ES2610923T3 - Pretratamiento consolidado e hidrólisis de biomasa vegetal que expresa enzimas de degradación de pared celular - Google Patents

Pretratamiento consolidado e hidrólisis de biomasa vegetal que expresa enzimas de degradación de pared celular Download PDF

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Abstract

Método para la producción de azúcares solubles de material vegetal modificado que comprende: pretratamiento mediante la mezcla del material vegetal modificado con una formulación de reducción a pasta que incluye bisulfito de amonio y carbonato amónico para formar una mezcla a un pH que varía de 5,0 a 9,0 y una temperatura de 40 °C a 95 °C, donde el material vegetal modificado incluye una primera secuencia de polinucleótidos que codifica una primera proteína y una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica una segunda proteína y donde la primera proteína comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 1, SEC ID n.º: 5, SEC ID n.º: 6, SEC ID n.º: 7 y SEC ID n.º: 8, y la segunda proteína comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 2, SEC ID n.º: 3, SEC ID n.º: 4, SEC ID n.º: 9, SEC ID n.º: 10, SEC ID n.º: 11 y SEC ID n.º: 12; y provisión de condiciones de hidrólisis a la mezcla.

Description

DESCRIPCIÓN
Pretratamiento consolidado e hidrólisis de biomasa vegetal que expresa enzimas de degradación de pared celular
Campo de invención 5
[0001] La divulgación se refiere a métodos para producir azúcares solubles de plantas que expresan enzimas de degradación de pared celular, plantas transgénicas, vectores de expresión, ácidos nucleicos y proteínas de degradación de pared celular.
10
Antecedentes
[0002] La biomasa lignocelulósica es una materia prima atractiva para la producción de biocombustibles, productos químicos y bioproductos.
La biomasa lignocelulósica proporciona muchos beneficios, incluyendo disponibilidad abundante, coste 15 potencialmente bajo, sostenibilidad y el hecho de que no se consume ordinariamente por seres humanos como una fuente de alimento (Langeveld JWA et al. 2010 Crop Sci 50: S131-S151).
Para convertir biomasa lignocelulósica en energía renovable y bioquímicos, los bioprocesos convierten una porción de la biomasa lignocelulósica en azúcares simples, que se convierten en biocombustibles u otros bioproductos.
20
[0003] El coste de producción de azúcar por conversión biológica es costoso debido a los costes de pretratamiento de biomasa e hidrólisis enzimática (Alvira P et al. 2010 Bioresour Technol 101: 4851; Abramson M et al. 2010 Plant Science 178: 61; Daniel Klein-Marcuschamer et al. Biotecnol. Bioeng. 2012,109:1083).
Paredes celulares vegetales son recalcitrantes para la hidrólisis enzimática debido a que la heterogeneidad, composición química y características estructurales de los polisacáridos de pared celular las hacen inaccesibles a 25 enzimas hidrolíticas (Zhu L et al. 2008 Bioresour Technol 99: 3817).
Por esta razón, la hidrólisis enzimática requiere un pretratamiento que puede hacer las paredes celulares vegetales accesibles.
Las tecnologías de pretratamiento predominantes en la industria típicamente emplean condiciones duras tales como altas temperaturas y pHs extremos (Wyman CE et al. 2005 Bioresour Technol 96:1959; Mosier N et al. 2005 30 Bioresour Technol 96: 673).
Estas condiciones causan degradación de azúcar y suponen una producción de azúcar reducida y formación de compuestos de fermentación tóxicos, de forma que se requieren pasos adicionales costosos de detoxificación, separación y neutralización, al igual que un equipo de capital inicial costoso.
35
[0004] Costes de pretratamiento, costes altos de cargas de enzima exógena, bajos índices de hidrólisis y un suministro limitado de enzimas son también una preocupación para la comercialización de procesos que implican la biomasa lignocelulósica.
Resumen 40
[0005] Las formas de realización de la invención se presentan aquí en las reivindicaciones.
En un aspecto, la invención se refiere a un método para la producción de azúcares solubles de material vegetal modificado.
El método incluye pretratamiento mediante la mezcla del material vegetal modificado con una formulación de 45 reducción a pasta para formar una mezcla.
El material vegetal modificado incluye una primera secuencia de polinucleótidos que codifica una primera proteína seleccionada del grupo que consiste en: una xilanasa, una endoglucanasa, una exoglucanasa, una feruloil esterasa, una xilanasa modificada de inteína, una endoglucanasa modificada de inteína, una exoglucanasa modificada de inteína y una feruloil esterasa modificada de inteína. 50
El método también incluye la provisión de condiciones de hidrólisis.
[0006] En un aspecto, la invención se refiere a una planta modificada.
La planta modificada incluye una primera secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia de aminoácido con al menos un 90 % de identidad con una primera secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste 55 en: SEC ID n.º: 1, SEC ID n.º: 2, SEC ID n.º: 3, SEC ID n.º: 4, SEC ID n.º: 5, SEC ID n.º: 6, SEC ID n.º: 7, SEC ID n.º: 8, SEC ID n.º: 9, SEC ID n.º: 10 y SEC ID n.º: 11.
[0007] En un aspecto, la invención se refiere a un casete de expresión.
El casete de expresión incluye una primera secuencia de polinucleótidos capaz de la hibridación bajo condiciones de 60 astringencia moderada a un ácido nucleico que consiste en una primera secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 32, SEC ID n.º: 33, SEC ID n.º: 34, SEC ID n.º: 35, SEC ID n.º: 36, SEC ID n.º: 37, SEC ID n.º: 38 y SEC ID n.º: 39 [P77853:S158-30-108-35].
El casete de expresión también incluye una segunda secuencia de polinucleótidos capaz de la hibridación bajo condiciones de astringencia moderada a un ácido nucleico que consiste en una segunda secuencia de referencia 65 seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 32, SEC ID n.º: 33, SEC ID n.º: 34, SEC ID n.º: 35, SEC ID n.º:
36, SEC ID n.º: 37, SEC ID n.º: 38, SEC ID n.º: 39, SEC ID n.º: 40, SEC ID n.º: 41, SEC ID n.º: 42 y SEC ID: 43.
El SEC ID n.º seleccionado como la primera secuencia de referencia es diferente del SEC ID n.º seleccionado como la segunda secuencia de referencia.
[0008] En un aspecto, la invención se refiere a un casete de expresión. 5
El casete de expresión incluye una secuencia de polinucleótidos capaz de la hibridación bajo condiciones de astringencia moderada de un ácido nucleico que consiste en una secuencia de referencia seleccionada del grupo de secuencias que consiste en: SEC ID n.º: 52, SEC ID n.º: 53, SEC ID n.º: 54, SEC ID n.º: 55, SEC ID n.º: 56, SEC ID n.º: 57, SEC ID n.º: 58, SEC ID n.º: 59, SEC ID n.º: 60, SEC ID n.º: 61 y SEC ID n.º: 62.
10
[0009] En un aspecto, la invención se refiere a un vector de expresión.
El vector de expresión incluye una secuencia de polinucleótidos capaz de la hibridación bajo condiciones de astringencia moderada de un ácido nucleico que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 68, SEC ID n.º: 69, SEC ID n.º: 70, SEC ID n.º: 71, SEC ID n.º: 72, SEC ID n.º: 73, SEC ID n.º: 74, SEC ID n.º: 75, SEC ID n.º: 76, SEC ID n.º: 77, SEC ID n.º: 78, SEC ID n.º: 79, SEC ID n.º: 80, SEC ID n.º: 81, SEC ID 15 n.º: 82 y SEC ID n.º: 83.
Breve descripción de los dibujos
[0010] La siguiente descripción detallada de las formas de realización preferidas de la presente invención se 20 entenderá mejor cuando se lea conjuntamente con los dibujos anexos.
Con motivo de ilustrar la invención, en los disbujos se muestran formas de realización que son preferidas actualmente.
Sin embargo, se entiende que la invención no está limitada a las disposiciones precisas y mediaciones mostradas.
En los dibujos: 25
FIG. 1 es un diagrama de flujo del proceso que ilustra pasos de pretratamiento consolidado e hidrólisis de biomasa vegetal que expresa enzimas de degradación de pared celular.
Figuras 2A-2B ilustran rendimientos de glucosa (FIG.2A) y xilosa (FIG.2B) a partir de una xilanasa de expresión de planta transgénica pretratada A (XynA.2015.05) y una planta de control transgénica carente de xilanasa A (TGC.4000.12) después de la hidrólisis enzimática con cóctel enzimático #5 (FCt; gris (barra mediana de cada 30 conjunto de tres)); o el cóctel enzimático #5 carente de xilanasa (Ct-Xyn; estrías diagonales (derecha)); o ninguna de las enzimas (NCt; blanca (izquierda)).
Figuras 3A-3B ilustran rendimientos de glucosa (FIG.3A) y xilosa (FIG.3B) a partir de una planta transgénica pretratada que expresa xilanasa B (XynB. 2063.17) y una planta de control de tipo salvaje pretratada (AxB) después de hidrólisis enzimática con cóctel enzimático #1 (FCt; gris (medio)); o el cóctel enzimático #1 carente 35 de xilanasa (Ct-Xyn; estrías diagonales (derecha)), o ninguna de las enzimas (NCt; blanca (izquierda)).
FIG. 4 ilustra rendimientos de glucosa de plantas transgénicas pretratadas que expresan endoglucanasa (EG) después de la hidrólisis enzimática con cóctel enzimático #1 (FCt; gris (medio)), o el cóctel enzimático #1 carente de endoglucanasa (Ct-EG(derecha)), o ninguna de las enzimas (NCt; blanca (izquierda)).
FIG. 4A ilustra el rendimiento de glucosa de plantas transgénicas que expresan endoglucanasa A (EGA.2049.02 40 y EGA.2049.10) y una planta de control transgénica carente de endoglucanasa (TGC.4000.12). FIG. 4B ilustra el rendimiento de glucosa a partir de una planta transgénica que expresa endoglucanasa B (EGB2042.03) y una planta de control transgénica carente de endoglucanasa (TGC.2004.8.02).
Figuras 5A-5D ilustran resultados de hidrólisis con plantas transgénicas que expresan proteínas múltiples.
Figuras 5A y 5C ilustran rendimientos de glucosa y las figuras 5B y 5D ilustran rendimientos de xilosa de plantas 45 de prueba transgénicas y las plantas de control transgénicas con cóctel #1.
Las Figuras 5A y 5B ilustran resultados con 1) plantas transgénicas de pila doble XynA/AccA/B.2096.05 y XynA/AccA/B.2096.01, que expresan xilanasa A (XynA) y enzimas accesorias (acc) y 2) una planta de control transgénica TGC.2004.8.02 en tratamientos con un cóctel de enzima completo (FCt; gris oscuro (medio)), un cóctel completo carente de xilanasa (FCt-Xyn; barras rayadas (derecha)) y ninguna de las enzimas (NCt; barras 50 blancas (izquierda)).
Figuras 5C y 5D ilustran resultados con 1) una planta transgénica EGA/XynA.2242.09 que expresa XynA y EGA y 2) una planta de control transgénica TGC.4000.12 en tratamientos con un cóctel de enzima completo (FCt; gris oscuro (barra izquierda de las cuatro para cada muestra)), un cóctel completo carente de xilanasa (Ct-Xyn; estrías diagonales (segunda de la izquierda)), un cóctel completo carente de endoglucanasa (Ct-EG; blanca 55 (tercero de la izquierda)) y un cóctel completo carente de xilanasa y endoglucanasa (Ct-Xyn-EG; cuadros (cuarto de la izquierda)).
Figuras 6A-6B ilustran rendimientos de glucosa y xilosa, respectivamente, desde el forraje de la planta de control tipo salvaje pretratada AxB y las plantas de maíz transgénico XynB/EGA/CBHB.2349.56; XynB/EGA/CBHB.2349.55, y XynB/EGA/CBHA.2345.116, que expresan proteínas apiladas triples. 60
Los rendimientos fueron medidos después de la hidrólisis enzimática con el cóctel enzimático Accelerase® de 1500/XY (FCt; barras negras (derecha)) en comparación con un tratamiento de control que carece del cóctel enzimático (NCt; barras gris (izquierda)).
Figuras 7A-7B ilustran rendimientos de glucosa y xilosa, respectivamente, de plantas transgénicas.
FIG. 7A muestra rendimientos de glucosa de plantas de pasto varilla transgénicas pretratadas que expresan 65 xilanasa A (XynA.pv2015.3c; XynA.pv2015.4c) y una planta de pasto varilla de tipo salvaje pretratada (Alamo)
después de la hidrólisis enzimática con el cóctel enzimático #1 (FCt; gris (medio)); el cóctel #1 carente de xilanasa (Ct-Xyn; estrías diagonales (derecha)); y un tratamiento de control que carece del cóctel enzimático (NCt; blanco (izquierda)).
FIG. 7B muestra los resultados de rendimientos de xilosa a partir de una planta transgénica de primera generación pretatada A que expresa xilanasa (XynA.2015.05.T0), una planta transgénica de segunda 5 generación que expresa xilanasa A (XynA.2015.05.T1) y una planta transgénica pretratada carente de xilanasa (TGC.4000.11) después de la hidrólisis enzimática con el cóctel enzimático #1 (FCt; gris (medio)); el cóctel #1 carente de xilanasa (Ct-Xyn; estrías diagonales (derecha)); y un tratamiento de control que carece de cóctel enzimático (NCt; blanca (izquierda)).
Figuras 8A-8B ilustran rendimientos de glucosa y xilosa, respectivamente, de dos plantas de pasto varilla 10 transgénicas pretratadas que expresan xilanasa A (XynA.pv2015.3c y XynA.pv2015.4c) en comparación con una planta de pasto varilla no transgénica de control (Alamo) después de la hidrólisis enzimática con cóctel enzimático #1 (FCt; gris (medio)); cóctel enzimático #1 carente de xilanasa (Ct-Xyn; estrías diagonales (derechas)) y un tratamiento de control que carece del cóctel enzimático (NCt; blanca (izquierda)).
Figuras 9A-9B ilustran rendimientos de glucosa y xilosa, respectivamente, a partir de una planta transgénica 15 pretratada (iXynA.2229.110) que expresa XynA modificada de inteína (iXynA) y una planta de control de tipo salvaje pretratada (AxB) después de la hidrólisis enzimática con cóctel enzimático #1(FCt; gris (medio)); cóctel enzimático #1 carente de xilanasa (Ct-Xyn; estrías diagonales (derecha)) y un tratamiento de control que carece del cóctel enzimático (NCt; blanca (derecha)).
FIG. 10 ilustra el curso temporal del rendimiento de glucosa de hidrólisis enzimática de una planta transgénica 20 pretratada que expresa xilanasa A (XynA.2015.5T1 triángulo cerrado), y una planta transgénica pretratada que expresa xilanasa B (Xyn B.2063.17 círculo cerrado) contra una planta de control transgénica (TGC.2004.8.02 cuadrado abierto) que usa un cóctel enzimático #1.
FIG. 11 ilustra el curso temporal de rendimiento de glucosa de hidrólisis enzimática de una planta transgénica pretratada (EGA.2049.10) y un control transgénico pretratado (TGC.4000.11) que usa un cóctel enzimático #1 25 (EGA.2049.10.FCt, cuadrado cerrado; TGC.4000.11.FCt, diamante abierto) y el cóctel enzimático #1 cerente de endoglucanasa (EGA.2049.10.Ct-EG, triángulo cerrado; TGC.4000.11.Ct-EG, círculo abierto).
Figuras 12A-12B ilustran cursos temporales del rendimiento de glucosa de hidrólisis enzimática de una planta transgénica pretratada (EGA/XynA.2242.09) y una planta de control transgénica pretratada (TGC.4000.11) utilizando el cóctel de enzima completo (EGA/XynA.2242.09.FCt, cuadrado cerrado; TGC.4000.11.FCt, diamante 30 abierto) en comparación con tratamientos que utilizan el cóctel enzimático completo carente de endoglucanasa (EGA/XinA.2242.09.Ct-EG, círculo cerrado; TGC.4000.11.Ct-EG, círculo abierto inFIG. 12A) y el cóctel de enzima completo carente de xilanasa (EGA/XinA.2242.09.Ct-Xin, círculo cerrado; TGC.4000.11.Ct-Xin, círculo abierto).
Figuras 13A-13B ilustran cursos temporales de rendimientos de glucosa y xilosa, respectivamente, a partir de 35 una planta transgénica pretratada que expresa xilanasa A y feruloil esterasa B (XynA/AccB.2092.103) y una planta de control transgénica pretratada (TGC.4000.11) después de la hidrólisis enzimática con el cóctel enzimático completo (XynA/AccB.2092.103.FCt, cuadrado cerrado; TGC.4000.11.FCt, diamante abierto) y el cóctel enzimático completo carente de xilanasa (XynA/AccB.2092.103.Ct-Xyn, triángulo cerrado; TGC.4000.11.Ct-Xyn, círculo abierto). 40
FIG. 14 ilustra rendimientos de glucosa de hidrólisis enzimática de plantas transgénicas pretratadas que expresan las proteínas siguientes: xilanasa B (XynB.2063.17), endoglucanasa (EGA.2049.10), xilanasa A y feruloil esterasa B (XynA/Acc.B.2092.103), xilanasa A y endoglucanasa (EGA/XynA.2242.09), xilanasa modificada de inteína A (iXynA.2229.110) en comparación con una planta de control no transgénica (AxB) y una planta de control transgénica carente de enzimas (TGC.4000.11). Pretratamientos fueron realizados a 45 temperaturas de 65 °C (PT_65) y 75°C (PT_75).
Carga de enzima incluye 0,2 ml de Accellerase® 1500 o 0,1 ml de Accellerase® XY por gramo de biomasa y 0,05 µM de -glucosidasa (BGL).
Las barras sobre cada uno de los pretratamientos PT 65 y PT 75 establecen datos presentes para las plantas transgénicas y de control de izquierda a derecha como sigue: AxB; TGC.4000.11 XynA.2015.05T1 50 XynB.2063.17 XynA/AccB.2092.103 iXynA.2229.110 EGA.2049.10 y XynA/EGA.2242.09.
FIG. 15 ilustra rendimientos de glucosa de hidrólisis enzimática de pasto varilla transgénico pretratado (EGC.2253.4b, círculo cerrado) y un pasto varilla tipo salvaje (Alamo, cuadrado abierto) con cóctel enzimático #5.
Temperaturas de pretratamiento: 65 °C, 75 °C y 95 °C. 55
FIGS.16A-16B ilustran un efecto de una temperatura de pretratamiento y tiempo en rendimientos de glucosa (FIG. 16A) y xilosa (FIG. 16B) de hidrólisis enzimática de una planta transgénica pretratada que expresa endoglucanasa y xilanasa A (EGA/XynA.2342.105 barras negras (derecha)) y una planta de control pretratada (TGC.2342.01 barras grises (izquierda)).
Figuras 17A-17B ilustran un efecto de una temperatura de pretratamiento en los rendimientos de glucosa (FIG. 60 17A) y xilosa (FIG. 17B) de las plantas transgénicas pretratadas EGA/XynA.2242.09.01 y EGA/XynA.2242.09.07 que expresan endoglucanasa A y xilanasa A, y las plantas de control: AxB tipo salvaje y transgénico TGC.4000.11.
FIG. 18 ilustra un efecto de reducción de la carga de enzimas externas en rendimientos de glucosa de las plantas transgénicas pretratadas XynA.2015.05T1 (círculo cerrado), XynB.2063.17 (triángulo cerrado) y planta 65 de control TGC.2004.8.04 (cuadrado cerrado) después de la hidrólisis con las cargas enzimáticas decrecientes:
cóctel completo #1 (FCt), 75 % cóctel completo #1 (0,75 FCt), 50% cóctel completo #1 (0,50FCt), 25% cóctel completo #1 (0,25FCt), 10% cóctel completo #1 (0,10FCt) y ninguna de las enzimas (0FCt).
FIG. 19 ilustra un efecto de la reducción de cargas de enzimas externas en el rendimiento de glucosa de las plantas transgénicas XynE/EGC/CBHA.2339.03; XynE/EGC/CBHA.2339.04 y XynE/EGC/CBHA.2339.05, y la planta de control BxA. 5
Pretratamiento fue realizado utilizando 0,17 M de amonio bisulfito y carbonato amónico (pH 8,1) a 75 °C, a una proporción líquido a sólido igual a 10 durante 16 horas.
Hidrólisis enzimática fue conducida a aproximadamente 2 % de contenido de sólidos sin enzimas (NCt; blanco (izquierda)), 20 % de cóctel completo (0,2FCt; gris (medio)) y cóctel completo de Accellerase ®1500/XY a 0,2ml/0,1 ml de forraje por gramo (FCt; negro (derecha)) a 50 °C y pH 5,0 para un periodo de 3 días. 10
Figuras 20A-20B ilustran rendimientos de glucosa y xilosa, respectivamente, de plantas pretratadas que expresan xilanasa A y endoglucanasa (Xyn A/EGA.2309.54 y XynA/EGA2309.107) en comparación con una planta de control no transgénica pretratada (BxA) después de la hidrólisis enzimática con una plena carga del cóctel enzimático de Accelerase ®1500/XY (FCt; negra (derecha)), un 20 % de carga del cóctel (0,2FCt; gris (medio de la FIG. 20A y derecha de la FIG. 20B)) y ninguna de las enzimas (NCt; blanco (izquierda de la FIG. 15 20A)).
Figuras 21A-21B ilustran un efecto de la reducción de cargas de enzimas externas en rendimientos de glucosa (FIG. 21A) y xilosa (FIG. 21B) de las plantas transgénicas EGA/XynA.2242.09.16; CBHA.2069.01.03 y la planta de control TGC.4000.11 después de la hidrólisis enzimática con el cóctel completo a 0,2 ml de Accellerase® 1500 por gramo de forraje + 0,1ml de Accellerase® XY por gramo de forraje), 80 % de cóctel completo: 0,16 ml 20 de Accellerase® 1500 por gramo de forraje + 0,08 ml Accellerase® XY por gramo de forraje (0,8FCt), 60 % de cóctel completo: 0,12 ml de Accellerase® 1500 por gramo de forraje + 0,06 ml de Accellerase® XY por gramo de forraje (0,6FCt), 40 % de cóctel completo: 0,08 mL de Accellerase® 1500 por gramo de forraje + 0,04 mL de Accellerase® XY por gramo de forraje (0,4FCt), 20 % de cóctel completo: 0,04 mL de Accellerase® 1500 por gramo de forraje + 0,02 mL de Accellerase® XY por gramo de forraje (0,2FCt) y ninguna de las enzimas (0FCt). 25
FIG. 22 ilustra la producción de etanol de sacarificación simultánea y fermentación (SSF) de plantas transgénicas pretratadas EGA.2049.10 y EGA/XynA.2242.09 contra las plantas de control utilizando 1) cócteles enzimáticos Accellerase® 1500 y Accellerase® XY; y 2) rendimientos de cepa Saccharomyces cerevisiae D5A.
