TWI433934B - 新型β－葡萄糖苷酶及其用途 - Google Patents

Description

新型β-葡萄糖苷酶及其用途

本發明係關於一種新穎之β-葡萄糖苷酶以及編碼該β-葡萄糖苷酶之核酸。

替代性能源之發展(如，太陽能、生質燃料、水力、風力等)，多年來一直受到大力提倡，以解決因大量消耗化石燃料而產生之日漸嚴重的能源問題。在諸多可能之能源中，植物生質是特別受到關注的，因其為可再生性。植物體含有高量之纖維素，其為製造生質燃料的一種起始材料。為將纖維素轉化為生質燃料，其首先須由微生物之纖維素水解系統降解為可醱酵糖，諸如纖維二糖及葡萄糖。此種系統包括三種主要類型之水解酶，亦即，内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(EC 3.2.1.91)、及β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)。儘管已由各種微生物中分離出諸多葡萄糖苷酶，其效能皆不令人滿意。因此，仍需要具有高效能之葡萄糖苷酶。

本發明係關於一種新穎之葡萄糖苷酶，BGL-Cr -D2，其係分離自臺灣原生種之真菌刺孢殼葉斑菌(Chaetomella raphigera )。圖2所示為該成熟BGL-Cr -D2蛋白之序列(722個胺基酸殘基/SEQ ID NO: 1)、對應之bgl-Cr -D2 cDNA(2166 bps/SEQ ID NO: 2)、其信號肽序列(SEQ ID NO: 7)、對應之cDNA(SEQ ID NO: 8)、BGL-Cr -D2蛋白與其信號肽(SEQ ID NO: 4)、以及對應之cDNA(SEQ ID NO: 5)。圖1所示為刺孢殼葉斑菌中編碼該BGL-Cr -D2酶之基因組DNA區域(2851 bps,SEQ ID NO: 3)，其含有12個內含子節段，而該基因組DNA區域對應SEQ ID NO: 4(SEQ ID NO: 6)。

因此，本發明之一態樣係一種分離之多肽，其含有與SEQ ID NO:1具有由BLAST算法所測定之至少70%(如，80%、90%、95%、或99%)胺基酸相同性之序列。在一實例中，該多肽具有β-葡萄糖苷酶活性。

本發明亦涵括(i)一種分離之核酸，其包括編碼上述多肽之核苷酸序列，以及(ii)一種宿主細胞，其含有該種分離之核酸。在一實例中，該核苷酸序列含有SEQ ID NO: 2、3、5、或6之序列。本發明之分離核酸可為表現載體，其中該核苷酸序列以可操作之方式連結適當之啟動子序列(亦即，可在宿主細胞中起始轉錄之序列)。

名辭「分離之多肽」或「分離之核酸」在本文中係指一多肽或核酸，其實質上不含天然相連結之分子，亦即，該等天然相連結分子構成含有該多肽或核酸之製備物之最多20%乾重。純度可以任何適當之方法測量，如，管柱層析、聚丙烯醯胺凝膠電泳、及HPLC。

本發明之範圍中亦包括(A)一種組合物，其含有上述之多肽、外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、及β-葡萄糖苷酶，以及(B)一種由木質纖維素物質製備可醱酵糖之方法。該方法包括(i)提供上述之組合物，以及(ii)使此組合物與木質纖維素物質接觸以製備可醱酵糖，如，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、或纖維二糖。該可醱酵糖可藉由微生物醱酵或酶之處理而轉化成為醱酵產物，諸如，醇。用於此方法中之木質纖維素物質的實例包括，但不限於，果園剪枝、樹叢、工廠廢材、城市廢木料、城市廢棄物、伐木廢棄物、森林疏伐、短輪伐期木質作物、工業廢棄物、小麥、麥桿、燕麥桿、稻草、大麥桿、裸麥桿、亞麻莖、黃豆殼、稻殼、燕麥殼、甘蔗、玉米、玉米穗軸、玉米桿、玉米麩飼料、玉米芯、玉米皮、玉米粒、取自核仁之纖維、草原之草、鸭茅狀磨擦禾、狐尾草、甜菜渣、柑橘類水果渣、種殼、纖維素質動物糞便、草坪修剪物、棉花、海草、樹木、灌木、草、甘蔗渣、穀物之濕或乾磨的產物及副產物、城市固體廢棄物、廢紙、庭院廢棄物、草本材料、農業廢棄物、林業廢棄物、城市固體廢棄物、廢紙、紙漿、造紙廠廢材、枝條、灌木、甘蔗、玉米、玉米皮、能源作物、森林、水果、花、穀粒、草、草本作物、葉、樹皮、針狀葉、圓木材、根、樹苗、灌木、柳枝稷、樹木、蔬菜、果皮、藤蔓、甜菜渣、小麥粉頭、燕麥殼、硬及軟木、由農業流程產生之有機廢棄物質、林業廢木，或其組合。如該醱酵產物係可燃性者，該方法進一步包含燃燒該可燃性醱酵產物以產生能量的步驟。

本發明亦提供一種生物反應器，其含有木質纖維素物質以及一種組合物，該組合物含有上述之多肽、外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、及/或β-葡萄糖苷酶。

