ES2589595T3 - Xilanasa fúngica - Google Patents

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Peter J. Punt
Jan Cornelis Verdoes
Arkady Panteleimonovich Sinitsyn
Elena Vlasenko
Sandra Wihelmina Agnes Hinz
Mark Gosink
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Abstract

Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo consistente en: a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína consistente en la SEC ID de secuencia de aminoácidos Nº:32; b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos con actividad de xilanasa que es al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de longitud total de (a); c) una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo consistente en: SEC ID Nº:31, y SEC ID Nº:33; d) una secuencia de ácidos nucleicos que es completamente complementaria a las secuencias de ácidos nucleicos de (a); (b) o (c).

Description

DESCRIPCIÓN
Xilanasa fúngica
Campo de la invención 5
[0001] Esta invención se refiere a enzimas nuevas y métodos nuevos para producirlas.
Más específicamente esta invención se refiere a enzimas producidas por hongos.
La invención también se refiere a un método para convertir biomasa lignocelulósica en azúcares fermentables con enzimas que degradan el material lignocelulósico y combinaciones nuevas de enzimas, incluyendo aquellas que 10 proporcionan una liberación sinergística de azúcares de biomasa vegetal.
La invención también se refiere a métodos para usar las enzimas nuevas y composiciones de tales enzimas en una variedad de otros procesos, incluyendo lavado de la ropa, procesos detergentes, desentintado y bioblanqueo de papel y pulpa, y tratamiento de corrientes de residuos.
15
Antecedentes de la invención
[0002] Las cantidades grandes de carbohidratos en la biomasa vegetal proporcionan una fuente abundante de energía potencial en forma de azúcares (tanto azúcares de cinco carbonos como de seis carbonos) que se pueden utilizar para numerosos procesos industriales y agrícolas. 20
Sin embargo, el potencial de energía enorme de estos carbohidratos está actualmente subutilizado debido a que los azúcares se bloquean en polímeros complejos, y por lo tanto no son fácilmente accesibles para la fermentación.
Frecuentemente se denomina a estos polímeros complejos para colectivamente como lignocelulosa.
Los azúcares generados de degradación de biomasa vegetal potencialmente representan materias primas abundantes económicamente competitivas para la fermentación en productos químicos, plásticos, y combustibles, 25 incluyendo etanol como un sustituto para petróleo.
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[0003] Por ejemplo, los granos secos destiladores (DDG) son subproductos lignocelulósicos del proceso de molienda en seco de maíz.
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Los granos de maíz entero molido se tratan con amilasas para licuar el almidón en los granos e hidrolizarlos a 30 glucosa.
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La glucosa producida así es luego fermentada en un segundo paso en etanol.
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Los sólidos residuales después de la fermentación de etanol y destilación se centrifugan y secan, y el producto resultante es DDG, que se usa como una materia prima de pienso para animales.
Aunque la composición de DDG puede variar, una composición típica de DDG es: 32% hemicelulosa, 22% celulosa, 35 30% proteína, 10% lípidos, 4% almidón residual, y 4% inorgánicos.
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En teoría, las fracciones de celulosa y hemicelulosa, que comprenden aproximadamente 54% del peso del DDG, pueden ser eficazmente hidrolizadas en azúcares fermentables por enzimas; sin embargo, se ha descubiertos que los carbohidratos que comprenden materiales lignocelulósicos en DDG son más difíciles de asimilar.
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Hasta la fecha, la eficiencia de hidrólisis de estos polímeros (hemi) celulósicos por enzimas es muy inferior a la 40 eficiencia hidrolítica de almidón, debido a la naturaleza más compleja y recalcitrante de estos sustratos.
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Por consiguiente, el coste de la producción de las enzimas requeridas es superior al coste de producción de amilasas para hidrólisis de almidón.
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[0004] Polisacáridos mayores que comprenden materiales lignocelulósicos incluyen celulosa y hemicelulosas. 45
La hidrólisis enzimática de estos polisacáridos en azúcares solubles (y finalmente en monómeros tales como glucosa, xilosa y otras hexosas y pentosas) se cataliza por diferentes enzimas que actúan de concierto.
Por ejemplo, endo-1,4-β-glucanasas (EGs) y exo-celobiohidrolasas (CBHs) catalizan la hidrólisis de celulosa insoluble a cellooligosacáridos (con celobiosa del producto principal), mientras β-glucosidasas (BGLs) convierten los oligosacáridos en glucosa. 50
De forma similar, xilanasas, junto con otras enzimas tales como α-L-arabinofuranosidasas, feruloilo y acetilxilano esterasas y β-xilosidasas, catalizan la hidrólisis de hemicelulosas.
[0005] Independientemente del tipo de materia prima celulósica, el coste y la eficiencia hidrolítica de las enzimas son factores principales que limitan el uso difundido de procesos de bioconversión de biomasa. 55
La eficiencia hidrolítica de un complejo de multienzima en el proceso de sacarificación lignocelulósica depende tanto de las propiedades de las enzimas individuales como de la proporción de cada enzima en el complejo.
[0006] Las enzimas útiles para la hidrólisis de polisacáridos complejos son también altamente útiles en una variedad de aplicaciones textiles industriales, al igual que aplicaciones de papel industrial y pulpa, y en el tratamiento de 60 corrientes de residuos.
Por ejemplo, como una alternativa al uso de pómez en el proceso de lavado de piedra, métodos para tratar tejidos que contienen celulosa para la ropa con enzimas hidrolíticas, tales como celulasas, se conocen por mejorar la suavidad o el tacto de tales tejidos.
Las celulasas son también usadas en composiciones detergentes, bien para aumentar la capacidad de limpieza de 65 la composición o como un agente suavizante.
Las celulasas son también usadas en combinación con agentes poliméricos en procesos para suministrar una variación localizada en la densidad de color de las fibras.
Tales enzimas también pueden usarse para la sacarificación de biomasa lignocelulósica en corrientes de residuos, tales como residuos sólidos municipales, para el bioblanqueo de pulpa de madera, y para el desentintado de papel de impresión reciclado. 5
Como con la hidrólisis anteriormente descrita de estos polisacáridos en materiales lignocelulósicos para su uso como materias primas, el coste y eficiencia hidrolítica de las enzimas son factores mayores que controlan el uso de enzimas en estos procesos.
[0007] Los hongos filamentosos son una fuente de celulasas y hemicelulasas, al igual que otras enzimas útiles en la 10 hidrólisis enzimática de polisacáridos mayores.
En particular, cepas de Trichoderma sp., tales como T. viride, T. reesei y T. longibrachiatum, y Penicillium sp., y enzimas derivadas de estas cepas, han sido previamente usadas para hidrolizar celulosa cristalina.
Sin embargo, los costes asociados a enzimas de producción de estos hongos, al igual que la presencia de enzimas adicionales indeseables, permanece un inconveniente. 15
Es por lo tanto deseable producir enzimas económicas y mezclas enzimáticas que eficazmente degradan celulosa y hemicelulosa para su uso en una variedad de aplicaciones agrícolas e industriales.
[0008] GUSAKOV ALEXANDER V ET AL: ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY, vol 36, No. 1, 6 January 2005, pages 57-69, divulga la purificación y clonación de dos celobiohidrolasas termoestables de una tensión del 20 hongo Chrysosporium lucknowense. Dicho hongo se proporciona para ser un productor industrial de celulasas y hermicelulasas.
[0009] GUSAKOV ALEXANDER V ET AL: BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 97, No. 5, 1 August 2007, pages 1028-1038 divulga varias enzimas de C. lucknowense, incluyendo celobiohidrolasa, endoglucanasas y 25 xilanasa II.
[0010] WO 98/15633 A1 divulga enzimas y genes de F. luckowense y menciona la presencia de xilanasas en dicho hongo.
30
[0011] WO 01/79507 A2 divulga la secuencia de ADN del C. luceknowense xilanasa Xyll gen y la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada Xyll.
Resumen de la invención
35
[0012] La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo consistente en:
a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína consistente en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en: SEC ID Nº:32;
b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos con actividad de xilanasa 40 que es al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de longitud total de (a);
c) una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo consistente en: SEC ID Nº:31, y SEC ID Nº:33;
d) una secuencia de ácidos nucleicos que es completamente complementaria a las secuencias de ácidos nucleicos de (a), (b) o (c) 45
[0013] Tal molécula de ácido nucleico aislada se define en reivindicación independiente 1 anexa aquí.
Formas de realización de la invención se definen en reivindicaciones anexas que son dependientes en la reivindicación 1 y a la que ahora debe hacerse referencia.
50
[0014] En algunas formas de realización, la secuencia de ácidos nucleicos de (b) codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos 95%, al menos 97%, o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de (a) y tiene una actividad biológica de la proteína comprendiendo la secuencia de aminoácidos.
[0015] La invención también proporciona una proteína tal y como se define en la reivindicación 2 anexa aquí. 55
[0016] La invención también proporciona una composición para la degradación de un material lignocelulósico que comprende al menos la proteína aislada de la presente invención.
[0017] La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante que incluye una molécula de 60 ácido nucleico aislada de la presente invención, operativamente enlazada al menos a una secuencia de control de expresión.
[0018] En algunas formas de realización, la molécula de ácido nucleico recombinante comprende un vector de expresión. 65
En algunas formas de realización, la molécula de ácido nucleico recombinante comprende un vector dirigido.
[0019] La invención también proporciona una célula huésped aislada modificada con una molécula de ácido nucleico de la presente invención.
[0020] En algunas formas de realización, la célula huésped es un hongo. 5
En algunas formas de realización, la célula huésped es un hongo filamentoso.
En algunas formas de realización, el hongo filamentoso es de un género seleccionado del grupo consistente en: Chrysosporium, Thielavia, Neurospora, Aureobasidium, Filibasidium, Piromices, Corynascus, Cryplococus, Acremonium, Tolyoc/adium, Scytalidium, Schizofilum, Sporotrichum, Penicillium, Gibberella, Myceliophthora, Mucor, Aspergillus, Fusarium, Humicola, y Trichoderma, y anamorfos y teleomorfos de los mismos. 10
En algunas formas de realización, la célula huésped es una bacteria.
[0021] La invención también proporciona un método para la producción de una proteína de la presente invención, que comprende cultivo de una célula que ha sido modificada con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína, y expresión de la proteína con la célula modificada. 15
[0022] En algunas formas de realización, el método comprende además la recuperación de la proteína de la célula o de un cultivo que comprende la célula.
[0023] La invención también proporciona un organismo genéticamente modificado que comprende componentes 20 adecuados para la degradación de un material lignocelulósico en azúcares fermentables, donde el organismo ha sido genéticamente modificado para expresar al menos la proteína de la presente invención.
[0024] En algunas formas de realización, el organismo genéticamente modificado es un microorganismo.
En algunas formas de realización, el microorganismo es un hongo filamentoso. 25
[0025] En algunas formas de realización, el hongo filamentoso es de un género seleccionado del grupo consistente en: Chrysosporium, Thielavia, Neurospora, Aureobasidium, Filibasidium, Piromyces, Corynascus, Cryplococcus, Acremonium, Tolyocladium, Scytalidium, Schizophyllum, Sporotrichum, Penicillium, Talaromyces, Gibberella, Myceliophthora, Mucor, Aspergillus, Fusarium, Humicola y Trichoderma. 30
[0026] En algunas formas de realización, el hongo filamentoso es seleccionado del grupo consistente en: Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Aspergillus japonicus, Penicillium canescens, Penicillium solitum, Penicillium funiculosum, y Talaromyces flavus.
35
[0027] En algunas formas de realización, el organismo ha sido genéticamente modificado para expresar al menos una enzima adicional.
[0028] En algunas formas de realización, la enzima adicional es una enzima accesoria seleccionada del grupo consistente en: celulasa, xilanasa, ligninasa, glucuronidasa, arabinofuranosidasa, arabinogalactanasa, esterasa de 40 ácido ferúlico, lipasa, pectinasa, glucomanasa, amilasa, laminarinasa, xiloglucanasa, galactanasa, glucoamilasa, pectato liasa, quitinasa, exo-β-D-glucosaminidasa, deshidrogenasa de celobiosa, y acetilxilano esterasa.
[0029] En algunas formas de realización, el organismo genéticamente modificado es una planta.
45
[0030] La invención también proporciona una composición de multienzima que comprende al menos la proteína de la presente invención y al menos una proteína adicional para la degradación de un material lignocelulósico o un fragmento del mismo que tiene actividad biológica.
[0031] En algunas formas de realización, al menos una proteína adicional para la degradación de un material 50 lignocelulósico en azúcares fermentables es seleccionada del grupo consistente en: SEC ID Nº:8, SEC ID n.º: 14, SEC ID Nº:17, SEC ID Nº:20, SEC ID Nº:26 y SEC ID Nº:47, o un fragmento del mismo que tiene actividad biológica.
[0032] En algunas formas de realización, la composición de multienzima comprende al menos una celobiohidrolasa, al menos una xilanasa, al menos una endoglucanasa, al menos una β-glucosidasa, al menos una β-xilosidasa, y al 55 menos una enzima accesoria.
[0033] En algunas formas de realización, entre aproximadamente 50% y aproximadamente 70% de las enzimas de la composición son celobiohidrolasas.
60
[0034] En algunas formas de realización, entre aproximadamente 10% y aproximadamente 30% de las enzimas de la composición son xilanasas.
[0035] En algunas formas de realización, entre aproximadamente 5% y aproximadamente 15% de las enzimas de la composición son endoglucanasas. 65
[0036] En algunas formas de realización, entre aproximadamente 1% y aproximadamente 5% de las enzimas de la composición son β-glucosidasas.
[0037] En algunas formas de realización, entre aproximadamente 1% y aproximadamente 3% de las enzimas de la composición son β-xilosidasas. 5
[0038] En algunas formas de realización, la composición comprende aproximadamente 60% celobiohidrolasas, aproximadamente 20% xilanasas, aproximadamente 10% endoglucanasas, aproximadamente 3% β-glucosidasas, aproximadamente 2% β-xilosidasas, y aproximadamente 5% enzimas accesorias.
10
[0039] En algunas formas de realización, las xilanasas son seleccionadas del grupo consistente en: endoxilanasas, exoxilanasas, y β-xilosidasas.
[0040] En algunas formas de realización, las enzimas accesorias incluyen una enzima seleccionada del grupo consistente en: ligninasa, glucuronidasa, arabinofuranosidasa, arabinogalactanasa, esterasa de ácido furílico, lipasa, 15 pectinasa, glucomanasa, amilasa, laminarinasa, xiloglucanasa, galactanasa, glucoamilasa, pectato liasa, quitinasa, exo-β-D-glucosaminidasa, deshidrogenasa de celobiosa, y acetilxilano esterasa.
[0041] En algunas formas de realización, la composición comprende al menos una proteína comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº:11, donde la proteína tiene actividad de celobiohidrolasa, al menos una 20 proteína que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en: SEC ID Nº:94 y SEC ID Nº:23, donde la proteína tiene actividad de endoglucanasa, al menos una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en: SEC ID Nº:29, SEC ID Nº:32, SEC ID Nº:35, SEC ID Nº:38 y SEC ID Nº:41, donde la proteína tiene actividad de xilanasa, al menos una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº:44, donde la proteína tiene actividad de β-glucosidasa, y al menos una proteína que 25 incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en: SEC ID Nº:50, SEC ID Nº:53, SEC ID Nº:62, SEC ID Nº:65, SEC ID Nº:68, SEC ID Nº:71, SEC ID Nº:74, SEC ID Nº:77, SEC ID Nº:80, SEC ID Nº:83, SEC ID Nº:86, SEC ID Nº:89, y SEC ID Nº:92, donde la proteína tiene actividad de hemicelulasa.
[0042] En algunas formas de realización, la composición comprende al menos una primera proteína que incluye una 30 secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en: SEC ID Nº:2, SEC ID Nº:5, SEC ID Nº:8 y SEC ID Nº:11 y tiene actividad de celobiohidrolasa, o un fragmento de la misma que tiene actividad de celobiohidrolasa; al menos una segunda proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en: SEC ID Nº:14, SEC ID Nº:94, SEC ID n.º: 17, SEC ID Nº:20 y SEC ID Nº:23 y tiene actividad de 35 endoglucanasa, o un fragmento de la misma que tiene actividad de endoglucanasa; y al menos una tercera proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en: SEC ID Nº:26, SEC ID Nº:29, SEC ID Nº:32, SEC ID Nº:35, SEC ID Nº:38 y SEC ID Nº:41 y tiene actividad de xilanasa, o un fragmento de la misma que tiene actividad de xilanasa.
40
[0043] En algunas formas de realización, la composición comprende además una cuarta proteína que incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a SEC ID Nº:44 y tiene actividad de β-glucosidasa, o un fragmento de la misma que tiene actividad de β-glucosidasa.
[0044] En algunas formas de realización, la composición comprende además al menos una quinta proteína que 45 incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en: SEC ID Nº:47, SEC ID Nº:50, SEC ID Nº:53, SEC ID Nº:56, SEC ID Nº:59, SEC ID Nº:62, SEC ID Nº:65, SEC ID Nº:68, SEC ID Nº:71, SEC ID Nº:74, SEC ID Nº:77, SEC ID Nº:80, SEC ID Nº:83, SEC ID Nº:86, SEC ID Nº:89, y SEC ID Nº:92, y tiene actividad de hemicelulasa o de quitinasa, o un fragmento de la misma que tiene actividad de hemicelulasa o quitinasa 50
[0045] La invención también proporciona un método para la degradación de un material lignocelulósico en azúcares fermentables, que comprende poner en contacto el material lignocelulósico con al menos la proteína aislada de la presente invención.
55
[0046] En algunas formas de realización, la proteína aislada es parte de una composición de multienzima.
[0047] La invención también proporciona un método para la degradación de un material lignocelulósico en azúcares fermentables, que comprende poner en contacto el material lignocelulósico con al menos una composición de multienzima de la presente invención. 60
[0048] La invención también proporciona un método para la producción de una sustancia orgánica, que comprende:
a) sacarificación de un material lignocelulósico con una composición de multienzima de la presente invención;
b) fermentación del material lignocelulósico sacarificado obtenido con uno o varios microorganismos 65 fermentadores; y
c) recuperación de la sustancia orgánica de la fermentación.
[0049] En algunas formas de realización, los pasos de la sacarificación y fermentación son realizadas simultáneamente.
5
[0050] En algunas formas de realización, la sustancia orgánica es un alcohol, ácido orgánico, cetona, aminoácido, o gas.
[0051] En algunas formas de realización, la sustancia orgánica es un alcohol.
En algunas formas de realización, el alcohol es etanol. 10
[0052] En algunas formas de realización, el material lignocelulósico es seleccionado del grupo consistente en material herbáceo, residuo agrícola, residuo de silvicultura, residuos sólidos municipales, papel de desecho, y pulpa y residuo de fábrica de papel.
15
[0053] En algunas formas de realización, el material lignocelulósico es granos secos del destilador o granos secos del destilador con solubles.
[0054] En algunas formas de realización, los granos secos del destilador o granos secos del destilador con solubles son derivados de maíz. 20
[0055] La invención también proporciona un método para la degradación de un material lignocelulósico consistente en granos secos del destilador o granos secos del destilador con solubles en azúcares, el método comprendiendo poner en contacto los granos secos del destilador o granos secos del destilador con solubles con una composición de multienzima, donde al menos 10% de los azúcares fermentables son liberados, donde la composición de 25 multienzima es la composición de multienzima de la presente invención.
[0056] En algunas formas de realización, al menos 15% de los azúcares son liberados.
En algunas formas de realización, al menos 20% de los azúcares son liberados.
En algunas formas de realización, al menos 23% de los azúcares son liberados. 30
[0057] En algunas formas de realización, los granos secos del destilador o granos secos del destilador con solubles son derivados de maíz.
[0058] En algunas formas de realización, el método comprende además un proceso de pretratamiento para la 35 pretratación del material lignocelulósico.
[0059] En algunas formas de realización, el proceso de pretratamiento es seleccionado del grupo consistente en tratamiento físico, ión metálico, luz ultravioleta, ozono, tratamiento organosolv, tratamiento de explosión de vapor, impregnación de cal con tratamiento de explosión de vapor, tratamiento de peróxido de hidrógeno, tratamiento de 40 peróxido/ozono de hidrógeno (peroxono), tratamiento ácido, tratamiento de ácido diluído, y tratamiento de base.
[0060] En algunas formas de realización, el proceso de pretratamiento es seleccionado del grupo consistente en organosolv, explosión de vapor, tratamiento térmico y AFEX.
45
[0061] En algunas formas de realización, el tratamiento térmico comprende calentamiento del material lignocelulósico a 121°C durante 15 minutos.
[0062] En algunas formas de realización, el método comprende además detoxificación del material lignocelulósico.
50
[0063] En algunas formas de realización, el método comprende además recuperación del azúcar fermentable.
[0064] En algunas formas de realización, el azúcar es seleccionado del grupo consistente en glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, manosa, ramnosa, sacarosa y fructosa.
55
[0065] En algunas formas de realización, el método comprende además la recuperación del material lignocelulósico puesto en contacto después de que los azúcares fermentables sean degradados.
[0066] La invención también proporciona un método para el lavado a la piedra de un tejido, que comprende por en contacto el tejido con al menos la proteína aislada de la presente invención. 60
[0067] La invención también proporciona un método para el lavado a la piedra de un tejido, que comprende poner en contacto el tejido con al menos una composición de multienzima de la presente invención.
[0068] En algunas formas de realización, el tejido es tela vaquera. 65
[0069] La invención también proporciona un método para el aumento de la suavidad o tacto de un tejido o defrisado de un tejido, que comprende poner en contacto el tejido con al menos la proteína aislada de la presente invención.
La invención también proporciona un método para mejorar la suavidad o tacto de un tejido o defrisado de un tejido, que comprende poner en contacto el tejido con al menos una composición de multienzima de la presente invención.
5
[0070] La invención también proporciona un método para restaurar el color o brillo un tejido, que comprende poner en contacto el tejido con al menos la proteína aislada de la presente invención.
[0071] La invención también proporciona un método para restaurar el color o brillo un tejido, que comprende poner en contacto el tejido con al menos una composición de multienzima de la presente invención. 10
[0072] La invención también proporciona un método de biopulido, desfibrilación, blanqueo, tintura o desencolado de un tejido, que comprende poner en contacto el tejido con al menos la proteína aislada de la presente invención.
[0073] La invención también proporciona un método de biopulido, desfibrilación, blanqueo, tintura o desencolado de 15 un tejido, que comprende poner en contacto el tejido con al menos una composición de multienzima de la presente invención.
[0074] La invención también proporciona un método del desentintado o bioblanqueo de papel o pulpa, que comprende poner en contacto el papel o pulpa con al menos la proteína aislada de la presente invención. 20
[0075] La invención también proporciona un método del desentintado o bioblanqueo de papel o pulpa, que comprende poner en contacto el papel o pulpa con al menos una composición de multienzima de la presente invención.
25
[0076] La invención también proporciona una composición de detergente, que comprende al menos la proteína aislada de la presente invención y al menos un tensioactivo.
[0077] La invención también proporciona una composición de detergente, que comprende al menos una composición de multienzima de la presente invención y al menos un tensioactivo. 30
Breve descripción de las figuras
[0078]
La Figura 1 muestra la actividad específica de celobiohidrolasas y endoglucanasas hacia los sustratos 35 indicados.
Actividades específicas (unidades/mg) fueron determinadas a pH 5.0 y 50°C.
La Figura 2 ilustra la actividad enzimática (porcentaje de máximo) de celobiohidrolasas a niveles de pH variables.
Las actividades fueron determinadas usando un sustrato Avicel a 40°C. 40
La Figura 3 ilustra la actividad enzimática (porcentaje de máximo) de celobiohidrolasas a niveles de temperatura variables.
Las actividades fueron determinadas usando un sustrato Avicel a pH de 5.0.
La Figura 4 ilustra la actividad enzimática (porcentaje de máximo) de endoglucanasas a niveles de pH variables. 45
Las actividades fueron determinadas usando un sustrato CMC a 50°C.
La Figura 5 ilustra la actividad enzimática (porcentaje de máximo) de endoglucanasas a niveles de temperatura variables.
Las actividades fueron determinadas usando un sustrato CMC a pH 5.0.
La Figura 6 muestra la actividad específica de la xilanasa de la presente invención y xilanasas de la 50 divulgación hacia los sustratos indicados.
Actividades específicas (unidades/mg) fueron determinadas a pH 5.0 y 50°C.
La Figura 7 ilustra la actividad enzimática (porcentaje de máximo) de la xilanasa de la presente invención y xilanasas de la divulgación a niveles de pH variables.
Las actividades fueron determinadas usando un sustrato de xilano soluble a 40°C. 55
La Figura 8 ilustra la actividad enzimática (porcentaje de máximo) de la xilanasa de la presente invención y xilanasas de la divulgación a niveles de temperatura variables.
Las actividades fueron determinadas usando un sustrato de xilano soluble a pH 5.0.
La Figura 9 ilustra la actividad enzimática (porcentaje de máximo) de enzimas a niveles de pH variables.
La Figura 10 ilustra la actividad enzimática (porcentaje de máximo) de enzimas a niveles de temperatura 60 variables.
La Figura 11 muestra un gráfico de calibración estándar para el ensayo de Somogyi-Nelson usado para la medición de azúcares reductores en hidrolizados enzimáticos.
La Figura 12 muestra un gráfico de calibración estándar con estándares de glucosa de 0.025 g/l a 0.5 g/l para un ensayo de glucosooxidasa-peroxidasa usado para decidir niveles de glucosa. 65
La Figura 13 muestra la actividad relativa a lo largo del tiempo de xilanasa a diluciones de 20-, 10- y 5 vecesen un ensayo de cambio brusco de temperatura.
La Figura 14 muestra la estabilidad de granulación de la xilanasa de la presente invención y xilanasas de la divulgación.
Se muestra el porcentaje de actividad después de 20 segundos a 80°C con respecto a una muestra no 5 calentada.
La Figura 15 muestra la viscosidad relativa de mezclas agua/centeno tratadas con la enzima(s) indicada.
Para comparar la eficiencia de las preparaciones, las actividades de xilanasa de las muestras (unidades por matraz) son también indicadas.
La Figura 16 muestra un gráfico de la viscosidad residual (%) de la mezcla agua/centeno) después del 10 tratamiento enzimático.
La Figura 17 muestra un gráfico de la viscosidad residual (%) de extracto de agua de harina de centeno después de una incubación de 1-hora con 1 unidad de la xilanasa indicada (en la prueba de pienso in vitro).
La Figura 18 muestra la capacidad de bioblanqueo (A235) de la xilanasa de la presente invención y las xilanasas de la divulgación de pulpa de madera blanda a pH 7.5 y 50°C durante 2 horas. 15
Para cada xilanasa, el ensayo fue realizado utilizando 0.01, 0.003, 0.001, 0.0003 mg/ml de enzima en la mezcla reactiva, como indicado.
La Figura 19 muestra la capacidad de bioblanqueo (A235) de la xilanasa de la presente invención y xilanasas de la divulgación en pulpa de madera dura a pH 7.5 y 50°C durante 2 horas.
Para cada xilanasa, el ensayo fue relizado utilizando 0.01, 0.003, 0.001, 0.0003 mg/ml de enzima en la 20 mezcla reactiva, como indicado.
La Figura 20 ilustra la capacidad de biodescrudado de celobiohidrolasas y endoglucanasas de la presente invención.
Se muestra el recíproco del tiempo (1/tiempo; sec-1) de adsorción de caída de agua en un textil después del tratamiento a pH 5.0 con 0.6 mg/l de enzima seguida de calentamiento. 25
El tiempo de adsorción de caída de agua para la muestra de control no tratada es 2400 seg (1/tiempo = 0.0004).
La Figura 21 ilustra una comparación del contenido de pectina en una muestra sin lavar, una muestra inspeccionada alcalina, y muestras bioinspeccionadas.
La Figura 22 muestra un diagrama de células para el tratamiento de tensión enzimática y mecánica del 30 tejido.
En la figura 22A, los números siguientes representan la estructura indicada: 1: matraz, 2: tubo de plástico, 3: muestra de tela vaquera, 4: anillo de caucho, 5: bolas de posta, y 6: disco de teflón.
En la figura 22B, los números siguientes representan la estructura indicada: 1: tapa con un interior de rosca, 2: anillo de caucho, 3: cuerpo celular (acero inoxidable), 4: recambio cilíndrico, 5: cilindros de acero 35 inoxidable, 6: muestra de tela vaquera circular.
La Figura 23 ilustra la capacidad de biopulido de celobiohidrolasas y endoglucanasas de la presente invención.
Se muestra la liberación de tinte (D 400 nm) después del tratamiento con 0.2g/l enzima a pH 5.0, 50°C.
La Figura 24 muestra un histograma de ejemplo generado por el análisis de intensidad de color de una 40 muestra de tela vaquera.
La Figura 25 ilustra la capacidad de lavado (abrasión) de tela vaquera de celobiohidrolasas y endoglucanasas de la presente invención.
Se muestran las unidades relativas por mg de enzima determinada a 50°C, pH 5.0.
La Figura 26 muestra un gráfico de la capacidad de sacarificación de celobiohidrolasas y endoglucanasas. 45
La cantidad de glucosa (g/1) producida después de la hidrólisis de 5 g/l Avicel a pH 5.0, 40°C durante 120 horas en presencia de 0.1 mg/ml enzima y 0.2 U/ml celobiasa es mostrada.
Descripción detallada de la invención
50
[0079] La presente divulgación se refiere generalmente a proteínas que juegan un papel en la degradación de celulosa y hemicelulosa y ácidos nucleicos que codifican los mismos.
En particular, la presente invención se refiere a una xilanasa aislada de una tensión fúngica filamentosa denominada aquí como C1 (número de acceso VKM F-3500-D), ácidos nucleicos que codifican la enzima, y métodos de la producción y utilizando la enzima. 55
La invención también proporciona composiciones que incluyen por lo menos la xilanasa de la invención descrita aquí para usos incluyendo, pero no limitado a, la hidrólisis de lignocelulosa.
La invención y la divulgación surgen, en parte, del descubrimiento de una variedad de celulasas nuevas y hemicelulasas producida por el hongo C1 que exhibe alta actividad hacia celulosa y otros componentes de biomasa.
60
[0080] La presente invención también proporciona métodos y composiciones para la conversión de biomasa vegetal en azúcares fermentables que se pueden convertir en productos útiles.
Los métodos incluyen métodos para la degradación de material lignocelulósico que usa mezclas enzimáticas para liberar azúcares.
Las composiciones de la invención incluyen combinaciones enzimáticas que descomponen lignocelulosa. 65
Como se utiliza en este caso los términos "biomasa" o "material lignocelulósico" incluyen materiales que contienen celulosa y/o hemicelulosa.
Generalmente, estos materiales también contienen xilano, lignina, proteína, y carbohidratos, como el almidón y azúcar.
La lignocelulosa es generalmente descubierta, por ejemplo, en los tallos, hojas, cascos, cáscaras, y mazorcas de 5 plantas u hojas, derivaciones, y madera de árboles.
El proceso de la conversión de un carbohidrato complejo (como almidón o celulosa) en azúcares fermentables es también denominado en este caso como "sacarificación." Azúcares fermentables, como se utiliza en este caso, se refiere a azúcares simples, tales como glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, manosa, ramnosa, sacarosa y fructosa.
10
[0081] La biomasa puede incluir biomasa virgen y/o biomasa no virgen tal como biomasa agrícola, orgánicos comerciales, construcción y detrito de demolición, residuos sólidos municipales, papel de desecho y residuos de jardín.
Las formas comunes de biomasa incluyen árboles, arbustos y hierbas, trigo, paja de trigo, bagazo de azúcar de caña, maíz, cáscaras de maíz, grano de maíz incluyendo fibra de granos, productos y derivados del fresado de 15 granos tales como maíz, trigo y cebada (incluyendo molienda en húmedo y molienda en seco) al igual que residuos sólidos municipales, papel de desecho y residuos de jardín.
La biomasa puede también ser, pero no se limita a, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos de silvicultura, desperdicios de sólido municipal, papel de desecho, y pulpa y residuos de fábrica de papel. "Biomasa agrícola" incluye derivaciones, casquillos, bastones, maíz y cáscaras de maíz, cultivos energéticos, bosques, frutas, flores, 20 granos, hierbas, plantas de cultivo herbáceas, hojas, corteza, agujas, registros, raíces, plantones, plantas de cultivo leñosas de rotación corta, arbustos, pastos varilla, árboles, verduras, pieles de fruta, vides, pulpa de remolacha azucarera, afrenchillo de trigo, cascos de avena, y bosques duros y blandos (no incluyendo bosques con materiales deletéreos).
Además, la biomasa agrícola incluye materiales de residuos orgánicos generados de procesos agrícolas incluyendo 25 cultivo y actividades de silvicultura, específicamente incluyendo residuos de madera de silvicultura.
La biomasa agrícola puede ser cualquiera de lo anteriormente indicado singularmente o en cualquier combinación o mezcla de lo mismo.
[0082] La biomasa alta en almidón, azúcar, o proteína tal como maíz, granos, frutas y verduras es normalmente 30 consumida como alimento.
Por el contrario, la biomasa alta en celulosa, hemicelulosa y lignina no es fácilmente digerible y es principalmente utilizada para productos de madera y papel, pienso para animales, combustible, o es típicamente dispuesta.
Generalmente, el sustrato es de alto contenido de lignocelulosa, incluyendo rastrojos de maíz de granos secos destiladores, mazorcas de maíz, paja de arroz, heno, bagazo de caña de azúcar, y otra biomasa agrícola, pasto 35 varilla, desperdicios de silvicultura, astillas de madera de álamo, astillas de madera de pino, serrín, residuos de jardín, y similares, incluyendo cualquier combinación de sustrato.
[0083] En una forma de realización, el material lignocelulósico es granos secados de destilador (DDG).
DDG (también conocido como grano de destilador seco, o bagazo de destilador) es granos secos consumidos 40 recuperados después de la fermentación alcohólica.
El material lignocelulósico puede también ser grano del destilador secado con material soluble reciclado de vuelta (DDGS).
Mientras se hará referencia aquí a DDG por conveniencia y simplicidad, se debe entender que tanto DDG como DDGS se contemplan como materiales lignocelulósicos deseados. 45
Estos son en gran medida considerados desperdicio y se pueden obtener después de la fermentación del almidón derivado de cualquier número de granos, incluyendo maíz, trigo, cebada, avena, arroz y centeno.
En una forma de realización, el DDG es derivada de maíz.
[0084] Debe observarse que los granos del destilador no deben ser necesariamente secados. 50
Aunque los granos normalmente, actualmente secos, agua y enzimas se agregan al sustrato DDG en la presente invención.
Si la sacarificación fuera hecha en el sitio, la etapa de secado podría ser eliminada y las enzimas podrían ser añadidas a los granos del destilador sin secado.
55
[0085] Debido en parte a los muchos componentes que comprenden biomasa y materiales lignocelulósicos, enzimas o una mezcla de enzimas capaz de degradar xilano, lignina, proteína, y carbohidratos se necesitan para conseguir sacarificación.
La presente invención y divulgación incluye enzimas o composiciones de la misma con, por ejemplo, celobiohidrolasa, endoglucanasa, xilanasa, β-glucosidasa, hemicelulasa y actividades de quitinasa. 60
[0086] Las enzimas de la presente invención y divulgación también pueden ser para tejidos celulósicos de lavado de piedra tales como algodón (por ejemplo; tela vaquera), lino, cáñamo, ramio, cuproso liocel, newcell, rayón y similares.
Ver, por ejemplo, patente US nº 6,015,707. 65
Las enzimas y composiciones de la presente invención y divulgación se adecuan para aplicaciones textiles industriales además del proceso de lavado de piedra.
Por ejemplo, las celulasas se usan en composiciones detergentes, bien para aumentar la capacidad de limpieza de la composición o como un agente suavizante.
Cuando usada así, la celulasa degradará una porción del material celulósico, por ejemplo, un tejido de algodón, en el 5 lavado, lo que facilita la limpieza y/o reblandecimiento del tejido.
Los componentes de endoglucanasa de celulasas fúngicas también han sido usada para los fines del aumento de la capacidad de limpieza de composiciones detergentes, para su uso como un agente suavizante, y para su uso en la mejora de la sensación de los tejidos algodoneros y similares.
Enzimas y composiciones de la presente invención y divulgación también pueden usarse en el tratamiento de pasta 10 de papel (por ejemplo, para mejorar el drenaje o para el destintado de papel reciclado) o para el tratamiento de corrientes de aguas residuales (por ejemplo, para hidrolizar material de residuos que contiene celulosa, hemicelulosa y pectinas a polímeros de peso molecular inferior soluble).
[0087] En un aspecto, la presente invención incluye una proteína aislada o derivada del conocimiento de enzimas de 15 un hongo tal como C. luceknowense o un mutante u otro derivado, y más particularmente de la cepa fúngica denominada aquí como C1 (número de registro VKM F-3500-D).
Preferiblemente, la proteína de la invención poseen actividad enzimática.
Como se describe en la patente US nº 6,015,707 o patente US nº 6,573,086, una cepa llamada C1 (número de registro VKM F-3500-D), fue aislada de muestras de tierra alcalina de bosque de Sola Lake, Far East de la 20 Federación Rusa.
Esta cepa fue depositada en la All-Russian Collection of Microorganisms of Russian Academy of Sciences (VKM), Bakhurhina St. 8, Moscú, Russia, 113184, según las condiciones del Tratado de Budapest sobre International Regulation of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure el 29 de agosto de 1996, como Chrysosporium lucknowense Garg 27K, VKM-F 3500 D. Varias cepas mutantes de C. lucknowense C1 han sido 25 producidas y estas cepas también han sido depositadas en la All-Russian Collection of Microorganisms of Russian Academy of Sciences (VKM), Bakhurhina St. 8, Moscú, Russia, 113184, según las condiciones del Tratado de Budapest sobre International Regulation of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure el 2 de septiembre de 1998.
Por ejemplo, la cepa C1 fue mutagenizada sometiéndola a luz ultravioleta para generar cepa UV13-6 (número de 30 registro VKM F-3632 D).
Esta cepa fue posteriormente mutada más con N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina para generar cepa NG7C-19 (número de registro VKM F-3633 D).
Esta última cepa sucesivamente fue sometida a mutación por luz ultravioleta, dando como resultado cepa UV18-25 (VKM F-3631 D). 35
La cepa C1 fue clasificada como una Chrysosporium luceknowense basada en características de crecimiento y morfológicas del microorganismo, como discutido en detalle en la patente US nº 6,015,707 y la patente US nº 6,573,086.
[0088] En formas de realización determinadas de la presente invención, una proteína de la invención consiste en la 40 secuencia de aminoácidos SEC ID n.º: 32.
[0089] En general, las proteínas descritas aquí poseen actividad enzimática de carbohidrasa, o la capacidad para degradar materiales que contienen carbohidratos.
Más específicamente, las proteínas pueden poseer actividad de celulasa tal como actividad de endoglucanasa (por 45 ejemplo; 1,4-β-D-glucano-4-glucanohidrolasas), actividad de exoglucanasa (por ejemplo, 1,4-β-D-glucano celobiohidrolasas), y actividad de β-glucosidasa.
Las proteínas pueden poseer actividad de hemicelulasa tal como actividad de endoxilanasa, actividad de exoxilanasa, o actividad β-xilosidasa.
Las proteínas pueden poseer laminarinasa, xiloglucanasa, galactanasa, glucoamilasa, pectato liasa, quitinasa, exo-50 β-D-glucosaminidasa, deshidrogenasa de celobiosa, acetilxilano esterasa, ligninasa, amilasa, glucuronidasa, esterasa de ácido ferúlico, arabinofuranosidasa, pectin metilesterasa, arabinasa, lipasa, glucosidasa o actividades de glucomananasa.
Las propiedades físicas, las características bioquímicas y las especificidades de sustrato de proteínas de la presente invención se ilustran por debajo. 55
[0090] Como se utiliza en este caso, "carbohidrasa" se refiere a cualquier proteína que cataliza la hidrólisis de carbohidratos, "hidrolasa de glucósido" o "glicosidasa" se refiere a una proteína que cataliza la hidrólisis de los enlaces glicosídicos entre carbohidratos o entre un carbohidrato y un residuo no carbohidrato.
Endoglucanasas, celobiohidrolasas, β-glucosidasas, α-glucosidasas, xilanasas, β-xilosidasas, galactanasas, α-60 galactosidasas, β-galactosidasas, α-amilasas, glucoamilasas, endo-arabinasas, arabinofuranosidasas, mananasas, β-manosidasas, pectinasas, esterasas de xilano de acetilo, esterasas de manano de acetilo, esterasas de ácido ferúlico, esterasas de ácido cumárico, pectin metilesterasas, y quitinasas son los ejemplos de glicosidasas.
[0091] "Celulasa" se refiere a una proteína que cataliza la hidrólisis de enlaces 1,4-β-D-glicosídicos en la celulosa (tal 65 como celulosa bacteriana, algodón, papel de filtro, celulosa hinchada de ácido fosfórico, Avicel); derivados químicos
de la celulosa (tal como carboximetilcelulosa e hidroxietilcelulosa); materiales lignocelulósicos de planta, beta-D-glucanos o xiloglucanos.
La celulosa es un beta-(1-4) glucano lineal consistente en unidades de anhidrocelobiosa.
Las endoglucanasas, celobiohidrolasas, y β-glucosidasas son los ejemplos de celulasas. "Endoglucanasa" se refiere a una proteína que cataliza la hidrólisis de celulosa en cadenas de oligosacárido en ubicaciones al azar mediante 5 una actividad de endoglucanasa. "Celobiohidrolasa" se refiere a una proteína que cataliza la hidrólisis de celulosa en celobiosa vía una actividad de exoglucanasa, secuencialmente liberando moléculas de celobiosa de las extremidades reductoras o no reductoras de celulosa o celooligosacáridos. "β-glucosidasa" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de celobiosa y oligosacáridos en glucosa.
10
[0092] "Hemicelulasa" se refiere a una proteína que cataliza la hidrólisis de hemicelulosa, tal como la encontrada en materiales lignocelulósicos.
La hemicelulosa es un polímero complejo, y su composición varía frecuentemente mucho de organismo a organismo, y de un tipo tejido a otro.
Las hemicelulosas incluyen una variedad de compuestos, tales como xilanos, arabinoxilanos, xiloglucanos, 15 mananos, glucomananos, y galactomananos.
La hemicelulosa puede también contener glucano, que es un término general para residuos de glucosa beta-enlazados.
En general, un componente principal de hemicelulosa es xilosa beta-1,4-ligada, un azúcar de cinco carbonos.
Sin embargo, esta xilosa es frecuentemente ramificada como beta-1,3 enlaces o beta-1,2 enlaces, y se puede 20 sustituir con enlaces a arabinosa, galactosa, manosa, ácido glucurónico, o por esterificación a ácido acético.
La composición, la naturaleza de sustitución, y el grado de la ramificación de hemicelulosa son muy diferentes en las plantas dicotiledóneas (dicots, es decir, plantas cuyas semillas tienen dos cotiledones u hojas de semilla tales como habas, cacahuetes, almendras, guisantes, frijoles) en comparación con plantas monocotiledóneas (monocots; es decir, planta con un cotiledón u hoja de semilla únicos tales como maíz, trigo, arroz, hierbas, cebada). 25
En dicotiledóneas, la hemicelulosa se comprende principalmente de xiloglucanos que son cadenas 1,4-beta-enlazadas de glucosa con cadenas laterales de xilosilo 1,6-alfa-enlazado.
En monocotiledóneas, incluyendo la mayoría de las plantas de cultivo de grano, los componentes principales de hemicelulosa son heteroxilanos.
Estos son principalmente compuestos de polímeros de esqueleto de xilosa 1,4-beta-enlazada con enlaces de 1,2- o 30 1,3-beta a arabinosa, galactosa y manosa al igual que xilosa modificada por ácidos acéticos enlazados a éster.
También hay beta glucanos ramificados presentes compuestos de cadenas glucosiles 1,3- y 1,4-beta-enlazadas.
En monocotiledóneas, celulosa, heteroxilanos y beta glucanos están presentes en cantidades aproximadamente iguales, cada uno comprendiendo aproximadamente 15-25% de la sustancia seca de paredes celulares.
Las enzimas hemicelulolíticas, es decir hemicelulasas, incluyen enzimas endo-actuando y exo-actuantes, tales como 35 xilanasas, β-xilosidasas, galactanasas, α-galactosidasas, β-galactosidasas, endo-arabinasas, arabinofuranosidasas, mananasas, β-manosidasas.
Las hemicelulasas también incluyen enzimas accesorias, tales como acetilesterasas, esterasas de ácido ferúlico, y esterasas de ácido cumárico.
Entre estos, xilanasas y esterasas de xilano de acetilo disocian el xilano y las cadenas laterales de acetilo de xilano 40 y los xilo-oligómeros restantes son no sustituidos y pueden así ser hidrolizados solo con β-xilosidasa.
Además, varias actividades de lado menos conocidas han sido descubiertas en preparaciones enzimáticas que hidrolizan hemicelulosa.
Por consiguiente, xilanasas, acetilesterasas y β-xilosidasas son los ejemplos de hemicelulasas.
45
[0093] "Xilanasa" específicamente se refiere a una enzima que hidroliza el β-1,4-enlace en el esqueleto de xilano, produciendo xilooligosacáridos cortos.
[0094] β-Mananasas hidrolizan hemicelulosas basadas en manano (manano, glucomanano, galactomanano) y producen β-1,4-mannooligosacáridos cortos. 50
[0095] "Galactanasa" o "arabinogalactano endo-1,4 -β - galactosidasa" se refiere a una proteína que cataliza la hidrólisis de enlaces endo-1,4-β-D-galactosídicos en arabinogalactanos.
[0096] "Glucoamilasa" se refiere a una proteína que cataliza la hidrólisis de residuos de α-D-glucosa 1,4-enlazada 55 terminal sucesivamente de extremidades no-reductoras de las cadenas con la liberación de β-D-glucosa.
[0097] "Quitinasa" o "exo-β-D-quitinasa" se refiere a una proteína que cataliza la hidrólisis de N-acetil-β-D-glucosaminida 1,4- β-enlaces en la quitina y quitodextrinas.
60
[0098] "α-L-arabinofuranosidasa" o "arabinofuranosidasa" se refiere a una proteína que hidroliza hemicelulosas que contienen arabinofuranosil.
Algunas de estas enzimas eliminan residuos de arabinofuranósido de residuos O-2 y/o O-3 de xilosa sustituida única, al igual que de residuos O-2 y O-3 de xilosa doblemente sustituida.
65
[0099] "Endo-arabinasa" se refiere a una proteína que cataliza la hidrólisis de enlaces 1,5-α-arabinofuranosídicos en 1,5-arabinanos.
[0100] "β-xylosidasa" se refiere a una proteína que hidroliza 1,4-β-D-xilooligómeros cortos en la xilosa.
5
[0101] "Acetil xilano esterasa" se refiere a una proteína que cataliza la eliminación de los grupos acetil de residuos de xilosa. "Acetil manano esterasa" se refiere a una proteína que cataliza la eliminación de los grupos acetil de residuos de manosa. "Feruloil esterasa" o "esterasa de ácido ferúlico" se refiere a una proteína que hidroliza el enlace estérico entre el grupo sustituyente de arabinosa y ácido ferúlico. "Esterasa de ácido cumárico" se refiere a una proteína que hidroliza el enlace estérico entre el grupo sustituyente de arabinosa y ácido cumárico. 10
Esterasas de xilano de acetilo, esterasas de ácido ferúlico y pectin metilesterasas son los ejemplos de esterasas de carbohidrato.