FIG. 23 ilustra la solubilización de biomasa basada en pérdida de peso en una planta transgénica que expresa exoglucanasa CBHA (CBHA.2069.3.17 blanco) y planta de control de tipo silvestre (AxB; gris). 30
Figuras 24A-24B ilustran el rendimiento de ácido acético (HAc) a partir de una planta de control no transgénica (AxB; FIG. 24A) y una planta transgénica que expresa exoglucanasa CBHA (CBHA.2063.3.17 FIG. 24B).
Los tratamientos fueron realizados a 75 °C durante 16 horas (blanca (izquierda)); 85 °C durante 7 horas (barras rayadas (medio)) y 95 °C (cuatros (derecha)).
Figuras 25A-25B ilustran el rendimiento de productos de degradación de azúcar de hidroximetilfurfural (HMF) y 35 furfural a partir de una planta de control no transgénica (AxB; FIG. 25A) y una planta transgénica CBHA que expresa exoglucanasa (CBHA.2063.3.17). Los tratamientos indicados por barras blancas, rayadas o a cuadros fueron de la siguiente manera de izquierda a derecha: blanca, HMF 75°C durante 16 horas; rayada, HMF_85 °C durante 7 horas; a cuadros, HMF_95 °C durante 16 horas; rayada, Furfural_95 °C durante 16 horas).
FIG. 26 ilustra el rendimiento de xilosa a partir de una planta transgénica que expresa xilanasa B solo 40 (XynB.2063.15), una de planta transgénica que expresa xilanasa A y dos enzimas accesorias A y B (XynA/AccA/B.2096.1) y una planta de control no transgénica (peso AxB) seguida del pretratamiento con 0,17M de bisulfito de amonio y carbonato amónico (BSC; pH 8,1) y autohidrólisis.
Rendimiento de xilosa fue evaluado para xilosa como un monómero (negro (derecha)) y xilosa como oligosacárido (gris (izquierda)). 45
FIG. 27 ilustra rendimientos de xilosa de dos plantas transgénicas que expresan xilanasa B, endoglucanasa y CBHB (XynB/EGA/CBHB.2349.56 y XynB/EGA/CBHB.2349.55), una planta transgénica que expresa xilanasa B, endoglucanasa y CBHA (XynB/EGA/CBHA.2345.116) y una planta de control no transgénica (AxB) seguida del pretratamiento con 0,17M de amonio bisulfito y 0,165M de carbonato amónico (BSC; pH 8,1) y autohidrólisis
Figuras 28A - 28B ilustran rendimientos de glucosa y xilosa, respectivamente, de plantas transgénicas 50 pretratadas que usan Accellerase® XY.
EGA/XynA.2242.09T (círculo cerrado) expresó simultáneamente endoglucanasa y xilanasa A y la planta de control transgénica fue TGC.4000 (cuadrado cerrado).
Figuras 28C-28D muestran, respectivamente, rendimientos de glucosa y xilosa de XynB/EGA/CBHB.2349.55 (círculo abierto), XynB/EGA/CBHB.2349.229 (triángulo cerrado, punto arriba), y XynB/EGA/CBHB.2349.56 55 (triángulo cerrado, punto abajo), cada uno de los cuales expresó simultáneamente endoglucanasa A, xilanasa B y celobihidrolasa B, e iXynA.2329.14, que expresó xilanasa modificada de inteína A y una planta de control tipo salvaje AxB.
Descripción detallada de las formas de realización preferidas 60
[0011] Determinada terminología se usa en la siguiente descripción solo por conveniencia y no es limitativa.
Las palabras "derecha", " izquierda", "arriba" y "abajo" designan direcciones en los dibujos a los que se hace referencia.
Las palabras "un" y "uno," como se usan en las reivindicaciones y en las partes correspondientes de la 65 especificación se definen como que incluyen uno o más de los elementos referenciados a menos que
específicamente se declare de otro modo.
Esta terminología incluye las palabras arriba específicamente mencionadas, derivadas de las mismas y palabras de importancia similar.
La frase "al menos uno" seguida de una lista de dos o más elementos, tal como "A, B, o C" significa cualquiera individual de A, B o C, así como cualquier combinación de los mismos. 5
[0012] Formas de realización aquí proporcionan tecnologías para expresar un portfolio de proteínas (CWD) de degradación de pared celular en una planta.
Las proteínas CWD pueden ser enzimas CWD o formas modificadas de las enzimas CWD.
Las formas modificadas pueden ser proteínas CWD modificada de inteína. 10
La planta puede ser de maíz, sorgo, pasto varilla u otra planta.
Formas de realización aquí proporcionan una biomasa vegetal de cosecha con proteínas CWD en planta para su uso como una materia prima en la producción de azúcar.
La expresión de enzima en planta usa la planta como una "fábrica" antes que la fermentación microbiana para producir enzimas CWD industriales. 15
Esta estrategia tiene la ventaja de proporcionar las proteínas directamente a las materias primas de biomasa para la producción de azúcar fermentable.
La biomasa vegetal transgénica con rasgos hidrolíticos no puede requerir pretratamientos fuertes para mejorar la accesibilidad de pared celular de celulosa a enzimas exógenas.
La expresión de diferentes clases de proteínas CWD en una planta única puede crear una plataforma de azúcar de 20 coste bajo para producción biocombustible y bioquímica.
Formas de realización aquí proporcionan métodos para producir azúcares solubles utilizando un pretratamiento químico moderado de biomasa lignocelulósica derivada de plantas genéticamente modificadas para incluir uno o más tipos de una proteína CWD.
25
[0013] Una forma de realización proporciona un método para la producción de azúcares solubles de material vegetal modificado.
El método puede incluir el pretratamiento del material vegetal modificado mediante la mezcla con una formulación de reducción a pasta para formar una mezcla.
El material vegetal modificado puede incluir una primera secuencia de polinucleótidos que codifica una primera 30 proteína.
La primera proteína puede ser una enzima CWD.
La primera proteína puede ser una enzima CWD modificada de inteína.
La primera proteína puede ser una xilanasa, una endoglucanasa, una exoglucanasa, una feruloil esterasa, una xilanasa modificada de inteína, una endoglucanasa modificada de inteína, una exoglucanasa modificada de inteína o 35 una feruloil esterasa modificada de inteína.
La primera proteína puede ser capaz de la hidrolización de un componente del material vegetal modificado.
Ser capaz de la hidrolización de un componente significa que la primera proteína cataliza la hidrólisis del componente bajo condiciones de hidrólisis.
En el caso de una primera proteína modificada de inteína, ser capaz de hidrolizar un componente significa que 40 después de que la inteína se haya unido desde el péptido, la proteína puede hidrolizar el componente bajo condiciones de hidrólisis.
El método puede incluir además la provisión de condiciones de hidrólisis.
Las condiciones de hidrólisis se pueden adecuar a la hidrolización del componente.
45
[0014] El material vegetal modificado puede incluir además una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica una segunda proteína.
La segunda proteína puede ser una proteína CWD.
La segunda proteína puede ser una proteína CWD modificada de inteína.
La segunda proteína puede ser una xilanasa, una endoglucanasa, una exoglucanasa, una feruloil esterasa, una 50 xilanasa modificada de inteína, una endoglucanasa modificada de inteína, una exoglucanasa modificada de inteína o una feruloil esterasa modificada de inteína.
La proteína seleccionada como la segunda proteína puede ser diferente de la proteína seleccionada como la primera proteína.
La segunda proteína puede ser capaz de la hidrolización de un componente del material vegetal modificado. 55
Ser capaz de la hidrolización de un componente significa que la segunda proteína cataliza la hidrólisis del componente bajo condiciones de hidrólisis.
En el caso de una segunda proteína modificada de inteína, ser capaz de hidrolizar un componente significa que después de la inteína se haya desde el péptido, la proteína puede hidrolizar el componente bajo condiciones de hidrólisis. 60
[0015] El material vegetal modificado puede incluir además una tercera secuencia de polinucleótidos que codifica una tercera proteína.
La tercera proteína puede ser una proteína CWD.
La tercera proteína puede ser una proteína CWD modificada de inteína. 65
La tercera proteína puede ser una xilanasa, una endoglucanasa, una exoglucanasa, una feruloil esterasa, una
xilanasa modificada de inteína, una endoglucanasa modificada de inteína, una exoglucanasa modificada de inteína, o una feruloil esterasa modificada de inteína.
La proteína seleccionada como la tercera proteína puede ser diferente de la proteína seleccionada como la primera proteína.
La proteína seleccionada como la tercera proteína puede ser diferente de la proteína seleccionada como la segunda 5 proteína.
La tercera proteína puede ser capaz de la hidrolización de un componente del material vegetal modificado.
Ser capaz de la hidrolización de un componente significa que la tercera proteína cataliza la hidrólisis del componente bajo condiciones de hidrólisis.
En el caso de una tercera proteína modificada de inteína, ser capaz de hidrolizar un componente significa que 10 después de que la inteína se haya unido desde el péptido, la proteína puede hidrolizar el componente bajo condiciones de hidrólisis.
[0016] El material vegetal modificado se refiere a una planta transgénica, progenie de una planta transgénica, un descendiente de una planta transgénica o una parte de cualquiera de las anteriormente mencionadas. 15
El material vegetal modificado puede incluir una enzima de degradación de pared celular, que no se produce naturalmente en la planta o un gen que codifica el mismo.
El material vegetal modificado puede ser una planta transgénica que expresa una proteína CWD o cualquier parte de la planta transgénica.
El material vegetal modificado puede ser cualquier planta transgénica que expresa una forma modificada de una 20 proteína CWD o cualquier parte de la planta transgénica.
La planta transgénica puede ser de cualquier tipo de planta.
El tipo de planta de planta transgénica puede ser pero no está limitado a maíz, remolacha azucarera, azúcar de caña, sorgo, pasto varilla, miscanthus, eucalipto, sauce o álamo.
El material vegetal modificado puede ser una planta transgénica entera o partes de la planta. 25
Las partes pueden ser pero de forma no limitativa hojas, tallos, flores, capullos, pétalos, ovarios, frutos o semillas.
El material vegetal modificado puede ser callo a partir de una planta transgénica.
El material vegetal modificado se puede regenerar de partes de una planta o plantas transgénicas.
El material vegetal modificado puede ser un producto de cruce sexual de una primera planta transgénica y una segunda planta transgénica o una planta no transgénica donde la planta de producto retiene una secuencia de 30 polinucleótidos introducida en la primera planta transgénica.
La planta transgénica puede ser cualquiera de las plantas transgénicas proporcionadas aquí.
La planta transgénica puede incluir aquí cualquier vector, casete de expresión o ácido nucleico aislado o fragmento de los mismos.
35
[0017] Se puede realizar la mezcla del material vegetal modificado con una formulación de reducción a pasta por cualquier combinación de la planta madre modificada con la formulación de reducción a pasta.
La mezcla se puede realizar por agitación.
[0018] La formulación de reducción a pasta puede ser una sustancia que descompone la lignina, que enlaza unidas 40 las fibras de lignocelulosa dentro del material vegetal lignocelulósico.
La sustancia puede descomponer lignina sin degradar seriamente las fibras de lignocelulosa.
El pretratamiento puede llevar a una liberación parcial de enzimas expresadas en las plantas genéticamente modificadas y degradación parcial de lignina dentro del material vegetal lignocelulósico.
45
[0019] El método puede incluir la activación de una proteína CWD antes, durante o después del pretratamiento.
El método puede incluir la activación de una proteína CWD antes, durante o después de la provisión de condiciones de hidrólisis.
La proteína CWD siendo activada puede ser una primera proteína, segunda proteína o tercera proteína, o cualquier enzima de tratamiento de lignocelulosa adicional. 50
Una proteína CWD se puede modificar para incluir una inteína.
La inteína se puede fusionar a la enzima CWD en un extremo de la enzima o en la enzima.
La inteína puede ser inducible para la unión proporcionando condiciones de inducción.
Las condiciones de inducción pueden ser una temperatura particular de la mezcla.
Las condiciones de inducción pueden ser una temperatura proporcionada antes, durante o después de una de la 55 pretratación o provisión de pasos de hidrólisis.
Las enzimas modificadas de inteína y condiciones para la unión de inducción de las inteínas, que podría usarse como condiciones de activación, se describieron en EEUU Appln. 10/886,393 filed July 7, 2004 and PCT/US10/55746 filed November 5, 2010, and PCT/US10/55669 filed November 5, 2010 y PCT/US10/55751 filed November 5, 2010, que son incorporados aquí por referencia como se ha expuesto detalladamente. 60
[0020] El componente puede ser cualquier fracción deseada para el tratamiento.
El componente puede ser material lignocelulósico.
El componente puede ser el sustrato para cualquier proteína CWD enumerada aquí.
El componente puede ser el sustrato para una xilanasa, una endoglucanasa, una exoglucanasa, una feruloil 65 esterasa.
El componente puede ser una fracción que incluye un sustrato para cualquier proteína CWD enumerada aquí.
El componente puede ser una fracción que incluye un sustrato para una xilanasa, una endoglucanasa, una exoglucanasa, una feruloil esterasa.
[0021] El método también puede incluir la adición de otro material vegetal antes, durante o después de la mezcla, 5 pretratamiento o provisión de condiciones de hidrólisis.
Otro material vegetal puede ser cualquier biomasa vegetal, material celulósico o lignocelulósico diferente del material vegetal modificado.
El otro material vegetal puede ser de biorefinerías.
Otro material vegetal puede incluir silvicultura y residuos agrícolas. 10
La silvicultura y residuos agrícolas pueden ser, pero de forma no limitativa, forrajes de maíz, bagazos, paja de trigo, madera residual, recortes forestales, papel de desecho y residuos sólidos municipales (MSW).
Otro material vegetal puede ser cualquier planta de cultivo de energía.
La planta de cultivo de energía puede ser, pero no está limitada a, pasto varilla, sorgo, remolacha azucarera, azúcar de caña, miscanthus y álamo. 15
[0022] Una secuencia de polinucleótidos que codifica una primera proteína, una segunda proteína, una tercera proteína o cualquier enzima adicional puede estar operativamente conectada a una secuencia reguladora.
En este contexto, operativamente conectado significa que el elemento regulador imparte su función a la secuencia de polinucleótidos. 20
En el caso de un elemento regulador que es un promotor, el promotor es capaz de controlar la expresión de la secuencia de polinucleótidos cuando estos están conectados operativamente.
En el caso de un elemento regulador que es un terminador, el terminador es capaz de la transcripción terminante desde la secuencia de polinucleótidos.
Ejemplos no limitativos de elementos reguladores se proporcionan abajo. 25
[0023] Al menos una de la primera proteína, la segunda proteína o la tercera proteína puede ser pero no está limitada a una enzima seleccionada de XynA: Beta-1,4-xilanasa 229B de Dictyoglomus thermophilum (registro de Uniprot P77853); XynB: endo-1,4-beta-xilanasa de Thermomyces lanuginosus (registro de Uniprot 043097); EGA: Endo-beta 1,4-endoglucanasa de Nasutitermes takasagoensis (registro de Uniprot 077044); EGB: Endo-beta 1,4-30 endoglucanasa de Acidothermus cellulolyticus (registro de Uniprot P54583); AccA: feruloil esterasa A de Apergillus niger (registro de Uniprot 042807); AccB: feruloil esterasa B de Aspergillus niger (número de registro de Uniprot Q8WZI8); AccA/B: feruloil esterasa A y feruloil esterasa B de Aspergillus niger; EGC: Endo-beta 1,4-endoglucanasa de Rhodothermus marinus (registro de Uniprot 033897); P40942: Beta-1,4-xilanasa de Clostridium stercorarium F9 (número de registro de Uniprot P40942); P40943: Beta-1,4-xylanase de Geobacillus stearothermophilus T-6 (Bacillus 35 stearothermophilus; Uniprot número de registro P40943); O30700: Beta-1,4-xilanasa de especie Bacillus.
NG-27(Uniprot número de registro 030700); CBHA: celobiohidrolasa A de Clostridium thermocellum (número de registro de Uniprot 068438); CBHB: celobiohidrolasa B (SYT BD22308); o XynE: xilanasa (EU591743).
[0024] La primera proteína puede incluir, constar esencialmente de o constar de una secuencia de aminoácidos con 40 al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 1[WT P77853], SEC ID n.º: 2 [AnfaeA], SEC ID n.º: 3 [AnfaeB], SEC ID n.º: 4 [NtEGm], SEC ID n.º: 5 [EU591743], SEC ID n.º: 6 [043097], SEC ID n.º: 7 [P77853:T134-100-101], SEC ID n.º: 8 [P77853:S158-30-108-35], SEC ID n.º: 9 [O33897], SEC ID n.º: 10 [O68438] y SEC ID n.º: 11 [P54583].
La primera proteína puede incluir, consta esencialmente de o consta de una secuencia de aminoácidos con al 45 menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la secuencia de referencia de SEC ID: 12 [BD22308].
[0025] La segunda proteína puede incluir o constar esencialmente de o constar de una secuencia de aminoácidos con al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con una segunda secuencia de referencia 50 seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 1[WT P77853], SEC ID n.º: 2 [AnfaeA], SEC ID n.º: 3 [AnfaeB], SEC ID n.º: 4 [NtEGm], SEC ID n.º: 5 [EU591743], SEC ID n.º: 6 [O43097], SEC ID n.º: 7 [P77853:T134-100-101], SEC ID n.º: 8 [P77853:S158-30-108-35], SEC ID n.º: 9 [O33897], SEC ID n.º: 10 [O68438], y SEC ID n.º: 11 [P54583].
La segunda proteína puede incluir, constar esencialmente de o constar de una secuencia de aminoácidos con al 55 menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la secuencia de referencia de SEC ID: 12 [BD22308].
[0026] La tercera proteína puede incluir, constar esencialmente de o constar de una secuencia de aminoácidos con al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con una tercera secuencia de referencia 60 seleccionada del grupo que consiste en SEC ID n.º: 1[WT P77853], SEC ID n.º: 2 [AnfaeA], SEC ID n.º: 3 [AnfaeB], SEC ID n.º: 4 [NtEGm], SEC ID n.º: 5 [EU591743], SEC ID n.º: 6 [043097], SEC ID n.º: 7 [P77853:T134-100-101], SEC ID n.º: 8[P77853:S158-30-108-35], SEC ID n.º: 9 [O33897], SEC ID n.º: 10 [O68438] y SEC ID n.º: 11 [P54583].
La tercera proteína puede incluir, constar esencialmente de o constar de una secuencia de aminoácidos con al menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la secuencia de referencia 65 de SEC ID: 12 [BD22308].
[0027] Al menos una de la primera secuencia de polinucleótidos, la segunda secuencia de polinucleótidos o la tercera secuencia de polinucleótidos puede incluir además una primera secuencia de polinucleótido diana que codifica un péptido diana respectivo.
Para material vegetal modificado que carece de la tercera secuencia de polinucleótidos, una primera secuencia de 5 polinucleótido diana se puede incluir en al menos una de la primera secuencia de polinucleótidos o la segunda secuencia de polinucleótidos.
Para material vegetal modificado que carece de la segunda secuencia de polinucleótidos y la tercera secuencia de polinucleótidos, una primera secuencia de polinucleótido diana se puede incluir en la primera secuencia de polinucleótidos. 10
Cada péptido diana respectivo puede ser independientemente seleccionado para cada una de la primera, la segunda o la tercera secuencia de polinucleótidos.
Un péptido diana se puede fusionar con la primera proteína, la segunda proteína o la tercera proteína.
Cada péptido diana respectivo puede ser independientemente seleccionado de, pero no está limitado a una señal diana amiloplasto, un péptido diana de pared celular, un péptido diana mitocondrial, una señal de localización de 15 citosol, una señal diana cloroplasto, un péptido diana nuclear y un péptido diana vacuola.
[0028] Un primer polinucleótido diana puede estar aguas arriba de la primera secuencia de polinucleótidos, la segunda secuencia de polinucleótidos o la tercera secuencia de polinucleótidos.
Un péptido diana puede tener al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con una de SEC 20 ID n.º: 13 [BAASS], la secuencia de aleurona de cebada SEC ID n.º: 14 [HVAlePS], SEC ID n.º: 15 [PRla], SEC ID n.º: 16 [la secuencia de gamma-zeína xGZein27ss-02] o SEC ID n.º: 17 [Glu B4SP].
[0029] Una primera secuencia de polinucleótido diana en combinación con una de la primera secuencia de polinucleótidos, la segunda secuencia de polinucleótidos o la tercera secuencia de polinucleótidos juntas pueden 25 codificar una secuencia de aminoácidos con al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 18 [BAASS:P77853], SEC ID n.º: 19 [BAASS:O33897], SEC ID n.º: 20 [HVAlePS:NtEGm] y SEC ID n.º: 21 [BAAS:P77853:S158-30-108-35].
[0030] Al menos una de la primera secuencia de polinucleótidos, la segunda secuencia de polinucleótidos o la 30 tercera secuencia de polinucleótidos puede incluir además una segunda secuencia de polinucleótido diana que codifica un péptido carboxilo diana.
Para material vegetal modificado que carece de la tercera secuencia de polinucleótidos, una segunda secuencia de polinucleótido diana se puede incluir en al menos una de la primera secuencia de polinucleótidos o la segunda secuencia de polinucleótidos. 35
Para material vegetal modificado que carece de la segunda secuencia de polinucleótidos y la tercera secuencia de polinucleótidos, una segunda secuencia de polinucleótido diana se puede incluir en la primera secuencia de polinucleótidos.
Un péptido diana carboxilo se puede seleccionar de, pero no está limitado a la secuencia teniendo al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 de identidad con uno de SEC ID n.º: 22 [SEKDEL], el abreviado SEC ID n.º: 23 40 [KDEL] o la secuencia determinante de clasificación vacuolar de cebada SEC ID n.º: 24 [HvVSD-01].
Un péptido diana carboxilo se puede fusionar por lo menos con una de la primera proteína, la segunda proteína o la tercera proteína.
[0031] Al menos una de la primera proteína, la segunda proteína o la tercera proteína se puede proporcionar sin el 45 péptido diana para la acumulación en el citoplasma.
[0032] La primera secuencia de polinucleótido diana y la segunda secuencia de polinucleótido diana en combinación con una de la primera secuencia de polinucleótidos, la segunda secuencia de polinucleótidos o la tercera secuencia de polinucleótidos juntas puede codificar una secuencia de aminoácidos con al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 50 98, 99 o 100 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 25 [BAASS: AnfaeB: SEKDEL], SEC ID n.º: 26 [BAASS:AnfaeA:SEKDEL], SEC ID n.º: 27 [PR1a:NtEGm:SEKDEL], SEC ID n.º: 28 [BAASS: P77853:T134-100-101:SEKDEL], SEC ID n.º: 29 [HvAleSP:NtEGm:SEKDEL], SEC ID n.º: 30 [BAASS:O43097:SEKDEL] y SEC ID n.º: 31[xGZein27ss-02:BD22308:HWSD-O1].