本發明一或多個具體實例之細節述於附呈之圖示及下文之敘述。本發明之其他特徵、標的、及優點將可由該敘述及圖示以及申請專利範圍明示。

本發明係(至少部份)根據一種新穎β-葡萄糖苷酶及其高酶活性或效能的非預期性發現。β-葡萄糖苷酶(或β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶，BGL)是用於進行木質纖維素糖化作用之一組關鍵酶。此種類型之酶可在内切葡聚糖酶(EG)(主要降解纖維素纖維之非結晶部份)及外切葡聚糖酶(或纖維二糖水解酶，CBH)(主要降解結晶纖維素)之作用後，由纖維素水解基質(諸如，纖維二糖、纖維素寡醣、及其他葡萄糖苷)中釋放D-葡萄糖單元。就由木質纖維素之工業規模生質燃料生產而言，發現具有高活性及生產力之低成本纖維素酶(亦即，CBH、EG、及BGL)是極為重要的。

本發明揭示下列新穎發現：具β-葡萄糖苷酶活性之多肽、編碼該多肽之聚核苷酸、以及自酵母菌表現之重組β-葡萄糖苷酶的β-葡萄糖苷酶專一性活性增進。明確言之，茲發現一種臺灣原生種之真菌，亦即，刺孢殼葉斑菌D2菌種，可分泌活性β-1,4-葡萄糖苷酶(BGL-Cr -D2)。編碼此酶之基因(bgl-Cr -D2，大小=2166 bps)已由逆轉錄之cDNA中選殖出來，並已經使用巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris )SMD1168菌株作為宿主而成功在酵母菌中表現。由畢赤酵母分泌之重組酶BGL-Cr -D2-Pp 具有高於原酶(約3X)及基準Novozyme-188(約17X)之較高β-葡萄糖苷酶活性(根據pNPG酶活性測量)。本發明提供一種新穎之重組β-葡萄糖苷酶，其具有與其他纖維素酶共同利用以進行纖維素糖化作用之潛力。

1.　來自木質纖維素之生質燃料

再生性能源之發展(如，太陽能、生質燃料、水力、風力等)，多年來一直受到大力提倡，以解決因大量消耗化石燃料而產生之日漸嚴重的能源問題。在目前所開發之能量形式/來源中，生質燃料具有可一方面減少農業/都市/工業之有機廢棄物，同時產生潔淨與富含能量之燃料(如，甲醇、乙醇、丁醇、及氫)的獨特優點。因此，其已被列為重要永續能源之一(Antoni et al.,2007,Appl Microbiol Biotechnol 77:23-35；及Rubin,2008,Natures 454:841-845)。不只在臺灣，全世界都都亟需由木質纖維素生產生物乙醇，因為每年地球上都要產生約5×10¹² 噸富含纖維素之農業廢棄物，而在諸多國家中，其皆已經或將會在汽油中添加乙醇。在進一步之醱酵進行乙醇生產之前，茲需要各種不同之酶系統(如，木質酶、纖維素酶、及半纖維素酶)以完全分解木質纖維素(含有約5-30%之木質素、約35-50%之纖維素、及約20-35%之半纖維素)而釋放可醱酵之葡萄糖(Lynd et al.,2002,Microbiol Mol Biol Rev 66:506-577)。

2.　纖維素酶

就由纖維素所進行之生物乙醇生產而言，纖維素酶之有效糖化作用(降解多聚性之纖維素纖維以釋放較小之葡萄糖分子)是極為關鍵的。纖維素酶是一群負責進行複雜纖維素水解作用之酶。根據該等酶之結構及功能特徵，多種之纖維素酶已被分類成為三組，亦即，(i)外切葡聚糖酶(包括1,4-β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶，CBH，EC 3.2.1.91、及1,4-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.74)，(ii)内切葡聚糖酶(EG)(EC 3.2.1.4)，及(iii)β-葡萄糖苷酶(或β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶，BGL)(EC 3.2.1.21)(Coughlan et al.,1988,於Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation,pp.11-30；及Henrissat et al.,1989,Gene 81:83-95)。CBH主要係作用在位於纖維素纖維之還原或非還原端的結晶部份，而EG則係隨機攻擊纖維素之非結晶部份。更特定言之，此等纖維素酶可切割纖維素中葡糖基間之β-1,4-葡聚糖或β-D-葡萄糖苷連結，以形成短鏈基質，其包括纖維二糖(亦即，雙醣)、其他纖維糊精(亦即，纖維素寡醣)、及葡萄糖苷(如，醇苷、氰苷、或酚苷)。此等短鏈中間化合物可由BGL進一步水解為葡萄糖(亦即，單醣)，該酶主要係催化氧親核基間之糖基轉移(Bhatia et al.,2002,Crit Rev Biotechnol 22(4):375-407)。就纖維素糖化作用而言，不足之BGL活性不僅會造成葡萄糖之缺乏，亦會造成纖維二糖之累積，而纖維二糖係CBH及EG之纖維素水解作用的強抑制劑(Harris et al.,2007,US Patent 7,244,605B2)。因此，BGL在由纖維素達成高乙醇產率上扮演著重要角色(Lynd et al.,2002,Microbiol Mol Biol Rev 66:506-577；及Hong et al.,2007,Appl Microbiol Biotechnol 73:1331-1339)。