[0102] "Pectato liasa" se refiere a una proteína que cataliza la escisión de 1,4-α-D-galacturonano en los sustratos de oligosacárido. 15
[0103] Las glicosidasas (glicósido hidrolasas; GH), una familia grande de enzimas que incluye celulasas y hemicelulasas, catalizan la hidrólisis de enlaces glicosídicos, predominantemente en carbohidratos.
Las glicosidasas tales como las proteínas de la presente divulgación se pueden asignar a familias basándose en similitudes de secuencia, y hay ahora más de 100 tales familias diferente definidas (ver el sitio web CAZy 20 (Carbohydrate Active EnZymes database), mantenido por la Architecture of Fonction de Macromolecules Biologiques of the Centre National de la Recherche Scientifiquee, que describe las familias de módulos de enlace de carbohidratos y catalítico relacionados estructuralmente (o dominios funcionales) de enzimas que degradan, modifican, o crean enlaces glicosídicos; Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. 25
En "Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering", H.J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat and B. Svensson eds., The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12).
Como hay una relación directa entre la secuencia de aminoácidos de una proteína y sus similitudes de plegado, tal clasificación refleja las características estructurales de estas enzimas y su especificidad de sustrato.
Tal sistema de clasificación puede ayudar a revelar las relaciones evolutivas entre estas enzimas y proporcionar una 30 herramienta conveniente para decidir información tal como una actividad y función de la enzima.
Así, se preve que enzimas asignadas a una familia particular en base a homología secuencial con otros miembros de la familia tienen actividades enzimáticas similares y especificidades de sustrato relacionadas.
Clasificaciones de familia CAZy también existen para glicosiltransferasas (GT), liasas polisacáridas (PL), y esterasas de carbohidrato (CE). 35
Asimismo, homología secuencial se puede utilizar identificando dominios particulares dentro de proteínas, tales como módulos de unión de celulosa (CBM; también conocidos como dominios de enlace de celulosa (CBD)).
Las homologías CAZy de proteínas de la presente invención se describen por debajo.
[0104] Las proteínas de la presente divulgación también pueden incluir homólogos y fragmentos de las proteínas 40 descritas aquí.
Los fragmentos de proteínas incluyen, pero de forma no limitativa, fragmentos que comprenden un dominio catalítico (CD) y/o un dominio de unión a la celulosa (también conocido como un módulo de unión de celulosa (CBM); ambos se denominan en este caso como CBD).
La identidad y ubicación de dominios dentro de proteínas de la presente divulgación se describen en detalle por 45 debajo.
La presente divulgación abarca todas las combinaciones de los dominios descritos.
Por ejemplo, un fragmento de proteína puede comprender un CD de una proteína pero no un CBD de la proteína o un CBD de una proteína pero no un CD.
De forma similar, dominios de distintas proteínas pueden ser combinados. 50
Los fragmentos de proteínas que comprenden un CD, CBD o combinaciones de los mismos para cada proteína descrita aquí pueden ser fácilmente producidos usando técnicas estándar conocidas en la técnica. En algunas formas de realización, un fragmento de proteína comprende un dominio de una proteína que tiene al menos una actividad biológica de la proteína en toda su longitud.
Los homólogos de proteínas de la invención y divulgación que tienen al menos una actividad biológica de la proteína 55 en toda su longitud son descritos en detalle por debajo.
Como se utiliza en este caso, la frase "actividad biológica" de una proteína se refiere a cualquier función(s) mostrada o realizada por la proteína que se asigna a la forma de origen natural de la proteína como in vivo o in vitro medida u observada.
En formas de realización determinadas, un fragmento de proteína comprende un dominio de una proteína que tiene 60 la actividad catalítica de la enzima en toda su longitud.
Las actividades biológicas específicas de las proteínas de la divulgación e invención, y las estructuras en las proteínas que son responsables de las actividades, son descritas abajo.
Celobiohidrolasas 65
[0105] Las proteínas determinadas descritas aquí poseen actividad enzimática de celobiohidrolasa.
Por ejemplo, los polipéptidos denominados aquí como CBH Ia (SEC ID Nº:2), CBH Ib (SEC ID Nº:5), CBH IIa (SEC ID Nº:8), y CBH IIb (SEC ID Nº:11) poseen actividad de celobiohidrolasa.
Estas enzimas participan en la conversión hidrolítica de celulosa insoluble a celooligosacáridos, con celobiosa siendo un producto primario de la catálisis enzimática. 5
[0106] La CBH Ia denominada enzimática se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos genómica representada aquí como SEC ID Nº:1 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:3.
La secuencia de ácidos nucleicos de CBH Ia codifica una secuencia de 526 aminoácidos, representada aquí como SEC ID Nº:2. 10
El péptido señal para CBH Ia se localiza en posiciones de 1 a aproximadamente 17 de SEC ID Nº:2, con la proteína madura que abarca de aproximadamente posición 18 a posición 526 de SEC ID Nº:2.
Dentro de CBH Ia hay dos dominios: un dominio catalítico (CD) y undominio de unión a la celulosa (CBD) .
La secuencia de aminoácidos con el CD de CBH Ia abarca desde un punto de partida de aproximadamente posición 19 de SEC ID Nº:2 hasta un punto de finalización de aproximadamente posición 453 de SEC ID Nº:2. 15
La secuencia de aminoácidos con el CBD de CBH Ia abarca desde un punto de partida de aproximadamente posición 490 de SEC ID Nº:2 hasta un punto de finalización de aproximadamente posición 519 de SEC ID Nº:2.
Basado en homología, CBH Ia se puede asignar a familias CAZy GH7 y CBM 1.
Como demostrado por debajo, CBH Ia muestra actividad de celobiohidrolasa.
20
[0107] La enzima denominada CBH Ib se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:4 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:6.
La secuencia de ácidos nucleicos CBH Ib codifica un secuencia de 450 aminoácidos, representada aquí como SEC ID Nº:5.
El péptido señal para CBH Ia se localiza desde posiciones 1 hasta alrededor de posición 20 de SEC ID Nº:5, con la 25 proteína madura que abarca desde alrededor de posición 21 hasta posición 450 de SEC ID Nº:5.
Dentro de CBH Ia hay un dominio catalítico (CD).
La secuencia de aminoácidos con el CD de CBH Ib abarca desde un punto de partida de aproximadamente posición 22 de SEC ID Nº:5 hasta un punto de finalización de aproximadamente posición 450 de SEC ID Nº:5.
Basado en homología, CBH Ib se puede asignar a familia CAZy GH 7. 30
Como demostrado por debajo, CBH Ib muestra actividad de celobiohidrolasa.
[0108] La enzima denominada CBH IIa se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:7 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:9.
Las secuencias de ácidos nucleicos CBH IIa codifican una secuencia de 395 aminoácidos, representada aquí como 35 SEC ID Nº:8.
El péptido señal para CBH IIa está localizado de posiciones 1 a aproximadamente posición 17 de SEC ID Nº:8, con la proteína madura que abarca de aproximadamente posición 18 a posición 395 de SEC ID Nº:8.
Dentro de CBH IIa hay un dominio catalítico (CD).
La secuencia de aminoácidos con el CD de CBH IIa abarca desde un punto de partida de aproximadamente posición 40 40 de SEC ID Nº:8 hasta un punto de finalización de aproximadamente posición 395 de SEC ID Nº:8.
Basado en homología, CBH IIa se puede asignar a familia CAZy GH 6.
Como demostrado por debajo, CBH IIa muestra actividad de celobiohidrolasa.
[0109] La enzima denominada CBH IIb se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como 45 SEC ID Nº:10 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:12.
El secuencia de ácidos nucleicos CBH IIb codifica un secuencia de 482 aminoácidos, representada aquí como SEC ID n.º: 11.
El péptido señal para CBH IIb está localizado desde posiciones 1 hasta aproximadamente posición 17 de SEC ID n.º: 11, con la proteína madura que abarca desde aproximadamente posición 18 hasta posición 482 de SEC ID n.º: 50 11.
Dentro de CBH IIb hay dos dominios: un dominio catalítico (CD) y un dominio de unión a la celulosa (CBD).
La secuencia de aminoácidos con el CBD de CBH IIb va de un punto de partida de aproximadamente posición 27 de SEC ID Nº:11 a un punto de finalización de aproximadamente posición 62 de SEC ID n.º: 11.
La secuencia de aminoácidos con el CD de CBH IIb va de un punto de partida de aproximadamente posición 125 de 55 SEC ID Nº:11 a un punto de finalización de aproximadamente posición 482 de SEC ID n.º: 11.
Basado en homología, CBH IIb se puede asignar a familias CAZy GH 6 y CBM 1.
Como demostrado por debajo, CBH IIb presenta actividad de celobiohidrolasa.
[0110] Las propiedades físicas, las características bioquímicas y las especificidades de sustrato de celobiohidrolasas 60 descritas aquí se ilustran en tablas 1 y 2 por debajo.
Las características físicas y bioquímicas incluyen peso molecular, punto isoeléctrico, pH y temperatura óptimo de actividad enzimática, y la estabilidad de las enzimas después del calentamiento a 50°C durante cinco horas a pH 5.0 o 7.0.
Las especificidades de sustrato que demuestran actividad enzimática para los sustratos indicados fueron determinados usando ensayos estándar conocidos en la técnica, tales como los descritos en los ejemplos por debajo.
La Figura 1 ilustra la actividad específica de celobiohidrolasas de la presente divulgación hacia sustratos seleccionados de tabla 2. 5
Tabla 1. Propiedades físicas y bioquímicas de C1 celobiohidrolasas
Enzima
SEC ID n.º PM (kDa) pl pH (50%) T°C (50%) Estabilidad de pH 5.0 Estabilidad de pH 7.0
CBH Ia
2 65 4.5 5.0 (3.5-6.5) 60 (45->80) 99% 96%
CBH la (CD)
2 (CD sólo) 52 4.5 5.0 (3.5-6.5) 60 (45->80) 97% 95%
CBH Ib
5 60 3.8 4.7 (3.3-6.3) 65 (50->80) 80% 80%
CBH IIa
8 43 4.2 5.0 (3.5-6.5) 60 (50-72) 98% 70%
CBH IIb
11 70 5.6 5.0 (<3.0-6.5) 60 (50-75) 100% 80%
PM = peso molecular, kilodaltones (kDa) pl = punto isoeléctrico pH (50%) = pH óptimo de actividad enzimática (gama de al menos 50% actividad) T°C (50%) = temperatura óptima de actividad enzimática (gama de al menos 50% actividad) Estabilidad de pH 5.0 = actividad enzimática residual después de incubación durante 5 horas a 50 °C, pH 5.0 Estabilidad de pH 7.0 = actividad enzimática residual después de incubación durante 5 horas a 50 °C, pH 7.0
Tabla 2. Especificidades de sustrato de C1 celobiohidrolasas (actividad hacia sustratos específicos (unidades/mg))
10
Sustrato
CBH Ia CBH Ia (CD) CBH Ib CBH IIa CBH IIb
CMC (ensayo S-N)
0.2 0.2 0.3 1.1 0.1
CMC (viscosimétrico)
0.01 0.02 0.02 0.6 0.01
β-glucano
<0.1 <0.1 <0.1 2.0 0.2
Avicel
0.21 0.10 0.12 0.08 0.22
Xilano de madera de abedul
0 0 0 1.4 0.03
Xiloglucano
0 0 0 0 0
Laminarina
0 0 0 0 0
Arabinano
0 0 0 0.1 0
Galactano
0 0 0 0 0
Galactomanano
0 0 0 0 0
p-NPh-β-D-celobiósido
0.021 0.025 0.02 0 0
p-NPh-β-D-lactósido
0.12 0.11 0.09 0 0
[0111] Las dependencias de pH y temperatura de celobiohidrolasas descritas aquí se ilustran en tablas 3 y 4 por debajo. Dependencias de pH y temperatura fueron determinadas usando el ensayo de celulasa Avicel descrito en ejemplo 5 por debajo. Dependencias de pH fueron ensayadas variando el pH a 40°C durante una hora, mientras dependencias de temperatura fueron ensayadas variando la temperatura a pH 5.0 durante una hora. 15
Temperatura/pH que mostró la actividad enzimática máxima fue fijada a 100% en las tablas por debajo, con los valores restantes expresando un porcentaje de este estándar.
Las dependencias de pH y temperatura de las celobiohidrolasas son también ilustradas gráficamente en las Figuras 2 y 3, respectivamente.
Tabla 3: Dependencia de pH de C1 celobiohidrolasas (% actividad)
pH
CBH Ia CBH Ia (CD) CBH Ib CBH IIa CBH IIb
3
23 35 22 21 72
3.55
50 50 48 50.0 87
3.9
58 61 85 68 89
4.3
75 80 95 85 91
4.7
95 95 100 99 95
5.08
100 100 92 100 100
5.6
98 98 75 98 98
6
77 78 58 78 94
6.6
48 49 46 51.6 50
7.1
17.4 20 20 42 30
7.5
2 8 23 10
Tabla 4: Dependencia de temperatura de C1 celobiohidrolasas (% actividad)
Temp °C
CBH Ia CBH Ia (CD) CBH Ib CBH IIa CBH IIb
30
11.0 10
35
20 20 20.0 18
40
39 32 28 30
45
50 48 43 41
50
62 55 25 55 55.6
55
82 67 54 78 73
60
95 82 92 100 89
65
100 100 100 90 100
70
85 92 29 64 76
75
40 75 6 40 36.5
80
15 20 2 20 23
5
Endoglucanasas
[0112] Algunas proteínas descritas aquí poseen actividad enzimática de endo-1,4-β-glucanasa.
Por ejemplo, los polipéptidos EG I (SEC ID n.º: 14), EG II (SEC ID Nº:94), EG III (SEC ID n.º: 17), EG V (SEC ID Nº:20), y EG VI (SEC ID Nº:23) poseen actividad de endo-1,4- β-glucanasa. 10
Como con las celobiohidrolasas anteriormente descritas, estas endoglucanasas también participan en la conversión hidrolítica de celulosa insoluble a celooligosacáridos, con celobiosa siendo un producto primario de la catálisis enzimática.
[0113] La enzima denominada EG I se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC 15 ID Nº:13 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:15.
La secuencia de ácidos nucleicos EG I codifica una secuencia de 456 aminoácidos, representada aquí como SEC ID n.º: 14.
El péptido señal para EG I está localizado desde posiciones 1 hasta aproximadamente posición 20 de SEC ID n.º: 14, con la proteína madura que abarca de aproximadamente posición 21 hasta posición 456 de SEC ID Nº:14. 20
Dentro de EG I hay un dominio catalítico (CD).
La secuencia de aminoácidos con el CD de EG I abarca desde un punto de partida de aproximadamente posición 22 de SEC ID n.º: 14 hasta un punto de finalización de aproximadamente posición 420 de SEC ID n.º: 14.
Basado en homología, EG I puede ser asignado a familia CAZy GH 7.
Como demostrado por debajo, EG I muestra actividad de endoglucanasa.
[0114] La enzima denominada EG II es una secuencia de 389 aminoácidos, representada aquí como SEC ID Nº:94.
El péptido señal para EG II está localizado desde posición 1 a aproximadamente posición 16 de SEC ID Nº:94, con 5 la proteína madura que abarca desde aproximadamente posición 17 hasta posición 389 de SEC ID Nº:94.
Dentro de EG II hay dos dominios: un dominio catalítico (CD) y un dominio de unión a la celulosa (CBD).
La secuencia de aminoácidos con el CBD de EG II abarca desde un punto de partida de aproximadamente posición 17 de SEC ID Nº:94 hasta un punto de finalización de aproximadamente posición 52 de SEC ID Nº:94.
La secuencia de aminoácidos con el CD de EG II abarca desde un punto de partida de aproximadamente posición 10 84 de SEC ID Nº:94 hasta un punto de finalización de aproximadamente posición 388 de SEC ID Nº:94.
Como demostrado por debajo, EG II muestra actividad de endoglucanasa.
[0115] La enzima denominada EG III se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:16 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:18. 15
a secuencia EG III de ácidos nucleicos codifica una secuencia de 247aminoácidos, representada aquí como SEC ID Nº:17.
El péptido señal para EG III está localizado desde posición 1 hasta aproximadamente posición 15 de SEC ID n.º: 17, con la proteína madura que abarca desde aproximadamente posición 16 hasta posición 247 de SEC ID Nº:17.
Dentro de EG III hay un dominio catalítico (CD). 20
La secuencia de aminoácidos con el CD de EG III abarca desde un punto de partida de aproximadamente posición 91 de SEC ID n.º: 17 hasta un punto de finalización de aproximadamente posición 247 de SEC ID n.º: 17.
Basado en homología, EG III se puede asignar a familia CAZy GH12.
Como demostrado por debajo, EG III muestra actividad de endoglucanasa.
25
[0116] La enzima denominada EG V se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:19 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:21.
La secuencia de ácidos nucleicos EG V codifica una secuencia de 225 aminoácidos, representada aquí como SEC ID Nº:20.
El péptido señal para EG V está localizado desde posición 1 a aproximadamente posición 18 de SEC ID Nº:20, con 30 la proteína madura que abarca desde aproximadamente posición 19 a posición 225 de SEC ID Nº:20.
Dentro de EG V es un dominio catalítico (CD).
La secuencia de aminoácidos con el CD de EG V abarca desde un punto de partida de aproximadamente posición 23 de SEC ID Nº:20 hasta un punto de finalización de aproximadamente posición 224 de SEC ID Nº:20.
Basado en homología, EGV se puede asignar a familia CAZy GH 45. 35
Como demostrado por debajo, EG V muestra actividad de endoglucanasa.
[0117] La enzima denominada EG VI se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:22 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:24.
La secuencia de ácidos nucleicos EG VI codifica una secuencia de 381 aminoácidos, representada aquí como SEC 40 ID Nº:23.
El péptido señal para EG VI está localizado de posiciones 1 a aproximadamente posición 18 de SEC ID Nº:23, con la proteína madura que abarca desde aproximadamente posición 19 hasta posición 381 de SEC ID Nº:23.
Dentro de EG VI es un dominio catalítico (CD).
La secuencia de aminoácidos con el CD de EG VI abarca desde un punto de partida de aproximadamente posición 45 33 de SEC ID Nº:23 hasta un punto de finalización de aproximadamente posición 378 de SEC ID Nº:23.
Basado en homología, EG VI se puede asignar a familia CAZy GH 6.
Como demostrado por debajo, EG VI muestra actividad de endoglucanasa.
[0118] Las propiedades físicas, las características bioquímicas y las especificidades de sustrato de endoglucanasas 50 de la presente divulgación se ilustran en tablas 5 y 6 por debajo.
Las características físicas y las bioquímicas incluyen peso molecular, punto isoeléctrico, pH y temperatura óptimas de actividad enzimática, y la estabilidad de las enzimas después del calentamiento a 50°C durante cinco horas a pH 5.0 o 7.0.
Las especificidades de sustrato que demuestran actividad enzimática para los sustratos indicados fueron 55 determinadas usando ensayos estándar conocidos en la técnica, tales como los descritos en los ejemplos por debajo.
La Figura 1 ilustra la actividad específica de endoglucanasas de la presente invención hacia sustratos seleccionados de tabla 6.
60
Tabla 5. Propiedades físicas y bioquímicas de C1 endoglucanasas
Enzima
SEC ID n.º PM (kDa) pl pH (50%) T°C (50%) Estabilidad de pH 5.0 Estabilidad de pH 7.0
EG I
14 60 3.7 4.8 (3.5-7.5) 60 (43-76) 80% 80%
EG II
97 51 4.8 4.7 (3.5-7.5) 70 (53-77) 93% 93%
EG II (CD)
97 (CD sólo) 44 6.0 5.2 (3.5-7.5) 70 (53-77) 90% 90%
EG III
17 28 5.7 5.3 (3.8-7.0) 60 (30-75) 92% 74%
EG V
20 25 4.0 5.5 (3.5-8.5) 65 (50-75) 95% 92%
EG VI
23 47 5.7 6.0 (4.5->8.5) 70 (40-82) 60% 75%
PM = peso molecular, kilodaltones (kDa) Pl = punto isoeléctrico pH (50%) = pH óptimo de actividad enzimática (gama de al menos 50% actividad) T °C (50%) = temperatura óptima de actividad enzimática (gama de al menos 50% actividad) Estabilidad de pH 5.0 = actividad enzimática residual después de incubación de 5 horas a 50 °C, pH 5.0 Estabilidad de pH 7.0 = actividad enzimática residual después de incubación de 5 horas a 50 °C, pH 7.0
Tabla 6. Especificidades de sustrato de C1 endoglucanasas (actividad hacia sustratos específicos (unidades/mg))
Sustrato
EG I EG II EG II (CD) EG III EG V EG VI
CMC (ensayo S-N)
12 52 59 11 17 14
CMC (viscosimétrico)
5 46 39 19 20 6
β-glucano
18 75 74 125 5.3 18
Avicel
0.08 0.19 0.06 0.02 0.06 0.07
Xilano de madera de abedul
0 0.18 0.07 0.2 0 0.08
Xiloglucano
0 0 0 15.6 1.9 0
Laminarina
0 0.1 0.1 0 0 0
Arabinano
0 0 0.3 0 0 0
Galactano
0 0 0.6 0 0 0.1
Galactomanano
0 1.1 1 0 0.1 0
p-NPh-β-D-celobiósido
0.12 0 0 0 0 0
p-NPh-β-D-lactósido
0.27 0 0 0 0 0
[0119] Las dependencias de pH y temperatura de endoglucanasas se ilustran en tablas 7 y 8 por debajo. Las dependencias de pH y temperatura fueron determinados usando el CMC ensayo de celulasa descrito en ejemplo 3 5 por debajo. Las dependencias de pH fueron ensayadas variando el pH a 50°C durante cinco minutos, mientras que las dependencias de temperatura fueron ensayadas variando la temperatura a pH 5.0 durante cinco minutos.
Temperatura/pH que mostró la actividad enzimática máxima fue fijadas a 100% en las tablas por debajo, con los valores restantes expresando un porcentaje de este estándar.
Las dependencias de pH y temperatura de las endoglucanasas son también ilustradas gráficamente en las Figuras 4 10 y 5, respectivamente.
Tabla 7: Dependencia de pH de C1 endoglucanasas (% actividad)
pH
EG I EG II EGII (CD) EG III EG V EG VI
2.7
9 23 16 0 16.5 8
3.34
30 39 29 10 48 17
4.04
88 87 77 60 81 37
4.777
100 100 95 98 94.5 75
5.36
98 96 100 100 100 97
6.06
87 86 96 89 98 100
6.73
74 75 81 70 88 96
7.38
55 58 64 38 76.5 91
8
33 43 38 15 67 75
8.44
23 32 25 8 52 68
Tabla 8: Dependencia de temperatura de C1 endoglucanasas (% actividad)
Temp °C
EG I EG II EG II (CD) EG III EG V EG VI
30
22.5 19 10.5 55.2 22 24.7
35
30.5 20 12 69.1 26 37.0
40
42.3 24 20.7 80.6 37 52
45
61.1 27 25 86.3 45 68.5
50
83.3 35.4 32 93.2 51 79.8
55
95.5 55 56 97.5 70 89.0
60
100 72 71 100 83.3 96.1
65
93.5 90 92 95.9 100 99
70
77.6 100 100 87.9 88 100
75
57.3 62 70 57.5 60 82.2
80
32.4 31 35 13.4 33 57.5
Xilanasas
5
[0120] Ciertas proteínas de la presente divulgación y la proteína de la presente invención poseen actividad enzimática de xilanasa.
Por ejemplo, los polipéptidos Xyl 1 (SEC ID Nº:26), Xyl 2 (SEC ID Nº:29), Xyl 3 (SEC ID Nº:32), Xyl 4 (SEC ID Nº:35), Xyl 5 (SEC ID Nº:38), y Xyl 6 (SEC ID Nº:41) poseen actividad de xilanasa.
Estas xilanasas participan en la conversión hidrolítica de hemicelulosa en xilosa. 10
[0121] La enzima denominada 1 se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:25 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:27.
La secuencia de ácidos nucleicos de Xyl 1 codifica una secuencia de 384 aminoácidos, representada aquí como SEC ID Nº:26. 15
El péptido señal para Xyl 1 está localizado de posición 1 a aproximadamente posición 17 de SEC ID Nº:26, con la proteína madura que abarca de aproximadamente posición 18 a posición 384 de SEC ID Nº:26.
Dentro de Xyl 1 hay dos dominios: un dominio catalítico (CD) y un dominio de unión a la celulosa (CBD).
La secuencia de aminoácidos con el CBD de Xyl 1 abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 18 de SEC ID Nº:26 a un punto de finalización de aproximadamente posición 53 de SEC ID Nº:26. 20
La secuencia de aminoácidos con el CD de Xyl 1 abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 83 de SEC ID Nº:26 a un punto de finalización de aproximadamente posición 384 de SEC ID Nº:26.
Basado en homología, Xyl 1 se puede asignar a familias CAZy GH 10 y CBM 1.
Como demostrado por debajo, Xyl 1 muestra actividad de xilanasa.
25
[0122] La enzima denominada Xyl 2 se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:28 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:30.
La secuencia de ácidos nucleicos de Xyl 2 codifica una secuencia de 221 aminoácidos, representada aquí como SEC ID Nº:29.
El péptido señal para Xyl 2 está localizado de posición 1 a aproximadamente posición 18 de SEC ID Nº:29, con la 30 proteína madura que abarca desde aproximadamente posición 19 a posición 221 de SEC ID Nº:29.
Dentro de Xyl 2 hay un dominio catalítico (CD).
La secuencia de aminoácidos con el CD de Xyl 2 abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 25 de SEC ID Nº:29 a un punto de finalización de aproximadamente posición 219 de SEC ID Nº:29.
Basado en homología, Xyl 2 se puede asignar a familia CAZy GH 11. 35
Como demostrado por debajo, Xyl 2 muestra actividad de xilanasa.
[0123] La enzima denominada Xyl 3 se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:31 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:33.
La secuencia de ácidos nucleicos de Xyl 3 codifica una secuencia de 413 aminoácidos, representada aquí como 40 SEC ID Nº:32.
El péptido señal para Xyl 3 está localizado de posición 1 a aproximadamente posición 17 de SEC ID Nº:32, con la proteína madura que abarca de aproximadamente posición 18 a posición 413 de SEC ID Nº:32.
Dentro de Xyl 3 hay dos dominios: un dominio catalítico (CD) y un dominio de unión a la celulosa (CBD).
La secuencia de aminoácidos con el CD de Xyl 3 abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 18 de 45 SEC ID Nº:32 a un punto de finalización de aproximadamente posición 336 de SEC ID Nº:32.
La secuencia de aminoácidos con el CBD de Xyl 3 abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 377 de SEC ID Nº:32 a un punto de finalización de aproximadamente posición 413 de SEC ID Nº:32.
Basado en homología, Xyl 3 se puede asignar a familia CAZy GH 10.
Como demostrado por debajo, Xyl 3 muestra actividad de xilanasa.
La enzima denominada Xyl4 se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:34 5 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:36.
La secuencia de ácidos nucleicos de Xyl 4 codifica una secuencia de 375 aminoácidos, representada aquí como SEC ID Nº:35.
El péptido señal para Xyl 4 está localizado de posición 1 a aproximadamente posición 19 de SEC ID Nº:35, con la proteína madura que abarca de aproximadamente posición 20 a posición 375 de SEC ID Nº:35. 10
Dentro de Xyl 4 es un dominio catalítico (CD).
La secuencia de aminoácidos con el CD de Xyl 4 abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 31 de SEC ID Nº:35 a un punto de finalización de aproximadamente posición 354 de SEC ID Nº:35.
Basado en homología, Xyl 4 se puede asignar a familia CAZy GH 10.
Como demostrado por debajo, Xyl 4 muestra actividad de xilanasa. 15
[0124] La enzima denominada Xyl 5 se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:37 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:39.
La secuencia de ácidos nucleicos de Xyl 5 codifica una secuencia de 226 aminoácidos, representada aquí como SEC ID Nº:38. 20
El péptido señal para Xyl 5 está localizado de posiciones 1 a aproximadamente posición 21 de SEC ID Nº:38, con la proteína madura que abarca de aproximadamente posición 22 a posición 226 de SEC ID Nº:38.
Dentro de Xyl 5 hay un dominio catalítico (CD).
La secuencia de aminoácidos con el CD de Xyl 5 abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 42 de SEC ID Nº:38 a un punto de finalización de aproximadamente posición 223 de SEC ID Nº:38. 25
Basado en homología, Xyl 5 se puede asignar a familias CAZy GH 11 y CE 4.
Como demostrado por debajo, Xyl 5 muestra actividad de xilanasa.
[0125] La enzima denominada Xyl 6 se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:40 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:42. 30
La secuencia de ácidos nucleicos de Xyl 6 codifica una secuencia de 228 aminoácidos, representada aquí como SEC ID Nº:41.
El péptido señal para Xyl 6 está localizado de posición 1 a aproximadamente posición 20 de SEC ID Nº:41, con la proteína madura que abarca de aproximadamente posición 21 a posición 228 de SEC ID Nº:41.
Dentro de Xyl 6 hay un dominio catalítico (CD). 35
La secuencia de aminoácidos con el CD de Xyl 6 abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 37 de SEC ID Nº:41 a un punto de finalización de aproximadamente posición 226 de SEC ID Nº:41.
Basado en homología, Xyl 6 se puede asignar a familia CAZy GH 11.
Como demostrado por debajo, Xyl 6 muestra actividad de xilanasa.
40
[0126] Las propiedades físicas, las características bioquímicas y las especificidades de sustrato de xilanasas de la presente divulgación y la xilanasa de la presente invención se ilustran en tablas 9, 10, 11 y 12 por debajo.
Las características físicas y bioquímicas incluyen peso molecular, punto isoeléctrico, pH y temperatura óptimoa de actividad enzimática, y la estabilidad de las enzimas después del calentamiento a 50°C durante cinco horas a pH 5.0 o 7.0, o después del calentamiento a 80°C durante veinte segundos. 45
Las especificidades de sustrato que demuestran la actividad enzimática para los sustratos indicados (específico y no-específico) fueron determinadas usando ensayos estándar conocidos en la técnica, tales como los descritos en los ejemplos por debajo.
El grado de hidrólisis exhaustiva de xilano de sustratos específicos es también indicado.
La Figura 6 ilustra la actividad específica de xilanasas de la presente divulgación y la xilanasa de la presente 50 invención hacia sustratos seleccionados de tabla 10.
Tabla 9: Propiedades físicas y bioquímicas de C1 xilanasas
Enzima
SEC ID n.º PM (kDa) pl pH T °C Estabilidad pH 5.0 Estabilidad pH 7.0 Estabilidad 80°C
Xyl1
26 42 7.8 5.5-7.0 65-70 100% (81%) 100% (85%) 12%
Xyl 1 (CD)
26 (CD sólo) 31 8.9 5.5-7.0 65-70 100% (76%) 100% (88%) 19%
Xyl 2
29 24 7.9 5.7-7.5 70 84% (35%) 71% (25%) 23%
Xyl 3
32 57 4.4 5.5-6.5 80-85 100% (90%) 100% (92%) 75%
Xyl 3 (CD)
32(CD sólo) 46 4.3 5.5-6.5 80-85 100% (95%) 100% (97%) 98%
Xyl 4
35 38 4.8 5.0 80 100% (82%) 100% (70%) 82%
Xyl 5
38 22 6.7 4.5 65 45% (35%) inestable a pH ≥ 7.0 68%
Xyl 6
41 23 8.4 6.0 65-70 90% (12%) 95% (20%) 60%
PM = peso molecular, kilodaltones (kDa) Pl = punto isoeléctrico pH = pH óptimo de actividad enzimática T °C = temperatura óptima de actividad enzimática PH de estabilidad 5.0 = actividad enzimática residual después incubación de 1 hora a 50 °C (60 °C), pH 5.0 Estabilidad de pH 7.0 = actividad enzimática residual después de incubación de 1 hora a 50 °C (60 °C), pH 7.0 Estabilidad 80 °C = actividad enzimática residual después de 20 segundos a 80 °C
Tabla 10: Especificidades de sustrato de C1 xilanasas (actividad hacia sustratos específicos (unidades/mg))
Sustrato
Xyl 1 Xyl 1 (CD) Xyl 2 Xyl 3 Xyl 3 (CD) Xyl 4 Xyl 5 Xyl 6
Xilano de madera de abedul
65 83 395 39 85 32 300 169
Xilano de madera de haya
66 71 329 47 88 36 300 188
Arabinoxilano de trigo
83 102 494 52 98 40 143 268
Arabinoxilano de trigo (insoluble)
83 82 198 52 78 24 57 107
Arabinoxilano de espelta de avena
96 100 485 63 107 42 320 329
Actividad viscométrica, arabinoxilano de trigo
1311 1382 2158 807 1210 234 2700 2452
Tabla 11: Grado de hidrólisis exhaustiva de xilano de sustratos específicos por C1 xilanasas (%)
Sustrato
Xyl 1 Xyl 1 (CD) Xyl 2 Xyl 3 Xyl 3 (CD) Xyl 4 Xyl 5 Xyl 6
Xilano de madera de abedul
26 24 19 24 23 25 22 21
Xilano de madera de haya
24 22 15 22 20 23 18 17
Arabinoxilano de trigo
26 28 15 30 29 24 18 17
Arabinoxilano de trigo (insoluble)
12 13 7 14 11 12 9 8
Arabinoxilano de espelta de avena
28 27 19 29 25 26 20 19
5
Tabla 12: Especificidades de sustrato de C1 xilanasas (actividad hacia sustratos no-específicos (unidades/mg))
Sustrato
Xyl 1 Xyl 1 (CD) Xyl 2 Xyl 3 Xyl 3 (CD) Xyl 4 Xyl 5 Xyl 6
CMC
0.65 1 0 0.12 0.2 0 0 0
Avicel
0 0 0 0 0 0 0 0
P-NPh-β-D-xilopiranósido
0 0 0 0.3 0.6 0.3 0 0
P-NPh-β-D-celobiósido
0.36 0.42 0 0.84 1.6 4.0 0 0
[0127] Las dependencias de pH y de temperatura de xilanasas de la presente divulgación y la xilanasa de la presente invención se ilustran en tablas 13 y 14 por debajo. Las dependencias de pH y de temperatura fueron determinadas usando el ensayo de xilanasa (en el xilano soluble) descrito en ejemplo 7 por debajo. Las 10
dependencias de pH fueron ensayadas variando el pH a 40°C durante 10 minutos, mientras que las dependencias de temperatura fueron ensayadas variando la temperatura a pH 5.0 durante 10 minutos.
Temperatura/pH que mostró la actividad enzimática máxima fue fijada a 100% en la tabla por debajo, con los valores restantes expresando un porcentaje de este estándar.
Las dependencias de pH y de temperatura de las xilanasas son también ilustradas gráficamente en las Figuras 7 y 8, 5 respectivamente.
Tabla 13: Dependencia de pH de C1 xilanasas (% actividad)
pH
Xyl 1 Xyl 1 (CD) Xyl 3 Xyl 3 (CD) pH Xyl 4 pH Oxy 2 pH Xyl 6 pH Xyl 5
2.5
0.00 0.46 1.83 0.42 3.0 0.37 3.1 0 2.35 0.00 2.44 0.00
3.53
22.00 25.48 39.99 25.32 3.5 36.33 3.8 5.89 3.53 14.25 3 13.65
4.67
70.23 73.56 74.68 71.26 4.0 78.51 4.2 26.66 4.42 45.85 3.5 36.97
4.92
85.63 83.69 84.23 86.62 4.5 94.89 4.8 70.06 4.92 75.55 4 80.39
5.57
100 97.00 97.22 95.00 5.0 100 5.3 90.00 5.57 94.76 4.5 100
6.03
99.59 100 98.33 97.53 5.5 89.22 5.8 97.26 6.03 100 5.1 70.32
6.64
97.33 95.34 100 100 6.0 73.65 6.4 100 6.64 96.92 5.5 45.14
7.1
95.46 90.08 90.43 91.99 6.5 52.16 6.9 99.05 7.1 78.61 5.81 29.11
7.61
90.76 85.16 79.49 79.90 7.0 40.83 7.9 89.62 7.61 60.77 6.75 0.00
8.71
72.12 62.86 61.10 63.44 8.0 19.64 9.5 4.40 8.71 21.99 7.2 0.00
Tabla 14: Dependencia de temperatura de C1 xilanasas (% actividad) 10
Temp °C
Xyl 1 Xyl 1 (CD) Xyl 2 Xyl 3 Xyl 3 (CD) Xyl 4 Xyl 5 Xyl 6
30
37.5 37.5 8.3 27.3 26.5 18.6 44.8 35.4
40
46.8 46.8 22.7 34.1 31.7 27.4 56.3 57.0
45
63.1 63.1 40.0 30.0 36.4 62.6
50
73.1 73.1 47.2 46.4 36.5 40.3 75.9 76.1
55
82.9 82.9 59.5 63.8 50.5 85.0
60
88.1 88.1 79.0 63.3 67.5 70.3 98.3 87.5
65
98.0 98.0 92.5 76.1 80.4 81.8 100.0 97.2
70
100.0 100.0 100.0 81.5 87.5 86.4 92.2 97.3
75
95.0 95.0 95.2 92.0 88.8 92.6 70.1 71.6
80
63.7 63.7 56.4 100.0 98.3 100.0 30.2 46.2
85
41.0 41.0 100.0 100.0 85.3 31.1
90
21.1 21.1 71.9 69.8 65.6 20.8
Glicosidasas adicionales
[0128] Ciertas proteínas de la presente divulgación poseen actividad enzimática de glicosidasa, incluyendo actividades de β-glucosidasa, galactanasa, glucoamilasa, endo-arabinasa, y β-xilosidasa. 15
Los polipéptidos denominados aquí como Bg13A (SEC ID Nº:44), Gal53A (SEC ID Nº:47), G1a15A (SEC ID Nº:50), Abnl (SEC ID Nº:89) y bx12 (SEC ID Nº:92) poseen actividad de glicosidasa, como indicado por debajo.
[0129] La enzima Bgl3A se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:43 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:45. 20
La secuencia Bgl3A de ácidos nucleicos codifica una secuencia de 871 aminoácidos, representado aquí como SEC ID Nº:44.
El péptido señal para Bgl3A está localizado de posición 1 a aproximadamente posición 19 de SEC ID Nº:44, con la proteína madura que abarca de aproximadamente posición 20 a posición 871 de SEC ID Nº:44.
Dentro de Bgl3A hay un dominio catalítico (CD). 25
La secuencia de aminoácidos con el CD de Bgl3A abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 87 de SEC ID Nº:44 a un punto de finalización de aproximadamente posición 643 de SEC ID Nº:44.
Basado en homología, Bgl3A se puede asignar a familia CAZy GH 3.
[0130] La enzima Gal53A se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:46 y 30 la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:48.
La secuencia de ácidos nucleicos Gal53A codifica una secuencia de 350 aminoácidos, representada aquí como SEC ID Nº:47.
El péptido señal para Gal53A está localizado de posición 1 a aproximadamente posición 18 de SEC ID Nº:47, con la proteína madura que abarca de aproximadamente posición 19 a posición 350 de SEC ID Nº:47.
Dentro de Gal53A hay un dominio catalítico (CD). 5
La secuencia de aminoácidos con el CD de Gal53A abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 19 de SEC ID Nº:47 a un punto de finalización de aproximadamente posición 334 de SEC ID Nº:47.
Basado en homología, Gal53A se puede asignar a familia CAZy GH 53.
Como demostrado por debajo, Gal53A muestra actividad galactanasa (arabinogalactano endo-1,4-β-galactosidasa).
10
[0131] La enzima Gla15A se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:49 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:51.
La secuencia de ácidos nucleicos Gla15A codifica una secuencia de 628 aminoácidos, representada aquí como SEC ID Nº:50.
El péptido señal para Gla15A está localizado de posición 1 a aproximadamente posición 20 de SEC ID Nº:50, con la 15 proteína madura que abarca de aproximadamente posición 21 a posición 628 de SEC ID Nº:50.
Dentro de Gla15A hay dos dominios: un dominio catalítico (CD) y un dominio de unión al almidón (CBM 20).
La secuencia de aminoácidos con el CD de Gla15A abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 28 de SEC ID Nº:50 a un punto de finalización de aproximadamente posición 461 de SEC ID Nº:50.
La secuencia de aminoácidos con el dominio de unión al almidón de Gla15A abarca de un punto de partida de 20 aproximadamente posición 518 de SEC ID Nº:50 a un punto de finalización de aproximadamente posición 628 de SEC ID Nº:50.
Basado en homología, Gla15A se puede asignar a familias CAZy GH 15 y CBM 20.
Como demostrado por debajo, Gla15A muestra actividad de glucoamilasa.
25
[0132] La enzima Abnl se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:88 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:90.
La secuencia de ácidos nucleicos Abnl codifica una secuencia de 321 aminoácidos, representada aquí como SEC ID Nº:89.
El péptido señal para Abnl está localizado de posición 1 a aproximadamente posición 20 de SEC ID Nº:89, con la 30 proteína madura que abarca de aproximadamente de posición 21 a posición 321 de SEC ID Nº:89.
Dentro de Abnl hay un dominio catalítico (CD).
La secuencia de aminoácidos con el CD de Abnl abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 27 de SEC ID Nº:89 a un punto de finalización de aproximadamente posición 321 de SEC ID Nº:89.
Basado en homología, Abnl se puede asignar a familia CAZy GH 43. 35
Como se ilustra debajo en el ejemplo 23, Abn1 muestra actividad de endo-arabinasa como medida por la capacidad para hidrolizar AZCL-arabinano (desramificado).
Abnl también posee homología significativa (aproximadamente 61% de aminoácidos 13 a 321 de Abnl) con una endo-arabinasa de Aspergillus niger (número de registro Genbank. AAA32682 ver también Flipphi et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 40:318 (1993)). Basado en este grado de homología, está previsto que Abnl muestre actividad 40 similar enzimática de endo-arabinasa.
[0133] La enzima Bx12 se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:91 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:93.
Lasecuencia de ácidos nucleicos Bx12 codifica una secuencia de 733 aminoácidos, representada aquí como SEC 45 ID Nº:92.
El péptido señal para Bx12 está localizado de posición 1 a aproximadamente posición 17 de SEC ID Nº:92, con la proteína madura que abarca de aproximadamente posición 18 a posición 733 de SEC ID Nº:92.
Dentro de Bx12 hay un dominio catalítico (CD).
La secuencia de aminoácidos con el CD de Bx12 abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 26 de 50 SEC ID Nº:92 a un punto de finalización de aproximadamente posición 602 de SEC ID Nº:92.
Basado en homología, Bx12 se puede asignar a familia CAZy GH 3.
Como se ilustra debajo en el ejemplo 24; Bx12 muestra actividad de β-xilosidasa.
Bx12 también posee homología significativa (aproximadamente 70% de aminoácidos 28 a 733 de Bx12) con una β-glucosidasa de Hipocrea jecorina (Genbank nº de registro 1713235A; ver también Bamett et al., Biotecnol. 9:562 55 (1991)).
Basado en este grado de homología, también se espera que Bx12 muestre actividad similar enzimática de β-glucosidasa.
Pectato liasas 60
[0134] Ciertas proteínas de la presente divulgación poseen actividad enzimática de pectato liasa.
El polipéptido denominado aquí como Pell (SEC ID Nº:53) posee actividad de pectato liasa.
[0135] La enzima Pell se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:52 y la 65 secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:54.
La secuencia de ácidos nucleicos Pell codifica una secuencia de 375 aminoácidos, representada aquí como SEC ID Nº:53.
El péptido señal para Pell está localizado de posición 1 a aproximadamente posición 20 de SEC ID Nº:53, con la proteína madura que abarca de aproximadamente posición 21 a posición 375 de SEC ID Nº:53.
Dentro de Pell hay un dominio catalítico (CD). 5
La secuencia de aminoácidos con el CD de Pell abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 21 de SEC ID Nº:53 a un punto de finalización de aproximadamente posición 375 de SEC ID Nº:53.
Como demostrado por debajo, Pell muestra actividad de pectato liasa.
Quitinasas 10
[0136] Ciertas proteínas de la presente divulgación poseen actividad enzimática de quitinasa.
Los polipéptidos denominados aquí como Chi18A (SEC ID Nº:56) y Gls2A (SEC ID Nº:59) poseen actividad de quitinasa.
15
[0137] La enzima Chi18A se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:55 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:57.
La secuencia de ácidos nucleicos Chi18A codifica una secuencia de 426 aminoácidos, representada aquí como SEC ID Nº:56.
El péptido señal para Chi18A está localizado de posición 1 a aproximadamente posición 23 de SEC ID Nº:56, con la 20 proteína madura que abarca de aproximadamente posición 24 a posición 426 de SEC ID Nº:56.
Dentro de Chi18A hay un dominio catalítico (CD).
La secuencia de aminoácidos con el CD de Chi18A abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 42 de SEC ID Nº:56 a un punto de finalización de aproximadamente posición 386 de SEC ID Nº:56.
Basado en homología, Chi18A se puede asignar a familia CAZy GH 18. 25
Como demostrado por debajo, Chi18A muestra actividad de quitinasa.
[0138] La enzima Gls2A se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:58 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:60.
La secuencia de ácidos nucleicos Gls2A codifica una secuencia de 907 aminoácidos, representada aquí como SEC 30 ID Nº:59.
El péptido señal para Gls2A está localizado de posición 1 a aproximadamente posición 20 de SEC ID Nº:59, con la proteína madura que abarca de aproximadamente posición 21 a posición 907 de SEC ID Nº:59.
Dentro de Gls2A hay un dominio catalítico (CD).
La secuencia de aminoácidos con el CD de Gls2A abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 210 35 de SEC ID Nº:59 a un punto de finalización de aproximadamente posición 764 de SEC ID Nº:59.
Basado en homología, Gls2A se puede asignar a familia CAZy GH 2.
Como demostrado por debajo, Gls2A muestra actividad de quitinasa (exo-β-D-quitinasa).
Esterasas de carbohidrato 40
[0139] Ciertas proteínas de la presente divulgación poseen actividad enzimática de esterasa de carbohidrato, tal como actividad de acetil esterasa de xilano, esterasa de ácido ferúlico y pectin metilesterasa los polipéptidos denominado aquí como Axe3 (SEC ID Nº:62), FaeA1 (SEC ID Nº:65), FaeA2 (SEC ID Nº:68), FaeB2 (SEC ID Nº:71), Axe1 (SEC ID Nº:80) Axe2 (SEC ID Nº:83) y Pme1 (SEC ID Nº:86) poseen actividad de esterasa de carbohidrato. 45
[0140] La enzima Axe3 se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:61 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:63.
La secuencia de ácidos nucleicos Axe3 codifica una secuencia de 313 aminoácidos, representada aquí como SEC ID Nº:62. 50
El péptido señal para Axe3 está localizado de posición 1 a aproximadamente posición 21 de SEC ID Nº:62, con la proteína madura que abarca de aproximadamente posición 22 a posición 313 de SEC ID Nº:62.
Dentro de Axe3 hay un dominio catalítico (CD).
La secuencia de aminoácidos con el CD de Axe3 abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 22 de SEC ID Nº:62 a un punto de finalización de aproximadamente posición 255 de SEC ID Nº:62. 55
Basado en homología, Axe3 se puede asignar a familia CAZy CE 1.