55
[0033] Al menos una de la primera, la segunda o la tercera secuencia de polinucleótidos puede codificar una "variante" de una proteína CWD.
La secuencia de aminoácidos de una variante de una proteína CWD puede diferir por supresiones, adiciones, sustituciones de secuencias de aminoácidos u otras modificaciones de la proteína CWD.
Una variante de una proteína CWD puede mantener la actividad biológica de la proteína CWD. 60
Mantener la actividad biológica como se utiliza en este caso significa que la variante con al menos 60 % de la actividad de la proteína CWD de la que se deriva la actividad de una xilanasa se puede evaluar en un ensayo usando un sustrato AX xilazima como se describe en este caso en la subsección del ejemplo 1 aquí titulada "ensayo de enzima de forraje". La actividad de una endoglucanasa se puede evaluar usando el sustrato Cellazyme como se describe en este caso en la subsección del ejemplo 1 aquí titulada "ensayo de enzima de forraje". La actividad de 65 una exoglucanasa se puede evaluar usando un fluorescente 4-metilumbeliferil-b-D-lactopiranósido (4-MU) como se
describe en Harrison MD et al. 2011 "Accumulation of recombinant cellobiohidrolase and endoglucanase in the leaves of mature transgenic sugar cane," Plant Biotechnologi Journal 9: 884-896 y se incorporan aquí por referencia como se ha expuesto detalladamente.
La actividad de una feruloil esterasa se puede evaluar utilizando un ensayo usando ferulato marcado pNP como un sustrato (como se describe en Hegde S. et al. 2009 "Single-step synthesis of 4-nitrophenyl ferulate for 5 spectrophotometric assay of feruloyl esterases," Analytical Biochemistry 387(1): 128-129).
Las pruebas anteriormente mencionadas para la actividad de una xilanasa, endoglucanasa, exoglucanasa o feruloil esterasa se puede utilizar para determinar si una secuencia con menos del 100 % de identidad con una secuencia de proteína de degradación CWD aquí es una variante de la proteína de degradación CWD.
Variantes de una proteína CWD aquí se pueden modificar en la secuencia de aminoácidos contra la proteína CWD 10 basada en similitud en la hidrofobicidad, hidrofilicidad, solubilidad, polaridad de residuos de aminoácidos.
Variantes de una proteína CWD aquí pueden diferir después de las modificaciones postraduccionales.
La modificación postraduccional que difiere puede ser, pero de forma no limitativa, glicosilaciones, acetilaciones o fosforilaciones.
Una variante se puede desarrollar por cualquier medio. 15
Una variante se puede desarrollar mediante mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis no objetiva.
Se puede utilizar PCR con tendencia al error para crear mutantes de una proteína CWD aquí y cualquiera de los ensayos de arriba se puede utilizar para valorar si el mutante es una variante.
[0034] Formas de realización incluyen por lo menos una de la primera proteína, la segunda proteína o la tercera 20 proteína o variantes de las mismas fusionadas con variantes de al menos uno de un péptido diana, un péptido diana carboxilo.
Variantes de un péptido diana o un péptido diana carboxi dirigirá la proteína que se fusiona con a la misma ubicación como la secuencia de referencia para el péptido diana o péptido diana carboxi.
25
[0035] Variantes de inteína se pueden proporcionar en una primera proteína, una segunda proteína o una tercera proteína.
Una variante de inteína puede unirse desde la proteína donde es fusionada.
[0036] Para la determinación de la identidad en porcentaje de dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de 30 ácidos nucleicos pueden incluir la alineación y comparación de los residuos de aminoácidos o nucleótidos en posiciones correspondientes en las dos secuencias.
Si todas las posiciones en dos secuencias se ocupan por residuos de aminoácidos idénticos o nucleótidos luego las secuencias se dice que son 100 % idénticas.
La identidad en porcentaje se puede medir por el algoritmo de Smith Waterman (Smith TF, Waterman MS 1981 35 "Identification of Common Molecular Subsequences," J Mol Biol 147: 195 -197, que es incorporado aquí por referencia como se expone detalladamente).
[0037] En una forma de realización, una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína con menos del 100 % de identidad con la secuencia de referencia de aminoácido citada puede codificar una variante de la proteína que 40 tiene la secuencia de referencia de aminoácido.
En una forma de realización, una proteína con menos del 100 % de identidad con la secuencia de referencia de aminoácido citada puede ser una variante de la proteína que tiene la secuencia de referencia de aminoácido.
En una forma de realización, una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína que tiene menos del 100 % de identidad con la proteína codificada por la secuencia de referencia de ácido nucleico citada puede codificar una 45 variante de la proteína codificada por la secuencia de referencia.
[0038] En referencia a la FIG. 1, se ilustra un método para la producción de azúcares solubles de material vegetal modificado.
FIG. 1 representa un flujo de proceso para el pretratamiento consolidado e hidrólisis de material vegetal modificado. 50
El material vegetal modificado o material vegetal modificado mezclado con otro material vegetal se puede añadir mediante el alimentador 10 al reactor 20 para el pretratamiento químico y licuefacción enzimática; es decir, el proceso de conversión de biomasa lignocelulósica sólida a un estado licuado adecuado para otro tratamiento e hidrólisis.
En el reactor 20, el material vegetal modificado o material vegetal modificado mezclado con otro material vegetal se 55 puede mezclar con la formulación de reducción a pasta.
La formulación de reducción a pasta puede incluir al menos una fracción que tiene un ion seleccionado del grupo que consiste en: sulfito, bisulfito, sulfato, carbonato, hidróxido y óxido.
Al menos una fracción puede incluir además, pero no está limitada a un contraión seleccionado del grupo que consiste en: amonio, sodio, magnesio y calcio. 60
Al menos una fracción puede ser una sal.
Una sal puede ser pero no está limitada a un sulfito (SO32-), un bisulfito (HSO3-), un óxido (O2-) y un hidróxido (OH-).
La sal puede incluir un contraión.
Un contraión puede ser pero no está limitado a sodio (Na+), calcio (Ca2+), hidrógeno, potasio (K+), magnesio (Mg2+), y amonio (NH4+). 65
Una formulación de reducción a pasta puede incluir al menos uno de óxido de calcio (CaO), cal o hidróxido cálcico
(Ca(OH)2), cal agitada.
[0039] En una forma de realización, una formulación de reducción a pasta puede incluir al menos uno de bisulfito de amonio y carbonato amónico.
El bisulfito de amonio puede estar a una concentración de 0,02 M a 0,35 M y el carbonato amónico puede estar a 5 una concentración de 0,025 M a 0,25 M.
La formulación de reducción a pasta se puede mezclar con el material vegetal modificado o material vegetal modificado mezclado con otro material vegetal a una proporción de líquido a sólido óptima en una mezcla.
La mezcla puede tener una proporción líquido a sólido seleccionada del valor inferior a o igual a uno de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1, o cualquier valor en un rango entre dos cualquiera de los anteriormente mencionados (primero y 10 último incluidos).
Por ejemplo, la proporción líquido a sólido puede ser un valor menor de cualquier número entero o número no entero seleccionado de 3 a 7.
La proporción de líquido a sólido puede ser igual a 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1, o cualquier valor en un rango entre cualquiera de los anteriormente mencionados (primero y último incluidos). 15
Por ejemplo, la proporción líquido a sólido puede ser un valor igual a cualquier número entero o número no entero en el rango de 3 a 7.
[0040] El pretratamiento puede incluir la incubación de la mezcla para cualquier periodo de tiempo.
Pretratar puede incluir incubar la mezcla durante hasta 16 horas. 20
La incubación se puede realizar durante periodos de tiempo más largos o más cortos.
Pretratar puede incluir incubar la mezcla durante un periodo de menos o igual a uno de 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 hora(s).
[0041] El pretratamiento puede incluir proporcionar una temperatura de mezcla de 40 °C a 95 °C. 25
Una temperatura de mezcla de 40 °C a 95 °C puede permitir la rotura o eliminación de partes de lignina en el material lignocelulósico en la mezcla sin desactivar enzimas hidrolíticas.
Pretratar puede incluir proporcionar una temperatura de mezcla de 55 °C, 65 °C, 75 °C, 95 °C, menos de 55 °C, menos de 65 °C, menos de 75 °C, menos de 95 °C, menos de 100 °C, 40 °C a 55 °C, 40 °C a 65 °C, 40 °C a 75 °C, 40 °C a 95 °C, 40 °C a menos de 100 °C, 55 °C a 65 °C, 55 °C a 75 °C, 55 °C a 95 °C, 55 °C a menos del 100 °C, 65 30 °C a 75 °C, 65 °C a 95 °C, 65 °C a menos de 100 °C, 75 °C a 95 °C, 75 °C a menos de 100 °C o 95 °C a menos de 100 °C.
[0042] El pretratamiento puede incluir proporcionar un pH de mezcla que varía de 5,0 a 10.
Pretratar puede incluir proporcionar un pH de mezcla dentro de un rango de 6,5 a 8,5. 35
El pH de mezcla proporcionado puede ser 5.0, 5.5, 6.0, 7.0, 7.5, 8.0, 9.0, 9.5, o 10, o un pH dentro de un rango entre cualquiera de dos de los valores de pH anteriormente mencionados (primero y último incluidos).
El pH de la mezcla durante el pretratamiento puede depender del tipo de sustancia química usada y/o tipo de material vegetal usado.
Proporcionar un pH de mezcla puede incluir añadir una sustancia química de modificación de pH. 40
Una sustancia química de modificación de pH puede ser un ácido o un álcali.
[0043] Al final del paso de pretratamiento, la mezcla puede incluir material vegetal degradado parcialmente y una fase líquida llamada un filtrado parcial que puede incluir productos químicos desde la formulación de reducción a pasta y una concentración baja de enzima CWD o enzimas liberadas de material vegetal modificado. 45
El método puede incluir la separación del filtrado parcial de sólidos de material vegetal degradado parcialmente en el separador 30.
La separación se puede conseguir mediante varios procesos.
La separación se puede conseguir mediante sedimentación, filtración o centrifugado del filtrado parcial.
El método puede incluir al menos uno de recogida o reciclaje de al menos una porción del filtrado parcial en 50 múltiples ciclos del pretratamiento.
Después de la eliminación del filtrado parcial, la concentración de sólidos en la mezcla se puede aumentar y puede ser cualquier valor entero o no entero dentro de un rango de 2 % a 15 % (p/v), o cualquier rango dentro de valores enteros en el rango de 2 % a 15 % (p/v).
55
[0044] El método puede incluir el lavado del material vegetal modificado pretratado con cualquier líquido adecuado.
El líquido puede ser agua desionizada.
El líquido se puede quitar por centrifugación.
[0045] El método puede incluir además el refinamiento por pulido mecánico, que se realiza en el refinador 40 por 60 cualquier método conocido, tal como, pero no está limitado a, desfibrilación, fresado o choque.
[0046] El método puede incluir la transferencia de biomasa pretratada refinada al vaso de sacarificación 50.
Hidrólisis por una enzima CWD liberada de material vegetal modificado puede ocurrir en el vaso de sacarificación 5.
65
[0047] La provisión de condiciones de hidrólisis puede incluir ajustar la mezcla de 2 % a 25 % de sólidos, para
cualquier valor entero o no entero dentro de 2 % a 25 % de sólidos (primero y último incluidos), o en cualquier valor de un número entero o no entero dentro de un rango entre cualquiera de dos números enteros dentro de 2 % a 25 % de sólidos.
Proporcionar condiciones de hidrólisis puede incluir la incubación de la mezcla durante un periodo de tiempo hasta 144 horas, un periodo de tiempo seleccionado de cualquier valor de número entero o no entero hasta 144 horas o un 5 periodo de tiempo dentro de un rango entre cualquiera de dos valores números enteros mayores que cero y hasta 144 horas.
Proporcionar condiciones de hidrólisis puede incluir proporcionar una temperatura de mezcla de 100 °C o menos, 65 °C o menos, 50 °C o menos, 48 °C a 50 °C, 48 °C a 65 °C, 48 °C a menos que 100 °C o 48 °C a 100 °C.
Proporcionar condiciones de hidrólisis puede incluir proporcionar un pH que varía de 4,8 a 5,0, un pH de 4,8, un pH 10 de 4,9 o un pH de 5,0.
Al menos una de la temperatura, pH o tiempo de tratamiento se puede seleccionar basándose en la actividad específica de una enzima CWD en el material vegetal modificado.
[0048] Si el material vegetal modificado incluye enzimas CWD múltiples, las condiciones óptimas para al menos una 15 de expresión, pretratamiento o hidrólisis por cada una de las enzimas CWD múltiples se pueden proporcionar consecutivamente.
Las condiciones de hidrólisis pueden incluir proporcionar un pH óptimo para la actividad de una enzima, seguida de un pH diferente óptimo para la actividad de otra enzima.
Las condiciones de hidrólisis pueden incluir el ajuste de temperaturas en periodos diferentes de tiempo para una 20 actividad óptima de cada enzima.
Por ejemplo, una xilanasa puede requerir una temperatura o pH diferente a una endoglucanasa.
[0049] El método puede incluir la adición de una o más enzimas exógenas a por lo menos uno de material vegetal modificado, otro material vegetal o la mezcla. 25
Las enzimas exógenas se pueden añadir antes, durante o después del pretratamiento.
Las enzimas exógenas se pueden añadir antes, durante o después de la provisión de condiciones de hidrólisis.
Las enzimas exógenas se pueden añadir al vaso de sacarificación 50.
Una o más enzimas exógenas se pueden proporcionar en un cóctel enzimático.
Un cóctel enzimático puede incluir una o más enzimas CWD. 30
Una enzima CWD proporcionada aquí en una forma de realización puede ser pero no está limitada a una enzima de degradación de lignina, una enzima de degradación de celulosa o una enzima de degradación de hemicelulosa.
Una enzima CWD proporcionada en una forma de realización aquí puede ser pero no está limitada a una seleccionado de glicosidasas, xilanasas, celulasas, endoglucanasas, exoglucanasas, celobiohidrolasas, -xilosidasas, feruloilo esterasas y amilasas. 35
Un cóctel enzimático puede incluir una celulasa aislada de Trichoderma reesii.
Un cóctel enzimático puede ser comprado a un vendedor.
Un cóctel enzimático puede ser, pero no está limitado a Accellerase™ 1000, Accellerase® 1500 y Accellerase ®XY disponible de un Genencor internacional (Rochester, NY).
Un cóctel enzimático puede ser Cellic. 40
Un cóctel enzimático puede incluir clases diferentes de enzimas CWD.
Se pueden proporcionar condiciones óptimas para clases diferentes de enzimas CWD en un cóctel.
Por ejemplo, la temperatura, pH y tiempo de tratamiento para hidrólisis se puede ajustar durante el método para proporcionar condiciones óptimas para enzimas diferentes en el cóctel.
Las condiciones de hidrólisis pueden incluir cargas reducidas de enzimas externas incluidas en un cóctel enzimático. 45
Las cargas reducidas pueden incluir formulaciones con menos de o carentes de una proteína CWD o proteínas expresadas en el material vegetal modificado.
Por ejemplo, si una planta transgénica expresa xilanasa y endoglucanasa, estas enzimas se pueden quitar de un cóctel enzimático formulado para la hidrólisis de material vegetal modificado que tiene la planta transgénica.
50
[0050] La eficiencia de hidrólisis se puede evaluar por la medición de la solubilización del material vegetal.
Los métodos para medir la solubilización del material vegetal se conocen en la técnica y pueden incluir la determinación del monosacárido y concentraciones de disacárido, por ejemplo por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).
Como se describe en ejemplos aquí, HPLC se puede realizar utilizando una bomba binaria Shimadzu LC-20 AD con 55 LC software de soluciones (Shimadzu, Kyoto, Japón) y la concentración de azúcar se puede determinar utilizando una columna de azúcar Aminex HPX-87P (Bio-Rad Laboratories).
Están disponibles otros métodos para medir la solubilización de material vegetal, por ejemplo, por la determinación de pérdida de peso, eliminación de lignina o desacetilación en el material vegetal pretratado.
60
[0051] El método puede incluir además poner en contacto la mezcla y/o productos de hidrólisis con un organismo fermentador para producir un producto bioquímico.
Después de la hidrólisis enzimática, los azúcares solubles se pueden recuperar y usar para la producción de un producto bioquímico.
Alternativamente, la sacarificación simultánea y fermentación de azúcares solubles en un producto bioquímico se 65 pueden realizar en el método.
Un producto bioquímico puede ser pero no está limitado a butano, butanodiol, butadieno, butanol, isobutanol, propano, propanodiol, propileno, propanol, isopropanol, metano, metanol, etanol, fenol, glicerol, etileno, tolueno, etilo, benceno, estireno, xileno, etilenglicol, óxido de etileno, ácido fórmico, dióxido de carbono, formaldehído, acetaldheído, acetona, vitamina a, etano, pentano, hexano, heptano, octano, benceno, ácido acético, sorbitol, arabinitol, ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido dicarboxílico de furano, ácido aspártico, ácido 5 glucárico, ácido glutámico, ácido itacónico, ácido levulínico, hidroxibutirolactona, glicerol, sorbitol, xilitol, arabinitol, ácido glucónico, ácido láctico, ácido malónico, ácido propiónico, ácido cítrico, ácido aconítico, ácido xilónico, furfural, levoglucosano, alanina, prolina, lisina, serina o treonina (ver T. Werpi y G. Petersen, Top Value Added Chemicals From Biomass, Volume 1, Results of Screening for Potential Candidates from Sugars and Synthesis Gas, Agust 2004, Report, PNNL & NREL, que es incorporado aquí por referencia como se expone detalladamente en el mismo). 10
El método puede incluir la sacarificación simultánea y fermentación de azúcares solubles para producir etanol.
La sacarificación simultánea y fermentación para producir etanol puede incluir la provisión de Saccharomyces cerevisiae D5A antes, durante o después del pretratamiento o provisión de condiciones de hidrólisis.
[0052] La conversión de azúcares en productos bioquímicos deseados se puede realizar por cualquier organismo 15 fermentador adecuado.
El organismo fermentador se puede seleccionar en base al producto bioquímico deseado.
El organismo fermentador puede ser levadura.
La levadura puede ser pero no está limitada a uno de Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Yarrowia, Spathaspora o Scheffersomyces ssp. 20
El organismo fermentador puede ser una bacteria.
Una bacteria puede ser pero no está limitada a un Zymomonas, Escherichia, Bacillus, Lactobacillus o Clostridium ssp.
El organismo fermentador puede ser un organismo tipo salvaje o un organismo recombinante genéticamente modificado. 25
[0053] Una forma de realización incluye una planta modificada que incluye una primera secuencia de polinucleótidos que codifica una primera proteína.
La primera proteína puede ser una proteína CWD.
La primera proteína puede ser una proteína CWD modificada de inteína. 30
La primera proteína puede ser descrita por cualquiera con respecto al método para la producción de los azúcares solubles de material vegetal modificado.
La primera proteína puede incluir, constar esencialmente de o constar de una secuencia de aminoácidos con al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con una primera secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 1 [peso P77853], SEC ID n.º: 2 [AnfaeA], SEC ID n.º: 3 35 [AnfaeB], SEC ID n.º: 4 [NtEGm], SEC ID n.º: 5 [EU591743], SEC ID n.º: 6 [O43097], SEC ID n.º: 7 [P77853:T134-100-101], SEC ID n.º: 8[P77853:S158-30-108-35], SEC ID n.º: 9 [O33897], SEC ID n.º: 10 [O68438] y SEC ID n.º: 11 [P54583].
La primera proteína puede incluir, constar esencialmente de o constar de una secuencia de aminoácidos con al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la secuencia de referencia de SEC ID: 12 40 [BD22308].
[0054] La planta modificada puede incluir además una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica una segunda proteína.
La segunda proteína puede ser una enzima CWD. 45
La segunda proteína puede ser una proteína CWD modificada de inteína.
La segunda proteína puede ser descrita por cualquiera con respecto al método para la producción de azúcares solubles de material vegetal modificado.
La segunda proteína puede incluir, constar esencialmente de o constar de una secuencia de aminoácidos con al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con una segunda secuencia de referencia 50 seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 1[WT P77853], SEC ID n.º: 2 [AnfaeA], SEC ID n.º: 3 [AnfaeB], SEC ID n.º: 4 [NtEGm], SEC ID n.º: 5 [EU 591743], SEC ID n.º: 6 [O43097], SEC ID n.º: 7 [P77853:T134-100-101], SEC ID n.º: 8 [P77853:S158-30-108-35], SEC ID n.º: 9 [O33897], SEC ID n.º: 10 [O68438], SEC ID n.º: 11 [P54583] y SEC ID: 12 [BD22308].
El SEC ID n.º seleccionado como la segunda secuencia de referencia puede ser diferente del SEC ID n.º 55 seleccionado como la primera secuencia de referencia.
[0055] La planta modificada puede incluir además una tercera secuencia de polinucleótidos que codifica una tercera proteína.
La tercera proteína puede ser una enzima CWD. 60
La tercera proteína puede ser una proteína CWD modificada de inteína.
La tercera proteína puede ser descrita por cualquiera con respecto al método para la producción de azúcares solubles de material vegetal modificado.
La tercera proteína puede incluir, constar esencialmente de o constar de una secuencia de aminoácidos con al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con una tercera secuencia de referencia 65 seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 1[WT P77853], SEC ID n.º: 2 [AnfaeA], SEC ID n.º: 3 [AnfaeB],
SEC ID n.º: 4 [NtEGm], SEC ID n.º: 5 [EU591743], SEC ID n.º: 6 [O43097], SEC ID n.º: 7 [P77853:T134-100-101], SEC ID n.º: 8 [P77853:S158-30-108-35], SEC ID n.º: 9 [O33897], SEC ID n.º: 10 [O68438], SEC ID n.º: 11 [P54583] y SEC ID: 12 [BD22308].
El SEC ID n.º seleccionado como la tercera secuencia de referencia puede ser diferente del SEC ID n.º seleccionado como la primera secuencia de referencia. 5
El SEC ID n.º seleccionado como la tercera secuencia de referencia puede ser diferente del SEC ID n.º seleccionado como la segunda secuencia de referencia.
[0056] Al menos una de la primera secuencia de polinucleótidos, la segunda secuencia de polinucleótidos o la tercera secuencia de polinucleótidos en una planta modificada puede incluir además una primera secuencia de 10 polinucleótido diana que codifica un péptido diana respectivo.
Para una planta modificada carente de la tercera secuencia de polinucleótidos, una primera secuencia de polinucleótido diana se puede incluir en al menos una de la primera secuencia de polinucleótidos o la segunda secuencia de polinucleótido.