3. β-葡萄糖苷酶(BGLs)之來源

酶BGL是遍在性者，且已在所有生物界中獲得發現，從微生物、昆蟲、及植物，到高度演化之哺乳動物(Esen,1993,於Biochemistry and Molecular Biology,American Chemical Society,1-14;Bhatia et al.,2002,Crit Rev Biotechnol 22(4):375-407)。其中一種主要之BGL產源係來自於細菌，包括農桿菌屬(Agrobacterium )、桿菌屬(Bacillus )、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio )、纖維弧菌屬(Cellovibrio )、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium )、伊文氏桿菌屬(Erwinia )、假單胞菌屬(Pseudomonas )、熾熱球菌屬(Pyrococcus )、瘤胃球菌屬(Ruminococcus )、鏈黴菌屬(Streptomyces )、熱袍菌屬(Thermotoga )、嗜熱放線菌屬(Thermobifida )等中之某些菌株(Hashimoto et al.,1998,Arch Biochem Biophys 360:1-9；Srivastava et al.,1999,Biotechnol Lett 21:293-297；及Yun et al.,2001,Biosci Biotechnol Biochem 65(9):2028-2032)。具有BGL生產能力之真菌菌株(黴菌或酵母菌)包括取自麴菌屬(Aspergillus )、念珠菌屬(Candida )、腐殖菌屬(Humicola )、青黴屬(Penicillium )、畢赤酵母屬(Pichia )、覆膜酵母屬(Saccharomycopsis )、踝節菌屬(Talaromyces )、木黴菌屬(Trichoderma )等(Dan et al.,2000,J Biol Chem 275(7):4973-4980；及Dunn-Coleman et al.,2008,美國專利公開案2008/0095889A1)。在此等微生物中，真菌種黑麴菌(Aspergillus niger )、薰煙麴菌(Aspergillus fumigates )、及瑞氏木黴(Trichoderma reesei )是最為熟之且有效之BGL生產者，因而使其成為世界上商用BGL的主要來源(Dan et al.,2000,J Biol Chem 275(7):4973-4980；Harris et al.,2007,美國專利第7,244,605B2號；及Dunn-Coleman et al.,2008,美國專利公開案2008/0095889A1)。此外，已發現少數之植物亦含有BGL，如，大麥、閉鞘薑、及玉米。

除上述之天然來源之外，有些重組BGLs已在不同的宿主中表現(如，大腸桿菌(E. coli )、枯草桿菌(B. subtilis )、巴斯德畢赤酵母(P. pastoris )、釀酒酵母(S. cerevisiae )、白曲黴菌(A. kawachii )、及瑞氏木黴(T. reesei ))(Pandey et al.,1995,J Ferment Bioeng 80(5):446-453；Murray et al.,2004,Protein Expres Purif 38:248-257；及Roy et al.,2005,Biochem Bioph Res Co 336:299-308)。舉例而言，取自桿菌種之bgl 基因已被成功選值並在大腸桿菌系統表現(Hashimoto et al.,1998,Arch Biochem Biophys 360:1-9；及Srivastava et al.,1999,Biotechnol Lett 21:293-297)。此外，黑麴菌之BGL編碼基因bgl 1已在巴斯德畢赤酵母及釀酒酵母中表現(Dan et al.,2000,J Biol Chem 275(7):4973-4980)。由各種不同之來源選殖BGL基因，接著再在不同之宿主中表現，此已為取得較高BGL生產力(過表現)及/或活性(較佳之轉譯後修飾改良該等酶之動力特徵)之實務方法。

4. BGLs之特性

到目前為止，BGLs之特性相當分歧。一般而言，取自不同目及界之BGLs，對於連結糖基之糖苷配基部分(芳基-、烷基-、或胺基-)，似乎具有不同之特異性(Bhatia et al.,2002,Crit Rev Biotechnol 22(4):375-407)。茲已發現其為胞內、胞外、連結細胞溶質、連結膜、或位於細胞周質。其對於水解短鏈纖維二糖或寡醣之催化功能在纖維素微生物之間相當類似，但在不同之生物中則已發現部分其他不同之功能(如，在部分微生物中可合成不同分子間之糖基鍵，在昆蟲及植物中可由氰苷前體化合物釋出氰化物，以及在人體中可水解糖基神經醯胺以治療高雪氏症(Gaucher’s disease))(Bhatia et al.,2002,Crit Rev Biotechnol 22(4):375-407)。就纖維素之水解作用而言，BGLs可以保留淨異頭構形之方式水解其受質，該作用推測係經由兩步驟、雙替代之機制進行，其涉及關鍵活性位點之兩個羧酸殘基(Davies et al.,1998,Comprehensive Biological Catalysis Vol. 1,pp. 119-208;and Withers,2001,Carbohyd Polym 44:325-337)。咸已記錄，BGLs具有不同之受質專一性，且可作用於廣泛之受質(如，p NPG、纖維二糖、水楊素、MUG、熊果素、芳基-、烷基-、及甲基-葡糖苷)。此外，大部分之BGLs具有在弱酸範圍中之最適pH，並具有嗜中溫範圍之最適溫度，但亦曾報告有部分之強酸及/或嗜熱特性。取自不同生物來源之BGL單體具有極為廣泛之分子大小範圍(亦即，約13-137 kDa)(Gabelsberger et al.,1993,Appl Microbiol Biotechnol 40:44-52；Iwashita et al.,1999,Appl Environ Microbiol 65:5546-5553；Srivastava et al.,1999,Biotechnol Lett 21:293-297；及Dan et al.,2000,J Biol Chem 275(7):4973-4980)。不同生物種BGLs間之胺基酸序列相似性亦廣泛各異(10s-90s%)。然而，茲已辨識出天冬胺酸(Asp,D)及麩胺酸(Glu,E)為BGLs之催化性親核基團及催化性質子供體。