Como se ilustra debajo en el ejemplo 19, Axe3 muestra actividad enzimática de esterasa de acetilo.
Axe3 también posee homología significativa (aproximadamente 69% de aminoácidos 41 a 312 de Axe3) con una acetil esterasa de xilano de Penicillium purpurogenum (número de registro Genbank. AAM93261.1 Ver también Gordillo et al., Mycol.Res. 110:1129 (2006)). Basado en este grado de homología, se espera que Axe3 muestre 60 actividad enzimática similar de esterasa de xilano de acetilo.
[0141] La enzima FaeA1 se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:64 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:66.
La secuencia de ácidos nucleicos FaeA1 codifica una secuencia de 279 aminoácidos, representada aquí como SEC 65 ID Nº:65.
El péptido señal para FaeA1 está localizado de posición 1 a aproximadamente posición 20 de SEC ID Nº:65, con la proteína madura que abarca de aproximadamente posición 21 a posición 279 de SEC ID Nº:65.
Dentro de FaeA1 hay un dominio catalítico (CD).
La secuencia de aminoácidos con el CD de FaeA1 abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 33 de SEC ID Nº:65 a un punto de finalización de aproximadamente posición 216 de SEC ID Nº:65. 5
Basado en homología, FaeA1 se puede asignar a familia CAZy CE 1.
Como se ilustra debajo en el ejemplo 20, FaeA1 muestra actividad enzimática de esterasa de ácido ferúlico.
FaeA1 también posee homología significativa (aproximadamente 51% de aminoácidos 22 a 264 de FaeA1) con una esterasa de ácido ferúlico de Aspergillus clavatus (Genbank nº de registro CAC85738).
Basado en este grado de homología, se espera que FaeA1 muestre actividad similar enzimática de esterasa de 10 ácido ferúlico.
[0142] La enzima FaeA2 se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:67 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:69.
La secuencia de ácidos nucleicos FaeA2 codifica una secuencia de 302 aminoácidos, representada aquí como SEC 15 ID Nº:68.
El péptido señal para FaeA2 está localizado de posición 1 a aproximadamente posición 26 de SEC ID Nº:68, con la proteína madura que abarca de aproximadamente posición 27 a posición 302 de SEC ID Nº:68.
Como se ilustra debajo en el ejemplo 20, FaeA2 muestra actividad enzimática de esterasa de ácido ferúlico.
FaeA2 también posee homología significativa (aproximadamente 45% de aminoácidos 32 a 301 de FaeA2) con una 20 esterasa de ácido ferúlico de Aspergillus clavatus (Genbank nº de registro CAC85738).
Basado en este grado de homología, se espera que FaeA2 muestre actividad similar enzimática de esterasa de ácido ferúlico.
[0143] La enzima FaeB2 se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:70 y la 25 secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:72.
La secuencia de ácidos nucleicos FaeB2 codifica una secuencia de 319 aminoácidos, representada aquí como SEC ID Nº:71.
El péptido señal para FaeB2 está localizado de posición 1 a aproximadamente posición 22 de SEC ID Nº:71, con la proteína madura que abarca de aproximadamente posición 23 a posición 319 de SEC ID Nº:71. 30
Dentro de FaeB2 hay un dominio catalítico (CD).
La secuencia de aminoácidos con el CD de FaeB2 abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 63 de SEC ID Nº:71 a un punto de finalización de aproximadamente posición 278 de SEC ID Nº:71.
Como se ilustra debajo en el ejemplo 20, FaeB2 muestra actividad enzimática de esterasa de ácido ferúlico.
FaeB2 también posee homología significativa (aproximadamente 68% de aminoácidos 46 a 319 de FaeB2) con un 35 tipo B de esterasa de ácido ferúlico de Neurospora crassa (Genbank nº de registro CAC05587).
Basado en este grado de homología, se espera que FaeB2 muestre actividad similar enzimática de esterasa de ácido ferúlico
[0144] La enzima Axe1 se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:79 y la 40 secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:81.
La secuencia de ácidos nucleicos Axe1 codifica una secuencia de 303 aminoácidos, representada aquí como SEC ID Nº:80.
El péptido señal para Axe1 está localizado de posición 1 a aproximadamente posición 21 de SEC ID n.º: 80, con la proteína madura que abarca de aproximadamente posición 22 a posición 303 de SEC ID Nº:80. 45
Dentro de Axe1 hay dos dominios: un dominio catalítico (CD) y un dominio de unión a la celulosa (CBD).
La secuencia de aminoácidos con el CD de Axe1 abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 37 de SEC ID Nº:80 a un punto de finalización de aproximadamente posición 246 de SEC ID Nº:80.
La secuencia de aminoácidos con el CBD de Axe1 abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 271 de SEC ID Nº:80 a un punto de finalización de aproximadamente posición 303 de SEC ID Nº:80. 50
Basado en homología, Axe1 se puede asignar a familias CAZy CE 5 y CBM 1.
Como se ilustra debajo en el ejemplo 19, Axe1 muestra actividad enzimática de esterasa de acetilo.
Axe1 también posee homología significativa (aproximadamente 57% de aminoácidos 3 a 303 de Axe1) con una acetil esterasa de xilano de Hipocrea jecorina (número de registro Genbank. CAA93247; Ver también Margolles-Clark et al., Eur. J. Biochem. 237:553 (1996)). Basado en este grado de homología, se espera que Axe1 muestre 55 actividad similar enzimática de esterasa de xilano de acetilo.
[0145] La enzima Axe2 se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:82 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:84.
La secuencia de ácidos nucleicos Axe2 codifica una secuencia de 228 aminoácidos, representada aquí como SEC 60 ID Nº:83.
El péptido señal para Axe2 está localizado de posición 1 a aproximadamente posición 17 de SEC ID n.º: 83, con la proteína madura que abarca de aproximadamente posición 18 a posición 228 de SEC ID Nº:83.
Dentro de Axe2 hay un dominio catalítico (CD).
La secuencia de aminoácidos con el CD de Axe2 abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 26 de 65 SEC ID Nº:83 a un punto de finalización de aproximadamente posición 242 de SEC ID Nº:83.
Basado en homología, Axe2 se puede asignar a familia CAZy CE 5.
Como se ilustra debajo en el ejemplo 19, Axe2 muestra actividad enzimática de esterasa de acetilo.
Axe2 también posee homología significativa (aproximadamente 58% de aminoácidos 7 a 225 de Axe2) con una acetil esterasa de xilano de Penicillium purpurogenum (Genbank nº de registro 059893; ver también Egana et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 24(1):33 (1996)). Basado en este grado de homología, se espera que Axe2 muestre 5 actividad similar enzimática de esterasa de xilano de acetilo.
[0146] La enzima Pme1 se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:85 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:87.
La secuencia de ácidos nucleicos Pmelcodifica una secuencia de 331 aminoácidos, representada aquí como SEC 10 ID Nº:86.
El péptido señal para Pmel está localizado de posición 1 a aproximadamente posición 27 de SEC ID n.º: 86, con la proteína madura que abarca de aproximadamente posición 28 a posición 331 de SEC ID Nº:86.
Dentro de Pmel hay un dominio catalítico (CD).
La secuencia de aminoácidos con el CD de Pmel abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 43 de 15 SEC ID Nº:86 a un punto de finalización de aproximadamente posición 327 de SEC ID Nº:86.
Basado en homología, Pme1 se puede asignar a familia CAZy CE 8.
Como se ilustra debajo en el ejemplo 22, Pmel muestra actividad enzimática de pectin metilesterasa en sustratos, tal como pectina metilada (por ejemplo, la capacidad para hidrolizar pectina cítrica con un grado de metilación de 65 que lleva a la formación de ácido galacturónico no sustituido). 20
Las pectin metilesterasas catalizan la hidrólisis de grupos metilester de pectinas tales como los encontrados en las paredes celulares de plantas.
Pmel también posee homología significativa (aproximadamente 55% de aminoácidos 7 a 331 de Pmel) con una pectin metilesterasa de Emericella nidulans (número de registro Genbank. ABF50865.1; ver también Bauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:11417 (2006)). Basado en este grado de homología, se espera que Pmel muestre 25 actividad similar enzimática de pectin metilesterasa.
Arabinofuranosidasas
[0147] Ciertas proteínas de la presente divulgación poseen actividad enzimática de arabinofuranosidasa. 30
Los polipéptidos denominados aquí como Abf1 (SEC ID Nº:74) y Abf2 (SEC ID Nº:77) poseen actividad de arabinofuranosidasa.
[0148] La enzima Abf1 se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:73 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:75. 35
La secuencia de ácidos nucleicos Abf1 codifica una secuencia de 370 aminoácidos, representada aquí como SEC ID Nº:74.
El péptido señal para Abf1 está localizado de posición 1 a aproximadamente posición 22 de SEC ID Nº:74, con la proteína madura que abarca de aproximadamente posición 23 a posición 370 de SEC ID Nº:74.
Dentro de Abf1 hay dos dominios: un dominio catalítico (CD) y un dominio de unión a la celulosa (CBD). 40
La secuencia de aminoácidos con el CD de Abf1 abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 24 de SEC ID Nº:74 a un punto de finalización de aproximadamente posición 294 de SEC ID Nº:74.
La secuencia de aminoácidos con el CBD de Abf1 abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 339 de SEC ID Nº:74 a un punto de finalización de aproximadamente posición 370 de SEC ID Nº:74.
Basado en homología, Abf1 se puede asignar a familias CAZy CBM 1, CBM 13 y GH 62. 45
Como se ilustra debajo en el ejemplo 21, Abf1 muestra actividad enzimática de α-arabinofuranosidasa.
Abf1 También posee homología significativa (aproximadamente 70% de aminoácidos 19 a 322 de Abf1) con una arabinofuranosidasa de Streptomyces termoviolaceus (Genbank nº de registro JC7820; ver también Tsujibo et al., Biosci. Biotecnol. Biochem. 66:434 (2002)). Basado en este grado de homología, se espera que Abf1 muestre actividad similar enzimática de arabinofuranosidasa. 50
[0149] La enzima Abf2 se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos representada aquí como SEC ID Nº:76 y la secuencia de ADNc representada aquí como SEC ID Nº:78.
La secuencia de ácidos nucleicos Abf2 codifica una secuencia de 321 aminoácidos, representada aquí como SEC ID Nº:77. 55
El péptido señal para Abf2 está localizado de posición 1 a aproximadamente posición 19 de SEC ID Nº:77, con la proteína madura que abarca de aproximadamente posición 20 a posición 321 de SEC ID Nº:77.
Dentro de Abf2 hay un dominio catalítico (CD).
La secuencia de aminoácidos con el CD de Abf2 abarca de un punto de partida de aproximadamente posición 22 de SEC ID Nº:77 a un punto de finalización de aproximadamente posición 291 de SEC ID Nº:77. 60
Basado en homología, Abf2 se puede asignar a familia CAZy GH 62.
Como se ilustra debajo en el ejemplo 21, Abf2 muestra actividad enzimática de α-arabinofuranosidasa.
Abf2 también posee homología significativa (aproximadamente 75% de aminoácidos 21 a 315 de Abf2) con una arabinofuranosidasa de Streptomyces termoviolaceus (Genbank nº de registro JC7820; ver también Tsujibo et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 66:434 (2002)). Basado en este grado de homología, se espera que Abf2 muestre 65 actividad similar enzimática de arabinofuranosidasa.
[0150] Las propiedades físicas, las características bioquímicas y las especificidades de sustrato de las glicosidasas, pectato liasas, quitinasas, esterasas de carbohidrato, y arabinofuranosidasas de la presente divulgación se ilustran en tablas 15, 16, 17 y 18 por debajo.
Las características físicas y bioquímicas incluyen peso molecular, punto isoeléctrico, pH y temperatura óptimos de 5 actividad enzimática, y la estabilidad de las enzimas después de calentamiento a 50°C durante cinco horas a pH 5.0.
Las especificidades de sustrato que demuestran actividad enzimática para los sustratos indicados (específicos y no-específicos) fueron determinadas usando ensayos estándar conocidos en la técnica, tales como los descritos en los ejemplos por debajo.
10
Tabla 15: Propiedades físicas y bioquímicas de C1 enzimas
Enzima
SEC ID n.º PM (kDa) pl pH (50%) T °C (50%) Estabilidad de pH 5.0
Bgl3A
44 106 4.8 4.0 (2.5-7.0) 60 (45-70) 64%
Gal53A
47 30 8.2 4.5 (2.7-6.0) 55-60 (30-70) 100%
Gla15A
50 68 4.3 5.5 (3.5-7.0) 70 50%
Pel1
53 33 5,3 8.5 (7.8-8.8) 60-65 (30-70) 100% **
Chi18A
56 43 4.0 7.5 (5.7-8.7) 70 (60-75) 76%
Gls2A
59 80 6.6 5.9 (5.0-7.0) 70 (55-75) 100%
Axe3
62 35 6.5-6.8
FaeA1
65 25-40 3.5-4.0
FaeA2
68 29.1* 4.87*
FaeB2
71 29.3* 4.28*
Abf1
74 35 7.3 y 8.5-9.0
Abf2
77 33 4.5-5.0
Axe1
80 28* 7.2*
Axe2
83 27 6
Pme1
86 32.6* 8.79*
Abn1
89 32.8* 5.57*
Bx12
95 75.9* 4.8*
PM = peso molecular, kilodaltones (kDa) (* = predicho) Pl = punto isoeléctrico (* = predicho) pH (50%) = pH óptimo de actividad enzimática (gama de al menos 50% actividad) T °C (50%) = temperatura óptima de actividad enzimática (gama de al menos 50% actividad) Estabilidad de pH 5.0 = actividad enzimática residual después de incubación durante 3 horas a 50 °C, pH 5.0 ** pH 8.5, 1mM CaCl2
Tabla 16: Especificidades de sustrato de C1 enzimas (actividad hacia sustratos (unidades/mg))
Sustrato
Bgl3A Gal53A Pel1
CMC (ensayo S-N)
1.5 0 0
β-glucano de cebada
18 0 0
Glucuronoxilano de madera de abedul
0 0 0
Arabinoxilano de trigo
0 0 0
Xiloglucano de tamarindo
0 0 0
Laminarina (β-1,3 β-1,6)
109 0 0
Ácido poligalacturónico (RS)
0 0 70
Pectina cítrica (Viscosimetry; A235)
0 0 525*
Pectina cítrica (Etereficación 89%, A235)
0 0 82*
Pectina cítrica (Etereficación 65%, A235)
0 0 126*
Pectina cítrica (Etereficación 26%, A235)
0 0 133*
Galactano
0 620 0
Arabinano desramificado
0 97 0
Arabinano ramificado
0 90 0
Arabinogalactano
0 0 0
Galactomanano
0 0 0
p-NPh-β-D-celobiósido
0.03 0 0
p-NPh-β-D-lactósido
0 0 0
p-NPh-β-L-arabinofuranósido
0 0 0
p-NPh-β-L-arabinopiranósido
0 0 0
o-NPh-β-D-xilopiranósido
0 0 0
p-NPh-β-D-glucopiranósido
39 0 0
p-NPh-β-L-galactopiranósido
0 0 0
Celobiosa (β-1,4)
52 0 0
Laminaribiosa (β-1,3)
86 0 0
α-Soforosa (β-1,2)
50 0 0
Gentibiosa (β-1,6)
107 0 0
Maltosa
0 0 0
* C1 pectato liasa es una enzima dependiente de Ca+2, así que las actividades fueron medidas en 1 mM de CaCl2.
Tabla 17: Especificidades de sustrato de C1 Gla15A (actividad hacia sustratos (unidades/mg))
Sustrato
Actividad de glucoamilasa
Soluble de almidón (patata), NS*
150
Soluble de amilosa (patata), NS
87
Soluble de amilopectina (patata), NS
104
Pululano (Aureobasidium pullulans)
11
Insoluble de almidón (patata) NS
35
Insoluble de amilosa (patata), NS
59
Insoluble de amilopectina (patata), NS
43
Maltose**
18
Isomaltose**
1.2
Maltotriose**
48
Maltohexaose**
61
pNph-α-D-glucopiranósido
0
Tabla 18: Especificidades de sustrato C1 enzimas (actividad hacia sustratos (unidades/mg)) 5
Sustrato
Chi18A Gls2A
Quitosano soluble, 140kDa
35 28
Coloide de quitina
8 0
CMC
0 0
β-glucano
0 0
Glucuronoxilano de madera de abedul
0 0
p-NPh-β-D-N-acetilglucosamina
0.1 0
Quitosano, 140kDa viscometría
210 0
[0151] Las dependencias de pH y temperatura de ciertas enzimas de la presente divulgación se ilustran en tablas 19 y 20 por debajo. Las dependencias de pH y temperatura fueron determinadas usando los ensayos estándar con el sustrato y condiciones enumerados por debajo:
Enzima
pH Temperatura
Bgl3A Gla15A Chi18A Gls2A Ga153A1 Ga153A2 Pell
p-NPh-β-D-glucopiranósido Almidón de patata, 50°C, 10 minutos Quitina coloidal, 50°C, 10 minutos Quitosano (140 kD), 50°C, 10 minutos Arabinano ramificado, 50°C, 10 minutos Galactano, 50°C, 10 minutos A235, PGA + 1 mM CaCl2 celobiosa Almidón de patata, pH 5.0,10 minutos Quitosano (140 kD), pH 5.0, 10 minutos Quitosano (140 kD), pH 5.0, 10 minutos Arabinano ramificado, pH 5.0, 10 minutos No aplicable A235, PGA + 1 mM CaCl2
[0152] La temperatura/pH que mostró la actividad enzimática máxima fue ajustada a 100% en las tablas por debajo, con los valores restantes expresando un porcentaje de este estándar.
Las dependencias de pH y temperatura de ciertas enzimas son también ilustradas gráficamente en las Figuras 9 y 10, respectivamente. 5
Tabla 19: Dependencia de pH de C1 enzimas (% actividad)
pH
Bgl3A Gla15 A Chi18A Gls2 a pH Gal 53A1 pH Gal 53A 2 pH Pel1
2.0
2
2.6
50 37 2.45 39.5 2.9 0.3
3.0
70 43 2 0 2.73 55.6 3.51 26.5
3.5 3
90 51 2 3 3.5 70.4 4.22 93.9 7.25 2.8
4.0
100 78 2 10.3 4.05 89.3 4.62 97.4 7.75 41.9
4.5 7
98 90 8 40 4.5 100.0 4.90 97.7 8.05 70.5
5.0
93 97 20 50 4.95 75.6 5.45 100 8.18 88.8
5.5
83 100 30 64 5.5 70.6 6.02 95.8 8.42 100
6.0
72 96 57 100 6.02 48.2 6.51 91.6 8.88 49.6
6.5
58 83 62 65 6.47 34.5 7.03 71.9 8.99 33
7.0
47 50 83 37.8 7.03 19.8 7.50 51.7 9.5 5
7.5
30 25 100 7.5 17.8 8.00 42.2
8
17 1 98 9.04 17.1 9.11 1.7
9
25
Tabla 20: Dependencia de temperatura de C1 enzimas (% actividad)
Temp °C
Bgl3A Gla15 A Chi18A Gls2 a Gal 53A1 Temp °C Pel1
25
10 21 6.9
30
10 20 15 46.6 30 15.2
35
18 21 18
40
36 20 25 22 80.3 39 29.6
45
48 19 36 32 47 51.5
50
65 20 40 43 92.1
55
95 44 42 53 56 82.5
60
100 62 47 60 100 61 100
65
80 88 60 80 97.1 67 94.8
70
48 100 100 100 59.8 72 33.9
75
15 5 53 53
80
12 15
85
90
[0153] Más específicamente, una proteína aislada, tal como una enzima según la presente invención, es una 10 proteína (incluyendo un polipéptido o péptido) que se ha quitado de su ambiente natural (es decir, que ha sido sometida para manipulación humana) y puede incluir proteínas purificadas, proteínas parcialmente purificadas, proteínas recombinantemente producidas, proteínas sintéticamente producidas, proteínas complejas con lípidos, proteínas solubles, y proteínas aisladas asociadas a otras proteínas, por ejemplo.
Como tal, "aislado" no refleja hasta qué punto la proteína ha sido purificada. 15
Preferiblemente, una proteína aislada de la presente invención es producida recombinantemente.
Además, y a modo de ejemplo, una " proteína de C. lucknowens" o "enzima de C. lucknowens" se refiere a una proteína (generalmente incluyendo un homólogo de una proteína de origen natural) de Chrysosporium lucknowense
o a una proteína que ha sido de otro modo producida del conocimiento de la estructura (por ejemplo, secuencia) y quizás la función de una proteína de origen natural de Chrysosporium lucknowense.
En otras palabras, una proteína C. lucknowens incluye cualquier proteína que tiene estructura sustancialmente similar y función de una proteína C. lucknowens de origen natural o que es un homólogo biológicamente activo (es decir, tiene actividad biológica) de una proteína de origen natural de C. lucknowens como se describe en detalle 5 aquí.
Como tal, una proteína C. lucknowens puede incluir proteínas purificadas, parcialmente purificadas, recombinantes, mutadas/modificadas y sintéticas.
Aquí, los términos "modificación" y "mutación" se pueden usar de forma intercambiable, particularmente con respecto a las modificaciones/mutaciones a la secuencia de aminoácidos de una proteína C. lucknowens (o 10 secuencias de ácidos nucleicos) descrita aquí.
Una proteína aislada según la presente invención puede ser aislada de su fuente natural, producida recombinantemente o producida sintéticamente.
[0154] Aquí, los términos "modificación" y "mutación" se pueden usar de forma intercambiable, particularmente con 15 respecto a las modificaciones/mutaciones a las secuencias de aminoácidos primarias de una proteína o un péptido (o secuencias de ácidos nucleicos) descrito aquí.
El término "modificación" también puede usarse para describir modificaciones postraduccionales a una proteína o péptido incluyendo, pero no limitado a, metilación, farnesilación, carboximetilación, geranilación de geranilo, glicosilación, fosforilación, acetilación, miristoilación, prenilación, palmitación, y/o amidación. 20
Modificaciones también pueden incluir, por ejemplo, complexar una proteína o péptido con otro compuesto.
Tales modificaciones se pueden considerar mutaciones, por ejemplo, si la modificación es diferente a la modificación postraduccional que ocurre en la proteína natural tipo salvaje o péptido.
[0155] Como se utiliza en este caso, el término "homólogo" se utiliza para referirse una proteína o péptido que difiere 25 de una proteína o péptido de origen natural (es decir, la proteína "prototipo" o "tipo salvaje" ) por modificaciones menores a la proteína de origen natural o péptido, pero que mantiene la proteína básica y estructura de cadena lateral de la forma de origen natural.
Tales cambios incluyen, pero de forma no limitativa: cambios en una o algunas cadenas laterales de aminoácido; cambios en uno o algunos aminoácidos, incluyendo deleciones (por ejemplo, una versión truncada de la proteína o 30 péptido), inserciones y/o sustituciones; cambios en la estereoquímica de uno o algunos átomos; y/o derivaciones menores, incluyendo pero no limitado a: metilación, glicosilación, fosforilación, acetilación, miristoilación, prenilación, palmitación, amidación y/o adición de inositol de glicosilfosfatidilo.
Un homólogo puede tener bien propiedades mejoradas, disminuidas, o sustancialmente similares en comparación con la proteína o péptido de origen natural. 35
Un homólogo puede incluir un agonista de una proteína o un antagonista de una proteína.
[0156] Los homólogos pueden ser el resultado de variación alélica natural o mutación natural.
Una variante alélica de origen natural de un ácido nucleico que codifica una proteína es un gen que ocurre a esencialmente lo mismo locus (o loci) en el genoma que el gen que codifica tal proteína, pero que, debido a 40 variaciones naturales provocadas por, por ejemplo, mutación o recombinación, tiene una secuencia similar pero no idéntica.
Las variantes alélicas típicamente codifican proteínas con actividad similar a la de la proteína codificada por el gen al que éstas son comparadas.
Una clase de variantes alélicas pueden codificar la misma proteína pero tener secuencias de ácidos nucleicos 45 diferentes debido a la degeneración del código genético.
Las variantes alélicas también pueden comprender alteraciones en las regiones no traducidas 5' o 3' del gen (por ejemplo, en las regiones de control regulador).
Las variantes alélicas son conocidas por los expertos en la técnica.
50
[0157] Los homólogo se pueden producir usando técnicas conocidas en la técnica para la producción de proteínas incluyendo, pero no limitado a, modificaciones directas a la proteína de origen natural aislada, síntesis de proteína directa, o modificaciones a la secuencia de ácidos nucleicos que codifican la proteína usando, por ejemplo, técnicas de ADN recombinantes o clásicas para efectuar mutagénesis aleatoria o prevista.
55
[0158] Las modificaciones en la proteína homóloga, en comparación con la proteína tipo salvaje, bien agonizan, antagonizan o sustancialmente no cambian la actividad biológica básica del homólogo en comparación con la proteína de origen natural.
Las modificaciones de una proteína, tal es como en un homólogo, pueden suponer proteínas con la misma actividad biológica que la proteína de origen natural, o en proteínas con actividad biológica disminuida o aumentada en 60 comparación con la proteína de origen natural.
Las modificaciones que suponen una reducción en la expresión de proteína o una reducción en la actividad de la proteína se pueden llamar inactivación (completa o, parcial) reducción, o acción disminuida de una proteína.
De forma similar, modificaciones que suponen un aumento en la expresión de proteína o un aumento en la actividad de la proteína, se puede llamar amplificación, sobreproducción, activación, realce, sobre-regulación o acción 65 aumentada de una proteína.
[0159] Según la presente divulgación, una proteína aislada, incluyendo un homólogo biológicamente activo o fragmento del mismo, tiene al menos una característica de actividad biológica de una proteína tipo salvaje o de origen natural.
Como se ha mencionado anteriormente, en general, la actividad biológica o acción biológica de una proteína se 5 refiere a cualquier función(s) mostrada o realizada por la proteína que se asigna a la forma de origen natural de la proteína como medida u observada in vivo (es decir, en el ambiente fisiológico natural de la proteína) o in vitro (es decir, bajo condiciones de laboratorio).
La actividad biológica de una proteína de la presente divulgación puede incluir una actividad enzimática (actividad catalítica y/o actividad de unión de sustrato), tal como actividad de celulasa, actividad de hemicelulasa, actividad de 10 β-glucanasa, actividad de β-glucosidasa, actividad de α-galactosidasa, actividad de β-galactosidasa, actividad de xilanasa o cualquiera otra actividad descrita aquí.
Las actividades biológicas específicas de las proteínas descritas aquí son descritas en detalle por encima y en los ejemplos.
Los métodos de la detección y medición de la actividad biológica de una proteína de la invención y divulgación 15 incluyen, pero de forma no limitativa, los ensayos descritos en la sección de ejemplos por debajo.
Tales ensayos incluyen, pero de forma no limitativa, medición de actividad enzimática (por ejemplo, actividad catalítica), medición de unión de sustrato, y similares.
Cabe señalar que una proteína aislada de la presente divulgación (incluyendo homólogos) no tiene por qué tener una actividad biológica tal como actividad catalítica. 20
Una proteína puede ser un proteína truncada, mutada o inactiva, o falta al menos una actividad de la enzima tipo salvaje, por ejemplo.
Las proteínas inactivas pueden ser útiles en algunos ensayos de selección, por ejemplo, o para otros fines tales como producción de anticuerpos.
25
[0160] Los métodos para medir niveles de expresión de proteína de una proteína según la invención y divulgación incluyen, pero de forma no limitativa: transferencia de Western, inmunocitoquímica, citometría de flujo u otros ensayos basados en inmunología; ensayos basados en una propiedad de la proteína incluyendo pero no limitado a, unión de ligandos o interacción con otros socios de proteína.
Los ensayos de unión son también bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, una máquina de BIAcore puede 30 utilizarse para decidir la constante de unión de un complejo entre dos proteínas.
El constante de disociación para el complejo se puede determinar mediante el control de cambios en el índice de refracción respecto al tiempo conforme el búfer se pasa sobre el chip (O'Shannessy et al. Anal. Biochem. 212:457-468 (1993); Schuster et al., Nature 365:343-347 (1993)). Otros ensayos adecuados para medir la unión de una proteína a otra incluyen, por ejemplo, inmunoensayos tales como ensayos inmunoabsorbentes enlazados 35 enzimáticos (ELISA) y radioinmunoanálisis (RIA), o determinación de la unión por el control del cambio en las propiedades espectroscópicas u ópticas de las proteínas a través de fluorescencia, absorción de UV, dicroismo circular, o resonancia magnética nuclear (RMN).
[0161] La enzima y proteína de la presente invención pueden ser un objetivo deseable para modificación y uso en 40 los procesos descritos aquí.
La proteína ha sido descrita en términos de función y secuencia de aminoácidos (y secuencia de ácidos nucleicos que los codifican) de la proteína de tipo salvaje representativa.
En una forma de realización de la invención, homólogos de la proteína (que puede incluir proteínas relacionadas de otros organismos o formas modificadas de la proteína dada) se incluyen para su uso en la invención. 45
Los homólogos de una proteína encerrada por la presente invención pueden comprender, consistir esencialmente en, o consistir en, en una forma de realización, una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica, y más preferiblemente al menos aproximadamente 95% idéntica, y más preferiblemente al menos aproximadamente 96% idéntica, y más preferiblemente al menos aproximadamente 97% idéntica, y más preferiblemente al menos aproximadamente 98% idéntica, y más preferiblemente al menos aproximadamente 99% idéntica, a una secuencia 50 de aminoácidos descrita aquí que representa la secuencia de aminoácidos de una enzima o proteína según la invención (incluyendo un dominio biológicamente activo de una proteína en toda su longitud).
Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del homólogo tiene una actividad biológica del tipo salvaje o proteína de referencia o de un dominio biológicamente activo de la misma (por ejemplo, un dominio catalítico).
55
[0162] En una forma de realización, una proteína de la presente invención comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de aminoácidos que es menos un 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº:32 (es decir, un homóloga).
En otro aspecto de la invención, un homólogo según la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos que es menos de aproximadamente 99% idéntica a cualquiera de tales secuencias de aminoácidos, y en otra forma de 60 realización, es inferior a aproximadamente 98% idéntica a cualquiera de tales secuencias de aminoácidos, y en otra forma de realización, es inferior a aproximadamente 97% idéntica a cualquiera de tales secuencias de aminoácidos, y en otra forma de realización, es inferior a aproximadamente 96% idéntica a cualquiera de tales secuencias de aminoácidos, y en otra forma de realización, es inferior a aproximadamente 95% idéntica a cualquiera de tales secuencias de aminoácidos, y en otra forma de realización, es inferior a aproximadamente 94% idéntica a cualquiera 65 de tales secuencias de aminoácidos, y en otra forma de realización, es inferior a aproximadamente 93% idéntica a
cualquiera de tales secuencias de aminoácidos, y en otra forma de realización, es inferior a aproximadamente 92% idéntica a cualquiera de tales secuencias de aminoácidos, y en otra forma de realización, es inferior a aproximadamente 91% idéntica a cualquiera de tales secuencias de aminoácidos.
[0163] Como se utiliza en este caso, a menos que se especifique lo contrario, la referencia a un porcentaje (%) de 5 identidad se refiere una evaluación de homología que es realizada utilizando: (1) una búsqueda de homología BLAST 2.0 Basic BLAST que usa blastp para buscar aminoácidos y blastn para buscar ácido nucleico con parámetros por defecto estándar, donde la secuencia de pregunta se filtra para regiones de baja complejidad por defecto (descrita en Altschul, S.F., Madden, T.L., Schääffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search program." Nucleic Acids Res. 10 25:3389-3402); (2) una alineación de BLAST 2 (utilizando los parámetros descritos debajo); (3) PSI-BLAST con los parámetros por defecto estándar (Position-Specific Iterated BLAST; y/o (4) homología CAZy determinada utilizando parámetros por defecto estándar de la base de datos de enzimas activas de carbohidrato (Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach.
En "Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering", H.J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat and B. Svensson eds., 15 The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12).
[0164] Cabe señalar que debido a algunas diferencias en los parámetros estándar entre BLAST 2.0 Basic BLAST y BLAST 2, dos secuencias específicas se pueden reconocer como con homología significativa usando el programa de explosión 2, mientras que una búsqueda realizada en lBLAST 2.0 Basic BLAST usando una de las secuencias 20 como la secuencia de pregunta no pueden identificar la segunda secuencia en las coincidencias principales.
Además, PSI-BLAST proporciona una versión automatizada fácil de utilizar de una búsqueda de "perfil", que es una forma sensible para buscar homólogos de secuencia.
El primer programa ejecuta una búsqueda de base de datos BLAST distanciada.
El programa de PSI-BLAST usa la información de cualquier alineamiento significativo devuelto para la construcción 25 de una matriz de puntuación específica de posición, que reemplaza la secuencia de pregunta para la siguiente ronda de búsqueda de base de datos.
Por lo tanto, debe entenderse que identidad en porcentaje se puede determinar usando cualquiera de estos programas.
30
[0165] Dos secuencias específicas se pueden alinear una a otra usando secuencia de BLAST 2 como se describe en Tatusova and Madden, (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250.
Alineación de secuencia de BLAST 2 se realiza en blastp o blastn usando el algoritmo de BLAST 2.0 para ejecutar una búsqueda de explosión distanciada (BLAST 2.0) entre las dos secuencias que permiten la introducción de 35 huecos (deleciones e inserciones) en la alineación resultante.
Para fines de claridad aquí, una alineación de secuencia de BLAST 2 es realizada utilizando los parámetros por defecto estándar de la siguiente manera.
Para blastn, usando matriz 0 BLOSUM62:
Recompensa por correspondencia = 1 40
Penalización por no correspondencia = -2
Penalizaciones por hueco abierto (5) y hueco de extensión (2)
Hueco x_dropoff (50) espera (10) tamaño de palabra (11) filtro (on)
Para BLASTP, usando matriz 0 BLOSUM62:
Penalizaciones por hueco abierto (11) y hueco de extensión (1) 45
Hueco x_dropoff (50) espera(10) tamaño de palabra (3) filtro (on).
[0166] Una proteína de la presente divulgación puede también incluir proteínas con una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos de cualquiera de las secuencias descritas aquí (es decir, 10 residuos de aminoácidos contiguos con 100% identidad con 10 aminoácidos contiguos de SEC ID Nº:2). 50
En otras formas de realización, un homólogo de una secuencia de aminoácidos de proteína incluye secuencias de aminoácidos que comprenden al menos 20, o al menos 30, o al menos 40, o al menos 50, o al menos 75, o al menos 100, o al menos 125, o al menos 150, o al menos 175, o al menos 150, o al menos 200, o al menos 250, o al menos 300, o al menos 350 residuos de aminoácidos contiguos de cualquiera de la secuencia de aminoácidos representada aquí descrita 55
Incluso pequeños fragmentos de proteínas sin actividad biológica son útiles en la presente divulgación, por ejemplo, en la preparación de anticuerpos contra la proteína en toda su longitud o en un ensayo de selección (por ejemplo, un ensayo de unión).
Fragmentos también pueden usarse para construir proteínas de fusión, por ejemplo, donde la proteína de fusión comprende dominios funcionales de dos o más proteínas diferentes (por ejemplo, un CBD de una proteína enlazada 60 a un CD de otra proteína).
En una forma de realización, un homólogo tiene una actividad biológica que se puede medir o detectar asociada a la proteína tipo salvaje (por ejemplo, actividad enzimática).
[0167] Como se utiliza en este caso, el término "contiguo" o "consecutivo", con respecto a secuencias de ácido 65 nucleico o aminoácidos descritas aquí, significa estar conectado una secuencia ininterrumpida.
Por ejemplo, que una primera secuencia comprenda 30 aminoácidos contiguos (o consecutivos) de una segunda secuencia, significa que la primera secuencia incluye una secuencia ininterrumpida de 30 residuos de aminoácidos que es 100% idéntica a una secuencia ininterrumpida de 30 residuos de aminoácidos en la segunda secuencia.
De forma similar, que una primera secuencia tenga "100% identidad" con una segunda secuencia significa que la primera secuencia iguala exactamente la segunda secuencia sin espacios entre nucleótidos o aminoácidos. 5
[0168] En otra forma de realización, una proteína de la presente divulgación, incluido un homólogo, incluye una proteína con una secuencia de aminoácidos que es suficientemente similar a la secuencia de aminoácidos natural que una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el homólogo es capaz de hibridar bajo condiciones de astringencia moderadas, altas o muy altas (descritas abajo) a (es decir con) una molécula de ácido nucleico que 10 codifica la proteína natural (es decir, al complemento de la cadena de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos natural).
Preferiblemente, un homólogo de una proteína de la presente divulgación se codifica por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza bajo condiciones de astringencia bajas, moderadas o altas al complemento de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína que comprende, 15 que consiste esencialmente en, o que consiste en una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de: SEC ID Nº:2, SEC ID Nº:5, SEC ID Nº:8, SEC ID Nº:11, SEC ID Nº:14, SEC ID Nº:17, SEC ID Nº:20, SEC ID Nº:23, SEC ID Nº:26, SEC ID Nº:29, SEC ID Nº:32, SEC ID Nº:35, SEC ID Nº:38, SEC ID Nº:41, SEC ID Nº:44, SEC ID Nº:47, SEC ID Nº:50, SEC ID Nº:53, SEC ID Nº:56, SEC ID Nº:59, SEC ID Nº:62, SEC ID Nº:65, SEC ID Nº:68, SEC ID Nº:71, SEC ID Nº:74, SEC ID Nº:77, SEC ID Nº:80, SEC ID Nº:83, SEC ID Nº:86, SEC ID Nº:89, SEC ID Nº:92, o 20 SEC ID Nº:94.
Tales condiciones de hibridación son descritas en detalle por debajo.
[0169] Un complemento de secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de la presente invención se refiere a la secuencia de ácidos nucleicos de la cadena de ácido nucleico que 25 es complementaria a la cadena que codifica la proteína.
Será apreciado que un ADN bicatenario que codifica una secuencia de aminoácidos dada comprende un ADN monocatenario y su cadena complementaria tiene una secuencia que es un complemento al ADN monocatenario.
Como tal, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser bien bicatenarias o monocatenarias.
Los métodos para deducir una secuencia complementaria se conocen por los expertos en la técnica. Debe 30 observarse que ya que las tecnologías de secuenciación de ácido nucleico no son totalmente sin errores, las secuencias presentadas aquí, como mucho, representan secuencias aparentes de las proteínas de la presente invención.
[0170] Como se utiliza en este caso, la referencia a condiciones de hibridación se refiere a condiciones de 35 hibridación estándar bajo las que moléculas de ácido nucleico se utilizan para identificar moléculas de ácido nucleico similares.
Tales condiciones estándar se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989.
Sambrook et al., ibid. (ver específicamente, páginas 9.31-9.62). 40
Además, las fórmulas para calcular la hibridación apropiada y condiciones de lavado para conseguir la hibridación que permite grados variables de desapareamiento de nucleótidos se describe, por ejemplo, en Meinkoth et al., 1984, Anal. Biochem. 138, 267-284; Meinkoth et al., ibid..
[0171] Más particularmente, las condiciones de hibridación de astringencia y lavado moderadas, como denominado 45 en este caso, se refiere a condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácido nucleico con al menos aproximadamente un 70% en identidad de secuencia de ácidos nucleicos con la molécula de ácido nucleico siendo usada para sondar en la reacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten aproximadamente 30% o menos de desapareamiento de nucleótidos).
Hibridación de astringencia alta y condiciones de lavado, como denominado en este caso, se refiere a condiciones 50 que permiten aislamiento de moléculas de ácido nucleico con al menos aproximadamente 80% en identidad de secuencia de ácidos nucleicos con la molécula de ácido nucleico siendo usada para sondar en la reacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten aproximadamente 20% o menos de desapareamiento de nucleótidos).
Condiciones de hibridación de astringencia y lavado muy altas, como denominado en este caso, se refiere a 55 condiciones que permiten aislamiento de moléculas de ácido nucleico con al menos aproximadamente 90% en identidad de secuencia de ácidos nucleicos con la molécula de ácido nucleico usada para sondar en la reacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten aproximadamente 10% o menos de desapareamiento de nucleótidos).
Como se ha mencionado anteriormente, un experto en la técnica puede usar las fórmulas en Meinkoth et al., ibid. 60 para calcular las condiciones de hibridación de astringencia y lavado para conseguir estos niveles particulares de desapareamiento de nucleótido.
Tales condiciones variarán, dependiente de si híbridos ADN:ARN o ADN:ADN son formados.
Las temperaturas de fusión calculadas para híbridos de ADN:ADN son 10°C menos que para híbridos de ADN:ARN.
En formas de realización particulares, las condiciones de hibridación astringentes para híbridos de ADN:ADN 65 incluyen hibridación a una fuerza iónica de 6X SSC (0.9 M Na+) a una temperatura de entre aproximadamente 20°C
y aproximadamente 35°C (astringencia inferior), más preferiblemente, entre aproximadamente 28°C y aproximadamente 40°C (más astringencia), e incluso más preferiblemente, entre aproximadamente 35°C y aproximadamente 45°C (aún más astringencia), con condiciones de lavado apropiadas.
En formas de realización particulares, las condiciones de hibridación astringentes para híbridos de ADN:ARN incluyen hibridación a una fuerza iónica de 6X SSC (0.9 M Na+) a una temperatura de entre aproximadamente 30°C 5 y aproximadamente 45°C, más preferiblemente, entre aproximadamente 38°C y aproximadamente 50°C, e incluso más preferiblemente, entre aproximadamente 45°C y aproximadamente 55°C, con condiciones de lavado similarmente astringentes.
Estos valores se basan en cálculos de una temperatura de fusión para moléculas mayor a aproximadamente 100 nucleótidos, 0% formamida y un contenido de G + C de aproximadamente 40%. 10
Alternativamente, Tm se puede calcular empíricamente como se expone en Sambrook et al., supra, páginas 9.31 a 9.62.
En general, las condiciones de lavado deberían ser tan astringentes como sea posible, y deberían ser apropiadas para las condiciones de hibridación elegidas.
Por ejemplo, las condiciones de hibridación pueden incluir una combinación de condiciones de sal y temperatura que 15 están aproximadamente 20-25°C por debajo del Tm calculado de un híbrido particular, y las condiciones de lavado típicamente incluyen una combinación de condiciones de temperatura y sal que están aproximadamente 12-20°C por debajo del Tm calculado del híbrido particular.
Un ejemplo de condiciones de hibridación adecuadas para el uso con híbridos de ADN:ADN incluye una hibridación de 2-24 horas en 6X SSC (50% formamida) en alrededor de 42°C, seguido de pasos de lavado que incluyen uno o 20 varios lavados a temperatura ambiente en aproximadamente 2X SSC, seguido de lavados adicionales a temperaturas más altas y fuerza iónica inferior (por ejemplo, al menos un lavado a aproximadamente 37°C en aproximadamente 0.1X-0.5X SSC, seguido de al menos un lavado a alrededor de 68°C en aproximadamente 0.1X-0.5X SSC).
25
[0172] El tamaño mínimo de una proteína y/o homólogo de la presente divulgación es un tamaño suficiente para tener actividad biológica o, cuando no se requiere que la proteína tenga tal actividad, suficiente para ser útil para otro fin asociado a una proteína de la presente divulgación, tal como para la producción de anticuerpos que enlazan con una proteína de origen natural.
En una forma de realización, la proteína de la presente divulgación es al menos 20 aminoácidos de longitud, o al 30 menos aproximadamente 25 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 30 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 40 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 60 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 70 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 80 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 90 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 125 35 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 150 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 175 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 200 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 250 aminoácidos de longitud, etcétera hasta un longitud total de cada proteína, e incluyendo cualquier tamaño entremedias en incrementos de un número entero completo (un ácido de amino).
No hay límite, más allá de un límite práctico, en el tamaño máximo de tal proteína ya que la proteína puede incluir 40 una porción de una proteína o una proteína en toda su longitud, más secuencia adicional (por ejemplo, una secuencia de proteína de fusión), si se desea.
[0173] La presente invención también incluye una proteína de fusión que incluye una proteína de la presente invención (incluyendo un homólogo) fijada a uno o varios segmentos de fusión, que son típicamente heterólogos en 45 la secuencia a la secuencia de proteína (es decir, diferente a la secuencia de proteína).
Los segmentos de fusión adecuados para el uso con la presente invención incluyen, pero de forma no limitativa, segmentos que pueden: mejorar una estabilidad de la proteína; proporcionar otra actividad biológica deseable; y/o asistir con la purificación de la proteína (por ejemplo, por cromatografía de afinidad).
Un segmento de fusión adecuado puede ser un dominio de cualquier tamaño que tiene la función deseada (por 50 ejemplo, imparte estabilidad aumentada, solubilidad, acción o actividad biológica; y/o simplifica la purificación de una proteína).
Los segmentos de fusión se pueden unir a terminales de amino y/o carboxilo del dominio de una proteína de la presente invención y pueden ser susceptibles de escisión para permitir la recuperación sencilla de la proteína.
Las proteínas de fusión son preferiblemente producidas por el cultivo de una célula recombinante modificada con 55 una molécula de ácido nucleico de fusión que codifica una proteína con el segmento de fusión fijado al carboxilo y/o al extremo de amino terminal de un dominio de una proteína de la presente invención.
Por consiguiente, las proteínas de la presente invención también incluyen productos de expresión de fusiones de gen (por ejemplo, usados para sobre expresar formas solubles activas de la proteína recombinante), de genes mutagenizados (tales como genes con modificaciones de codón para mejorar la transcripción y movimiento de gen), 60 y de genes truncados (tales como genes con dominios de unión de membrana quitados para generar formas solubles de una proteína de membrana, o genes con secuencias de señal quitados que son tolerados mal en un huésped recombinante particular).
[0174] En una forma de realización de la presente invención, cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas aquí se pueden producir con al menos uno, y hasta aproximadamente 20, aminoácidos heterólogos adicionales que flanquean cada una de las extremidades C- y/o N-terminales de la secuencia de aminoácidos específica.
La proteína o polipéptido resultante se puede referir como "que consta esencialmente de" la secuencia de aminoácidos específica. 5
Según la presente invención, los aminoácidos heterólogos son una secuencia de aminoácidos que no son naturalmente descubiertos (es decir, no se encuentran en la naturaleza, in vivo) flanqueando la secuencia de aminoácidos específica, o que no se relacionan con la función de la secuencia de aminoácidos específica, o que no se codifican los nucleótidos que flaquean la secuencia de ácidos nucleicos que codifican el origen natural de la secuencia de aminoácidos específica como ocurre en el gen, si tales nucleótidos en la secuencia de origen natural 10 fueron traducidas usando el codón estándar para el organismo del cual la secuencia de aminoácidos dada es derivada.
[0175] La presente invención también proporciona combinaciones enzimáticas que descomponen material de lignocelulosa. 15
Tales combinaciones o mezclas enzimáticas puede incluir una composición de multienzima que contiene al menos la proteína de la presente invención en combinación con una o varias proteínas adicionales de la presente divulgación o una o varias enzimas u otras proteínas de otros microorganismos, plantas, u organismos similares.
Combinaciones de enzima sinergística y métodos relacionados son contemplados.
La divulgación incluye métodos identificando las proporciones óptimas y composiciones de enzimas con el cual 20 degradar cada material lignocelulósico.
Estos métodos implican pruebas identificando la composición enzimática óptima y proporciones para la conversión eficaz de cualquier sustrato lignocelulósico a su azúcares constituyentes.
