CN106244622A - 在工程植物中表达多种蛋白的表达盒和表达载体及制备工程植物和生产可溶性糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程领域，具体涉及在工程植物中表达多种蛋白的表达盒和表达载体及制备工程植物和生产可溶性糖的方法。本发明提供了一种用于在工程植物中表达多种蛋白的表达盒、一种表达载体、一种制备工程植物的方法以及一种使用如上所述的表达盒生产可溶性糖的方法和一种生产可溶性糖的方法。采用本发明的方法进行可溶性糖的生产，能够有效提高可溶糖的产量。

Description

在工程植物中表达多种蛋白的表达盒和表达载体及制备工程 植物和生产可溶性糖的方法

本申请为申请日为2012年3月7日、申请号为201280021388.2、名称为“表达细胞壁降解酶的植物生物质的联合预处理和水解”的中国发明专利申请的分案申请。

本申请要求2011年3月7日提交的美国临时申请No.61/449,769的优先权，该临时申请在此以全文援引的方式纳入本文。

以电子方式与本申请提交的序列表以“序列表”为文件名，创建于2012年3月7日，文件大小为620,037字节，在此以全文援引的方式纳入本文。

技术领域

本发明涉及从表达细胞壁降解酶的植物中生产可溶性糖的方法，以及转基因植物、表达载体，核酸以及细胞壁降解蛋白。

背景技术

木质纤维素生物质是一种引人注目的用于生产生物燃料、化学物质和生物产品的原料。木质纤维素生物质可提供许多优势，包括丰富的可用性、潜在的低成本、可持续性，以及一般不作为人类的食物来源被消耗(Langeveld JWA et al.2010Crop Sci 50：S131-S151)。为了将木质纤维素生物质转换成可再生能源和生化药剂，生物处理将一部分木质纤维素生物质转变成单糖，然后转化为生物燃料或其他生物产品。

由于生物质预处理和酶水解的成本，通过生物转化来生产糖的成本是昂贵的(Alvira P et al.2010Bioresour Technol 101：4851；Abramson M et al.2010PlantScience 178：61；Daniel Klein-Marcuschamer et al.Biotechnol.Bioeng.2012；109:1083)。酶水解不容易降解植物细胞壁，因为细胞壁多糖的生物异质性、化学组成和结构特征使它们难以被水解酶水解(Zhu L et al.2008Bioresour Technol 99：3817)。出于这个原因，酶水解需要能够使植物细胞壁容易水解的预处理。在工业上比较普遍的预处理技术，通常使用苛刻的条件，如高温和极端的pH值条件(Wyman CE et al.2005BioresourTechnol 96:1959；Mosier N et al.2005Bioresour Technol 96：673)。这些条件会引起糖降解并且导致产糖量减少，以及形成有毒的发酵化合物，需要昂贵的额外步骤以及昂贵的前期资本设备来进行解毒、分离和中和。

预处理成本、外源酶用量的高成本、缓慢的水解速率、酶的有限供应也会影响到涉及木质纤维素生物质工艺的商业化。

发明内容

一方面，本发明涉及一种从基因工程植物材料(engineered plant material)中生产可溶性糖的方法。该方法包括通过将基因工程植物材料与制浆制剂(pulpingformulation)混合形成混合物以进行预处理。所述基因工程植物材料包括编码第一蛋白的第一多核苷酸序列，所述第一蛋白选自由木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、经内含肽修饰的木聚糖酶、经内含肽修饰的内切葡聚糖酶、内含肽修饰的外切葡聚糖酶和内含肽修饰的阿魏酸酯酶所组成的组中。所述方法还包括提供水解条件。

一方面，本发明涉及一种基因工程植物。所述基因工程植物包括编码与第一参考序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列的第一多核苷酸序列，所述第一参考序列选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所组成的组中。

一方面，本发明涉及一种表达盒。所述表达盒包括能够在中度严格条件下与含有第一参考序列的核酸杂交的第一多核苷酸序列，所述第一参考序列选自由SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39[P77853:S158-30-108-35]所组成的组中。所述表达盒还包括能够在中度严格条件下与含有第二参考序列的核酸杂交的第二多核苷酸序列，所述第二参考序列选自由SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID：43所组成的组中。被选定为第一参考序列的SEQ ID NO不同于被选定为第二参考序列的SEQID NO。

一方面，本发明涉及一种表达盒。所述表达盒包括能够在中度严格条件下与含有参考序列的核酸杂交的多核苷酸序列，所述参考序列选自由含有SEQ ID NO：52、SEQ IDNO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ IDNO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62的序列所组成的组中。

一方面，本发明涉及一种用于在工程植物中表达多种蛋白的表达盒，该表达盒包括：第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列编码第一蛋白并能够在中度严格条件下与由第一参考序列组成的的核酸的互补物杂交，所述第一参考序列选自由SEQ ID NO：32、SEQID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43所组成的组中；第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列编码第二蛋白且能够在中度严格条件下与由第二参考序列组成的核酸的互补物杂交，所述第二参考序列选自由SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ IDNO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID：43所组成的组中，其中，被选定为第一参考序列的SEQ ID NO不同于被选定为第二参考序列的SEQ ID NO，并且所述第一蛋白和第二蛋白中的均能够水解植物材料的组分。

一方面，本发明涉及一种表达载体。所述表达载体包括能够在中度严格条件下与含有选自由SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：83所组成的组中的序列的核酸杂交的多核苷酸序列。

一方面，本发明涉及一种表达载体，该表达载体包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列能够在中度严格条件下与由选自由SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：83所组成的组中的序列组成的核酸的互补物杂交。

一方面，本发明还提供了一种制备工程植物的方法，该方法包括：提供如上所述的表达盒，以及使用整合有所述表达盒的载体转化植物。

一方面，本发明还提供了一种制备工程植物的方法，该方法包括：使用如上所述的载体转化植物。

本发明还提供了一种使用如上所述的表达盒生产可溶性糖的方法，该方法包括：

收获通过如上所述的方法制备的工程植物；

预处理所述工程植物，其中，所述预处理步骤包括：将工程植物与制浆制剂混合形成pH值在5.0-9.0的混合物，所述制浆制剂含有亚硫酸氢铵和碳酸铵，并且提供55-95℃的混物物温度；以及

提供给所述混合物水解条件。

一方面，本发明还提供了一种生产可溶性糖的方法，该方法包括：

收获通过如上所述的方法制备的工程植物；

预处理所述工程植物，其中，所述预处理步骤包括：将工程植物与制浆制剂混合形成pH值在5.0-9.0的混合物，所述制浆制剂含有亚硫酸氢铵和碳酸铵，并且提供55-95℃的混物物温度；以及

提供给所述混合物水解条件。

附图说明

结合附图阅读将会更好地理解以下对本发明优选实施方式的详细说明。出于图解本发明的目的，图中显示的是目前优选的实施方式。然而，应当理解的是本发明并不局限于显示出的具体设置和方法。在附图中：

图1是显示表达细胞壁降解酶的植物生物质的联合预处理和水解步骤的流程图。

图2A-2B显示了使用#5复合酶(enzyme cocktail)(FCt；灰色(每3个一组的柱形图的中间))或缺乏木聚糖酶A的#5复合酶(Ct-Xyn；斜条纹(右))或者不经酶(NCt；白色(左))水解后，来自预处理的表达木聚糖酶A的转基因植物(transgenic plant)(XynA.2015.05)和缺乏木聚糖酶A的转基因对照植物(XynB.2063.17)的葡萄糖(图2A)和木糖(图2B)的产量。

图3A-3B显示使用#1复合酶(FCt；灰色(每3个一组的柱形图的中间))或缺乏木聚糖酶的#1复合酶(Ct-Xyn；斜条纹(右))，或者不经酶(NCt；白色(左))水解后，来自预处理的表达木聚糖酶B(XynB.2063.17)的转基因植物和预处理的野生型对照植物(AxB)的葡萄糖(图3A)和木糖(图3B)的产量。

图4显示了对预处理的表达内切葡聚糖酶(EG)的转基因植物进行#1复合酶(FCt；灰色(中间))或缺乏内切葡聚糖酶的#1复合酶(Ct-EG(右))，或者不经酶(NCt；白(左))水解后的葡萄糖产量。图4A显示了从表达内切葡聚糖酶A的转基因植物(EGA.2049.02和EGA.2049.10)和缺乏内切葡聚糖酶的转基因对照植物(TGC.4000.12)中产出的葡萄糖产量。图4B显示了从表达内切葡聚糖酶B的转基因植物(EGB2042.03)和缺乏内切葡聚糖酶的转基因对照植物(TGC.2004.8.02)中产出的葡萄糖产量。

图5A-5D显示了表达多种蛋白的转基因植物的水解结果。图5A和图5C表示使用#1复合酶处理的从测试转基因植物和转基因对照植物中产出的葡萄糖产量，图5B和图5D表示使用#1复合酶处理的从测试转基因植物和转基因对照植物中产出的木糖产量。图5A和图5B显示的结果：经过全复合酶处理(FCt；深灰色(中间))、缺乏木聚糖酶的全复合酶处理(FCt-Xyn；条纹柱(右)以及不经酶(NCt；白色柱(左))的处理的1)双重叠表达木聚糖酶A(XynA)和辅酶(Acc)的转基因植物XynA/AccA/B.2096.05和XynA/AccA/B.2096.01；2)转基因对照植物TGC.2004.8.02。图5C和图5D显示的结果：经过全复合酶处理(FCt；深灰色(每组样品中四个的最左边))、缺乏木聚糖酶的全复合酶处理(Ct-Xyn；斜条纹(左二))，缺乏内切葡聚糖酶的全复合酶处理(Ct-EG；白色(左三))，以及缺乏木聚糖酶和内切葡聚糖酶的全复合酶处理(Ct-Xyn-EG；网格线(左四))的1)表达XynA和EGA的转基因植物EGA/XynA.2242.09；2)转基因对照植物TGC.4000.12。

图6A-6B分别显示从预处理的野生型对照植物AxB和表达三重叠加(triplestacked)蛋白的转基因玉米植株XynB/EGA/CBHB.2349.56，XynB/EGA/CBHB.2349.55和XynB/EGA/CBHA.2345.116的秸秆中产出的葡萄糖和木糖的产量。产量的衡量是根据使用1500/XY复合酶(FCt；黑色柱(右))进行酶水解，并与缺乏复合酶的对照处理(NCt；灰色(左))对比进行的。

图7A-7B分别显示的是转基因植物的葡萄糖和木糖的产量。图7A显示的是经过#1复合酶(FCt；灰色(中))，缺乏木聚糖酶的#1复合酶(Ct-Xyn；斜条纹(右))和缺乏复合酶的对照处理(NCt；白色(左))的酶水解后，从预处理的表达木聚糖酶A的转基因柳枝稷(XynA.pv2015.3c、XynA.pv2015.4c)和预处理的野生型柳枝稷(Alamo白杨)中产出的葡萄糖产量。图7B显示了经过#1复合酶(FCt；灰色(中))，缺乏木聚糖酶的#1复合酶(Ct-Xyn；斜条纹(右))和缺乏复合酶的对照处理(NCt；白色(左))的酶水解后，从预处理的表达木聚糖酶A的第一代转基因植物(XynA.2015.05.T0)，表达木聚糖酶A的第二代转基因植物(XynA.2015.05.T1)以及预处理的缺乏木聚糖酶的转基因植物(TGC.4000.11)中产出的木糖产量的结果。

图8A-8B分别显示了经过#1复合酶(FCt；灰色(中))，缺乏木聚糖酶的#1复合酶(Ct-Xyn；斜条纹(右))和缺乏复合酶的对照处理(NCt；白色(左))的酶水解后，从两种预处理的表达木聚糖酶A的转基因柳枝稷植物(XynA.pv2015.3c和XynA.pv2015.4c)和对照非转基因柳枝稷植物(Alamo)中产出的葡萄糖和木糖产量。

图9A-9B分别显示了经过#1复合酶(FCt；灰色(中))，缺乏木聚糖酶的#1复合酶(Ct-Xyn；斜条纹(右))和缺乏复合酶的对照处理(NCt；白色(左))的酶水解后，从预处理的表达经内含肽修饰的木聚糖酶A(iXynA)的转基因植物(iXynA.2229.110)和预处理的野生型对照植物(AxB)中产出的葡萄糖和木糖产量。

图10阐明了使用#1复合酶对预处理的表达木聚糖酶A的转基因植物(XynA.2015.5T1；实心三角)和预处理的表达木聚糖酶B的转基因植物(XynB.2063.17；实心圆圈)与对比的转基因对照植物(TGC.2004.8.02；空心方框)进行酶水解产生葡萄糖产量的时间进程。

图11阐明了使用#1复合酶(EGA.2049.10.FCt、实心方框；TGC.4000.11.FCt、空心菱形)和缺乏内切葡聚糖酶的#1复合酶(EGA.2049.10.Ct-EG、实心三角；TGC.4000.11.Ct-EG、空心圆圈)对预处理的转基因植物(EGA.2049.10)和预处理的转基因对照(TGC.4000.11)进行酶水解产出葡萄糖产量的时间进程。

图12A-12B阐明了经过全复合酶(EGA/XynA.2242.09.FCt，实心方块；TGC.4000.11.FCt、空心菱形)处理，与使用缺乏内切葡萄糖酶的全复合酶(图12A中EGA/XynA.2242.09.Ct-EG、实心圆圈；TGC.4000.11；Ct-EG，空心圆圈)和使用缺乏木聚糖酶的全复合酶(EGA/XynA.2242.09.Ct-Xyn、实心圆圈；TGC.4000.11；Ct-Xyn，空心圆圈)处理相比，预处理的转基因植物(EGA/XynA.2242.09)和预处理的转基因对照植物(TGC.4000.11)的酶水解产出葡萄糖产量的时间进程。

图13A-13B阐明了经过全复合酶(XynA/AccB.2092.103.FCt，实心方块；TGC.4000.11.FCt，空心菱形)与缺乏木聚糖酶的全复合酶(XynA/AccB.2092.103.Ct-Xyn、实心三角；TGC.4000.11.Ct-Xyn、空心圆圈)进行酶水解后，分别来自预处理的表达木聚糖酶A和阿魏酸酯酶B的转基因植物(XynA/AccB.2092.103)和预处理的转基因对照植物(TGC.4000.11)的葡萄糖和木糖产量的时间进程。

图14阐明了对预处理的以下表达蛋白的转基因植物进行酶水解，与非转基因对照植物(AxB)和缺乏酶的转基因对照植物(TGC.4000.11)对比得到葡萄糖的产量，所述表达蛋白的转基因植物包括：表达木聚糖酶B的转基因植物(XynB.2063.17)，表达内切葡聚糖酶的转基因植物(EGA.2049.10)，表达木聚糖酶A和阿魏酸酯酶B的转基因植物(XynA/Acc.B.2092.103)，表达木聚糖酶A和内切葡聚糖酶的转基因植物(EGA/XynA.2242.09)，表达经内含肽修饰的木聚糖酶A的转基因植物(iXynA.2229.110)。进行预处理的温度为65℃(PT_65)和75℃(PT_75)。酶用量包括每克生物质0.2毫升1500或0.1毫升XY以及0.05μM的β-葡糖苷酶(BGL)。每个PT_65和PT_75预处理的上面的条形设定为目前转基因和对照植物的数据，从左到右依次是AxB；TGC.4000.11；XynA.2015.05T1；XynB.2063.17；XynA/AccB.2092.103；iXynA.2229.110；EGA.2049.10；和XynA/EGA.2242.09。

图15显示了使用#5复合酶对预处理的转基因柳枝稷(EGC.2253.4b，实心圆圈)和野生型柳枝稷(Alamo、空心方框)进行酶水解产出的葡萄糖的产量。预处理温度为：65℃、75℃和95℃。

图16A-16B显示了预处理温度和时间对从酶水解的预处理的表达内切葡聚糖酶和木聚糖酶A的转基因植物(EGA/XynA.2342.105；黑条(右))和预处理的对照植物(TGC.2342.01；灰条(左))中产出的葡萄糖(图16)和木糖(图16B)产量的影响。

图17A-17B显示了预处理温度对从预处理的表达内切葡聚糖酶A和木聚糖酶A的转基因植物EGA/XynA.2242.09.01和EGA/XynA.2242.09.07，以及对照植物：野生型AxB和转基因TGC.4000.11中产出的葡萄糖(图17A)和木糖(图17B)产量的影响。

图18显示了使用减少的酶用量：#1全复合酶(FCt)，75％的#1全复合酶(0.75FCt)，50％的#1全复合酶(0.50FCt)，25％的#1全复合酶(0.25FCt)，10％的#1全复合酶(0.10FCt)和无酶(0FCt)进行水解后，减少外源酶用量对从预处理的转基因植物XynA.2015.05T1(实心圆圈)，XynB.2063.17(实心三角)和对照植物TGC.2004.8.04(实心方块)中产出的葡萄糖产量的影响。

图19显示了减少外源酶用量对从转基因植物XynE/EGC/CBHA.2339.03，XynE/EGC/CBHA.2339.04，XynE/EGC/CBHA.2339.05和对照植物BxA中产出的葡萄糖产量的影响。预处理使用0.17M亚硫酸氢铵和碳酸铵(pH8.1)，在75℃、液固比为10条件下进行16小时。在大约2％固含量，没有酶(NCt；白色(左))，20％全复合酶(0.2FCt；灰色(中间))和全复合酶，加入量为0.2毫升/0.1毫升的每克秸秆(0.2ml/0.1ml of per gram stover)，50℃和pH值5.0的条件下进行为期三天的酶水解。