Para una planta modificada carente de la segunda secuencia de polinucleótidos y la tercera secuencia de 15 polinucleótidos, una primera secuencia de polinucleótido diana se puede incluir en la primera secuencia de polinucleótido.
Un péptido diana respectivo puede ser independientemente seleccionado de pero no está limitado a una señal diana de amiloplasto, un péptido diana de pared celular, un péptido diana mitocondrial, una señal de localización de citosol, una señal diana de cloroplasto, un péptido diana nuclear o un péptido diana de vacuola. 20
[0057] Cada péptido diana respectivo se puede fusionar con la correspondiente primera proteína, segunda proteína o tercera proteína.
Un péptido diana puede tener al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con uno de SEC ID n.º: 13 [BAASS], SEC ID n.º: 14 [HvAleSP], SEC ID n.º: 1 [PR1a] 5, SEC ID n.º: 16 [xGZein27ss-02] o SEC ID n.º: 25 17 [GluB4SP].
[0058] Al menos una de la primera secuencia de polinucleótidos, la segunda secuencia de polinucleótidos o la tercera secuencia de polinucleótidos en una planta modificada puede incluir además una segunda secuencia de polinucleótido diana que codifica un péptido diana carboxi. 30
Para una planta modificada carente de la tercera secuencia de polinucleótidos, una segunda secuencia de polinucleótido diana se puede incluir en al menos una de la primera secuencia de polinucleótido o la segunda secuencia de polinucleótido.
Para una planta modificada carente de la segunda secuencia de polinucleótido y la tercera secuencia de polinucleótidos, una segunda secuencia de polinucleótido diana se puede incluir en la primera secuencia de 35 polinucleótido.
Un péptido diana carboxi se puede seleccionar de pero no está limitado a una secuencia con al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 de identidad con uno de SEC ID n.º: 22 [SEKDEL], el abreviado SEC ID n.º: 23 [KDEL] o SEC ID n.º: 24 [la secuencia determinante de clasificación vacuolar de cebada HvVSD-01].
Un péptido diana carboxi se puede fusionar por lo menos con una de la primera proteína, la segunda proteína o la 40 tercera proteína.
[0059] Una planta modificada puede incluir al menos una secuencia de polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que incluye, consta esencialmente de o consta de una secuencia con al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 18 45 [BAASS:P77853], SEC ID n.º: 19 [BAASS:O33897], SEC ID n.º: 20 [HVAlePS:NtEGm], SEC ID n.º: 21 [BAASS:P77853:S158-30-108-35], SEC ID n.º: 25 [BAASS: AnfaeB: SEKDEL], SEC ID n.º: 26 [BAASS:AnfaeA:SEKDEL], SEC ID n.º: 27 [PR1a:NtEGm:SEKDEL], SEC ID n.º: 28 [BAASS: P77853:T134-100-101:SEKDEL], SEC ID n.º: 29 [HvAleSP:NtEGm:SEKDEL], SEC ID n.º: 30 [BAASS:O43097:SEKDEL] y SEC ID n.º: 31 [xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]. 50
[0060] Una planta modificada puede incluir al menos una secuencia de aminoácidos que incluye, consta esencialmente de o consta de una secuencia con al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 18 [BAASS:P77853], SEC ID n.º: 19 [BAASS:O33897], SEC ID n.º: 20 [HVAlePS:NtEGm], SEC ID n.º: 21 [BAASS:P77853:S158-30-108-35], SEC ID 55 n.º: 25 [BAASS: AnfaeB: SEKDEL], SEC ID n.º: 26 [BAASS:AnfaeA:SEKDEL], SEC ID n.º: 27 [PR1a:NtEGm:SEKDEL], SEC ID n.º: 28 [BAASS: P77853:T134-100-101:SEKDEL], SEC IDNO: 29 [HvAleSP:NtEGm:SEKDEL], SEC ID n.º: 30 [BAASS:O43097:SEKDEL] y SEC ID n.º: 31 [xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01].
60
[0061] La planta modificada puede ser una planta transgénica, progenie de una planta transgénica, un descendiente de una planta transgénica o cualquier parte de las anteriormente mencionadas.
La planta modificada puede incluir una proteína CWD, que no se produce naturalmente en la planta o un gen que codifica la misma.
La proteína CWD puede ser una proteína CWD modificada de inteína. 65
La planta transgénica puede ser cualquier tipo de planta.
El tipo de planta transgénica puede ser maíz, azúcar de caña, remolacha azucarera, sorgo, pasto varilla, miscanthus, eucalipto, sauce o álamo.
La planta transgénica se puede crear por métodos conocidos para expresar una enzima CWD o proteína CWD en cualquier forma.
La planta se puede crear por transformación mediada por Agrobacterium utilizando un vector que incluye unas 5 secuencias de polinucleótido que codifican una enzima.
La planta transgénica se puede crear por otros métodos para la transfomación de plantas, por ejemplo, bombardeo de partícula o absorción de ADN directa.
La planta transgénica puede incluir aquí cualquier ácido nucleico aislado, secuencia de aminoácidos, casete de expresión o vector. 10
[0062] En una forma de realización, se proporciona un casete de expresión que incluye al menos uno de una primera secuencia de polinucleótidos, una segunda secuencia de polinucleótidos o una tercera secuencia de polinucleótidos, que codifica, respectivamente, una primera proteína, una segunda proteína y una tercera proteína.
Cualquier una o más de la primera proteína, la segunda proteína o la tercera proteína puede ser una proteína CWD. 15
Cualquier una o más de la primera proteína, la segunda proteína o la tercera proteína puede ser una proteína CWD modificada de inteína.
Cualquier una o más de la primera proteína, la segunda proteína o la tercera proteína puede ser una de las proteínas descritas con respecto al método para la producción de azúcares solubles de material vegetal modificado o las plantas modificadas. 20
Cualquier una o más de la primera proteína, la segunda proteína o la tercera proteína puede ser una xilanasa, una endoglucanasa, una exoglucanasa, una feruloil esterasa, una xilanasa modificada de inteína, una endoglucanasa modificada de inteína, una exoglucanasa modificada de inteína o una feruloil esterasa modificada de inteína.
La proteína seleccionada como la segunda proteína puede ser diferente de la proteína seleccionada como la primera proteína. 25
La proteína seleccionada como la tercera proteína puede ser diferente de la proteína seleccionada como la primera proteína.
La proteína seleccionada como la tercera proteína puede ser diferente de la proteína seleccionada como la segunda proteína.
30
[0063] Al menos una de la primera secuencia de polinucleótidos, la segunda secuencia de polinucleótidos o la tercera secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína CWD en un casete de expresión se puede modificar por inserción de la secuencia de ácido nucleico que codifica una inteína.
Un polinucleótido modificado de inteína puede codificar una proteína modificada de inteína con una función modificada. 35
Una función modificada puede ser de inactivación de una proteína CWD mientras la inteína permanece fusionada con o en la proteína CWD.
Una inteína en una proteína modificada de inteína puede ser inducible para unirse de la proteína no modificada de inteína.
La condición de inducción para la unión puede ser pero no está limitada a proporcionar una temperatura 40 determinada.
La temperatura proporcionada puede ser la proporcionada durante al menos uno de pretratamiento o condiciones de hidrólisis descritas con respecto al método para la producción de azúcares solubles de material vegetal modificado.
La condición de inducción puede ser cualquier otra condición de inducción que combine con la inteína seleccionada.
La proteína modificada de inteína puede ser iXynA: es decir, XynA modificada de inteína. 45
La proteína modificada de inteína puede ser P77853) modificada de inteína.
La proteína modificada de inteína puede ser P77853:T134-100-101 o P77853:S158-30-108-35.
[0064] Una o más de la primera proteína, la segunda proteína o la tercera proteína en un casete de expresión puede incluir, constar esencialmente de o constar de una secuencia de aminoácidos con al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 50 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 1[WT P77853], SEC ID n.º: 2 [AnfaeA], SEC ID n.º: 3 [AnfaeB], SEC ID n.º: 4 [NtEGm], SEC ID n.º: 5 [EU 591743], SEC ID n.º: 6 [O43097], SEC ID n.º: 7 [P77853:T134-100-101], SEC ID n.º: 8 [P77853:S158-30-108-35], SEC ID n.º: 9 [O33897], SEC ID n.º: 10 [O68438] y SEC ID n.º: 11 [P54583].
Una o más de la primera proteína, la segunda proteína o la tercera proteína puede incluir, constar esencialmente de 55 o constar de una secuencia de aminoácidos con al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la secuencia de referencia de SEC ID: 12 [BD22308].
[0065] Al menos una de la primera secuencia de polinucleótidos, la segunda secuencia de polinucleótidos o la tercera secuencia de polinucleótidos en un casete de expresión puede incluir además una primera secuencia de 60 polinucleótido diana que codifica un péptido diana respectivo.
Para un constructo de expresión que carece de la tercera secuencia de polinucleótidos, una primera secuencia de polinucleótido diana se puede incluir en al menos una de la primera secuencia de polinucleótido o la segunda secuencia de polinucleótido.
Para un constructo de expresión que carece de la segunda secuencia de polinucleótidos y la tercera secuencia de 65 polinucleótidos, una primera secuencia de polinucleótido diana se puede incluir en la primera secuencia de
polinucleótidos.
Cada péptido diana respectivo puede ser independientemente seleccionado para cada una de la primera secuencia de polinucleótidos, la segunda secuencia de polinucleótidos o la tercera secuencia de polinucleótidos.
Un péptido diana se puede fusionar con la primera proteína, la segunda proteína o la tercera proteína.
Cada péptido diana respectivo puede ser independientemente seleccionado de, pero no está limitado a una señal 5 diana de amiloplasto, un péptido diana de pared celular, un péptido diana mitocondrial, una señal de localización de citosol, una señal diana de cloroplasto, un péptido diana nuclear y un péptido diana de vacuola.
Un primer polinucleótido diana puede estar aguas arriba de la primera secuencia de polinucleótidos, la segunda secuencia de polinucleótidos o la tercera secuencia de polinucleótidos.
Un péptido diana puede tener al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con uno de 10 BAASS (SEC ID n.º: 13), la secuencia de aleurona de cebada HVAlePS (SEC ID n.º: 14), PR1a (SEC ID n.º: 15), la secuencia de gamma-zeína xGZein27ss-02 (SEC ID n.º: 16) o GluB4SP (SEC ID n.º: 17).
Una primera secuencia de polinucleótido diana en combinación con una de la primera secuencia de polinucleótidos, la segunda secuencia de polinucleótidos o la tercera secuencia de polinucleótidos unida puede codificar una secuencia de aminoácidos con al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con una 15 secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 18 [BAASS:P77853], SEC ID n.º: 19 [BAASS:O33897], SEC ID n.º: 20 [HVAlePS:NtEGm] y SEC IDNO: 21 [BAAS:P77853:S158-30-108-35].
[0066] Al menos una de la primera secuencia de polinucleótidos, la segunda secuencia de polinucleótidos o la tercera secuencia de polinucleótidos en un casete de expresión puede incluir además una segunda secuencia de 20 polinucleótidos diana que codifica un péptido diana carboxi.
Para un constructo de expresión que carece de la tercera secuencia de polinucleótidos, una segunda secuencia de polinucleótidos diana se puede incluir en al menos una de la primera secuencia de polinucleótidos o la segunda secuencia de polinucleótidos.
Para un constructo de expresión que carece de la segunda secuencia de polinucleótidos y la tercera secuencia de 25 polinucleótidos, una segunda secuencia de polinucleótidos diana se puede incluir en la primera secuencia de polinucleótidos.
Un péptido diana carboxi se puede seleccionar de, pero no está limitado a una secuencia con al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 de identidad con uno de SEKDEL (SEC ID n.º: 22), el abreviado KDEL (SEC ID n.º: 23) o la secuencia determinante de clasificación vacuolar de cebada HvVSD-01 (SEC ID n.º: 24). 30
Un péptido diana carboxi se puede fusionar por lo menos con una de la primera proteína, la segunda proteína o la tercera proteína.
[0067] Un casete de expresión se puede configurar de manera que al menos una de la primera proteína, la segunda proteína o la tercera proteína está proporcionada sin el péptido diana para la acumulación en el citoplasma. 35
[0068] En un casete de expresión, la primera secuencia de polinucleótidos diana y la segunda secuencia de polinucleótidos diana en combinación con una de la primera secuencia de polinucleótidos, la segunda secuencia de polinucleótidos o la tercera secuencia de polinucleótidos juntas pueden codificar una secuencia de aminoácidos con al menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del 40 grupo que consiste en: SEC ID n.º: 25 [BAASS: AnfaeB: SEKDEL], SEC ID n.º: 26 [BAASS:AnfaeA:SEKDEL], SEC ID n.º: 27 [PR1a:NtEGm:SEKDEL], SEC ID n.º: 28 [BAASS: P77853:T134-100-101:SEKDEL], SEC IDNO: 29 [HvAleSP:NtEGm:SEKDEL], SEC ID n.º: 30 [BAASS:O43097:SEKDEL] y SEC ID n.º: 31[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01].
45
[0069] Las formas de realización incluyen un casete de expresión que codifica al menos una de la primera proteína, la segunda proteína o la tercera proteína o variantes de las mismas, fusionadas con variantes de al menos uno de un péptido diana o un péptido diana carboxi.
[0070] En una forma de realización, una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína en un casete de 50 expresión y tiene menos del 100 % de identidad con la secuencia de aminoácido de referencia citada puede codificar una variante de la proteína que tiene la secuencia de aminoácido de referencia.
En una forma de realización, una proteína con menos del 100 % de identidad con la secuencia de aminoácido de referencia citada puede ser una variante de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de referencia.
En una forma de realización, una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína con menos el 100 % de 55 identidad con la proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico de referencia citada puede codificar una variante de la proteína codificada por la secuencia de referencia.
[0071] En un casete de expresión, al menos una de la primera secuencia de polinucleótidos, la segunda secuencia de polinucleótidos o la tercera secuencia de polinucleótidos puede ser capaz de la hibridación a una secuencia de 60 referencia que codifica una proteína CWD o una proteína CWD modificada de inteína bajo una de, bajas, moderadas o altas condiciones de astringencia.
Al menos uno del primero, el segundo o el tercer polinucleótido puede ser capaz de la hibridación bajo una de bajas, moderadas o altas condiciones de astringencia de un ácido nucleico que consiste en una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 32[WT P77853], SEC ID n.º: 33 [AnfaeA], SEC ID n.º: 34 65 [AnfaeB], SEC ID n.º: 35 [NtEGm], SEC ID n.º: 36 [EU591743], SEC ID n.º: 37 [O43097], SEC ID n.º: 38
[P77853:T134-100-101], SEC ID n.º: 39 [P77853:S158-30-108-35], SEC ID n.º: 40 [033897], SEC ID n.º: 41 [O68438], SEC ID n.º: 42 [P54583] y SEC ID n.º: 43 [BD22308].
Un casete de expresión puede incluir una secuencia de polinucleótidos capaz de la hibridación bajo una de bajas, moderadas o altas condiciones de astringencia de un ácido nucleico que consiste en una secuencia de referencia seleccionada del grupo de secuencias que consisten en: SEC ID n.º: 52 [BAASS:P77853], SEC ID n.º: 53 5 [BAASS:O33897], SEC ID n.º: 54 [HVAlePS:NtEGm], SEC ID n.º: 55 [BAASS: P77853:S158-30-108-35], SEC ID n.º: 56 [BAASS: AnfaeB: SEKDEL], SEC ID n.º: 57 [BAASS:AnfaeA:SEKDEL], SEC ID n.º: 58 [PR1a:NtEGm:SEKDEL], SEC ID n.º: 59 [BAASS: P77853:T134-100-101:SEKDEL], SEC ID NO:60[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL], SEC IDNO: 61 [BAASS:O43097:SEKDEL] y SEC ID n.º: 62 [xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01].
10
[0072] Un casete de expresión aquí puede incluir un elemento regulador.
[0073] En una forma de realización, aquí se proporciona un vector que incluye cualquier ácido nucleico aislado, secuencia de polinucleótidos o casete de expresión.
Formas de realización aquí incluyen un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN plástido, virus o fragmento de 15 ácido nucleico que tiene al menos un casete de expresión incorporado en este.
Una forma de realización proporciona un vector para la expresión de las proteínas CWD en una planta.
Una forma de realización proporciona un vector de transformación de planta.
El vector de transformación de planta puede ser pero no está limitado a un vector T-ADN, un vector binario o un vector cointegrado. 20
El vector de transformación puede incluir aquí cualquier ácido nucleico aislado, secuencia de polinucleótidos o casete de expresión.
[0074] Una forma de realización incluye un vector de expresión que incluye una secuencia de polinucleótidos capaz de la hibridación bajo condiciones de una de bajas, moderadas o altas condiciones de astringencia para el ácido 25 nucleico que consiste en una secuencia que incluye, consta esencialmente de o consta de una secuencia seleccionada del grupo que consta de: SEC ID n.º: 63 [pAG 2015], SEC ID n.º: 64 [pAG2048], SEC ID n.º: 65 [pAG2049], SEC ID n.º: 66 [pAG2063], SEC ID n.º: 67 [pAG2069], SEC ID n.º: 68 [pAG2091], SEC ID n.º: 69 [pAG2092], SEC ID n.º: 70 [pAG2096], SEC ID n.º: 71 [pAG2201], SEC ID n.º: 72 [pAG2229], SEC ID n.º: 73 [pAG2233], SEC ID n.º: 74 [pAG2234], SEC ID n.º: 75 [pAG2242], SEC ID n.º: 76 [pAG2252], SEC ID n.º: 77 30 [pAG2253], SEC ID n.º: 78 [pAG2309], SEC ID n.º: 79 [pAG2310], SEC ID n.º: 80 [pAG2339], SEC ID n.º: 81 [pAG2342], SEC ID n.º: 82 [pAG2345], y SEC ID n.º: 83 [pAG2349].
[0075] Una forma de realización incluye un vector de expresión que incluye una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con una secuencia seleccionada del grupo 35 que consiste en: SEC ID n.º: 63 [pAG 2015], SEC ID n.º: 64 [pAG2048], SEC ID n.º: 65 [pAG2049], SEC ID n.º: 66 [pAG2063], SEC ID n.º: 67 [pAG2069], SEC ID n.º: 68 [pAG2091], SEC ID n.º: 69 [pAG2092], SEC ID n.º: 70 [pAG2096], SEC ID n.º: 71 [pAG2201], SEC ID n.º: 72 [pAG2229], SEC ID n.º: 73 [pAG2233], SEC ID n.º: 74 [pAG2234], SEC ID n.º: 75 [pAG 2242], SEC ID n.º: 76 [pAG2252], SEC ID n.º: 77 [pAG2253], SEC ID n.º: 78 [pAG2309], SEC ID n.º: 79 [pAG2310], SEC ID n.º: 80 [pAG2339], SEC ID n.º: 81 [pAG2342], SEC ID n.º: 82 40 [pAG2345] y SEC ID n.º: 83 [pAG2349].
[0076] Métodos de hibridación y condiciones de astringencia se conocen en la técnica y son descritos en los libros siguientes: Molecular Cloning, T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, and Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Siedman, J.A. 45 Smith, K.
Struhl, Volume 1, John Wiley & Sons, 2000, que se incorporan por la presente por referencia como se expone detalladamente.
[0077] Condiciones moderadas pueden ser de la siguiente manera: filtros cargados con muestras de ADN se 50 pretratan durante 2 - 4 horas a 68 °C en una solución que contiene 6 x solución salina tamponada de citrato (SSC; Amresco, Inc., Solon, OH), 0,5 % de sulfato dodecil de sodio (SDS; Amresco, Inc., Solon, OH), solución de 5xDenhardt (Amresco, Inc., Solon, OH) y esperma de salmón desnaturalizado (Invitrogen Life Technologies, Inc. Carlsbad, CA).
Hibridación se lleva en la misma solución con las modificaciones siguientes: 0,01 M EDTA (Amresco, Inc., Solon, 55 OH), 100 µg/ml esperma de salmón ADN y 5 - 20 x 106 cpm 32P-marcado o sondas fluorescentemente marcadas.
Los filtros se incuban en la mezcla de hibridación durante 16-20 horas y luego se lavan durante 15 minutos en una solución que contiene 2xSSC y 0,1 % SDS.
La solución de lavado se sustituye para un segundo lavado con una solución que contiene 0,1xSSC y 0,5 % SDS y se incuba 2 horas adicionales de 20 °C a 29 °C por debajo Tm (temperatura de fusión en °C). 60
Tm = 81,5 +16,61Log10([Na+]/(1,0+0,7[Na+]))+0,41(%[G+C])-(500/n)-P-F.[na+] = concentración molar de iones de sodio. %[G+C] = porcentaje de G+C bases en la secuencia de ADN.
N = longitud de secuencia de ADN en bases.
P = una corrección de temperatura para % pares de bases dispares ( 1 °C por 1 % disparidad).
F = corrección para concentración de formamida (=0,63 °C por 1 % de formamida). 65
Filtros son expuestos para el desarrollo en un generador de imágenes o por autoradiografía.
Condiciones de astringencia bajas se refieren a condiciones de hibridación a temperaturas bajas, por ejemplo, entre 37 °C y 60 °C, y el segundo lavado con más alto [Na+] (sobre 0,825M) y a una temperatura de 40 °C a 48 °C por debajo Tm.
Astringencia alta se refiere a condiciones de hibridación a altas temperaturas, por ejemplo, sobre 68 °C y el segundo lavado con [Na+] = 0,0165 a 0,0330M a una temperatura de 5 °C a 10 °C por debajo Tm. 5
[0078] Una forma de realización proporciona una secuencia de ácidos nucleicos aislada con una secuencia que hibridiza bajo una de las condiciones de astringencia bajas, moderadas o altas de un ácido nucleico que consiste en una secuencia seleccionada de SEC ID n.º: 32[WT P77853], SEC ID n.º: 33 [AnfaeA], SEC ID n.º: 34 [AnfaeB], SEC ID n.º: 35 [NtEGm], SEC ID n.º: 36 [EU591743], SEC ID n.º: 37 [O43097], SEC ID n.º: 38 [P77853:T134-100-101] y 10 SEC ID n.º: 39 [P77853:S158-30-108-35], de SEC ID n.º: 40 [O33897], SEC ID n.º: 41 [O68438], SEC ID n.º: 42 [P54583], y SEC ID: 43 [BD22308], SEC ID n.º: 52 [BAASS:P77853], SEC ID n.º: 53 [BAASS:O33897], SEC ID n.º: 54 [HVAlePS:NtEGm], SEC ID n.º: 55 [BAASS: P77853:S158-30-108-35], SEC ID n.º: 56 [BAASS: AnfaeB: SEKDEL], SEC ID n.º: 57 [BAASS:AnfaeA:SEKDEL], SEC ID n.º: 58 [PR1a:NtEGm:SEKDEL], SEC ID n.º: 59 [BAASS: P77853:T134-100-101:SEKDEL], SEC ID n.º: 60 [HvAleSP:NtEGm:SEKDEL], SEC ID n.º: 61 15 [BAASS:O43097:SEKDEL] y SEC ID n.º: 62 [xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01], SEC ID n.º: 63 [pAG 2015], SEC ID n.º: 64 [pAG2048], SEC ID n.º: 65 [pAG2049], SEC ID n.º: 66 [pAG2063], SEC ID n.º: 67 [pAG2069], SEC ID n.º: 68 [pAG2091], SEC ID n.º: 69 [pAG2092], SEC ID n.º: 70 [pAG2096], SEC ID n.º: 71 [pAG2201], SEC ID n.º: 72 [pAG2229], SEC ID n.º: 73 [pAG2233], SEC ID n.º: 74 [pAG2234], SEC ID n.º: 75 [pAG 2242], SEC ID n.º: 76 [pAG2252], SEC ID n.º: 77 [pAG2253], SEC ID n.º: 78 [pAG2309], SEC ID n.º: 79 [pAG2310], SEC ID n.º: 80 20 [pAG2339], SEC ID n.º: 81 [pAG2342], SEC ID n.º: 82 [pAG2345], y SEC ID n.º: 83 [pAG2349] o su complemento.