5. BGLs之分類

根據其所催化之化學反應，根據IUBMB(國際生物化學暨分子生物學聯合會(International Union of Biochemistry and Molecular Biology))所公佈用於3,000種以上之酶的數字分類規則，所有之BGLs已被指定為EC 3.2.1.21類別(亦即，3-水解酶、2-糖基酶、1-糖苷酶、及21-葡萄糖苷酶)(Webb,1992,Enzyme nomenclature: recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes[酶命名法：國際生物化學暨分子生物學聯合會命名委員會對於酶命名及分類之建議],ISBN 0-12-227164-5；以及ExPASy,2009,www.expasy.org/enzyme/ )。另外，BGLs係多功能之水解酶，其已根據各種標準而進一步分類(如，受質專一性及序列相同性)。早先，BGLs被歸類成為第I型及第II型(Beguin et al.,1990,Ann Rev Microbiol 44:219-248)或是亞型A及B(Rojas et al.,1995,Biochem Mol Biol Int 35:1223-1231)；但近來此等較早期之分類大部分已被根據胺基酸及/或核苷酸序列相同性之現今所接受的標準取代(Henrissat et al.,1996,Biochem J 316:695-696)。

根據胺基酸序列及摺疊相似性，BGLs已被歸至115種至今(2009年11月)所定義之GH(糖苷水解酶)家族中的家族1或3中，除外糖基神經醯胺酶(亦即，歸於家族30之酸性β-葡萄糖苷酶)(Henrissat,1991,Biochem J 280:309-316；Henrissat et al.,1993,Biochem J 293:781-788；Henrissat et al.,1996,Biochem J 316:695-696；Hong et al.,2007,Appl Microbiol Biotechnol 73:1331-1339；及Cantarel et al.,2009,Nucleic Acids Res. 37:D233-238)。家族1(GH1)含有取自部分古細菌、細菌、真菌、植物、及哺乳動物之β-葡萄糖苷酶，而家族3(GH3)則包含部份細菌、真菌、及植物來源之β-葡萄糖苷酶(Henrissat et al.,1996,Biochem J 316:695-696；及Cantarel et al.,2009,Nucleic Acids Res. 37:D233-238)。

6.　應用

除了用於進行纖維素乙醇生產之纖維二糖/纖維糊精水解功能之外，BGLs亦可廣泛用於醫藥、農業、及食品業之領域中，其中需要諸多涉及糖苷鍵之切割或合成的反應。根據BGLs之水解活性的應用包括(1)除去柑橘類果汁之苦澀感，(2)製造低黏度結冷膠食品，(3)解毒木薯(熱帶地區第三到第四大之卡洛里來源)，(4)增強香氣釋放以助益製酒流程，(5)做為飼料添加物以增進單胃動物之營養利用，(6)將染料木苷水解為染料木黄酮以作為抗癌劑，(7)由根皮苷產生黑色素以降低皮膚癌之風險並促進毛髮深色，(8)由橄欖苦苷產生羥基酪醇以預防冠狀動脈心臟病及癌症，(9)水解昆布多醣以生產酵母萃取物並將海藻生質轉化成為可醱酵糖，(10)製造色素作為糕點糖果產品中之天然食物染劑等等(Bhatia et al.,2002,Crit Rev Biotechnol 22(4):375-407)。

此外，合成性之BGLs活性已被廣泛用於製造藥物、精細化學品、及食品成份(如由Bhatia et al.,2002,Crit Rev Biotechnol 22(4):375-407所摘述)。例如，合成性之芳族n-烷基葡萄糖苷酯可有效用於治療發燒、風溼、頭痛、及其他疾病(Otto et al.,1998,Biotechnol Lett 20:437-440)。亦已有其他BGLs應用之報告，諸如，組織漿菌症之血清診斷，或是肝缺血再灌流損傷及復原之後診斷。因此，由各異之來源製備高品質/大量之BGLs就此等多用途之應用而言一直都是基本任務。

本文所述係一種分離之多肽，其包括與BGL-Cr -D2(SEQ ID NO:1)或其具有至少20個(如，30、50、80、100、150、200、250、300、及350個)毗連胺基酸之部份具有至少70%相同性的胺基酸序列。