Los ejemplos inferiores incluyen ensayos que se pueden utilizar para identificar proporciones óptimas y composiciones de enzimas con las que degradar materiales lignocelulósicos. 25
[0176] Cualquier combinación de las proteínas descrita aquí es adecuada para su uso en las composiciones de multienzima de la presente divulgación.
Debido a la naturaleza compleja de más fuentes de biomasa, que pueden contener xilano, lignina, proteína, y carbohidratos, entre otros componentes, las combinaciones de enzima preferida pueden contener enzimas con una 30 gama de especificidades de sustrato que trabajan en conjunto para degradar biomasa en azúcares fermentables de la manera más eficaz.
Un ejemplo de un complejo de multienzima para sacarificación de lignocelulosa es una mezcla de celobiohidrolasa(s), xilanasa(s), endoglucanasa(s), β-glucosidasa(s), β-xilosidasa(s), y enzimas accesorias.
Sin embargo, debe entenderse que las enzimas descritas específicamente aquí se pueden combinar con cualquiera 35 de una o varias de las enzimas descritas aquí o con cualquiera de las otras enzimas disponibles y adecuadas, para producir una composición de multienzima.
La divulgación no está restringida o limitada a las combinaciones ejemplares específicas enumeradas por debajo.
[0177] En una forma de realización, la celobiohidrolasa(s) comprenden entre aproximadamente 30% y 40 aproximadamente 90% o entre aproximadamente 50% y aproximadamente 70% de las enzimas en la composición, y más preferiblemente, entre aproximadamente 55% y 65%, y más preferiblemente, aproximadamente 60% de las enzimas en la composición (incluyendo cualquier porcentaje entre 50% y 70% en incrementos de 0.5% (por ejemplo, 50%, 50.5%, 51%, etc.).
45
[0178] En una forma de realización, la xilanasa(s) comprende entre aproximadamente 10% y aproximadamente 30% de las enzimas en la composición, y más preferiblemente, entre aproximadamente 15% y aproximadamente 25%, y más preferiblemente, aproximadamente 20% de las enzimas en la composición (incluyendo cualquier porcentaje entre 10% y 30% en incrementos de 0.5%).
50
[0179] En una forma de realización, la endoglucanasa(s) comprenden entre aproximadamente 5% y aproximadamente 15% de las enzimas en la composición, y más preferiblemente, entre aproximadamente 7% y aproximadamente 13%, y más preferiblemente, aproximadamente 10% de las enzimas en la composición (incluyendo cualquier porcentaje entre 5% y 15% en 0.5% incrementos).
55
[0180] En una forma de realización, la β-glucosidasa(s) comprenden entre aproximadamente 1% y aproximadamente 5% de las enzimas en la composición, y preferiblemente entre aproximadamente 2% y 4%, y más preferiblemente, aproximadamente 3% de las enzimas en la composición (incluyendo cualquier porcentaje entre 1% y 5% en incrementos de 0.5%).
60
[0181] En una forma de realización, la β-xilosidasa(s) comprende entre aproximadamente 1% y aproximadamente 3% de las enzimas en la composición, y preferiblemente, entre aproximadamente 1.5% y aproximadamente 2.5%, y más preferiblemente, aproximadamente 2% de las enzimas en la composición (incluyendo cualquier porcentaje entre 1% y 3% en incrementos de 0.5%.
65
[0182] En una forma de realización, las enzimas accesorias comprenden entre aproximadamente 2% y aproximadamente 8% de las enzimas en la composición, y preferiblemente, entre aproximadamente 3% y aproximadamente 7%, y más preferiblemente, aproximadamente 5% de las enzimas en la composición (incluyendo cualquier porcentaje entre 2% y 8% en incrementos de 0.5%.
5
[0183] Un ejemplo particularmente preferido de un complejo de multienzima para sacarificación de lignocelulosa es una mezcla de aproximadamente 60% celobiohidrolasa(s), aproximadamente 20% xilanasa(s), aproximadamente 10% endoglucanasa(s), aproximadamente 3% β-glucosidasa(s), aproximadamente 2% β-xilosidasa(s) y aproximadamente 5% enzima(s) accesoria.
10
[0184] La composición de multienzima puede comprender al menos una celobiohidrolasa.
En algunas formas de realización, la celobiohidrolasa puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID Nº:2, SEC ID Nº:5, SEC ID Nº:8 SEC ID Nº:11 o una proteína de fusión homóloga, o fragmento de la misma que tiene actividad de celobiohidrolasa.
Las composiciones que comprenden al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más celobiohidrolasas se contemplan en la 15 divulgación.
[0185] La composición de multienzima puede comprender al menos una endoglucanasa.
En formas de realización determinadas, la endoglucanasa puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID n.º: 14, SEC ID Nº:94, SEC ID Nº:17, SEC ID Nº:20 o SEC ID Nº:23 o una proteína de fusión homóloga, o 20 fragmento de lo mismo que tiene actividad de endoglucanasa.
Las composiciones que comprenden al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más endoglucanasas se contemplan en la divulgación.
[0186] La composición de multienzima puede comprender al menos una xilanasa. 25
En algunas formas de realización, la xilanasa puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID Nº:26, SEC ID Nº:29, SEC ID Nº:32, SEC ID Nº:35, SEC ID Nº:38 o SEC ID Nº:41 o una proteína de fusión homóloga o fragmento de la misma que tiene actividad de xilanasa.
Composiciones que comprenden al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más xilanasas se contemplan en la divulgación. 30
[0187] La composición de multienzima puede comprender además β-glucosidasa.
En una forma de realización, la β-glucosidasa puede tener una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº:44 o una proteína de fusión homóloga o fragmento de la misma que tiene actividad de β-glucosidasa.
Composiciones que comprenden al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más β-glucosidasas se contemplan en la 35 divulgación.
[0188] La composición de multienzima puede comprender además hemicelulasa.
En formas de realización determinadas, la hemicelulasa puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID Nº:47, SEC ID Nº:50, SEC ID Nº:53, SEC ID Nº:56, SEC ID Nº:59, SEC ID Nº:62, SEC ID Nº:65, SEC ID 40 Nº:68, SEC ID Nº:71, SEC ID Nº:74, SEC ID Nº:77, SEC ID Nº:80, SEC ID Nº:83, SEC ID Nº:86, SEC ID Nº:89, SEC ID Nº:92, o una proteína de fusión homóloga o fragmento de la misma que tiene una actividad de hemicelulasa.
Composiciones que comprenden al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más hemicelulasas se contemplan en la divulgación.
45
[0189] Uno o varios componentes de una composición de multienzima (diferente de la proteína de la presente invención) se pueden obtener de o derivar de una fuente microbiana, de planta, u otra fuente o combinación de la misma, y contendrán enzimas capaces de degradar material lignocelulósico.
Ejemplos de enzimas incluidas en las composiciones de multienzima de la invención incluyen celulasas, hemicelulasas (tales comos xilanasas, incluyendo endoxilanasas, exoxilanasa, y β-xilosidasa), ligninasas, amilasas, 50 glucuronidasas, proteasas, esterasas (incluyendo esterasa de ácido ferúlico), lipasas, glucosidasas (tales como β-glucosidasa), glucomannanasas, y xilogluconasas.
[0190] Mientras la composición de multienzima puede contener muchos tipos de enzimas, las mezclas que comprenden enzimas que aumentan o mejoran la liberación de azúcar de biomasa son preferidas, incluyendo 55 hemicelulasas.
En una forma de realización, la hemicelulasa es seleccionada de una xilanasa, una arabinofuranosidasa, una acetil esterasa de xilano, una glucuronidasa, una endo-galactanasa, una mananasa, una endo-arabinasa, una exo-arabinasa, una exo-galactanasa, una esterasa de ácido ferúlico, una galactomananasa, una xilogluconasa, o mezclas de cualquiera de estas. 60
En particular, las enzimas puede incluir glucoamilasa, β-xilosidasa y/o β-glucosidasa.
Las enzimas de la composición de multienzima se pueden proporcionar por una variedad de fuentes.
En una forma de realización, las enzimas se pueden producir por unos microorganismos o plantas de crecimiento que producen las enzimas naturalmente o por virtud de ser genéticamente modificadas para expresar la enzima o enzimas. 65
En otra forma de realización, al menos una enzima de la composición de multienzima es una enzima disponible comercialmente.
[0191] En algunas formas de realización, las composiciones de multienzima comprenden una enzima accesoria.
Una enzima accesoria es cualquier enzima adicional capaz de hidrolizar lignocelulosa o aumentar o promover la 5 hidrólisis de lignocelulosa, donde la enzima accesoria es típicamente proporcionada además de una enzima de núcleo o conjunto de núcleo de enzimas.
Una enzima accesoria puede tener la mismo o función similar o una función diferente como una enzima o enzimas en el conjunto de núcleo de enzimas.
Estas enzimas se han descrito aquí, y pueden generalmente incluir celulasas, xilanasas, ligninasas, amilasas, 10 lipidasas, o glucuronidasas, por ejemplo.
Las enzimas accesorias puede incluir enzimas que cuando puestas en contacto con biomasa en una reacción, permiten un aumento en la actividad de enzimas (por ejemplo; hemicelulasas) en la composición de multienzima.
Una enzima accesoria o mezcla enzimática puede ser compuesta de enzimas de (1) proveedores comerciales; (2) enzimas de expresión de genes clonados; (3) caldo complejo (tal como el resultante de crecimiento de una cepa 15 microbiana en medios, donde las tensiones segregan proteínas y enzimas en el medio); (4) lisatos celulares de cepas cultivadas como en (3); y, (5) enzimas de expresión de material vegetal capaces de degradar lignocelulosa.
En algunas formas de realización, la enzima accesoria es una glucoamilasa, una pectinasa, o una ligninasa.
[0192] Como se utiliza en este caso, una ligninasa es una enzima que puede hidrolizar o descomponer la estructura 20 de polímeros de lignina, incluyendo peroxidasas de lignina, peroxidasas de manganeso, lacasas, y otras enzimas descritas en la técnica conocidas por depolimerizar o de otro moso romper polímeros de lignina.
También se incluyen enzimas capaces de hidrolizar enlaces formados entre azúcares hemicelulósicos (sobre todo arabinosa) y lignina.
25
[0193] En una forma de realización, la composición de multienzima comprende la enzima CBH Ia (SEC ID Nº:2), un homólogo de la misma biológicamente activo (por ejemplo, tiene actividad enzimática), o un fragmento que comprende, que consiste esencialmente en, o consiste en su CD.
En otra forma de realización, la composición de multienzima comprende la enzima CBH IIb (SEC ID n.º: 11), un homólogo biológicamente activo de la misma, o un fragmento que comprende, que consiste esencialmente en, o 30 consiste en su CD.
En otra forma de realización, la composición de multienzima comprende la enzima EG II (SEC ID Nº:94), un homólogo biológicamente activo de la misma, o un fragmento que comprende, que consiste esencialmente en, o consiste en su CD.
En otra forma de realización, la composición de multienzima comprende la enzima Xyl 2 (SEC ID Nº:29), un 35 homólogo biológicamente activo de la misma, o un fragmento que comprende, que consiste esencialmente en, o consiste en su CD.
En otra forma de realización, la composición de multienzima comprende la enzima de β-glucosidasa (SEC ID Nº:44), un homólogo biológicamente activo de la misma, o un fragmento que comprende, que consiste esencialmente en, o consiste en su CD. 40
En formas de realización determinadas, la composición de multienzima comprende cualquier combinación de las enzimas enumerada por encima.
En otras formas de realización, la composición de multienzima comprende al menos una de las enzimas enumeradas arriba en combinación con una enzima de β-xilosidasa.
45
[0194] En una forma de realización, la composición de multienzima comprende CBH Ia (SEC ID Nº:2), CBH IIb (SEC ID Nº:11), EG II (SEC ID Nº:94), el CD de Xyl 2 (SEC ID Nº:29) y el CD de β-glucosidasa (SEC ID Nº:44).
Esta combinación enzimática preferida puede comprender además una enzima de β-xilosidasa.
Un experto en la técnica apreciará, sin embargo, que cualquier enzima en las combinaciones anteriormente descritas se puede sustituir con una enzima que exhibe una especificidad de sustrato similar. 50
Además, la combinación enzimática óptima para un uso particular (por ejemplo, para degradación de una biomasa derivada de una fuente específica) puede ser determinado por un experto en la técnica que usa experimentación rutinaria y ensayos conocida en la técnica, tales como los descrito aquí.
[0195] En una forma de realización, la composición de multienzima comprende la enzima CBH Ib (SEC ID Nº:5), un 55 homólogo biológicamente activo de la misma, o un fragmento que comprende, que consiste esencialmente en, o consiste en su CD.
En una forma de realización adicional, la composición de multienzima comprende la enzima EG V (SEC ID Nº:20), un homólogo biológicamente activo de la misma, o un fragmento que comprende, que consiste esencialmente en, o consiste en su CD. 60
En todavía otra forma de realización, la composición de multienzima comprende la enzima Xyl 1 (SEC ID Nº:26), un homólogo biológicamente activo de la misma, o un fragmento que comprende, que consiste esencialmente en, o consiste en su CD.
En otras formas de realización, la composición de multienzima comprende la enzima arabinogalactanasa (SEC ID Nº:47), un homólogo biológicamente activo de la misma, o un fragmento que comprende, que consiste 65 esencialmente en, o consiste en su CD.
En formas de realización determinadas, la composición de multienzima comprende cualquier combinación de las enzimas enumerada por encima.
En otras formas de realización, la composición de multienzima comprende al menos una de las enzimas enumeradas arriba en combinación con al menos una enzima accesoria tal como, por ejemplo, α-L-arabinofuranosidasa. 5
[0196] Un experto en la técnica apreciará, sin embargo, que cualquier enzima en las combinaciones anteriormente descritas se puede sustituir con una enzima que exhibe una especificidad de sustrato similar.
Además, la combinación enzimática óptima para un uso particular (por ejemplo, para degradación de una biomasa derivada de una fuente específica) se puede determinar por un experto en la técnica que usa experimentación 10 rutinaria y ensayos conocida en la técnica, tales como los descrito aquí.
[0197] Las composiciones de multienzima, en algunas formas de realización, comprenden una biomasa que comprende microorganismos o un producto de fermentación cruda de microorganismos.
Un producto de fermentación cruda se refiere al caldo de fermentación que ha sido separado de la biomasa de 15 microorganismo (por filtración, por ejemplo).
En general, los microorganismos se cultivan en fermentadores, son opcionalmente centrifugados o filtrados para eliminar la biomasa, y, opcionalmente concentrados, formulados y secado para producir una enzima(s) o una composición de multienzima que es un producto de fermentación cruda.
En otras formas de realización, enzima(s) o composiciones de multienzima producida por el microorganismo 20 (incluyendo un microorganismo genéticamente modificado como se describe abajo) se somete a uno o varios pasos de purificación, tales como precipitación de sulfato amónico, cromatografía, y/o ultrafiltración, que suponen una enzima(s) parcialmente purificada o purificada.
Si el microorganismo ha sido genéticamente modificado para expresar la enzima(s), la enzima(s) incluirá enzimas recombinantes. 25
Si el microorganismo genéticamente modificado también naturalmente expresa la enzima(s) u otras enzimas útiles para sacarificación lignocelulósica, la enzima(s) puede incluir tanro enzimas de origen natural como recombinante.
[0198] Otra forma de realización de la presente invención se refiere a una composición que comprende al menos aproximadamente 500 ng, y preferiblemente al menos aproximadamente 1 µg, y más preferiblemente al menos 30 aproximadamente 5 µg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 10 µg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 25 µg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 50 µg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 75 µg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 100 µg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 250 µg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 500 µg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 750 µg, y más preferiblemente al menos aproximadamente 1 mg, y más preferiblemente 35 al menos aproximadamente 5 mg, de una proteína aislada de la invención.
Tal composición de la presente invención puede incluir cualquier portador con el cual la proteína se une en virtud del método de preparación de proteína, un método de purificación de proteína, o una preparación de la proteína para usar en cualquier método según la presente invención.
Por ejemplo, tal portador puede incluir cualquier búfer, extracto, o medio adecuado que se adecúa para la 40 combinación con la proteína de la presente invención de modo que la proteína se puede usar en cualquier método descrito aquí según la presente invención.
[0199] En una forma de realización de la invención, una o varias enzimas de la invención se ligan a un soporte sólido, es decir, una enzima inmovilizada. 45
Como se utiliza en este caso, una enzima inmovilizada incluye enzimas aisladas inmovilizadas, células microbianas inmovilizadas que contienen la enzima de la invención, otras células intactas estabilizadas que producen la enzima de la invención, y homogenizados estabilizados de célula/membrana.
Las células intactas estabilizadas y homogenizados de célula/membrana estabilizados incluyen células y homogenizados de microorganismos de origen natural que expresan la enzima de la invención y preferiblemente, de 50 microorganismos genéticamente modificados como descritos en otra parte aquí.
Así, aunque métodos para la inmovilización de enzimas se discuten por debajo, será apreciado que tales métodos son igualmente aplicables para inmovilizar células microbianas y en tal forma de realización, las células pueden ser lisadas, si se desea.
55
[0200] Una variedad de métodos para la inmovilización de una enzima se describe en Industrial Enzymology 2nd Ed., Godfrey, T. and West, S. Eds., Stockton Press, New York, N.Y., 1996, pp. 267-272; Immobilized Enzymes, Chibata, I. Ed., Halsted Press, New York, N.Y., 1978; Enzymes and Immobilized Cells in Biotechnology, Laskin, A. Ed., Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., Menlo Park, California, 1985; and Applied Biochemistry and Bioengineering, Vol. 4, Chibata, I. and Wingard, Jr., L. Eds, Academic Press, New York, N.Y., 1983. 60
[0201] Brevemente, un soporte sólido se refiere a cualquier soporte inorgánico, orgánico o biopolimero sólido, que pueda formar un enlace con una enzima sin significativamente afectar la actividad de la enzima.
Soportes sólidos orgánicos ejemplares incluyen polímeros tales como poliestireno, nilón, resinas de fenoloformaldehído, copolímeros acrílicos (por ejemplo, poliacrilamida), células enteras intactas estabilizadas, y 65 homogenizados estabilizados de célula/membrana entera cruda.
Soportes biopolimeros ejemplares incluyen celulosa, polidextranas (por ejemplo, Sephadex®), agarosa, colágeno y quitina.
Soportes inorgánicos ejemplares incluyen perlas de vidrio (poroso y no poroso), acero inoxidable, óxidos metálicos (por ejemplo, cerámica porosa tal como ZrO2, TiO2, Al2O3, y NiO) y arena.
En una forma de realización, el soporte sólido es seleccionado del grupo consistente en células intactas 5 estabilizadas y/o homogenizados de célula cruda (por ejemplo, producidos de las enzimas recombinantes de expresión de células huésped microbianas, solo o en combinación con enzimas naturales).
Las preparación de tales soportes requieren un mínimo de la manipulación y coste.
Adicionalmente, tales soportes proporcionan estabilidad excelente de la enzima.
10
[0202] Las células intactas estabilizadas y/o homogenizadas de célula/membrana pueden ser producidas, por ejemplo, usando agentes reticulantes bifuncionales (por ejemplo, glutaraldehido) para estabilizar células y homogenizados celulares.
En las células intactas y las membranas celulares, la pared y las membranas celulares hacen de soportes de inmovilización. 15
En tal sistema, las proteínas de membrana integral están en el "mejor" ambiente de membrana lípidica.
Se empiece con células intactas u homogenizados, en este sistema las células ya no están ni "activoas" o "metabolizando", o alternativamente, están "descansando" (es decir, las células mantienen potencial metabólico y de enzima activo, pero bajo las condiciones de cultivo no están creciendo); en cualquier caso, las células inmovilizadas o membranas sirven como biocatalizadores. 20
[0203] Una enzima de la invención puede ser limitada a un soporte sólido por una variedad de métodos incluyendo adsorción, reticulación (incluyendo unión covalente), y atrapamiento.
La adsorción puede hacerse a través de fuerzas van del Waal, unión de hidrógeno, unión iónica, o unión hidrofóbica.
Soportes sólidos ejemplares para inmovilización de adsorción incluyen resinas de intercambio de iones y 25 adsorbentes poliméricos.
Los soportes sólidos en forma de reborde son particularmente adecuados.
El tamaño de partícula de un soporte sólido de adsorción se puede seleccionar de manera que la enzima inmovilizada se retiene en el reactor por un filtro de malla mientras se permite que el sustrato puede fluir a través del reactor a un índice deseado. 30
Con soportes granulosos porosos es posible controlar el proceso de adsorción para permitir introducir enzimas o células en la cavidad de la partícula, proporcionando así protección sin una pérdida inaceptable de actividad.
[0204] La reticulación de una enzima a un soporte sólido implica la formación de un enlace químico entre un soporte sólido y la enzima. 35
Será apreciado que aunque la reticulación implica generalmente conectar la enzima a un soporte sólido que utiliza un compuesto intermediario, también es posible conseguir una unión covalente entre la enzima y el soporte sólido directamente sin el uso de un compuesto intermediario.
La reticulación usa comúnmente un reactivo bifuncional o multifuncional para activar y adherir un grupo carboxilo, grupo amino, grupo de azufre, grupo-hidroxi u otro grupo funcional de la enzima al soporte sólido. 40
El término "activar" se refiere a una transformación química de un grupo funcional que permite una formación de un enlace en el grupo funcional.
Los reactivos de activación de grupo amino ejemplar incluyen carbodiimidas hidrosolubles, glutaraldehido, bromuro de cianógeno, ésteres de N-hidroxisuccinimida, triazinas, cloruro cianúrico, y diimidazola de carbonilo.
Los reactivos de activación de grupo carboxilo ejemplar incluyen carbodiimidas hidrosolubles, y N-etil-5-45 fenilisoxazolio-3-sulfonato.
Los reactivos ejemplares que activan al grupo tirosilo incluyen compuestos de diazonio.
Y los reactivos ejemplares que activan al grupo sulfhidrilo incluyen ácido ditiobis-5,5'-(2-nitrobenzoico), y disulfuro de glutatión-2-piridilo.
Los sistemas para conectar de manera covalente una enzima directamente a un soporte sólido incluyen Eupergit®, 50 un soporte de reborde de polimetacrilato disponible de Rohm Pharma (Darmstadt; Alemania), kieselguhl (Macrosorbs), disponible de Sterling Organics, kaolinite disponible de English China Clay como soportes "Biofix", geles de sílice que se pueden activar por silanización, disponible de W.R. Grace, y alúmina de alta densidad, disponible de UOP (Des Plains, IL).
55
[0205] El atrapamiento también puede usarse para inmovilizar una enzima.
El atrapamiento de un enzimático implica la formación de, entre otras cosas, geles (que usan polímeros orgánicos o biológicos), vesículas (incluyendo microencapsulación), membranas semipermeables u otras matrices.
Los materiales ejemplares usados para el atrapamiento de una enzima incluyen colágeno, gelatina, agar, triacetato de celulosa, alginato, poliacrilamida, poliestireno, poliuretano, resinas epoxi, carragenina, y albúmina de huevo. 60
Algunos de los polímeros, en particular triacetato de celulosa, pueden utilizarse para atrapar la enzima conforme se centrifugan en una fibra.
Otros materiales tales como geles de poliacrilamida se pueden polimerizar en la solución para atrapar la enzima.
Además otros materiales tales como oligómeros poliglicol que son funcionales con grupos terminales de vinilo polimerizable pueden atrapar enzimas formando un polímero reticulado con iluminación de luz UV en presencia de 65 un fotosintetizador.
[0206] Otras formas de realización de la presente invención incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de la presente invención.
Una molécula de ácido nucleico de la presente divulgación incluye una molécula de ácido nucleico que comprende, que consiste esencialmente en, o consisten en una secuencia de ácidos nucleicos que codifica cualquiera de las 5 proteínas aisladas descritas aquí, incluyendo un fragmento o un homólogo de tales proteínas, anteriormente descrito.
Las moléculas de ácido nucleico pueden incluir una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un fragmento de una proteína que no tiene actividad biológica, y también pueden incluir partes de un gen o polinucleótido que codifica la proteína que no son parte de la región de codificación para la proteína (por ejemplo, intrones o regiones reguladoras 10 de un gen que codifica de la proteína).
Las moléculas de ácido nucleico pueden incluir una secuencia de ácidos nucleicos que es útil como una sonda o cebador (secuencias de oligonucleótido).
[0207] En una forma de realización, una molécula nucleica de la presente invención incluye una molécula de ácido 15 nucleico que comprende, que consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID Nº:31, o SEC ID Nº:33. En una forma de realización, una molécula nucleica de la presente invención incluye una molécula de ácido nucleico que comprende, que consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº:32 o un homólogo de la misma. 20
Preferiblemente, la secuencia de ácidos nucleicos codifica una proteína (incluyendo un homólogo de la misma) útil en la invención, o abarca secuencias de ácidos nucleicos complementarias.
[0208] Conforme a la presente invención, una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico (polinucleótido) que se ha quitado de su ambiente natural (es decir, que ha sido sujeta a manipulación humana) y 25 puede incluir ADN, ARN, o derivados de bien ADN o ARN, incluyendo ADNc.
Como tal, "aislado" no refleja la extensión en la que la molécula de ácido nucleico ha sido purificada.
Aunque la frase "molécula de ácido nucleico" principalmente se refiere a la molécula de ácido nucleico física, y la frase "secuencia de ácido nucleico" principalmente se refiere a la secuencia de nucleótidos en la molécula de ácido nucleico, las dos frases se pueden usar de forma intercambiable, especialmente respecto a una molécula de ácido 30 nucleico, o una secuencia de ácidos nucleicos, siendo capaz de codificar una proteína.
Una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención se puede aislar de su fuente natural o producida usando tecnología del ADN recombinante (por ejemplo, amplificación de reacción en cadena de polimerasa (PCR), clonación) o síntesis química.
Las moléculas de ácido nucleico aisladas puede incluir, por ejemplo, genes, variantes alélicas naturales de genes, 35 regiones de codificación o partes de las mismas, y regiones reguladoras y/o de codificación modificadas por inserciones de nucleótido, deleciones, sustituciones, y/o en cierto modo de inversiones de manera que las modificaciones no interfieren sustancialmente con la habilidad del ácido nucleico de la molécula para codificar una proteína de la presente invención o para formar híbridos estables bajo condiciones de astringencia con gen natural aislado. 40
Una molécula de ácido nucleico aislado puede incluir degeneraciones.
Como se utiliza en este caso, la degeneración de nucleótido se refiere al fenómeno de que un aminoácido se puede codificar por codones de nucleótido diferentes.
Así, la secuencia de ácidos nucleicos de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de la presente invención puede variar debido a degeneraciones. 45
Cabe señalar que no es necesario que una molécula de ácido nucleico de la presente divulgación codifique una proteína con actividad de proteína.
Una molécula de ácido nucleico puede codificar una proteína truncada, mutada o inactiva, por ejemplo.
Además, las moléculas de ácido nucleico de la divulgación son útiles como sondas y cebadores para la identificación, aislamiento y/o purificación de otras moléculas de ácido nucleico. 50
Si la molécula de ácido nucleico es un oligonucleótido, tal como una sonda o cebador, el oligonucleótido preferiblemente varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 o aproximadamente 500 nucleótidos, más preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 nucleótidos, y de la forma más preferible de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleótidos en la longitud.
55
[0209] Como se utiliza en este caso, la referencia a un gen incluye todas las secuencias de ácidos nucleicos relacionadas con un gen natural (es decir tipo salvaje), tales como las regiones reguladoras que controlan la producción de la proteína codificada por ese gen (tal como, pero no limitado a, transcripción, traducción o regiones de control postraduccional) al igual que la misma región de codificación.
En otra forma de realización, un gen puede ser una variante alélica de origen natural que incluye una secuencia 60 similar pero no idéntica a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína dada.
Variantes alélicas han sido previamente descritas por encima.
Las frases "molécula de ácido nucleico" y "gen" se pueden usar de forma intercambiable cuando la molécula de ácido nucleico comprenden un gen como se ha descrito anteriormente.
65
[0210] Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención se produce utilizando tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, amplificación de reacción en cadena de polimerasa (PCR), clonación, etc.) o síntesis química.
Las moléculas de ácido nucleico aisladas incluyen cualquier molécula de ácido nucleico y homólogo de las mismas que son parte de un gen descrito aquí y/o que codifican una proteína descrita aquí, incluyendo, pero no limitado a, 5 variantes alélicas naturales y moléculas de ácido nucleico modificadas (homólogo) donde los nucleótidos han sido insertados, eliminados, sustituidos y/o invertidos de manera que tales modificaciones proporcionan el efecto deseado en la actividad biológica de proteína o en la actividad de la molécula de ácido nucleico.
Las variantes alélicas y la proteína homóloga (por ejemplo, proteínas codificadas por ácido nucleico homólogo) han sido discutidas en detalle por encima. 10
[0211] Un homólogo de molécula de ácido nucleico (es decir, que codifica un homólogo de una proteína de la presente invención) se puede producir utilizando un número de métodos conocido por los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al.).
Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico se pueden modificar utilizando una variedad de técnicas incluyendo, 15 pero no limitado a, mutagénesis clásica y técnicas de ADN recombinante (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio, tratamiento químico, escisión de enzima de restricción, ligamiento de fragmentos de ácido nucleico y/o amplificación de PCR), o síntesis de mezclas oligonucleótidas y ligamiento de grupos de mezcla para "construir" una mezcla de moléculas de ácido nucleico y combinaciones de los mismos.
Otro método para la modificación de una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína es 20 transposición de genes (es decir, cultivo molecular) (ver, por ejemplo, patente US nº 5,605,793 a Stemmer; Minshull y Stemmer; 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:284-290; Stemmer, 1994, P.N.A.S. USA 91:10747-10751).
Esta técnica puede utilizarse para introducir eficazmente cambios simultáneos múltiples en la proteína.
La molécula de ácido nucleico homólogo se puede seleccionar por hibridación con un gen o polinucleótido, o por cribando en busca de la función de una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico (es decir, actividad 25 biológica).
[0212] El tamaño mínimo de una molécula de ácido nucleico de la presente divulgación es un tamaño suficiente para codificar una proteína (incluyendo un fragmento u homólogo de una proteína en toda su longitud) con actividad biológica, suficiente para codificar una proteína que comprende al menos un epítopo que se enlaza a un anticuerpo, 30 o suficiente para formar una sonda o cebador oligonucleótido que es capaz de formar un híbrido estable con la secuencia complementaria de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína natural (por ejemplo, condiciones de astringencia baja, medio-alta o alta).
Como tal, el tamaño de la codificación de molécula de ácido nucleico tal proteína puede depender de la composición de ácido nucleico y porcentaje de homología o identidad entre la molécula de ácido nucleico y secuencia 35 complementaria al igual que ante condiciones de hibridación de por sí (por ejemplo, temperatura, concentración de sal, y concentración de formamida).
El tamaño mínimo de una molécula de ácido nucleico que se usa como un cebador oligonucleótido o como una sonda es típicamente al menos aproximadamente de 12 a aproximadamente 15 nucleótidos en la longitud si las moléculas de ácido nucleico son ricas en GC y al menos aproximadamente de 15 a aproximadamente 18 bases en 40 la longitud si son ricas en AT.
No hay límite, más allá del límite práctico, en tamaño máximo de una molécula de ácido nucleico de la presente invención, en que la molécula de ácido nucleico puede incluir una porción de una secuencia codificante de proteína, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína en toda su longitud (incluyendo un gen), incluyendo cualquier fragmento de longitud entre aproximadamente 20 nucleótidos y el número de nucleótidos que compone el 45 ADNc de longitud total que codifica una proteína, en números enteros completos (por ejemplo, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ...... Nucleótidos), o genes múltiples, o partes de los mismos.
[0213] La frase "que consiste esencialmente de", cuando se usa con referencia a una secuencia de ácidos nucleicos aquí, se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos específica que 50 puede estar flanqueada por al menos uno, y como mucho aproximadamente 60, nucleótidos heterólogos adicionales a cada uno de y/o el extremo de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos específica.
Los nucleótidos heterólogos no se encuentra naturalmente (es decir, en la naturaleza, in vivo) flanqueando la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos específica como ocurre en el gen natural o 55 no codifican una proteína que imparte cualquier función adicional a la proteína o cambia la función de la proteína con la secuencia de aminoácidos específica.
[0214] En una forma de realización, las sondas de polinucleótido o cebadores de la divulgación se conjugan a marcadores detectables. 60
Las etiquetas detectables adecuadas para usar en la presente divulgación incluyen cualquier composición detectable por espectroscópica, medios fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos.
Etiquetas útiles en la presente divulgación incluyen biotina para la coloración con conjugado de estreptavidina marcada, perlas magnéticas (por ejemplo; Dynabeads™), colorantes fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rojo de texas, rodamina, proteína verde fluorescente, y similar), radioetiquetas (por ejemplo, 3H, 125I, 35S, 14C, o 32P), 65 enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina y otros comúnmente usado en una ELISA), y
etiquetas colorimétricas tales como perlas de oro coloidal o vidrio coloreado o plástico (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.).
Preferiblemente, las sondas de polinucleótido se inmovilizan en un sustrato tal como: membranas artificiales, soportes orgánicos, soportes de biopolimero y soportes inorgánicos.
5
[0215] Una forma de realización de la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico aislada anteriormente descrita que está operativamente enlazada al menos a una secuencia de control de expresión.
Más particularmente, según la presente invención, una molécula de ácido nucleico recombinante típicamente comprende un vector recombinante y una o varias de las moléculas de ácido nucleico aisladas como se describe en 10 este caso.
Según la presente invención, un vector recombinante es una molécula de ácido nucleico diseñada (es decir, artificialmente producida) que se usa como una herramienta para la manipulación de una secuencia de ácidos nucleicos de elección y/o para la introducción de tal secuencia de ácidos nucleicos en una célula huésped.
El vector recombinante es por lo tanto adecuado para usar en la clonación, secuenciación, y/o de otro modo 15 manipulando de la secuencia de ácidos nucleicos de elección, tal como por la expresión y/o entrega de la secuencia de ácidos nucleicos de elección en una célula huésped para formar una célula recombinante.
Tal vector contiene típicamente secuencias de ácidos nucleicos heterólogas, es decir, secuencias de ácidos nucleicos que no se encuentran naturalmente adyacentes a la secuencia de ácidos nucleicos por ser clonada o entregado, aunque el vector puede también contener secuencias de ácidos nucleicos reguladoras (por ejemplo, 20 regiones no traducidas promotoras) que son naturalmente encontradas adyacentes a secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención o que son útiles para la expresión de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención (discutidas en detalle por debajo).
El vector puede ser bien ARN o ADN, bien procariota o eucariota, y es típicamente un plásmido.
El vector se puede mantener como un elemento extracromosómico (por ejemplo, un plásmido) o se puede integrar 25 en el cromosoma de una célula huésped recombinante, aunque se prefiere si el residuo de vector permanece separado del genoma para la mayoría de las aplicaciones de la invención.
El vector entero puede quedar en su lugar dentro de una célula huésped, o bajo ciertas condiciones, el ADN plásmido puede ser eliminado, dejando atrás la molécula de ácido nucleico de la presente invención.
Una molécula de ácido nucleico integrada puede estar bajo control del promotor cromosómico, bajo control de 30 promotor nativo o plásmido, o bajo controles de una combinación de diferentes promotores.
Las copias únicas o múltiples de la molécula de ácido nucleico se pueden integrar en el cromosoma.
Un vector recombinante de la presente invención puede contener al menos una etiqueta seleccionable.
[0216] En una forma de realización, un vector recombinante usado en una molécula de ácido nucleico recombinante 35 de la presente invención es un vector de expresión.
Como se utiliza en este caso, la frase "vector de expresión" se utiliza para referirse a un vector que se adecua para la producción de un producto codificado (por ejemplo, una proteína de interés, tal como una enzima de la presente invención).
En esta forma de realización, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el producto por ser producido (por 40 ejemplo, la proteína u homólogo de la misma) se inserta en el vector recombinante para producir una molécula de ácido nucleico recombinante.
La secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína por ser producida es insertada en el vector en cierto modo que enlaza operativamente la secuencia de ácidos nucleicos a secuencias reguladoras en el vector que permite la transcripción y traducción de la secuencia de ácidos nucleicos en la célula huésped recombinante. 45
[0217] Típicamente, una molécula de ácido nucleico recombinante incluye al menos una molécula de ácido nucleico de la presente invención operativamente enlazada a una o varias secuencias de control de expresión (por ejemplo, secuencias de control de transcripción o secuencias de control de traducción).
Como se utiliza en este caso, la frase "molécula recombinante" o "molécula de ácido nucleico recombinante" 50 principalmente se refiere a una molécula de ácido nucleico o secuencia de ácidos nucleicos operativamente enlazada a una secuencia de control de transcripción, pero se puede usar de forma intercambiable con la frase "molécula de ácido nucleico", cuando tal molécula de ácido nucleico es una molécula recombinante como discutida aquí.
Según la presente invención, la frase "operativamente enlazada" se refiere a conectar una molécula de ácido 55 nucleico a una secuencia de control de expresión de manera que la molécula es capaz de ser expresada cuando es modificada (es decir, transformada, transducida, modificada, conjugada o conducida) en una célula huésped.
Las secuencias de control de transcripción son secuencias que controlan la iniciación, alargamiento, o terminación de transcripción.
Las secuencias de control de transcripción particularmente importantes son las que controlan iniciación de 60 transcripción, tales como secuencias promotoras, intensificadoras, operadoras y represoras.
Las secuencias de control de transcripción adecuadas incluyen cualquier secuencia de control de transcripción que pueden funcionar en una célula o un organismo huésped en que la molécula de ácido nucleico recombinante debe ser introducida.
65
[0218] Las moléculas de ácido nucleico recombinante de la presente invención también pueden contener secuencias reguladoras adicionales, tales como secuencias reguladoras de traducción, orígenes de replicación, y otras secuencias reguladoras que son compatibles con la célula recombinante.
En una forma de realización, una molécula recombinante de la presente invención, incluyendo las que se integran en el cromosoma de célula huésped, también contiene señales de secretaria (es decir, secuencias de ácidos nucleicos 5 de segmento de señal) para permitir que una proteína expresada sea segregada de la célula que produce la proteína.
Los segmentos de señal adecuados incluyen un segmento de señal que es naturalmente asociada a la proteína por ser expresada o cualquier segmento de señal heterólogo capaz de dirigir la secreción de la proteína según la presente invención. 10
En otra forma de realización, una molécula recombinante de la presente invención comprende una secuencia líder para permitir que una proteína expresada sea entregada e insertada en la membrana de una célula huésped.
Las secuencias líder adecuadas incluyen una secuencia líder que es naturalmente asociada a la proteína, o cualquier secuencia líder heteróloga capaz de dirigir la entrega e inserción de la proteína en la membrana de una célula. 15
[0219] Según la presente invención, el término "transfección" es generalmente usado para referirse a cualquier método por el que una molécula de ácido nucleico exógeno (es decir, una molécula de ácido nucleico recombinante) se puede insertar en una célula.
El término "transformación" se puede usar de forma intercambiable con el término "transfección" cuando tal término 20 se utiliza para referirse a la introducción de moléculas de ácido nucleico en células o plantas microbianas y describe un cambio heredado debido a la adquisición de ácidos nucleicos exógenos por el microorganismo que es esencialmente sinónimo con el término "transfección". Las técnicas de transfección incluyen, pero de forma no limitativa, transformación, bombardeo de partícula, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción, infección y fusión de protoplasto. 25
[0220] Una o varias moléculas recombinantes de la presente invención pueden utilizarse para producir un producto codificado (por ejemplo, una proteína) de la presente invención.
En una forma de realización, un producto codificado se produce por la expresión de una molécula de ácido nucleico como se describe en este caso bajo condiciones eficaces para producir la proteína. 30
Un método preferido para producir una proteína codificada es transfectar una célula huésped con una o varias moléculas recombinantes para formar una célula recombinante.
Las células huésped adecuadas para transfectar incluyen, pero de forma no limitativa, cualquier célula bacteriana, fúngica (por ejemplo, de hongos filamentosos o levadura), de planta, de insecto, o animal que puede ser modificada.
Las células huésped pueden ser bien células no modificadas o células que están ya modificadas con al menos una 35 otra molécula de ácido nucleico recombinante.
[0221] Las células adecuadas (por ejemplo, una célula huésped u organismo de producción) incluyen cualquier microorganismo (por ejemplo, una bacteria, una protista, una alga, un hongo, u otro microbio), y es preferiblemente una bacteria, una levadura o un hongo filamentoso. 40
Los géneros bacterianos adecuados incluyen, pero de forma no limitativa, Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Pseudomonas y Streptomyces.
Las especies bacterianas adecuadas incluyen, pero de forma no limitativa, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Lactobacillus brevis, Pseudomonas aeruginosa y Streptomyces lividans.
Los géneros de levadura adecuados incluyen, pero de forma no limitativa, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, 45 Candida, Hansenula, Pichia, Kluyveromyces, y Phaffia.
Las especies de levadura adecuadas incluyen, pero de forma no limitativa, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, P. canadensis, Kluyveromyces marxianus y Phaffia rhodozima.
50
[0222] Los géneros fúngicos adecuados incluyen, pero de forma no limitativa, Chrysosporium, Thielavia, Neurospora, Aureobasidium, Filibasidium, Piromices, Corynascus, Cryplococcus, Acremonium, Tolipocladium, Scytalidium, Schizofilum Sporotrichum, Penicillium, Gibberella, Myceliophthora, Mucor, Aspergillus, Fusarium, Humicola, y Trichoderma, y anamorfos y teleomorfos de los mismos. Las especies fúngicas adecuadas incluyen, pero de forma no limitativa, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Absidia coerulea, Rhizopus oryzae, 55 Chrysosporium lucknowense, Neurospora crassa, Neurospora crassa, Trichoderma reesei, Penicillium canescens, Penicillium solitum, Penicillium funiculosum, y Talaromyces flavus.
En una forma de realización, la célula huésped es una célula fúngica de las especies Chrysosporium lucknowense.
En una forma de realización, la célula huésped es una célula fúngica de cepa C1 (VKM F-3500-D) o una cepa mutante derivada de la misma (por ejemplo, UV13-6 (número de registro VKM F-3632 D); NG7C-19 (número de 60 registro VKM F-3633 D); o UV18-25 (VKM F-3631D)).
Las células huésped pueden ser células no modificadas o células que son ya modificadas con al menos otra molécula de ácido nucleico recombinante.
Las formas de realización adicionales de la presente invención incluyen cualquiera de las células genéticamente modificadas descritas aquí. 65
[0223] En una forma de realización, una o varias proteína(s) expresadas por una molécula de ácido nucleico aislado de la presente invención se producen por el cultivo de una célula que expresa la proteína (es decir, una célula recombinante o célula huésped recombinante) bajo condiciones eficaces para producir la proteína.
En algunos casos, la proteína puede ser recuperada, y en otros, la célula se puede cosechar entera, y cualquiera se puede usar en una composición. 5
[0224] Los microorganismos usados en la presente invención (incluyendo células huésped recombinantes o microorganismos genéticamente modificados) se cultivan en un medio de fermentación apropiado.
Un medio de fermentación apropiado o eficaz se refiere a cualquier medio donde una célula de la presente invención, incluyendo un microorganismo genéticamente modificado (descrito abajo), cuando cultivado, es capaz de 10 expresar enzimas útiles en la presente invención y/o de catalizar la producción de azúcares de biomasa lignocelulósica.
Tal medio es típicamente un medio acuoso que comprende carbono asimilable, nitrógeno y fuentes de fosfato.
Tal medio puede también incluir sales, minerales, metales y otros nutrientes apropiados.
Los microorganismos y otras células de la presente invención se pueden cultivar en los biorreactores de 15 fermentación convencional.
Los microorganismos se pueden cultivar por cualquier proceso de fermentación que incluya, pero no se limita a, fermentación de lote, de lote alimentado, reciclaje de célula, y continua.
La fermentación de microorganismos tales como hongos se puede realizar en cualquier reactor apropiado, usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la fermentación se puede llevar a cabo durante un 20 periodo de 1 a 14 días, o más preferiblemente entre aproximadamente 3 y 10 días.
La temperatura del medio es típicamente mantenida entre aproximadamente 25 y 50°C, y más preferiblemente entre 28 y 40°C.
El pH del medio de fermentación se regula a un pH adecuado para el crecimiento y la producción de proteínas del organismo particular. 25
El fermentador se puede airear para suministrar el oxígeno necesario para la fermentación y para evitar la acumulación excesiva de dióxido de carbono producido por fermentación.
Además, la aireación ayuda a controlar la temperatura y la humedad del medio de cultivo.
En general las cepas fúngicas se cultivan en fermentadores, son opcionalmente centrifugadas o filtradas para eliminar la biomasa, y, son opcionalmente concentradas formuladas, y secadas para producir una enzima(s) o una 30 composición de multienzima que es un producto de fermentación cruda.
Las condiciones especialmente adecuadas para el cultivo de hongos filamentosos son descritos, por ejemplo, en la patente US nº 6,015,707 y patente USU nº 6,573,086, supra.
[0225] Dependiendo del sistema vector y huésped usado para la producción, las proteínas resultantes de la presente 35 invención pueden permanecer en la célula recombinante; ser segregadas en el medio de cultivo; ser segregadas en un espacio entre dos membranas celulares; o ser retenidas en la superficie externa de una membrana celular.
La frase "recuperar la proteína" se refiere a recoger el medio de cultivo entero con la proteína y no necesita implicar pasos adicionales de separación o purificación.
Las proteínas producidas según la presente invención se pueden purificar utilizando una variedad de técnicas de 40 purificación de proteína estándar, tales como, pero no limitado a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio de iones, filtración, electrofóresis, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de fase inversa, concanavalina A cromatografía, cromato-enfoque y solubilización diferencial.
[0226] Las proteínas de la presente invención son preferiblemente recuperadas, obtenidas, y/o usados de forma 45 "sustancialmente pura".
Como se utiliza en este caso, "sustancialmente pura" se refiere a una pureza que permite el uso eficaz de la proteína en cualquier método según la presente invención.
Para que una proteína sea útil en cualquiera de los métodos descritos aquí o en cualquier método usando enzimas de los tipos descritos aquí según la presente invención, es sustancialmente libre de contaminantes, otras proteínas 50 y/o productos químicos que pueden interferir o que interferirían con su uso en un método descrito por la presente invención (por ejemplo, que puede interferir con actividad enzimática), o que al menos sería indeseable para la inclusión con una proteína de la presente invención (incluyendo homólogo) cuando se usa en un método descrito por la presente invención (descrita en detalle por debajo).
Preferiblemente, una proteína "sustancialmente pura", como referenciada aquí, es una proteína que se puede 55 producir por cualquier método (es decir, por purificación directa de una fuente natural, recombinantemente, o sintéticamente), y que ha sido purificada de otros componentes de proteína de manera que la proteína comprende al menos aproximadamente 80% peso/peso de la proteína total en una composición (por ejemplo, la proteína de interés es aproximadamente 80% de la proteína en una solución/composición/búfer), y más preferiblemente, al menos aproximadamente 85%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 90%, y más preferiblemente al 60 menos aproximadamente 91%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 92%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 93%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 94%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 95%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 96%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 97%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 98%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 99%, peso/peso de la proteína total en una composición. 65
[0227] Será apreciado por un experto en la técnica que el uso de tecnologías de ADN recombinante pueden mejorar el control de expresión de moléculas de ácido nucleico modificado por la manipulación, por ejemplo, del número de copias de las moléculas de ácido nucleico en la célula huésped, de la eficiencia con la cual aquellas moléculas de ácido nucleico son transcritas, de la eficiencia con la cual los transcritos resultantes son traducidos, y la eficiencia de modificaciones postraduccionales. 5
Adicionalmente, la secuencia promotora puede ser genéticamente modificada para mejorar el nivel de expresión en comparación con el promotor nativo.