[0079] Una forma de realización proporciona un fragmento de cualquiera de los ácidos nucleicos aislados anteriores.
El fragmento puede ser una sonda de hibridación o cebador.
La sonda o cebador puede tener cualquier longitud. 25
La sonda o cebador puede ser 6, 10,15,20,25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos en longitud o tener una longitud en un rango entre cualquiera de dos de las longitudes anteriormente mencionadas (primero y últimos incluidos).
Un fragmento puede tener una longitud menor de la longitud total y/o incluir sustituciones o deleciones en comparación con la secuencia de referencia citada.
El fragmento puede ser una variante de la secuencia de referencia citada. 30
Un péptido codificado por un fragmento puede tener una longitud menor de la longitud total y/o incluir sustituciones o deleciones en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de referencia citada.
El péptido con una longitud menor de la longitud total puede ser una variante de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de referencia citada.
35
[0080] Un casete de expresión se puede generar de manera recombinante por métodos conocidos.
Un casete de expresión puede incluir una serie de elementos de ácido nucleico específicos, que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula vegetal o tejido vegetal.
El casete de expresión puede incluir una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína.
La proteína puede ser una enzima CWD o una enzima CWD modificada de inteína. 40
La enzima CWD se puede seleccionar desde la lista de enzimas CWD que consisten en: xilanasas, endoglucanasas, exoglucanasas, xilosidasas, glucosidasas y feruloilo esterasas.
[0081] Una secuencia de polinucleótidos en un casete de expresión, ácido nucleico aislado, vector o cualquier otro constructo de ADN aquí o utilizado en un método aquí puede estar operativamente conectado a uno o más 45 elementos reguladores.
Un elemento regulador incluido puede ser un promotor.
El promotor puede ser un promotor constitutivo que proporciona la transcripción de las secuencias polinucleótidas mediante la planta en más células, tejidos y órganos, y durante muchas pero no necesariamente todas las etapas de desarrollo. 50
El promotor puede ser un promotor inducible, que inicia la transcripción de las secuencias polinucleótidas solo cuando se exponen a una sustancia química particular o estímulo medioambiental.
El promotor puede ser específico para una fase de desarrollo particular, órgano o tejido.
Un promotor específico de tejido puede ser capaz de la transcripción de iniciación en un tejido vegetal particular.
El tejido vegetal que puede ser focalizado por un promotor específico de tejido puede ser pero no está limitado a un 55 vástago, hojas, tricomas, anteras o semilla.
Un promotor constitutivo aquí puede ser el promotor de ubiquitina de arroz 3 (OsUbi3P) o promotor de actina de arroz 1.
Otros promotores constitutivos conocidos pueden ser utilizados e incluyen pero de forma no limitativa virus de mosaico de coliflor (CaMV) 35S promotor, el promotor de virus de enrollamiento de hoja amarilla Cestrum (CMP) o la 60 versión corta CMP (CMPS), el promotor de subunidad pequeña Rubisco y el promotor de ubiquitina de maíz.
El promotor específico de tejido puede incluir el promotor de semilla específica.
El promotor de semilla específica puede ser, pero no está limitado al promotor de arroz GluB4 o el promotor de zeína de maíz.
Otro elemento regulador que se puede proporcionar es una secuencia terminadora, que termina la transcripción. 65
Una secuencia terminadora se puede incluir en el 3' extremo de una unidad transcripcional del casete de expresión.
El terminador se puede derivar de una variedad de genes de planta.
El terminador puede ser una secuencia terminadora de la nopalina sintasa o genes octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens.
[0082] Los vectores que incorporan un casete de expresión aquí también pueden incluir elementos genéticos 5 adicionales tales como lugares de clonación múltiples para facilitar la clonación molecular y marcadores de selección para facilitar la selección.
Una etiqueta seleccionable que se puede incluir en un vector puede ser un gen de fosfomanosa isomerasa (PMI) de Escherichia coli que confiere a la célula transformada la capacidad de utilizar manosa para el crecimiento.
Unos marcadores seleccionables que se pueden incluir en un vector incluyen, pero de forma no limitativa un gen de 10 neomicina fosfotransferasa (npt) quec confiere resistencia a la canamicina, un gen de higromicina fosfotransferasa (hpt) que confiere resistencia a la higromicina y un gen de enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa que confiere resistencia al glifosato.
[0083] En una forma de realización, el vector se puede construir para incluir secuencias de polinucleótidos que 15 codifican múltiples enzimas CWD.
Un vector aquí puede incluir además una secuencia de polinucleótidos modificada para silenciar un gen o genes en una planta.
[0084] Un vector de expresión se puede introducir en células huésped adecuadas, tejidos, órganos y/o organismos. 20
Huéspedes adecuados pueden ser dicotiledóneas (dicot) o plantas monocotiledóneas (monocot).
[0085] Otras formas de realización aquí se pueden formar por la complementación de una forma de realización con uno o más elementos de cualquiera de una o más formas de realización aquí y/o por la substitución de uno o más elementos de una forma de realización con uno o más elementos de una o más formas de realización de aquí. 25
Otras formas de realización aquí pueden ser descritas por referencia en cualquiera de las reivindicaciones anexas que siguen a la reivindicación 1 y al leer la reivindicación elegida depende de cualquiera de una o más de las reivindicaciones precedentes.
Ejemplos 30
[0086] Los siguientes ejemplos no limitativos se proporcionan para ilustrar formas de realización particulares.
Todas las formas de realización se pueden suplementar con uno o más detalles de uno o más ejemplos de abajo y/o uno o más elementos a partir de una forma de realización se pueden sustituir con uno o más detalles de uno o más ejemplos de abajo. 35
Ejemplo 1- Materiales y métodos
Vectores
40
[0087] Un diseño de vector aquí se basa en el pSB11 plásmido intermedio disponible de tabaco de Japón y descrito en la solicitud internacional Nos. PCT/US10/55746 filed November 5, 2010; PCT/US10/55669 filed November 5, 2010 and PCT/US10/55751 filed November 5, 2010, que son incorporados aquí por referencia como se ha expuesto detalladamente.
Brevemente, el pSB11 plásmido usado para la clonación se conjuga con el pSB1 vector aceptor, un plásmido Ti 45 desarmado, mediante una recombinación homóloga usando sitios cos y ori presentes en pSB11 y pSB1.
El vector integrado contiene genes de virulencia tales como virB, virC y vir G requeridos para la transferencia T-ADN y se pueden usar para la transformación de planta.
El vector de transformación de base incluye un casete de expresión que contiene un gen macho A que codifica PMI bajo el control del promotor CMPS más tarde sustituido por el promotor OsUbi3P. 50
Este vector de base fue usado para obtener los vectores enumerados abajo, que fueron usados para la transformación de planta y expresión de enzimas de degradación de pared celular en planta:
1. pAG2015(SEQ ID n.º: 63): OsUbi3P:P77853;
2. pAG2048 (SEC ID n.º: 64): OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm entre arroz Ubi3 promotor fusionado a vacuola;
3. pAG2049 (SEC ID n.º: 65): OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL; 55
4. pAG2063 (SEC ID n.º: 66): OsUbi3P:BAASS:O43097:SEKDEL;
5. pAG2069 (SEC ID n.º: 67): OsUbi3P:O68438;
6. pAG2091 (SEC ID n.º: 68): OsUbi3P:BAASS: AnfaeA:SEKDEL + OsUbi3P:BAASS:P77853;
7. pAG2092 (SEC ID n.º: 69): OsUbi3P:BAASS:AnfaeB:SEKDEL + OsUbi3P:BAASS:P77853;
8. pAG2096 (SEC ID n.º: 70): OsUbi3P:BAASS:AnfaeA:SEKDEL + OsUbi3P:BAASS:AnfaeB:SEKDEL + 60 OsUbi3P:BAASS:P77853;
9. pAG2201 (SEC ID n.º: 71): OsUbi3P:ZmUBQm:P77853;
10. pAG2229 (SEC ID n.º: 72): OsUbi3P:BAASS:P77853:T134-100-101: SEKDEL (xilanasa modificada de inteína);
11. pAG2233 (SEC ID n.º: 73) OsUbi3P:P77853:S158-30-108-35;
12. pAG2234(SEQ ID Nº: 74) OsUbi3P:BAASS:P77853:S158-30-108-35; 65
13. pAG2242 (SEC ID n.º: 75): OsUbi3P:PR1aSP:NtEGm:SEKDEL + OsUbi3P:ZmUBQm:P77853;
14. pAG2252 (SEC ID n.º: 76): OsUbi3P:O33897 (endoglucanasa);
15. pAG2253 (SEC ID n.º: 77): OsUbi3P:BAASS:O33897;
16. pAG2309 (SEC ID n.º: 78): OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm + OsUbi3P:P77853;
17. pAG2310 (SEC ID n.º: 79): OsUbi3P:EU591743 (xilanasa);
18. pAG2339 (SEC ID n.º: 80): OsUbi3P:O68438 + OsUbi3P:BAASS:O33897 + OsUbi3P:EU591743; 5
19. pAG2342 (SEC ID n.º: 81): OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL + OsUbi3P:P77853;
20. pAG2345 (SEC ID n.º: 82): OsUbi3P:O68438 + OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL + OsUbi3P:BAASS:O43097:SEKDEL;
21. pAG2349 (SEC ID n.º: 83): ZmUbilP:ZmKozak:xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01 + OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL + OsUbi3P:BAASS:O43097:SEKDEL; 10
22. pAG2042 (SEC ID n.º: 84): P54583 (endoglucanasa EGB)
Producción de plantas de maíz transgénico
[0088] Los métodos para la transformación de maíz y pasto varilla fueron descritos en la solicitud internacional Nos. 15 PCT/US10/55746 filed November 5, 2010; PCT/US10/55669 filed November 5, 2010; PCT/US10/55751 filed November 5, 2010 and Gray et al. 2011 Plant Biotech J 9:1100, que están todos incorporados aquí por referencia somo se ha expuesto detalladamente.
Brevemente, callo embriogénico de maíz AxB de tipo salvaje fue inoculado con LBA4404 células de Agrobacterium que contienen el plásmido de transformación apropiado. 20
La transformación mediada por Agrobacterium de embriones de maíz inmaduros fue realizada como se ha descrito previamente (Negrotto D et al. 2000 Plant Cell Rep 19: 798; Ishida Y et al. 1996 Nat Biotecn 14: 745).
Los casetes de expresión para genes enzimáticos fueron clonados en los sitios KpnI-EcoRI del pAG2004 (SEC ID n.º: 85) vector para generar un vector intermedio capaz de la recombinación con el vector pSB1 en el acoplamiento triparental en la cepa Agrobacterium tumefaciens LBA4404 usando procedimientos proporcionados previamente 25 (Ishida Y et al. 1996 Nat Biotecn 14: 745; Hiei Y et al. 1994 Plant J 6: 271; Hiei Y and Komari T 2006 Plant Cell Tissue Organ Cult. 85: 27; Komari T et al. 1996 Plant J 10: 165).
Plantas de materia prima de maíz (cultivos Zea mays HiII, A188 o B73) crecieron en un invernadero con 16 horas de luz diurna a 28 °C.
Los embriones zigóticos inmaduros fueron aislados de los granos e inoculados con la solución de Agrobacterium con 30 los genes de interés.
Después de la inoculación, los embriones inmaduros crecieron en un proceso de cultivo de tejido durante 10 - 12 semanas.
Se tomó una muestra de semillas bien desarrolladas con hojas y raíces para el análisis PCR para identificar plantas transgénicas que contengan genes de interés. 35
Plantas positivas PCR y enraizadas se enjuagaron con agua para lavar el medio agar y se transplantaron en la tierra y crecieron en el invernadero para generar semillas y forraje.
[0089] Las plantas transgénicas particulares se denominan en este caso por una designación enzimática (por ejemplo; "P77853", " P40942", " 030700", " NtEGm", etc.) o control transgénico (p.ej.; " TGC," etc.) seguido por un 40 número expresado en millares que designa el plásmido usado para crear la planta (p.ej.; " 2014", " 2015", " 2229", " 2092", etc.).
Los caracteres adicionales son insertados ocasionalmente, pero la i) enzima o control y ii) designación de plásmido son claras en el contexto.
Los plásmidos a los que se refiere se nombran como pAGXXXX. 45
Por ejemplo, las designaciones "2229", " 2252", " 2253", " 2092", " 2096" o " 2042" en un nombre de planta transgénica significa que la planta transgénica se ha hecho por transformación con "pAG2229", " pAG2252", "pAG2253", " pAG2092", " pAG2096" o " pAG2042", respectivamente.
Se puede hacer referencia a las secuencias incorporadas marcadas con los nombres de plásmido para determinar secuencias usadas para hacer una planta transgénica particular. 50
[0090] Para generar plantas de pasto varilla transgénicas, se usaron semillas de Panicum virgatum, cv.
Se usó Alamo para iniciar las líneas de callo embriogénico de iniciación posteriormente usadas para la transformación usando Agrobacterium LBA4404 que contiene pSB1 plásmido.
La presencia del gen de interés se confirmó por PCR usando cebadores específicos de gen. 55
[0091] Las siguientes plantas transgénicas que expresan una enzima CWD o enzimas CWD y plantas de control se usaron para el pretratamiento e hidrólisis consolidados:
1. Planta de maíz tipo salvaje usada como controles negativos (AxB; BxA);
2. Plantas de maíz transformadas con un vector vacío usadas como controles negativos (TGC.4000.12 TGC.4000.11 60 TGC.2004.8.02 TGC.2004.8.04 TGC.2243.01)
3. Una planta de maíz transgénico XynA.2015.05 hecha por transformación con pAG2015 y expresión de xilanasa XynA (P77853);
4. Una planta de maíz transgénica de segunda generación XynA.2015.5T1 hecha por transformación con pAG2015 y expresión de xilanasa XynA (P77853); 65
5. Una planta de maíz transgénico XynB.2063.17 hecha por transformación con pAG2063 y xilanasa de expresión
XynB (043097);
6. Plantas de maíz transgénico EGA.2049.02 y EGA.2049.10 hechas por transformación con pAG2049 y expresión de endoglucanasa EGA (NtEG);
7. Una planta de maíz transgénico EGB.2042.03 hecha por transformación con pAG2042 y expresión de endoglucanasa EGB (P54583); 5
8. Una planta de maíz transgénico EGC.2253.4b hecha por transformación con pAG2253 y expresión de endoglucanasa EGC (033897);
9. Una planta de maíz transgénico EGA/XynA.2242.09 hecha por transformación con pAG2242 y expresión de endoglucanasa EGA (NtEG) y xilanasa XynA (P77853);
10. Una planta de maíz transgénico de segunda generación de planta 9, arriba, llamada EGA/XynA.2242.09.16T1 y 10 expresión de endoglucanasa EGA (NtEG) y xilanasa XynA (P77853);
11. Una planta de maíz transgénico XynA/AccB.2092.103 hecha por transformación con pAG2092 y expresión de xilanasa XynA (P77853) y feruloil esterasa B de Aspergillus niger;
12. Plantas de maíz transgénico XynA/AccA/B.2096.01 y XynA/AccA/B.2096.05 hechas por transformación con pAG2096 y expresión de xilanasa XynA (P77853), feruloil esterasa A de Aspergillus niger y feruloil esterasa B de 15 Aspergillus niger;
13. Una planta de maíz transgénico CBHA.2069.3.17 hecha por transformación con pAG2069 y expresión de exoglucanasa CBH (068438);
14. Plantas de pasto varilla transgénicas XynA.pv2015.3c y XynA.pv2015.4c hechas por transformación con pAG2015 y expresión de xilanasa XynA (P77853); 20
15. Una planta de maíz transgénico iXynA.2229.110 hecha por transformación con pAG2229 y expresión de xilanasa XynA modificada de inteína (P77853);
16. Plantas de maíz transgénico XynA/EGA.2309.54 y XynA/EGA.2309.107 hechas por transformación con pAG2309 y expresión de XynA (P77853), endoglucanasa EGA(NtEGm);
17. Una planta de maíz transgénico XynA/EGA.2342.105 hecha por transformación con pAG2342 y expresión de 25 XynA (P77853) y EGA(NtEGm);
18. Plantas de maíz transgénico XynE/EGC/CBHA.2339.03; XynE/EGC/CBHA.2339.04 y XynE/EGC/CBHA.2339.05 hechas por transformación con pAG2339 y expresión XynE (EU591743), endoglucanasa EGC(O33897) y CBHA (068438);
19. Una planta de maíz transgénico XynB/EGA/CBHA.2345.116 hecha por transformación con pAG2345 y expresión 30 XynB (043097), endoglucanasa EGA(NtEGm) y CBHA (068438);
20. Plantas de maíz transgénico XynB/EGA/CBHB.2349.55 y XynB/EGA/CBHB.2349.56 hechas por transformación con pAG2349 y expresión XyanB (043097), endoglucanasa EGA(NtEG), CBHB (BD22308) y ZmUbilP:ZmKozak:xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01:NosT.
35
Forraje de planta
[0092] Se secó el forraje de maíz de invernadero cosechado en un circulador de aire a 37 °C durante 1-2 semanas.
Tras el secado, el forraje se cortó manualmente en piezas de 1,0-1,5 pulgadas y luego se molieron utilizando un triturador UDY (modelo 014, UDY Corporation, Fort Collins, CO) con una pantalla de 0,5 mm. 40
Preparación de extractos de proteína de planta
[0093] Granos molidos individuales o 20 mg de forraje molido fueron resuspendidos en el búfer de extracción de proteína que incluye 100 mM de fosfato sódico (pH 6,5), ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA;1 mM), Triton X-100 45 (0,1 %; v/v) y fenilmetanosulfonilfluoride (PMSF; 0,1 mM).
Las muestras de tejido resuspendidas se mezclaron íntegramente y luego el material insoluble se sedimentó por centrifugación.
La proteína soluble que contiene líquido sobrenadante fue transferida a un tubo nuevo.
50
Productos químicos y enzimas
[0094] Estándares de azúcar (glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, manosa y celobiosa) fueron comprados de Acros orgánicos (Morris Plains, NJ).
Todos los otros productos químicos usados en este estudio fueron comprados de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). 55
Endoglucanasa (C8546), -glicosidasa (49291) y endoxilanasa (X2753) para hacer el cóctel interno todos se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO).
La celobiohidrolasa (CBHI) (EC 3.2.1.91) y -xilosidasa (EC 3.2.1.37) se obtuvieron de Megazyme (Wicklow, Irlanda).
Accellerase® 1500 y Accellerase® XY fueron regalos generosos de Genencor International (Rochester, NY). 60
La levadura Saccharomyces cerevisiae, cepa D5A se obtuvo de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) (Manassas, VA).
Ensayos de enzima de forraje
65
[0095] La proteína fue extraída de 15 mg de forraje en 500 µl de búfer de extracción (100 mM de búfer de fosfato
sódico, pH 6,5; NaOAc, pH 4,5; o Tris, pH 8,0, EDTA (10 mM) y Triton X-100 (0,1 %) tras la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente.
El forraje se centrifugó por centrifugación.
El sobrenadante se recogió y transfirió a un nuevo Eppendorftube.
Para ensayos enzimáticos, 50 µl de extracto de proteína fue resuspendida en un búfer. 5
Típicamente, la Xilazima incluía en el búfer en 100 mM Na de fosfato, pH 6,5 o Cellazyme en 100 mM NaOAc, pH 4,5.
Xilazima AX o comprimidos cellazyme se usaron como fue apropiado para cada tubo de ensayo enzimático.
Las reacciones se incubaron en la temperatura de ensayo (normalmente aproximadamente 50-60 °C, dependiendo de la enzima que se evalúe) hasta que un color azul fue visible en el líquido sobrenadante. 10
La cantidad de tinte de azul fue cuantificada por la absorbancia de medición de la reacción a 590 nm.
Controles para esta reacción incluían enzimas elevadas de manera microbiana y extractos de plantas tipo salvaje.
Sustratos de hidrólisis se pueden determinar también usando un sustrato conjugado de AZCL (Megazyme) en vez de xilazima AX y comprimidos de cellazyme.
Utilizar el sustrato conjugado de AZCL permite para la optimización que el volumen de forraje y la concentración de 15 sustrato se evalúen.
Detección de actividad de xilanasa
[0096] Las proteínas solubles se analizaron usando xilazima AX (Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland) como un 20 sustrato en reacciones de 0,5-ml a 50 °C en el búfer (100 mM, pH 8,0) para BSX o en el fosfato sódico (100 mM, pH 6,5) para XynB.
Para parar las reacciones de xilazima AX, 1 ml 2 % (p/v) Tris base se añadió a las reacciones.
El material insoluble desde la reacción de xilazima AX fue sedimentado por centrifugación y la absorbancia de la reacción 100 µL del sobrenadante fue medida por triplicado espectrofotométricamente a 590 nm. 25
Para la cuantificación de BSX o niveles de acumulación de XynB, las curvas de calibración fueron construidas por incubación de cantidades conocidas de BSX purificado, elevado de manera microbiana o XynB diluido en el búfer de ensayo con comprimidos de xilazima AX concurrentes con los ensayos de xilazima AX usando material vegetal transgénico.
30
[0097] Tabla 1 de abajo demuestra las actividades enzimáticas detectadas en plantas transgénicas.
Como se ha indicado, las actividades enzimáticas fueron detectadas para diferentes xilanasas, endoglucanasas, celobiohidrolasas y feruloilo esterasas.