图20A-20B分别显示了经过全用量的复合酶1500/XY(FCt；黑色(右))、20％用量的复合酶(0.2FCt；灰色(图20A中和图20B右))以及无酶(NCt；白色(图20A左))的酶水解后，预处理的表达木聚糖酶A和内切葡聚糖酶的植物(XynA/EGA.2309.54和XynA/EGA2309.107)与预处理的非转基因对照植物对比的葡萄糖和木糖的产量。

图21A-21B显示了经过每克秸秆加入0.2毫升1500和0.1毫升XY的全复合酶(FCt)，80％的全复合酶；每克秸秆加入0.16毫升1500和0.08毫升XY(0.8FCt)，60％的全复合酶；每克秸秆加入0.12毫升1500和0.06毫升XY(0.6FCt)，40％的全复合酶；加入每克秸秆0.08毫升1500和0.04毫升XY(0.4FCt)，20％的全复合酶；每克秸秆加入0.04毫升1500和0.02毫升XY(0.2FCt)以及无酶(0FCt)的情况下进行酶水解后，减少的外源酶用量对从转基因植物EGA/XynA.2242.09.16，CBHA.2069.01.03和对照植物TGC.4000.11中产出的葡萄糖(图21A)和木糖(图21B)产量的影响。

图22显示了使用1)复合酶1500和XY；和2)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)D5A预处理的转基因植物EGA.2049.10和EGA/XynA.2242.09以及对比的对照植物的同步糖化和发酵(SSF)得到的乙醇产量。

图23显示了基于表达外切葡聚糖酶CBHA的转基因植物(CBHA.2069.3.17；白色)和野生型对照植物(AxB；灰色)的重量损失的生物质增溶。

图24A-24B显示了从非转基因对照植物(AxB；图24A)和表达外切葡聚糖酶CBHA的转基因植物(CBHA.2063.3.17；图24B)中产出乙酸(HAc)的产量。处理在75℃下进行16小时(白色(左))、85℃下进行7小时(条纹(中间))和95℃下进行(网格(右))

图25A-25B显示了从非转基因对照植物(AxB；图25A)和表达外切葡聚糖酶CBHA的转基因植物(CBHA.2063.3.17)产出糖降解产物羟甲基糠醛(HMF)和糠醛的产量。处理方式用白色、条纹或网格表示，从左至右依次是：白色，HMF_75℃处理16小时；条纹，HMF_85℃处理7小时；网格，HMF_95℃处理16小时；条纹，糠醛_95℃处理16小时)。

图26显示了经过0.17M亚硫酸氢铵和碳酸铵(BSC；pH 8.1)预处理并自动水解后，从仅表达木聚糖酶B的转基因植物(XynB.2063.15)、表达木聚糖酶A和两种辅助酶A和B的转基因植物(XynA/AccA/B.2096.1)和非转基因对照植物(WT AxB)中产出的木糖产量。将木糖作为单糖(黑色(右))和将木糖作为寡糖(灰色(左))来评估木糖的产量。

图27显示了经过0.17M亚硫酸氢铵和0.165M碳酸铵(BSC；pH 8.1)预处理并自动水解后，从两种表达木聚糖酶B、内切葡聚糖酶和CBHB(XynB/EGA/CBHB.2349.56和XynB/EGA/CBHB.2349.55)的转基因植物，表达木聚糖酶B、内切葡聚糖酶和CBHA(XynB/EGA/CBHA.2345.116)的转基因植物和非转基因对照植物(AxB)产出的木糖产量。

图28A-28B分别显示从使用XY预处理的转基因植物(同时表达内切葡聚糖酶和木聚糖酶A的EGA/XynA.2242.09T1(实心圆圈)，以及转基因对照植物TGC.4000(实心方块))中产出的葡萄糖和木糖产量。

图28C-28D分别表示从都同时表达内切葡聚糖酶A、木聚糖酶B和外切纤维素酶B(cellobihydrolase B)的XynB/EGA/CBHB.2349.55(空心圆圈)，XynB/EGA/CBHB.2349.229(实心正三角)和XynB/EGA/CBHB.2349.56(实心倒三角)，以及表达经内含肽修饰的木聚糖酶A的iXynA.2329.14和野生型对照植物AxB中产出的葡萄糖和木糖的产量。

具体实施方式

在以下的说明中某些术语的使用只是为了方便而不是限制。单词“右”、“左”、“顶”和“底”在所提及的附图中用于指代方向。用于权利要求书和说明书相应部分中的单词“一个”和“一种”，除特别声明外，定义为包括一个或多个引用项。这个术语包括以上特别提到的单词，及其衍生词，以及相似的单词。短语“至少一个”意思为两个或两个以上的项目的列表，如“A，B或C”，意思是A、B或C的任何一个及它们的任何组合。

本文的实施方式提供了在植物中表达一系列的细胞壁降解(CWD)蛋白的技术。CWD蛋白可以是CWD酶或CWD酶的修饰形式。修饰形式可以是经内含肽修饰的CWD蛋白。植物可以是玉米、高粱、柳枝稷或其他植物。本文的实施方式提供了获得含有植物CWD蛋白的生物质，以在糖生产中用作原料。植物酶表达使用植物作为一个“工厂”，而不是微生物发酵生产工业CWD酶。这种方法的优势在于将生物质原料中的蛋白直接用于可发酵糖生产中。有水解特性的转基因植物生物质可以不需要严格的预处理来提高细胞壁纤维素与外源酶的可结合性。在单株植物中，不同类型CWD蛋白的表达可以为生物燃料和生物化学生产创建一个低成本的糖平台。本文的实施方式提供了对来自包括一种或多种类型CWD蛋白的基因工程植物的木质纤维素生物质进行温和的化学预处理来生产可溶性糖的方法。

一种实施方式提供了一种从基因工程植物材料中生产可溶性糖的方法。所述方法可以包括通过与制浆制剂混合形成混合物以预处理基因工程植物原料。基因工程植物材料可以包括编码第一蛋白的第一多核苷酸序列。第一蛋白可以是CWD酶。第一蛋白可以是经内含肽修饰的CWD酶。第一蛋白可以是木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶，阿魏酸酯酶，经内含肽修饰的木聚糖酶、经内含肽修饰的内切葡聚糖酶、经内含肽修饰的外切葡聚糖酶或经内含肽修饰的阿魏酸酯酶。第一蛋白可以能够水解基因工程植物材料的组分。能够水解某组分意味着在水解条件下第一蛋白催化该组分的水解。对于经内含肽修饰的第一蛋白而言，能够水解某组分意味着该内含肽从肽上剪接(spliced)后，该蛋白能够在水解条件下水解该组分。所述方法还可以包括提供水解条件。水解条件可以适于水解该组分。

基因工程植物材料还可以包括编码第二蛋白的第二多核苷酸序列。第二蛋白可以是CWD蛋白。第二蛋白可以是经内含肽修饰的CWD蛋白。第二蛋白可以是木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、经内含肽修饰的木聚糖酶、经内含肽修饰的内切葡聚糖酶、经内含肽修饰的外切葡聚糖酶或经内含肽修饰的阿魏酸酯酶。被选定为第二蛋白的蛋白可以不同于被选定为第一蛋白的蛋白。第二蛋白能够水解基因工程植物原料的组分。能够水解某组分意味着第二蛋白在水解条件下催化这种组分水解。对于经内含肽修饰的第二蛋白而言，能够水解某组分意味着该内含肽从肽上剪接后，该蛋白可以在水解条件下水解该组分。

基因工程植物材料还可以包括编码第三蛋白的第三多核苷酸序列。第三蛋白可以是CWD蛋白。第三蛋白可以是经内含肽修饰的CWD蛋白。第三蛋白可以是木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、经内含肽修饰的木聚糖酶、经内含肽修饰的内切葡聚糖酶、经内含肽修饰的外切葡聚糖酶或经内含肽修饰的阿魏酸酯酶。被选定为第三蛋白的蛋白可以不同于被选定为第一蛋白的蛋白。被选定为第三蛋白的蛋白可以不同于被选定为第二蛋白的蛋白。第三蛋白可以能够水解基因工程植物原料的组分。能够水解某组分意味着第三蛋白在水解条件下催化这种组分水解。对于经内含肽修饰的第三蛋白而言，能够水解某组分意味着该内含肽从肽上剪接后，该蛋白能够在水解条件下水解该组分。

基因工程植物材料是指转基因植物、转基因植物的子代，转基因植物的后代，或上述任何一种植物的部分。转基因植物材料可以含有不存在于天然植物中的细胞壁降解酶或其编码基因。基因工程植物材料可以是表达CWD蛋白的转基因植物，或转基因植物的任何部分。基因工程植物材料可以是表达修饰形式的CWD蛋白的任何转基因植物，或转基因植物的任何部分。转基因植物可以是任何形式的植物。植物的转基因植物类型可以是但不限于玉米、甜菜、甘蔗、高粱、柳枝稷、芒草、桉树、柳树或杨树。基因工程植物材料可以是整个转基因植物或该植物的部分。所述部分可以是但不限于叶、茎、花、芽、花瓣、子房、果实或种子。基因工程植物材料可以是来自转基因植物的愈伤组织。基因工程植物材料可以由一种或多种转基因植物的部分再生。基因工程植物材料可以是第一转基因植物和第二转基因植物或非转基因植物有性杂交的产品，其中，产品植物保留引种到第一转基因植物的多核苷酸序列。转基因植物可以是本文所提供的转基因植物中的任何一种。转基因植物可以含有任何载体，表达盒，或单独的核酸或其片段。

基因工程植物材料与制浆制剂的混合可以通过任何基因工程植物材料和制浆制剂的结合来完成。混合可以通过搅拌来完成。

制浆制剂可以是分解木质素的物质，所述木质素将木质纤维素植物材料内部的木质纤维素结合在一起。所述物质可以降解木质素而不会严重降解木质纤维素。预处理可以导致在基因工程植物中表达的部分酶的释放和木质纤维素植物材料内木质素的部分降解。

所述方法可以包括在预处理之前，期间或之后对CWD蛋白进行激活。所述方法可以包括在供给水解条件之前、期间或之后对CWD蛋白进行激活。被激活的CWD蛋白可以是第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白，或任何外加的木质纤维素处理酶。CWD蛋白可以被修饰为含有内含肽。所述内含肽可以融合至CWD酶上或酶末端或酶的内部。所述内含肽在供给诱导条件下可诱导剪接。诱导条件可以是特定的混合物温度。诱导条件可以是预处理或提供水解步骤之前、期间或之后的温度。经内含肽修饰的酶和用于诱导内含肽剪接的条件，可以作为活化条件，这在2004年7月7日提交的美国申请Appln.10/886,393和2010年的11月5日提交的PCT/US10/55746，2010年的11月5日提交的PCT/US10/55669和2010年的11月5日提交的PCT/US10/55751中有所描述，在此以全文援引的方式纳入本文。

所述组分可以是需要处理的任何部分。所述组分可以是木质纤维材料。所述组分可以为本文所列出的任何CWD蛋白的底物。所述组分可以为木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶，阿魏酸酯酶的底物。所述组分可以是包括本文所列出的任何CWD蛋白的底物的一部分。所述组分可以是包括木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶，阿魏酸酯酶的底物一部分。

所述方法还包括混合之前、期间或之后添加其他植物材料，预处理，或提供水解条件。其他植物材料可以是基因工程材料以外的任何植物生物质、纤维素或木质纤维材料。其他植物材料可以来源于生物炼制产物。其他植物材料可以包括林业和农业废物。林业和农业废物可以是但不限于玉米秸秆、甘蔗渣(baggasses)、小麦秸秆、废木材、森林修剪物(forest trimmings)、废纸、城市固体废物(MSW)。其他植物材料可以是任何能源作物。能源作物可以是但不限于。柳枝稷、高粱、甜菜、甘蔗、芒草和杨树。

编码第一蛋白，第二蛋白，第三蛋白或任何额外的酶的多核苷酸序列可以可操作地连接至调控序列上。本文中，可操作地连接意味着调控元件将其功能赋予多核苷酸序列。在调控元件是启动子的情况下，当将调控元件与多核苷酸序列可操作地连接的时候，启动子能够控制它们的表达。在调控元件是终止子的情况下，所述终止子能够终止多核苷酸序列的转录。下面提供了调控元件的非限制性参考示例。

第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的至少一种可以是但不限于选自下列的酶：XynA：来自嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)的β-1,4-木聚糖酶229B(Uniprot登记号P77853)；XynB：来自米曲霉(Thermomyces lanuginosus)的内-1,4-β-木聚糖酶(Uniprot登记号O43097)；EGA：来自高山象白蚁(Nasutitermes takasagoensis)的内-β-1,4-内切葡聚糖酶(Uniprot登记号O77044)；EGB：来自解纤维热酸菌(Acidothermuscellulolyticus)的内-β-1,4-内切葡聚糖酶(Uniprot登记号P54583)；AccA：来自黑曲霉(Aspergillus niger)的阿魏酸酯酶A(Uniprot登记号O42807)；AccB：来自黑曲霉的阿魏酸酯酶B(Uniprot登记号Q8WZI8)；AccA/B：黑曲霉的阿魏酸酯酶A和阿魏酸酯酶B；EGC：来自海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)的内-β-1,4-内切葡聚糖酶(Uniprot登记号O33897)；P40942：来自粪堆梭菌F9(Clostridium stercorarium F9)的β-1,4-木聚糖酶(Uniprot登记号P40942)；P40943：来自嗜热脂肪土芽孢杆菌T-6(Geobacillusstearothermophilus T-6嗜热脂肪芽孢杆菌)的β-1,4-木聚糖酶(Uniprot登记号P40943)；O30700：来自芽孢杆菌属NG-27的β-1,4-木聚糖酶(Uniprot登记号O30700)；CBHA：来自热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)的外切纤维素酶A(Uniprot登记号O68438)；CBHB：外切纤维素酶B(SYT BD22308)；或XynE：木聚糖酶(EU591743)。

第一蛋白可以包括与参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列、基本上由或由与参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列组成，所述参考序列选自由SEQ ID NO：1[WT P77853]、SEQ ID NO：2[AnfaeA]、SEQ ID NO：3[AnfaeB]、SEQ ID NO：4[NtEGm]、SEQ ID NO：5[EU591743]、SEQ ID NO：6[O43097]、SEQ ID NO：7[P77853:T134-100-101]、SEQ ID NO：8[P77853:S158-30-108-35]、SEQ ID NO：9[O33897]、SEQ ID NO：10[O68438]和SEQ ID NO：11[P54583]所组成的组中。第一蛋白可以包括与参考序列SEQ ID：12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列、基本上由或由与参考序列SEQ ID：12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列组成。

第二蛋白可以包括与第二参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列、基本上由或由与第二参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列组成，所述第二参考序列选自由SEQ ID NO：1[WT P77853]、SEQ ID NO：2[AnfaeA]、SEQ ID NO：3[AnfaeB]、SEQ ID NO：4[NtEGm]、SEQ ID NO：5[EU591743]、SEQ ID NO：6[O43097]、SEQ IDNO：7[P77853:T134-100-101]、SEQ ID NO：8[P77853:S158-30-108-35]、SEQ ID NO：9[O33897]、SEQ ID NO：10[O68438]和SEQ ID NO：11[P54583]所组成的组中。第二蛋白可以包括与参考序列SEQ ID：12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列、基本上由或由与参考序列SEQ ID：12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列组成。

第三蛋白可以包括与第三参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列、基本上由或由与第三参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列组成，所述第三参考序列选自由SEQ ID NO：1[WT P77853]、SEQ ID NO：2[AnfaeA]、SEQ ID NO：3[AnfaeB]、SEQ ID NO：4[NtEGm]、SEQ ID NO：5[EU591743]、SEQ ID NO：6[O43097]、SEQ IDNO：7[P77853:T134-100-101]、SEQ ID NO：8[P77853:S158-30-108-35]、SEQ ID NO：9[O33897]、SEQ ID NO：10[O68438]和SEQ ID NO：11[P54583]所组成的组中。第三蛋白可以包括与参考序列SEQ ID：12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列、基本上由或由与参考序列SEQ ID：12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列组成。

第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一种还可以包括编码各自靶向肽的第一靶向多核苷酸序列。对于缺乏第三多核苷酸序列的基因植工程植物材料，第一靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列的至少一种上。对于缺乏第二多核苷酸和第三多核苷酸序列的基因工程植物材料，第一靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列上。第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的每种可以独立选择各自的靶向肽。靶向肽可以融合到第一蛋白，第二蛋白或第三蛋白上。每种各自的靶向肽可以独立地选自但不限于造粉体靶向信号、细胞壁靶向肽、线粒体靶向肽、细胞质定位信号、叶绿体靶向信号、核靶向肽和液泡靶向肽。

第一靶向多肽可以位于所述第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列的上游。靶向肽可以与SEQ ID NO：13[BAASS]、大麦糊粉粒序列SEQ ID NO：14[HVAlePS]、SEQ ID NO：15[PR1a]、SEQ ID NO：16[γ玉米蛋白序列xGZein27ss-02]或SEQID NO：17[Glu B4SP]中的一种具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性。

与第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的一种相结合的第一靶向多核苷酸序列可以编码与参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列，所述参考序列选自由SEQ ID NO：18[BAASS:P77853]、SEQ ID NO：19[BAASS:O33897]、SEQ ID NO：20[HVAlePS:NtEGm]和SEQ IDNO：21[BAAS:P77853:S158-30-108-35]所组成的组中。

