agrivida, Inc. Transgenic plants expressing civps or intein modified proteins and related method
ATE405653T1 (de) * 2002-12-19 2008-09-15 Bayer Cropscience Ag Pflanzenzellen und pflanzen, die eine stärke mit erhöhter endviskosität synthetisieren
CA2517879A1 (en) * 2003-03-07 2004-09-16 Basf Plant Science Gmbh Enhanced amylose production in plants
AR048024A1 (es) * 2004-03-05 2006-03-22 Bayer Cropscience Gmbh Plantas con actividad aumentada de distintas enzimas fosforilantes del almidon
RS20060506A (en) * 2004-03-08 2008-04-04 Syngenta Participations Ag., Self-processing plants and plant parts
BRPI0808462A2 (pt) 2007-03-05 2014-07-15 Archer Daniels Midland Co Método de preparo de alimentos para animais mais digestíveis
CA2704016A1 (en) * 2007-11-05 2009-05-14 Syngenta Participations Ag Methods for increasing starch content in plants
JP5695422B2 (ja) * 2007-11-27 2015-04-08 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション デンプン代謝改変植物
CA2753546A1 (en) * 2009-02-25 2010-09-02 Syngenta Participations Ag Methods for increasing starch content in plant cobs
UA117654C2 (uk) * 2009-11-06 2018-09-10 Агрівіда, Інк. Трансгенна рослина, яка експресує фермент, що деградує клітинну стінку, і вектор експресії
US8420387B2 (en) * 2009-11-06 2013-04-16 Agrivida, Inc. Intein-modified enzymes, their production and industrial applications
CA2803868A1 (en) * 2010-06-25 2011-12-29 Agrivida, Inc. Plants with altered levels of vegetative starch
CN101979548B (zh) * 2010-09-16 2013-06-19 华中农业大学 叶片特异性表达人工microRNA提高水稻对白叶枯病抗性的方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2920311A4 (en) 2016-04-27
BR112015011152A2 (pt) 2017-08-29
AU2013344666B2 (en) 2019-05-02
EP2920311A1 (en) 2015-09-23
WO2014078588A1 (en) 2014-05-22
CN104981543A (zh) 2015-10-14
EP2920311B1 (en) 2020-01-08
AU2013344666A1 (en) 2015-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jung et al. RNAi suppression of lignin biosynthesis in sugarcane reduces recalcitrance for biofuel production from lignocellulosic biomass
Buanafina et al. Functional testing of a PF02458 homologue of putative rice arabinoxylan feruloyl transferase genes in Brachypodium distachyon
Petersen et al. High-level expression of a suite of thermostable cell wall-degrading enzymes from the chloroplast genome
ES2610923T3 (es) Pretratamiento consolidado e hidrólisis de biomasa vegetal que expresa enzimas de degradación de pared celular
BR112016021857B1 (pt) Célula de levedura recombinante e método para produzir etanol a partir de glicose
RU2658779C1 (ru) Растения, экспрессирующие ферменты, деградирующие клеточную стенку, и векторы экспрессии
US9598700B2 (en) Methods and compositions for processing biomass with elevated levels of starch
BRPI1002997A2 (pt) sorgo sacarino transgÊnico com composiÇço de lignina alterada e processo de preparaÇço do mesmo
US20120064580A1 (en) Termite enzymes and uses thereof for in vitro conversion of lignin-containing materials to fermentable products
ES2774426T3 (es) Métodos y composiciones para procesar biomasa con niveles elevados de almidón
AU2018202165A1 (en) Plants with altered levels of vegetative starch
WO2011160050A2 (en) Systems to reduce recalcitrance of cellulosic biomass and increase yields of fermentable sugars
Farran et al. Increased bioethanol production from commercial tobacco cultivars overexpressing thioredoxin f grown under field conditions
US10246719B2 (en) Modulating laccase enzyme to regulate cell wall biosynthesis and recalcitrance in plants
Kim et al. In planta production and characterization of a hyperthermostable GH10 xylanase in transgenic sugarcane
US20160160254A1 (en) Plants expressing cell wall degrading enzymes and expression vectors
AU2011270679B2 (en) Plants with altered levels of vegetative starch
Aspegren Lessard et al.
US10227601B2 (en) PtDUF266 gene regulating cell wall biosynthesis and recalcitrance in populus
US20150135369A1 (en) Transgenic plants having altered expression of pectin acetylesterase and methods of using same
Wang et al. Construction of SHP-GLOX Straw Lignin Degulation System and Its Application Effect in Rice
US20120096583A1 (en) Methods and compositions for enhanced gene expression through intron free energy reduction
Raab Lessard et al.
Shearer Marcia M. de O. Buanafina, Howard W. Fescemyer, Mandeep Sharma & Erica
Kumar Energy crops for biofuel feedstocks: Facts and recent patents on genetic manipulation to improve biofuel crops