兩胺基酸序列之「相同性百分比」係使用Karlin and AltschulProc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68,1990之算法，如Karlin and AltschulProc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77,1993中所修飾者進行判定。此種算法已納入Altschul,et al. J. Mol. Biol. 215:403-10,1990之NBLAST及XBLAST程式(2.0版)中。BLAST蛋白檢索可以XBLAST程式、分值(score)=50、字長(wordlength)=3進行，以取得與本發明蛋白分子同源之胺基酸序列。在兩序列間存在間隙時，可如Altschulet al.,Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402,1997所述使用Gapped BLAST。在使用BLAST及Gapped BLAST程式時，可使用各程式之系統預設參數(如，XBLAST及NBLAST)。

該分離之多肽可由適當微生物(如，刺孢殼葉斑菌)純化而製備。其亦可經由習知之重組技術製備。其中一種實例如下。自刺孢殼葉斑菌細胞以聚合酶連鎖反應製備編碼BGL-Cr-D2之DNA片段，再將其選殖至表現載體中。在插入時，該編碼BGL-Cr-D2之片段係以可操作之方式與該表現載體中所含之適當啟動子連結。接著將所得知DNA建構物引入適當之宿主細胞中(如，大腸桿菌細胞、酵母菌細胞、昆蟲細胞、及哺乳動物細胞)以進行BGL-Cr-D2之表現，其再可以習知之方法由該等細胞中純化。酵母菌細胞之實例之一為巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris )，如，巴斯德畢赤酵母SMD1168菌株。

為製備BGL-Cr-D2之功能對等物，其亦包括在本發明之範圍之中，可在不破壞其β-葡萄糖苷酶活性之情形下，將一或多個保守性之胺基酸取代引入SEQ ID NO:1中。「保守性之胺基酸取代」是其中胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換者。具有類似側鏈之胺基酸殘基家族已在技藝中獲得定義。此等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈者(如，天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電荷之極性側鏈者(如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺、絲胺酸、羥丁胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、具有非極性側鏈者(如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、具有支鏈性側鏈者(如，羥丁胺酸、纈胺酸、異白胺酸)、以及具有芳族側鏈者(如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，較佳可以取自相同側鏈家族之另一胺基酸殘基取代SEQ ID NO: 1中預期為非必需之胺基酸殘基。或者，可在SEQ ID NO: 1之全部或部份隨機引入突變，諸如，藉由飽和誘變，再篩選所得突變體之β-葡萄糖苷酶活性，以辨識保留該活性之突變體，如下文實例一節所述。

可應用融合蛋白技術以改良本發明多肽之表現效率並協助其純化。為製備含有BGL-Cr-D2之融合蛋白，可使編碼此種β-葡萄糖苷酶之DNA片段與編碼融合配對物(如，穀胱甘肽-s-轉移酶(GST)、6x-His抗原表位標記、或M13基因3蛋白)之另一DNA片段連結。在適當之宿主細胞內，將所得之融合核酸表現為融合蛋白，其可再以技藝中已知之方法分離。該分離之融合蛋白可在進一步由，如，酶切消化作用處理，以除去該融合配對物，並取得本發明之重組多肽。

本文亦述及一種分離之核酸，其編碼本發明之多肽。核酸係指DNA分子(如，cDNA或基因組DNA)、RNA分子、或DNA/RNA類似物，其可由核苷酸類似物合成。在一實例中，本發明之核酸係一表現載體，其中編碼該多肽之DNA片段以可操作之方式連結適當之啟動子。

在本文中，名辭「啟動子」係指一種核苷酸序列，其含有可在所欲之宿主微生物中起始轉錄與其以可操作方式連結之核酸序列的元件。最低限度，啟動子含有RNA聚合酶結合位點。其可進一步含有一或多個增強子元件，其就定義而言可增強轉錄，或是一或多個調控元件，其可控制該啟動子之開/關狀態。當使用大腸桿菌作為宿主微生物時，代表性之大腸桿菌啟動子包括，但不限於，β-內醯胺酶及乳糖啟動子系統(參見Chang et al.,Nature 275:615-624,1978)，SP6、T3、T5、及T7 RNA聚合酶啟動子(Studier et al.,Meth .Enzymo1 . 185:60-89,1990)，λ啟動子(Elvin et al.,Gene 87:123-126,1990)，trp啟動子(Nichols and Yanofsky,Meth .in Enzymology 101:155-164,1983)，以及Tac及Trc啟動子(Russell et al.,Gene 20:231-243,1982)。在使用酵母菌作為宿主微生物時，例示性之酵母菌啟動子包括3-磷酸甘油酸激酶啟動子，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動子，半乳糖激酶(GAL1)啟動子，半乳糖表異構酶啟動子，以及醇脫氫酶(ADH)啟動子。適合用於在其他類型之細胞中驅動基因表現之啟動子亦為技藝中所熟知。