Para cada evento transgénico, la actividad enzimática detectada fue confirmada también por análisis de electrotransferencia. "N/A" se refiere alanálisis que todavía no se ha realizado. 35
Tabla 1
Planta transgénica
Xilanasa Endoglucanasa CBH AccA o B
AxB
- - - -
BxA
- - - -
TGC.2243.01
- - - -
TGC.4000.12
- - - -
TGC.4000.11
- - - -
TGC.2004.8.02
- - - -
TGC.2004.8.04
- - - -
TGC.2243.01
- - - -
XynA.2015.05
+ - - -
XynA.2015.5T1
+ - - -
XynB.2063.17
+ - - -
EGA.2049.02
- + - -
EGA.2049.10
- + - -
EGB.2042.03
- + - -
EGC.2253.4b
- + - -
EGA/XynA.2242.09
+ + - -
EGA/XynA.2242.09.16T1
+ + - -
XynA/AccB.2092.103
+ - - +
XynA/AccA/B.2096.01
+ - - +
XynA/AccA/B.2096.05
+ - - +
XynA.pv2015.3c
+ - - -
XynA.pv2015.4c
+ - - -
IXynA.2229.110
+ - - -
XynA/EGA.2309.54
+ + - -
XynA/EGA.2309.107
+ + - -
XynA/EGA.2342.105
+ + - -
XynE/EGC/CBHA.2339.03
+ + N/A -
XynE/EGC/CBHA.2339.04
+ + N/A -
XynE/EGC/CBHA.2339.05
+ + N/A -
XynB/EGA/CBHA.2345.116
+ + N/A -
XynB/EGA/CBHB.2349.55
+ + + -
XynB/EGA/CBHB.2349.56
+ + + -
Análisis composicional de carbohidrato de biomasa
[0098] Antes del análisis composicional de carbohidrato, duplicados de 3,0 g de forraje molido secado al aire regurgitaron con 90 % (v/v) de etanol utilizando un sistema de extracción de vidrio Soxhlet (Fisher Scientific, 5 Pittsburg, PA) para eliminar los materiales de etanol extraíbles siguiendo estándares NREL (NREL/TP-510-42619).
Los extractos que contienen etanol se evaporaron al vacío utilizando un evaporador giratorio equipado con un baño maría establecido a 40 °C (Heidolph LR4000 G5B, IL EE.UU).
El contenido del extracto se determinó por el peso de los sólidos en el matraz después del secado al horno a 50 °C durante 48 horas. 10
[0099] El forraje sin extracto fue sujeto a una hidrólisis de ácido en dos etapas (NREL/TP-510-42618), que fue el primer hidrolizado a 30 °C con 1,5 ml de 72 % (p/p) H2SO4 por 0,16-0,18 g (peso seco en aire) durante 60 min, seguido de 121 °C durante 1 hora con suplementación de 42,0 ml de agua.
Después de la hidrólisis ácida, hidróxido sódico e hidróxido cálcico se añadieron para ajustar el pH a entre 4,0 y 9,0 15 y todas las muestras se filtraron a través de un 0,2 µm de PVDF filtros (Fisher Scientific, Pittsburg, PA) para el análisis de cromatografía líquida (HPLC) de alto rendimiento.
Proceso consolidado con pretratamiento y sacarificación moderados
20
[0100] Para evaluar el efecto de enzimas CWD expresadas en planta en la hidrólisis de forraje, se desarrolló un proceso consolidado que incluía un pretratamiento moderado seguido de hidrólisis enzimática sin lavado de interfase de la biomasa/detoxificación.
El proceso consolidado elimina cualquier paso de lavado/separación/detoxificación y permite un pretratamiento integrado y sacarificación simultánea y proceso de fermentación (SSF). 25
[0101] Pretratamiento moderado Un pretratamiento moderado eficaz fue desarrollado de forma que puede conseguir algunos efectos de pretratamiento en la biomasa, pero no desactivar las enzimas hidrolíticas en la planta.
La sustancia química de pretratamiento fue una mezcla de 0,02M - 0,18 M de amonio bisulfito y 0,025M - 0,20 M de carbonato amónico con pH entre 5,0 y 9,0, preferiblemente alrededor de 8,10. 30
Para evaluar la hidrólisis de forraje de planta, 20,0 mg de forraje de maíz molido se añadió a 2-ml tubos de microcentrifugadora con solución de sustancia química de pretratamiento a una proporción alcohol a sólido (L/S) de 10 o menos (preferiblemente 3 - 6).
El pretratamiento fue incubado en una coctelera a 350 r.p.m. y a una temperatura de 40 °C - 95 °C durante 0 - 16 horas. 35
Para forraje molido y no molido, una refinación mecánica o desfibrilación siguieron el pretratamiento con productos químicos.
Además, el material pretratado fue sujeto a hidrólisis enzimática sin lavado de interfase.
[0102] Hidrólisis enzimática El forraje pretratado fue sujeto a hidrólisis enzimática en un polibúfer Britton-Robinson 40 (40 mM fosfato, 40 mM acetato, 40 mM borato) con azida sódica.
La hidrólisis enzimática fue conducida a 2 % de contenido de sólidos (p/v), pH 4.9, 50 °C en un nuevo agitador Brunswick (New Brunswick Scientific, New Jersey USA) a 250 r.p.m. por un tiempo variable (0-144 horas).
Cóctel #1 fue cargado como 0,5 µM endoglucanasa, 0,1 µM celobiohidrolasa (CBHI), 0,05 µM -glicosidasa y 0,5 µM endoxilanasa basada en 10,0 mg de forraje con un volumen de reacción de 1 ml. 45
Cóctel 5# era el cóctel #1 con 0,1 µM de -xilosidasa adicionada.
En la conjunción, tres tipos de hidrólisis enzimática pasaron en paralelo: ningún cóctel enzimático (NCt), un cóctel de enzima completa (FCt) y un cóctel enzimático que carece de la enzima expresada en-planta (Ct-PE), por ejemplo, cóctel enzimático carente de una endoxilanasa (Ct-Xin) o endoglucanasa (Ct-EG) o ambos (Ct-EG-Xin) dependiendo de la enzima expresada en plantas. 50
Accellerase® 1500 fue cargada a 0,2 ml/g de masa seca y Accellerase® XY fue cargada a 0,1 ml/g de masa seca.
Los rendimientos de glucosa y xilosa (% de teorético) fueron expresados como un porcentaje de glucosa y xilosa total en cada sustrato.
Las barras de error en las figuras de acompañamiento son la desviación típica del medio de ensayos de replicación.
55
Sacarificación y fermentación simultáneas (SSF)
[0103] El inóculo se preparó por el crecimiento de la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae D5A a un OD600 de 0,5 en el YPD (10 g/l extracto de levadura, 20 g/l peptona y 20 g/l dextrosa) a 30 °C y 250 r.p.m.
Las células fueron cosechadas por centrifugación (3000 g durante 5 min) y resuspendidas en un 1X YP (10 g/l extracto de levadura y 20 g/l peptona).
[0104] Experimentos de SSF fueron realizados por duplicado en matraces de vidrio Erlenmeyer de 250 ml con un volumen de trabajo de 50 ml, que consiste en 3,0 - 4,0 g (peso en seco) de biomasa pretratada, tampón Britton-5 Robinson, 10 x YP (100 g/l de extracto de levadura y 200 g/l de peptona), inóculos y enzimas hidrolíticas.
Los matraces fueron sellados por un obstaculizador de caucho con una cámara de descompresión.
Los experimentos comenzaron añadiendo inóculos de levadura y enzimas (Accellerase® 1500 a 10 FPU/g masa seca y Accellerase® XY a 0,1 ml/g de masa seca), y fueron incubados a 35 °C y 120 r.p.m. durante 7 días.
Las muestras se retiraron después de 0, 24, 48, 72, 144 y 168 horas y se analizaron para etanol y azúcares. 10
Análisis de azúcares fermentables y etanol
[0105] Las muestras de hidrolizado fueron calentadas a 90 °C durante 20 min y luego centrifugadas a 10,000 g, seguidos de las cuales los sobrenadantes fueron clarificados por el paso a través de filtros 0,20 µm PVDF (Cat. #: 15 09-910-13, Fisher Scientific, Pittsburg, PA).
Las concentraciones de monosacárido y disacárido fueron determinadas por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), utilizando una bomba binaria Shimadzu LC-20 AD con soluciones de software LC (Shimadzu, Kyoto, Japón).
Concentraciones de azúcar fueron determinadas utilizando una columna de azúcar Aminex HPX-87P (Bio-Rad 20 Laboratories, Hércules, CA) que opera a 0,6 ml/min y 80 °C con agua desgasificada como la fase móvil.
Se analizó la concentración de etanol en el caldo de fermentación utilizando una columna Aminex HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Hércules, CA) columna ácida que opera a 0,6 ml/min, 60 °C con 0,004 M de ácido sulfúrico como la fase móvil.
Áreas de valor máximo para todas las muestras, analizadas con un detector RI (RID 10AD), fueron integradas y los 25 valores fueron en comparados con curvas estándar para cuantificación.
Ejemplo 2 - Análisis composicional de carbohidrato de forraje de planta
[0106] El forraje de plantas transgénicas fue caracterizado en cuanto a su composición de carbohidrato estructural y 30 el contenido de azúcar para examinar cualquier cambio significativo provocado por modificación genética.
Tabla 2 muestra resultados del análisis de carbohidrato estructural de maíz transgénico y no transgénico probado de forma aleatoria y sucesos de pasto varilla.
El contenido en glucano y xilano a partir de un conjunto de plantas transgénicas, si expresan una enzima única o enzimas múltiples CWD o si carecen de un transgen que codifica una enzima CWD (control transgénico TGC), son 35 similares a plantas de control tipo salvaje (AxB).
Tabla 2. Contenido en glucano y xilano de plantas transgénicas (expresión CWD o TGC) frente a plantas (AxB) no transgénicas de tipo salvaje.
40
Forraje de planta
# sucesos (n) Glucano (g/100 g de forraje) Xilano (g/100 g de forraje)
Controles de maíz tipo salvaje
4 31,51 ± 0,33 17,12 ± 0,66
Controles de maíz transgénico
8 30,16 ± 1,02 15,99 ± 1,14
Maíz transgénico con enzimas
18 31,40 ± 1,52 16,59 ± 1,34
[0107] Una prueba T de estudiante de las muestras en la tabla 2 no presenta ninguna diferencia significativa en la cantidad de glucano entre sucesos de maíz transgénico que expresan enzimas CWD y maíz tipo salvaje AxB o entre sucesos de maíz transgénico que expresan enzimas CWD y sucesos de control transgénico que no expresan una enzima CWD con un p-valor de 0,90 y 0,14, respectivamente. 45
Los p-valores correspondientes a partir de una prueba T en el contenido de xilano son 0,57 y 0,36, respectivamente.
[0108] Por lo tanto, la expresión en planta de enzimas proporciona una oportunidad para producir no solo enzimas de coste bajo sino también materias primas de biomasa con características hidrolíticas para la producción de azúcar fermentable económico. 50
Ejemplo 3 - Efecto de enzimas CWD expresadas en planta en la hidrólisis de biomasa
Metodología para la evaluación de hidrólisis de biomasa vegetal
55
[0109] Uno de los objetos de la expresión de enzimas CDW en planta es eliminar o reducir la gravedad de condiciones de pretratamiento químico para el tratamiento de biomasa lignocelulósica.
[0110] Para evaluar los efectos de enzimas CWD expresadas en planta en la hidrólisis de biomasa, fue desarrollado
un proceso consolidado con pretratamiento de sustancia química moderada (pH 5.0 - 9.0,55 °C durante 16 horas) seguido de una hidrólisis enzimática (pH 4.9, 50 °C durante 72 horas) sin lavado de interfase y elegido como un procedimiento estándar para la selección de forraje de planta inicial.
En este proceso, se usaron cócteles de enzima internos (cóctel #1 y cóctel #5) para la evaluación.
El cóctel interno es una combinación de componentes enzimáticos individuales, que permite la omisión de cualquier 5 componente dependiendo de la identidad de la enzima(s) expresada en la planta.
Para cada forraje de planta transgénico y forraje de planta de control transgénico o tipo salvaje, los tratamientos siguientes para hidrólisis enzimática se realizaron en paralelo: ningún cóctel enzimático (NCt), cóctel completo (FCt) y cóctel que carece de la enzima expresada en planta (Ct-PE; por ejemplo, cóctel carente de xilanasa (Ct-Xyn), cóctel carente de endoglucanasa (Ct-EG) o cóctel carente tanto de xilanasa como de endoglucanasa (Ct-Xyn-EG)). 10
[0111] Para determinar qué enzima o enzimas permiten un buen rendimiento de hidrólisis, se usaron dos criterios para evaluar las características de tratamiento de sucesos transgénicos de expresión de enzimas CWD en la selección inicial:
1. Rendimiento de azúcar total de la hidrólisis de cóctel total (FCt) (altura (1) en figuras 2A-2B). 15
2. Diferencia de rendimiento de azúcar entre hidrolizaciones que implican el cóctel completo (FCt) y el cóctel enzimático sin la enzima que se expresa en planta (Ct-PE) (altura (2) en figuras 2A-2B).
[0112] El azúcar total producido (altura (1)) del tratamiento es un criterio para ser considerado porque afecta directamente al rendimiento de productos finales, la productividad y coste operativo. 20
Con la expresión en planta de enzimas CWD se demostró que las plantas transgénicas que expresan enzimas consiguieron una mejor hidrólisis en general que una planta de control bajo las mismas condiciones de tratamiento, lo que se demostró de los rendimientos de glucosa y xilosa totales en la FIG. 2.
El segundo criterio, la diferencia de rendimiento de azúcar entre FCt y Ct-PE (altura (2)) representa un efecto de enzimas expresadas en planta en la hidrólisis. 25
Al usar estas plantas transgénicas como materias primas de biomasa, se observó que las enzimas externas en el cóctel enzimático se pueden sustituir parcialmente o completamente por una enzima CWD o enzimas CWD expresadas en plantas transgénicas, mientras se consigue una hidrólisis similar o igual, lo que se indica por un cambio menor o ninguna diferencia en el rendimiento de azúcar entre hidrólisis FCt y Ct-PE (FIG. 2B).
30
Evaluación de hidrólisis de forraje de planta
[0113] Utilizando los dos criterios de selección identificados arriba, se realizó la hidrólisis enzimática de muestras de forraje con el cóctel interno para filtrar el rendimiento de diferentes enzimas CWD de expresión de plantas de maíz transgénico. 35
Basados en los resultados de esta selección, los mejores sucesos de planta transgénica llevados a cabo fueron identificados e incluidos en plantas transgénicas que expresan xilanasa XynA.2015.05 y XynB.2063.17 plantas transgénicas que expresan endoglucanasa EGA.2049.10 y EGB.2042.03, y plantas transgénicas que expresan múltiples enzimas XynA/AccA/B.2096.01; XynA/AccB.2092.103; EGA/XynA.2242.09; XynB/EGA/CBHA.2345.116; XynB/EGA/CBHB.2349.55 XynB/EGA/CBHB.2349.56 y XynB/EGA/CBHB.2349.229. 40
[0114] FIG. 2 ilustra rendimientos de glucosa (FIG. 2A) y xilosa (FIG. 2B) después de la hidrólisis de material a partir de una planta transgénica que expresa xilanasa A (XynA; XynA.2015.05) y una planta de control transgénico TGC.4000.12 que no expresa una enzima CWD (TGC.4000.12). Los datos en rendimientos de azúcar del suceso transgénico XynA.2015.05 y el control transgénico después de la hidrólisis enzimática por FCt (cóctel interno #5), 45 NCt y Ct-Xyn (cóctel interno #5 carente de xilanasa A) fueron evaluados utilizando los criterios de selección citados anteriormente.
Se mostró que el valor de un rendimiento de glucosa total después del tratamiento FCt (criterio 1) fue más alto que la diferencia de valores de rendimiento de glucosa entre tratamientos FCt y Ct-Xyn (criterio 2) para ambos XynA.2015.05 y TGC.4000.12. 50
El valor de rendimientos de glucosa y xilosa para todos los tratamientos fue más alto para el suceso transgénico XynA.2015.05 que para la planta de control TGC.4000.12.
De manera interesante, la diferencia de los rendimientos de glucosa y xilosa después de tratamientos con un cóctel enzimático completo y un cóctel enzimático sin la xilanasa expresada en planta A fue muy pequeña.
Basada en estos resultados, la xilanasa A expresada en una planta fue casi tan eficaz en la hidrolización del forraje 55 de planta como la xilanasa A proporcionada en un cóctel completo.
Basado en el criterios de selección 1 y 2, el suceso transgénico XynA.2015.05 mostrado en la FIG. 2 fue identificado como un buen realizador para hidrólisis.
Xilanasa de expresión de plantas 60
[0115] El xilano se conoce por ser la hemicelulosa dominante en la madera dura, residuo agrícola, biomasa y hierbas perennes.
Xilano es un biopolimero heteropolimérico que consiste en una repetición esqueleto de xilosa -1,4-vinculada adornado con grupos de derivación y se puede reticular a lignina por ésteres aromáticos (Dodd D y Cann IO 2009 65 Glob Change Biol Bioenergy 1: 2).
La destrucción y eliminación de xilano beneficia la hidrólisis de celulosa en azúcares fermentables.
En un cóctel de enzima hidrolítica típica, las xilanasas son una gran clase de enzimas CWD requeridas para hidrolizar polímeros de hemicelulosa ya que estos desempeñan un papel clave en hacer que la celulosa sea más accesible a la hidrólisis enzimática.
En referencia a FIG. 3B, figuras 5B - 5D y FIG. 7B, la XynA o XynB de expresión de sucesos de planta transgénica 5 (XynB.2063.17; XynA/Acc/A/B.2096.01 y XynA.2015.05T1) demostraron 29.80-172.1 % de conversión de xilano más alta de Ct-Xyn hidrólisis que las plantas de control, indicando el efecto mejorado de la xilanasa expresada en planta en la hidrólisis de xilano de biomasa.
Asimismo, estas plantas transgénicas también muestran 50,1-93,5 % de conversión de glucano más alta de Ct-Xyn hidrólisis de lo que lo hicieron las plantas de control. 10
[0116] Figuras 3A-3B ilustran rendimientos de glucosa (FIG. 3A) y xilosa (FIG. 3B) a partir de una xilanasa de expresión de tejido vegetal transgénico pretratado B (XynB.2063.17) y un control tipo salvaje (AxB) después de la hidrólisis por el cóctel interno # 1, (FCt) cóctel # 1 carente de xilanasa B (Ct-Xin) y ningún cóctel (NCt).
Resultados para un tratamiento Ct-Xyn demostraron 63,2 % de rendimiento de glucosa más alto y 109,4 % de 15 rendimiento de xilosa más alto del suceso transgénico XynB.2063.17 que de la planta de control AxB.
Hidrólisis de xilano mejorada del suceso XynB.2063.17 fue evidente también de la pequeña diferencia en valores de rendimiento de xilosa entre los tratamientos FCt y Ct-Xyn (criterio 2).
[0117] Estos resultados muestran sorprendentemente un buen funcionamiento de xilanasa B expresada en la planta 20 en la hidrolización de forraje en comparación con la enzima proporcionada en el cóctel completo.
Celulosa de expresión de plantas
[0118] La biomasa lignocelulósica se conoce por estar compuesta por una matriz con biopolímeros entrelazados 25 múltiples (celulosa, hemicelulosas, lignina y extractivos), lo que requiere diferentes clases de enzimas en grandes cantidades para liberar eficazmente azúcares fermentables.
Entre estos, la celulasa es una enzima clave.
Tres tipos de celulasas; endoglucanasa, exoglucanasa y -glucosidasa, trabajan juntas para hidrolizar celulosa en la glucosa. 30
En el proceso de hidrólisis, la endoglucanasa rompe reticulaciones entre cadenas de celulosa mientras la exoglucanasa hidroliza las cadenas de glucano individuales y la -glucosidasa descompone los productos de exoglucanasa para monómeros de glucosa (Sticklen MB 2008 Nature Reviews Genetics 9:433).
[0119] Figuras 4A-4B muestran los resultados de hidrólisis para las endoglucanasas de expresión de plantas 35 transgénicas.
Estas figuras ilustran rendimientos de glucosa de los eventos transgénicos EGA.2049.02 y EGA.2049.10, que expresan endoglucanasa A (EGA) y la planta de control transgénica TGC.4000.12, que carece de la enzima (FIG. 4A).
Estas figuras también ilustran rendimiento de glucosa del suceso transgénico EGB.2042.03, que expresa 40 endoglucanasa B (EGB) y la planta de control transgénico TGC.2004.8.02 (FIG. 4B).
Tratamientos de hidrólisis fueron con el cóctel enzimático completo #1 (FCt), cóctel enzimático carente de endoglucanasa (Ct-EG) y ninguna de las enzimas (NCt).
Para sucesos de maíz de expresión EGA, tanto EGA.2049.02 como EGA.2049.10 consiguieron 48,9-126,9 % de conversión de glucano más alta en comparación con la planta de control transgénica (TGC.4000.12) (FIG. 4A). 45
La diferencia en los rendimientos de glucosa entre Ct-EG e hidrólisis FCt es insignificante para EGA.2049.10 y aproximadamente 29,1 % menor para TGC.4000.12.
Observaciones similares basadas en criterio 2 se hicieron para el suceso transgénico EGA.2049.02.
En referencia a FIG. 4B, la planta transgénica de expresión EGB EGB.2042.0) muestra 63,6 % de conversión de glucano más alta de Ct-EG hidrólisis que el control transgénico TGC.2004.8.02. 50
Sorprendentemente, el rendimiento de glucosa de Ct-EG hidrólisis de EGB.2042.03 solo es 12,2 % inferior en comparación con el valor inferior de hidrólisis FCt 23,0 % de los tratamientos correspondientes para TGC.2004.8.02.
Estos datos muestran aproximadamente 50,0 % de hidrólisis mejor de la planta de expresión EGB que de la planta de control.
55
Plantas que expresan múltiples enzimas
[0120] Para desarrollar un sistema de producción de enzima eficaz y económico para la despolimerización de biomasa rápida y menos costosa, diferentes enzimas usadas en el cóctel de enzima hidrolítica fueron expresadas en el maíz. 60
[0121] Figuras 5A-5D y figuras 6A-6B muestran los resultados desde la hidrólisis de las plantas transgénicas XynA/AccA/B.2096.05; XynA/AccA/B.2096.01; EGA/XynA.2242.09; XynB/EGA/CBHB.2349.56; XynB/EGA/CBHB.2349.55 y XynB/EGA/CBHA.2345.116, que expresan enzimas múltiples.
65
[0122] Figuras 5A - 5B ilustran los datos de hidrólisis enzimática de las plantas de maíz transgénico pretratado
XynA/AccA/B.2096.01; XynA/AccA/B.2096.05 expresión de xilanasa A (XynA) y enzimas accesorias (Acc) y la planta de control transgénica TGC.2004.8.02 después del cóctel completo #1, (FCt) cóctel #1 sin xilanasa (Ct-Xin) y tratamientos (NCt) sin cóctel.