第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一种还可以包括编码羧基靶向肽的第二靶向多核苷酸序列。对于缺乏第三多核苷酸序列的基因工程植物材料，第二靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列中的至少一种上。对于缺乏第二多核苷酸序列和第三多核苷酸序列的基因工程植物材料，第二靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列上。羧基靶向肽可以选自但不限于与SEQ IDNO：22[SEKDEL]、缩减的SEQ ID NO：23[KDEL]或大麦液泡分类决定序列SEQ ID NO：24[HvVSD-01]中的一种具有至少72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100的同一性的序列。羧基靶向肽可以融合到第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白的至少一种上。

在细胞质积累中，提供的所述第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中至少有一种可以不含有靶向肽。

所述第一靶向多核苷酸序列和第二靶向多核苷酸序列与第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列结合在一起，可以编码与参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列，所述参考序列选自由SEQ ID NO：25[BAASS：AnfaeB：SEKDEL]、SEQ ID NO：26[BAASS:AnfaeA:SEKDEL]、SEQID NO：27[PR1a:NtEGm:SEKDEL]、SEQ ID NO：28[BAASS：P77853:T134-100-101:SEKDEL]、SEQ ID NO：29[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQ ID NO：30[BAASS:O43097:SEKDEL]和SEQ IDNO：31[xGZein27ss-02:BD22308:HVVSD-01]所组成的组中。

第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一种可以编码CWD蛋白的“变体”。所述CWD蛋白的变体的氨基酸序列可以根据氨基酸序列的缺失、添加、替换或CWD蛋白的其它修饰而改变。CWD蛋白的变体可以维持CWD蛋白的生物活性。本文中，所述维持生物活性是指，变体至少有从CWD蛋白中得到的60％的活性。对木聚糖酶活性的评估可以在实验中使用本文中实施例1标题为“秸秆酶活性测定”的小节中描述的XylazymeAX底物。对内切葡聚糖酶的活性的评估可以通过在实验中使用本文中实施例1标题为“秸秆酶活性测定”的小节中描述的Cellazyme底物。外切葡聚糖酶活性的评估可以通过在实验中使用荧光4-甲基伞形酮-b-D-乳吡喃糖苷(4-methylumbelliferyl-b-D-lactopyranoside)(4-MU)，如Harrison MD et al.2011“Accumulation of recombinant cellobiohydrolaseand endoglucanase in the leaves of mature transgenic sugar cane,”PlantBiotechnology Journal(植物生物科技杂志)9：884-896中所描述的，这里以全文援引的方式纳入本文。对阿魏酸酯酶活性的评估可以通过在实验中使用pNP标记的阿魏酸盐作为底物(详见Hegde S.等.2009“Single-step synthesis of 4-nitrophenyl ferulate forspectrophotometric assay of feruloyl esterases,”Analytical Biochemistry(分析生物化学)387(1)：128-129)。上述木聚糖酶、内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶或阿魏酸酯酶活性的测试可以用来确定与CWD降解蛋白序列有少于100％的同一性的序列是否为CWD降解蛋白的变体。这里CWD蛋白的变体可以被修饰成与CWD蛋白有相似的疏水性、亲水性、溶解度、氨基酸残基极性的氨基酸序列。这里CWD蛋白可以根据翻译后的修饰而改变。不同的翻译后修饰可以是但不限于糖基化，乙酰化或磷酸化作用。变体可以通过任何方式形成。变体可以通过定点诱变或非定点诱变形成。本文中，易错PCR可以用来创建CWD蛋白的突变体，而且以上任何实验均可以用来评估突变体是否是变体。

实施方式包括将第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白，或它们的变体中的至少一种融合到靶向肽或羧基靶向肽中的至少一种的变体上。靶向肽或羧基靶向肽的变体将蛋白靶向融合到与靶向肽或羧基靶向肽的参考序列相同的位点上。

内含肽的变体可以在第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中提供。内含肽的变体可以从其融合的蛋白中剪接。

为确定两种氨基酸序列或两种核酸序列的同一性百分比，可以包括在两条序列的相应位置上比对和比较氨基酸残基或核苷酸。如果两条序列所有的位置都被相同的氨基酸残基或核苷酸占据，那么这两条序列被称为具有100％的同一性。同一性百分比可以通过Smith Waterman算法测定(Smith TF、Waterman MS 1981“Identification of CommonMolecular Subsequences,”J Mol Biol 147：195-197，该文献通过全文援引的方式纳入本文)。

在一种实施方式中，编码与引用的氨基酸参考序列具有低于100％同一性的蛋白的多核苷酸序列可以编码含有氨基酸参考序列的蛋白的变体。在一种实施方式中，与引用的氨基酸参考序列具有低于100％的同一性的蛋白可以是含有氨基酸参考序列的蛋白的变体。在一种实施方式中，编码与引用的核酸参考序列编码的蛋白具有低于100％的同一性的蛋白的多核苷酸序列可以编码蛋白的变体，所述蛋白由参考序列编码。

参考图1，显示了一种从基因工程植物材料中生产可溶性糖的方法。图1显示了基因工程植物材料的联合预处理和水解的工艺流程。基因工程植物材料或基因工程植物材料混同其他植物材料可以通过送料机10添加到反应器20进行化学预处理和酶液化，也就是说，将固体木质纤维素生物质转化成液化状态以进一步加工和水解的过程。在反应器20，基因工程植物材料或基因工程植物材料混同其他植物材料可以与制浆制剂混合。制浆制剂可以包括至少一种组分，所述组分具有选自由亚硫酸根、亚硫酸氢根、硫酸根、碳酸根、氢氧根和氧负离子(oxide)所组成的组中的离子。所述至少一种组分还包括但不限于选自由铵离子、钠离子、镁离子及钙离子所组成的组中的反荷离子(counter ion)。至少一种组分可以是盐。所述盐可以是但不限于亚硫酸盐(SO₃ ^2-)、亚硫酸氢盐(HSO₃ ^-)、氧化物(O^2-)和氢氧化物(OH^-)。所述盐可以包括反荷离子。反荷离子可以包括但不限于钠离子(Na⁺)、钙离子(Ca^{2 +})、氢离子、钾离子(K⁺)、镁离子(Mg²⁺)和铵离子(NH₄ ⁺)。制浆制剂可以包括氧化钙(CaO)、石灰或氢氧化钙(Ca(OH)₂)、消石灰中的至少一种。

在一种实施方式中，制浆制剂可以至少包括亚硫酸氢铵和碳酸铵中的一种。亚硫酸氢铵的浓度可为0.02M至0.35M，而碳酸铵的浓度可为0.025M至0.25M。制浆制剂可以与基因工程植物材料或混有其他植物材料的基因工程植物材料以优选的液固比混合成混合物。这种混合物具有的液固比可选自小于或等于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1的值，或上述任何两个值区间内的任意值(包括端点)。例如，液固比可以为小于任何选自3–7之间的整数或非整数的值。液固比值可以等于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1，或上述任何两个值区间内任何值(包含端点)。例如，液固比可以为等于3至7范围内任何整数或非整数的值。

预处理可以包括培养混合物任意一段时间。预处理可以包括培养混合物长达16个小时。所述培养可以进行更长或更短的时间。预处理可以包括培养混合物一段小于或等于16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1小时的时间。

预处理可以包括提供40℃至95℃的混合物温度。40℃至95℃的混合物温度，可以在不使水解酶失活的情况下破损或除去混合物中木质素纤维材料的部分木质素。预处理可以包括提供55℃、65℃、75℃、95℃、低于55℃、低于65℃、低于75℃、低于95℃、低于100℃、40℃至55℃、40℃至65℃、40℃至75℃、40℃至95℃、40℃至低于100℃、55℃至65℃、55℃至75℃、55℃至95℃、55℃至低于100℃、65℃至75℃、65℃至95℃、65℃至低于100℃、75℃至95℃、75℃至低于100℃或95℃至低于100℃的混合物温度。

预处理可以包括提供混合物pH值为5.0至10。预处理可以包括提供混合物pH值在6.5-8.5范围内。提供的混合物pH值可以是5.0、5.5、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0、9.5或10，或任意两个上述pH值之间的(包括端点)pH值。预处理过程中混合物的pH值可以取决于使用的化学物质的类型和/或使用的植物材料的类型。提供混合物pH值可以包括添加pH值调节化学物质。pH值调节化学物质可以是酸或碱。

预处理步骤结束时，混合物可以包括部分降解的植物材料和称为部分滤液的液相，所述部分滤液可以含有来自制浆制剂和低浓度的CWD酶的化学物质或从基因工程植物材料释放的酶。所述方法可以包括在分离器30中从部分降解的植物材料的固体部分分离部分滤液。分离可通过各种工艺来完成。可以通过沉淀、过滤或离心部分滤液。所述方法可以包括在多个回合的预处理中至少收集或回收一部分部分滤液。在去除部分滤液后，混合物中固体的浓度可以增加并且可以为在2％至15％(w/v)的范围内的任何整数或非整数值，或为在2％至15％(w/v)范围内的任何两个整数值内的范围。

所述方法可以包括用任何合适的液体清洗预处理的基因工程植物材料。液体可以是去离子水。液体可以通过离心分离而去除。

所述方法还包括通过机械研磨来精炼，这可以在精炼机40内通过任何已知的方法完成，例如但不限于去纤维化(defibrillation)，研磨或打碎。

所述方法可以包括转移精炼的预处理的生物质到糖化容器50。从基因工程植物材料中释放的CWD酶的水解作用发生在糖化容器50中。

提供的水解条件可以包括调整混合物为2％至25％的固含量，在2％至25％(包括端点)之间的任何整数或非整数值的固含量，或在2％至25％之间任意两个整数范围内的任何整数或非整数值的固含量。提供的水解条件可以包括培养混合物长达144小时的一段时间，选自长达144小时的任何一个整数或非整数值的一段时间，或大于零和长达144小时内任意两个整数值范围内的一段时间。提供水解条件可以包括提供100℃或更低、65℃或更低、50℃或更低、48℃至50℃、48℃至65℃、48℃至小于100℃，或48℃至100℃的混合物温度。提供水解条件可以包括提供从4.8至5.0范围的pH值，4.8的pH值，4.9的pH值或者5.0的pH值。可以根据基因工程植物材料中CWD酶的具体活性来选择温度，pH值或处理时间中的至少一种。

如果基因工程植物材料包括多种CWD酶，可以按顺序为所述多种酶中的每一种的表达、预处理或水解中的至少一步提供最佳的条件。水解条件可以包括提供一种酶活性最佳的pH值，然后提供适于另一种酶活性的最佳的不同pH值。水解条件可以包括在不同的时段来调整每种酶最佳活性的温度。例如，木聚糖酶可能需要不同于内切葡聚糖酶的温度或pH值。

所述方法包括添加一种或多种外源酶到基因工程植物材料，其它植物材料或混合物其中的至少一种中。外源酶可以在预处理之前、期间或之后添加。外源酶可以在提供水解条件之前、期间或之后添加。外源酶可以添加到糖化容器50中。一种或多种外源酶可以以复合酶(enzyme cocktail)的形式提供。复合酶可以包括一种或多种CWD酶。本文中，在一种实施方式中提供的CWD酶可以是但不限于木质素降解酶，纤维素降解酶或半纤维素降解酶。本文中，在一种实施方式中提供的CWD酶可以是但不限于选自糖苷酶、木聚糖酶、纤维素酶、纤维素内切酶、外切葡萄糖酶、外切纤维素酶、β-木糖苷酶、阿魏酸酯酶以及淀粉酶中的一种。复合酶可以包括从里氏木霉(Trichoderma reesii)中分离的的纤维素酶。复合酶可以从供应商购买。复合酶可以为但不限于从杰能科国际(Genencor International)(罗契斯特市，纽约)购买的Accellerase^TM 1000，1500和XY。复合酶可以是诺纤力·赛力二代(Cellic)。酶Cellic可以包括不同类型的CWD酶。混合物中不同类型的CWD酶的最优条件可以被提供。例如，在所述方法中，可以调节水解处理的温度、pH值和时间以为混合物中不同的酶提供最优条件。水解条件可以包括减少复合酶中含有的外源酶的用量。减少用量可以包括在基因工程植物材料中具有较少的或缺乏一种或多种CWD蛋白表达的制剂。例如，如果转基因植物表达木聚糖酶和内切葡聚糖酶，这些酶可以从按配方制成的用于具有转基因植物的基因工程植物材料水解的复合酶中去除。

水解效率可以通过测量植物材料的增溶进行评估。测量植物材料增溶的方法为本技术领域所公知，可以包括确定单糖和二糖浓度，例如通过高效液相色谱(HPLC)法。在此描述的实施例中，可以使用具有LC解决方案软件(solutions software)的Shimadzu LC-20AD二元液相泵(Shimadzu，Kyoto，Japan)进行HPLC，糖浓度的测量可以使用Aminex HPX-87p糖柱(Bio-Rad实验室)。其他测量植物材料的增溶的方法，例如，通过测定重量损失、木质素去除或对预处理的植物材料进行脱乙酰作用都是可用的。

所述方法还可以包括使混合物和/或水解产物与发酵生物相接触，以便生产生化产品。酶水解后，可溶性糖可以回收并用于生产生化产品。或者，在所述方法中，可以同步糖化和发酵可溶性糖以形成生化产品。生化产品可以是但不限于丁烷、丁二醇、丁二烯、丁醇、异丁醇、丙烷、丙二醇、丙烯、丙醇、异丙醇、甲烷、甲醇、乙醇、苯酚、丙三醇、乙烯、甲苯、乙酯(ethyl)、苯、苯乙烯、二甲苯、乙二醇、环氧乙烷、甲酸、二氧化碳、甲醛、乙醛、丙酮、维生素、乙烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、苯、醋酸、山梨糖醇、阿拉伯糖醇、琥珀酸、胡索酸、苹果酸、呋喃二羧酸、天冬氨酸、葡糖二酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、羟基内丁酯、甘油、山梨醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、葡糖酸、乳酸、丙二酸、丙酸、柠檬酸、乌头酸、木糖酸、糠醛、左旋葡聚糖、丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸(参见T.Werpy和G.Petersen,Top Value AddedChemicals From Biomass,Volume 1,Results of Screening for Potential Candidatesfrom Sugars and Synthesis Gas,2004年8月,Report,PNNL&NREL，在此以全文引用的方式纳入本文)。所述方法可以包括同步糖化和发酵可溶性糖生产乙醇。同步糖化和发酵生产乙醇可以包括在预处理之前、期间或之后提供酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)D5A或提供水解条件。

可以通过任何合适的发酵生物将糖类转换成所需的生化产品。发酵生物可以根据所需的生化产品来选择。发酵生物可以是酵母。酵母可以是但并不仅限于酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichiai)、耶氏酵母属(Yarrowia)、刀孢酵母属(Spathaspora)或发酵酵母属(Scheffersomyces)各属种中的一种。发酵的生物可以是细菌。细菌可以是但不限于单胞发酵菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)或梭菌属(Clostridium)各属种中的一种。发酵生物可以是野生型生物或基因工程重组生物。

一种实施方式包括含有编码第一蛋白的第一多核苷酸序列的基因工程植物。第一蛋白可以是CWD蛋白。第一蛋白可以是经内含肽修饰的CWD蛋白。第一蛋白可以通过任何一种描述的有关从基因工程植物材料生产可溶性糖的方法中获得。第一蛋白可以包括、基本上由或由与第一参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列组成，所述第一参考序列选自由SEQ ID NO：1[WT P77853]、SEQ ID NO：2[AnfaeA]、SEQ ID NO：3[AnfaeB]、SEQ ID NO：4[NtEGm]、SEQ ID NO：5[EU591743]、SEQ ID NO：6[O43097]、SEQ ID NO：7[P77853:T134-100-101]、SEQ ID NO：8[P77853:S158-30-108-35]、SEQ ID NO：9[O33897]、SEQ ID NO：10[O68438]和SEQ ID NO：11[P54583]所组成的组中。所述第一蛋白可以包括，基本上由或由与参考序列SEQ ID：12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列组成。

基因工程植物还可以包括编码第二蛋白的第二多核苷酸序列。第二蛋白可以是CWD酶。第二蛋白可以是经内含肽修饰的CWD蛋白。第二蛋白可以通过任何一种描述的有关从基因工程植物材料生产可溶性糖的方法中获得。第二蛋白可以包括、基本上由或由与第二参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列组成，所述第二参考序列选自由SEQ ID NO：1[WT P77853]、SEQ ID NO：2[AnfaeA]、SEQ ID NO：3[AnfaeB]、SEQ ID NO：4[NtEGm]、SEQ ID NO：5[EU 591743]、SEQ IDNO：6[O43097]、SEQ ID NO：7[P77853:T134-100-101]、SEQ ID NO：8[P77853:S158-30-108-35]、SEQ ID NO：9[O33897]、SEQ ID NO：10[O68438]、SEQ ID NO：11[P54583]和SEQ ID：12[BD22308所组成的组中。被选定为第二参考序列的SEQ ID NO可以不同于被选定为第一参考序列的SEQ IDNO。

基因工程植物还可以包括编码第三蛋白的第三多核苷酸序列。第三蛋白可以是CWD酶。第三蛋白可以是经内含肽修饰的CWD蛋白。第三蛋白可以通过任何一种描述的有关从基因工程植物材料生产可溶性糖的方法中获得。第三蛋白可以包括与第三参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列、基本上由或由与第三参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列组成，所述第三参考序列选自由SEQ ID NO：1[WTP77853]、SEQ ID NO：2[AnfaeA]、SEQ ID NO：3[AnfaeB]、SEQ ID NO：4[NtEGm]、SEQ ID NO：5[EU591743]、SEQ ID NO：6[O43097]、SEQ ID NO：7[P77853:T134-100-101]、SEQ ID NO：8[P77853:S158-30-108-35]、SEQ ID NO：9[O33897]、SEQ ID NO：10[O68438]、SEQ ID NO：11[P54583]和SEQ ID：12[BD22308]所组成的组中。被选定为第三参考序列的SEQ ID NO可以不同于被选定为第一参考序列的SEQ IDNO。被选定为第三参考序列的SEQ ID NO可以不同于被选定为第二参考序列的SEQ IDNO。