Las técnicas recombinantes útiles para controlar la expresión de moléculas de ácido nucleico incluyen, pero de forma no limitativa, integración de las moléculas de ácido nucleico en uno o varios cromosomas de célula huésped, adición de secuencias de estabilidad de vector para plásmidos, sustituciones o modificaciones de señales de control 10 de transcripción (por ejemplo, promotores, operadores, potenciadores), sustituciones o modificaciones de señales de control traslacionales (por ejemplo, sitios de unión de ribosoma), modificación de moléculas de ácido nucleico para corresponder al uso de codón de la célula huésped, y deleción de secuencias que desestabilizan transcripciones.
[0228] Otro aspecto de la presente invención se refiere a un microorganismo genéticamente modificado que ha sido 15 modificado con una o varias moléculas de ácido nucleico de la presente invención.
Como se utiliza en este caso, un microorganismo genéticamente modificado puede incluir una bacteria, levadura, hongo filamentoso, u otro microbio genéticamente modificado.
Tal microorganismo genéticamente modificado tiene un genoma que es modificado (es decir, mutado o cambiado) de su forma normal (es decir, tipo salvaje o de origen natural) de manera que el resultado deseado es conseguido 20 (es decir, actividad aumentada o modificada y/o producción de al menos una enzima o una composición de multienzima para la conversión de material lignocelulósico en azúcares fermentables).
La modificación genética de un microorganismo se puede realizar usando desarrollo de cepa tradicional y/o técnicas genéticas moleculares.
Tales técnicas son conocidas en la técnica y son generalmente descritas para microorganismos, por ejemplo, en 25 Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press or Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russel, 2001), (jointly referred to herein as "Sambrook").
Las referencias de Sambrook, ibid.. Un microorganismo genéticamente modificado puede incluir un microorganismo donde las moléculas de ácido nucleico han sido insertadas, eliminadas o modificadas (es decir, mutadas; por ejemplo, por inserción, deleción, sustitución, y/o inversión de nucleótidos), de manera que tales modificaciones 30 proporcionan el efecto deseado en el microorganismo.
[0229] En una forma de realización, un microorganismo genéticamente modificado puede endogenamente contener y expresar una enzima o una composición de multienzima para la conversión de material lignocelulósico para azúcares fermentables, y la modificación genética puede ser una modificación genética de una o varias de tales 35 enzimas endógenas, donde la modificación tiene algún efecto en la capacidad del microorganismo para convertir material lignocelulósico en azúcares fermentables (por ejemplo, expresión aumentada de la proteína por introducción de promotores u otras secuencias de control de expresión, o modificación de la región de codificación por recombinación homóloga para aumentar la actividad de la proteína codificada).
40
[0230] En otra forma de realización, un microorganismo genéticamente modificado puede endogenamente contener y expresar una enzima para la conversión de material lignocelulósico en azúcares fermentables, y la modificación genética puede ser una introducción de al menos una secuencia de ácidos nucleicos exógena (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante), donde la secuencia de ácidos nucleicos exógena codifica al menos una enzima adicional útil para la conversión de material lignocelulósico en azúcares fermentables y/o una proteína que 45 mejora la eficiencia de la enzima para la conversión de material lignocelulósico en azúcares fermentables.
En este aspecto de la invención, el microorganismo puede también tener al menos una modificación a un gen o genes que comprenden su enzima(s) endógena para la conversión de material lignocelulósico en azúcares fermentables.
50
[0231] En otra forma de realización, el microorganismo genéticamente modificado no contiene endogenamente (naturalmente) necesariamente una enzima para la conversión de material lignocelulósico en azúcares fermentables, pero está genéticamente modificado para introducir al menos una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica al menos una enzima o una pluralidad de enzimas para la conversión de material lignocelulósico en azúcares fermentables. 55
Tal microorganismo se puede usar en un método de la invención, o como un microorganismo de producción para productos de fermentación cruda, enzimas recombinantes parcialmente purificadas, y/o enzimas recombinantes purificadas, cualquiera de ellas puede luego ser usada en un método de la presente invención.
[0232] Una vez las proteínas (enzimas) son expresadas en una célula huésped, un extracto celular que contiene la 60 actividad para probar puede ser generado.
Por ejemplo, un lisado de la célula huésped es producido, y el sobrenadante con la actividad es cosechado y/o la actividad se puede aislar del lisado.
En el caso de células que segregan enzimas en el medio de cultivo, el medio de cultivo que las contiene puede ser cosechado, y/o la actividad se puede purificar del medio de cultivo. 65
Los extractos/actividades preparados de esta manera se pueden evaluar usando ensayos conocidos en la técnica Por consiguiente, se proporcionan métodos para identificar composiciones de multienzima capaces de degradar biomasa lignocelulósica.
[0233] Los sustratos artificiales, o mezclas complejas de carbohidratos poliméricos y lignina, o lignocelulosa real se 5 puede usar en tales pruebas.
Un ensayo que se puede utilizar para medir la liberación de azúcares y oligosacáridos de estos sustratos complejos es el ensayo de ácido dinitrosalicílico (DNS).
En este ensayo, el material lignocelulósico tal como DDG se incuba con enzimas(s) varias veces y los azúcares reductores son medidos. 10
[0234] La divulgación también contempla plantas genéticamente modificadas transformadas con una o varias moléculas de ácido nucleico de la invención.
Las plantas se pueden utilizar para la producción de las enzimas, y/o como el material lignocelulósico usado como un sustrato en los métodos de la invención. 15
Los métodos para generar plantas recombinantes se conocen en la técnica. Por ejemplo, numerosos métodos para transformación de planta han sido desarrollados, incluyendo protocolos de transformación biológica y física.
Ver, por ejemplo, Miki et al., Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R. and Thompson, J.E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) pp. 67-88. 20
Además, están disponibles vectores y métodos de cultivo in vitro para transformación de célula vegetal o tejido y regeneración de plantas.
Ver, por ejemplo, Gruber et al., "Vectors for Plant Transformation" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R. and Thompson, J.E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) pp. 89-119.
25
[0235] El método más utilizado para la introducción de un vector de expresión en plantas se basa en el sistema de transformación natural de Agrobacterium.
Ver, por ejemplo, Horsch et al., Science 227:1229 (1985).
A. Tumefaciens y A. rhizogenes son bacterias de tierra patógena de planta que transforman genéticamente células vegetales. 30
Los plásmidos Ti y Ri de A. tumefaciens y A. rhizogenes, respectivamente, llevan genes responsables de transformación genética de la planta.
Ver, por ejemplo, Kado, C.I., Crit. Rev. Plant. Sci. 10:1 (1991). Descripciones de sistemas de vector de Agrobacterium y métodos para transferencia de gen mediado por Agrobacterium se proporcionan por referencias numerosas, incluyendo Gruber et al., supra, Miki et al., supra, Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989), y 35 patentes US Nos. 4,940,838 y 5,464,763.
[0236] Otro método generalmente aplicable de transformación de planta es transformación mediada por microproyectiles donde ADN se lleva en la superficie de microproyectiles.
El vector de expresión se introduce en los tejidos de planta con un dispositivo biolístico que acelera los 40 microproyectiles a velocidad suficiente para penetrar las paredes y membranas celulares vegetales.
Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5:27 (1987), Sanford, J.C., Trends Biotech. 6:299 (1988), Sanford, J.C., Physiol. Plant 79:206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992).
[0237] Otro método para entrega física de ADN a plantas es sonicación de células objetivo. 45
Zhang et al., bio/tecnología 9:996 (1991).
Alternativamente, liposoma o fusión de esferoplasto han sido usados introducir vectores de expresión en plantas.
Deshayes et al., EMBO J., 4:2731 (1985), Christou et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 84:3962 (1987). Comprensión directa de ADN en protoplastos usando precipitación de CaCl2, alcohol polivinílico o poli-L-ornitina también ha sido proporcionada. 50
Hain et al., Mol. Gen. Genet. 199:161 (1985) y Draper et al., Plant Cell Physiol. 23:451 (1982). Electroporación de protoplastos y células enteras y tejidos también han sido descritas.
Donn et al., en Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p. 53 (1990); D'Halluin et al., Plant Cell 4:1495-1505 (1992) y Spencer et al., Plant Mol. Biol. 24:51-61 (1994).
55
[0238] Otra forma de realización de la presente invención se refiere a un anticuerpo aislado o fragmento de unión de antígeno del mismo capaz de unión selectiva a una proteína de la presente invención.
El agente aglutinante se enlaza selectivamente a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID Nº:32.
[0239] Según la presente invención, la frase "se enlaza selectivamente" se refiere a la capacidad de un anticuerpo, 60 fragmento de unión de antígeno de la presente invención para preferentemente enlazar con proteínas específicas.
Más específicamente, la frase "enlaza selectivamente" se refiere al enlace específico de una proteína a otra (por ejemplo, un anticuerpo, fragmento del mismo, o compañero de unión a un antígeno), donde el nivel de la unión, como medido por cualquier ensayo estándar (por ejemplo, un inmunoensayo), es estadísticamente significativamente superior al control de fondo para el ensayo. 65
Por ejemplo, cuando se realiza un inmunoensayo, los controles típicamente incluyen un pocillo/tubo de reacción que contiene sólo fragmento de unión de anticuerpo o antígeno (es decir, en ausencia de antígeno), donde una cantidad de reactividad (por ejemplo, unión inespecífica al pocillo) por el anticuerpo o el fragmento de unión de antígeno del mismo en ausencia del antígeno se considera básico.
La unión se puede medir utilizando una variedad de métodos estándar en la técnica incluyendo inmunoensayos 5 enzimáticos (por ejemplo, ELISA, ensayos de inmunotransferencia, etc. ).
[0240] Los anticuerpos se caracterizan por el hecho de que comprenden dominios de inmunoglobulina y como tal, son miembros la superfamilia de inmunoglobulinas de proteínas.
Un anticuerpo de la invención incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos bivalentes y 10 monovalentes, anticuerpos bi- omulti-específicos, suero que contiene tales anticuerpos, anticuerpos que han sido purificados a grados variables, y cualquier equivalente funciona de anticuerpos enteros.
Los anticuerpos aislados de la presente invención pueden incluir suero que contienen tales anticuerpos, o anticuerpos que han sido purificados a grados variables.
Los anticuerpos enteros de la presente invención pueden ser policlonales o monoclonales. 15
Alternativamente, los equivalentes funcionales de anticuerpos enteros, tales como fragmentos de unión al antígeno donde uno o varios dominios de anticuerpos son truncados o ausente (por ejemplo, fragmentos Fv, Fab, Fab, o F(ab)2), al igual que anticuerpos diseñados genéticamente o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, incluyendo anticuerpos monocatenarios o anticuerpos que pueden enlazar con más de un epítopo (por ejemplo, anticuerpos bi-específicos), o anticuerpos que pueden enlazar con uno o varios antígenos diferentes (por ejemplo, 20 anticuerpos bi- o multi-específicos), también pueden ser usados en la invención.
Los métodos para la generación y producción de anticuerpos se conocen bien en la técnica.
[0241] Los anticuerpos monoclonales se pueden producir según la metodología de Kohler y Milstein (Nature 256:495-497,1975). 25
Los polipéptidos sin anticuerpos, a veces llamados socios de unión, se diseñan para enlazar específicamente a una proteína de la invención.
Los ejemplos del diseño de tales polipéptidos, que poseen una especificidad de ligando prescrito se dan en Beste et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 96:1898-1903,1999).
En una forma de realización, un agente aglutinante de la invención se inmoviliza en un sustrato tal como: 30 membranas artificiales, soportes orgánicos, soportes de biopolimero y soportes inorgánicos tales como para usar en un ensayo de selección.
[0242] Las proteínas de la presente invención, al menos una proteína de la presente invención, las composiciones que comprenden tales proteína(s) de la presente invención, y las composiciones de multienzima (ejemplos de las 35 cuales son anteriormente descrita) se pueden utilizar en cualquier método dónde es deseable hidrolizar enlaces glicosídicos en el material lignocelulósico, o cualquier otro método donde enzimas de la misma función o similar son útiles.
[0243] En una forma de realización, la presente invención incluye el uso de al menos la proteína de la presente 40 invención, composiciones que comprenden al menos la proteína de la presente invención, o composiciones de multienzima en métodos para hidrolizar la lignocelulosa y generar azúcares fermentables desde ahí.
En una forma de realización, el método comprende poner en contacto el material lignocelulósico con una cantidad eficaz de una o varias proteínas de la presente invención, una composición que comprende al menos la proteína de la presente invención, o una composición de multienzima, donde se produce (libera) al menos un azúcar 45 fermentable.
El material lignocelulósico puede ser parcialmente o completamente degradado en azúcares fermentables.
Los niveles económicos de degradación a costes comercialmente viables son contemplados.
[0244] Típicamente, la cantidad de enzima o composición enzimática puesta en contacto con la lignocelulosa 50 dependerá de la cantidad de glucano presente en la lignocelulosa.
En algunas formas de realización, la cantidad de enzima o composición enzimática puesta en contacto con la lignocelulosa puede ser de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 200 mg de enzima o composición enzimática por gramo de glucano; en otras formas de realización, de aproximadamente 3 a aproximadamente 20 mg de enzima o composición enzimática por gramo de glucano. 55
La divulgación abarca el uso de cualquier cantidad adecuada o suficiente de enzima o composición enzimática entre aproximadamente 0.1 mg y aproximadamente 200 mg de enzima por gramo de glucano, en incrementos de 0.05 mg (es decir, 0.1 mg, 0.15 mg, 0.2 mg ... 199.9 mg, 199.95 mg, 200 mg).
[0245] En otra forma de realización, la invención proporciona un método para la degradación de DDG, 60 preferiblemente, pero no limitado a, DDG derivado de maíz, en azúcares.
El método comprende poner en contacto el DDG con una proteína de la presente invención, una composición que comprende al menos la proteína de la presente invención, o una composición de multienzima de la presente invención.
En formas de realización determinadas, al menos 10% de azúcares fermentables son liberados. 65
En otra forma de realización, al menos 15% de los azúcares son liberados, o al menos 20% de los azúcares son liberados, o al menos 23% de los azúcares son liberados, o al menos 24% de los azúcares son liberados, o al menos 25% de los azúcares son liberados, o al menos 26% de los azúcares son liberados, o al menos 27% de los azúcares son liberados, o al menos 28% de los azúcares son liberados.
5
[0246] En otra forma de realización, la invención proporciona un método para la producción de azúcares fermentables que comprenden el cultivo de un microorganismo genéticamente modificado de la presente invención en un medio nutritivo que comprende un material lignocelulósico, donde azúcares fermentables son producidos.
[0247] También se proporcionan métodos que comprenden poner en contacto además el material lignocelulósico 10 con al menos una enzima accesoria.
Las enzimas accesorias se han descrito aquí.
La enzima o enzimas accesorias se pueden añadir lo mismo tiempo, antes, o después de la adición de una proteína de la presente invención, una composición que comprende al menos la proteína de la presente invención, o una composición de multienzima de la presente invención, o se puede expresar (endogenamente o sobreexpresada) en 15 un microorganismo genéticamente modificado usado en un método de la invención.
Cuando se añade simultáneamente, la proteína de la presente invención, una composición que comprende al menos la proteína de la presente invención, o una composición de multienzima de la presente invención será compatible con las enzimas accesorias seleccionadas.
Cuando las enzimas son agregadas después del tratamiento con la proteína de la presente invención, una 20 composición que comprende al menos la proteína de la presente invención, o una composición de multienzima de la presente invención, las condiciones (tales como temperatura y pH) se pueden alterar para que sean óptimas para la enzima accesoria antes, durante, o despuésde la adición de la enzima accesoria.
La adición de enzima de ciclos múltiples son también englobadas.
La enzima accesoria también puede estar presente en el mismo material lignocelulósico como resultado de modificar 25 genéticamente la planta.
El medio nutritivo usado en una fermentación puede también comprender una o varias enzimas accesorias.
[0248] En algunas formas de realización, el método comprende un proceso de pretratamiento.
En general, un proceso de pretratamiento resultará en que los componentes de la lignocelulosa sean más accesibles 30 para aplicaciones hacia abajo o de modo que sea más digerible por de enzimas tras el tratamiento en ausencia de hidrólisis.
El pretratamiento puede ser un pretratamiento químico, físico o biológico.
La lignocelulosa puede ser previamente tratada para liberar alguno o todos los azúcares, como en el caso de DDG.
Los tratamientos físicos, tales como pulido, ebullición, congelación, fresado, infiltración de vacío y similares también 35 pueden ser usados con los métodos de la invención.
En una forma de realización, el tratamiento térmico comprende el calentamiento del material lignocelulósico a 121°C durante 15 minutos.
Un tratamiento físico tal como el fresado puede permitir que se use una concentración más alta de lignocelulosa en los métodos de la invención. 40
Una concentración más alta se refiere a aproximadamente 20%, hasta aproximadamente 25%, hasta aproximadamente 30%, hasta aproximadamente 35%, hasta aproximadamente 40%, hasta aproximadamente 45%, o hasta aproximadamente 50% de lignocelulosa.
La lignocelulosa también puede estar conectada con un ión metálico, luz ultravioleta, ozono, y similares.
Los procesos de pretratamiento adicional son conocidos por los expertos en la técnica, y pueden incluir, por ejemplo, 45 tratamiento organosolv, tratamiento de explosión de vapor, impregnación de cal con tratamiento de explosión de vapor, tratamiento de peróxido de hidrógeno, tratamiento de peróxido/ozono de hidrógeno (peroxone), tratamiento ácido, tratamiento de ácido diluído, y tratamiento de base, incluyendo tecnología de explosión de fibra de amoníaco (AFEX).
Detalles en las tecnologías de pretratamiento y procesos se pueden encontrar en Wyman et al., Bioresource Tech. 50 96:1959 (2005); Wyman et al., Bioresource Tech. 96:2026(2005); Hsu, "Pretreatment of biomass" In Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, Taylor and Francis Eds., p. 179-212 (1996); and Mosier et al., Bioresource Tech. 96:673 (2005).
[0249] En una forma de realización adicional, el método comprende detoxificación del material lignocelulósico. 55
La dextoxification puede ser deseable el caso de que los inhibidores estén presentes en el material lignocelulósico.
Tales inhibidores se pueden generar por un proceso de pretratamiento, que deriva de la degradación de azúcar o son directamente liberados del polímero de lignocelulosa.
La detoxificación puede incluir la reducción de su formación ajustando las condiciones de extracción de azúcar; el uso de cepas tolerantes al inhibidor o degradadoras de inhibidor de microorganismos. 60
La detoxificación también puede ser realizada por la adición de resinas de cambio de iones, carbón activo, detoxificación enzimática que usa, por ejemplo, lacasa, y similares.
En algunas formas de realización, las proteínas, composiciones o productos de la presente invención comprenden además agentes de detoxificación.
65
[0250] En algunas formas de realización, los métodos se pueden realizar una o más veces completamente o en parte.
Es decir, se pueden realizar uno o varios pretratamientos, seguidos de una o varias reacciones con una proteína de la presente invención, composición o producto de la presente invención y/o enzima accesoria.
Las enzimas se pueden añadir en una dosis individual, o se pueden añadir en una serie de dosis pequeñas. 5
Además, el proceso entero se puede repetir una o más veces como sea necesario.
Por lo tanto, son contemplados uno o varios tratamientos adicionales con calor y enzimas.
[0251] Los métodos anteriormente descritos suponen la producción de azúcares fermentables.
Durante, o después de los métodos descritos, los azúcares fermentables pueden ser recuperados. 10
En el caso de un cultivo de microorganismos, los azúcares se pueden recuperar a través de un método de lote continuo o lote alimentado.
Los azúcares recuperados se pueden concentrar o purificar.
La recuperación puede ocurrir por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitado a, lavado, flujo de gravedad, presión, cromatografía, extracción, cristalización (por ejemplo, cristalización vaporizable), 15 separación de membrana, ósmosis inversa, destilación, y filtración.
Los azúcares se pueden someter a más tratamientos; por ejemplo, también pueden ser esterilizados, por ejemplo, por filtración.
[0252] En una forma de realización relacionada, la divulgación proporciona medios para mejorar la calidad de 20 material lignocelulósico, incluyendo DDG para nutrición animal.
En una forma de realización, el material lignocelulósico tratado (por ejemplo, un material lignocelulósico que ha sido sacarificado) es recuperado (por ejemplo, tiene los azúcares solubles quitados).
El material recuperado se puede usar como un aditivo de pienso.
Se cree que el material recuperado tendrá propiedades beneficiosas para la nutrición animal, posiblemente debido a 25 un contenido más alto de proteínas.
En algunas formas de realización, la cantidad de enzima o composición enzimática puesta en contacto con el material lignocelulósico puede ser de aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 1.0 % del peso del material lignocelulósico; en otras formas de realización, de aproximadamente 0.005 % a aproximadamente 0.1 % del peso del material lignocelulósico. 30
La divulgación incluye el uso de cualquier cantidad de enzima o composición enzimática entre aproximadamente 0.0001 % y aproximadamente 1.0%, en incrementos de 0.0001 (es decir, 0.0001, 0.0002,0.0003 ... etc.).
[0253] En una forma de realización adicional, la invención proporciona un método para la producción de una sustancia orgánica, que comprende la sacarificación de un material lignocelulósico con una cantidad eficaz de una 35 proteína de la presente invención o una composición que comprende al menos la proteína de la presente invención, la fermentación del material lignocelulósico sacarificado obtenido con uno o varios microorganismos fermentadores, y la recuperación de la sustancia orgánica de la fermentación.
Los azúcares liberados de biomasa se pueden convertir en productos de fermentación útiles incluyendo pero no limitado a aminoácidos, vitaminas, fármacos, suplementos de pienso para animales, productos químicos de 40 especialidad, materias primas químicas, plásticos, solventes, combustibles, u otros polímeros orgánicos, ácido láctico, y etanol, incluyendo etanol combustible.
Los productos específicos que se pueden producir según los métodos de la invención incluyen, pero no están limitados a, biocombustibles (incluyendo etanol); ácido láctico; plásticos; productos químicos de especialidad; ácidos orgánicos, incluyendo ácido cítrico, ácido succínico y ácido maléico; solventes; suplementos de pienso para 45 animales; fármacos; vitaminas; aminoácidos, tal como lisina, metionina, triptófano, treonina, y ácido aspártico; enzimas industriales, tales como proteasas, celulasas, amilasas, glucanasas, lactasas, lipasas, liasas, oxidorreductasas, y transferasas; y materias primas químicas.
Los métodos de la invención son también útiles para generar materias primas para fermentación por microorganismos fermentadores. 50
En una forma de realización, el método comprende además la adición de al menos un organismo fermentador.
Como se utiliza en este caso, "organismo de fermentación" se refiere a un organismo capaz de fermentación, tales como bacterias y hongos, incluyendo levadura.
Tales materias primas tienen un valor nutritivo adicional sobre el valor nutritivo proporcionado por los azúcares liberados. 55
[0254] La proteína de la presente invención y las composiciones que comprenden al menos la proteína de la presente invención son también útiles en una variedad de otra aplicaciones implicando la hidrólisis de enlaces glicosídicos en el material lignocelulósico, tales como lavado de piedra, abrilantación de color, defrisado y reblandecimiento de tejido, al igual que otras aplicaciones bien conocidas en la técnica. Las proteínas de la presente 60 invención y composiciones que comprenden al menos la proteína de la presente invención son también fácilmente listas para ser usadas como aditivos en el detergente y otros medios usados para este tipo de aplicaciones.
Estos y otros métodos de uso fácilmente se sugerirán por sí mismos a los de habilidad en la técnica basándose en la invención descrita aquí.
65
[0255] En una forma de realización de esta invención, la proteína y las composiciones de la presente invención se pueden usar en los procedimientos de lavado de piedra para tejidos u otros tejidos.
En algunas formas de realización, la proteína y las composiciones se pueden usar en los procedimientos de lavado a la piedra para jeans de tela vaquera.
Por medio de ejemplo, el método para lavar a la piedra el tejido comprende poner en contacto el tejido con una 5 proteína o composición de la presente invención.
En una forma de realización adicional, la proteína o composición de la presente invención se incluye en una composición de detergente, como se describe abajo.
Un margen de pH preferido de aplicaciones de lavado a la piedra está entre aproximadamente 5.5 y 7.5, de la forma más preferiblede alrededor de pH 6 a aproximadamente 7. 10
Uno de habilidad en la técnica sabrá regular la cantidad o concentración de la proteína o composición producida por esta invención basándose en tales factores como la actividad de la enzima y las condiciones de lavado, incluyendo pero no limitado a temperatura y pH.
Ejemplos de estos usos se pueden encontrar en publicación de solicitud de patente US nº 2003/0157595.
15
[0256] En otra forma de realización de esta divulgación, las composiciones de celulasa de esta invención pueden utilizarse para reducir o eliminar la dureza asociada a un tejido o textil poniendo en contacto el tejido o textil con una proteína o composición de la presente invención.
En algunas formas de realización, el tejido o textil puede ser hecho de celulosa o algodón.
Por medio de ejemplo, una gama preferida para la reducción o eliminando la dureza asociada a un tejido o textil está 20 de entre aproximadamente pH 8 a aproximadamente 12, o entre aproximadamente pH 10 a aproximadamente 11.
[0257] La proteína o las composiciones de la presente invención se pueden usar en composiciones detergentes.
En una forma de realización, la composición de detergente puede comprender al menos una proteína o composición de la presente invención y uno o varios surfactantes. 25
Las composiciones detergentes también pueden incluir ingrediente de detergente adicional conocidos en la técnica. Los ingredientes detergentes contemplados para uso con las composiciones detergentes de la presente invención incluyen, pero de forma no limitativa, detergentes, tampones, surfactantes, blanqueadores, suavizantes, solventes, agentes de formación de sólidos, abrasivos, álcalis, electrolitos inorgánicos, activadores de celulasa, antioxidantes, constructores, silicatos, conservantes, y estabilizadores. 30
Las composiciones detergentes de esta invención preferiblemente emplean un agente activo de superficie, es decir, tensioactivo, incluyendo, surfactantes aniónicos, no iónicos y anfolíticos bien conocidos para su uso en composiciones detergentes.
Además de la proteína o composición de la presente invención y el agente activo de superficie, las composiciones detergentes de esta invención pueden adicionalmente contener uno o varios de los siguientes componentes: las 35 enzimas amilasas, celulasas, proteinasa, lipasas, óxido-reductasas, peroxidasas y otras enzimas; surfactantes catiónicos y ácidos grasos de cadena larga; constructores; agentes anti-redeposición; blanqueadores; agentes de azulado y colorantes fluorescentes; inhibidores de apelmazamiento; enmascarar agentes para factores inhibidores de la actividad de celulasa; activadores de celulasa; antioxidantes; y solubilizantes.
Además, perfumes, conservantes, colorantes, y similares pueden ser usados, si se desea, con las composiciones 40 detergentes de esta invención.
Los ejemplos de composiciones detergentes que usan celulasas se ejemplifican en US Pat. Nº. 4,435,307, 4,443,355, 4,661,289, 4,479,881, 5,120,463.
[0258] Cuando una base detergente usada en la presente invención está en forma de un polvo, puede ser una que 45 se prepara por cualquier método de preparación conocida que incluye un método de secado por pulverización y/o un método de granulación.
Los métodos de granulación son los más preferidos debido a la naturaleza no pulverulenta de gránulos en comparación con productos secos de spray.
La base detergente obtenida por el método de secado por pulverización son gránulos huecos que se obtienen 50 pulverizando un compuesto líquido acuoso de ingredientes termorresistentes, tales como agentes activos de superficie y constructores, en un espacio caliente.
Los gránulos tienen un tamaño de aproximadamente de 50 a aproximadamente 2000 micrómetros.
Después del secado por pulverización, perfumes, enzimas, blanqueadores, y/o constructores alcalinos inorgánicos pueden ser añadidos. 55
Con una base de detergente altamente denso granuloso obtenido tal como por el método pulverización-secado-granulación, varios ingredientes también puede ser añadidos después de la preparación de la base.
Cuando la base detergente es un líquido, puede ser bien una solución homogénea o una solución inhomogénea.
[0259] Otras aplicaciones textiles donde proteínas y composiciones de la presente divulgación que se pueden utilizar 60 incluyen, pero de forma no limitativa, aplicaciones de tintura de prenda tal como mercerización enzimática de viscosa, aplicaciones de biopulido, pulido de superficie enzimática; biolavado (lavado o lavado bajo tratamiento de materiales textiles), microfibrilación enzimática, "algodonización" enzimática de lino, ramio y cáñamo; y tratamiento de liocel o Newcell (es decir, "TENCEL"de Courtauld's), cupro y otras fibras celulósicas o prendas, eliminación de tinte de sustratos celulósicos teñidos tales como algodón teñido (Leisola & Linko--(1976) Analytical Biochemistry, v. 65 70, p. 592. Determination Of The Solubilizing Activity Of A Cellulase Complex With Dyed Substrates; Blum & Stahl--
Enzymic Degradation Of Cellulose Fibers; Reports of the Shizuoka Prefectural Hamamatsu Textile Industrial Research Institute Nº 24 (1985)), como un blanqueante para hacer que tela vaquera teñida de índigo nueva parezca vieja ((Suzuki--Great Britain Patent Nº 2 094 826), para mejorar la acción de blanqueo de blanqueadores (Suzuki--Great Patente de bretaña nº 2 094 826), y en un proceso para composiciones para desencolado y blanqueo enzimático de tejidos (Windbichtler et al., US Pat. nº 2,974,001. 5
Otro ejemplo de desencolado enzimático que usa celulasas se proporciona en Bhatawadekar (May 1983) Journal of the Textile Association, pages 83-86.
[0260] La cantidad de enzima o composición enzimática contactada con un textil puede variar con la aplicación particular. 10
Típicamente, para el bioacabado y las aplicaciones de lavado de tela vaquera, de aproximadamente 0.02 en peso % a aproximadamente 5 en peso % de una enzima o composición enzimática se puede poner en contacto con el textil.
En algunas formas de realización, de aproximadamente 0.5 en peso % a aproximadamente 2 en peso % de una enzima o composición enzimática se puede poner el contacto con el textil.
Para el biodescrudado, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10, o de aproximadamente 0.1 a 15 aproximadamente 1.0 gramos de una enzima o composición enzimática por kilogramo de textil pueden ser utilizados, incluyendo cualquier cantidad entre aproximadamente 0.1 gramos y aproximadamente 10 gramos, en incrementos de 0.1 gramos.
[0261] En otras formas de realización, la proteína o las composiciones de la presente invención se pueden usar en la 20 sacarificación de biomasa de lignocelulosa de agricultura, productos de bosque, residuos sólidos municipales, y otras fuentes, para el bioblanqueo de pulpa de madera, y para el destintado de papel de impresión reciclada, todo por métodos conocidos por un experto en la técnica.
[0262] La cantidad de enzima o composición enzimática usada para modificación de pulpa y papel (por ejemplo, 25 bioblanqueo de pulpa de madera, destintado de papel, o biorefinación de pulpa para fabricación de papel) varía típicamente dependiendo de la materia prima que es usada, el pH y temperatura del sistema, y el tiempo de retención.
En formas de realización determinadas, la cantidad de enzima o composición enzimática puesta en contacto con el papel o pulpa puede ser de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 50 U; de aproximadamente 0.1 a 30 aproximadamente 15 U; o de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 5 U de enzima o composición enzimática por gramo de fibra seco, incluyendo cualquier cantidad entre aproximadamente 0.01 y aproximadamente 50 U, en incrementos de 0.01 U.
En otras formas de realización, la cantidad de enzima o composición enzimática puesta en contacto con el papel o pulpa puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 2000 gramos o de aproximadamente 100 a 35 aproximadamente 500 gramos de enzima o composición enzimática por tonelada de pulpa seca, incluyendo cualquier cantidad entre aproximadamente 1 y aproximadamente 2000 gramos, en incrementos de 1 gramo.
[0263] Las proteínas o las composiciones de la presente divulgación pueden ser añadidas a aguas residuales para reducir la cantidad de sólidos tales como residuos o para aumentar demanda de oxígeno bioquímico total (BOD) y 40 eliminación de demanda de oxígeno químico (COD).
Por ejemplo, las proteínas o las composiciones de la presente invención pueden utilizarse para transformar COD granuloso para COD soluble en aguas residuales producidas de procesos industriales de grano/fruta/celulosa o para aumentar la proporción de BOD/COD mediante el aumento de la biodegradabilidad de residuos (polímeros solubres de peso molecular más bajo en desperdicios celulósico/hemicelulósicos son típicamente más fácilmente 45 biodegradables que el material no-soluble).
En los sistemas de tratamiento de aguas residuales biológicas, las proteínas o las composiciones de la presente invención también pueden usarse para aumentar la digestión de residuos por bacterias aeróbicas y/o anaeróbicas.
[0264] Quitinasas de la presente divulgación (por ejemplo, SEC ID Nº: 56 y 59) pueden hidrolizar la conexión P-1,4-50 glicosídica presente en quitina y así se pueden utilizar para degradar materiales que contienen quitina.
Los ejemplos de materiales que contienen quitina incluyen paredes de célula fúngica, exoesqueletos de insecto, huevos de gusanos parasitarios, y conchas de crustáceo.
[0265] Las quitinasas se pueden utilizar paran inhibir o reducir el crecimiento fúngico, con el tratamiento de 55 infecciones fúngicas tales como las provocadas por los hongos de uña.
Por ejemplo, las quitinasas de la presente divulgación se pueden aplicar a cualquier hongo o área susceptible de crecimiento fúngico.
Las quitinasas también puede usarse para revestir o tratar semillas y bulbos de flores para prevenir el crecimiento de hongos. 60
Además, las quitinasas se pueden añadir a cultivos fúngicos para bajar la viscosidad de cultivo mediante el aumento de la degradación de la pared celular.
Las quitinasas también pueden ser usadas como enzimas de lisado para la generación de protoplastos de hongos (ver, por ejemplo, Yano et al., Biosci Biotechnol Biochem. 70:1754 (2006).
65
[0266] Las quitinasas o composiciones que contienen quitinasas se pueden utilizar como un agente de control biológico tal como un insecticida (ver, por ejemplo, Kramer et al., Inspect Biochem Mol Biol. 27:887 (1997).
Las quitinasas de la presente divulgación han demostrado ser eficaces para controlar las larvas de mosca blanca en las pruebas de laboratorio.
Así, las quitinasas se pueden aplicar a cultivos, planta y similares para controlar infestaciones de insectos. 5
[0267] También se ha sugerido que la quitina juega un papel en la inducción de inflamación alérgica y asma (ver Reese et al., Nature 447:92 (2007)).
Por consiguiente, las quitinasas de la presente divulgación se pueden administrar a un sujeto para reducir respuestas inflamatorias alérgicas inducidas por quitina o para reducir los síntomas de asma. 10
[0268] Métodos ejemplares según la invención y divulgación se presentan por debajo.
Los ejemplos de los métodos anteriormente descritos también pueden verse en las siguientes referencias: Trichoderma & Gliocladium. Volume 2. Enzymes, biological control and commercial applications. Editors: Gary E. Harman, Christian P. Kubicek. Taylor & Francis Ltd 1998, 393 (in particular, chapters 14, 15 and 16) Helmut Uhlig. 15 Industrial enzymes and their applications. Translated and updated by Elfriede M. Linsmaier-Bednar. John Wiley & Sons, Inc 1998, p. 454 (in particular, chapters 5.1, 5.2, 5.3,5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.9, 5.10, 5.11, and 5.13) For saccharification applications: Hahn-Hagerdal, B., Galbe, M., Gorwa-Grauslund, M.F. Lidén, Zacchi, G. Bio-ethanol - the fuel of tomorrow from the residues of today. Trends in Biotechnology. 2006, 24 (12), 549-556; Mielenz, J.R. Ethanol production from biomass: technology and commercialization status. Current Opinion in Microbiology. 2001, 4, 20 324-329; Himmel, M.E., Ruth, M.F., Wyman, C.E. Cellulase for commodity products from cellulosic biomass. Current Opinion in Biotechnology. 1999, 10, 358-364; Sheehan, J., Himmel, M. Enzymes, energy, and the environment: a strategic perspective on the U.S. Department of Energy's Research and Development Activities for Bioethanol. Biotechnology Progress. 1999, 15, 817-827.
Para aplicaciones de tratamiento textil: Galante, Y.M., Formantici, C. Enzyme applications in detergency and in 25 manufacturing industries. Current Organic Chemistiy. 2003, 7, 1399-1422.
Para aplicaciones de pulpa y papel: Bajpai, P., Bajpai, P.K Deinking with enzymes: a review. TAPPI Journal. 1998. 81(12), 111-117; Viikari, L., Pere, J., Suurnäkki, A., Oksanen, T., Buchert, J. Use of cellulases in pulp and paper applications. In: "Carbohydrates from Trichoderma reesei and other microorganisms. Structure, Biochemistry, Genetics and Applications." Editors: Mark Claessens, Wim Nerinckx, and Kathleen Piens. The Royal Society of 30 Chemistry 1998, 245-254.
Para aplicaciones de alimento y bebida: Roller, S., Dea, I.C.M. Biotechnology in the production and modification of biopolymers for foods. Critical Reviews in Biotechnology. 1992, 12(3), 261-277.
[0269] Los ejemplos siguientes se proporcionan con motivo de ilustración y no pretenden limitar el alcance de la 35 presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1 40
[0270] El ejemplo siguiente ilustra el ensayo de Somogyi-Nelson usado para medir la actividad enzimática de beta-glucanasa.
[0271] Este ensayo mide la liberación de azúcares reductores (como equivalentes de glucosa) por la acción de β-45 glucanasa en un β-glucano soluble.
Una unidad de actividad β-glucanasa es la cantidad de enzima que libera 1 micromol de azúcares reductores, expresado como equivalentes de glucosa, en un minuto a 50° C y pH 5.0.
Reactivos 50
[0272] El tampón de acetato (0.05 M, pH 5.0) se prepara de la siguiente manera. 4,1 G de acetato sódico anhidro o 6,8 g de acetato sódico * 3H2O es disuelto en agua destilada de modo que el volumen final de la solución es 1000 mL (solución A).
En un matraz separado, 3.0 g (2.86 mL) de ácido acético glacial se mezcla con agua destilada para llegar a un 55 volumen total de 1000 mL (solución B).
El tampón acetato final 0.05 M, pH 5.0, se prepara mediante la mezcla de solución A con solución B hasta que el pH de la solución resultante es igual a 5.0.
[0273] β-glucano de cebada (viscosidad media, Megazyme, P-BGBM) se usa como el sustrato de ensayo. 60
El sustrato se mole en un mortero antes de la disolución. 1% de solución madre de p/v es preparada de la siguiente manera. 500 Mg de β-glucano se mezclan con 50 mL de agua destilada y agitada en un agitador magnético durante 1 hora.
Después de eso, la suspensión se coloca en un baño ultrasónico Bandelin SONOREX TK52 durante 10 minutos para destruir partículas no disueltas y luego en un baño maría de ebullición hasta que la solución se vuelve clara. 65
Finalmente, la solución se agita en un agitador magnético durante 30 minutos.
La solución es típicamente estable durante 2 días.
[0274] El reactivo de Somogyi se prepara de la siguiente manera. 24 G de carbonato de sodio anhidro y 12 g de tartrato de potasio de sodio tetrahidrato son disueltos en 250 mL de agua destilada.
Una solución de pentahidrato de sulfato cúprico (4 g en 40 mL de agua destilada) se añade en la agitación, y luego 5 16 g de bicarbonato sódico es disuelto para obtener la solución A.
En un matraz separado, 180 g de sulfato de sodio es disuelto en 500 mL de agua destilada caliente (∼80° C) y hervido durante 5 minutos (solución B).
La solución A se mezcla con la solución B y el volumen final se ajusta a 1000 mL.
El reactivo es estable durante 2-3 meses en almacenamiento en un matraz oscuro. 10
[0275] El reactivo de Nelson se prepara de la siguiente manera. 50 G de molibdato de amonio es disuelto en 900 mL de agua destilada caliente (∼60° C).
La solución se enfría a 5-10°C y 42 g de ácido sulfúrico concentrado con 6 g de arseniato de sodio son cuidadosamente añadidos en la agitación. 15
El volumen de la mezcla se ajusta a 1000 mL.
El matraz se incuba a 40°C durante 48 horas y luego la solución es filtrada si es necesario.
El reactivo es estable durante 2-3 meses.
[0276] Usando los reactivos anteriores, el ensayo se realiza como detallada por debajo. 20
Forma preliminar reactiva
[0277] 0.5 mL de 0.05 M búfer de acetato sódico se mezcla en un tubo de ensayo de cristal graduado (1.5 cm x 15 cm) con 0.5 mL de reactivo de Somogyi e incubado en un baño maría durante 40 minutos. 25
Luego, la probeta se enfría en un baño de hielo o agua fría y 0.5 mL de reactivo de Nelson se añade y mezcla por agitación manualmente.
Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, el volumen de solución se ajusta a 5 mL con agua destilada.
30
Muestra enzimática
[0278] 0.25 mL de 1% p/v de la solución madre de β-glucano se mezcla con 0.15 mL de 0.05 M tampón acetato, pH 5.0, en los tubos de ensayo de vidrio graduado (1.5 cm x 15 cm) y precalentado a 50°C durante 5 minutos.
La muestra enzimática es adecuadamente diluida por el búfer de acetato sódico 0.05 M (la dilución de la muestra 35 enzimática es elegida de modo que A610 debería estar entre 0.05 y 0.4 unidades de densidad óptica). 0.1 ML de muestra de enzima adecuadamente diluida se añade a 0.4 mL de la solución de sustrato precalentado, mezclado e incubado a 50°C durante 10 minutos.
Después de exactamente 10 minutos de incubación, 0.5 mL de reactivo de Somogyi se añade, y los tubos de ensayo se colocan en un baño maría durante 40 minutos. 40
Luego, los tubos de ensayo se enfrían en un baño de hielo o agua fría y 0.5 mL de reactivo de Nelson se añade y mezcla por agitación manualmente.
Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, el volumen de solución se ajusta a 5 mL con agua destilada.
Luego, la absorbancia a 610 nm (A610) se mide contra la forma preliminar reactiva como As (muestra enzimática). 45
Forma preliminar enzimática
[0279] 0.4 mL de 0.05 M búfer de acetato sódico se mezcla en un tubo de ensayo de cristal graduado (1.5 cm x 15 cm) con 0.1 mL de muestra de enzima con la misma dilución que por encima. 0.5 ML de reactivo de Somogyi se 50 añade y la probeta se incuba en un baño maría durante 40 minutos.
Luego, la probeta se enfría en un baño de hielo o agua fría y 0.5 mL de reactivo de Nelson se añade y mezcla por agitación manualmente.
Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, el volumen de solución se ajusta a 5 mL con agua destilada. 55
Luego, la absorbancia a 610 nm (A610) se mide contra la forma preliminar reactiva como AEB (forma preliminar enzimática).
Forma preliminar de sustrato
60
[0280] 0.25 mL de 1% p/v solución madre de β-glucano se mezcla con 0.25 mL de 0.05 M tampón acetato, pH 5.0, en un tubo de ensayo de cristal graduado (1.5 cm x 15 cm), 0.5 mL de reactivo de Somogyi se añade, y la probeta se coloca en un baño maría durante 40 minutos.
Luego, la probeta se enfría en un baño de hielo o agua fría y 0.5 mL de reactivo de Nelson se añade y mezcla por agitación manualmente. 65
Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, el volumen de solución se ajusta a 5 mL con agua destilada.
Luego, la absorbancia a 610 nm (A610) se mide contra la forma preliminar reactiva como ASB (forma preliminar de sustrato).
El valor de ASB no debería exceder 0.05 unidades de densidad óptica. 5
[0281] Todas las muestras enzimáticas y formas preliminares de enzima y sustrato deberían ser hervidas juntas.
Gráfico de calibración estándar
10
[0282] La solución de glucosa de materia prima (1 mg/mL) se prepara por la disolución de 100 mg de D-glucosa en 100 mL de 0.05 M tampón acetato, pH 5.0.
Luego, diluciones diferentes de solución de glucosa de materia prima son preparadas de la siguiente manera:
Solución madre (mL)
0.05 M tampón acetato (mL) Concentración de glucosa (mg/ml)
0.05
4.95 0.01
0.10
4.90 0.02
0.15
4.85 0.03
0.20
4.80 0.04
0.25
4.75 0.05
0.30
4.70 0.06
0.35
4.65 0.07
0.40
4.60 0.08
0.45
4.55 0.09
0.50
4.50 0.10
15
[0283] Muestras (0.5 mL) de solución de glucosa con diluciones diferentes se colocan en tubos de ensayo de vidrio graduado (1.5 cm x 15 cm). 0.5 ML de reactivo de Somogyi se añade y los tubos de ensayo se colocan en un baño maría durante 40 minutos.
Luego, los tubos de ensayo se enfrían en un baño de hielo o agua fría y 0.5 mL de reactivo de Nelson se añade y 20 mezcla por agitación manualmente.
Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, el volumen de solución se ajusta a 5 mL con agua destilada.
Luego, la absorbancia a 610 nm (A610) se mide contra la forma preliminar reactiva.
Los siguientes datos típicos A610 obtenidos con diluciones de glucosa diferente se dan por debajo: 25
Glucosa, mg/mL 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10
A610 0.11 0.20 0.28 0.41 0.48 0.60 0.72 0.79 0.93 1.06
Absorbancia (A610) en el eje y contra concentración de glucosa (G; mg/mL) en el eje x se fija para generar un gráfico de calibración estándar tal como el mostrado en la figura 11.
De figura 11, el inverso del pendiente (1/a = 0.098) es calculado. 30
Cálculo de actividad
[0284] La actividad es calculada de la siguiente manera: actividad (UI/ml) = 1/a * ΔA610 * DF * 2.78,
donde 1/a - inverso del agua calculada del gráfico de calibración estándar, ΔA610= A (muestra enzimática) - AEB 35 (forma preliminar enzimática) - ASB (forma preliminar de sustrato), DF es el factor de dilución enzimática, y 2.78 es el coeficiente que representa dilución enzimática adicional 5 veces en la mezcla reactiva (0,1 mL enzimático + 0,4 mL sustrato), tiempo de reacción (10 minutos) y peso molecular de glucosa (0.18016 mg/micromol), es decir 5/(10*0,18016) = 2.78
40
[0285] Un cálculo de ejemplo se suministra por debajo.
B4 UF concentrado DF ΔA610
20,000 0.545 45
40,000 0.316
80,000 0.154
Ejemplo 2 50
[0286] El ejemplo siguiente ilustra los ensayos usados para medir actividades enzimáticas de beta-glucosidasa, α-galactosidasa y β-galactosidasa.
[0287] Este ensayo mide la liberación de p-nitrofenol por la acción de β-glucosidasa en el p-nitrofenilo β-D-glucopiranoside (PNPG). 5
Las modificaciones en el ensayo para medir actividades enzimáticas de β-galactosidasa y β-galactosidasa se discuten por debajo.
Una unidad de actividad de β-glucosidasa es la cantidad de enzima que libera 1 micromol de p-nitrofenol en un minuto a 40 °C y pH 5.0.