El rendimiento de glucosa (FIG. 5A) de la hidrólisis Ct-Xyn de los eventos transgénicos XynA/AccA/B.2096.01; XynA/AccA/B.2096.05 es, respectivamente, 80,4 % y 93,5 % superior que de la planta de control TGC.2004.8.02. 5
En referencia a la FIG. 5C, el rendimiento de glucosa sorprendentemente más alto de Ct-Xyn-EG hidrólisis de EGA/XynA.2242.09 se puede explicar por un efecto hidrolítico sinergístico.
Asimismo, la eficiencia de conversión de xilano basada en rendimiento de xilosa (FIG. 5B) de CT-Xin hidrólisis de los tejidos transgénicos de XynA/AccA/B.2096.01; XynA/AccA/B.2096.05 es, respectivamente, 143,4 % y 172,1 % superior que de la planta de control TGC.2004.8.02. 10
La eficiencia alta observada de conversión de xilano para estos sucesos transgénicos también se puede atribuir a un efecto sinergístico de enzimas múltiples.
[0123] FIG. 5 ilustra rendimientos de glucosa (FIG. 5C) y xilosa (FIG. 5D) del suceso de maíz transgénico EGA/XynA.2242.09 que simultáneamente expresa endoglucanasa A (EGA) y xilanasa A (XynA) seguida de los 15 tratamientos enzimáticos con el cóctel completo #1, (FCt) cóctel #1 carente de xilanasa (Ct-Xin), cóctel #1 carente de endoglucanasa (Ct-EG] y cóctel #1 carente de xilanasa y endoglucanasa (Ct-Xin-EG).
La expresión en planta de XynA produce rendimientos de glucosa mejorada y xilosa mejorados para EGA/XynA.2242.09 después de la hidrólisis.
Por ejemplo, para el tratamiento Ct-Xyn los sucesos transgénicos de demostraron 50,1 % eficiencia más alta de 20 conversión de glucano (FIG. 5C) y 29,8 % de eficiencia más alta de conversión de xilano (FIG. 5D) con respecto al de la planta de control.
La expresión en planta de EGA produce una eficiencia mejorada de hidrólisis de glucano evidente de la diferencia en los rendimientos de glucosa entre tratamientos FCt, Ct-EG y Ct-Xyn-EG.
25
[0124] Las Figuras 6A-6B ilustran rendimientos de glucosa (FIG. 6A) y xilosa (FIG. 6B) de 1) sucesos transgénicos que simultáneamente expresan tres enzimas CWD (XynB/EGA/CBHB.2349.56 y XynB/EGA/CBHB.2349.55, que simultáneamente expresan xilanasa B, endoglucanasa A, (EGA) celobiohidrolasa B y XynB/EGA/CBHA.2345.116, que expresa simultáneamente xilanasa B, endoglucanasa A (EGA) y celobiohidrolasa A) y 2) planta de control tipo salvaje AxB. Cóctel completo (FCt) y no se ha mostrado ningún resultado de tratamientos (NCt) de cóctel enzimático. 30
El pretratamiento incluía 0,17 M de bisulfito de amonio y carbonato amónico (BSC), una proporción líquido a sólido igual a 10, a 55 °C durante 17 horas.
La hidrólisis enzimática del forraje fue realizada a 50 °C, pH 5,0 durante tres días utilizando 0,2/0,1 ml de Accellerase® 1500/XY por gramo de forraje.
En referencia a la FIG. 6, los resultados muestran que los rendimientos de glucosa y xilosa de las plantas 35 transgénicas que expresan tres enzimas CWD fueron mucho mayores que de la planta de control tipo salvaje.
Sorprendentemente, el mejor suceso de realización XynB/EGA/CBHB.2345.56 mostró 43,6 % más alto en el rendimiento de glucosa y 117,6 % más alto en el rendimiento de xilosa que el del control negativo (AxB) después de un pretratamiento químico muy moderado.
40
Plantas de segunda generación que expresan enzimas CWD
[0125] La planta de primera generación (TO) XynA.2015.05 fue identificada como un buen candidato de hidrólisis.
Para evaluar adicionalmente este suceso y la construcción de (XynA) de enzima correspondiente, se plantaron semillas de este suceso para generar una progenie de segunda generación T1. 45
Los resultados de evaluación de hidrólisis para T0 y T1 de plantas XynA.2015.05 se muestran en la FIG. 7B.
[0126] Los dos criterios usados para la evaluación de las T0 plantas fueron también aplicados para evaluar la eficiencia de hidrólisis de las plantas producidas en T1 y para demostrar que las enzimas pueden ser eficaces a través de especies. 50
FIG. 7B muestra rendimientos de glucosa (FIG. 7A) de plantas de pasto varilla realizadas utilizando rendimientos de pAG2015 y xilosa (FIG. 7B) de un T0 suceso transgénico XynA.2015.05T0 que expresa xilanasa A, el T1 suceso transgénico XynA.2015.05T1 que expresa xilanasa A y la planta de control transgénica que carece de enzima TGC.4000.11.
La hidrólisis se realizó junto con el cóctel completo, (FCt) el cóctel que carece de xilanasa (Ct-Xin) y ningún 55 tratamiento (NCt) de cóctel enzimático.
Para el tratamiento Ct-Xyn, el suceso transgénico de primera generación XynA.2015.05T1 demostró 55,3 % de alto glucano y 101,6 % de hidrólisis de xilano como se ha determinado por los rendimientos de glucosa y xilosa similar al del suceso de primera generación XynA.2015.05T0 y superior al rendimiento de azúcar para la planta de control TGC.4000.12. 60
[0127] Estos datos muestran que enzimas expresadas en la planta son heredables y preservan una actividad en generaciones posteriores de plantas transgénicas.
Especies de planta diversas 65
[0128] Además de los sucesos de maíz transgénico, las plantas de pasto varilla que expresan xilanasa A fueron obtenidas mediante la transformación con el vector pAG2015.
Al expresar la xilanasa A a partir de un buen realizador de hidrólisis de maíz XynA.2015.05 en el pasto varilla por transformación con la misma construcción (pAG2015) el pasto varilla transgénico resultante XynA.pv2015.3c también demuestra una mejor conversión de glucano y xilano sobre el pasto varilla de control Alamo. 5
FIG. 8 ilustra rendimientos de glucosa (FIG. 8A) y xilosa (FIG. 8B) seguidos de hidrólisis de los rendimientos de pasto varilla transgénico pretratado XynA.pv2015.3c, XynA.pv2015.4c y la planta de pasto varilla de control tipo salvaje (Alamo) en tratamientos con el cóctel completo (FCt), cóctel enzimático carente de xilanasa (Ct-Xin) y ninguna de las enzimas (NCt).
Ambos eventos transgénicos XynA.pv2015.3c y XynA.pv2015.4c muestran mejor hidrólisis que el pasto varilla de 10 control (Alamo).
El mejor suceso de realización XynA.pv2015.3c demostró aproximadamente 30,0 % de eficiencia más alta en la conversión de glucano y 50,0 % de eficiencia más alta en la conversión de xilano en comparación con la de la planta de control.
Estos datos muestran que la misma característica hidrolítica se puede conservar a través de enzimas de expresión 15 de especies en la planta.
Plantas que expresan enzimas modificadas de inteína
[0129] Para evitar efectos perjudiciales de acumulación en planta de enzimas CWD en el crecimiento de planta, 20 enzimas modificadas de inteína fueron desarrolladas y expresadas en plantas para conseguir rendimiento deseable en la hidrólisis sin causar anomalías fenotípicas en plantas.
FIG. 9 ilustra rendimientos de glucosa (FIG. 9A) y xilosa (FIG. 9B) después de la hidrólisis de una planta transgénica pretratada iXynA.2229.110 que expresa XynA modificada de inteína y una planta de control tipo salvaje AxB en FCt, Ct-Xyn y tratamientos NCt. 25
La temperatura de pretratamiento superior a 50 °C indujo la unión de inteína en iXynA.2229.110.
La hidrólisis por Ct-Xyn demuestra un 66,0 % de eficiencia más alta de conversión de glucano y un 57,3 % de eficiencia más alta de conversión de xilano para iXynA.2229.110 que para la planta de control AxB.
Las plantas transgénicas iXynA.2229.110 fueron todas normales
30
[0130] Los datos del análisis composicional de carbohidrato no mostraron ninguna diferencia significativa en las cantidades de glucano y xilano entre las plantas transgénicas que expresan la enzima hidrolítica o enzimas y plantas de control.
Los resultados de hidrólisis demostraron que las plantas transgénicas que expresan enzimas CWD consiguieron hasta un 141 % de rendimiento de glucosa más alto y 172 % de rendimiento de xilosa más alto comparado con las 35 plantas de control de hidrólisis enzimática bajo las condiciones experimentales.
Ejemplo 4 - Transcurso temporal de hidrólisis
[0131] Para evaluar mejor el efecto de las enzimas expresadas en planta en la hidrólisis, se llevó a cabo una 40 evaluación del transcurso temporal de hidrólisis para plantas transgénicas candidatas.
FIG. 10 compara los transcursos temporales para la hidrólisis (FCt) de cóctel completo de planta transgénica XynB, 2063.17, XynA.2015.05T1 y la planta de control TGC.2004.8.02.
La cinética de hidrólisis sigue un perfil típico: una hidrólisis inicial rápida se sigue por una fase de aumento lenta y una meseta final. 45
La hidrólisis se ralentiza a las 24 horas y se nivela después de 48 horas.
Las xilanasas de expresión de plantas transgénicas en planta demuestran consistentemente mejor hidrólisis que la planta de control a través del paso del tiempo, como es evidente de 30,0-40,0 % de rendimientos de glucosa más altos para una hidrólisis de 3-días.
Expresión de xilanasa en la planta se puede considerar como un pretratamiento enzimático para mejorar tanto la 50 hemicelulosa de biomasa como la hidrólisis de celulosa.
[0132] FIG. 11 ilustra el transcurso temporal de hidrólisis enzimática de la planta transgénica EGA.2049.10 que expresa endoglucanasa A (EGA) en comparación con una planta de control transgénica TGC.4000.11 que usa FCt y Ct-EG. 55
El efecto de la endoglucanasa A expresada en planta en la hidrólisis se demostró por la diferencia en los rendimientos de glucosa de estas plantas en todo el curso temporal de Ct-EG hidrólisis.
En todo el curso temporal, las plantas que expresan endoglucanasa EGA.2049.10 demostraron un 48,9 % y 63,6 % de conversión de glucano consistentemente más alta de Ct-EG hidrólisis de lo que lo hicieron las plantas de control TGC.4000.11. 60
Sorprendentemente, se ha conseguido una hidrólisis más eficaz y más rápida de las plantas transgénicas con expresión de endoglucanasa.
[0133] FIG. 12 ilustra el curso temporal de hidrólisis enzimática del suceso transgénico EGA/XynA.2242.09 que expresa EGA y XynA y la planta de control transgénica TGC.4000.11. 65
El suceso transgénico EGA/XynA.2242.09 demuestra consistentemente rendimientos de glucosa (FIG. 12A) y xilosa
(FIG. 12B) más altos usando FCt, Ct-EG y Ct-Xyn en comparación con los de la planta de control TGC.4000.11.
Los datos demuestran que estos rendimientos altos de azúcar se originan de la expresión simultánea de endoglucanasa y xilanasa en plantas.
[0134] FIG. 13 ilustra el curso temporal de la hidrólisis enzimática de la planta transgénica XynA/AccB.2092.103 que 5 expresa XynA y una enzima accesoria (Aspergillus niger FAEB) y la planta de control transgénico TGC.4000.11 que usa tratamientos FCt y Ct-Xyn.
La hidrólisis Ct-Xyn del forraje pretratado de la planta transgénica XynA/AccB.2092.103 consiguió más del 30% de eficiencia más alta en la conversión de glucano (FIG. 13A) y más del 24 % de eficiencia más alta en la conversión de xilano (FIG. 13B) que una planta de control transgénico en todo el curso temporal. 10
[0135] En referencia a la FIG. 12 y FIG. 13, la mejor hidrólisis de plantas transgénicas que expresan enzimas múltiples fue también observada en cuanto a rendimientos de glucosa y xilosa en todo el curso temporal de hidrólisis de XynA/AccB.2092.103 y EGA/XynA.2242.09.
La mejor hidrólisis se puede explicar por un efecto sinergístico de la acción de enzimas múltiples. 15
[0136] En referencia a las figuras 10, 11, 12A y 13A, los resultados muestran que además de los altos rendimientos de hidrólisis conseguidos a través de la expresión de enzimas CWD en plantas, los perfiles de cinética de los sucesos transgénicos que expresan enzimas CWD durante el curso temporal de hidrólisis muestran un gradiente inicial más alto en el cambio de rendimientos de glucosa en comparación con el de plantas de control que indican 20 una hidrólisis inicial más rápida.
[0137] En referencia a la FIG. 10, además de la mejor hidrólisis, las enzimas hidrolíticas de expresión de plantas transgénicas también muestran una hidrólisis inicial más rápida de lo que lo hace la planta de control (FIG. 10).
Después de la expresión en planta, las enzimas hidrolíticas han sido acumuladas dentro de células vegetales. 25
Durante el tratamiento, estas pueden empezar a funcionar inmediatamente in situ sin la necesidad de un transporte y difusión a larga distancia.
Por lo tanto, se espera que la eficiencia de estas enzimas sea alta debido a la resistencia baja de transferencia de masa y una reducción prevista en la unión no selectiva de las enzimas en planta con lignina u otras moléculas no diana. 30
La sobreexpresión de enzimas de degradación de biomasa vegetal en plantas no parece suponer una reducción en la celulosa, sino una intercalación débil de xiloglucano, seguida de una modificación de pared irreversible.
Todos estos factores pueden contribuir a la hidrólisis más rápida para plantas que expresan enzimas.
Ejemplo 5 - Mejoras de hidrólisis mediante el aumento de temperatura de pretratamiento 35
[0138] Con los productos químicos de pretratamiento, una alta temperatura relativamente alta para el pretratamiento típicamente proporciona más efectos de pretratamiento en la hidrólisis.
Para examinar el efecto de temperatura de pretratamiento, los principales ejecutadores de hidrólisis identificados estuvieron sujetos a pretratamientos a 65 °C y 75 °C. 40
Los rendimientos de hidrólisis de glucosa de estas plantas se muestran en la FIG. 14.
[0139] Se ha descubierto que la termoestabilidad de algunas enzimas CWD incluyendo endoglucanasa A (077044) puede mejorar cuando se expresa en plantas.
La termoestabilidad de enzimas altamente termoestables tales como una endoglucanasa C de familia 12 (033897) 45 se puede mejorar además después de la expresión en plantas, provisión de oportunidades para aplicar temperaturas de pretratamiento elevadas durante el tratamiento para conseguir una hidrólisis mejorada.
La FIG. 14 ilustra el efecto de unas temperaturas de pretratamiento en el rendimiento de glucosa de los principales sucesos transgénicos de realización XynB.2063 (expresión de xilanasa B), XynA.2015.05T1 (expresión de xilanasa A), EGA.2049.10 (expresión de endoglucanasa A), XynA/AccB.2092.103 (expresión de xilanasa A y enzima 50 accesoria B), XynA/EGA.2242.09 (expresión de xilanasa A y endoglucanae A), e iXynA.2229.110 (expresión de una xilanasa A modificada de inteína) frente a la planta de control tipo salvaje AxB y la planta de control transgénico carente de enzima TGC.4000.11.
La hidrólisis de las plantas se realizó utilizando FCt a una temperatura de 65 °C o 75 °C.
Se demostró que aumentando una temperatura de pretratamiento de 65 °C a 75 °C mejoraron los rendimientos de 55 hidrólisis de glucosa para las plantas de control AxB y TGC.4000.11 pero no para las plantas transgénicas que expresan enzimas.
Este hecho se puede explicar por la saturación de las enzimas expresadas en planta en el sustrato de biomasa disponible.
Con una temperatura de pretratamiento de 65 °C, todas las plantas transgénicas que expresan enzimas mostraron 60 un 11,0-33,4 % de hidrólisis más alta en comparación con la planta de control tipo salvaje AxB y el control transgénico TGC.4000.11, que llegó a 80-84 % de rendimiento de glucosa teórico.
[0140] FIG. 15 ilustra el rendimiento de glucosa de la planta de pasto varilla transgénica EGC.2253.4b que expresa una endoglucanasa altamente termoestable A (EGC) seguida de un pretratamiento con temperaturas de 65 °C, 75 65 °C y 95 °C e hidrólisis enzimática.
Como se muestra, el rendimiento de glucosa del evento transgénico EGC.2253.4b fue consistentemente superior al de la planta de control Alamo, alcanzando 89,4 % y 71,4 % de índices de conversión respectivos de un pretratamiento a 95 °C.
[0141] Las figuras 16A-16B ilustran un efecto de la temperatura de pretratamiento y tiempo en los rendimientos de 5 glucosa (FIG. 16A) y xilosa (FIG. 16B) del suceso transgénico XynA/EGA.2342.05 y la planta de control transgénico carente de enzimas TGC.2243.01 después de la hidrólisis enzimática.
Los pretratamientos se realizaron utilizando 0,175M de bisulfito de amonio y carbonato amónico a un pH 8,1 y temperaturas de 55 °C, 60 °C y 75 °C durante 2, 4, 6 y 16 horas a cada temperatura y 3000 r.p.m.
La hidrólisis enzimática fue realizada utilizando 0,2 ml de Accellerase® 1500/g de forraje pretratado y 0,1 ml de 10 Accellerase® XY/g de forraje, a 2 % de sólidos, pH  5.0,1x Britton-Robinson polibúfer (BR; pH final 4,9), 0,02 % de azida sódica a 50° C durante 72 horas, a 250 r.p.m.
Como se muestra, para todas las temperaturas de pretratamiento y periodos de tiempo, el suceso transgénico XynA/EGA.2342.105 que expresa xilanasa A y endoglucanasa A se realizó consistentemente mejor que la planta de control TGC.2243.01. 15
Estos datos también muestran que extendiendo el tiempo de pretratamiento aumenta tanto el rendimiento de glucosa como de xilosa de plantas casi linealmente y que el pretratamiento durante 16 horas mejora significativamente la hidrólisis de las plantas transgénicas y de control.
[0142] Las figuras 17A-17B ilustran un efecto de temperatura de pretratamiento en rendimientos de glucosa (FIG. 20 17A) y xilosa (FIG. 17B) de los sucesos transgénicos XynA/EGA.2242.09.01 y XynA/EGA.2242.09.07 (expresión de xilanasa A y endoglucanasa A) y plantas de control AxB tipo salvaje y transgénico TGC.4000.11.
Las plantas fueron sometidas a hidrólisis enzimática usando cóctel enzimático Accellerase completo a temperaturas 55 °C a 65 °C y 75 °C.
Las cargas enzimáticas incluían 0,2 ml de Accellerase® 1500 por gramo de forraje pretratado y 0,1 ml de 25 Accellerase®XY por gramo de forraje pretratado.
Las enzimas de expresión de plantas transgénicas CWD hasta 83,5-89,1 % de rendimiento de glucosa y 50,0-64,3% de rendimiento de xilosa en comparación con plantas de control consiguieron solo 63,0-76,6 % de rendimiento de glucosa y 35,7-45,3 % de rendimiento de xilosa.
30
[0143] Hidrólisis significativa se puede conseguir cuando la temperatura de pretratamiento aumenta a 65 °C.
Para algún forraje de maíz, el aumento de temperatura a 75 °C mejoró la hidrólisis para las plantas de control pero no para las plantas transgénicas que expresan enzimas.
En referencia a la FIG. 15, para el pasto varilla transgénico EGC.2253.4b que expresa una endoglucanasa altamente termoestable C (EGC), se descubrió sorprendentemente que la hidrólisis mejorada es significativamente más alta 35 con un aumento de la temperatura de pretratamiento, especialmente a 95 °C que la de la planta de control Alamo.
[0144] Globalmente, el forraje de pretratamiento de la principal realización de plantas transgénicas a temperaturas elevadas (65 °C y 75 °C) consiguió sobre el 80 % de rendimientos de hidrólisis de glucosa, que es una hidrólisis 25 % más alta en comparación con plantas de control que no expresan enzimas hidrolíticas heterólogas. 40
Por lo tanto, en la expresión en planta de enzimas hidrolíticas altamente termoestables proporcionarán más oportunidades para conseguir el componente diana de hidrólisis.
Ejemplo 6 - Reducción de carga de enzima y fermentabilidad
45
[0145] Ya que las plantas transgénicas que expresan enzimas CWD demostraron rendimientos de hidrólisis más altos y cinética más rápida durante la hidrólisis en comparación con las plantas de control bajo condiciones de tratamiento similares, se evaluó la reducción de las cargas de enzima exógena.
FIG. 18 ilustra rendimientos de glucosa de las plantas transgénicas XynB.2063.17 que expresan xilanasa B, XynA.2015.5T1 de expresión de xilanasa A y la planta de control TGC.2004.8.4 después de los tratamientos de 50 hidrólisis utilizando el cóctel interno #1 con cargas variables, tales como el cóctel completo (FCt), 75 % de cóctel (0,75 FCt), 50 % de cóctel (0,50 FCt). 25 % de cóctel (0,25 FCt), 10 % de cóctel (0,10 FCt) y ninguna de las enzimas (0 FCt).
Los datos demuestran la posibilidad en la reducción de cargas de enzimas exógenas para la aplicación del material transgénicoque expresa enzimas CWD sin reducir los rendimientos de azúcar. 55
Por ejemplo, el evento transgénico XynA.2015.15T1 consiguió más del 60 % de la conversión de glucano utilizando 0,75 FCt carga que es similar a aproximadamente 65 % de conversión de glucano conseguida utilizando la carga FCt.
En cambio, el control transgénico TGC.2004.8.4 consiguió aproximadamente un 50,0 % de conversión de glucano usando carga FCt y aproximadamente un 40 % de conversión de glucano utilizando 0,75 carga FCt. 60
Estos datos muestran que la hidrólisis de plantas que expresan CWD enzimas fue más eficaz que la de plantas de control y con cargas inferiores de enzimas externas.
[0146] FIG. 19 ilustra rendimientos de glucosa de las plantas transgénicas XynE/EGC/CBHA.2339.03; XynE/EGC/CBHA.2339.04 y XynE/EGC/CBHA.2339.05 (expresión de xilanasa E, endoglucanasa C y 65 celobiohidrolasa A) y la planta de control tipo salvaje BxA después de la hidrólisis enzimática con el cóctel completo
(FCt), 20 % de cóctel completo (0,2 FCt) y ninguno de los tratamientos (NCt) de enzimas.