基因工程植物中的第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一种还可以包括编码各自的靶向肽的第一靶向多核苷酸序列。对于缺乏第三多核苷酸序列的基因工程植物，第一靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列的至少一种上。对于缺乏第二多核苷酸序列和第三多核苷酸序列的基因工程植物，第一靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列上。各自靶向肽可以独立地选自但不限于造粉体靶向信号、细胞壁肽、线粒体靶向肽、细胞质定位信号，叶绿体靶向信号，细胞核靶向肽或液泡靶向肽。

每条单独的靶向肽可以融合到相应的第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白上。靶向肽可以与SEQ ID NO：13[BAASS]、SEQ ID NO：14[HvAleSP]、SEQ ID NO：15[PR1a]、SEQ ID NO：16[xGZein27ss-02]或SEQ ID NO：17[GluB4SP]中的一种具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性。

基因工程植物的第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一种还可以包括编码羧基靶向肽的第二靶向多核苷酸序列。对于缺乏第三多核苷酸序列的基因工程植物，第二靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列中的至少一种上。对于缺乏第二多核苷酸序列和第三多核苷酸序列的基因工程植物，第二靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列上。羧基靶向肽可以选自但不限于与SEQ ID NO：22[SEKDEL]、缩减的SEQ ID NO：23[KDEL]或SEQ ID NO：24[大麦液泡分类决定序列HvVSD-01]中的一种具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100的同一性的序列。羧基靶向肽可以融合到第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白的至少一种上。

基因工程植物可以包括至少一种编码氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列包括与选自由SEQ ID NO：18[BAASS:P77853]、SEQ ID NO：19[BAASS:O33897]、SEQ IDNO：20[HVAlePS:NtEGm]、SEQ ID NO：21[BAASS:P77853:S158-30-108-35]、SEQ ID NO：25[BAASS：AnfaeB：SEKDEL]、SEQ ID NO：26[BAASS:AnfaeA:SEKDEL]、SEQ ID NO：27[PR1a:NtEGm:SEKDEL]、SEQ ID NO：28[BAASS：P77853:T134-100-101:SEKDEL]、SEQ ID NO：29[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQ ID NO：30[BAASS:O43097:SEKDEL]和SEQ ID NO：31[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]所组成的组中的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的序列、基本上由或由与选自由SEQ IDNO：18[BAASS:P77853]、SEQ ID NO：19[BAASS:O33897]、SEQ ID NO：20[HVAlePS:NtEGm]、SEQ ID NO：21[BAASS:P77853:S158-30-108-35]、SEQ ID NO：25[BAASS：AnfaeB：SEKDEL]、SEQ ID NO：26[BAASS:AnfaeA:SEKDEL]、SEQ ID NO：27[PR1a:NtEGm:SEKDEL]、SEQ ID NO：28[BAASS：P77853:T134-100-101:SEKDEL]、SEQ ID NO：29[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQID NO：30[BAASS:O43097:SEKDEL]和SEQ ID NO：31[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]所组成的组中的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的序列组成。

基因工程植物可以包括至少一种氨基酸序列，所述氨基酸序列包括与选自由SEQID NO：18[BAASS:P77853]、SEQ ID NO：19[BAASS:O33897]、SEQ ID NO：20[HVAlePS:NtEGm]、SEQ ID NO：21[BAASS:P77853:S158-30-108-35]、SEQ ID NO：25[BAASS：AnfaeB：SEKDEL]、SEQ ID NO：26[BAASS:AnfaeA:SEKDEL]、SEQ ID NO：27[PR1a:NtEGm:SEKDEL]、SEQID NO：28[BAASS：P77853:T134-100-101:SEKDEL]、SEQ ID NO：29[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQ ID NO：30[BAASS:O43097:SEKDEL]和SEQ ID NO：31[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]所组成的组中的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的序列、基本上由或由与选自由SEQ ID NO：18[BAASS:P77853]、SEQ ID NO：19[BAASS:O33897]、SEQ ID NO：20[HVAlePS:NtEGm]、SEQ ID NO：21[BAASS:P77853:S158-30-108-35]、SEQ ID NO：25[BAASS：AnfaeB：SEKDEL]、SEQ ID NO：26[BAASS:AnfaeA:SEKDEL]、SEQ ID NO：27[PR1a:NtEGm:SEKDEL]、SEQ ID NO：28[BAASS：P77853:T134-100-101:SEKDEL]、SEQ ID NO：29[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQ ID NO：30[BAASS:O43097:SEKDEL]和SEQ ID NO：31[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]所组成的组中的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的序列组成。

基因工程植物可以是转基因植物，转基因植物的子代，转基因植物的后代，或上述的任何一部分。基因工程植物可以包括不在植物中天然存在的CWD蛋白，或编码相同CWD蛋白的基因。CWD蛋白可以是经内含肽修饰的CWD蛋白。转基因植物可以是任何类型的植物。转基因植物类型可以是玉米、甘蔗、甜菜、高粱、柳枝稷、芒草、桉树、柳树或杨树。转基因植物可以通过已知的方法创建，用来表达任何形式的CWD酶或CWD蛋白。所述植物可以使用载体进行农杆菌介导转化来创建，所述载体包括编码酶的多核苷酸序列。还可以通过用于转基因植物的其他方法来创建转基因植物，例如，基因枪法或直接吸收DNA法。本文所述的转基因植物可以含有任何单独的核酸、氨基酸序列、表达盒或载体。

在一种实施方式中提供了一种表达盒，包括第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一种，分别编码第一蛋白、第二蛋白和第三蛋白。第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的一种或多种可以是CWD蛋白。第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的一种或多种可以是经内含肽修饰的CWD蛋白。第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的一种或多种可以是从基因工程植物材料或基因工程植物中生产可溶性糖的方法中描述的一种蛋白。第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的一种或多种可以是木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、经内含肽修饰的木聚糖酶、经内含肽修饰的内切葡聚糖酶、经内含肽修饰的外切葡聚糖酶或经内含肽修饰的阿魏酸酯酶。被选定为第二蛋白的蛋白可以不同于被选定为第一蛋白的蛋白。被选定为第三蛋白的蛋白可以不同于被选定为第一蛋白的蛋白。被选定为第三蛋白的蛋白可以不同于被选定为第二蛋白的蛋白。

在表达盒中编码CWD蛋白的第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中至少有一种可以通过插入编码内含肽的核酸序列被修饰。经内含肽修饰的多核苷酸可以使用修饰功能编码经内含肽修饰的蛋白。修饰功能可以使CWD蛋白失活而内含肽仍然融合到或在CWD蛋白中。存在于经内含肽修饰的蛋白中的内含肽可以诱导剪接形成非经内含肽修饰的蛋白。剪接的诱导条件可以是但并不局限于提供一定的温度。提供的温度可以是用于从基因工程植物材料中生产可溶性糖的方法中描述的预处理或水解条件中至少一种中提供的温度。诱导条件可以是与选定的内含肽相匹配的任何其他诱导条件。经内含肽修饰的蛋白可以是iXynA：即，经内含肽修饰的XynA。经内含肽修饰的蛋白可以是经内含肽修饰的P77853。经内含肽修饰的蛋白可以是P77853:T134-100-101或P77853:S158-30-108-35。

在表达盒中的第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的一种或多种可以包括与参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列、基本上由或由与参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列组成，所述参考序列选自由SEQ ID NO：1[WT P77853]、SEQ ID NO：2[AnfaeA]、SEQ ID NO：3[AnfaeB]、SEQ ID NO：4[NtEGm]、SEQ ID NO：5[EU591743]、SEQ ID NO：6[O43097]、SEQ ID NO：7[P77853:T134-100-101]、SEQ ID NO：8[P77853:S158-30-108-35]、SEQ ID NO：9[O33897]、SEQ ID NO：10[O68438]和SEQ ID NO：11[P54583]所组成的组中。所述第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的一种或多种可以包括、基本上由或由与参考序列SEQ ID:12(BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列组成。

表达盒中的第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列其中至少有一种还可以包括编码各自的靶向肽的第一靶向多核苷酸序列。对于缺乏第三多核苷酸序列的表达构建体，第一靶向多核苷酸序列可以被包括在第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列的至少一种上。对于缺乏第二多核苷酸序列和第三多核苷酸序列的表达构建体，第一靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列上。每种各自的靶向肽可以独立地来自第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的每一种。靶向肽可以融合到第一蛋白，第二蛋白或第三蛋白上。每种各自的靶向肽可以独立选自但不限于造粉体靶向信号、细胞壁靶向肽、线粒体靶向肽、细胞质定位信号、叶绿体靶向信号、细胞核靶向肽和液泡靶向肽。第一靶向多核苷酸可以位于第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列的上游。靶向肽可以与BAASS(SEQ ID NO：13)、大麦糊粉序列HVAlePS(SEQ ID NO：14)、PR1a(SEQ ID NO：15)、γ玉米蛋白序列xGZein27ss-02(SEQ ID NO：16)或GluB4SP(SEQID NO：17)中的一种具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性。第一靶向多核苷酸序列与第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列结合在一起可以编码与参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列，所述参考序列选自由SEQ ID NO：18[BAASS:P77853]、SEQ ID NO：19[BAASS:O33897]、SEQ ID NO：20[HVAlePS:NtEGm]和SEQ ID NO：21[BAAS:P77853:S158-30-108-35]所组成的组中。

表达盒中的第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少有一种还可以包括编码羧基靶向肽的第二靶向多核苷酸序列。对于缺乏第三多核苷酸序列的表达构建体，第二靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列上。对于缺乏第二多核苷酸序列和第三多核苷酸序列的表达构建体，第二靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列上。羧基靶向肽可以选自但不限于与SEKDEL(SEQ ID NO：22)，缩减的KDEL(SEQ ID NO：23)或大麦液泡分类决定序列HvVSD-01(SEQ ID NO：24)中的一种具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100同一性的序列。羧基靶向肽可以与所述第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的至少一种相融合。

表达盒可以配置为提供第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的至少一种，不含有用于在细胞质中积累的靶向肽。

在表达盒中，与第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三核苷酸序列中的一种结合到一起的第一靶向多核苷酸序列和第二靶向多核苷酸序列可以编码与参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列，所述参考序列选自由SEQ ID NO：25[BAASS：AnfaeB：SEKDEL]，SEQ ID NO：26[BAASS:AnfaeA:SEKDEL]，SEQ ID NO：27[PR1a:NtEGm:SEKDEL]，SEQ ID NO：28[BAASS：P77853:T134-100-101:SEKDEL]，SEQ ID NO：29[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]，SEQ ID NO：30[BAASS:O43097:SEKDEL]和SEQ ID NO：31[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]所组成的组中。

实施方式包括编码与靶向肽或羧基靶向肽中的至少一种相融合的第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白，或者它们的变体中的至少一种的表达盒。

在一种实施方式中，在表达盒中，编码与所引用的氨基酸参考序列具有低于100％同一性的蛋白的多核苷酸序列，可以编码具有氨基酸参考序列的蛋白的变体。在一种实施方式中，与所引用的氨基酸参考序列具有低于100％的同一性的蛋白可以是具有氨基酸参考序列的蛋白的变体。在一种实施方式中，编码与所引用核酸参考序列编码的蛋白具有低于100％同一性的蛋白的多核苷酸序列，可以编码所述参考序列编码的蛋白的变体。

在一种表达盒中，所述第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一种能够与在低度、中度或高度严格条件下编码CWD蛋白或经内含肽修饰的CWD蛋白的参考序列杂交。所述第一，第二或第三多核苷酸中的至少一种能够在低度、中度或高度严格条件下与含有参考序列的核酸杂交，所述参考序列选自由SEQ ID NO：32[WTP77853]、SEQ ID NO：33[AnfaeA]、SEQ ID NO：34[AnfaeB]、SEQ ID NO：35[NtEGm]、SEQ IDNO：36[EU591743]、SEQ ID NO：37[O43097]、SEQ ID NO：38[P77853:T134-100-101]、SEQ IDNO：39[P77853:S158-30-108-35]、SEQ ID NO：40[033897]、SEQ ID NO：41[O68438]、SEQ IDNO：42[P54583]和SEQ ID NO：43[BD22308]的所组成的组中。表达盒可以包括能够在低度、中度或高度严格条件下与含有参考序列的核酸杂交的多核苷酸序列，所述参考序列选自由含有SEQ ID NO：52[BAASS:P77853]、SEQ ID NO：53[BAASS:O33897]、SEQ ID NO：54[HVAlePS:NtEGm]、SEQ ID NO：55[BAASS：P77853:S158-30-108-35]、SEQ ID NO：56[BAASS：AnfaeB：SEKDEL]、SEQ ID NO：57[BAASS:AnfaeA:SEKDEL]、SEQ ID NO：58[PR1a:NtEGm:SEKDEL]、SEQ ID NO：59[BAASS：P77853:T134-100-101:SEKDEL]、SEQ ID NO：60[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQ ID NO：61[BAASS:O43097:SEKDEL]和SEQ ID NO：62[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]的序列所组成的组中。

本文的表达盒可以包括调控元件。

在一种实施方式中，提供了包括本文所述的任何分离的核酸，多核苷酸序列或表达盒的载体。本文的实施方式包括其中结合有至少一种本文所述的表达盒的质粒，染色体，线粒体DNA，质体DNA，病毒或核酸片段。一种实施方式提供了用于在植物中表达CWD蛋白的载体。一种实施方式提供了植物转化载体。所述植物转化载体可以是但并不仅限于T-DNA载体，双运载体或共整合载体。转化载体可以包括本文所述的任何分离的核酸，多核苷酸序列或表达盒。

一种实施方式包括含有多核苷酸序列的表达载体，所述多核苷酸能够在低度、中度或高度严格条件下与含有以下序列的核酸杂交，所述序列包括、基本上由或由选自由SEQID NO：63[pAG 2015]、SEQ ID NO：64[pAG2048]、SEQ ID NO：65[pAG2049]、SEQ ID NO：66[pAG2063]、SEQ ID NO：67[pAG2069]、SEQ ID NO：68[pAG2091]、SEQ ID NO：69[pAG2092]、SEQ ID NO：70[pAG2096]、SEQ ID NO：71[pAG2201]、SEQ ID NO：72[pAG2229]、SEQ ID NO：73[pAG2233]、SEQ ID NO：74[pAG2234]、SEQ ID NO：75[pAG2242]、SEQ ID NO：76[pAG2252]、SEQ ID NO：77[pAG2253]、SEQ ID NO：78[pAG2309]、SEQ ID NO：79[pAG2310]、SEQ ID NO：80[pAG2339]、SEQ ID NO：81[pAG2342]、SEQ ID NO：82[pAG2345]和SEQ ID NO：83[pAG2349]所组成的组中的序列组成。

一种实施方式包括含有多核苷酸序列的表达载体，所述多核苷酸序列与选自由SEQ ID NO：63[pAG 2015]、SEQ ID NO：64[pAG2048]、SEQ ID NO：65[pAG2049]、SEQ ID NO：66[pAG2063]、SEQ ID NO：67[pAG2069]、SEQ ID NO：68[pAG2091]、SEQ ID NO：69[pAG2092]、SEQ ID NO：70[pAG2096]、SEQ ID NO：71[pAG2201]、SEQ ID NO：72[pAG2229]、SEQ ID NO：73[pAG2233]、SEQ ID NO：74[pAG2234]、SEQ ID NO：75[pAG 2242]、SEQ ID NO：76[pAG2252]、SEQ ID NO：77[pAG2253]、SEQ ID NO：78[pAG2309]、SEQ ID NO：79[pAG2310]、SEQ ID NO：80[pAG2339]、SEQ ID NO：81[pAG2342]、SEQ ID NO：82[pAG2345]和SEQ ID NO：83[pAG2349]所组中的组中的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性。

杂交的方法和严格度条件为本技术领域所公知，并且在以下书籍中有所描述：Molecular Cloning,T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook，Cold Spring HarborLaboratory,1982，以及Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.G.Siedman,J.A.Smith,K.Struhl,Volume 1,JohnWiley&Sons,2000，在此以全文援引的方式纳入本文。

温和的条件可以如下：将装有DNA样品的过滤器在含有6x柠檬酸盐缓冲盐水(SSC；Amresco，Inc.，Solon，OH)、0.5％十二烷基硫酸钠(SDS；Amresco，Inc.，Solon，OH)，5xDenhardt’s溶液(Amresco，Inc.，Solon，OH)以及和变性鲑鱼精子(Invitrogen LifeTechnologies，Inc.Carlsbad，CA)的溶液中68℃预处理2-4小时。杂交是在同样的溶液中并稍加以下改动：0.01M EDTA(Amresco，Inc.，Solon，OH)、100μg/ml鲑鱼精子DNA以及5–20x10⁶cpm的³²P-标记或荧光标记探针。过滤器先在杂交混合物中孵育16-20小时，然后用含有2x SSC和0.1％SDS的溶液洗15分钟。第二次清洗更换含有0.1x SSC和0.5％SDS的洗液，并且在Tm(融化温度℃)以下20℃至29℃下额外培养2小时。Tm＝81.5+16.61Log₁₀([Na+]/(1.0+0.7[Na+]))+0.41(％[G+C])-(500/n)-P-F。[Na+]＝钠离子的摩尔浓度。％[G+C]＝DNA序列中G+C碱基的百分比。N＝DNA序列的碱基长度。P＝错配碱基对百分比的温度校正(每1％的错配约1℃)。F＝甲酰胺浓度的校正(每1％甲酰胺＝0.63℃)。过滤器暴露在成像仪中或者通过放射自显影法显影。低严格度条件是指低温杂交条件，例如，在37℃和60℃之间，第二次洗涤在低于Tm的40℃至48℃的温度下用高浓度[Na⁺](高达0.825M)。高严格度是指在高温杂交条件，例如，高于68℃，第二次洗涤在低于Tm的5℃至10℃的温度下用0.0165至0.0330M的[Na⁺]。