載體係指一種核酸分子，其可載運其所連結之另一核酸。載體可獨立複製或是納入宿主DNA中。載體之實例包括質體、黏接質體(cosmid)、或病毒載體。本發明之質體包括編碼BGL-Cr-D2之核苷酸序列，其形式為適合在宿主細胞中表現該核酸者。較佳者，該載體包括一或多個調控序列，以可操作之方式連結該編碼序列。「調控序列」包括啟動子、增強子、以及其他表現控制元件(如，聚腺苷酸化信號)。調控序列包括該等可指引核苷酸序列之持續性全身表現者，以及組織專一性之調控及/或誘發序列。表現載體之設計可取決於諸等因子，如，欲轉形宿主細胞之選擇、所欲之蛋白表現量、及其類似者。可將該表現載體引入宿主細胞以製備本發明之多肽。

本發明之範圍亦包括一種宿主細胞，其含有上述之核酸。實例包括大腸桿菌細胞、昆蟲細胞(如，使用桿狀病毒表現載體)、酵母菌細胞、植物細胞、或哺乳動物細胞。參見，如，Goeddel,(1990)Gene Expression Technology : Methods in Enzymology 185[基因表現技術：酶學方法185],Academic Press,San Diego,CA。為製備本發明之多肽，可在容許本發明核酸所編碼之多肽表現的條件下，於培養基中培養宿主細胞，再由該經培養之細胞或該細胞之培養基中純化該多肽。或者，可在試管中轉錄及轉譯本發明之核酸，例如，使用T7啟動子調控序列及T7聚合酶。

本文尚述及一種方法，使用含有本文所述之β-葡萄糖苷酶及其他纖維素水解酶(諸如，外切葡聚糖酶及内切葡聚糖酶)之多酶組合物，將木質纖維素物質轉化成為可醱酵產物(如，可醱酵糖)。參見，如，美國專利申請案第20070238155及20070250961號。名辭「纖維素水解酶」係指可將纖維素(一種由葡萄糖單元構成之多醣)水解成為較小糖類單元之酶。參見Gilbert H J,Hazlewood G P,1993J Gen Microbiol 139:187-194；Olimiya K et al. 1997Biotechnol Genet Eng Rev. 14:365-414。亦參見美國專利申請案第2007016805號。此種多酶組合物可取自，微生物、植物、或其組合，且其含有可降解木質纖維素物質之酶。除上述之纖維素水解酶外，其可進一步包括纖維二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶)、半纖維素酶(諸如，木聚糖酶，包括，內切木聚糖酶、外切木聚糖酶、及β-木糖苷酶)、木質素酶、澱粉酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖苷酸酶、阿拉伯糖酶、葡糖苷酸酶、蛋白酶、酯酶(包括阿魏酸酯酶及乙醯基木聚糖酯酶)、脂肪酶、葡甘聚糖酶、或木葡聚糖酶。

在本文中，名辭「木質纖維素物質」係指含有纖維素及/或半纖維素之物質。一般而言，此等物質亦含有木聚糖、木質素、蛋白質、及碳水化合物，諸如，澱粉及糖類。木質纖維素可見於，例如，植物之莖、葉、殼、皮、及穗軸，或是樹木之葉、枝、及木材。將複雜碳水化合物(諸如，澱粉、纖維素、或半纖維素)轉化為可醱酵糖之過程在本文中稱為「糖化作用」。可醱酵糖在本文中係指簡單糖類，諸如，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、或纖維二糖。木質纖維素材料可包括原始植物生質及/或非原始植物生質，諸如，農業生質、商業有機物、營造及拆除廢棄物、城市固體廢棄物、廢紙、及庭院廢棄物。木質纖維素物質之常見形式包括樹木、灌木及草、小麥、麥桿、甘蔗渣、玉米、玉米皮、玉米粒(包括取自玉米粒之纖維)、穀物(諸如，玉米、稻米、小麥、及大麥)碾磨之產品及副產品(包括濕磨及乾磨)、以及城市固體廢棄物、廢紙、及庭院廢棄物。木質纖維素物質亦可為，但不限於，草本材料、農業廢棄物、林業廢棄物、及造紙廠廢材。「農業生質」包括枝條、灌木、甘蔗、玉米及玉米皮、能源作物、森林、水果、花、穀粒、草、草本作物、葉、樹皮、針狀葉、圓木材、根、樹苗、短輪伐期木質作物、灌木、柳枝稷、樹木、蔬菜、果皮、藤蔓、甜菜渣、小麥粉頭、燕麥殼、硬及軟木(不包括具有害物質之木材)、由農業流程產生之有機廢棄物質(包括農耕及林業活動，特別包括林業廢木)，或其混合物。

在上述方法中所製備之可醱酵糖可經由酶處理或化學反應而轉化成為具附加價值的有用醱酵產物。該醱酵產物之實例包括，但不限於，胺基酸、維生素、藥物、動物飼料添加劑、特殊化學品、化學原料、塑膠、溶劑、燃料、或其他有機聚合物、乳酸、及乙醇，包括燃料乙醇。可由本發明方法製備之特定具附加價值的醱酵產物包括，但不限於，生質燃料(包括乙醇及丁醇)；乳酸；塑膠；特殊化學品；有機酸，包括檸檬酸、琥珀酸、及馬來酸；溶劑；動物飼料添加物；藥物；維生素；胺基酸，諸如，離胺酸、甲硫胺酸、色胺酸、羥丁胺酸、及天冬胺酸；化學原料。可醱酵糖亦可用於培養微生物，其可產製醱酵產物，如，工業用酶，諸如，蛋白酶、纖維酶、澱粉酶、葡聚糖酶、乳酸酶、脂肪酶、裂解酶、氧化還原酶、轉移酶、及木聚糖酶。