10
Reactivos
[0288] Tampón acetato (0.1 M, pH 5.0) se prepara de la siguiente manera. 8.2 g de acetato sódico anhidro o 13,6 g de acetato sódico * 3H2O es disuelto en agua destilada de modo que el volumen final de la solución es 1000 (solución A). 15
En un matraz separado, 6.0 g (5.72 mL) de ácido acético glacial se mezcla con agua destilada para tener el volumen total de 1000 mL (solución B).
El M tampón acetato final 0.1, pH 5.0, se prepara mediante la mezcla de solución A con solución B hasta que el pH de la solución resultante es igual a 5.0.
20
[0289] PNPG de Sigma (EE.UU) se usa como el sustrato de ensayo. 6 mg de PNPG son disueltos en 2 mL de agua destilada usando un agitador magnético para obtener 10 mM de solución madre.
La solución es estable durante 2 día en almacenamiento a 4 °C.
[0290] El reactivo de parada (1 M solución de carbonato de sodio) es preparado de la siguiente manera. 10. 6 g de 25 carbonato de sodio anhidro es disuelto en 80 mL de agua destilada, y el volumen de solución se ajusta a 100 mL.
Este reactivo se utiliza para terminar la reacción enzimática.
[0291] Usando los reactivos anteriores, el ensayo se realiza como detallada por debajo.
30
Muestra enzimática
[0292] 0.09 mL de 10 mM solución madre PNPG se mezcla con 0.81 mL de tampón acetato 0.1 M, pH 5.0, y precalentado a 40° C durante 5 minutos.
La muestra enzimática es adecuadamente diluida con el búfer 0.1 M de acetato sódico (la dilución de la muestra 35 enzimática es elegida de modo que A400 debería ser de entre 0.05 y 0.35 unidades de densidad óptica). 0.1 ML de muestra de enzima adecuadamente diluida se añade a 0.9 mL de la solución de sustrato precalentado, mezclado e incubado a 40 °C durante 10 minutos.
Después de exactamente 10 minutos de incubación, 0.5 mL de solución de 1 M carbonato de sodio se añade y luego la absorbancia a 400 nm (A400) es medida como As (muestra enzimática). 40
Forma preliminar de sustrato
[0293] 0.09 mL de 10 mM solución madre PNPG se mezcla con 0.91 mL de 0.1 M tampón acetato, pH 5.0.
Luego, 0.5 mL de 1 M solución de carbonato de sodio se añade y la absorbancia a 400 nm (A400) es medida como 45 ASB (forma preliminar de sustrato).
Cálculo de actividad
[0294] La actividad es calculada de la siguiente manera: actividad (UI/ml) = ΔA400 * DF * 0.082, donde ΔA400= A 50 (muestra enzimática) - ASB (forma preliminar de sustrato), DF es el factor de dilución enzimática, y 0.082 es el coeficiente obtenido de la siguiente manera:
donde 106 es factor usado para convertir moles/L en el coeficiente de extinción en micromoles/L, 18300 M-1 cm-1 es el coeficiente de extinción de p-nitrofenol liberado, 10 minutos es el tiempo de reacción, y 0.1 mL es el volumen de 55 solución enzimática añadido a 0.0015 L del volumen de ensayo total.
[0295] Un cálculo de ejemplo se suministra por debajo.
B4 UF concentrado DF ΔA400
5,000 0.495 60
10,000 0.268
20,000 0.144
Para
Para
5
Finalmente, la actividad de β-glucosidasa = 228 IU/mL, como un valor medio entre dos mediciones.
Ensayos de α- y β-galactosidasa
[0296] Los procedimientos de ensayo para α- y β-galactosidasas son los mismos que el ensayo de β-glucosidasa 10 anteriormente descrito, excepto que p-nitrofenilo α-D-galactopiranósido y p-nitrofenilo β-D-galactopiranósido se usan como sustratos, respectivamente, en vez de p-nitrofenilo β-D-glucopiranosido.
Ejemplo 3
15
[0297] El ejemplo siguiente ilustra el ensayo de Somogyi-Nelson usado para medir la actividad enzimática de CMCasa.
[0298] Este ensayo mide la liberación azúcares reductores (como equivalentes de glucosa) por la acción de celulasa en un sustrato celulósico soluble (CMC). 20
Una unidad de CMCasa de actividad es la cantidad de enzima que libera 1 micromol de azúcares reductores, expresado como equivalentes de glucosa, en un minuto a 50° C, pH 5.0, 0.05 M búfer de acetato sódico.
Reactivos
25
[0299] El tampón acetato (0.05 M, pH 5.0) se prepara de la siguiente manera. 4.1 g de acetato sódico anhidro o 6.8g de acetato sódico * 3H2O es disuelto en agua destilada de modo que el volumen final de la solución es 1000 (solución A).
En un matraz separado, 3.0g (2.86 mL) de ácido acético glacial se mezcla con agua destilada para hacer el volumen total de 1000 mL (solución B). 30
El tampón acetato final 0.05 M, pH 5.0, se prepara mediante la mezcla de solución A con solución B hasta que el pH de la solución resultante es igual a 5.0.
[0300] La sal de sodio de carboximetilcelulosa (CMC, viscosidad media, Sigma, C 4888) se usa como el sustrato.
Un 1% de solución madre de p/v se prepara en 0.05 M tampón acetato, pH 5.0, añadiendo gradualmente 1.0 g de 35 CMC a 99 mL del búfer agitado en un agitador magnético.
La mezcla se agita hasta que el CMC es completamente disuelto.
La solución es estable durante 2 día a 4°C.
[0301] El reactivo de Somogyi se prepara de la siguiente manera. 24 G de carbonato de sodio anhidro y 12 g de 40 tartrato de potasio de sodio tetrahidrato son disueltos en 250 mL de agua destilada.
La solución de pentahidrato de sulfato cúprico (4 g en 40 mL de agua destilada) se añade en la agitación, y luego 16 g de bicarbonato sódico es disuelto para obtener la solución A.
En un matraz separado, 18. 0 g de sulfato de sodio es disuelto en 500 mL de agua destilada caliente (∼80° C) y hervido durante 5 min (solución B). 45
La solución A se mezcla con la solución B y el volumen final se ajusta a 1000 mL.
El reactivo es estable durante 2-3 meses en el almacenamiento en un matraz oscuro a temperatura ambiente.
[0302] El reactivo de Nelson se prepara de la siguiente manera. 50 G de molibdato de amonio es disuelto en 900 mL agua destilada a (∼60° C). 50
La solución se enfría a 5-10° C y 42 g de ácido sulfúrico concentrado con 6 g de arseniato de sodio son cuidadosamente añadidos en la agitación.
El volumen de la mezcla se ajusta a 1000 mL.
El matraz se incuba a 40° C durante 48 horas y luego la solución es filtrada si es necesario.
El reactivo es estable durante 2-3 meses a temperatura ambiente. 55
[0303] Usando los reactivos anteriores, el ensayo se realiza como detallado por debajo.
Forma preliminar reactiva
60
[0304] 0.5 mL de 0.05 M búfer de acetato sódico se mezcla en un tubo de ensayo de cristal graduado (1.5 cm x 15 cm) con 0.5 mL de reactivo de Somogyi e incubado en un baño maría durante 40 minutos.
Luego, la probeta se enfría en un baño de hielo o agua fría y 0.5 mL de reactivo de Nelson se añade y mezcla por agitación manual.
Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, el volumen de solución se ajusta a 5 mL con agua destilada.
5
Muestra enzimática
[0305] 0.25 mL de 1% p/v solución madre CMC se precalienta en tubos de ensayo de vidrio graduado (1.5 cm x 15 cm) a 50° C durante 5 minutos.
Las muestra enzimática son adecuadamente diluidas por el búfer de acetato sódico 0.05 M (la dilución de la muestra 10 enzimática es elegida de modo que A610 debería ser entre 0.05 y 0.35 unidades de densidad óptica) y precalentadas a 50° C durante 5 minutos. 0.25 ML de muestra de enzima adecuadamente diluida se añade a 0.25 mL de solución madre CMC precalentada, mezclada e incubada a 50° C durante 5 minutos.
Después de exactamente 5 minutos de incubación, 0.5 mL de reactivo de Somogyi se añade, y los tubos de ensayo se colocan en un baño maría durante 40 minutos. 15
Luego, los tubos de ensayo se enfrían en un baño de hielo o agua fría y 0.5 mL de reactivo de Nelson se añade y mezcla por agitación manualmente.
Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, 1 mL de acetona se añade para disolver precipitado CMC durante el procedimiento de ebullición y el volumen de solución se ajusta a 5 mL con agua destilada.
Luego, la absorbancia a 610 nm (A610) se mide contra la forma preliminar reactiva como As ( muestra enzimática). 20
Forma preliminar enzimática
[0306] 0.25 mL de 0.05 M búfer de acetato sódico se mezcla en un tubo de ensayo de cristal graduado (1.5 cm x 15 cm) con 0.25 mL de muestra de enzima con la misma dilución que por encima. 0.5 ML de reactivo de Somogyi se 25 añade y la probeta se incuba en un baño maría durante 40 minutos.
Luego, la probeta se enfría en un baño de hielo o agua fría y 0.5 mL de reactivo de Nelson se añade y mezcla por agitación manualmente.
Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, el volumen de solución se ajusta a 5 mL con agua destilada. 30
Luego, la absorbancia a 610 nm (A610) se mide contra la forma preliminar reactiva como AB (forma preliminar enzimática).
[0307] Todas las muestras enzimáticas y formas preliminares enzimáticas deberían ser hervidas juntas.
35
Gráfico de calibración estándar
[0308] Una solución de glucosa de materia prima (1 mg/mL) se prepara por la disolución de 100 mg de D-glucosa en 100 mL de tampón acetato 0.05 M, pH 5.0.
Luego, diluciones diferentes de solución de glucosa de materia prima son preparadas de la siguiente manera: 40
Solución madre (mL)
0.05 M tampón acetato (mL) Concentración de glucosa (mg/ml)
0.05
4.95 0.01
0.10
4.90 0.02
0.15
4.85 0.03
0.20
4.80 0.04
0.25
4.75 0.05
0.30
4.70 0.06
0.35
4.65 0.07
0.40
4.60 0.08
0.45
4.55 0.09
0.50
4.50 0.10
[0309] Muestras (0.5 mL) de solución de glucosa con diluciones diferentes se colocan en tubos de ensayo de vidrio graduado (1.5 cm x 15 cm). 0.5 ML de reactivo de Somogyi se añade y los tubos de ensayo se colocan en un baño maría durante 40 minutos. 45
Luego, los tubos de ensayo se enfrían en un baño de hielo o agua fría y 0.5 mL de reactivo de Nelson se añade y mezcla por agitación manualmente.
Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, el volumen de solución se ajusta a 5 mL con agua destilada.
Luego, la absorbancia a 610 nm (A610) se mide contra la forma preliminar reactiva. 50
Los siguientes datos típicos A610 obtenidos con diluciones de glucosa diferentes se dan por debajo:
Glucosa, mg/mL 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10
A610 0.11 0.20 0.28 0.41 0.48 0.60 0.72 0.79 0.93 1.06
La absorbancia (A610) en el eje y contra concentración de glucosa (G; mg/mL) en el eje x se fija para generar un gráfico de calibración estándar como el mostrado en la figura 11.
El inverso de la pendiente (1/a = 0.098) es calculado de figura 11.
5
Cálculo de actividad
[0310] La actividad es calculada de la siguiente manera: CMCasa (UI/ml) = 1/a * ΔA610 * DF * 2.22,
donde 1/a - inverso de la pendiente calculada del gráfico de calibración estándar, ΔA610= A (muestra enzimática) - AB (forma preliminar enzimática), DF - factor de dilución enzimática, y 2.22 es el coeficiente que representa dilución 10 enzimática adicional de 2 veces en la mezcla reactiva (0.25 mL enzima + 0.25 mL sustrato), tiempo de reacción (5 minutos) y peso molecular de glucosa (0.18016 mg/micromol), es decir 2/(5*0.18016) = 2.22.
[0311] Un cálculo de ejemplo se suministra por debajo.
Muestra de ECA DF ΔA610 15
40,000 0.41
80,000 0.25
20 Ejemplo 4
[0312] El ejemplo siguiente ilustra el ensayo de proteína Lowry.
[0313] El procedimiento Lowry es uno de los ensayos de proteína más conocidos y muy usados, siendo primer 25 descrito en 1951 (Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ (1951) J. Biol. Chem. 193: 265-275).
Bajo condiciones alcalinas, el cobre acompleja con proteína.
Cuando el reactivo de fenol de Folin (reactivo fosfo-molíbdico-fosfotúngstico) se añade, se enlaza a la proteína.
El reactivo ligado es lentamente reducido y cambia de color de amarillo a azul.
30
Soluciones madre y reactivos
[0314] La solución madre Lowri A es 2% Na2CO3 en 0.1 M NaOH.
La solución madre Lowri B es 1% CuSO4 • 5H2O en agua destilada.
La solución madre Lowri C es 2% tartrato de potasio de sodio (NaKC4H4O6• 4H2O) en agua destilada. 35
El reactivo Lowri de materia prima se prepara fresco a diario mediante la mezcla de 49 ml Lowri A, 0.5 ml Lowri B y 0.5 ml Lowri C.
El reactivo de Folin comercial: reactivo de fenol - 2N (Folin - reactivo Ciocalteau) es diluido 1:1 en el agua destilada antes de usarse y es almacenado en un frigorífico.
40
[0315] La albúmina de suero bovino (BSA) se usa como el estándar de ensayo.
Cuando BSA se pesa antes del uso, la preparación de proteína usada para preparar el estándar debería no tener sal para evitar resultados imprecisos.
BSA es disuelto a una concentración de 1 mg/ml en un tampón similar a la solución para análisis.
Una serie de diluciones de estándar es preparada donde la concentración de proteína (BSA) se varía en la gama de 45 0.05-0.5 mg/ml.
Procedimiento de ensayo
[0316] Usando los reactivos anteriores, el ensayo es realizado de la siguiente manera. 100 µl de muestra se añade a 50 cada tubo seguido de 1.0 ml de reactivo Lowri de materia prima y la mezcla es incubada 10 minutos a temperatura ambiente. 100 µl de reactivo de Folin se añade a cada tubo y los tubos son además incubados durante 40 minutos a temperatura ambiente.
Una absorbancia a 750 nm es leída en un espectrofotómetro contra una forma preliminar (control) preparada de la misma manera que la muestra excepto el búfer se añade al tubo en vez de la proteína analizada. 55
La concentración de proteína es la determinada por la lectura de la absorbancia a 750 nm para cada muestra y trazando el resultado en un BSA gráfico de calibración obtenido a partir de las diluciones estándar mencionadas anteriormente.
[0317] El procedimiento Lowry debería ser realizado con precaución al estar sometido a interferencia por una amplia 60 variedad de productos químicos.
Entre los productos químicos proporcionados para interferir con el procedimiento Lowry están barbitúrico, CAPS, cloruro de cesio, citrato, cisteína, dietanolamina, ditiotreitol, EDTA, EGTA HEPES, mercaptoetanol, Nonidet P-40, fenol, polivinilpirrolidona, deoxicolato sódico, salicilato de sodio, timerosal, tricina, TRIS y Tritón X-100.
65
Ejemplo 5
[0318] El ejemplo siguiente ilustra el ensayo de Somogyi-Nelson usado para medir la actividad de avicelasa.
[0319] El ensayo mide la velocidad de liberación de azúcares reductores por la acción de celulasas en la celulosa de 5 Avicel insoluble (micro celulosa cristalina) cuando los azúcares reductores se ensayan por el método de Somogyi-Nelson como equivalentes de glucosa.
Una unidad de actividad de avicelasa es igual a la cantidad de enzima que libera 1 micromol de azúcares reductores, expresada como equivalentes de glucosa (cuando los azúcares reductores son ensayados por el método de Somogyi-Nelson) durante un minuto a 40° C, pH 5.0 (0.05 M búfer de acetato sódico). 10
Reactivos
[0320] Tampón acetato (0.05 M, pH 5.0) se prepara de la siguiente manera. 4,1 g de acetato sódico anhidro o 6,8 g de acetato sódico * 3H2O son disueltos en agua destilada de modo que el volumen final de la solución es 1000 15 (solución A).
En un matraz separado, 3.0 g (2.86 mL) de ácido acético glacial se mezclan con agua destilada para llegar al volumen total de 1000 mL (solución B).
El tampón acetato final 0.05 M, pH 5.0, se prepara mediante la mezcla de solución A con solución B hasta que el pH de la solución resultante es igual a 5.0. 20
[0321] Avicel PH 105 (Serva; FRG) (o cualquier otra fuente disponible de Avicel) se usa como sustrato de ensayo. 1% P/v de suspensión de materia prima de Avicel se prepara en 0.05 M tampón acetato, pH 5.0, añadiendo 50 mg de Avicel seco gradualmente a un vaso con 5 mL del búfer agitado en un agitador magnético.
Después de que la suspensión de Avicel obtenida se mezcle en un agitador magnético durante 1 hora a temperatura 25 ambiente (para la inflamación de Avicel), 1% de suspensión de materia prima de p/v de Avicel se puede almacenar en el vaso cubierto durante 5-7 días a 4°C.
[0322] El reactivo de Somogyi se prepara de la siguiente manera. 24 g de carbonato de sodio anhidro y 12 g de tartrato de potasio de sodio * 4H2O son disueltos en 250 mL de agua destilada. 30
La solución de sulfato cúprico *5H2O (4 g en 40 mL de agua destilada) se añaden en la agitación, y luego 16 g de bicarbonato sódico son disueltos (solución A).
En un matraz separado, 18.0 g de sulfato de sodio son disueltos en 500 mL de agua destilada caliente (∼80° C) y hervidos durante 5 minutos (solución B).
Solución uno se mezcla con solución B y el volumen final se ajusta a 1000 mL por destilar agua. 35
El reactivo es estable durante 2-3 mese en el almacenamiento de en un matraz oscuro a temperatura ambiente.
[0323] El reactivo de Nelson se prepara de la siguiente manera. 50 G de molibdato de amonio son disueltos en 900 mL de agua destilada caliente (∼60° C).
La solución se enfría durante 5-10° C y 42 mL de ácido sulfúrico concentrado con 6 g de arseniato de sodio son 40 cuidadosamente adicionados con la agitación.
El volumen de la mezcla se ajusta a 1000 mL con agua destilada.
El matraz con esta solución se incuba a 40° C durante 48 horas y luego la solución es filtrada si es necesario.
El reactivo es estable durante 2-3 meses a temperatura ambiente.
45
[0324] Usando los reactivos anteriores, el ensayo se realiza como detallada por debajo.
Forma preliminar de protección
[0325] 0.2 mL de 0.05 M de búfer de acetato sódico (pH 5.0) se mezclan en un tubo de ensayo de cristal graduado 50 con 0.2 mL de reactivo de Somogyi, se cubren, y se incuban en un baño maría durante 40 minutos.
Luego, la probeta se enfría en un baño de agua fría y 0.2 mL de reactivo de Nelson se añaden y mezclan por agitación manualmente.
Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, el volumen de solución se ajusta a 2 mL con agua destilada. 55
La solución obtenida se usa como una forma preliminar de protección.
Determinación de actividad de avicelasa
[0326] La actividad de avicelasa se determina por realización de la reacción de hidrólisis de Avicel a 40° C y pH 5.0 60 durante 60 minutos mientras se mezcla.
Un suspensión de materia prima de 1% p/v de Avicel se mezcla en el agitador magnético durante 10 minutos, luego 0.25 mL de esta solución madre de avicel de 1% p/v se coloca en un tubo de ensayo de cristal graduado. 0.15 ML de 0.05 M tampón acetato (pH 5.0) se añaden al tubo y la mezcla se calienta a 40° C durante 10 minutos con agitación. 0.1 ML de muestra de enzima, adecuadamente diluidos y precalentados a 40° C durante 10 minutos, se colocan en 65 el tubo.
La mezcla reactiva es luego incubada durante 1 hora a 40° C con agitación.
Después de 1 hora, la mezcla reactiva es centrifugada 2 min a 12000 r.p.m., 0.2 mL de sobrenadante se retiran y colocan en un tubo de ensayo de cristal graduado. 0.2 ML de reactivo de Somogyi se añaden y la mezcla es incubada, cubierta, en un baño maría durante 40 minutos.
Luego, el tubo se enfría en un baño de agua fría y 0.2 mL de reactivo de Nelson se añaden y mezclan por agitación 5 manualmente.
Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, el volumen de solución se ajusta a 2 mL con agua destilada.
Luego, la absorbancia a 610 nm (A610) se mide contra la forma preliminar de protección como AES (muestra enzimática). 10
La muestra enzimática debe ser diluida con el 0.05 M búfer de acetato sódico de modo que A610 tiene entre 0.5 y 1.5 unidades de densidad óptica a 610 nm.
Forma preliminar enzimática
15
[0327] 0.16 mL de 0.05 M búfer de acetato sódico (pH 5.0) se mezclan en un tubo de ensayo de cristal graduado con 0.04 mL de muestra de enzima con el mismo grado de dilución explicado por encima. 0.2 mL de reactivo de Somogyi se añaden a la probeta, y el tubo es incubado, cubierto, en un baño maría durante 40 minutos.
Luego, la probeta se enfría en un baño de agua fría, 0.2 mL de reactivo de Nelson se añade y el tubo se mezcla por 20 agitación manualmente.
Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, el volumen de solución se ajusta a 2 mL con agua destilada.
Luego, la absorbancia a 610 nm (A610) se mide contra la forma preliminar de protección como AE (forma preliminar enzimática). 25
Forma preliminar de sustrato
[0328] Una suspensión de materia prima de 1% p/v de Avicel es mezclada utilizando un agitador magnético durante 10 minutos, luego 0.25 mL de la solución madre de avicel de 1% p/v se coloca en un tubo de ensayo de cristal 30 graduado. 0.25 ML de 0.05 M tampón acetato (pH 5.0) se añaden al tubo y la mezcla se calienta a 40° C durante 10 minutos con la agitación. 0.1 ML de muestra de enzima, adecuadamente diluidos y precalentados a 40° C durante 10 minutos, se colocan en el tubo.
La mezcla reactiva es luego incubada durante 1 hora a 40° C con agitación.
Después de 1 hora, la mezcla reactiva es centrifugada 2 min a 12000 r.p.m., 0.2 mL de sobrenadante se retiran y 35 colocan en un tubo de ensayo de cristal graduado. 0.2 ML de reactivo de Somogyi se añaden y la mezcla es incubada, cubierta, en un baño maría durante 40 minutos.
Luego, el tubo se enfría en un baño de agua fría y 0.2 mL de reactivo de Nelson se añaden y mezclan por agitación manualmente.
Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, el volumen de solución se ajusta a 2 mL con agua 40 destilada.
Luego, la absorbancia a 610 nm (A610) se mide contra la forma preliminar de protección como As (forma preliminar de sustrato).
Gráfico de calibración estándar 45
[0329] La solución de glucosa de materia prima (0.5 mg/mL) se prepara por la disolución de 10 mg de D-glucosa en 20 mL de 0.05 M de tampón acetato, pH 5.0.
Luego, diluciones diferentes de solución de glucosa de materia prima son preparadas de la siguiente manera:
Solución madre (mL)
0.05 M de tampón acetato (mL) Concentración de glucosa (mg/ml)
0.020
0.180 0.02
0.040
0.160 0.04
0.060
0.140 0.06
0.080
0.120 0.08
0.100
0.100
0.10
0.120
0.080 0.12
0.140
0.060 0.14
0.160
0.040 0.16
0.180
0.020 0.18
0.200
0 0.20
Las muestras (0.2 mL) de solución de glucosa con diluciones diferentes se colocan en tubos de ensayo de vidrio graduado. 0.2 ML de reactivo de Somogyi se añaden y los tubos de ensayo se colocan en un baño maría durante 40 minutos.
Luego, los tubos de ensayo se enfrían en un baño de agua fría y 0.2 mL de reactivo de Nelson se añaden a cada tubo, y los tubos son mezclados por agitación manualmente. 5
Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, el volumen de solución en cada tubo se ajusta a 2 mL con agua destilada.
Luego, la absorbancia a 610 nm (A610) se mide contra la forma preliminar búfer.
Los siguientes datos típicos A610 obtenidos con diluciones de glucosa diferentes se dan por debajo:
Glucosa, mg/mL 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20 10
A610 0.02 0.12 0.38 0.50 0.70 0.92 1.10 1.38 1.54 1.67
La absorbancia (A610) en el eje y contra la concentración de glucosa (G; mg/mL) en el eje x se fija para generar un gráfico de calibración estándar tal como que mostrado en la figura 11.
[0330] La dependencia de A610 de G es descrita por la ecuación y = ax + B. La concentración de azúcares 15 reductores (C) en una muestra ensayada se puede calcular de un gráfico de calibración que utiliza la ecuación C = (ΔA610- b) /a, donde b = - 0.2239 y 1/a = 0.204.
En otras palabras, C = (ΔA610+ 0.223,9) * 0.104 (en mg/mL).
Cálculo de actividad 20
[0331] La actividad es calculada de la siguiente manera: avicelasa (u/ml) = (ΔA610- b)* (1/a) * 0.463 *DR, donde ΔA610= AES (muestra enzimática) - AE (forma preliminar enzimática) - A (forma preliminar de sustrato), 1/a es 0.204, b es -0.2239, los coeficientes del gráfico de calibración de glucosa (ver arriba), DR es el grado de dilución enzimático (grado de dilución de muestra de enzima antes de adición la mezcla reactiva), y 0.463 es el coeficiente obtenido 25 como 5/(0,180*60), donde 5 es la dilución adicional de muestra de enzima en la mezcla reactiva (0.1 mL de enzima + 0.4 mL de mezcla reactiva), 0.180 mg/mkmol es el coeficiente de transición para glucosa de mg a mkmol (el peso molecular de glucosa es 180) y 60 es el tiempo de reacción (60 minutos).
La muestra enzimática debe ser de modo que ΔA610debería tener entre 0.5 y 1.5 unidades de densidad óptica.
30
[0332] Un cálculo de ejemplo se proporciona por debajo.
La muestra del grado de dilución de 500, AES es 1.436, AE es 0.102, As es 0.070, así que ΔA610= 1.436 - 0.102 - 0.070 = 1.264.
La actividad de avicelasa es: (1.264 + 0.2239) * 0.104 * 0.463 * 500 = 35.8 U/mL.
35
Ejemplo 6
[0333] El ejemplo siguiente ilustra la determinación de glucosa por un ensayo de glucosooxidasa-peroxidasa.
[0334] Como resultado de oxidación de β-D-glucosa por glucosa-oxidasa (GOD), peróxido de hidrógeno H2O2 y 40 glucono-lactona son formados.
Luego, H2O2 se usa por peroxidasa (POD) como un agente oxidante para 4-aminoantipirina, oxidación en presencia de sustancias fenólicas.
Como resultado, productos teñidos se acumulan en la mezcla reactiva y se pueden detectar a 490 nm espectrofotométricamente. 45
La cantidad de productos teñidos corresponde a concentración de glucosa como se muestra en el esquema de reacción por debajo:
50
[0335] El ensayo se realiza utilizando un Fotoglucose kit (Impacto Ltd., Rusia) con las condiciones generales: 40°C, pH 7.0, duración - 15min, A490, camino de luz 1cm.
Reactivos 55
[0336] Reactivo 1 (R1) se prepara de la siguiente manera.
Dos tabletas "tampón de sustrato" (0.1mmol/L potasio o sales amónicas de ácido fosfórico, 50 mmol/l 4-aminoantipirina, 0.75 mmom/L 8-oxiquinolin) son disueltas en 200 mL de agua destilada, filtradas a través de un filtro de celulosa, y el pH es ajustado a 7.0 si es necesario. 60
La solución se puede almacenar a oscuras a 4° C y deberían ser hechas de nuevo cada semana.
[0337] Reactivo 2 (R2) se prepara de la siguiente manera.
Una tableta "enzima" (2500 unidades de glucosa-oxidasa y 500 unidades de peroxidasa) es disuelta en 5 mL de agua destilada.
La solución se puede almacenar a oscuras a 4° C y deberían ser hechas de nuevo cada semana. 5
[0338] Una solución de glucosa de 10 mmol/L glucosa en 0.15% ácido benzoico se usa como el patrón de calibración.
La solución se dilye con agua destilada para obtener soluciones de glucosa de 0 a 5 g/L.
10
[0339] Usando los reactivos anteriores, el ensayo se realiza como detallado por debajo.
[0340] R1 y R2 se mezclan en una proporción de 40:1 (esta solución se puede almacenar a oscuras a 4° C y debería ser hecha cada semana fresca) y 1 mL de la mezcla se precalienta a 40° C para 5-10 segundos. 0.1 ML de la muestra (o estándar de glucosa) es luego adicionado y la mezcla se incuba a 40° C para 15 minutos. 15
Las mezclas son luego colocadas a temperatura ambiente y el A490 es determinado en el espectrofotómetro.
La prolongación del período de incubación a 20 minutos tiene poco o ningún efecto en los resultados, mientras que disminuirlo a menos de 15 minutos pueden resultar en una densidad óptica inferior.
Así, 15-20 min de incubación a 40°C se prefiere para la determinación de glucosa.
20
Cálculo de concentración de glucosa
[0341] Como se muestra en tabla 21, la calibración con estándares que contienen concentraciones variables de glucosa revelan una densidad óptica A490 en el rango de 0.06 a 1.15 que corresponde a concentraciones de glucosa de 0.025 g/L a 0.5 g/L. 25
Estos datos se fijan en la figura 12, que demuestra una proporción lineal y alta reproducibilidad en estas condiciones.
[0342] Usando los resultados de calibración, la fórmula siguiente se obtiene para determinar la glucosa en muestras de una lectura A490: 30
Tabla 21: Calibración de los reactivos usando soluciones de glucosa estándar (dos experimentos)
Glucosa, g/L
A490 A490
0
0.05 0.05
0.0025
0.05 0.05
0.005
0.06 0.06
0.01
0.07 0.07
0.025
0.11 0.11
0.05
0.17 0.17
0.1
0.29 0.29
0.25
0.65 0.64
0.5
1.20 1.20
1
1.71 1.72
2.5
1.93 1.94
5
2.06 2.06
Ejemplo 7 35
[0343] El ejemplo siguiente ilustra el ensayo de Somogyi-Nelson usado para medir la actividad de xilanasa.
[0344] Este ensayo mide la liberación de azúcares reductores (como equivalentes de glucosa) por la acción de xilanasa en un xilano soluble. 40
Una unidad de xilanasa de actividad es la cantidad de enzima que libera 1 micromol de azúcares reductores, expresado como equivalentes de glucosa, en un minuto a 50° C y pH 5.0.
Reactivos
45
[0345] El tampón de acetato (0.05 M, pH 5.0) se prepara de la siguiente manera. 4.1 g de acetato sódico anhidro o 6.8 g de acetato sódico * 3H2O son disueltos en agua destilada de modo que el volumen final de la solución es 1000 mL (solución A).
En un matraz separado, 3.0 g (2.86 mL) de ácido acético glacial se mezcla con agua destilada para llegar a un volumen total de 1000 mL (solución B). 5
El tampón acetato final 0.05 M, pH 5.0, se prepara mediante la mezcla de solución A con solución B hasta que el pH de la solución resultante es igual a 5.0.
[0346] El xilano de madera de abedul (Sigma, X 0502) se usa como sustrato.
Una solución madre de 1% p/v se prepara por la disolución de 500 mg de xilano en 50 mL de agua destilada con 10 agitación en un agitador magnético durante 1 hora.
La solución es estable durante 2 días a 4° C.
[0347] El reactivo de Somogyi se prepara de la siguiente manera. 24 g de carbonato de sodio anhidro y 12 g de tartrato de potasio de sodio tetrahidrato son disueltos en 250 mL de agua destilada. 15
Una solución de pentahidrato de sulfato cúprico (4 g en 40 mL de agua destilada) se añade con agitación, y luego 16 g de bicarbonato sódico son disueltos para obtener la solución A.
En un matraz separado, 180 g de sulfato de sodio son disueltos en 500 mL de agua destilada caliente (∼80° C) y hervidos durante 5 min (solución B).
La solución A se mezcla con solución B y el volumen final se ajusta a 1000 mL. 20
El reactivo es estable durante 2-3 meses en almacenamiento en un matraz oscuro.
[0348] El reactivo de Nelson se prepara de la siguiente manera. 50 g de molibdato de amonio son disueltos en 900 mL de agua destilada caliente (∼60° C).
La solución se enfría a 5-10° C y 42 g de ácido sulfúrico concentrado con 6 g de arseniato de sodio son 25 cuidadosamente añadidos con agitación.
El volumen de la mezcla se ajusta a 1000 mL.
El matraz se incuba a 40° C durante 48 horas y luego la solución es filtrada si es necesario.
El reactivo es estable durante 2-3 meses.
30
[0349] Usando los reactivos anteriores, el ensayo se realiza como detallado por debajo.
Forma preliminar reactiva
[0350] 0.5 mL de 0.05 M búfer de acetato sódico se mezcla en un tubo de ensayo de cristal graduado (1.5 cm x 15 35 cm) con 0.5 mL de reactivo de Somogyi e incubado en un baño maría durante 40 minutos.
Luego, la probeta se enfría en un baño de hielo o agua fría y 0.5 mL de reactivo de Nelson se añaden y se mezclan por agitación manualmente.
Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, el volumen de la solución se ajusta a 5 mL con agua destilada. 40
Muestra enzimática
[0351] 0.25 mL de solución madre de xilano de 1% p/v se mezclan con 0.15 mL de 0.05 M tampón acetato, pH 5.0, en los tubos de ensayo de vidrio graduado (1.5 cm x 15 cm) y son precalentados a 50° C durante 5 minutos. 45
La muestra enzimática es adecuadamente diluida por el 0.05 M búfer de acetato sódico (la dilución de la muestra enzimática es elegida de modo que A610 debería estar entre 0.95 y 1.05 unidades de densidad óptica). 0.1 ML de muestra de enzima adecuadamente diluida se añaden a 0.4 mL de la solución de sustrato precalentado, mezclado e incubado a 50° C durante 10 minutos.
Después de exactamente 10 minutos de incubación, 0.5 mL de reactivo de Somogyi se añaden, y los tubos de 50 ensayo se colocan en un baño maría durante 40 minutos.
Luego, los tubos de ensayo se enfrían en un baño de hielo o agua fría y 0.5 mL de reactivo de Nelson se añaden y mezclan por agitación manualmente.
Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, el volumen de la solución se ajusta a 5 mL con agua destilada. 55
Luego, la absorbancia a 610 nm (A610) se mide contra la forma preliminar reactiva como As (muestra enzimática).
Forma preliminar enzimática
[0352] 0.4 mL de 0.05 M búfer de acetato sódico se mezclan en un tubo de ensayo de cristal graduado (1.5 cm x 15 60 cm) con 0.1 mL de muestra de enzima con la misma dilución como por encima. 0.5 ML de reactivo de Somogyi se añaden y la probeta se incuba en un baño maría durante 40 minutos.
Luego, la probeta se enfría en un baño de hielo o agua fría y 0.5 mL de reactivo de Nelson se añaden y mezclan por la agitación manualmente.
Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, el volumen de la solución se ajusta a 5 mL con agua 65 destilada.
Luego, la absorbancia a 610 nm (A610) se mide contra la forma preliminar reactiva como AEB (forma preliminar enzimática).
Forma preliminar de sustrato
5
[0353] 0.25 mL de solución madre de xilano de 1% p/v se mezclan con 0.25 mL de 0.05 M tampón acetato, pH 5.0, en un tubo de ensayo de cristal graduado (1.5 cm x 15 cm), 0.5 mL de reactivo de Somogyi se añaden, y la probeta se coloca en un baño maría durante 40 minutos.
Luego, la probeta se enfría en un baño de hielo o agua fría y 0.5 mL de reactivo de Nelson se añaden y mezclan por la agitación manualmente. 10
Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, el volumen de la solución se ajusta a 5 mL con agua destilada.
Luego, la absorbancia a 610 nm (A610) se mide contra la forma preliminar reactiva como ASB (forma preliminar de sustrato).
El valor de ASB no debería exceder las 0.05 unidades de densidad óptica. 15
[0354] Todas las muestras enzimáticas y enzimas y formas preliminares de sustrato deberían ser hervidas juntas.
Gráfico de calibración estándar
20
[0355] La solución de glucosa de materia prima (1 mg/mL) se prepara por la disolución de 100 mg de D-glucosa en 100 mL de 0.05 M de tampón acetato, pH 5.0.
Luego, las diluciones diferentes de la solución de glucosa de materia prima son preparadas de la siguiente manera:
Solución madre (mL)
0.05 M tampón acetato (mL) Concentración de glucosa (mg/ml)
0.05
4.95 0.01
0.10
4.90 0.02
0.15
4.85 0.03
0.20
4.80 0.04
0.25
4.75 0.05
0.30
4.70 0.06
0.35
4.65 0.07
0.40
4.60 0.08
0.45
4.55 0.09
0.50
4.50 0.10
Las muestras (0.5 mL) de solución de glucosa con diluciones diferentes se colocan en los tubos de ensayo de vidrio 25 graduado (1.5 cm x 15 cm). 0.5 ML de reactivo de Somogyi se añaden y los tubos de ensayo se colocan en un baño maría durante 40 minutos.
Luego, los tubos de ensayo se enfrían en un baño de hielo o agua fría y 0.5 mL de reactivo de Nelson se añaden y mezclan por agitación manualmente.
Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, el volumen de la solución se ajusta a 5 mL con agua 30 destilada.
Luego, la absorbancia a 610 nm (A610) se mide contra la forma preliminar reactiva.
Los siguientes datos típicos A610 obtenidos con diluciones de glucosa diferentes se dan por debajo:
Glucosa, mg/mL 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10
A610 0.11 0.20 0.28 0.41 0.48 0.60 0.72 0.79 0.93 1.06 35
La absorbancia (A610) en el eje y contra concentración de glucosa (G; mg/mL) en el eje x se fija para demostrar un gráfico de calibración estándar tal como el mostrado en la figura 11.
El inverso de la pendiente (1/a = 0.098) es calculado de la figura 11.
Cálculo de actividad 40
[0356] La actividad es calculada de la siguiente manera: actividad (UI/ml) = 1/a * ΔA610 * DF * 2.78, donde 1/a es el inverso de la pendiente calculado del gráfico de calibración estándar, ΔA610 es A (muestra enzimática) - AEB (forma preliminar enzimática) - ASB (forma preliminar de sustrato), DF es el factor de dilución enzimática, y 2.78 es el coeficiente que representa dilución enzimática adicional de 5 veces en la mezcla reactiva (0.1 mL enzimático + 0.4 45 mL sustrato), tiempo de reacción (10 minutos) y peso molecular de glucosa (0.18016 mg/micromol), es decir 5/(10*0.18016) = 2.78
[0357] Un cálculo de ejemplo se suministra por debajo.
50
B4 UF concentrado DF ΔA610
5,000 1.61
10,000 1.04
20,000 0.64
5
Ejemplo 8
[0358] El ejemplo siguiente ilustra el ensayo usado para medir la estabilidad de enzimas de la presente divulgación y la proteína de la presente invención a cambio brusco de temperaturas.
10
[0359] El ensayo siguiente determina la estabilidad de enzimas después del tratamiento a corto plazo a temperatura elevada (por ejemplo temperatura de peletización de pienso animal).
Una solución de enzima se incuba durante aproximadamente dos minutos en un tubo de vidrio en un termostático a 80°C.
La caída gradual de actividad enzimática se registra a lo largo del tiempo y la curva resultante se utiliza para decidir 15 cuánto tiempo la enzima es estable (los resultados normalmente varían entre 10 - 60 segundos).
[0360] El uso de tubos de vidrio que encajan perfectamente en un termostato regular o tubos tipo Eppendorf ayuda a asegurar las condiciones térmicas y el calentamiento rápido del contenido de tubo.
La dilución enzimática usada es seleccionada de modo que después de la dilución adicional en la mezcla reactiva, la 20 densidad óptica es lo más alto posible (depende del método particular usado para determinar la actividad).
Por ejemplo, al determinar la actividad de xilanasa por el ensayo de Somogyi-Nelson descrito en el ejemplo 7, el seleccionado enzimático deberá dar una densidad óptica A610 1.0-1.1 después de ser diluido 5 veces en la mezcla reactiva.
25
[0361] Para equilibrado más rápido a 80°C, 0.4-0.5 ml de agua se pueden colocar el pocillo de termostato, antes de encajar en un tubo de vidrio.
La temperatura se fija a 80.3 - 80.4°C para compensar el enfriamiento. 360 µl de búfer deseado se colocan en el tubo y se calientan durante 2-3 minutos hasta que alcanza 80°C.
Resulta aconsejable controlar la temperatura en el tubo (utilizando un termómetro) asegurarse de que la temperatura 30 ha sido alcanzada. 40µl de solución enzimática son luego añadidos y el tubo es mezclado rápidamente.
Después de 20, 40, 60, 90 y 120 segundos, partes alícuotas son quitadas del tubo e inmediatamente transferidas a la mezcla reactiva para determinar la actividad (los componentes de ensayo son preparados previamente).
Para determinar la actividad de punto cero (sin calentamiento), la misma solución (360 µl tampón+40 µl enzimático) se prepara en el tubo separado a temperatura ambiente. 35
Las actividades determinadas en cada punto temporal son luego trazadas como actividad relativa (en %) vs. tiempo, con punto de tiempo cero (sin calentamiento) representando 100% de actividad.
La Figura 13 demuestra estos datos para estabilidad de xilanasa a diluciones de 20-, 10- y 5 veces.
[0362] En este protocolo, una dilución de enzima de 10 veces se usa (9:1 solución tamponada precalentada a 40 solución de enzima fría).
En principio uno puede usar índices de dilución más altos (por ejemplo; 1:20), pero típicamente no factores de dilución más bajos (por ejemplo; 1:5) porque mezclar volúmenes mayores de la solución enzimática en frío puede producir resultados imprecisos.
El gráfico de abajo ilustra este principio. 45
La estabilidad de xilanasa fue evaluada utilizando diluciones de 20-, 10- y 5 veces, y los resultados mostrados en la figura 13 demuestran que diluciones de 10- y 20 veces (y posiblemente más altos) dieron resultados consistentes.
En cambio, uso de una dilución de 5 veces genera valores sobreestimados.
[0363] Los porcentajes de actividad enzimática de xilanasas de la presente invención después de 20 segundos de 50 incubación a 80°C (también conocidos como las estabilidades de granulación) son mostrados debajo en la tabla 22 y en el gráfico representado en la figura 14.
Tabla 22: Estabilidad de granulación de C1 xylansas
Enzima
% actividad
Xyl 1
19
Xyl 1 (CD)
12
Xyl 2
98
Xyl 3
75
Xyl 3 (CD)
82
Xyl 4
23
Xyl 5
60
Xyl 6
68
Ejemplo 9
[0364] El ejemplo siguiente ilustra el ensayo in vitro semicuantitativo usado para medir la actividad de pienso de enzimas de la presente divulgación y la proteína de la presente invención. 5
[0365] El ensayo fue desarrollado para simular el tratamiento enzimático de pienso.
El ensayo detecta la dinámica de formación de fracción de líquido y residuo de un compuesto acuoso uniforme de salvado de centeno molido por la acción de las muestras enzimáticas en tubos de ensayo estrechos.
10
[0366] Una mezcla de solución enzimática y suspensión de salvado de centeno uniforme en el tampón de acetato (pH 5.0) se coloca en un tubo de vidrio largo (por ejemplo, pipetas de vidrio calibrado de 2 ml) y se almacena a temperatura ambiente (o a 40°C).
La acción de enzimas en el salvado de centeno sin almidón genera polisacáridos (por ejemplo arabinoxian, β-glucano y otros) causando que el compuesto acuoso de salvado de centeno de uniforme original se separe en una 15 fase líquida (con los polisacáridos) arriba y un residuo insoluble en el fondo.
El volumen de fase líquida formada encima de tubos durante la reacción es medido cada 10-15 min durante 1.5-3 horas (el tiempo de ensayo total depende de la actividad enzimática).
Los datos obtenidos se fijan como "líquido formado" (ml) vs tiempo (minutos) y la pendiente es de la línea calculada.
Cuanto mayor sea la pendiente de la línea en el gráfico obtenido, mayor será la actividad de pienso in vitro de la 20 muestra de enzima evaluada.
Sustrato
[0367] El salvado de centeno se usa como un sustrato en este ejemplo. 25
Sin embargo, trigo y salvado de cebada, centeno, trigo, cebada, y harina de soja también pueden usados como sustratos de ensayo.
Las muestras de salvado de centeno parcialmente de-almidonadas son cuidadosamente molidas y pasadas a través de la criba fina.
La fracción fina se toma como el sustrato. 30
El sustrato es pesado con precisión y colocado en un frasco de tapa roscada seco de 20-ml.
La muestra de sustrato se suspende en tampón de acetato para obtener suspensión de 30% p/v.
La suspensión de sustrato se mezcla enérgicamente con un agitador magnético durante 30-45 minutos a temperatura ambiente.
La suspensión resultante obtenida se puede almacenar a 4°C en un frasco sellado durante aproximadamente 2 días. 35
Procedimiento de ensayo
[0368] La mezcla reactiva contiene los componentes siguientes:
 1500 µl de suspensión de sustrato (300 mg/ml) 40
 750 µl de solución enzimática
[0369] La solución vacía contiene la misma cantidad de sustrato, pero la solución enzimática se sustituye con el mismo volumen de tampón de acetato.
45
[0370] La mezcla reactiva está sujeta a agitación vigorosa y ces olocada en los tubos de vidrio calibrados apropiados (por ejemplo, pipetas de vidrio de 2 ml).
Los tubos de vidrio o pipetas deberán rellenarse con la mezcla reactiva inmediatamente y ser colocados verticalmente.
El extremo superior del tubo se deja abierto mientras el extremo inferior se sella con una pieza de Parafilm o por 50 inmersión en la parafina derretida.
[0371] La concentración de muestras de enzima se pueden medir en mg/ml de proteína o en unidades/m de xilanasa en la mezcla reactiva (o cualquiera de las otras actividades enzimáticas, por ejemplo, β-glucanasa, α-galactosidasa, proteasa, etc. ). 55
El contenido de proteína o xilanasa (u otras actividades) de las muestras enzimáticas son medidas separadamente antes de los experimentos.
En los experimentos, la concentración enzimática fue igualada a 1 mg/ml de proteína en la mezcla reactiva, o en la actividad de xilanasa (2 a 3 U/ml).
60
Materiales e instrumentos
[0372]
 Termostato para 2 ml tubos de ensayo de tipo Eppendorf, establecidos a 40°C
 Conjunto de tubos de vidrio calibrado (por ejemplo, pipetas de vidrio de 2ml) 5
 Espectrofotómetro UV-Vis
 Reactivos para ejecutar ensayo Nelson-Somogyi
 Balances electrónicos analíticos
 Pipetas automatizadas en volume ajustable 40-200 µl y 200-1000 µl
 Salvado de centeno 10
 0.05 M tampón de acetato, pH 5.0
Análisis de datos
[0373] Los datos obtenidos se presentan en un gráfico como líquido formado (ml) vs tiempo (minutos). 15
Cuanto mayor sea la pendiente de la línea en el gráfico obtenido, mayor será la actividad de pienso in vitro de la muestra de enzima evaluada.
Ejemplo 10
20
[0374] El ejemplo siguiente ilustra el ensayo usado para medir la capacidad de enzimas para reducir la viscosidad de materiales de pienso.
[0375] El tratamiento enzimático de cebada, centeno o trigo puede aumentar el valor nutritivo por hidrólisis de polisacáridos viscosos (beta-glucano, xilano de arabino) en cereales. 25
La tabla 23 más abajo ilustra perfiles de polisacárido viscoso típico de piensos de muestra comparados con la viscosidad de mezclas de agua/comida.