一种实施方式提供了分离的核酸序列，所述核酸序列在低度、中度和高度严格条件下与含有选自SEQ ID NO：32[WT P77853]、SEQ ID NO：33[AnfaeA]、SEQ ID NO：34[AnfaeB]、SEQ ID NO：35[NtEGm]、SEQ ID NO：36[EU591743]、SEQ ID NO：37[O43097]、SEQID NO：38[P77853:T134-100-101]和SEQ ID NO：39[P77853:S158-30-108-35]、SEQ ID NO：40[O33897]、SEQ ID NO：41[O68438]、SEQ ID NO：42[P54583]和SEQ ID：43[BD22308]、SEQID NO：52[BAASS:P77853]、SEQ ID NO：53[BAASS:O33897]、SEQ ID NO：54[HVAlePS:NtEGm]、SEQ ID NO：55[BAASS：P77853:S158-30-108-35]、SEQ ID NO：56[BAASS：AnfaeB：SEKDEL]、SEQ ID NO：57[BAASS:AnfaeA:SEKDEL]、SEQ ID NO：58[PR1a:NtEGm:SEKDEL]、SEQID NO：59[BAASS：P77853:T134-100-101:SEKDEL]、SEQ ID NO：60[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQ ID NO：61[BAASS:O43097:SEKDEL]和SEQ ID NO：62[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]、SEQ ID NO：63[pAG2015]、SEQ ID NO：64[pAG2048]、SEQ ID NO：65[pAG2049]、SEQ ID NO：66[pAG2063]、SEQ ID NO：67[pAG2069]、SEQ ID NO：68[pAG2091]、SEQ ID NO：69[pAG2092]、SEQ ID NO：70[pAG2096]、SEQ ID NO：71[pAG2201]、SEQ ID NO：72[pAG2229]、SEQ ID NO：73[pAG2233]、SEQ ID NO：74[pAG2234]、SEQ ID NO：75[pAG2242]、SEQ ID NO：76[pAG2252]、SEQ ID NO：77[pAG2253]、SEQ ID NO：78[pAG2309]、SEQID NO：79[pAG2310]、SEQ ID NO：80[pAG2339]、SEQ ID NO：81[pAG2342]、SEQ ID NO：82[pAG2345]和SEQ ID NO：83[pAG2349]的序列或它们的互补序列的核酸杂交。

一种实施方式提供了上述任何分离的核酸的片段。所述片段可以是杂交探针或引物。所述探针或引物的长度不限。所述探针或引物可以是6，10，15，20，25，30，35，40，45或50个核苷酸长度，或者是前述任意两长度之间的长度(包括端点)。片段可以有小于全长的长度，和/或包括与引用的参考序列相比的碱基的替换或缺失。所述片段可以是所述引用的参考序列的变体。由片段编码的肽的长度可以小于全长，和/或包括与引用的参考序列编码的氨基酸序列相比的氨基酸的替换或缺失。长度小于全长的肽可以是由所述引用的参考序列编码的氨基酸序列的变体。

表达盒可以由已知方法通过基因重组产生。表达盒可以包括一系列特定的核酸元件，它使得植物细胞或植物组织中特定核酸被转录。所述表达盒可以包括编码蛋白的多核苷酸序列。所述蛋白可以是CWD酶或经内含肽修饰的CWD酶。CWD酶可以从包括木聚糖酶酶，纤维素内切酶，外切葡聚糖酶，木糖苷酶，葡糖苷酶和阿魏酸酯酶的一系列CWD酶中选取。

本文中，表达盒中的多核苷酸序列，分离的核酸，载体，或其他任何DNA构建体，或在本文所述的方法中应用的，都可以可操作地与一种或多种调控元件相连接。调控元件可以是启动子。启动子可以是组成型启动子，它在植物大部分细胞，组织和器官的整个发育过程以及许多但并非所有的发育阶段的发育过程中提供多核苷酸序列的转录。启动子可以是诱导型启动子，仅当其暴露在特定的化学物质或环境刺激时，才能启动所述多核苷酸序列的转录。启动子对于特定的发育阶段、器官或组织可以是特定的。组织特异性启动子能够启动在特定的植物组织中的转录。由组织特异性启动子靶向的植物组织可以是但不限于茎，叶，毛状体，花药或种子。本文中，组成型启动子可以是大米泛素3启动子(OsUbi3P)或大米肌动蛋白1启动子。也可以使用其他已知的组成型启动子，包括但不限于花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子，夜香树黄色叶卷曲病毒启动子(CMP)或截短型CMP(CMPS)，二磷酸核酮糖羧化酶小亚基启动子和玉米泛素启动子。组织特异性启动子可以包括种子特异性启动子。种子特异性启动子可以是但不限于大米GluB4启动子或玉米蛋白启动子。提供的另一种调控元件可以是终止转录的终止序列。终止序列可以被包括在表达盒的转录单元的3'端。终止子可以来自不同的植物基因。终止子可以是一种来自根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens.)的胭脂氨酸合成酶或章鱼碱合成酶基因的终止序列。

本文中，整合有表达盒的载体也可以包括另外的基因元件，如多个克隆位点来促进分子克隆和筛选标记以方便选择。包括在载体中的可筛选标记可以是来自大肠杆菌(Escherichia coli)的磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因，该基因赋予转化细胞利用甘露糖增殖的能力。包括在载体中的可筛选标记可以包括但不限于能赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(npt)基因，能赋予潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因和能赋予草甘膦抗性的3-磷酸烯醇式丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate-3-phosphate)合成酶基因。

在一种实施方式中，可以构建包括编码多种CWD酶的多核苷酸序列的载体。本文所述的载体还可以包括多核苷酸序列，其目的在于沉默植物中的一种或多种基因。

表达载体可以导入到合适的宿主细胞，组织，器官和/或生物体中。合适的宿主细胞可以是双子叶(dicots)或单子叶(monocots)的植物。

本文的其他实施方式可以通过补充实施方式来构成，补充的实施方式有一种或多种来源于本文中一种或多种其他实施方式的元件，和/或使用来自本文中一种或多种其他实施方式的一种或多种元件替换来自一种实施方式的一种或多种元件。本文进一步的实施方式可以通过参考权利要求1后的任何一条从属权利要求和阅读从任何一条或多条前述的权利要求中选出的权利要求来描述。

实施例

下面提供非限制性的实施例来说明具体的实施方式。全部实施方式都可以由来自下面的一种或多种实施例来补充一处或多处细节，和/或一种或多种来自一种实施方式的元件可被来自下面的一种或多种实施例中的一处或多处细节替换。

实施例1-材料和方法

载体

本文中设计的载体是根据从日本烟草购买的过渡质粒(intermediate plasmid)pSB11进行的，并且已在2010.11.5提交的申请No.PCT/US10/55746、2010.11.5提交的申请No.PCT/US10/55669和2010.11.5提交的申请No.PCT/US10/55751的国际申请中做出了描述，这些文献以全文援引的方式纳入本文。简单地说，所述用于克隆的质粒pSB11与pSB1受体载体结合，所述pSB1受体载体是在利用pSB11和pSB1都存在的cos和ori位点通过同源重组的卸甲Ti质粒(disarmed Ti plasmid)。整合载体包括诸如virB，virC和virG的毒性基因，这些毒性基因用于T-DNA转移并且可以用于植物转化。基础转化载体含有表达盒，所述表达盒含有在OsUbi3P启动子后续取代了CMPS启动子的控制下编码PMI的人A基因。该基础载体用来获取以下列出的载体，这些载体用于植物转化和细胞壁降解酶在植物中的表达：

1.pAG2015(SEQ ID NO：63)：OsUbi3P:P77853；

2.pAG2048(SEQ ID NO：64)：OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm，在水稻Ubi3启动子之间与液泡融合；

3.pAG2049(SEQ ID NO：65)：OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SE KDEL；

4.pAG2063(SEQ ID NO：66)：OsUbi3P:BAASS:O43097:SE KDEL；

5.pAG2069(SEQ ID NO：67)：OsUbi3P:O68438；

6.pAG2091(SEQ ID NO：68)：OsUbi3P:BAASS：AnfaeA:SE KDEL+OsUbi3P:BAASS:P77853；

7.pAG2092(SEQ ID NO：69)：OsUbi3P:BAASS:AnfaeB:SE KDEL+OsUbi3P:BAASS:P77853；

8.pAG2096(SEQ ID NO：70)：OsUbi3P:BAASS:AnfaeA:SE KDEL+OsUbi3P:BAASS:AnfaeB:SEKDEL+OsUbi3P:BAASS:P77853；

9.pAG2201(SEQ ID NO：71)：OsUbi3P:ZmUBQm:P77853；

10.pAG2229(SEQ ID NO：72)：OsUbi3P:BAASS:P77853：T134-100-101:SEKDEL(经内含肽修饰的木聚糖酶)；

11.pAG2233(SEQ ID NO：73)OsUbi3P:P77853:S158-30-108-35；

12.pAG2234(SEQ ID NO：74)OsUbi3P:BAASS:P77853:S158-30-108-35；

13.pAG2242(SEQ ID NO：75)：OsUbi3P:PR1aSP：NtEGm：SEKDEL+OsUbi3P:ZmUBQm:P77853；

14.pAG2252(SEQ ID NO：76)：OsUbi3P:O33897(内切葡聚糖酶)；

15.pAG2253(SEQ ID NO：77)：OsUbi3P:BAASS:O33897；

16.pAG2309(SEQ ID NO：78)：OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm+OsUbi3P:P77853；

17.pAG2310(SEQ ID NO：79)：OsUbi3P:EU591743(木聚糖酶)；

18.pAG2339(SEQ ID NO：80)：OsUbi3P:O68438+OsUbi3P:BAASS:O33897+OsUbi3P:EU591743；

19.pAG2342(SEQ ID NO：81)：OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm：SEKDEL+OsUbi3P:P77853；

20.pAG2345(SEQ ID NO：82)：OsUbi3P:O68438+OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL+OsUbi3P:BAASS:O43097:SEKDEL；

21.pAG2349(SEQ ID NO：83)：ZmUbi1P:ZmKozak：xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01+OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL+OsUbi3P:BAASS:O43097:SEKDEL；

22.pAG2042(SEQ ID NO：84)：P54583(内切葡聚糖酶EGB)

转基因玉米植物的生产

玉米和柳枝稷转化的方法在2010.11.5提交的申请的No.PCT/US10/55746，2010.11.5提交的申请No.PCT/US10/55669，2010.11.5提交的申请No.PCT/US10/55751的国际申请以及Gray等2011Plant Biotech J9:1100中有所描述，在此以全文援引的方式纳入本文。简单地说，将含有合适转化质粒的农杆菌细胞LBA4404接种到野生型AxB玉米胚性愈伤组织中。未成熟的玉米胚的农杆菌介导的转化按照前面描述的方法进行(Negrotto D等.2000Plant Cell Rep 19：798；Ishida Y et al.1996Nat Biotech 14：745)。酶基因的表达盒被克隆到pAG2004(SEQ ID NO：85)载体的KpnI-EcoRI位点，以便生成过渡载体，使用之前报道的方法(Ishida Y等.1996Nat Biotech14：745；Hiei Y et al.1994Plant J 6：271；Hiei Y和Komari T 2006Plant Cell Tissue Organ Cult.85：27；Komari T etal.1996Plant J 10：165)，所述中间载体能够与农杆菌菌株LBA4404三亲杂交的pSB1载体重组。玉米(玉米品种HiII，A188或B73)母株生长在28℃、16小时光照的温室中。未成熟合子胚从玉米粒中分离出来，并用含有目的基因的农杆菌溶液接种。接种后的未成熟胚在10-12周的组织培养过程中生长。对发育成具有叶和根的幼苗取样进行PCR分析来鉴定含有目的基因的转基因植物。用水清洗PCR阳性并且生根的植物，以洗掉琼脂培养基，移植到土壤中并在温室中生长，以产生种子和秸秆。

本文中，特定的转基因植物是指由酶所标示(如：“P77853”、“P40942”、“O3O700”、“NtEGm”等)或转基因对照(如：“TGC”等)，然后从以亿计的质粒中指定用于构建转基因植物的质粒(如：“2014”、“2015”、“2229”、“2092”等)。在上下文中，除i)酶或对照和ii)质粒名称外，偶尔插入的附加字符是清楚的。提及的质粒以pAGXXXX命名。例如，在转基因植物名称中“2229”、“2252”、“2253”、“2092”、“2096”或“2042”的名字的意思是所述转基因植物分别由“pAG2229”、“pAG2252”、“pAG2253”、“pAG2092”、“pAG2096”或“pAG2042”制备。可以参考纳入的用质粒名称标记的序列来确定用于制备特定的转基因植物的序列。

对于转基因柳枝稷植株的制备，柳枝稷(Panicum virgatum、cv.)的种子用于胚性愈伤组织的启动，随后使用含有pSB1质粒的农杆菌LBA4404用于转化。目的基因的存在使用基因特异性引物通过PCR来验证。

以下表达一种或多种CWD酶的转基因植物及对照植物用来于联合预处理和水解。

1.野生型玉米植株用作阴性对照(AxB；BxA)；

2.使用空载体转化的玉米植株，用作阴性对照(TGC.4000.12；TGC.4000.11；TGC.2004.8.02；TGC.2004.8.04；TGC.2243.01)；

3.通过使用pAG2015转化制备的转基因玉米植株XynA.2015.05，表达木聚糖酶XynA(P77853)；

4.通过使用pAG2015转化制备的第二代转基因玉米植株XynA.2015.5T1，表达木聚糖酶A(P77853)；

5.通过使用pAG2063转化制备的转基因玉米植株XynB.2063.17，表达木聚糖酶XynB(O43097)；

6.通过使用pAG2049转化制备的转基因玉米植株EGA.2049.02和EGA.2049.10，表达内切葡聚糖酶EGA(NtEG)；

7.通过使用pAG2042转化制备的转基因玉米植株EGB.2042.03，表达内切葡聚糖酶EGB(P54583)；

8.通过使用pAG2253转化制备的转基因玉米植株EGC.2253.4b，表达内切葡聚糖酶EGC(O33897)；

9.通过使用pAG2242转化制备的转基因玉米植株EGA/XynA.2242.09，表达内切葡聚糖酶EGA(NtEG)和木聚糖酶XynA(P77853)；

10.上面植株9的第二代转基因玉米植株，命名为EGA/XynA.2242.09.16T1，表达内切葡聚糖酶EGA(NtEG)和木聚糖酶XynA(P77853)；

11.通过使用pAG2092转化制备的转基因玉米植株XynA/AccB.2092.103，表达木聚糖酶XynA(P77853)HE来自黑曲霉(Aspergillus niger)的阿魏酸酯酶B；

12.通过使用pAG2096转化制备的转基因玉米植株XynA/AccA/B.2096.01和XynA/AccA/B.2096.05，表达木聚糖酶XynA(P77853)，来自黑曲霉(Aspergillus niger)的阿魏酸酯酶A和来自黑曲霉(Aspergillus niger)的阿魏酸酯酶B；

13.通过使用pAG2069转化制备的转基因玉米植株CBHA.2069.3.17,表达外切葡聚糖酶CBH(O68438)；

14.通过使用pAG2015转化制备的转基因柳枝稷植株XynA.pv2015.3c和XynA.pv2015.4c，表达木聚糖酶XynA(P77853)；

15.通过使用pAG2229转化制备的转基因玉米植株iXynA.2229.110是，表达经内含肽修饰的XynA(P77853)；

16.通过使用pAG2309转化制备的转基因玉米植株XynA/EGA.2309.54和XynA/EGA.2309.107，表达XynA(P77853)，内切葡聚糖酶EGA(NtEGm)；

17.通过使用pAG2342转化制备的转基因玉米植株XynA/EGA.2342.105，表达XynA(P77853)和EGA(NtEGm)；

18.通过使用pAG2339转化制备的转基因玉米植株XynE/EGC/CBHA.2339.03，XynE/EGC/CBHA.2339.04和XynE/EGC/CBHA.2339.05，表达XynE(EU591743)、内切葡聚糖酶EGC(O33897)和CBHA(O68438)；

19.通过使用pAG2345转化制备的转基因玉米植株XynB/EGA/CBHA.2345.116，表达XynB(O43097)、内切葡聚糖酶EGA(NtEGm)和CBHA(O68438)；

20.通过使用pAG2349转化制备的转基因玉米植株XynB/EGA/CBHB.2349.55和XynB/EGA/CBHB.2349.56，表达XyanB(O43097)、内切葡聚糖酶EGA(NtEG)、CBHB(BD22308)和ZmUbi1P:ZmKozak:xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01:NosT。

植物秸秆

收获的温室玉米秸秆在37℃条件下在空气循环器中干燥1-2周。干燥后，手动把秸秆切成1.0-1.5英寸的碎片，然后使用0.5mm筛的UDY粉碎机(Model 014，UDY公司，FortCollins，CO)磨碎。