本發明亦提供一種由木質纖維素物質產生能量之方法。本方法包括提供上述之多酶組合物；使該組合物與木質纖維素物質接觸，以產生可醱酵產物；醱酵該可醱酵產物，以產生可燃性醱酵產物，再燃燒該可燃性醱酵產物以產生能量的以產生能量。本方法可在生物反應器中進行，該生物反應器含有所有必須之組成份，且較佳可受配置以進行微生物之厭氧生長。製造及使用生物反應器之方法為技藝中已知。參見，如，美國專利申請案第20080131958號。

上述之多肽及組合物亦可用於紙業及木漿業。舉例而言，該多肽，其具有β-葡萄糖苷酶活性，可用於回收紙之脫墨及精製。在此應用中，其之使用可大量降低每噸紙所需用之酶量，並降低欲增加該紙亮度所需之與該酶接觸的時間。在精製過程中降低酶濃度及與酶之接觸時間可相應且如所欲般降低纖維素酶對於纖維本身之反應時間以及處理成本。

本發明之多肽具有其他之工業應用。由於其具有高β-葡萄糖苷酶活性，此種多肽可以較低之量作用。該多肽，結合其他之酶，可用於以較高產率而由水果萃取果汁，或是由植物萃取果汁或湯品之調味料。在結合蛋白酶之情形下，其可用於分解乾燥之海草，其接著可以醇進行醱酵而產生醋。該多肽，混合其他之酶，亦可在烘焙業中作為麵團調整劑。參見，如，美國專利第6602700號。

同時，本發明之多肽亦可用於紡織業。其可藉著除去會造成布料外觀暗沈之表面微纖維而用於增亮及軟化棉布。更特定言之，其可用於在製造具有「石洗」效果之牛仔褲時取代浮石。相較於長時間接觸浮石，酶處理可對牛仔布料造成較少之損害。參見美國專利第5232851、5677151、6451063、及7226773號。

在另一態樣，本發明提供一種轉基因植物，其基因組經由以可操作方式連結啟動子序列之編碼本發明多肽的重組聚核苷酸增強。該聚核苷酸經優化處理以在植物中表現，且該多肽係以大於5%總可溶性蛋白、大於10%總可溶性蛋白、或大於20%總可溶性蛋白之量製備。該多肽可以持續性全身方式或組織專一方式表現。舉例而言，其可在選自由莖及葉所構成之群的植物組織中表現。其亦可在靶向之亞細胞區室或胞器中表現，諸如，質外體、葉綠體、細胞壁、或液泡。該植物可為單子葉植物或雙子葉植物。在部份具體實例中，該植物係作物植物。該植物可選自由玉米、柳枝稷、高粱、芒草、甘蔗、白楊、松樹、小麥、稻米、大豆、棉花、大麥、草坪草、煙草、竹、油菜、甜菜、向日葵、柳樹、及尤加利樹所構成之群。製造轉基因植物之方法為技藝中所熟知。

下述之特定實例僅被視為說明，且不以任何方式限制本揭示內容之其他部分。在不須進一步詳盡闡述之情形下，咸信根據本文之敘述，熟習技藝者已可將本發明利用至其最完整之程度。所有本文所引述之刊物因此以其全文併入本文作為參考。同時，下文所提議之任何機制並不已任何方式限制所請發明之範圍。

I.　材料及方法 1.　原生D2真菌菌株之培育

以MR(Mendels-Reese)培養基(pH 5.0)培養原生真菌菌株(亦即，刺孢殼葉斑菌D2)，以收集真菌細胞進行DNA/RNA萃取，並收集粗製酶以進行特性分析(如，胺基酸序列、纖維素活性及酶濃度)。每1公升之MR培養基含有1 g大豆蛋白、1.4 g(NH₄ )₂ SO₄ 、0.3 g尿素、2.0 g KH₂ PO₄ 、0.34 g CaCl₂ 、0.3 g MgSO₄ ‧7H₂ O、5.0 mg FeSO₄ ‧7H₂ O、1.6 mg MnSO₄ ‧7H₂ O、1.4 mg ZnSO₄ ‧7H₂ O、2 mg CoCl₂ ‧6H₂ O、及0.72 g纖維二糖。在30℃之溫度以及125 rpm之混合速率下，使真菌培養物生長4天，接著再收集真菌細胞及其粗製酶。

2.　核酸萃取及粗製酶之收集

使用基因組DNA純化套組(Promega,USA)萃取C. raphigera D2真菌之基因組DNA，並使用植物總RNA微量製備純化套組(GeneMark,Taiwan)萃取真菌RNA。以分光光譜儀(NanoDrop ND-1000,Thermo Scientific,USA)測量所萃取核酸之濃度。在進行進一步之處理前(如，PCR及RT PCR)，將該等DNA及RNA萃取物貯存在-20℃下。