Tabla 23. Perfiles de polisacárido viscoso típico de piensos
Xilanos de Arabino g/kg de sustancia seca Beta-glucanos, g/kg de sustancia seca Viscosidad relativa de mezclas de agua/comida, U
Centeno
14.4 7.6 9.71
Cebada
3.3 24.3 4.21
Trigo
3.2 5.6 2.25
[0376] Como se muestra en la tabla, la alta viscosidad de una mezcla de comida de agua/centeno es 30 predominantemente debido a la presencia de arabinoxilanas.
De forma similar, la viscosidad de una mezcla de agua/cebada es predominantemente debido a la presencia de beta-glucanos, mientras la viscosidad de mezcla de agua/trigo es cercana al agua.
Sin embargo, cereales tales como cebada, centeno y trigo frecuentemente contienen inhibidores específicos de las enzimas hidrolíticas. 35
Así, preparaciones enzimáticas preferidas que eficazmente disminuyen la viscosidad deberían ser resistentes a inhibidores de cereal y ser enzimáticamente activas en dosificación baja.
Materiales e instrumentos
40
[0377]
 Frascos de vidrio con tapas de 100 ml
 Viscosímetro capilar Ostwald con termostato a 40° C
 Criba vibradora para incubación de comida a 40° C
 Granos de centeno, cebada, trigo integrales o cáscaras o sus mezclas 45
 Triturador giratorio y criba de 0.5 mm para preparar harina integral
 Pipetas automatizadas en volume ajustable 40-200 y 200-1000 ul
 Agua destilada o 0.1M búfer de acetato sódico, pH 5.0
Preparación de la muestra 50
[0378] Para preparar las comidas crudas de cebada, trigo o centeno, cereales integrales se muelen en un triturador giratorio y se pasan a través de una criba de 0.5 mm. 6 g de comida cruda de cebada o centeno o 12 g de comida de trigo se añaden a un 100 ml matraz de vidrio. 30 ml de agua destilada o búfer (matraz inicial) o 30 ml de la solución acuosa enzimática (matraces experimentales) son luego añadidos y los matraces son cubiertos. 55
La concentración de 6 g de comida por 30 ml de agua es de 200 g por litro, mientras 12 g por 30 ml es 400 g/l.
Los matraces se agitan bien a mano y luego se colocan en una coctelera a 40° C, 250 r.p.m.
[0379] Después de una incubación de 1 hora, las mezclas se centrifugan durante 5 min a 5000 r.p.m. para separar el precipitado insoluble de la comida cruda.
El sobrenadante es luego filtrado a través de un relleno de algodón. 5 ml del sobrenadante filtrado se colocan en un viscosímetro Ostwald a 40° C e se incuban durante al menos 3 minutos antes de que la viscosidad de la muestra 5 sea determinada.
La medición del tiempo de flujo de salida de las muestras del bulbo de viscosímetro debería ser hecha más de 80 minutos después del inicio de la incubación.
[0380] Una dosificación de 0.15 kg/t de la comida aproxima la dosificación usada en la práctica real. 10
Para preparaciones líquidas, una dosificación de 0.15 kg/t equivale a 90 µl de la preparación en una dilución o más de 100 veces por matraz (30ml de mezcla de agua/comida).
Para preparaciones secas, una dosificación de 0.15 kg/t iguala 90 µl de la solución 10 g/l por matraz (30 ml de mezcla de agua/comida).
15
[0381] La Figura 15 muestra la viscosidad relativa de mezcla agua/centeno tratada con la enzima(s) indicada.
Para comparar la eficiencia de las preparaciones, las actividades de xilanasa de las muestras (unidades por matraz) son también indicadas.
[0382] La eficiencia de las preparaciones también puede ser comparada por el trazado de la viscosidad residual (%) 20 de la mezcla de agua/comida después del tratamiento enzimático, como se muestra en figura 16.
[0383] La viscosidad residual es calculada de la siguiente manera:
La fórmula final es: 25
donde ResV es viscosidad residual, Rvi es la viscosidad relativa de la muestra con enzima, Rvnative es la viscosidad relativa de la mezcla de agua/comida nativa sin enzima, y Rvwater es 1.
[0384] La Tabla 24 muestra la viscosidad residual (%) de extracto de agua de comida de centeno después de una 30 incubación de 1 hora con 1 unidad de la xilanasa de la presente invención y las xilanasas de la presente divulgación.
Estos datos se presentan gráficamente en la figura 17.
Tabla 24: Viscosidades de pienso residual de C1 xylansas
Enzima
% Viscosidad residual
Xyl 1
59
Xyl 1 (CD)
59
Xyl 2
27
Xyl 3
25
Xyl 3 (CD)
76
Xyl 4
77
Xyl 5
94
Xyl 6
91
35
[0385] Tabla 25 muestra la viscosidad residual (%) de harina de cebada después de una incubación de 1-hora con 1 unidad de las endoglucanasas de la presente divulgación.
Tabla 25: Viscosidades de pienso Residual de C1 endoglucanasas
Enzima
% Viscosidad residual
EG I
18
EG II
13
EG II (CD)
14
EG III
10
EG V
18
EG VI
20
Ejemplo 11
[0386] El ejemplo siguiente ilustra un ensayo usado para medir la capacidad de bioblanqueo de enzimas de la presente divulgación y la enzima de la presente invención. 5
[0387] La capacidad de diferentes preparaciones enzimáticas crudas o enzimas purificadas para (bio)blanqueo de pulpa celulósica se pueden evaluar con el ensayo por debajo.
El ensayo supervisa la liberación de sustancias fenólicas cromogénicas de pulpa celulósica cruda por la acción de enzimas. 10
Las sustancias fenólicas se detectan por la absorbancia a 237 nm (A237) o 235 nm (A235).
Mini ensayo de bioblanqueo
[0388] La pulpa celulósica de eucalipto (mojado) crudo con pH natural 7.7 (National Paper Fabric, Uruguay) se 15 coloca en 5 ml tubos de reacción, y los tubos se colocan en una coctelera al baño maría (50°C, 200 r.p.m.).
El volumen de reacción consiste en 2 ml de muestra de enzima apropiadamente diluida en la solución de tampón apropiada y 2 ml de suspensión de pulpa celulósica (0.04 g de pulpa celulósica por peso seco).
La concentración de pulpa celulósica es 10 mg/ml.
El proceso de bioblanqueo comienza por la adición de 2 ml de la solución enzimática a la pulpa y el ensayo se 20 conduce durante 2 horas.
Después de la reacción, la mezcla se centrifuga y A237 del sobrenadante se monitorea en un espectrofotómetro.
Ya que algunos compuestos fenólicos se lavan para quitarlos de la pulpa celulósica cruda incluso en ausencia de enzimas, los experimentos en blanco con solución tamponada solo (sin enzimas) son realizados.
Alguna contribución al valor A237 podría ser hecha por sustancias cromogénicas, que existen en la muestra de 25 enzima en estado crudo, así que otros experimentos en blanco fueron efectuados para calcular esta contribución.
Todos los resultados tienen en cuenta ambos de aquellas formas preliminares en blanco como ΔA237.
A mayor valor ΔA237, mejor rendimiento de bioblanqueo.
[0389] El ensayo también puede ser realizado utilizando pulpa de madera dura o blanda a pH 7.5 y 50°C durante 2 30 horas, con la absorbancia determinada a 235 nm.
La tabla 26 y la figura 18 muestran la capacidad de bioblanqueo (A235) de la xilanasa de la presente invención y las xilanasas de la presente divulgación en la pulpa de madera blanda bajo estas condiciones, mientras la tabla 27 y la figura 19 muestran la misma capacidad de bioblanqueo en la pulpa de madera dura.
Para cada xilanasa, el ensayo fue conducido utilizando 0.01, 0.003, 0.001, 0.0003 mg/ml de enzima en la mezcla 35 reactiva, como indicado.
Una preparación de xilanasa de control positiva (Luminase, Verenium Corp., San Diego, CA EE.UU) fue también usada para comparar.
Tabla 26: Capacidad de bioblanqueo. de C1 xilanasas en la pulpa de madera blanda (A235) 40
Enzima (mg/ml)
Xyl 1 (CD) Xyl 1 Xyl 3 Xyl 3 (CD) Xyl 4 Xyl 2 Xyl 6 Luminasa
0.01
3 1.37 2.28 2.2 1.73 3.66 2.62 3
0.003
2.65 1.015 2.7 1.43 1.1 2.8 2.03 2.445
0.001
2.385 1.07 0.85 1.05 0.455 2.22 1.7 2.14
0.0003
1.45 0.615 0.575 0.31 0.2 1.615 1.4 1
Tabla 27: Capacidad de bioblanqueo de C1 xilanasas en la pulpa de madera dura (A235)
Enzima (mg/ml)
Xyl 1 (CD) Xyl 1 Xyl 3 Xyl 3 (CD) Xyl 4 Xyl 2 Xyl 6 Luminasa
0.01
8.5 2.355 4.2 3.715 1.9 5 6.5 7.585
0.003
6.25 1.82 2.24 2.27 0.82 4.45 4.5 5.6
0.001
5.4 1.37 1.05 1.5 0.5 2.355 3 4.8
0.0003
3.5 0.4 0.61 0.675 0.3 1.5 1.26 2.785
Ejemplo 12
[0390] El ejemplo siguiente ilustra la sacarificación de materia prima lignocelulósica pretratada utilizante preparaciones enzimáticas crudas. 5
[0391] El ensayo implica un protocolo para sacarificación enzimática de biomasa lignocelulósica pretratada con un contenido de humedad y composición conocidos para decidir la extensión de la celulosa y la digestibilidad de la hemicelulosa bajo condiciones específicas de sacarificación de la materia prima con celulasa cruda y preparaciones enzimáticas de hemicelulasa. 10
Equipo
[0392]
 IINNOVA 40 Thermo Shaker (New Jersey EE.UU), donde se realiza la agitación de un compuesto acuoso 15 en vasos plásticos usando 250 r.p.m. vibraciones (cada vaso suministrado por un matraz metálico de 0.5 cm para mejorar la mezcla de compuesto acuoso)
 Micro centrífugo
 Phmetro
 Agitador vortex 20
 Equilibrio analítico, sensible a 0.1 mg
 Espectrofotómetro UV/vis
 HPLC con detector de índice de refracción y columna Silica con fase de amino conectado (4 x 250 mm) y columna de protección
 Pipetas con volumen de muestra variable (5-5000 µL) 25
Reactivos y materiales
[0393]
 Materia prima lignocelulósica con composición y contenido de humedad conocidos (celulosa, hemicelulosa, 30 lignina, ceniza, extractivos)
 Búfer de acetato sódico (0.1 M, pH 5.0) con 1 mM de azida sódica para prevenir crecimiento de microflora
 Preparaciones de celulasa enzimática y hemicelulasa de distintas cepas fúngicas, bien en forma soluble o seca
 Reactivos para determinación de proteína (bien equipo Lowry o Pierce BCA) 35
 Agua, destilado y/o desionizado
 Ampiox, sal de sodio.
 Equipo "Fotoglucosa" (reactivos para determinación de glucosa usando ensayo de glucosa-oxidasa-peroxidasa) de Impact Ltd., Rusia
 Reactivos de Somogyi y Nelson para el ensayo de azúcar de reducción 40
 Acetonitrilo, grado de HPLC
 NaOH, ácido acético para ajustes de pH
Procedimiento de ensayo
45
[0394] El procedimiento descrito abajo asume que la hidrólisis se realiza a 5% de sólidos.
Si el proceso debería ser realizado a concentración de sustrato diferente, entonces recálculos deberían ser hechos para el peso de muestra de biomasa inicial (en una base de peso en seco) utilizando el contenido de humedad conocido en la muestra.
50
[0395] Una muestra de biomasa con 1g de sólidos (en una base de peso en seco) se pesa y coloca en un vaso plástico de 50 ml equipado con una tapa hermética y un matraz metálico (0.5 cm de diámetro) para mejorar la mezcla (el contenido de humedad se determina en experimentos preliminares por el secado de las muestras de biomasa a 105°C hasta que un peso constante es alcanzado).
El peso (volumen) de agua en la muestra se nota como W. 55
[0396] El volumen(es) de enzima(s) necesario para añadir a la mezcla reactiva es calculado teniendo en cuenta la concentración de proteína (actividad enzimática) en una solución madre y la concentración de proteína final (actividad enzimática) en la mezcla reactiva.
Usando estos datos, el volumen de búfer (Wa) que es necesario para ajustar el volumen total del sistema de reacción 60 a 20 ml es calculado, teniendo en cuenta el agua contenida en la muestra de biomasa (Ws).
[0397] La cantidad calculada (Wa) de 0.1 M, pH 5.0 búfer de Na-acetato con 200mg/l (4 mM) de azida sódica se añade al compuesto acuoso de biomasa, y el compuesto acuoso es íntegramente mezclado en el vaso de 50 ml que utiliza un vórtice.
El pH se mide y se ajusta de pH a 5.0 utilizando ácido acético concentrado o NaOH, si es necesario.
La tapa se cierra y los vasos incubados en un INNOVA 40 Thermo Shaker durante 15 minutos para precalentar la 5 muestra a 50°C.
[0398] La cantidad(s) calculada de solución(s) de materia prima de enzima se añade a la mezcla reactiva para iniciar la reacción enzimática. 20µl de solución Ampiox (100g/l) es luego añadida a la mezcla reactiva final, que se deja proceder durante 72 horas. (50°C y 250 r.p.m. vibraciones). 10
[0399] Partes alícuotas del compuesto acuoso de reacción (50-100 µL) son típicamente tomadas en puntos de tiempo de 6, 24, 48, 72 o 96 horas, usando una pipeta con una punta cortada.
Las partes alícuotas se centrifugan a 15,000 r.p.m. en un micro centrífugo durante 3 minutos, y los sobrenadantes se analizan para buscar glucosa con el ensayo de glucosa oxidasa-peroxidasa (véase ejemplo 6) y para buscar 15 azúcares reductores por el ensayo Nelson-Somogyi (ver, por ejemplo, ejemplo 1).
Las muestras (sobrenadantes) son típicamente analizadas inmediatamente.
En algunos casos, son sometidos a hervido durante 5 minutos, luego congelados y analizados más tarde.
El punto de tiempo final (72 horas) es también analizado para azúcares por HPLC.
20
[0400] Una forma preliminar (control) de sustrato se prepara de la misma forma en que se ha descrito anteriormente, excepto que se añade agua destilada al vaso en vez de la solución(s) de materia prima de enzima(s).
El sobrenadante resultante de la forma preliminar de sustrato se analiza para glucosa mediante el ensayo de glucosa-oxidasa-peroxidasa, azúcares reductores por el ensayo Nelson-Somogyi y también para azúcares por HPLC. 25
[0401] Las reacciones son típicamente realizadas por duplicado.
Los resultados del análisis para azúcares se determinan como valores medios junto con desviaciones estándar.
Típicamente, el contenido de proteína en el sistema de reacción (mg proteína/g sólidos) se usa como una medida de carga de enzima. 30
En los experimentos con preparaciones enzimáticas crudas, la carga de enzima es 5, 2.5 y 1 mg proteína/g sólidos.
Reacciones enzimáticas se pueden realizar en presencia de preparaciones de -β-glucosidasa (40 unidades de actividad de p-NPh- -β-glucosidasa por 1 g de sólidos) para convertir todos los oligosacáridos solubles en glucosa.
Cálculos 35
[0402] Para calcular la digestibilidad por ciento de celulosa (glucano), la concentración de glucosa en el sobrenadante final (72 o 96 horas) de la mezcla reactiva es determinada (datos del ensayo de glucosa oxidasa-peroxidasa y/o ensayo de HPLC), menos la concentración de glucosa de la forma preliminar (control) de sustrato.
El contenido de celulosa (glucano) inicial en el sistema de reacción es también calculado. 40
Por ejemplo, si el contenido de celulosa en la materia prima pretratada es 35% de los sólidos totales (sustancia seca) y la hidrólisis se realiza a 100 g sólidos/L, entonces la concentración de celulosa inicial sería 35 mg/mL.
[0403] La digestión por ciento de celulosa es calculada de la siguiente manera:
45
El factor 1.11 es un resultado de hidratación de residuos de anhidroglucosa en la celulosa (162 Da por un residuo) que produce una molécula de glucosa (180 Da).
50
[0404] Para calcular la digestibilidad por ciento de hemicelulosa (xilano), la concentración total de pentosas (xilosa + arabinosa) en el sobrenadante final (72 o 96 horas) de la mezcla reactiva es determinada (datos de ensayo de HPLC), sustrayendo la concentración de pentosa (xilosa + arabinosa) de la forma preliminar (control) de sustrato.
El contenido de hemicelulosa (xilano) inicial en el sistema de reacción es también calculado.
Por ejemplo, si el contenido de hemicelulosa en la materia prima pretratada es 30% de los sólidos totales (sustancia 55 seca) y la hidrólisis se realiza a 100 g sólidos/L, luego la concentración de hemicelulosa inicial sería 30 mg/ml.
[0405] La digestión por ciento de hemicelulosa es calculada de la siguiente manera:
60
El factor 1.136 es un resultado de hidratación de residuo de anhidropentosa (xilosa o arabinosa) en la hemicelulosa (132 Da por un residuo) que produce una molécula de pentosa (150 Da).
Referencias 5
[0406]
1. Berezin IV, Rabinovich ML, Sinitsyn AP (1977) Study of applicability of quantitative kinetic spectrophotometric method for glucose determination. Biokhimiya (Moscow) 42:1631-1636.
2. Ghose TK (1987) Measurement of cellulase activities. Pure Appl. Chem. 59:257-268. 10
3. Gusakov AV, Salanovich TN, Antonov AI, Ustinov BB, Okunev ON, Burlingame R, Emalfarb M, Baez M, Sinitsyn AP (2007) Design of highly efficient cellulase mixtures for enzymatic hydrolysis of cellulose. Biotechnol. Bioeng. On-line: http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/abstract/114064699/, DOI: 10.1002/bit.21329
4. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ (1951) Protein measurement with the Folin phenol 15 reagent. J. Biol. Chem. 193:265-275.
5. Sinitsyn AP, Chemoglazov VM, Gusakov AV (1990) Methods of investigation and properties of cellulolytic enzymes (in Russian), Biotechnology Series, v.25. Moscow: VINITI Press. 220 p.
6. Somogyi M (1952) Notes on sugar determination. J. Biol. Chem. 195:19-23.
20
Ejemplo 13
[0407] El ejemplo siguiente ilustra la sacarificación de materia prima lignocelulósica pretratada con enzimas purificadas individuales y mezclas enzimáticas.
25
[0408] El ensayo implica un protocolo para la sacarificación enzimática de biomasa lignocelulósica pretratada con composición y contenido de humedad conocidos para decidir la extensión de celulosa y digestibilidad de hemicelulosa bajo condiciones concretas de sacarificación de la materia prima con enzimas purificadas (monocomponentes) individuales y sus composiciones (mezclas de monocomponentes).
30
Equipo
[0409]
 TS-100 Thermo Shaker (Riga, Letonia), donde se realiza la agitación de un compuesto acuoso en tubos plásticos usando vibraciones 1200 r.p.m. 35
 Micro centrífugo
 Phmetro
 Agitador vortex
 Equilibrio analítico, sensible a 0.1 mg
 Espectrofotómetro UV/Vis 40
 HPLC con detector de índice de refracción y columna Silica con fase de amino conectada (4 x 250 mm) y columna de protección
 Pipetas con volumen de muestra variable (5-1000 µL)
Reactivos y materiales 45
[0410]
 Materia prima lignocelulósica con contenido de humedad y composición conocidos (celulosa, hemicelulosa, lignina, ceniza, extractivos)
 Búfer de acetato sódico (0.1 M, pH 5.0) con 1 mM de azida sódica para prevenir crecimiento de microflora 50
 Monocomponentes enzimáticos (celulasas, hemicelulasas, glicosidasas) aisladas de distintas cepas fúngicas, bien en la solución o liofilizadas
 Reactivos para determinación de proteína (bien equipo Lowry o Pierce BCA)
 Agua, destilada y/o desionizada
 Equipo "Fotoglucosa" (reactivos para determinación de glucosa usando ensayo de glucosa oxidasa-55 peroxidasa) de Impact Ltd., Rusia
 Somogyi y reactivos de Nelson para el ensayo de azúcares de reducción
 Acetonitrilo, grado de HPLC
 NaOH, ácido acético para ajustes de pH.
60
Procedimiento de ensayo
[0411] El procedimiento descrito abajo asume que la hidrólisis se realiza a 10% de sólidos.
Si el proceso debe ser realizado a una concentración de sustrato diferente, entonces los recálculos deberían ser realizados para el peso de muestra de biomasa inicial (en una base de peso en seco) utilizando el contenido de humedad en la muestra conocido.
[0412] Una muestra de biomasa con 200 mg de sólidos (en una base de peso en seco) se pesa y coloca en un tubo 5 de plástico de 2 ml equipado con una tapa hermética (el contenido de humedad se determina en experimentos preliminares por el secado de las muestras de biomasa a 105°C hasta que un peso constante es alcanzado).
El peso (volumen) de agua en la muestra se apunta como Ws.
[0413] 1 ml de búfer de Na-acetato (0.1 M, pH 5.0) con 1 mM de azida sódica se añade, y el compuesto acuoso es 10 íntegramente mezclado utilizando un vórtice.
El pH se mide y ajusta a 5.0 usando ácido acético concentrado o NaOH, si es necesario.
[0414] El volumen(s) de enzima(s) que es necesario para añadir al tubo de 2 ml es calculado teniendo en cuenta la concentración de proteína (actividad enzimática) en una solución madre y la concentración de proteína final 15 (actividad enzimática) en la mezcla reactiva.
Utilizando estos datos, el volumen de agua (búfer), que es necesario para ajustar el volumen total del sistema de reacción a 2 mL (Wa) es calculado, teniendo en cuenta el agua contenida en la muestra de biomasa (Ws) y el previamente añadido 1 ml de búfer.
20
[0415] La cantidad calculada del tampón acetato (Wa) se añade al compuesto acuoso de biomasa, la tapa cerrada y el tubo incubado en una TS-100 Thermo Shaker durante 5 minutos para precalentar la muestra a 50°C.
La cantidad(s) calculada de solución(s) de materia prima de enzima se añade al tubo para iniciar la reacción enzimática.
Se permtie que la reacción proceda a 50°C y 1200 r.p.m. vibraciones en un TS-100 Thermo Shaker durante 96 25 horas.
[0416] Las partes alícuotas del compuesto acuoso de reacción (50-100 µL) son típicamente tomadas a 3 o 6, 24, 48, 72, y 96 horas, usando una pipeta con una punta cortada.
Las partes alícuotas se centrifugan a 15,000 r.p.m. en un micro centrífugo durante 3 minutos, y los sobrenadantes se 30 analizan en busca de glucosa por el ensayo de glucosa oxidasa - peroxidasa (véase ejemplo 6) y en busca de azúcares reductores por el ensayo Nelson-Somogyi (ver, por ejemplo, ejemplo 1).
Las muestras (sobrenadantes) son típicamente analizadas inmediatamente.
En algunos casos, son hervidas 5 minutos, congeladas y analizadas más tarde.
El punto de tiempo final (96 horas) es también analizado en busca de azúcares por HPLC. 35
[0417] Una forma preliminar (control) de sustrato se prepara en la misma forma que se ha descrito por encima, excepto que se añade agua destilada al tubo en vez de la solución(s) de materia prima de enzima(s).
El sobrenadante resultante de la forma preliminar de sustrato se analiza en busca de glucosa mediante el ensayo de glucosa oxidasa - peroxidasa, azúcares reductores por el ensayo Nelson-Somogyi y también azúcares por HPLC. 40
Típicamente, no hay necesidad de preparar formas preliminares enzimáticas ya que enzimas purificadas (monocomponentes) normalmente no contienen azúcares.
[0418] Todas las reacciones se realizan por duplicado, y los resultados del análisis para azúcares se dan como valores medios junto con desviaciones estándar. 45
Típicamente, el contenido de proteína en el sistema de reacción (mg proteína/g sólidos) se usa como una medida de carga de enzima.
En el caso de enzimas purificadas donde las secuencias de aminoácidos son conocidas, la concentración de proteína es calculada de la absorción de UV a 280 nm usando coeficientes de extinción enzimática predichos por la herramienta de ProtParam (http://www.expasy.ch/herramientas/ProtParam.HTLM). De otro modo, la concentración 50 de proteína es determinada utilizando el ensayo Lowry (Pierce BCA).
[0419] En los experimentos con enzimas purificadas individuales (monocomponentes), la carga de enzima es 2 mg de proteína/g sólidos.
En el caso de celulasas monocomponentes (endoglucanasas y celobiohidrolasas), las reacciones enzimáticas se 55 realizan en presencia de β-glucosidasa purificada (0.5 U/ml actividad de celobiasa) para convertir todos los oligosacáridos solubles en glucosa.
[0420] En los experimentos con mezclas de monocomponentes, la carga de enzima es típicamente 2 mg de proteína total por 1 g de sólidos, cuando se realiza selección preliminar de mezclas. 60
Con mezclas seleccionadas de monocomponentes, la carga de enzima (proteína) se puede variar (hasta 5-10 mg de proteína/g sólidos).
Cálculos
65
[0421] Para calcular la digestibilidad por ciento de celulosa (glucano), la concentración de glucosa en el sobrenadante final (96 hora) de la mezcla reactiva es calculada (datos del ensayo de glucosa oxidasa - peroxidasa y/o ensayo de HPLC), menos la concentración de glucosa de la forma preliminar de sustrato (control).
El contenido de celulosa (glucano) inicial en el sistema de reacción es también calculado.
Por ejemplo, si el contenido de celulosa en la materia prima pretratada fue 35% de los sólidos totales (sustancia 5 seca) y la hidrólisis se efectuó a 100 g sólidos/L, entonces la concentración de celulosa inicial sería 35 mg/ml.
[0422] La digestión por ciento de celulosa es calculada de la siguiente manera:
10
El factor 1.11 es un resultado de la hidratación de residuo de anhidroglucosa en la celulosa (162 Da por un residuo) que produce una molécula de glucosa (180 Da).
[0423] Para calcular la digestibilidad por ciento de hemicelulosa (xilano), la concentración total de pentosas (xilosa + 15 arabinosa) en el sobrenadante final (96 horas) de la mezcla reactiva es determinado (datos de ensayo de HPLC), menos la concentración de pentosa (xilosa + arabinosa) de forma preliminar de sustrato (control).
El contenido de (xilano) de hemicelulosa inicial en el sistema de reacción es también calculado.
Por ejemplo, si el contenido de hemicelulosa en la materia prima pretratada es 30% de los sólidos totales (sustancia seca) y la hidrólisis se realiza a 100 g de sólidos/L, entonces la concentración de hemicelulosa inicial sería 30 mg/ml. 20
[0424] La digestión por ciento de hemicelulosa es calculada de la siguiente manera:
25
El factor 1.136 es un resultado de hidratación de residuo de anhidropentosa (xilosa o arabinosa) en la hemicelulosa (132 Da por un residuo) que se produce en la molécula de pentosa (150 Da).
Referencias
30
[0425]
1. Berezin IV, Rabinovich ML, Sinitsyn AP (1977) Study of applicability of quantitative kinetic spectrophotometric method for glucose determination. Biokhimiya (Moscow) 42:1631-1636.
2. Ghose TK (1987) Measurement of cellulase activities. Pure Appl. Chem. 59:257-268.
3. Gusakov AV, Salanovich TN, Antonov AI, Ustinov BB, Okunev ON, Burlingame R, Emalfarb M, Baez M, 35 Sinitsyn AP (2007) Design of highly efficient cellulase mixtures for enzymatic hydrolysis of cellulose. Biotechnol. Bioeng. On-line: http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/abstract/114064699/, DOI: 10.1002/bit.21329
4. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265-275. 40
5. Sinitsyn AP, Chemoglazov VM, Gusakov AV (1990) Methods of investigation and properties of cellulolytic enzymes (in Russian), Biotechnology Series, v.25. Moscow: VINITI Press. 220 p.
6. Somogyi M (1952) Notes on sugar determination. J. Biol. Chem. 195:19-23.
Ejemplo 14 45
[0426] El ejemplo siguiente ilustra un ensayo usado para medir la termoestabilidad de las enzimas de la presente divulgación y la enzima de la invención.
[0427] Este ensayo permite la determinación de la termoestabilidad a largo plazo de una enzima a 40, 50 y 70°C y a 50 valores de pH diferentes (los valores preferidos pueden variar con el área de uso de la enzima y su perfil de pH, que es típicamente de pH 5.0 o 7.0).
Una solución de enzima es incubada de 3-24 horas en un termostato.
La caída gradual de actividad enzimática es registrada.
Los datos resultantes se usan para decidir la vida media enzimática o la actividad enzimática después de 3 horas de 55 incubación bajo condiciones específicas (temperatura y pH).
[0428] Una dilución enzimática que da una densidad óptica suficientemente alta por ser determinada cuando la enzima es diluida (por ejemplo, en el rango 0.8-1.2 utilizando el ensayo de Somogyi-Nelson anteriormente descrito) debería ser seleccionada. 500-800 µl de esta dilución (preparada utilizante búfer precalentado y factores de 10 a 20 60
veces de dilución (por ejemplo, 450 µl búfer precalentado + 50 µl de enzyma)0 se coloca en un tubo de Eppendorf de 1.5-2.0 ml (cubierto) en un conjunto termostatico a 40, 50 o 60°C.
Partes alícuotas se quitan a 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180 minutos y la actividad es determinada simultáneamente utilizando cualquiera de los ensayos de actividad enzimática descritos en esta aplicación o conocidos en la técnica. Una actividad en el punto cero se determina por la preparación de la misma dilución enzimática a temperatura 5 ambiente.
La actividad relativa (en %) se cuadra vs tiempo, con la actividad de la enzima en el punto de tiempo cero (sin calentamiento) establecido como 100%.
Ejemplo 15 10
[0429] El ejemplo siguiente ilustra métodos del biodescrudado de tejidos que usa enzimas de la presente divulgación y la enzima de la invención.
[0430] Los métodos de aquí abajo están principalmente destinados para probar una pequeña cantidad de enzimas 15 (en el rango de mini-prueba de 0.5-5 mg de muestra de enzima).
Ensayos de biodescrudado
[0431] El descrudado retira ceras hidrofóbicas y sustancia péctica de la superficie de tejido de algodón en bruto. 20
Los métodos siguientes, que permiten la evaluación de la eficiencia de descrudado de enzimas puras y preparaciones enzimáticas crudas, se enumeran por debajo:
1) Procedimiento de descrudado y evaluación para bandas de 2.5 x 16 cm de bandas textiles,
2) micrométodo del descrudado y procedimiento de evaluación para piezas circulares de tejido, diámetro 1.4 cm, 25
3) método para determinación (coloración) de sustancias pécticas restantes en tejido inspeccionado (cualitativo),
4) método para determinación de ceras restantes en tejido inspeccionado.
Método A. Procedimiento de descrudado y evaluación para bandas de 2.5 x 16 cm de bandas textiles 30
[0432] Preparación de la muestra: para todas las prueba, se usa tejido de algodón 100% crudo (densidad de 142g/m2).
El tejido de algodón se reduce por α-amilasa durante toda la noche con tensioactivo adicionado a temperatura ambiente, luego enjuagado y seco a temperatura ambiente. 35
Para un tejido de 1-2 m2, se necesitan aproximadamente 5 litros de la solución con 5 g/l preparación de α-amilasa textil y 1g/l tensioactivo no iónico para el descrudado.
El tejido se enjuaga íntegramente con agua del grifo y se seca a temperatura ambiente durante toda la noche.
El tejido no debería ser planchado.
El tejido es luego cortado en bandas (2.5 x 16 cm). 40
[0433] Procedimiento de descrudado: las bandas se tratan en vasos plásticos de 100 mL en una coctelera de baño de agua Elpan a 50°C a 250 r.p.m. durante una hora.
Dos bandas de tejido de 16 x 2.5 cm (1.1-1.2 g total) se colocan en un vaso.
La proporción de solución es 20:1, usando 0.1M tampón acetato, pH 5.0. 45
[0434] En detalle, las bandas, normalmente 20 bandas (en 10 vasos), se marcan con una etiqueta textil, luego son sumergidas en el agua para completamente mojar cada banda.
Una solución enzimática (20 ml) se vierte en los vasos.
Luego, dos bandas mojadas son rápidamente colocadas en cada vaso usando pinzas pequeñas. 50
Los vasos son cubiertos y colocados en una coctelera de baño maría precalentado (fijado a 50°C, 250 r.p.m., amplitud 4) durante una hora.
[0435] Después del tratamiento, las bandas se enjuagan con agua del grifo fría durante 2-4 minutos, normalmente en un baño, y luego son secadas a temperatura ambiente durante toda la noche. 55
Enjuagues más intensos han sido evaluados (agua caliente, secuestro, por ejemplo EDTA, surfactantes) pero no son recomendados ya que proporcionan resultados menos reproducibles.
[0436] Calentamiento: bandas secas se calientan durante 1 hora a 105°C, y se dejan durante toda la noche a temperatura ambiente, y luego se evalúa la altura de mecha. 60
[0437] Análisis de humectabilidad: humectabilidad (altura de mecha) se mide según el estándar textil ruso.
Un extremo de la banda vertical de tejido seco se sumerge en un baño maría.
La altura de mecha (cm) es medida después de 30 minutos.
A mayor el valor de la altura de mecha - mejor el resultado de descrudado. 65
Un valor de 8 cm o más alto (para muestras calentadas) indica buen descrudado.
Todos experimentos se realizan por duplicado o triplicado.
[0438] Las dosificaciones enzimáticas para preparaciones comerciales están normalmente en la gama 5-60 g de preparación por kg de tejido.
Preferiblemente, las preparaciones deberían ser normalizadas por proteína. 5
La dosis de 0.6 mg de proteína por 1 ml de solución (12 g de proteína por kg de tejido) prueba ser adecuada cuando se comparan preparaciones y enzimas puras T.reesei usando este método y el micrométodo B presentado más abajo.
[0439] Cuando se comparan las preparaciones en una dosis, 4 repeticiones para cada preparación (dos vasos con 10 dos bandas en cada una) son realizadas.
Es frecuentemente más conveniente realizar una serie de 10-16 vasos, con 1 preliminar (tratamiento de protección sin enzima) y 1-2 vasos con una preparación estándar en cada serie.
[0440] Preferiblemente, una banda inspeccionada alcalina debería también ser añadida en el procedimiento de 15 calentamiento y evaluación.
Para descrudado alcalino, las bandas se tratan con una solución de 40 g/l NaOH en un baño maría durante 2 horas a una proporción de solución de 5-20.
Añadir tensioactivo es típicamente no necesario en estas muestras, pero dosis bajas de 1g/l de EM-3 tensioactivo o productos similares pueden ser beneficiosas. 20
[0441] Las bandas se pueden analizar sin calentamiento tras el secado durante toda la noche.
Sin embargo, el calentamiento de las bandas proporciona resultados más reproducibles y lleva a una diferencia superior entre pocillos y bandas inspeccionadas mal.
El secado y la preparación de las bandas durante toda la noche o más tiempo después del calentamiento es un paso 25 importante y no debería ser acortado.
Los resultados también pueden ser mejorados usando una cámara de preparación especial con humedad constante, en vez de dejar las muestras a condiciones ambientes.
Método B. Micrométodo de descrudado y procedimiento de evaluación para las piezas circulares de tejido, diámetro 30 1.4 cm
[0442] Procedimiento de tratamiento: en este método, se usan piezas circulares (diámetro 1.4 cm), del mismo tejido reducido del método A.
El tejido debería ser completamente mojado en el agua destilada antes del análisis, con agua de exceso quitada 35 usando papel de filtro.
[0443] Una pieza circular de tejido se coloca en un frasco cilíndrico pequeño ("penicilina, 2.2 cm de diámetro y 5 cm altura) con 2.0 ml de solución enzimática en 0.1 M búfer de Na-acetato (pH 5.0).
Los viales se colocan en un baño maría (50°C) precalentado en una coctelera (250 r.p.m.) y son incubado durante 1 40 hora.
La muestra tejida se quita con pinzas pequeñas, se lava 2-3 minutos con agua del grifo fría, y luego se seca a temperatura ambiente durante toda la noche.
Para cada muestra de enzima y muestra de control (tratamiento sin enzima en búfer), el procedimiento de ensayo es típicamente realizado en 2 repeticiones (2 piezas). 45
[0444] Calentamiento: muestras textiles secadas por la noche se calientan durante 1 hora a 105°C, luego se dejan a condiciones ambientales durante toda la noche antes de ser evaluar la humectabilidad.
El calentamiento proporciona generalmente mejores resultados, pero puede ser omitido.
50
[0445] Análisis de humectabilidad: la humectabilidad es medida utilizando un ensayo de impacto.
Una gota de agua destilada, 5 ul, se coloca en la superficie de tejido y se mide el tiempo que tarda la gota en absorberse en el material.
Para cada pieza circular, 5 mediciones son tomadas, colocando cada gota nueva en una área seca en la muestra de tejido. 55
El valor medio para cada muestra es luego calculado.
[0446] Las preparaciones enzimáticas y enzimas puras se evalúan a 0.6 mg proteína por ml de solución, pero los ensayos son típicamente reproducibles a dosis entre 0.6-2.4 mg de proteína por ml solución. Este método da normalmente desviaciones superiores que el método A, pero enzima de 10 veces menos es necesitada. 60
Así, el método B es normalmente recomendado, donde las cantidades enzimáticas son limitativas.
[0447] La prueba a una dosis con tratamiento térmico revela preparaciones de 8-10 cm (por ejemplo ECA tradicional, BioACE, IndiAGE 44L, Ecostone L 350, Celloviridin) proporcionan resultados comparativos.
65
[0448] La Tabla 28 y la Figura 20 muestran la capacidad de biodescrudado de celobiohidrolasas y endoglucanasas de la presente divulgación.
El recíproco del tiempo (1/tiempo; sec-1) de absorción de gota de agua en un tejido después del tratamiento a pH 5.0 con 0.6 mg/l de enzima seguida de calentamiento es mostrado.
El tiempo de adsorción de gota de agua para la muestra de control no tratada es 2400 seg (1/tiempo = 0.0004). 5
Tabla 28. Capacidades de biodescrudado de C1 celobiohidrolasas y endoglucanasas
Enzima
1/tiempo (sec-1)
Forma preliminar
0.0004
EG I
0.0006
EG II
0.0006
EG II (CD)
0.0007
EG III
0.0008
EG V
0.0007
EG VI
0.0007
CBH Ia
0.0006
CBH Ia (CD)
0.0006
CBH Ib
0.0006
CBH IIa
0.0006
CBH IIb
0.0006
Método cualitativo para determinación (coloración) de sustancias pécticas restantes en un tejido descrudado
10
[0449] Tinte rojo de rutenio (Sigma; R-2751) se usa para colorar específicamente sustancias pécticas en el tejido, formando un complejo con grupos de carboxilo cargados de pectinas.
[0450] Muestras pequeñas (2.5 x 6 o 2.5 x 2.5 cm) de tejido descrudado son marcados utilizando una etiqueta textil.
Las muestras inspeccionadas restantes después de los análisis de humectabilidad anteriormente descritos pueden 15 usarse.
[0451] Los controles siguientes son incluidos:
1) tejido sin lavar reducido,
2) control tratado con búfer (sin una enzima), 20
3) tejido descrudado alcalino.
[0452] Todas las muestras se tiñen en un baño y son pesadas juntas.
El volumen de la solución es calculado utilizando la fórmula siguiente:
25
[0453] El volumen deseado de 1g/l de solución del tinte se prepara.
La solución de tinte se agita y calienta en un baño maría durante 5 minutos hasta que el tinte se disuelve completamente. 30
La solución de tinte se calienta en un matraz en un conjunto de coctelera de baño maría a 50°C, 200 r.p.m.
Las muestras son luego colocadas en la solución y algún tensioactivo se añade si las muestras no son mojadas.
Las muestras se tintan durante 30 minutos a 50°C con la agitación a alrededor de 200 r.p.m. para tintado igualado.
[0454] Luego, las muestras son enjuagadas bajo agua del grifo seguido de 3-4 enjuagues (aproximadamente 5 35 minutos cada) con agua caliente (aproximadamente 70°C en un vaso de vidrio).
Después de esto, las muestras se secan durante toda la noche a temperatura ambiente.
Las muestras no deberían secarse con plancha, ya que esto puede destruir el tinte.
Las muestras son generalmente comparadas visualmente, aunque la evaluación colorimétrica cuantitativa puede ser usada. 40
[0455] Ejemplos de bandas manchadas se presentan en la figura 21.
La Figura 21 ilustra una comparación del contenido de pectina en una muestra sin lavar, una muestra inspeccionada alcalina, una muestra bioinspeccionada por BioPrep (Novo Nordisk, Dinamarca) a 20 g de preparación por 1 kg tejido, y muestras bioinspeccionadas por ECA a 40 g/kg durante 1 o 3 horas. 45
[0456] La muestra sin lavar y control (tratada sin enzima) se manchan a intensidad altoq e igual - lo que significa que ninguna de las pectinas se quitan durante el tratamiento de protección.
La muestra inspeccionada alcalina es muy manchada muy levemente - 100 % de pectina quitada (por definición).
Las tres muestras inspeccionadas enzimáticas son también levemente manchadas, pero un poco más 5 intensivamente que el inspeccionado alcalino.
Esto significa que el descrudado de celulasa y descrudado por BioPrep retira la mayoría de pectinas de la superficie (coloreable) de la pared primaria, similar que en el descrudado alcalino.
[0457] Otros colorantes positivamente cargados se pueden usar para la coloración de pectinas debido al polímero 10 cargado negativamente en el algodón.
Hemos evaluado cloruro de metiltioninio, pero resultó en menos distinción entre tejido inspeccionado y tejido sin lavar.
Método para la determinación de ceras restantes en tejidos inspeccionados 15
[0458] La presencia de ceras restantes en tejidos inspeccionados es determinada utilizando un procedimiento de extracción. 3-12 g de tejido descrudado se pesan y luego son extraídos con benceno de ebullición en un equipo Soxlet durante 4 horas.
El extracto se evapora en un evaporador giratorio. 20
Luego, un matraz con las ceras evaporadas extraídas se porta a un peso constante a 105°C (0.75-1 hora de período de incubación es normalmente necesaria).
El peso de ceras extraídas es luego determinado y el contenido de cera es calculado.
[0459] Comparamos biodescrudado (preparación de ECA) y descrudado alcalino. 25
Tiras de algodón reducidas fueron tratadas, secadas a condiciones ambientes durante toda la noche y divididas en dos partes: una parte fue evaluadas para la altura de mecha, otra parte fue calentada a 105°C durante 1 hora, equilibrada a condiciones ambientes durante toda la noche y luego la altura de mecha fue evaluada.
[0460] El contenido de cera fue determinado por el método anteriormente descrito, y los resultados se presentan en 30 la tabla 29 más abajo.
[0461] El biodescrudado por ECA y por el procedimiento alcalino dio resultados comparables basados en cambios de altura de mecha, pero el biodescrudado quitó menos cera.
El descrudado alcalino, sin embargo, no ha eliminado toda la cera. 35
Tabla 29. Biodescrudado por ECA vs descrudado alcalino.
Tipo de tratamiento
Altura de mecha, cm secado ambiente Altura de mecha, cm calentando 105°C, 1h Ceras, %
Algodón no tratado
6.0 0 0.62 ± 0.03
Descrudado alcalino
13.0 8.4 0.37 ± 0.03
Biodescrudado (ECA)
12.4 8.6 0.57 ± 0.03
Ejemplo 16
40
[0462] El ejemplo siguiente ilustra un método de biopulido de los tejidos (bioacabado) usando enzimas de la presente divulgación y la enzima de la invención.
[0463] El método permite evaluar una pequeña cantidad de enzimas (en el rango de mini-prueba de 0.5-5 mg de muestra de enzima). 45
El método para la prueba de enzimas puras y preparaciones enzimáticas crudas se realiza en celdas especialmente diseñadas (esencialmente una máquina de micro-lavado) también usadas para el ensayo de lavado de mini-tela vaquera (ver figura 22B).
[0464] Preparación de la muestra: Piezas circulares de tejido (diámetro de 28 mm) son extirpadas de tejido TIC-460 50 de algodón entrelazado teñido de rojo 80.
Las muestras se marcan con una etiqueta textil en el lado que será tratado con una enzima y tensión mecánica.
Cada muestra es luego pesada para una exactitud de 1 mg.
Una pieza pesa generalmente de 160 a 180 mg.
55
[0465] Procedimiento de tratamiento: la muestra se fija en la célula y tres cilindros metálicos se colocan en ella.
Cuando todas las células son ensambladas, 3 ml de la solución enzimática se agregan a cada célula.
Las soluciones enzimáticas contienen 0.1M búfer de Na-acetato, pH 5.0, para controlar el pH.
Las células se colocan en una coctelera Elpan precalentada al baño maría (50°C, 300 r.p.m., amplitud 4) y las muestras se tratan durante 1 hora.
[0466] La eficiencia del biopulido se ensaya por la medición de la densidad óptica de la solución de reacción.
Inmediatamente después del tratamiento, la solución debería ser íntegramente mezclada, utilizando una pipeta, para 5 resuspender cualquier sedimento posible de vello quitado.
Una parte alícuota de 1-1.5 ml de solución de reacción es luego tomada de cada celda.
La densidad óptica de la solución es luego medida en un espectrofotómetro a 400 nm en una cubeta 1 ml(1 cm camino óptico).
La solución se resuspende y dosifica en la cubeta y la densidad óptica es determinada rápidamente (en 10 10 segundos), conforme la suspensión se sedimenta gradualmente y la densidad óptica cambia debido a l sedimentación.
Si el valor de A400 excede 1 unidad, la muestra es diluida 2-4 veces cuidadosamente y la densidad óptica es determinada otra vez.
Si una muestra fue diluida, el valor resultante debería ser multiplicado por el factor de dilución. 15
[0467] Enjuague y secado: las piezas circulares de tejido deberían ser enjuagadas inmediatamente después de tomar las partes alícuotas de la solución de reacción, ya que la reacción enzimática procederá de lo contrario.
La muestra es quitada de la célula, y lavada brevemente en agua destilada.
Todas las muestras son luego enjuagadas juntas íntegramente en agua destilada para 3-5 min, agitando 20 suavemente y cambiando el agua periódicamente.
Después del aclarado, las muestras son transferidas usando papel el filtro y secadas a temperatura ambiente durante al menos 24 horas.
[0468] La medición de la eficiencia del biopulido por determinación de la pérdida de peso: cada muestra se pesa a 25 un 1 mg de exactitud.
Los valores resultantes son comparados con los de la misma muestra antes del tratamiento y la pérdida de peso se calcula como por debajo:
30
[0469] La evaluación cualitativa de la apariencia de superficie: la imagen del borde del tejido plegado es tomada utilizando un dispositivo adecuado a una ampliación de aproximadamente x 60.
Las imágenes de las muestras tratadas por diferentes pruebas de enzimas y vacío preliminar son comparadas visualmente. 35
[0470] En detalle, la pieza circular es plegada (para todas las muestras en una misma manera - por ejemplo, de modo que los hilos de superficie son perpendiculares a la línea de borde).
Todas las muestras deberían ser plegadas de modo que la superficie tratada está hacia arriba.