植物蛋白提取物的制备

将压碎的谷粒或20mg磨碎的秸秆分别重悬在蛋白提取缓冲液中，所述蛋白提取缓冲液包括100mM磷酸钠(pH值6.5)，乙二胺四乙酸(EDTA；1mM)，聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)(0.1％，v/v)和苯甲基磺酰氟(PMSF；0.1mM)。将重悬的组织样本充分混合，不溶性物质通过离心沉淀。将含可溶性蛋白的上清液转移至新管中。

化学物质和酶

糖标准品(葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和纤维二糖)是从AcrosOrganics(Morris Plains，NJ)购买的。本研究所用的其他化学物质均从Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)购买。用于自制复合酶(in house cocktail)的内切葡聚糖酶(C8546)，β-糖苷酶(49291)和木聚糖内切酶(X2753)都购自Sigma(St.Louis、MO)。所述外切纤维素酶(CBHI)(EC3.2.1.91)和β-木糖酶(EC 3 2 1 37)均从Megazyme(威克洛，爱尔兰)购买。1500和XY均由杰能科国际(Genencor International)(Rochester，NY)惠赠。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，菌株D5A是从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)(Manassas，VA)获得的。

秸秆酶测试

从15mg于室温下在500μl提取缓冲液(100mM磷酸钠缓冲液，pH6.5；NaOAc，pH，4.5或Tris，pH 8.0；EDTA(10mM)和Triton X-100(0.1％)中孵育30min的秸秆中提取蛋白。通过离心分离秸秆。收集上层清液并转移至新的微量离心管。在缓冲液中重浮50μl蛋白提取物用来进行酶分析。通常，将含有Xylazyme的100mM的磷酸钠溶液，pH 6.5或含有Cellazyme的100mM NaOAc溶液，pH 4.5，xylazyme AX或纤维素酶检测底物药片(cellazyme tablets)的缓冲液适量加入到用于酶测试的每管中。在测试温度下(通常约50-60℃，这取决于被测试酶)孵育进行反应，直至上清液有可见蓝颜色出现。通过测定反应产物在590纳米下的吸光度来量化蓝色染料的量。这些反应的对照包括微生物提高的酶和野生型植物提取物。水解底物也可以通过使用AZCL缀合底物(Megazyme)替代xylazyme AX和纤维素酶检测底物药片的情况而定。使用AZCL缀合底物使得被测秸秆的体积和底物浓度最优化。

木聚糖酶活性的检测

50℃下在0.5ml反应体系中使用Xylazyme AX(Megazyme,Bray,Co.Wicklow,Ireland)作为底物进行可溶性蛋白的测定，对于BSX使用HEPES缓冲液(100mM、pH 8.0)，对于XynB使用磷酸钠(100mM、pH 6.5)缓冲液。将1ml 2％(w/v)的Tris碱加入到反应体系中以终止Xylazyme AX反应。通过离心来沉淀来自Xylazyme AX反应的不溶性材料，使用分光光度计在590nm下测定100μL反应产物的吸光度值，一式三份。对于BSX或XynB积累水平的量化，通过孵育已知量的纯化的、使用含有Xylazyme AX药片的分析缓冲液稀释的微生物提高的BSX或XynB，以构建标准曲线；与此同时，使用转基因植物材料进行Xylazyme AX分析。

下面表1说明了在转基因植物中检测的酶活性。如文中所述。检测了几种木聚糖酶，内切葡聚糖酶，外切纤维酶和阿魏酸酯酶的酶活性。对于每一个转基因事件，被测的酶活性同样通过蛋白质印迹(Western blot)分析加以验证。“N/A”指的是没有进行的分析。

表1

生物质碳水化合物成分分析

在碳水化合物成分分析前，按照NREL标准(NREL/TP-510-42619)，使用玻璃的索氏提取系统(Fisher Scientific，Pittsburg，PA)，用90％(v/v)的乙醇对风干磨碎的秸秆3.0g重复进行回流来去除乙醇可提取的材料。含有提取物的乙醇使用带有水浴的旋转蒸发仪进行真空蒸发(Heidolph LR4000G5B，IL USA)，水浴设为40℃。通过称量长颈瓶中50℃烘干48小时后的固形物的重量来测量提取物的含量。

无提取物的秸秆经历两步酸水解(NREL/TP-510-42618)，首先在30℃下用1.5ml的72％(w/w)的硫酸(每0.16-0.18g风干重)水解60分钟，其次在121℃条件下补充42.0ml的水处理1小时。在酸水解后，添加氢氧化钠和氢氧化钙调整pH值在4.0和9.0之间，所有样品均通过0.2μm的PVDF过滤器过滤(Fisher Scientific，Pittsburg，PA)以便用于高效液相色谱(HPLC)分析。

温和的预处理和糖化的联合工艺

为了评估植物表达的CWD酶对秸秆水解的影响，开发出联合工艺，包括温和的预处理后进行不进行生物质/解毒作用的级间洗涤的酶水解。联合工艺去除了任何洗涤/分离/解毒步骤，允许联合预处理，以及同步糖化和发酵(SSF)过程。

温和预处理开发的高效的温和预处理，可以达到一定的生物质预处理效果，但不会使植物内的水解酶失活。预处理的化学物质是包括0.02M-0.18M亚硫酸氢铵和0.025M-0.20M碳酸铵的混合物，pH值在5.0和9.0之间，优选是8.10左右。为了检测植物秸秆水解作用，将20.0mg磨碎的玉米秸秆添加到2ml装有预处理化学溶液的微量离心管中，液固比(L/S)为10或更低(优选为3-6)。预处理在40℃-95℃，350rpm的摇床中培养0-16小时。化学预处理后对磨碎和未磨碎的秸秆进行机械精炼或去纤维化。另外，预处理材料还会经历没有级间洗涤的酶水解。

酶水解预处理的秸秆在有叠氮化钠的伯瑞坦一罗比森(Britton-Robinson)缓冲液(40mM的磷酸盐，40mM的醋酸盐，40mM的硼酸盐)中进行酶水解。酶水解在50℃，pH 4.9，2％(w/v)固含量的条件下，在New Brunswick摇床(New Brunswick Scientific、NewJersey USA)中进行，摇床以转速250rpm旋转不同时间(0-144小时)。基于具有1ml反应体积的10.0mg的秸秆，#1复合酶的用量为0.5μM的内切葡聚糖酶，0.1μM的外切纤维素酶(CBHI)，0.05μM的β-糖苷酶和0.5μ木聚糖内切酶。5#复合酶为添加有0.1μM的β-木糖酶的#1复合酶。同时，三种类型的酶水解并行进行：无复合酶(NCt)、全复合酶(FCt)和缺乏在植物中表达的酶的复合酶(Ct-PE)，例如，根据在植物中表达的酶，缺乏木聚糖内切酶(Ct-Xyn)或内切葡聚糖酶(Ct-EG)或两者(Ct-EG-Xyn)都缺乏的复合酶。1500用量为0.2ml/g干质量，XY用量为0.1ml/g干质量。葡萄糖和木糖产量(理论值％)表示为在每种底物中总葡萄糖和木糖的百分比。附图中的误差线是重复试验平均值的标准偏差。

同步糖化和发酵(SSF)

培养液是通过在30℃和250rpm的条件下，在的YPD(10g/l酵母提取物，20g/l蛋白胨和20g/l葡萄糖)中使酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)D5A生长到OD₆₀₀值为0.5而制备的。细胞通过离心(3000g 5分钟)收集，并且重新悬浮在1X YP((10g/l酵母提取物，20g/l蛋白胨)中。

SSF实验在250ml锥形玻璃烧瓶(有效容积为50ml)中重复两次，所述锥形玻璃烧瓶中含有3.0-4.0克(干重)预处理的生物质，Britton-Robinson缓冲液，10x YP(100g/l酵母提取物和200g/l蛋白胨)，接种物和水解酶。烧瓶由带有气塞的橡胶塞密封。实验开始时添加酵母接种物和酶(10FPU/g干质量的1500和0.1ml/g干质量的XY)，并在35℃，120rpm条件下培养7天。在0、24、48、72、144和168小时后分别取出样品，进行乙醇和糖分析。

发酵糖和乙醇的分析

将水解的样品在90℃下加热20分钟，之后进行10000g的离心，随后将上清液通过0.20μm PVDF过滤器(Cat.#：09-910-13、Fisher Scientific、Pittsburg、PA)进行澄清。使用岛津带有LC solutions软件的LC-20AD二元液相泵(Shimadzu、Kyoto、Japan)通过高效液相色谱(HPLC)测定单糖和二糖的浓度。糖浓度使用Aminex HPX-87P糖柱(Bio-RadLaboratories、Hercules、CA)测定，操作条件为80℃、0.6ml/min，使用脱气水作为流动相。发酵液中的乙醇浓度通过使用Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA)酸柱进行分析，操作条件为60℃、0.6ml/min，0.004M硫酸作为流动相。对通过RI检测器(RID10AD)分析的所有样品的峰面积进行整合，将所得数值与定量标准曲线进行比较。

实施例2-植物秸秆碳水化合物组成分析

对来自转基因植物的秸秆，根据他们的结构性碳水化合物组成和糖含量进行表征，以检测任何由基因修饰引起的显著变化。表2显示了随机抽样的转基因和非转基因玉米和柳枝稷事件的结构性碳水化合物分析的结果。来源于无论是表达一种还是多种CWD酶或缺乏编码CWD酶的转基因(转基因对照TGC)的一系列转基因植物的葡聚糖和木聚糖的含量类似于野生对照植物(AxB)的。

表2转基因植物(表达CWD或TGC)的葡萄糖和木糖的含量与非转基因野生型(AxB)植物比较。

表2中数据的Student’s t-检验显示，在表达CWD酶的转基因玉米事件和野生型玉米AxB之间，或表达CWD酶的转基因玉米事件和不表达CWD酶的转基因对照事件之间，葡聚糖总量无显著差异，P值分别为0.90和0.14。对木聚糖含量的t-检验相应的p值分别为0.57和0.36。

因此，植物中酶的表达，不仅为生产廉价酶，还为生产用于可溶性糖生产的具有水解特征的生物质原料提供了机会。

实施例3-植物表达的CWD酶对生物质水解的影响

植物生物质水解分析的方法学

植物中表达CWD酶的一个目标是消除或减少用于加工木质纤维素生物质的化学预处理条件的严格性。

为了评估植物表达的CWD酶对生物质水解的影响，开发了伴随温和的化学预处理(pH值为5.0-9.0，55℃处理16小时)后进行没有级间洗涤的酶水解(pH 4.9，50℃水解72小时)的联合工艺，并选定为用于植物秸秆初始筛选的标准程序。在这个工艺中，使用自制混合酶(#1复合酶和#5复合酶)用来检测。自制复合酶是单独酶组分的结合，从而使得取决于在植物中表达的酶的特性的任何组分的遗漏成为可能。对于每种转基因植物秸秆和野生型或转基因对照植物秸秆，以下酶水解处理并行运行：无复合酶(NCt)，全复合酶(FCt)和缺乏在植物中表达的酶的复合酶(Ct-PE；例如缺乏木聚糖酶的复合酶(Ct-Xyn)，酶缺乏内切葡聚糖酶的复合酶(Ct-EG)、或同时缺乏木聚糖酶和内切葡聚糖酶的复合酶(Ct-Xyn-EG))。

为了检测哪种酶或哪些酶支持好的水解作用，应用了两种标准来评估在初始筛选中表达CWD酶的转基因事件的加工特性。

1.来自全复合酶(FCt)水解(图2A–2B中的高度(1))的总糖产量。

2.涉及全复合酶(FCt)和不含有在植物中表达的酶的复合酶(Ct-PE)水解之间糖产量的差异(图2A–2B中的高度(2))。

加工过程中生产的总糖(高度(1))是考虑的标准，因为它直接影响到最终产品的产量，生产力和运营成本。在表达CWD酶的植物中，证明了表达酶的转基因植物与相同处理条件下的对照植物相比，能更好的完成全部水解，这在图2中的总葡萄糖和木糖产量中得到了证明。第二个标准，在FCt和Ct-PE(高度(2))之间的糖产量的差异代表了植物表达的酶对水解的影响。当使用这些转基因植物作为生物质原料时，观察到在复合酶中的外源酶能够部分或完全被在转基因植物中表达的一种或多种CWD酶所取代，而达到相似或相同的水解效果，这表明了在FCt和Ct-PE水解之间(图2B)的糖产量没有区别或只有小差别。

植物秸秆的水解评估

使用以上认定的两个选择标准，使用自制的复合酶对秸秆样品进行酶水解，以筛选不同的表达CWD酶的转基因玉米植株的性能。基于筛选的结果，鉴定出性能最好的转基因植物事件，包括表达木聚糖酶的转基因植物XynA.2015.05和XynB.2063.17；表达内切葡聚糖酶的转基因植物EGA.2049.10和EGB.2042.03以及表达多种酶的转基因植物-XynA/AccA/B.2096.01，XynA/AccB.2092.103，EGA/XynA.2242.09，XynB/EGA/CBHA.2345.116，XynB/EGA/CBHB.2349.55，XynB/EGA/CBHB.2349.56和XynB/EGA/CBHB.2349.229。

图2说明了对来自表达木聚糖酶A的转基因植物(XynA；XynA.2015.05)和不表达CWD酶的转基因对照植物TGC.4000.12(TGC.4000.12)的材料水解后葡萄糖(图2A)和木糖(图2B)的产量。转基因事件XynA.2015.05和转基因对照由FCt(自制#5复合酶)、NCt和Ct-Xyn(缺乏木聚糖酶A的自制#5复合酶)酶水解后，糖产量数据使用上面选择的标准来评估。FCt处理(标准1)后显示出的总葡萄糖产量值要高于对XynA.2015.05和TGC.4000.12两者进行FCt和Ct-Xyn处理(标准2)之间的葡萄糖产量的差值。所有处理的葡萄糖和木糖产量的总值，对于转基因事件XynA.2015.05来说要高于对照植物TGC.4000.12。值得关注的是，使用全复合酶和不含有植物表达的木聚糖酶A的复合酶处理后的葡萄糖和木糖产量的差异非常小。基于这些结果，植物中表达的木聚糖酶A在水解植物秸秆中与全复合酶提供的木聚糖酶A几乎一样有效。根据选择标准1和2，图2中显示的转基因事件XynA.2015.05被认为水解作用较好。

表达木聚糖酶的植物

木聚糖是已知的在硬木，农业废弃物、生物质和多年生牧草中占优势的半纤维素。木聚糖是杂聚生物聚合物，由重复的β-1,4连接的含有支链基团的木糖骨架组成，并且可以通过芳香族酯类(Dodd D和Cann IO 2009Glob Change Biol Bioenergy 1：2)交联到木质素上。木聚糖的破坏和去除有益于纤维素水解转化为可发酵糖。在典型的水解复合酶中，木聚糖酶是一类主要的用来水解半纤维素聚合物的CWD酶，因为他们在使纤维素更易被酶水解中起着非常重要的作用。参见图3B，图5B-5D以及图7B，表达XynA或XynB的转基因植物(XynB.2063.17、XynA/Acc/A/B.2096.01和XynA.2015.05T1)证明了来自Ct-Xyn水解的木聚糖的转化要比对照植物高29.80-172.1％，说明了植物中表达的木聚糖酶对生物质木聚糖水解有增强效应。同样，这些转基因植物也显示来自Ct-Xyn水解的葡聚糖转换要比对照植物高50.1-93.5％。

图3A-3B说明经自制的#1复合酶(FCt)、缺乏木聚糖酶B的#1复合酶(Ct-Xyn)和无酶(NCt)水解后，来自预处理的表达木聚糖酶B的转基因植物(XynB.2063.17)组织和野生型对照(AxB)的葡萄糖(图3A)和木糖(图3B)的产量。结果证明经过Ct-Xyn处理，来自转基因事件XynB.2063.17的葡萄糖产量和木糖产量分别比来自对照植物AxB的高63.2％和109.4％。从FCt和Ct-Xyn处理(标准2)之间的木糖产量值的细小差别可以看出，事件XynB.2063.17显示了明显改善的木聚糖水解效果。

这些结果表明，和全酶混合物提供的酶比较，植物中表达的木聚糖酶B在水解秸秆中有惊人的良好性能。

表达纤维素的植物

木质纤维素生物质被认为是由含多种交织的生物聚合物(纤维素、半纤维素、木质素及可提取物)的基质构成，这就需要几种不同类型的大量的酶来有效释放可发酵糖。其中，纤维素酶是关键酶。三种类型的纤维素酶：内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶共同起作用，使纤维素水解成葡萄糖。在水解过程中，内切葡聚糖酶破坏纤维素链之间的交联，而外切葡聚糖酶水解单个葡聚糖链，β-葡糖苷酶分解外切葡聚糖产物以形成葡萄糖单体(Sticklen MB 2008Nature Reviews Genetics 9:433)。

图4A–4B显示了表达内切葡聚糖酶的转基因植物的水解结果。这些图说明了从表达内切葡聚糖酶(EGA)的转基因事件EGA.2049.02和EGA.2049.10以及缺乏这种酶的转基因对照植物TGC.4000.12(图4A)产出的葡萄糖产量。这些图也说明了从表达内切葡聚糖酶B(EGB)的转基因事件EGB.2042.03和转基因对照植物TGC.2004.8.02(图4B)产出的葡萄糖产量。采用#1全复合酶(FCt)，缺乏内切葡聚糖酶(Ct-EG)的复合酶和无酶(NCt)进行水解处理。对于表达EGA的玉米事件，EGA.2049.02和EGA.2049.10达到了高于转基因对照植物(TGC.4000.12)(图4A)48.9-126.9％的葡聚糖转化。对于EGA.2049.10来说，Ct-EG和FCt水解之间的葡萄糖产量的差别是可以忽略的，比TGC.4000.12低大约29.1％。基于标准2，对转基因事件EGA.2049.02作了类似的观察。根据图4B，表达EGB的转基因植物EGB.2042.0经Ct-EG水解作用转化的葡聚糖要比转基因对照TGC.2004.8.02高63.6％。出乎意料的是，EGB.2042.03经Ct-EG水解作用产出的葡萄糖产量只比经FCt水解作用的低12.2％，相比而言，作相应处理的TGC.2004.8.02要低23.0％。这些数据显示表达EGB的植物的水解作用比对照植物大约好50.0％。