Los datos muestran que 50-70 % de rendimiento de glucosa se puede conseguir de las plantas transgénicas XynE/EGC/CBHA.2339.03; XynE/EGC/CBHA.2339.04 y XynE/EGC/CBHA.2339.05 usando solo 20 % de cargas del cóctel completo que es 35-77 % más alto que el de las plantas de control.
5
[0147] Sorprendentemente, el rendimiento de glucosa del suceso transgénico XynE/EGC/CBHA.2339.03 seguido de la hidrólisis con solo 20 % de carga del cóctel completo fue todavía 15 % superior al rendimiento de glucosa de la planta de control BxA después del tratamiento de hidrólisis utilizando el cóctel completo.
[0148] Las figuras 20A-20B ilustran el efecto de reducción en cargas de enzimas externas en el rendimiento de 10 glucosa de los sucesos transgénicos XynA/EGA.2309.54 y XynA/EGA.2309.107 (expresión de xilanasa A y endoglucanasa A) y las plantas de control BxA después de la hidrólisis con cóctel completo (FCt), 20 % de cóctel completo (0,2FCt) y ninguna de las enzimas (NCt). 60- 70 % de rendimientos de glucosa de plantas transgénicas que expresan enzimas se consiguieron usando 20 % de cargas de cócteles completos en comparación con aproximadamente 80 % de rendimientos de glucosa conseguidos con el cóctel completo. 15
En cambio, las plantas de control negativo produjeron solo 53 % de glucosa en el tratamiento 0,2 FCt y 70 % de glucosa en el tratamiento FCt.
En referencia a la FIG. 20B, aproximadamente 38 % de rendimientos de xilosa se consiguieron de las plantas transgénicas que expresan enzimas CWD en el tratamiento 0,2FCt en comparación con aproximadamente 47 % de rendimientos de xilosa en el tratamiento FCt y rendimientos de xilosa muy inferiores para las plantas de control 20 negativo en ambos tratamientos FCt y 0,2FCt. 20 % de rendimiento de glucosa FCt de XynA/EGA.2309.54 y XynA/EGA.2309.107 puede conseguir 16-29,3 % de rendimiento de glucosa más alto al igual que 27,6-31 % de rendimiento de xilosa más alto que el control negativo.
[0149] Las figuras 21A-21B ilustran el efecto de reducción en las cargas de enzima externa en la glucosa (FIG. 21A) 25 y xilosa (FIG. 21B) de las plantas transgénicas EGA/XynA.2242.09.16 (expresión de endoglucanasa CBHA.2069.1.3) y el control transgénico TGC.4000.11 después de la hidrólisis usando ninguna de las enzimas (0), 20 % de cóctel completo (0,2FCt), 40 % de cóctel completo (0,4FCt), 60 % de cóctel completo (0,6FCt), 80 % de cóctel completo (0,8FCt) y cóctel completo (Accellerase® 1500/XY).
El pretratamiento fue realizado utilizando 0,25 M de bisulfito de amonio y carbonato amónico (pH 8,56) en una 30 proporción líquido a sólido igual a 7, a 75 °C durante 20 horas.
La hidrólisis enzimática se realizó utilizando aproximadamente 2 % de contenido de sólidos, pH 5.0, a 50 °C durante tres días.
Sorprendentemente, los datos muestran que un 60 % de hidrólisis FCt puede conseguir un 80 % de rendimientos teóricos de glucosa y aproximadamente un 60 % de rendimientos de xilosa para ambas plantas transgénicas que 35 expresan enzimas mientras solo un 60 % y 49 %, respectivamente, para el control negativo TGC.4000.11.
[0150] Estos resultados demuestran el potencial para la reducción en cargas de enzimas externas y simultáneamente conseguir una hidrólisis eficaz de forraje de planta utilizando las plantas transgénicas que expresan enzimas CWD. 40
[0151] Para evaluar la fermentabilidad de los hidrolizados que son producidos de plantas transgénicas que expresan enzimas CWD, una sacarificación simultánea y experimento de fermentación (SSF) se realizaron utilizando Saccharomyces cerevisiae D5A.
FIG. 22 ilustra la producción de etanol durante SSF de las plantas transgénicas EGA.2049.10 (expresión de 45 endoglucanasa A) y EGA/XynA.2242.09 (expresión de endoglucanasa A y xilanasa A) y plantas de control AxB y TGC.4000.11 a un contenido de sólidos de biomasa de 6 %.
Estos datos muestran que se consiguió aproximadamente un 77,8 % de conversión de celulosa más alto usando las plantas transgénicas que expresan enzimas CWD en comparación con las plantas de control.
Además, con la biomasa pretratada moderadamente, SSF de las plantas que expresan enzimas EGA.2049.10 y 50 EGA/XynA.2242.09 produjeron etanol a una concentración de 8,0 g/l o a 65 % de rendimiento de etanol, en comparación con 4,5 g/l o 42 % de rendimiento de etanol para las plantas de control, que corresponde a un 55 % de mejora en la producción de etanol.
[0152] La hidrólisis mejorada tiene el potencial para ser traducido en la reducción de carga de enzima exógena 55 mientras todavía se mantiene una hidrólisis similar como se muestra en las figuras 18 - 21.
La expresión de las enzimas CWD en planta demostró la oportunidad para producir azúcar de bajo coste de plantas de cultivo que expresan enzimas CWD o biomasa para la producción de biocombustibles, bioquímicos y biomateriales.
El beneficio de hidrólisis inicial rápida también proporciona un potencial para conseguir una hidrólisis similar o mejor 60 en menos tiempo de operación, una ventaja para una sacarificación simultánea y el proceso de fermentación (FIG. 22), y una oportunidad para reducir el requisito de capacidad de equipo y coste operativo.
[0153] La producción en planta de enzimas de degradación de pared celular es un medio para bajar los costes asociados a la producción de azúcar fermentable de biomasa a través de la hidrólisis directa de plantas 65 transgénicas.
Ejemplo 7 - Efecto termoquímico: solubilización de biomasa de pretratamiento de moderado
[0154] FIG. 23 ilustra la solubilización de biomasa del pretratamiento moderado basado en la pérdida de peso en una planta transgénica que expresa exoglucanasa CBHA (CBHA.2069.3.17) y planta de control tipo salvaje (AxB) 5 después del pretratamiento con agua desionizada (DI); 0,06M o 0,25M de ácido sulfúrico diluido (DSA); o 0,25 M de amonio bisulfito y 0,23M de carbonato amónico (BSC; el pretratamiento de pH 8,1 se realizó a una temperatura de 75 °C, una proporción líquido a sólido igual a 8, durante 16 horas.
Esta figura resalta datos de pérdida de peso para muestras de forrajes de maíz secados en horno derivadas de la planta transgénica y la planta de control tipo salvaje. 10
Las mediciones se llevaron a cabo después de procedimientos de lavado y centrifugación de la biomasa pretratada.
En comparación con el pretratamiento con DI, el pretratamiento con 0,25 M BSC (pH 8,1) produce 17,5 % más de pérdida de peso de biomasa para la planta transgénica (CBHA.2069.3.17) y 12,2 % más de pérdida de peso para la planta de control no transgénica (AxB).
La planta transgénica que expresa exoglucanasa (CBHA.2069.3.17) muestra más pérdida de peso de biomasa de 15 todos los pretratamientos en comparación con la planta de control no transgénica.
Ejemplo 8 - Efecto termoquímico: pérdida de peso de biomasa y eliminación de lignina de pretratamiento de moderado
20
[0155] La pérdida de peso de biomasa y eliminación de lignina se determinó para muestras de forraje secado en horno derivadas a partir de una planta de control transgénica TGC.2209 después del pretratamiento con agua desionizada (DI) y 0,17 M de amonio bisulfito con 0,165M de carbonato amónico a pH 8,1 (BSC), una proporción líquido a sólido igual a 8, a una temperatura de 75 °C, durante 16 horas.
Las mediciones se llevaron a cabo después de procedimientos de lavado y centrifugación de la biomasa pretratada. 25
La tabla 3 muestra que el pretratamiento con 0,17 M BSC (pH 8,1) produce más pérdida de peso de biomasa y más eliminación de lignina en comparación con el pretratamiento con DI agua.
[0156]
Tabla 3: Pérdida de peso de biomasa después del pretratamiento y lignina insoluble ácida en la biomasa pretratada 30
Productos químicos de pretratamiento
Pérdida de peso de biomasa (% de forraje) Lignina insoluble ácida (% en la biomasa pretratada)
Dl agua
34,6 10,0
0,17 M BSC
39,9 14,6
Ejemplo 9 - Efecto termoquímico: desacetilación de pretratamiento moderado
[0157] Las figuras 24A-24B ilustran el efecto de la temperatura y tiempo en la desacetilación de biomasa vegetal 35 evaluada para los forrajes de maíz secados en horno derivados a partir de una planta transgénica que expresa celobiohidrolasa A (CBHA.2063.3.17) y una planta de control no transgénica (AxB).
Los pretratamientos incluían agua desionizada (DI), 0,06M de ácido sulfúrico diluido (DSA), 0,25 M DSA o 0,25 M de amonio bisulfito con 0,23M de carbonato amónico (BSC) y se realizaron a pH 8,1, una proporción líquido a sólido igual a 8, a temperaturas 75 °C o 95 °C durante 16 horas u 85 °C durante 7 horas. 40
La concentración de ácido acético (HAc) se determinó por análisis de HPLC de las muestras de filtrado obtenidas de la biomasa pretratada usando una columna HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Hércules, CA) columna ácida que opera a 0,6 ml/min, 60 °C con 0,004 M de ácido sulfúrico como la fase móvil.
El pretratamiento con 0,25 M BSC (pH 8,1) resultó en la desacetilación significativa en comparación con el pretratamiento con DI agua y 0,06 M DSA. 45
Ejemplo 10 - Efecto termoquímico: poca/ninguna degradación de azúcar (furfural y HMF) de pretratamiento moderado
[0158] Las figuras 25A-25B ilustran rendimientos de productos de degradación de azúcar hidroximetilfurfural (HMF) y 50 furfural en muestras de forrajes de maíz secados en horno a partir de una planta transgénica que expresa exoglucanasa CBHA (CBHA.2069.3.17) y una planta de control no transgénica (AxB) después del pretratamiento con agua desionizada (DI), 0,06M de ácido sulfúrico diluido (DSA), 0,25 DSA o 0,25 M de amonio bisulfito y 0,23M de carbonato amónico (BSC; pH 8,1).
El pretratamiento se realizó a temperaturas de 75 °C y 95 °C durante 16 horas y 85 °C durante 7 horas. 55
Concentraciones de HMF y furfural en el filtrado de la biomasa pretratada se midieron por análisis de HPLC usando una columna HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Hércules, CA) columna ácida que opera a 0,6 ml/min, 60 °C con 0,004 M de ácido sulfúrico como la fase móvil.
[0159] Los datos muestran que se encontró poco o ningún HMF o furfural en muestras a partir de una planta 60 transgénica que expresa exoglucanasa CBHA (CBHA.2069.3.17) o la planta de control no transgénica (AxB)

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Método para la producción de azúcares solubles de material vegetal modificado que comprende:
    pretratamiento mediante la mezcla del material vegetal modificado con una formulación de reducción a pasta que incluye bisulfito de amonio y carbonato amónico para formar una mezcla a un pH que varía de 5,0 a 9,0 y 5 una temperatura de 40 °C a 95 °C, donde el material vegetal modificado incluye una primera secuencia de polinucleótidos que codifica una primera proteína y una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica una segunda proteína y donde la primera proteína comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 1, SEC ID n.º: 5, SEC ID n.º: 6, SEC ID n.º: 7 y SEC ID n.º: 8, y la segunda proteína comprende una secuencia de 10 aminoácidos con al menos un 90 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 2, SEC ID n.º: 3, SEC ID n.º: 4, SEC ID n.º: 9, SEC ID n.º: 10, SEC ID n.º: 11 y SEC ID n.º: 12; y
    provisión de condiciones de hidrólisis a la mezcla.
    15
  2. 2. Método, según la reivindicación 1, que comprende además la adición de otro material vegetal a la mezcla.
  3. 3. Método, según la reivindicación 1, donde el material vegetal modificado comprende además una tercera secuencia de polinucleótidos que codifica una tercera proteína seleccionada del grupo que consiste en: una endoglucanasa, una exoglucanasa, una feruloil esterasa, una endoglucanasa modificada de inteína, una 20 exoglucanasa modificada de inteína y una feruloil esterasa modificada de inteína; donde la proteína seleccionada como la tercera proteína es diferente de la proteína seleccionada como la segunda proteína; y/o
    donde la tercera proteína incluye una secuencia de aminoácidos con un mínimo un 90 % de identidad con una tercera secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID n.º: 2, SEC ID n.º: 3, SEC ID n.º: 4, SEC ID n.º: 9, SEC ID n.º: 10, SEC ID n.º: 11 y SEC ID n.º: 12. 25
  4. 4. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, donde al menos una de la primera secuencia de polinucleótidos, la segunda secuencia de polinucleótidos o la tercera secuencia de polinucleótidos comprende además una primera secuencia de polinucleótidos diana que codifica un péptido diana respectivo independientemente seleccionado para cada una de la primera secuencia de polinucleótidos, la segunda secuencia 30 de polinucleótidos y la tercera secuencia de polinucleótidos del grupo que consiste en: una señal diana amiloplasto, un péptido diana de pared celular, un péptido diana mitocondrial, una señal de localización de citosol, una señal de diana cloroplasto, un péptido diana nuclear y un péptido diana vacuola, donde el péptido diana respectivo se fusiona con la primera proteína, la segunda proteína o la tercera proteína; y/o
    donde la primera secuencia de polinucleótidos diana respectiva está aguas arriba de la primera secuencia de 35 polinucleótidos, la segunda secuencia de polinucleótidos o la tercera secuencia de polinucleótidos y el péptido diana está independientemente seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 13, SEC ID n.º: 14, SEC ID n.º: 15, SEC ID n.º: 16 y SEC ID n.º: 17; y/o donde la primera secuencia de polinucleótido de diana en combinación con al menos una de la primera secuencia de polinucleótidos, la segunda secuencia de polinucleótidos o la tercera secuencia de polinucleótidos juntas codifican una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 % de identidad con 40 una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 18, SEC ID n.º: 19, SEC ID n.º: 20 y SEC ID n.º: 21.
  5. 5. Método, según la reivindicación 4, donde la planta comprende además una segunda secuencia de polinucleótidos diana que codifica un péptido diana carboxilo fusionado por lo menos con una de la primera proteína, la segunda 45 proteína o la tercera proteína, donde una secuencia de péptido diana carboxilo está independientemente seleccionada para cada una de la primera proteína, la segunda proteína y la tercera proteína del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 22, SEC ID n.º: 23 y SEC ID n.º: 24; y/o
    donde la primera secuencia de polinucleótidos diana y la segunda secuencia de polinucleótidos diana en combinación con una de la primera secuencia de polinucleótidos, la segunda secuencia de polinucleótidos o la 50 tercera secuencia de polinucleótidos, juntas codifican una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 % de identidad con una secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 25, SEC ID n.º: 26, SEC ID n.º: 27, SEC ID n.º: 28, SEC ID n.º: 29, SEC ID n.º: 30 y SEC ID n.º: 31.
  6. 6. Método, según la reivindicación 1, donde el bisulfito de amonio está a una concentración de 0,02 M a 0,35 M y el 55 carbonato amónico está a una concentración de 0,025 M a 0,25 M; y/o
    donde la mezcla tiene una proporción líquido a sólido seleccionada del valor inferior o igual a uno de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1; y/o donde el pretratamiento incluye la incubación de la mezcla por un periodo de menos o igual a una de 16 horas, 15 horas, 14 horas, 13 horas, 12 horas, 11 horas, 10 horas, 9 horas, 8 horas, 7 horas, 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas o 1 hora; y/o que comprende además la refinación de la mezcla por pulido mecánico; y/o 60 donde las condiciones de hidrólisis incluyen 2 % a 25 % de sólidos; y/o
    donde las condiciones de hidrólisis incluyen la incubación de la mezcla por un periodo hasta 144 horas; y/o
    donde las condiciones de hidrólisis incluyen una temperatura de mezcla de 100 °C o menos; y/o
    donde la temperatura de mezcla es 65 °C o menos; y/o
    donde las condiciones de hidrólisis incluyen un pH de mezcla de 4,8 a 5,0; y/o además comprenden el contacto de la 65 mezcla con un organismo fermentador para producir un producto bioquímico; y/o
    donde el organismo fermentador es una levadura seleccionada del grupo que consiste en:
    Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Yarrowia, Spathaspora y Scheffersomyces.
  7. 7. Método, según la reivindicación 1, que incluye además la adición de una o más enzimas exógenas; y/o
    donde una o más enzimas exógenas incluyen una endoglucanasa, una celobiohidrolasa, una glicosidasa y una 5 xilanasa; y/o
    donde una o más enzimas exógenas incluyen además una -xilosidasa; y/o
    donde una o más enzimas exógenas incluyen una celulasa aislada de Trichoderma reesii.
  8. 8. Planta modificada que incluye una primera secuencia de polinucleótidos que codifica una primera proteína que 10 tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 90 % de identidad con una primera secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 1, SEC ID n.º: 5, SEC ID n.º: 6, SEC ID n.º: 7, SEC ID n.º: 8 y
    que además incluye una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica una segunda proteína que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 % de identidad con una segunda secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 2, SEC ID n.º: 3, SEC ID n.º: 4, SEC ID n.º: 9, SEC ID n.º: 10, 15 SEC ID n.º: 11 y SEC ID n.º: 12.
  9. 9. Planta modificada, según la reivindicación 8, que comprende además una tercera secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 % de identidad con una tercera secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID n.º: 2, SEC ID n.º: 3, SEC ID n.º: 4, SEC ID n.º: 9, SEC 20 ID n.º: 10, SEC ID n.º: 11 y SEC ID n.º: 12, donde el SEC ID n.º seleccionado como la tercera secuencia de referencia es diferente del SEC ID n.º seleccionado como la segunda secuencia de referencia.
  10. 10. Planta modificada, según la reivindicación 9, donde al menos una de la primera secuencia de polinucleótidos, la segunda secuencia de polinucleótidos o la tercera secuencia de polinucleótidos incluye además al menos una 25 secuencia de polinucleótidos diana que codifica un péptido diana independientemente seleccionado para cada una de la primera secuencia de polinucleótidos, la segunda secuencia de polinucleótidos y la tercera secuencia de polinucleótidos del grupo que consiste en: una señal diana amiloplasto, un péptido diana de pared celular, un péptido diana mitocondrial, una señal de localización de citosol, una señal diana cloroplasto, un péptido diana nuclear y un péptido diana vacuola; y/o 30
    donde el péptido diana está seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 13, SEC ID n.º: 14, SEC ID n.º: 15, SEC ID n.º: 16, SEC ID n.º: 17, SEC ID n.º: 22, SEC ID n.º: 23 y SEC ID n.º: 24; y/o donde la planta modificada es seleccionada del grupo que consiste en: maíz, azúcar de caña, remolacha azucarera, sorgo, pasto varilla, miscanthus, eucalipto, sauce y álamo.
    35
  11. 11. Planta modificada, según la reivindicación 10, que incluye al menos una secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 % de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consta de: SEC ID n.º: 18, SEC ID n.º: 19, SEC ID n.º: 20, SEC ID n.º: 21, SEC ID n.º: 25, SEC ID n.º: 26, SEC ID n.º: 27, SEC ID n.º: 28, SEC ID n.º: 29, SEC ID n.º: 30 y SEC ID n.º: 31.
    40
  12. 12. Casete de expresión que comprende: una primera secuencia de polinucleótidos capaz de la hibridación bajo condiciones de astringencia moderada de un ácido nucleico que consiste en una primera secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 32, SEC ID n.º: 36, SEC ID n.º: 37, SEC ID n.º: 38 y SEC ID n.º: 39; y una segunda secuencia de polinucleótidos capaz de la hibridación bajo condiciones de astringencia moderada de un ácido nucleico que consta de una segunda secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en: 45 SEC ID n.º: 33, SEC ID n.º: 34, SEC ID n.º: 35, SEC ID n.º: 40, SEC ID n.º: 41, SEC ID n.º: 42 y SEC ID: 43.
  13. 13. Casete de expresión, según la reivindicación 12, que comprende además una tercera secuencia de polinucleótidos capaz de la hibridación bajo condiciones de astringencia moderada de una tercera secuencia de referencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID n.º: 33, SEC ID n.º: 34, SEC ID n.º: 35, SEC ID n.º: 40, 50 SEC ID n.º: 41, SEC ID n.º: 42 y SEC ID n.º: 43, donde el SEC ID n.º seleccionado como la tercera secuencia de referencia es diferente del SEC ID n.º seleccionado como la segunda secuencia de referencia; y/o
    donde al menos una de la primera secuencia de polinucleótidos, la segunda secuencia de polinucleótidos o la tercera secuencia de polinucleótidos además incluye al menos una secuencia de polinucleótidos diana que codifica un péptido diana independientemente seleccionado para cada una de la primera secuencia de polinucleótidos, la 55 segunda secuencia de polinucleótidos y la tercera secuencia de polinucleótidos del grupo que consiste en: una señal diana amiloplasto, un péptido diana de pared celular, un péptido diana mitocondrial, una señal de localización de citosol, una señal diana cloroplasto, un péptido diana nuclear y un péptido diana vacuola; y/o
    donde al menos una secuencia de polinucleótidos diana es independientemente seleccionada para cada una de la primera secuencia de polinucleótidos, la segunda secuencia de polinucleótidos y la tercera secuencia de 60 polinucleótidos del grupo que consiste en: SEC ID n.º: 44, SEC ID n.º: 45, SEC ID n.º: 46, SEC ID n.º: 47, SEC ID n.º: 48, SEC ID n.º: 49, SEC ID n.º: 50, y SEC ID n.º: 51.
  14. 14. Casete de expresión, según la reivindicación 13, que comprende una secuencia de polinucleótidos capaz de la hibridación bajo condiciones de astringencia moderada de un ácido nucleico que consiste en una secuencia de 65 referencia seleccionada del grupo de secuencias que consiste en: SEC ID n.º: 52, SEC ID n.º: 53, SEC ID n.º: 54,
    SEC ID n.º: 55, SEC ID n.º: 56, SEC ID n.º: 57, SEC ID n.º: 58, SEC ID n.º: 59, SEC ID n.º: 60, SEC ID n.º: 61 y SEC ID n.º: 62.
  15. 15. Vector de expresión que comprende una secuencia de polinucleótidos capaz de la hibridación bajo condiciones de astringencia moderada de un ácido nucleico que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste 5 en: SEC ID n.º: 68, SEC ID n.º: 69, SEC ID n.º: 70, SEC ID n.º: 75, SEC ID n.º: 78, SEC ID n.º: 80, SEC ID n.º: 81, SEC ID n.º: 82 y SEC ID n.º: 83.
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