Las muestras se pueden grapar a un papel para una operación más conveniente. 40
Las imágenes son luego tomadas utilizando un microscopio QX3 Intel Play a x 60 de ampliación y registrada en el formato JPEG.
[0471] Las muestras deberían ser realizadas en series de hasta 8 muestras en cada una.
En cada serie, allí debería haber un tratamiento de control (sin una enzima) y un tratamiento con una preparación 45 estándar.
Para cada preparación bajo investigación, al menos 2 repeticiones deberían ser hechas.
[0472] La determinación de peso está influenciada por las condiciones de secado.
El secado de las muestras antes del tratamiento y después en condiciones reproducibles es recomendado (por 50 ejemplo, calentando en un horno y secado en un desecante).
El secado a condiciones ambientes puede resultar en desviaciones ligeras entre series realizadas días diferentes.
[0473] El efecto de tratamiento enzimático junto con tensión mecánica en nuestra prueba es similar al muy usado Launderometer y otras máquinas de prueba de laboratorio, pero tiene geometría diferente. 55
Debido a esta geometría, el sistema es capaz de hacer otra miniaturización y requiere menos de 1 mg de cantidades de una enzima.
[0474] La evaluación del tejido biológicamente pulido puede ser problemática.
Los parámetros más importantes (y directos) son resistencia de frisado y vellosidad de un tejido tratado. 60
La pérdida de peso, la clarificación de color, y la mejora de blandura son parámetros menos directos pero valiosos.
La resistencia de frisado superior se correlaciona con pérdidas de peso superiores y da menos vello, clarificación de color y sensación más blanda.
La vellosidad se evalúa cualitativamente en nuestro método en 3 niveles: buena, moderada y pobre.
La densidad óptica debería correlacionarse directamente con tanto pérdida de peso (la pérdida de peso se debe principalmente al vello quitado haciendo suspensión túrbida en una solución) como vellosidad de tejido.
[0475] La Tabla 30 y la Figura 23 ilustran la capacidad de biopulido de celobiohidrolasas y endoglucanasas de la 5 presente divulgación.
La liberación de tinte (D 400 nm) después del tratamiento con 0.2 g/l de enzima a pH 5.0 y 50°C es mostrado.
Tabla 30: Capacidades de biopulido de C1 celobiohidrolasas y endoglucanasas
Enzima %
Liberación de tinte
EG I
0.17
EG II
0.2
EG II (CD)
0.1
EG III
0.16
EG V
0.2
EG VI
0.1
CBH Ia
0.1
CBH Ia (CD)
0.2
CBH Ib
0.3
CBH IIa
0.2
CBH IIb
0.1
10
Ejemplo 17
[0476] El ejemplo siguiente ilustra métodos de biostoning los tejidos (abrasión) usando enzimas de la presente divulgación y la enzima de la invención.
15
[0477] El método permite evaluar una pequeña cantidad de enzimas (en el rango de mini-prueba de 0.5-5 mg de muestra de enzima).
El método está disponible en dos balanzas, requeriendo aproximadamente 10 y 1 mg de proteína, respectivamente (método A y método B).
Ambas balanzas utilizan wl mismo principio y da resultados comparables. 20
El método B requiere celdas especialmente diseñadas pero resultó más fácil para evaluar las enzimas puras.
Método A
[0478] Vasos de 250 ml (diámetro interno 56 mm, altura 110 mm) con discos de teflón en el fondo (grosor 4 mm) se 25 usan para el tratamiento de tejido denim con celulasa (ver figura 22A).
Una muestra de tejido denim reducido (10 x 10 cm) se extiende sobre el extremo de un tubo de plástico (diámetro 50 mm, altura 100 mm) y se fija con un anillo de caucho.
El tubo se inserta en el vaso de 250 ml de modo que la muestra se agrega apretadamente y uniformemente al disco de teflón en el fondo del vidrio. 30
Diez bolas de perdigón metálicas (diámetro 7 mm) se colocan dentro del tubo para proporcionar tensión mecánica a la superficie de tejido, y se añaden 30 ml de la solución enzimática en el búfer apropiado.
El vaso se coloca sobre una coctelera de baño maría ELPAN (Polonia) de tipo 357 a 50°C.
El tratamiento enzimático de la tela vaquera se realiza durante 1 hora a la velocidad de coctelera de 300 r.p.m. y amplitud de vibraciones ajustada a 4 unidades. 35
La muestra es luego quitada y lavada durante 1 minuto con agua corriente.
Un exceso de agua en la superficie de la muestra se quita comprimiéndola entre dos hojas de secante, y luego la muestra se seca durante toda la noche al aire a temperatura ambiente.
En un experimento separado, un ensayo de control se realiza como se ha descrito anteriormente, pero en ausencia de enzima. 40
Para el control, 30 ml del mismo búfer usado para dilución enzimática se añaden al vaso.
Método B
[0479] Este procedimiento de ensayo usa celdas cilíndricas especialmente diseñadas (diámetro externo 35 mm, 45 diámetro interno 30 mm, altura 48 mm) hechas de acero inoxidable y equipadas con tapas estrechadas (ver figura 22B).
Este método también usa 10 veces menos enzima que método A.
Una muestra circular de tejido denim (30 mm de diámetro) se colocan en el fondo de una celda, y un cartucho cilíndrico de acero inoxidable se inserta para grapar la muestra.
Tres cilindros metálicos (7 x 7 mm), hechos de acero inoxidable, se colocan en la célula para proporcionar tensión mecánica, y 3 ml de la solución enzimática se añaden en el búfer apropiado.
Una tapa, equipada con un anillo de caucho interior, es rápidamente estrechado para sellar la celda herméticamente, 5 y la célula se coloca en un baño maría en una coctelera.
Luego, el procedimiento es realizado bajo las mismas condiciones que se han descrito anteriormente para el método A.
En el ensayo de control, la muestra afacric es tratada bajo las mismas condiciones pero en ausencia de enzima.
Con este fin, 3 ml del mismo búfer usado para la dilución enzimática se añaden a la celda. 10
[0480] Ambos ensayos (método A o método B) se realizan al menos en dos repeticiones para cada enzima particular (normalmente tres repeticiones).
Típicamente, cuando las preparaciones con celulasa diferentes son comparadas, las condiciones en el sistema de reacción se igualan por la actividad de CMCasa (1-3 U/ml). 15
Muestras de celulasa ácida se ensayan a pH 5.0 utilizando 0.1 M de tampón acetato.
Celulasas Neutrales se ensayan a pH 6.0 utilizando 0.1 M de tampón fosfato.
[0481] El análisis de intensidad de color en las muestras de tela vaquera se realiza utilizando un escáner Mustek MFS-12000SP (EE.UU). 20
Un área circular en la muestra, sometida a la acción combinada de enzima y mecánica como por encima, se escanea a resolución 300 dpi.
Esta área es normalmente más clara que la superficie de tela vaquera cerca de los bordes de muestra.
Cada muestra es escaneada dos veces: primero, cuando los hilos en la superficie del tejido son paraleloa al movimiento de la fuente luminosa en escaneado, y segundo, cuando los hilos son dirigidos perpendiculares al 25 movimiento de la fuente de luz durante el escaneado.
[0482] Las imágenes JPG obtenidas como resultado del escaneado son analizadas usando el software Adobe Photoshop (se puede utilizar la versión 3.0 o posterior).
Para cada exploración particular, se abre un histograma. 30
El canal azul se selecciona y el percentil a nivel 32 (P32) es leído.
Este parámetro muestra el porcentaje de píxeles de imagen con la intensidad de color superior al nivel 32 del histograma (un total de 256 sombras (niveles) de color azul como el eje de abscisa).
El más alto es el P32, el más oscuro es la muestra de tela vaquera.
Al contrario, el parámetro (100 - P32, %) muestra el porcentaje de píxeles con la intensidad de color por debajo del 35 nivel 32 del histograma.
La Figura 24 muestra un histograma de ejemplo generado del análisis de intensidad de color de una muestra de tela vaquera.
[0483] Para cada enzima particular evaluada, un valor medio del P32 y desviación típica es calculado utilizando los 40 datos de todos los sondeos para esta enzima.
Por ejemplo, si el ensayo se realiza en dos repeticiones, cuatro valores P32 se tienen en cuenta, ya que para cada repetición dos sondeos son realizados.
[0484] La diferencia entre el valor medio de P32 obtenido en el control (sin celulasa) y el valor medio de P32 para la 45 enzima se toma como un criterio de la actividad abrasiva de la enzima.
[0485] La Tabla 31 y la Figura 25 ilustran la capacidad de lavado (abrasión) de tela vaquera de celobiohidrolasas y endoglucanasas de la presente divulgación usando el ensayo B detallado arriba.
Las unidades relativas por mg de enzima determinada a 50°C, pH 5.0 son mostradas. 50
Tabla 31: Capacidades de abrasión de C1 celobiohidrolasas y endoglucanasas
Enzimas
Unidades relativas por mg
EG I
14
EG II
62
EG II (CD)
54
EG III
25
EG V
65
EG VI
12
CBH Ia
3
CBH Ia (CD)
11
CBH Ib
10
CBH IIa
22
CBH IIb
15
[0486] Ejemplos adicionales y discusión sobre métodos de A y B se presentan en A.Gusakov, A.Sinitsyn, S.Grishutin, D.Tikhomirov, D.Shook, D.Sheer, M.Emalfarb Microassays to control the results of cellulase treatment of denim fabrics; Textile Chemist and Colorist and American Dyestuff Reporter, (2000), V.32, N. 5, P.42. 5
Ejemplo 18
[0487] El ejemplo siguiente ilustra métodos de redeposición de tejidos usando enzimas de la presente divulgación y la enzima de la presente invención. 10
[0488] Los métodos permiten evaluar una pequeña cantidad de enzimas (en el rango de mini-prueba de 0.5-5 mg de muestra de enzima).
[0489] El método A de redeposición de índigo estándar requiere cantidades de enzima mayores (típicamente 2-5 mg 15 de proteína para un ensayo realizado con muestras de 3.5 x 3.5 cm en 2-3 repeticiones).
Cuando la purificación de componentes enzimáticos se realiza en una escala de laboratorio y es necesario evaluar el índice de redeposición (BSI) para la enzima purificada, cantidades muy inferiores de una enzima son típicamente disponibles.
En tal caso, una modificación de este método (método B) debería ser usada, donde se usan muestras menores de 20 prenda estándar (1.4 x 1.4 cm), y el volumen total de suspensión de índigo es 2 ml.
Este procedimiento de microensayo minimizado requiere diez veces menos cantidad de proteína (0.2-0.5 mg).
Método A
25
[0490] Preparación de reactivo de índigo: 250 mg de índigo se añaden a 50 ml de agua destilada en un matraz y se agitan enérgicamente durante 15-20 minutos en un agitador magnético.
Antes de tomar partes alícuotas para la coloración de experimentos, la suspensión se coloca en un baño ultrasónico Bandelin SONOREX TK52 durante 5 minutos para interrumpir agregados de índigo grandes y para hacer la suspensión más constante. 2 ml de partes alícuotas se usan para la coloración de experimentos (ver debajo) bajo 30 agitación magnética para proporcionar una suspensión de índigo constante en la mezcla reactiva.
[0491] Procedimiento de ensayo: una pieza de tejido blanco (3.5 x 3.5 cm) se añade a 18 ml de 0.1 M búfer de Na-acetato (pH 5.0) en un vaso de vidrio de 250 ml Y es incubado a temperatura ambiente DURANTE 10 minutos (control). 35
Una solución de preparación enzimática en la misma cantidad del búfer se usa en el procedimiento de ensayo enzimático. 2 ml de suspensión de índigo (5 mg/ml) son añadidos entonces, y el vaso se coloca en un baño maría (50°C) en una coctelera (300 r.p.m.) y se agita durante 30 min. La pieza de tejido se quita con pinzas pequeñas y es lavada dos veces durante 5 minutos con 50 ml de agua destilada (en una coctelera a 300 r.p.m.) y luego secada a temperatura ambiente durante toda la noche. 40
Para muestra de cada enzima y control, el procedimiento de ensayo se realiza al menos en 3 repeticiones.
[0492] Muestras de tejido manchado se escanean a resolución de 300 dpi en un escáner "Paragon" ("Muztek"; EE.UU).
Dos imágenes del lado frontal y dos imágenes del lado posterior (una directo y una rotada 90°) se obtienen para 45 cada muestra.
Las imágenes son procesadas utilizando un software de Adobe Photoshop.
Un histograma de intensidades de color se calcula para cada muestra utilizando un canal azul, y un percentil a nivel 120 se usa como un criterio del coloración.
El valor medio y desviación típica se calculan para preparación de cada enzima y control. 50
[0493] T. reesei (ECA) se usa normalmente como un control (estándar interno) para analizar las propiedades de pérdida de contraste de una muestra de enzima particular, ya que ECA se caracteriza por un índice alto de pérdida de contraste.
Si es posible, una muestra IndiAge Super GX debería ser usada como un segundo estándar interno ya que tiene un 55 índice de pérdida de contraste bajo.
Método B
[0494] La suspensión de materia prima de índigo (5 g/l) se prepara y el tratamiento de imagen se realiza como se ha descrito anteriormente.
[0495] Procedimiento de ensayo: una pieza de tejido de blanco (1.4 x 1.4 cm) se coloca en un frasco cilíndrico pequeño ("vial de penicilina", 2.2 cm diámetro y 5 cm altura) con 1.8 ml de solución enzimática en 0.1 M de búfer de 5 Na-acetato (pH 5.0) y se incuba a temperatura ambiente durante 10 min. 0.2 ml de suspensión de índigo se añaden entonces, y el frasco se coloca en un baño maría (50°C) en una coctelera (300 r.p.m.) y agitado durante 30 minutos.
La muestra de tejido se quita con pinzas pequeñas y se lava dos veces durante 5 minutos con 5 ml de agua destilada a 50°C (en una coctelera a 300 r.p.m.), luego se seca a temperatura ambiente durante toda la noche.
Para cada muestra de enzima y control (estándar interno), el procedimiento de ensayo es típicamente realizado en 3 10 repeticiones.
En más experimentos, se usan 1.5 unidades de CMCasa por ml de sistema de reacción.
En casos donde la actividad de CMCasa específica es muy baja (o ausente), se usan 0.05-0.1 mg de proteína por ml de sistema de reacción.
15
[0496] Resulta conveniente colocar tres viales (3 repeticiones) en un vaso de 250 ml con 15-20 ml de agua en el fondo y luego colocar el vaso en un baño maría en una coctelera.
[0497] Ejemplos adicionales y discusión sobre métodos de A y B se presentan en A. Gusakov, A. Sinitsyn, S. Grishutin, D. Tikhomirov, D. Shook, D. Sheer, M. Emalfarb Microassays to control the results of cellulase treatment of 20 denim fabrics; Textile Chemist and Colorist and American Dyestuff Reporter, (2000), V.32, N. 5, P.42.
Ejemplo 19
[0498] El ejemplo siguiente ilustra ensayos usado para medir la actividad enzimática de esterasa de acetilo. 25
Acitividad hacia sustrato de acetato de p-nitrofenilo
[0499] Este ensayo mide la liberación de p-nitrofenol por la acción de una acetil esterasa en el acetato de p-nitrofenilo (PNPAc). 30
Una unidad de actividad de acetil esterasa es la cantidad de enzima que libera 1 micromol de p-nitrofenol en un minuto a 37°C y pH 7.2.
[0500] El tampón fosfato (0.01 M, pH 7.2) se prepara de la siguiente manera: 0.124 g de NaH2PO4 * H2O y 0.178 g Na2HPO4 son disueltos en agua destilado de forma que el volumen final de la solución 500 ml y el pH de la solución 35 resultante es 7.2.
[0501] PNPAc (Fluka Chemie, Suiza, cat. # 46021) se usa como el sustrato de ensayo. 3.6 mg de PNPAc son disueltos en 10 ml de 0.01 M de tampón fosfato utilizando un agitador magnético para obtener un 2 mM de solución madre. 40
La solución es estable durante 2 días con almacenamiento a 4 °C.
[0502] El reactivo de parada (0.25 M Tris-HCl, pH 8.5) se prepara de la siguiente manera: 30.29 g de Tris son disueltos en 900 ml de agua destilada (solución A).
El Tris-HCl final 0.25 M pH 8.5 se prepara mediante la mezcla de solución A con 37% HCl hasta que el pH de la 45 solución resultante es igual al 8.5.
El volumen de la solución es luego ajustado a 1000 ml.
Este reactivo se utiliza para terminar la reacción enzimática.
Usando los reactivos anteriores, el ensayo se realiza como detallado por debajo.
50
[0503] Para la muestra enzimática, 0.10 ml de solución madre 2 mM PNPAc se mezclan con 0.01 ml de una muestra enzimática y son incubados a 37°C durante 5 minutos (Axe2 y Axe3) o 10 minutos (Axel).
Después de exactamente 5 o 10 minutos de incubación, 0.1 ml de 0.25 M solución Tris-HCl se añaden y luego la absorbancia a 405 nm (A405) se mide en placas de microtitulación como As.
55
[0504] Para la forma preliminar de sustrato, 0.10 mL de solución madre 2 mM PNPAc se mezcla con 0.01 ml de 0.01 M de tampón fosfato, pH 7.2. 0.1 mL de solución 0.25 M Tris-HCl se añden entonces y la absorbancia a 405 nm (A405) se mide en placas de microtitulación como ASB.
[0505] La actividad es calculada de la siguiente manera: 60
donde ΔA405 = AS - ASB, DF es el factor de dilución enzimática, 21 es la dilución de 10 µl de solución enzimática en 210 µl de volumen de reacción, 1.33 es el factor de conversión de placas de microtitulación para cubetas, 13.700 es el coeficiente de extinción (13700 M-1 cm-1 de p-nitrofenol liberado corregido para mol/L a µmol/mL), y 5 minutos es el tiempo de reacción.
5
[0506] Usando el ensayo de arriba, la actividad de esterasa de acetilo de Axe1 resultó ser 0.23 IU/mL (ΔA405= 1.11; DF=1), Axe2 resultó ser 2.80 U/ml ((ΔA405= 0.1714; DF=40), y Axe3 resultó ser 39.97 U/ml (ΔA405= 0.4901, DF=200).
Actividad hacia sustratos de oligosacárido de arabinoxilano
10
[0507] Este ensayo mide la liberación de acetato por la acción de una esterasa de acetilo de xilano en los oligosacáridos de arabinoxilano de madera de eucalipto.
[0508] 0.01 M hidróxido sódico se prepara de la siguiente manera: 0.4 g de hidróxido de sodio son disueltos en agua destilado de forma que el volumen final de la solución sea 1000 ml. 15
[0509] Oligosacáridos de arabinoxilano de madera de eucalipto fueron preparados disolviendo 5 mg de oligosacáridos de arabinoxilano en 1 ml de agua destilada usando un agitador magnético como se describe en Kabel et al. Carbohdr. Polym. 50:191 (2002).
20
[0510] Para la muestra enzimática, 1.0 mL de solución madre de oligosacáridos de arabinoxilano se mezcla con 0.005 mg de la muestra enzimática y se incuba a 35 °C.
El pH fue mantenido a 5.0 por la adición de 0.01 M NaOH.
El volumen adicionado de 0.01 M NaOH es proporcional a la descomposición de conexión de éster y liberación de acetato. 25
[0511] Para la forma preliminar de sustrato, 1.0 ml de solución madre de oligosacáridos de arabinoxilano se mezcla con 0.005 mg de agua destilada y se incuba a 35°C.
El pH fue mantenido a 5.0 por adición de 0.01 M NaOH.
El volumen adicionado de 0.01 M NaOH es proporcional a la descomposición de conexión de éster y liberación de 30 acetato.
[0512] Usando el ensayo de arriba, se descubrió que tanto Axe2 como Axe3 muestran actividad de esterasa de acetilo de xilano, como medido por la liberación de acetato de oligosacáridos de arabinoxilano de madera de eucalipto. 35
Para Axe2, 0.7 ml NaOH fue usado después de 200 minutos de incubación.
Para Axe3, 0.35 ml fue usado después de 200 minutos.
Ejemplo 20
40
[0513] El ejemplo siguiente ilustra ensayos usado para medir la actividad enzimática de esterasa de ácido ferúlico.
Acitividad hacia sustrato de butirato de p-nitrofenilo
[0514] Este ensayo mide la liberación de p-nitrofenol por la acción de una esterasa de ácido ferúlico en el butirato de 45 p-nitrofenilo (PNPBu).
Una unidad de actividad de acetil esterasa es la cantidad de enzima que libera 1 micromol de p-nitrofenol en un minuto a 37°C y pH 7.2.
[0515] Tampón fosfato (0.01 M, pH 7.2) se prepara de la siguiente manera: 0.124 g de NaH2PO4 * H2O y 0.178 g 50 Na2HPO4 son disueltos en agua destilada de manera que el volumen final de la solución es 500 ml y el pH de la solución resultante es igual a 7.2.
[0516] PNPBu (Sigma, EE.UU, cat. # N9876-5G) se usa como el sustrato de ensayo. 10 µl de PNPBu se mezclan con 25 ml de 0.01 M tampón fosfato usando un agitador magnético para obtener una solución madre de 2 mM. 55
La solución es estable durante 2 días con almacenamiento a 4°C.
[0517] El reactivo de parada (0.25 M Tris-HCl, pH 8.5) se prepara de la siguiente manera: 30.29 g de Tris son disueltos en 900 ml de agua destilada (solución A).
El Tris-HCl final 0.25 M pH 8.5 se prepara mediante la mezcla de solución A con 37% HCl hasta que el pH de la 60 solución resultante es igual a 8.5.
El volumen de la solución se ajusta a 1000 ml.
Este reactivo se utiliza para terminar la reacción enzimática.
Usando los reactivos anteriores, el ensayo se realiza como detallado por debajo.
65
[0518] Para la muestra enzimática, 0.10 ml de solución madre 2 mM PNPBu se mezclan con 0.01 ml de la muestra enzimática y se incuban a 37°C durante 10 minutos.
Después de exactamente 10 minutos de incubación, 0.1 ml de solución Tris-HCl 0.25 M se añaden y luego la absorbancia a 405 nm (A405) se mide en placas de microtitulación como As.
5
[0519] Para la forma preliminar de sustrato, 0.10 ml de solución madre 2 mM PNPBu se mezclan con 0.01 ml de 0.01 M tampón fosfato, pH 7.2. 0.1 ml de solución Tris-HCl 0.25 M se añaden entonces y la absorbancia a 405 nm (A405) es medida en placas de microtitulación como ASB.
[0520] La actividad es calculada de la siguiente manera: 10
donde ΔA405= AS - ASB, DF es el factor de dilución enzimática, 21 es la dilución de 10 µl de solución enzimática en 210 µl de volumen de reacción, 1.33 es el factor de conversión de placas de microtitulación para cubetas, 13.700 es 15 el coeficiente de extinción (13700 M-1 cm-1 de p-nitrofenol liberado corregida para mol/l a µmol/ml), y 10 minutos es el tiempo de reacción.
[0521] Usando el ensayo de arriba, la actividad de esterasa de ácido ferúlico de FaeA1 resultó ser 18.5 IU/ml (ΔA405= 0.906; DF=10), FaeA2 resultó ser 0.40 U/ml (ΔA405= 1.976; DF=1) y FaeB2 resultó ser 0.02 U/ml (ΔA405= 0.111, 20 DF=1).
Actividad hacia sustrato de butirato de p-nitrofenilo
[0522] El ensayo siguiente se utiliza para medir la actividad enzimática de una esterasa de ácido ferúlico hacia 25 oligosacáridos de salvado de trigo (WB) midiendo la liberación de ácido ferúlico.
[0523] Los oligosacáridos de salvado de trigo se preparan por degradación de salvado de trigo (obtenidos de Nedalco, Países Bajos) por endo-xilanasa III de A. niger (colección enzimática Laboratory of Food Chemistiy, Wageningen University, Países Bajos). 50 mg de WB son disueltos en 10 ml de 0.05 M pH de tampón de acetato 5.0 30 utilizando un agitador magnético. 1.0 ml de solución madre WB se mezcla con 0.0075 mg de la enzima y se incuba a 35°C durante 24 horas.
La reacción se detiene calentando las muestras durante 10 minutos a 100°C.
El material residual se quita por centrifugación (15 minutos a 14000 r.p.m.), y el sobrenadante se usa como el sustrato en el ensayo detallado por debajo. 35
[0524] Para la muestra enzimática, 1.0 ml de solución madre de oligosacáridos de salvado de trigo se mezcla con 0.005 mg de la muestra enzimática y se incuba a 35°C durante 24 horas.
La reacción se detiene calentando las muestras durante 10 minutos a 100°C.
La liberación de ácido ferúlico se analiza por la medición de la absorbancia a 335 nm. 40
[0525] Para la forma preliminar de sustrato, 1.0 ml de solución madre de oligosacáridos de salvado de trigo se mezcla con 0.005 mg de 0.05 M tampón acetato, pH 5.0, y se incuba a 35°C durante 24 horas.
La reacción se detiene calentando las muestras durante 10 minutos a 100°C.
La liberación de ácido ferúlico se analiza por la medición de la absorbancia a 335 nm. 45
[0526] Utilizando el ensayo de arriba, se descubrió que FaeA1 libera ácido ferúlico de los oligosacáridos de arabinoxilano de salvado de trigo, liberando 75% del ácido ferúlico presente en salvado de trigo.
FaeA1 también mostró actividad hacia los oligosacáridos de pulpa de remolacha azucarera (20% hidrólisis).
Se descubrió que FaeB2 libera 80% del ácido ferúlico presente en salvado de trigo. 50
FaeB2 también mostró actividad hacia los oligosacáridos de pulpa de remolacha azucarera (16% hidrólisis).
Ejemplo 21
[0527] El ejemplo siguiente ilustra un ensayo usado para medir la actividad enzimática de α-arabinofuranosidasa. 55
[0528] Este ensayo mide la liberación de arabinosa por la acción de la α-arabinofuranosidasa en los oligosacáridos de arabinoxilano de trigo (WAX).
[0529] Tampón de acetato (0,05 M, pH 5,0) se prepara de la siguiente manera: 4.1 g de acetato de sodio anhidro o 60 6.8 g de acetato de sodio * 3H2O son disueltos en agua destilada de forma que el volumen final de la solución es 1000 (solución A).
En un matraz separado, 3.0 g (2.86 mL) de ácido acético glacial se mezcla con agua destilada para hacer el volumen total de 1000 ml (solución B).
El tampón acetato final 0.05 M, pH 5.0, se prepara mediante la mezcla de la solución A con la solución B hasta que el pH de la solución resultante es igual a 5.0.
5
[0530] Oligosacáridos de arabinoxilano de trigo se preparan por degradación de arabinoxilano de trigo (Megazyme, Bray Ireland, Cat. # P-WAXiI) por endo-xilanasa I de A. niger (colección enzimática de Laboratory of Food Chemistiy, Wageningen University, Países Bajos). 50 Mg de cera son disueltos en 10 ml de 0.05 M tampón acetato, pH 5.0, usando un agitador magnético. 1.0 Ml de solución madre de cera se mezcla con 0.0075 mg de la enzima y se incuba a 35°C durante 24 horas. 10
La reacción se detiene calentando las muestras durante 10 minutos a 100°C.
El material residual se quita por centrifugación (15 minutos a 14000 r.p.m.), y el sobrenadante se usa como el sustrato en el ensayo detallado por debajo.
[0531] Para la muestra enzimática, 1.0 ml de solución madre de oligosacáridos de arabinoxilano de trigo se mezcla 15 con 0.0075 mg de la muestra enzimática y se incuba a 35°C durante 24 horas.
La reacción se detiene calentando las muestras durante 10 minutos a 100°C.
La liberación de arabinosa y la formación de nuevos oligosacáridos de arabinoxilano fueron analizadas por cromatografía de intercambio de anión de alto rendimiento.
20
[0532] Para la forma preliminar de sustrato, 1.0 ml de solución madre de oligosacáridos de arabinoxilano de trigo se mezcla con 0.0075 mg del 0.05 M tampón acetato, pH 5.0, y se incuba a 35°C durante 24 horas.
La reacción se detiene calentando las muestras durante 10 minutos a 100°C.
La liberación de arabinosa y la formación de nuevos oligosacáridos de arabinoxilano fueron analizadas por cromatografía de intercambio de anión de alto rendimiento. 25
[0533] Análisis de cromatografía de intercambio de anión de alto rendimiento es realizado utilizando un sistema de HPLC de Dionex equipado con una columna (2 mm ID x 250 mm) Dionex CarboPac PA-1 en combinación con una columna de protección CarboPac PA (1 mm ID x 25 mm) y un detector de Dionex EDetl PAD (Dionex Co., Sunnyvale, CA, EE.UU). 30
Una velocidad de flujo de 0.3 ml/min fue usada con el siguiente gradiente de acetato sódico en 0.1 M NaOH: 0-5 min, 0-100 mM; 5-45 min, 100-400 mM.
Cada elución fue seguida de un paso de lavado de 5 minutos 1,000 mM acetato sódico en 0.1 M NaOH y un paso de equilibrado de 15 minutos 0.1 M NaOH.
35
[0534] Utilizando el ensayo anterior, se descubrió que tanto Abf1 como Abf2 liberan arabinos de los oligosacáridos de arabinoxilano de trigo.
Ambas enzimas quitaron residuos de arabinosa, que fueron monosustituidos al esqueleto de xilosa.
Residuos de arabinosa enlazada a las posiciones 02 y 03 del residuo de xilosa fueron liberados por tanto Abf1 como Abf2. 40
Ejemplo 22
[0535] El ejemplo siguiente ilustra un ensayo usado para medir la actividad enzimática de pectin metilesterasa.
45
[0536] El ensayo siguiente se utiliza para medir la actividad enzimática de una pectin metilesterasa hacia pectina cítrica altamente metilada (DM 65) en combinación con rojo de metilo.
El ensayo mide la liberación de metanol por la acción de pectin metilesterasas en la pectina cítrica metilada.
La liberación de metanol acidificará una solución (ácido galacturónico no-esterificado), que hace el indicador de rojo de metilo cambie de color a un pH inferior a 4.4. 50
[0537] La solución de rojo de metilo de pectina es preparada de la siguiente manera: 0.5 g de pectina cítrica metilada (DM 65, Sigma, EE.UU, Cat. # P9436-5G), 2 mg rojo de metilo (Sigma; EE.UU) y 0.435 g NaCl son disueltos en agua destilado de forma que el volumen final de la solución es 50 ml.
El pH final se ajusta a 5.0 añadiendo 0.1 M NaOH. 55
[0538] Para la muestra enzimática, 0.1 ml de solución madre de rojo de metilo de pectina se mezclan con 0.01 ml de la muestra enzimática y se incuban a 37°C durante toda la noche.
La absorbancia a 520 nm (A520) es medida como As.
60
[0539] Para la forma preliminar de sustrato, 0.1 ml de solución madre de rojo de pectina/metilo se mezclan con 0.01 ml de agua destilada y se incuban a 37°C durante toda la noche.
La absorbancia a 520 nm (A520) es medida como ASB.
[0540] Usando el ensayo por encima, el ΔA520 de Pme1 resultó ser 0.401, lo que demuestra que Pme1 es activo 65 hacia pectina altamente metilada.
Ejemplo 23
[0541] El ejemplo siguiente ilustra un ensayo usado para medir la actividad enzimática de endo-arabinasa.
5
[0542] El ensayo se usa para medir la actividad enzimática de una endo-arabinasa hacia AZCL-arabinano (desramificado).
Este sustrato es insoluble en soluciones tamponadas, pero hidrata rápidamente para formar partículas de gel que se hidrolizan por endo-hidrolasas específicas, libernado fragmentos soluble marcados con tinte.
10
[0543] El tampón acetato (0.05 M, pH 5.0) se prepara de la siguiente manera: 4.1 g de acetato de sodio anhidro o 6.8 g de acetato de sodio * 3H2O son disueltos en agua destilada así que el volumen final de la solución es 1000 ml (solución A).
En un matraz separado, 3.0 g (2.86 ml) de ácido acético glacial se mezclan con agua destilada para producir un volumen total de 1000 ml (solución B). 15
El tampón acetato final 0.05 M, pH 5.0, se prepara mediante la mezcla de solución A con solución B hasta que el pH de la solución resultante es igual al 5.0.
[0544] AZCL-arabinano (desramificado) de Megazyme (Bray, Ireland, Cat. # I-AZDAR) se usa como el sustrato de ensayo. 50 Mg de AZCL-arabinano son disueltos en 10 ml de 0.05 M tampón acetato, pH 5.0, usando un agitador 20 magnético. Etanol 96% se utiliza para terminar la reacción enzimática.
[0545] Para la muestra enzimática, 0.2 ml de 5 mg/ml de solución madre de AZCL-arabinano se precalienta a 40°C durante 10 minutos.
Esta solución madre precalentada se mezcla con 200 µl de la muestra enzimática (precalentada a 40°C durante 10 25 minutos) e incubada a 40°C durante 10 minutos.
Después de exactamente 10 minutos de incubación, 1.0 ml de etanol 96% se añade y la absorbancia a 590 nm (A590) es luego medida como As.
[0546] Para la forma preliminar de sustrato, 1.2 ml de 5 mg/ml solución madre de AZCL-arabinano se precalientan a 30 40°C durante 10 minutos.
Esta solución madre precalentada se mezcla con 200 µl de 0.05 M pH de tampón de acetato 5.0 (precalentado a 40°C durante 10 minutos) e incubada a 40°C durante 10 minutos.
Después de exactamente 10 minutos de incubación, 1.0 ml de etanol 96% se añade y la absorbancia a 590 nm (A590) es luego medida como ASB. 35
[0547] La actividad de endo-arabinasa es determinada usando una curva estándar producida de una endo-arabinasa con actividad conocida hacia AZCL-arabinano. La actividad (UI/ml) = ΔA595 * DF,
donde ΔA595= AS - ASB y DF es el factor de dilución enzimática.
40
[0548] Usando el ensayo anterior, el ΔA595 resultó ser 1.53 con un DF de 1, indicando que Abnl muestra actividad de endo-arabinasa hacia AZCL-arabinano.
Ejemplo 24
45
[0549] El ejemplo siguiente ilustra un ensayo usado para medir actividad enzimática de β-xilosidasa.
[0550] Este ensayo mide la liberación de p-nitrofenol por la acción de una β-xilosidasa en el p-nitrofenilo β-D-xilopiranósido (PNPX).
Una unidad de actividad de β-xilosidasa es la cantidad de enzima que libera 1 micromol de p-nitrofenol en un minuto 50 a 37°C y pH 5.0.
[0551] El tampón acetato (0.1 M, pH 5.0) se prepara de la siguiente manera: 8.2 g de acetato de sodio anhidro o 13.6 g de acetato de sodio * 3H2O son disueltos en agua destilada de forma que el volumen final de la solución es 1000 ml (solución A). 55
En un matraz separado, 6.0 g (5.72 ml) de ácido acético glacial se mezclan con agua destilada para hacer el volumen total de 1000 ml (solución B).
El M tampón acetato final 0.1, pH 5.0, se prepara mediante la mezcla de solución A con solución B hasta que el pH de la solución resultante es igual al 5.0.
60
[0552] PNPX (Extrasynthese, Francia, Cat. # 4244) se usa como el sustrato de ensayo. 16.5 mg de PNPX son disueltos en 5 ml de agua destilada y 5 ml tampón acetato 0.1 M que utiliza un agitador magnético para obtener 2 mM de solución madre.
La solución es estable durante 2 días con almacenamiento a 4°C.
65
[0553] El reactivo de parada (0.25 M de solución de carbonato de sodio) es preparado de la siguiente manera: 26.5 g de carbonato de sodio anhidro son disueltos en 800 ml de agua destilada, y el volumen de solución se ajusta a 1000 ml.
Este reactivo se utiliza para terminar la reacción enzimática.
5
[0554] Para la muestra enzimática, 0.10 ml de solución madre 2 mM PNPX se mezclan con 0.01 ml de la muestra enzimática y se incuban a 37°C durante 30 minutos.
Después de exactamente 30 minutos de incubación, 0.1 ml de solución de carbonato de sodio 0.25 M se añade y la absorbancia a 405 nm (A405) es luego medida en placas de microtitulación como As.
10
[0555] Para la forma preliminar de sustrato, 0.10 ml de solución madre 2 mM PNPX se mezclan con 0.01 ml de 0.05 M tampón acetato, pH 5.0. 0.1 mL de solución de carbonato de sodio 0.25 M son luego añadidos y la absorbancia a 405 nm (A405) es medida en placas de microtitulación como ASB.
[0556] La actividad es calculada de la siguiente manera: 15
donde ΔA405 = AS - ASB, DF es el factor de dilución enzimática, 21 es la dilución de 10 µl solución enzimática en volumen de reacción 210 µl, 1.33 es el factor de conversión de placas de microtitulación para cubetas, 13.700 es el 20 coeficiente de extinción 13700 M-1 cm-1 de p-nitrofenol liberado corregido para mol/l a µmol/ml, y 30 minutos es el tiempo de reacción.
[0557] Usando el ensayo anterior, se descubrió que Bx12 muestra una actividad β-xilosidasa de 0.09 IU/ml (ΔA405= 1.36, DF=1). 25
Ejemplo 25
[0558] El ejemplo siguiente ilustra un ensayo usado para medir la capacidad de sacarificación de enzimas de la presente divulgación y la enzima de la presente invención. 30
[0559] La hidrólisis de 5 g/l Avicel catalizado por celulasas purificadas fue realizada durante 120 horas a 40°C y pH 5.0.
El sustrato Avicel (10 mg) fue mezclado con 1.0 ml de 0.1 M búfer de Na-acetato, pH 5.0, que contiene 1 mM de azida sódica para prevenir crecimiento microbiano, en un frasco 2 ml. 35
El frasco fue incubado en un baño maría termostático equipado con un agitador magnético.
La solución enzimática (1 ml), diluida como se necesitaba para alcanzar una concentración particular, fue añadida y la mezcla se agitó.
Concentraciones de proteína iguales (0.1 mg/ml) fueron usadas para todas las preparaciones enzimáticas.
Para convertir celooligosacáridos, que son productos solubles de hidrólisis de celulosa catalizados por 40 endoglucanasas y celobiohidrolasas, en un producto de hidrólisis final (glucosa) y así simplificar el análisis de beta-glucosidasa altamente purificada de A. japonicas hidrolizada (0.2 U/ml; ver debajo) se añadió a la mezcla reactiva.
Partes alícuotas de la suspensión (0.1 ml) fueron recogidas de la mezcla reactiva y centrifugadas después a intervalos de tiempo fijos.
La concentración de glucosa en el sobrenadante fue determinada por el método de oxidasa-peroxidasa de glucosa 45 (véase ejemplo 6).
[0560] Beta-glucosidasa fue purificada de filtrados de A. japonicas de cultivo usando cromatografía de cambio aniónico en el medio SOURCE Q (pH 5.5, gradiente de NaCl; GE Healthcare, EE.UU) seguido de cromatografía hidrofóbica en el medio de fenilo SUPEROSE (GE Healthcare, EE.UU) en un gradiente de sulfato amónico. 50
[0561] Las tabla 32 y la figura 26 muestran un gráfico de la capacidad de sacarificación de celobiohidrolasas y endoglucanasas de la presente divulgación.
La cantidad de glucosa (g/l) producida después de la hidrólisis de 5 g/l a pH Avicel 5.0, 40°C durante 120 horas en presencia de 0.1 mg/ml enzima y 0.2 U/ml beta-glucosidasa es mostrada. 55
Tabla 32: Capacidades de sacarificación de C1 celobiohidrolasas y endoglucanasas
Enzima
Rendimiento de glucosa (g/l)
EG I
1.2
EG II
0.97
EG II (CD)
0.4

Claims (18)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo consistente en:
    a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína consistente en la SEC ID de secuencia de 5 aminoácidos Nº:32;
    b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos con actividad de xilanasa que es al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de longitud total de (a);
    c) una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo consistente en: SEC ID Nº:31, y SEC ID Nº:33; 10
    d) una secuencia de ácidos nucleicos que es completamente complementaria a las secuencias de ácidos nucleicos de (a); (b) o (c).
  2. 2. Proteína aislada que comprende a) una secuencia de aminoácidos codificada por la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1; b) una proteína de fusión que comprende la proteína aislada de (a) fusionada a una 15 proteína que incluye una secuencia de aminoácidos que es heteróloga a la proteína aislada de (a); o c) un anticuerpo o fragmento de unión de antígeno del mismo que se enlaza selectivamente a la proteína de (a).
  3. 3. Composición para la degradación de un material lignocelulósico que comprende al menos una proteína aislada según la reivindicación 2 parte (a). 20
  4. 4. Molécula de ácido nucleico recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, operativamente enlazada al menos a una secuencia de control de expresión.
  5. 5. Célula huésped recombinante modificada con la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1. 25
  6. 6. Método para la producción de la proteína según la reivindicación 2 parte (a), que comprende el cultivo de una célula que ha sido modificada con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína, y expresión de la proteína con la célula modificada, opcionalmente recuperando la proteína de la célula o de un cultivo que comprende la célula. 30
  7. 7. Microorganismo genéticamente modificado que comprende componentes adecuados para la degradación de un material lignocelulósico en azúcares fermentables, donde el organismo ha sido genéticamente modificado para expresar al menos una proteína según la reivindicación 2 parte (a).
    35
  8. 8. Microorganismo genéticamente modificado según la reivindicación 7, donde el organismo ha sido genéticamente modificado para expresar al menos una enzima adicional; donde la enzima adicional es una enzima accesoria seleccionada del grupo consistente en: celulasa, xilanasa, ligninasa, glucuronidasa, arabinofuranosidasa, arabinogalactanasa, esterasa de ácido ferúlico, lipasa, pectinasa, glucomanasa, amilasa, laminarinasa, xiloglucanasa, galactanasa, glucoamilasa, pectato liasa, quitinasa, exo- β-D-glucosaminidasa, celobiosa 40 deshidrogenasa, y acetilxilano esterasa.
  9. 9. Composición según la reivindicación 3, que comprende además al menos una enzima adicional para la degradación de un material lignocelulósico o un fragmento de dicha enzima que retiene actividad biológica; a) donde la composición de multienzima comprende al menos una celobiohidrolasa, al menos una xilanasa, al menos una 45 endoglucanasa, al menos una β-glucosidasa, al menos una β-xilosidasa, y al menos una enzima accesoria; b) donde entre aproximadamente 50% y aproximadamente 70% de las enzimas en la composición son celobiohidrolasas; c) donde entre aproximadamente 10% y aproximadamente 30% de las enzimas en la composición son xilanasas; d) donde entre aproximadamente 5% y aproximadamente 15% de las enzimas en la composición son endoglucanasas; e) donde entre aproximadamente 1% y aproximadamente 5% de las enzimas en la composición son β-glucosidasas; 50 f) donde entre aproximadamente 1% y aproximadamente 3% de las enzimas en la composición son β-xilosidasas; o g) donde la composición comprende aproximadamente 60% de celobiohidrolasas, aproximadamente 20% de xilanasas, aproximadamente 10% de endoglucanasas, aproximadamente 3% de β-glucosidasas, aproximadamente 2% de β-xilosidasas, y aproximadamente 5% de enzimas accesorias.
    55
  10. 10. Composición de multienzima según la reivindicación 9, donde la composición comprende a) al menos una primera proteína que incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en SEC ID Nº:2, SEC ID Nº:5, SEC ID Nº:8 y SEC ID Nº:11 y tiene actividad de celobiohidrolasa, o un fragmento de la misma que tiene actividad de celobiohidrolasa; b) al menos una segunda proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a una secuencia de 60 aminoácidos seleccionada del grupo consistente en: SEC ID Nº:14, SEC ID Nº:94, SEC ID Nº:17, SEC ID Nº:20 y SEC ID Nº:23 y tiene actividad de endoglucanasa, o un fragmento de la misma que tiene actividad de endoglucanasa; c) al menos una tercera proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en: SEC ID Nº:26, SEC ID Nº:29, SEC ID Nº:32, SEC ID Nº:35, SEC ID Nº:38 y SEC ID Nº:41 y tiene actividad de xilanasa, o un fragmento de 65 la misma que tiene actividad de xilanasa; d) al menos una cuarta proteína que comprende una secuencia de
    aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a SEC ID Nº:44 y tiene actividad de β-glucosidasa, o un fragmento de la misma que tiene actividad de β-glucosidasa; y e) al menos una quinta proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en: SEC ID Nº:47, SEC ID Nº:50, SEC ID Nº:53, SEC ID Nº:56, SEC ID Nº:59, SEC ID Nº:62, SEC ID Nº:65, SEC ID Nº:68, SEC ID Nº:71, SEC ID Nº:74, SEC ID Nº:77, SEC ID Nº:80, SEC ID Nº:83, SEC ID Nº:86, SEC ID Nº:89, y 5 SEC ID Nº:92, y tiene actividad de hemicelulasa o quitinasa, o un fragmento de la misma que tiene actividad de hemicelulasa o quitinasa.
  11. 11. Composición de multienzima de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, que comprende además una o varias enzimas accesorias; donde las enzimas accesorias incluyen al menos una enzima seleccionada del grupo 10 consistente en: celulasa, xilanasa, ligninasa, glucuronidasa, arabinofuranosidasa, arabinogalactanasa, esterasa de ácido furílico, lipasa, pectinasa, glucomanasa, amilasa, laminarinasa, xiloglucanasa, galactanasa, glucoamilasa, pectato liasa, quitinasa, exo- β-D-glucosaminidasa, celobiosa deshidrogenasa, y acetilxilano esterasa.
  12. 12. Método para la degradación de un material lignocelulósico en azúcares fermentables, que comprende poner en 15 contacto el material lignocelulósico con al menos una proteína aislada según la reivindicación 2 parte (a) o al menos una composición de multienzima de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.
  13. 13. Método para la producción de una sustancia orgánica, que comprende:
    a) sacarificar un material lignocelulósico con una composición de multienzima de cualquiera de las 20 reivindicaciones 9 a 11;
    b) fermentar el material lignocelulósico sacarificado obtenido con uno o varios microorganismos fermentadores; y
    c) recuperar la sustancia orgánica de la fermentación.
    25
  14. 14. Método para la degradación de un material lignocelulósico consistente en granos secos de destilador o granos secos de destilador con solubles para azúcares, el método comprendiendo poner en contacto los granos secos de destilador o granos secos de destilador con solubles con una composición de multienzima, donde al menos 10% de los azúcares fermentables son liberados, y donde la composición de multienzima es la composición de multienzima de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11. 30
  15. 15. Método de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, que comprende además la recuperación del material lignocelulósico puesto en contacto después de que los azúcares fermentables sean degradados.
  16. 16. Método del papel o pulpa de desentintado o bioblanqueo, que comprende poner en contacto el papel o pulpa con 35 al menos una proteína aislada según la reivindicación 2 parte (a) o con al menos una composición de multienzima de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.
  17. 17. Método para tratar un tejido, donde el tratamiento es seleccionado del grupo consistente en lavado a la piedra de un tejido; aumento de la suavidad o tacto de un tejido o defrisado de un tejido; restauración de color o brillo de un 40 tejido; biopulido, desfibrilación, blanqueo, tintura o desencolado de un tejido; donde el método comprende poner en contacto el tejido con al menos una proteína aislada de reivindicación 2 parte (a) o al menos una composición de multienzima de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.
  18. 18. Composición de detergente, que comprende al menos una proteína aislada según la reivindicación 2 parte (a) o 45 al menos una composición de multienzima de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que opcionalmente comprende un tensioactivo.
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