表达多种酶的植物

为了开发高效和廉价的用于快速和廉价地对生物质进行解聚的酶生产系统，在玉米中表达了在水解复合酶中使用的几种酶。

图5A–5D和图6A–6B显示了表达多种酶的转基因植物XynA/AccA/B.2096.05、XynA/AccA/B.2096.01、EGA/XynA.2242.09、XynB/EGA/CBHB.2349.56、XynB/EGA/CBHB.2349.55和XynB/EGA/CBHA.2345.116的水解作用的结果。

图5A-5B说明了经#1全复合酶(FCt)、缺乏木聚糖酶的#1复合酶(Ct-Xyn)和不经复合酶(NCt)处理后，预处理的表达木聚糖酶A(XynA)和辅酶的(Acc)的转基因玉米植株XynA/AccA/B.2096.01、XynA/AccA/B.2096.05以及转基因对照植物TGC.2004.8.02的酶水解的数据。转基因事件XynA/AccA/B.2096.01，XynA/AccA/B.2096.05的Ct-Xyn水解作用产出的葡萄糖产量(图5A)分别比对照植物TGC.2004.8.02的高80.4％和93.5％。

根据图5C，EGA/XynA.2242.09经Ct-Xyn-E水解作用产糖量出奇的高可以用协同水解效应来解释。同样的，基于XynA/AccA/B.2096.01、XynA/AccA/B.2096.05的转基因组织的CT-Xyn水解作用产出的木糖产量的木聚糖转化效率(图5B)分别比对照植物TGC.2004.8.02的高143.4％和172.1％。观察到的这些转基因事件的木聚糖高效转化率也可以归因于多种酶的协同效应。

图5说明了使用#1全复合酶(FCt)、缺乏木聚糖酶的#1复合酶(Ct-Xyn)、缺乏内切葡聚糖酶的#1复合酶(Ct-EG)和缺乏木聚糖酶和内切葡聚糖酶的#1复合酶(Ct-Xyn-EG)进行酶处理后，从转基因玉米事件EGA/XynA.2242.09中产出的葡萄糖(图5C)和木糖(图5D)的产量，所述转基因玉米事件同时表达内切葡聚糖酶A(EGA)和木聚糖酶A(XynA)。在植物中表达XynA导致了水解作用后EGA/XynA.2242.09的葡萄糖和木聚糖产量的增加。例如，Ct-Xyn处理的转基因事件显示出高于对照植物50.1％的葡聚糖转化效率(图5C)和29.8％的木聚糖转化效率(图5D)。植物表达EGA导致了提高的葡聚糖水解效率，由此证明，在FCt、Ct-EG和Ct-Xyn-EG处理之间，葡萄糖产量的差异。

图6A–6B说明了从1)同时表达三种CWD酶的转基因事件(XynB/EGA/CBHB.2349.56和XynB/EGA/CBHB.2349.55，同时表达木聚糖酶B、内切葡聚糖酶A(EGA)、外切纤维素酶B；XynB/EGA/CBHA.2345.116，同时表达木聚糖B，内切葡聚糖酶A和外切纤维素酶A)；2)野生型对照植物AxB中产出的葡萄糖(图6A)和木糖(图6B)的产量，显示了全复合酶(FCt)和无复合酶(NCt)的处理结果。预处理包括0.17M的亚硫酸氢铵和碳酸铵(BSC)，液固比为10，55℃处理17小时。秸秆的酶水解在50℃，pH 5.0，使用每克秸秆0.2/0.1ml的1500/XY进行三天。根据图6，结果显示从表达三种CWD酶的转基因植物中产出的葡萄糖和木糖的产量要比野生型对照植物的高很多。出乎意料的是，非常温和的化学预处理后，最佳实施事件XynB/EGA/CBHB.2345.56显示出的葡萄糖和木糖的产量比阴性对照植物的高出43.6％和117.6％。

表达CWD酶的第二代植物

第一代(T0)XynA.2015.05植物被确认为是好的水解候选植物。为了进一步评估这个事件和相应的酶(XynA)的构造，种植来自这个事件的种子以便生成第二代T1后代。在图7B中显示了评价XynA.2015.05植物的T0和T1的水解结果。

用于评估T0植物的两个标准同样适用于评估T1植物产生的水解效率，并证明这种酶能够跨物种有效。图7B显示出从使用pAG2015制备的柳枝稷的中产出的葡萄糖产量(图7A)和从表达木聚糖酶A的T0转基因事件XynA.2015.05T0、表达木聚糖酶A的T1转基因事件XynA.2015.05T1和缺乏酶TGC.4000.11的转基因对照植物中产出的木糖产量(图7B)。水解通过全复合酶(FCt)，缺乏木聚糖酶的复合酶(Ct-Xyn)和非酶混合物的处理完成。对于Ct-Xyn处理，以葡萄糖和木糖产量判断，第一代转基因事件XynA.2015.05T1显示和第一代事件XynA.2015.05T0相似，但与对照植物TGC.4000.12的糖产量相比高出55.3％的葡聚糖和101.6％的木聚糖。

这些数据表明，在植物中表达的酶是可遗传的，并能够在转基因植物的后代中保持活性。

植物物种的多样性

除了转基因玉米事件，通过转化载体pAG2015获得了表达木聚糖酶A的柳枝稷植物。当来自好的玉米水解实施者XynA.2015.05的木聚糖酶A在通过相同的构建体(pAG2015)转化的柳枝稷中表达时，产生的转基因柳枝稷XynA.pv2015.3c也显示了与对照柳枝稷Alamo相比更好的葡聚糖和木糖转化。图8说明了经全复合酶(FCt)、缺乏木聚糖酶的复合酶(Ct-Xyn)和无酶(NCT)的处理后，从水解的预处理的转基因柳枝稷事件XynA.pv2015.3，XynA.pv2015.4c和野生型对照柳枝稷植物(Alamo)中产出的葡萄糖(图8A)和木糖(图8B)的产量。两个转基因事件XynA.pv2015.3c和XynA.pv2015.4c比对照柳枝稷(Alamo)表现出更好的水解。表现最好的事件XynA.pv2015.3c显示高出对照植物30.0％的葡聚糖转换率和50.0％的木聚糖转换率。这些数据表明，相同的水解特性在表达酶的植物中可能是跨物种保守的。

表达经内含肽修饰的酶的植物

为了避免CWD酶的积累对植物生长的有害影响，研发了经内含肽修饰的酶，并在植物中表达以达到令人满意的水解效果而不引起植物的表型异常。图9展示了经过FCt、Ct-Xyn和NCt处理后，从经过水解的预处理的表达经内含肽修饰的XynA的转基因植物iXynA.2229.110和野生型对照植物AxB产出的葡萄糖(图9A)和木糖(图9B)的产量。预处理温度比诱发在iXynA.2229.110中剪接内含肽的50℃高。通过Ct-Xyn水解的iXynA.2229.110显示出与对照植物AxB相比高出66.0％的葡聚糖转换率和57.3％的木聚糖转化率。转基因植物iXynA.2229.110都是正常的。

从碳水化合物组成分析得到的数据显示在表达一种或多种水解酶的转基因植物和对照植物产出的葡聚糖和木聚糖的总量之间无显著差异。水解结果表明，在实验条件下经过酶水解，表达CWD酶的转基因植物实现了与对照植物相比高出141％的葡萄糖产量和172％的木糖产量。

实施例4-水解作用的时间进程

为了更好的评估植物表达的酶对水解作用的影响。对候选转基因植物的水解进行了时间进程的评估。图10比较了转基因植物XynB2063.17，XynA.2015.05T1和对照植物TGC.2004.8.02的全复合酶(FCt)水解的时间进程。水解动力学遵循典型的分布图：迅速开始水解，紧随其后的是缓慢上升阶段，以及最后达到平衡。24小时后水解减慢，48小时后达到平衡。贯穿整个时间进程，植物中表达木聚糖酶的转基因植物与对照植物相比显示始终更好的水解，很明显在为期3天的水解过程中葡萄糖产量高出了30.0-40.0％。在植物中表达的木聚糖酶可以看作是改善生物质半纤维素和纤维素水解的酶预处理。

图11说明了使用FCt和Ct-EG处理的表达内切葡聚糖酶A(EGA)的转基因植物EGA.2049.10与转基因对照植物TGC.4000.11相比酶水解的时间进程。植物内切葡聚糖酶的表达对水解作用的影响显示了这些植物在Ct-EG水解的时间进程中葡萄糖产量的差别。在整个时间进程中，经Ct-EG水解后，表达内切葡聚糖酶的植物EGA.2049.10与对照植物TGC.4000.11相比显示，葡聚糖转化率始终高出48.9％和63.6％。出乎意料是，已经从具有内切葡聚糖酶表达的转基因植物中，实现了更有效和更快速的水解作用。

图12说明了表达EGA和XynA的转基因事件EGA/XynA.2242.09和转基因对照植物TGC.4000.11的酶水解的时间进程。说明了用FCt、Ct-EG和Ct-Xyn处理的转基因事件EGA/XynA.2242.09的葡萄糖产量(图12A)和木糖产量(图12B)始终要高于对照植物TGC.4000.11的。这些数据表明，这些高的糖产量是由于植物中内切葡聚糖酶和木聚糖酶的同时表达。

图13说明了经过FCt和Ct-Xyn处理的表达XynA和辅酶(黑曲霉FAEB)的转基因植物XynA/AccB.2092.103和转基因对照植物的酶水解的时间进程。在整个时间进程中，预处理的转基因植物XynA/AccB.2092.103的秸秆的Ct-Xyn水解达到了高于转基因对照植物30％以上的葡聚糖转化率(图13A)和24％以上的的木聚糖转化率(图13B)。

根据图12和图13，观察到表达多种酶的转基因植物的更好的水解作用，这种作用在对XynA/AccB.2092.103和EGA/XynA.2242.09进行水解的整个进程中的葡萄糖和木糖的产量中得以体现。更好的水解作用可以通过多种酶作用的协同效应来解释。

根据图10，11，12A和13A，结果显示出除通过在植物中表达CWD酶取得了较高的水解率外，表达CWD酶的转基因事件在水解的时间进程中的动力学图谱与对照植物相比，葡萄糖产量变化表现出较高的起始斜率，表明更快的初始水解。

根据图10，除了更好的水解作用，表达水解酶的转基因植物与对照植物相比也表现出更快的初始水解(图10)。当在植物中表达后，水解酶在植物细胞内积累。处理过程中，他们可以在原位立即开始起作用而不需要长距离运输和扩散。因此预计这些酶的效率会高，由于来自物质转移的较低阻力和预期的植物中的酶与木质素或其他非靶向分子的非选择性结合的降低。在植物中，植物生物质降解酶的过量表达不显示导致纤维素的减少，而是使木聚糖酶插嵌变松散，然后进行不可逆的细胞壁修饰。所有这些因素均可能有助于植物表达的酶更快的水解。

实施例5-通过提高预处理温度提高水解

使用用于预处理的预处理化学物质、相对高的温度通常对水解产生更佳的预处理影响。为了检测预处理温度的影响，将鉴定的最高水解执行者进行65℃和75℃的预处理。这些植物的葡萄糖水解产量显示在图14中。

已经发现，某些包括内切葡聚糖酶A(O77044)的CWD酶在植物中表达的时候其热稳定性可以提高。高耐热性的酶(如12内切葡聚糖酶C(O33897)家族)在植物中表达后其热稳定性可以得到进一步提高，提供了在处理过程中使用提高的预处理温度的机会来达到改善水解的目的。图14说明了预处理温度对来自高性能转基因事件XynB.2063(表达木聚糖酶B)、XynA.2015.05T1(表达木聚糖酶A)、EGA.2049.10(表达内切葡聚糖酶A)、XynA/AccB.2092.103(表达木聚糖酶A和辅酶B)、XynA/EGA.2242.09(表达木聚糖酶A和内切葡聚糖酶A)和iXynA.2229.110(表达经内含肽修饰的木聚糖酶A)以及对比的野生型对照植物AxB以及缺乏酶的转基因对照植物TGC.4000.11.的葡萄糖产量的影响。植物的水解作用在65℃或75℃条件下使用FCt来完成。这说明从65℃至75℃增加预处理的温度，对于对照植物AxB和TGC.4000.11来说提高了葡萄糖的产量，而对于表达酶的转基因植物则不然。这一事实可以解释为植物表达的酶对可利用的生物质底物的饱和作用。使用65℃的预处理温度，所有表达酶的转基因植物与野生型对照植物AxB和转基因对照TGC.4000.11相比，显示了高出11.0-33.4％的水解效率，达到了理论葡萄糖产量的80-84％。

图15说明了表达高耐热性的内切葡聚糖酶A(EGC)的转基因柳枝稷植株EGC.2253.4b经过65℃、75℃和95℃的温度进行酶水解的预处理后葡萄糖的产量。如图所示，转基因事件EGC.2253.4b的葡萄糖产量始终高于对照植物Alamo的，在95℃预处理时分别达到89.4％和71.4％的转化率。

图16A–16B说明了经过酶水解处理的预处理温度和时间对转基因事件XynA/EGA.2342.05和缺乏酶的转基因对照植物TGC.2243.01的葡萄糖(图16A)和木糖(图16B)的产量的影响。通过使用0.175M的亚硫酸氢铵和碳酸铵，在pH值为8.1，温度为55℃、60℃和75℃，每个温度处理2、4、6和16小时，3000rpm转速的条件下进行预处理。酶水解用0.2ml的1500/g预处理的秸秆和0.1ml的XY/g预处理的秸秆，在固含量2％、pH为5.0、1xBritton-Robinson缓冲液(BR；终pH 4.9)、0.02％叠氮化钠、50℃和250rpm转速的条件下处理72小时。如图所示，在所有预处理温度和处理的时间中，表达木聚糖酶A和内切葡聚糖酶A的转基因事件XynA/EGA.2342.105始终比对照植物TGC.2243.01表现要好。这些数据还表明了延长预处理时间会使来自植物的葡萄糖和木糖的产量几乎呈线性增加，而且处理16小时会明显改善转基因和对照植物的水解作用。

17A–17B说明了预处理温度对从转基因事件XynA/EGA.2242.09.01和XynA/EGA.2242.09.07(表达木聚糖酶A和内切葡聚糖酶A)以及野生型对照植物AxB和转基因TGC.4000.11中产出的葡萄糖(图17A)和木糖(图17B)产量的影响。使用全Accellerase复合酶在55℃至65℃以及75℃下对植物进行酶水解。酶量包括每克预处理的秸秆0.2ml的1500以及每克预处理的秸秆0.1ml的XY。表达CWD酶的转基因植物达到了高达83.5-89.1％的葡萄糖产量和50.0-64.3％木糖产量，而对照植物仅达到了63.0-76.6％的葡萄糖产量和35.7-45.3％的木糖产量。

当预处理温度提高到65℃时会达到显著性的水解作用。对于某些玉米秸秆来说，将温度提高到75℃会改善对照植物而不是表达酶的转基因植物的水解作用。根据图15，对于表达高耐热性的内切葡聚糖酶C(EGC)的转基因柳枝稷，出奇地发现使用提高的预处理温度能够改善水解作用，尤其在95℃时显著高于对照植物Alamo。

总的来说，从高性能的转基因植物得到的预处理的秸秆，在提高的温度(65℃和75℃)下获得了超过80％的葡萄糖水解率，与不表达异源性水解酶的对照植物相比高出25％的水解率。因此，植物中高耐热性的水解酶的表达将为实现目标组分的水解提供更多的机会。

实施例6-减少酶用量和发酵能力

因为表达CWD酶的转基因植物证明了，在相似水解条件下与对照植物相比有更高的水解产量和更快的动力学，所以对减少外源酶用量进行了测试。图18说明了经过使用不同用量的自制的#1复合酶，比如全复合酶(FCt)、75％的复合酶(0.75FCt)、50％的复合酶(0.50FCt)、25％的复合酶(0.25FCt)、10％的复合酶(0.10FCt)以及无酶(0FCt)的水解处理后，来自表达木聚糖酶B的转基因植物XynB.2063.17、表达木聚糖酶A的XynA.2015.5T1和对照植物TGC.2004.8.4的葡萄糖产量。这些数据证明通过表达CWD酶的转基因材料的应用，在不降低糖产量的情况下，减少外源酶的用量的可行性。例如，使用0.75FCt的用量，转基因事件XynA.2015.15T1取得了高于60％的葡聚糖转换，这类似于使用FCt用量的大约65％的葡聚糖转换。相比之下，使用FCt的用量，转基因对照TGC.2004.8.4能达到大约50.0％的葡聚糖转换，使用0.75FCt的用量大约有40％的葡聚糖转换。这些数据表明，表达CWD酶的植物的水解作用比对照植物的更有效，外源酶用量更少。

图19说明了经过使用全复合酶(FCt)、20％的全复合酶(0.2FCt)以及无酶(NCt)的水解处理后，从转基因植物XynE/EGC/CBHA.2339.03、XynE/EGC/CBHA.2339.04和XynE/EGC/CBHA.2339.05(表达木聚糖酶E，内切葡聚糖酶C和外切纤维素酶A)和野生型对照型植物BxA中产出葡萄糖的产量。这些数据显示50％-70％的葡萄糖产量可以从仅使用全复合酶用量20％的转基因植物XynE/EGC/CBHA.2339.03，XynE/EGC/CBHA.2339.04和XynE/EGC/CBHA.2339.05中获得，这比对照植物的高出35-77％。

值得关注的是，仅用20％用量的全复合酶进行水解后，转基因事件XynE/EGC/CBHA.2339.03产出的葡萄糖产量仍然比使用全复合酶水解处理的对照植物BxA产出的的葡萄糖产量高出15％。

图20A-20B显示了使用全复合酶(FCt)、20％的全复合酶(0.2FCt)和无酶(NCt)水解后，外源酶用量的减少对转基因事件XynA/EGA.2309.54和XynA/EGA.2309.107(表达木聚糖酶A和内切葡聚糖酶A)以及对照植物BxA的葡萄糖产量的影响。通过使用20％用量的全复合酶，从表达酶的转基因植物中获得了60％-70％的葡萄糖产量，与此相比，使用全复合酶获得了80％的葡萄糖产量。比较起来，在0.2FCt的处理中，阴性对照仅产生了53％的葡萄糖，FCt处理中产生了70％的葡萄糖。参见图20B，在0.2FCt的处理中，从表达CWD酶的转基因植物中获得了约38％的木糖产量，与此相比，FCt处理中获得了约47％的木糖产量，对阴性对照植物来说，在FCt和0.2FCt的处理中，木糖的产量均低的多。XynA/EGA.2309.54和XynA/EGA.2309.107的20％FCt的葡萄糖产量能够比阴性对照的高出16-29.3％，木糖高出27.6-31％。

图21A-21B说明了经过使用无酶(0)、20％全复合酶(0.2FCt)、40％全复合酶(0.4FCt)、60％全复合酶(0.6FCt)、80％全复合酶(0.8FCt)和全复合酶(1500/XY)水解处理后，外源酶量的减少对从转基因植物EGA/XynA.2242.09.16(表达内切葡聚糖酶CBHA.2069.1.3)和转基因对照TGC.4000.11产出的葡萄糖(图21A)和木糖(图21B)的影响。在液固比为7，75℃条件下，用0.25M亚硫酸氢铵和碳酸铵(pH8.56)进行预处理20小时。通过使用大约2％的固含量，在pH为5，50℃的条件下，进行酶水解3天。出乎意料的是，数据表明，对于两种表达酶的转基因植物，60％FCt的水解可以达到80％的葡萄糖理论产量和大约60％的木糖理论产量，而对于阴性对照TGC.4000.11仅分别是60％和49％。

这些结果说明了减少外源酶用量的可能性，并且同时通过利用表达CWD酶的转基因植物实现了植物秸秆的有效水解。

为了评估从表达CWD酶的转基因植物中生产出来的水解产物的发酵性能，使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)D5A进行了同步糖化和发酵(SSF)实验。图22显示了在生物质固含量为6％的条件下，对转基因植物EGA.2049.10(表达内切葡聚糖酶A)和EGA/XynA.2242.09(表达内切葡聚糖酶A和木聚糖酶A)以及对照植物AxB和TGC.4000.11进行的SSF过程中产出的乙醇的产量。这些数据显示通过使用表达CWD酶的转基因植物获得了高出对照植物大约77.8％的纤维素转化率。另外，对生物质进行温和地预处理，表达酶的植物EGA.2049.10和EGA/XynA.2242.09的SSF所产的乙醇浓度为8.9g/l，或65％的乙醇产量，相比之下对照植物乙醇浓度为4.5g/l，或乙醇产量为42％，这相当于乙醇产量有55％的提高。

如图18-21中所示，提高的水解可以被解释为，具有减少外源酶用量而仍然保持相似的水解作用的潜力。植物中CWD酶的表达说明了有机会从表达CWD酶的作物或生物质中生产低价糖以生产生物燃料，生化药剂和生化材料。快速的初始水解的好处是提供了在较短的操作时间内达到相似或更好的水解的可能性，同步糖化和发酵过程(图22)的优势，以及减少需要的设备容量和操作成本的机会。

植物细胞壁降解酶的生产是一种与通过对转基因植物的直接水解从生物质中生产可发酵糖相关的降低成本的方法。

实施例7-热化学效果：温和预处理的生物质溶解性

图23说明了经过去离子水(DI)、0.06M或0.25M稀硫酸(DSA)；或0.25M亚硫酸氢铵和0.23M碳酸铵(BSC；pH 8.1)预处理后，基于表达外切葡聚糖酶CBHA(CBHA.2069.3.17)的转基因植物和野生型对照植物(AxB)的重量损失的温和预处理的生物质的溶解性。在75℃，液固比为8的条件下进行预处理16小时。此图强调了烘干的玉米秸秆样品重量减轻的数据，这些玉米秸秆来源于转基因植物和野生型对照植物。对预处理的生物质进行清洗和离心分离过程后进行测量。与DI预处理相比，0.25M BSC(pH8.1)的预处理引起了转基因植物(CBHA.2069.3.17)超过17.5％的生物质损失，非转基因对照植物(AxB)超过12.2％的生物质损失。表达外切葡聚糖酶(CBHA.2069.3.17)的转基因植物与非转基因对照植物相比，显示出在所有预处理下更多的生物质损失。

实施例8-热化学效果：温和预处理下生物质损失和木质素的去除

使用去离子水(DI)以及0.17M亚硫酸氢铵和0.165M碳酸铵(BSC)，在pH为8.1、液固比为8、75℃条件下预处理16小时后，通过从转基因对照植物TGC.2209获得的烘干的秸秆样品，测定生物质损失和木质素的去除。对预处理的生物质进行清洗和离心分离过程后进行测量。表3说明了使用0.17M BSC(pH 8.1)的预处理与用去离子水的预处理相比，会导致更多的生物量损失和更多的木质素去除。

表3：预处理的生物质中预处理后的生物质损失和酸不溶性木质素

实施例9-热化学效果：温和预处理中的脱乙酰作用

图24A-24B说明了温度和时间对植物生物质的脱乙酰作用的影响，这通过对从表达外切纤维素酶A的转基因植物(CBHA.2063.3.17)和非转基因对照植物(AxB)中获得的烘干的玉米秸秆进行评估。预处理包括去离子水(DI)，0.06M稀硫酸(DSA)，0.25M DSA，或0.25M亚硫酸氢铵与0.23M碳酸铵(BSC)；在pH 8.1，液固比为8，75℃和95℃下处理16小时，或85℃处理7小时。通过对滤液样品进行高效液相色谱分析确定醋酸(HAc)的浓度，所述滤液样品来自于使用HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories、Hercules，CA)酸柱的预处理的生物质，酸柱的操作条件为：0.6ml/min、60℃、0.004M硫酸作为流动相。使用0.25M BSC(pH 8.1)的预处理与使用去离子水和0.06MDSA的预处理相比导致显著的脱乙酰作用。

实施例10-热化学效果：温和预处理下很少或没有糖降解(糠醛和羟甲基糠醛(HMF))

图25A-25B说明了用去离子水(DI)、0.06M稀硫酸(DSA)、0.25M DSA，或0.25M亚硫酸氢铵和0.23M碳酸铵(BSC；pH值8.1)处理后，来自表达外切葡聚糖酶CBHA的转基因植物(CBHA.2069.3.17)和非转基因对照植物(AxB)的烘干的玉米秸秆样本中的糖降解产物羟甲基糠醛(HMF)和糠醛的产量。预处理的进行在温度为75℃和95℃下处理16小时以及85℃处理7小时。预处理的生物质的滤液中HMF和糠醛的浓度用高效液相色谱分析来测量，使用HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA)酸柱，操作在0.6ml/min、60℃和0.004M硫酸作为流动相的条件下进行。

这些数据显示，与导致样本中糖降解以及HMF和糠醛检出的使用去离子水(DI)、0.06M稀硫酸(DSA)或0.25M DSA的预处理相比，使用0.25M BSC(pH 8.1)进行预处理后，HMF和糠醛很少或没有从表达外切葡聚糖CBHA的转基因植物(CBHA.2069.3.17)或非转基因对照植物(AxB)的样本中发现。

实施例11-植物中酶的自动水解

表达细胞壁降解酶的植物自动水解作用的实施例如图26所示。此图说明了经过预处理的单独表达XynB的玉米植物(XynB.2063.15)和同时表达三种酶：XynA和辅助酶A和B(XynA/AccA/B.2096.01)的植株的结果。所述结果与预处理的非转基因对照植物(AxB)作了比较。使用0.17M的亚硫酸氢铵和0.165M的碳酸铵(pH值8.1)，在液固比(L/S)为10，55℃条件下进行预处理16小时。在50℃的温度、pH 5.0，无外源复合酶(NCt)的条件下，使用2％固含量的植物中产生的酶处理3天完成酶水解。后酸水解在小于1.0的pH，121℃的温度下进行60分钟。表达木聚糖酶的两种转基因植物与对照AxB植物相比，通过自动水解，显示出3–5倍以上的木糖产量。

图27说明了同时表达木聚糖酶B，内切葡聚糖酶和CHBA的玉米植株(XynB/EGA/CBHA.2345.116)和表达木聚糖酶B，内切葡聚糖酶和CBHB的植物(XynB/EGA/CBHB.2349.55)与非转基因对照植物(AxB)相比的自动水解的结果。植物使用0.17M亚硫酸氢铵和0.165M碳酸铵BSC(pH值8.1)，在L/S为10，55℃下进行16小时预处理。在使用植物中表达的酶的预处理和水解之间没有中间洗涤程序。水解在以下条件下完成：2％固含量，无复合酶(NCt)，50℃和pH 5.0，处理3天。与对照植物AxB相比，通过自动水解，表达木聚糖酶和其他纤维素酶的转基因植物显示出显著高的木糖产量。

实施例12-机械去纤维化对未磨碎的秸秆的影响

机械去纤维化对加工的未磨碎秸秆的葡萄糖和木糖产量的影响数据显示在图28A-28B中。这些数据来自预处理的表达内切葡聚糖酶和木聚糖酶A的转基因植物(EGA/XynA.2242.09T1)和对比的转基因对照植物TGC.4000的试验。预处理是采用0.25M亚硫酸氢铵和0.23M的碳酸铵(pH值8.56，在L/S为8，75℃条件下处理16小时后进行机械去纤维化(6％的固含量)完成的。酶水解作用是在50℃的温度，pH 5.0的条件下，通过使用1500/XY(0.2/0.1ml每克秸秆)的4％固含量的植物中产生的酶，处理3天来完成的。整个时间进程中，同时表达内切葡聚糖酶和木聚糖酶的转基因玉米植物与对照植物TGC.4000相比，始终显示较高的葡萄糖和木糖产量，水解3天后，转基因玉米植物分别达到83％和63％的葡萄糖和木糖产量。

在本申请通篇中引用的参考文献均出于本文显而易见的目的而被纳入本文，如同将它们全文纳入本文一样。出于说明的目的，这些参考文献的特定部分被引用到本文特定的位置。在特定位置的参考文献的引用表明将参考文献中教导的方法纳入本文。然而，在特定位置的参考文献的引用，不限制将所有引用的参考文献教导的方法，出于任何目的而纳入本文。

因此应当理解的是，本发明不限于具体公开的实施方式，旨在涵盖如从属权利要求、如上的说明和/或如附图所示所定义的，在本发明的精神和范围内的所有变型。

Claims (29)

1.一种用于在基因工程植物中表达多种蛋白的表达盒，该表达盒包括：

第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列编码第一蛋白并能够在中度严格条件下与由第一参考序列组成的的核酸的互补物杂交，所述第一参考序列选自由SEQ ID NO：32、SEQID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43所组成的组中；以及

第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列编码第二蛋白且能够在中度严格条件下与由第二参考序列组成的核酸的互补物杂交，所述第二参考序列选自由SEQ ID NO：32、SEQID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID：43所组成的组中；

其中，被选定为第一参考序列的SEQ ID NO不同于被选定为第二参考序列的SEQ IDNO，并且所述第一蛋白和第二蛋白均能够水解植物材料的组分。

2.根据权利要求1所述的表达盒，其中，该表达盒还包括第三多核苷酸序列，所述第三多核苷酸序列编码第三蛋白且能够在中度严格条件下与由第三参考序列组成的核酸的互补物杂交，所述第三参考序列选自由SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID：43所组成的组中；

其中，被选定为第三参考序列的SEQ ID NO不同于被选定为第一参考序列的SEQ IDNO，且不同于被选定为第二参考序列的SEQ ID NO，并且所述第三蛋白能够水解植物材料的组分。

3.根据权利要求1或2所述的表达盒，其中，所述第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列还包括至少一种靶向多核苷酸序列以编码靶向肽，所述靶向肽选自由造粉体靶向信号、细胞壁靶向肽、线粒体靶向肽、细胞质定位信号、叶绿体靶向信号、细胞核靶向肽和液泡靶向肽所组成的组中。

4.根据权利要求3所述的表达盒，其中，所述至少一种靶向多核苷酸序列选自由SEQ IDNO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ IDNO：50和SEQ ID NO：51所组成的组中。

5.根据权利要求3所述的表达盒，其中，该表达盒包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列能够在中度严格条件下与由参考序列组成的核酸杂交，所述参考序列选自由SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ IDNO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62组成的序列所组成的组中。

6.根据权利要求1所述的表达盒，其中，所述第一多核苷酸序列选自由SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43所组成的组中；所述第二多核苷酸序列选自由SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43所组成的组中。

7.根据权利要求2所述的表达盒，其中，所述第三多核苷酸序列选自由SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43所组成的组中。

8.根据权利要求5所述的表达盒，其中，所述多核苷酸序列选自由SEQ ID NO：52、SEQID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62组成的序列所组成的组中。

9.根据权利要求1所述的表达盒，其中，所述基因工程植物选自由玉米、甘蔗、甜菜、高粱、柳枝稷、芒草、桉树、柳树和杨树所组成的组中。

10.一种表达载体，该表达载体包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列能够在中度严格条件下与由选自由SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ IDNO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ IDNO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：83所组成的组中的序列组成的核酸的互补物杂交。

11.根据权利要求10所述的表达载体，其中，所述多核苷酸序列选自由SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ IDNO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：83所组成的组中。

12.一种制备基因工程植物的方法，该方法包括：提供权利要求1-8中任意一项所述的表达盒，以及使用整合有所述表达盒的载体转化植物。

13.一种制备基因工程植物的方法，该方法包括：使用权利要求10或11所述的载体转化植物。

14.一种使用权利要求1-8中任意一项所述的表达盒生产可溶性糖的方法，该方法包括：

收获由权利要求12所述的方法制备的基因工程植物；

预处理所述基因工程植物，其中，所述预处理步骤包括：将基因工程植物与制浆制剂混合形成pH值在5.0-9.0的混合物，所述制浆制剂含有亚硫酸氢铵和碳酸铵，并且提供55-95℃的混物物温度；以及

提供给所述混合物水解条件。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，亚硫酸氢铵的浓度为0.02M至0.35M，碳酸铵的浓度为0.025M至0.25M。

16.根据权利要求14所述的方法，其中，所述混合物的液固比选自小于或等于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1的值。

17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述预处理包括将混合物孵育处理，所述孵育处理的时间小于或等于16小时、15小时、14小时、13小时、12小时、11小时、10小时、9小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时或1小时。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，该方法还包括通过机械研磨对混合物进行精炼。

19.根据权利要求14所述的方法，其中，所述水解条件包括2％至25％的固体。

20.根据权利要求14所述的方法，其中，所述水解条件包括孵育混合物长达144小时。

21.根据权利要求14所述的方法，其中，该方法还包括将混合物与发酵生物相接触以生产生化产品。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述发酵生物为酵母，所述酵母选自由酵母属(Saccharomyces)，克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)，毕赤酵母属(Pichia)，耶氏酵母属(Yarrowia)，刀孢酵母属(Spathaspora)和发酵酵母属(Scheffersomyces)所组成的组中。

23.根据权利要求14所述的方法，其中，该方法还包括加入一种或多种外源酶。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述一种或多种外源酶包括内切葡聚糖酶、外切纤维素酶、糖苷酶和木聚糖酶。

25.根据权利要求23所述的方法，其中，所述一种或多种外源酶还包括β-木糖苷酶。

26.根据权利要求23所述的方法，其中，所述一种或多种外源酶包括从里氏木霉(Trichoderma reesei)中分离的纤维素酶。

27.根据权利要求14所述的方法，其中，该方法还包括在所述混合物中加入其它植物材料。

28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述其它植物材料选自由植物生物质、不是基因工程植物材料的纤维素或木质纤维材料以及来自生物炼制产物、林业和农业废物、玉米秸秆、甘蔗渣、小麦秸秆、废木材、森林修剪物、废纸、城市固体废物、能源作物、柳枝稷、高粱、甜菜、甘蔗、芒草和杨树的植物材料所述组成的组中。

29.一种生产可溶性糖的方法，该方法包括：

收获由权利要求12所述的方法制备的基因工程植物；

预处理所述基因工程植物，其中，所述预处理步骤包括：将基因工程植物与制浆制剂混合形成pH值在5.0-9.0的混合物，所述制浆制剂含有亚硫酸氢铵和碳酸铵，并且提供55-95℃的混物物温度；以及

提供给所述混合物水解条件。