使4天真菌培養物之上清液，過濾通過Whatman No.1濾紙(Whatman/GE Healthcare,USA)，接著再過濾通過0.45 μm膜盤狀過濾器(PALL,USA)，再過濾通過30K NMWL(Nominal Molecular Weight Limit)Ultra-15離心過濾器(Millipore,USA)，收集粗製酶。根據Bio-Rad蛋白分析，使用BSA(牛血清白蛋白)作為校正標準物(Bio-Rad,USA)，測定酶濃度。將過濾之酶貯存在4℃下，直到進行進一步之分析。

3.　酶電泳及N-端定序

根據Hoefer’s Protein Electrophoresis Applications Guide[Hoefer蛋白電泳應用指南](Hoefer Scientific Instruments,1994)所建議之操作流程，進行包括非變性PAGE(聚丙烯醯胺凝膠電泳)及SDS(十二烷基硫酸鈉)PAGE之酶電泳。在對非變性PAGE進行考馬斯藍染色前，將凝膠浸在0.5 mM MUG(4-甲基傘形酮-β-D-吡喃葡糖苷)溶液中，並在50℃下共置15分鐘，接著在UV燈下觀察，以進行酶譜分析(Benoit et al.,1995,Curr Microbiol 30:305-312)。此外，亦使用PlusOne銀染套組(GE Healthcare,USA)進行銀染而非使用SDS-PAGE之考馬斯藍染色，以觀察具有部份低濃度之酶。

就N-端序列分析而言，使目標酶(亦即，具有MUG活性之BGL)自SDS-PAGE凝膠轉移至PVDF膜(iBlot Gel Transfer Stacks,Invitrogen,USA)，再根據Edman降解化學，以Applied Biosystems Procise蛋白定序儀494型(Applied Biosystems,USA)進行分析。茲使用所揭示N-端序列之一部份，PGDGDWA(SEQ ID NO: 9)，設計簡併引子D2-bgl-NT: CCN GGN GAY GGN GAY TGG GC(SEQ ID NO: 10)，以由基因組DNA及/或逆轉錄之cDNA，進一步擴增目標bgl基因。

4. D2-bgl基因之選殖及定序

首先使用聚-T引子：GGT TCT TGC CAC AGT CAC GAC TTT TTT TTT TTT TTT TTT(SEQ ID NO: 11)及III逆轉錄酶(Invitrogen,USA)，由RNA樣本逆轉錄(RT)出bgl-Cr -D2 cDNA；再接著使用D2-bgl-NT及聚-T錨引子：GGT TCT TGC CAC AGT CAC GAC(SEQ ID NO: 12)之引子組以及DNA聚合酶(TaKaRa Ex Taq^TM ,TaKaRa Bio Inc,Japan)進行擴增。PCR之熱循環條件為94℃4分鐘，接著為30循環的94℃1分鐘、58℃30秒、及72℃3分鐘，接著進行72℃5分鐘之終延長步驟。將RT-PCR產物(亦即，bgl-Cr -D2 cDNA擴增物)選殖於-T Easy Vector中(Promega,USA)，再轉移進入大腸桿菌細胞(DH5α菌株)，以進行保存及進一步之定序。除此之外，亦使用D2-bgl-f: CCT GGT GAT GGT GAT TGG GCA GC(SEQ ID NO: 13)及D2-bgl-r: ATG TCC ACC TTT CCG AAT ACC TTG GC(SEQ ID NO: 14)之引子組以及TaKaRa Ex Taq^TM ，由基因組DNA樣本擴增bgl-Cr -D2基因(含有內含子)。亦將該PCR產物選殖於-T Easy Vector中進行定序。比較bgl-Cr -D2 cDNA(無內含子)及bgl-Cr -D2基因組DNA(具內含子)之序列以判定內含子部份。

此外，亦以Sac I限制酶(NEB,New England Biolabs Inc.,USA)對基因組DNA進行酶切消化，再以T4 DNA接合酶進行自體接合，以揭露bgl-Cr -D2基因上游之信號序列；接著，再以D2-bgl233f: CGT TTC GTC CAA AAT GTA ACA GCA T(SEQ ID NO: 15)及D2-bgl232r: GAT GCT TTC ACC GTC AGT TCT GA(SEQ ID NO: 16)之引子組進行反向PCR。該PCR之程序如下：95℃5分鐘，接著為25循環的95℃1分鐘、55℃1分鐘、及72℃6分鐘，接著進行72℃10分鐘之終循環。將該反向PCR產物(應含有如下順序之序列：D2-bgl233f+部份D2-bgl+Sac I+部份D2基因組+D2-bgl之信號序列+部份D2-bgl+D2-bgl232r)選殖於-T Easy Vector中以進行進一步之定序。

使用Clustal X軟體(Thompson et al.,1997,Nucleic Acids Research 25(24): 4876-4882)，使由所揭示之bgl-Cr -D2 cDNA取得之BGL-Cr -D2推定胺基酸序列與其他GH3家族之BGLs進行排比，以分析種系發生關係。使用該排比結果建立種系發生樹，以TreeView圖示(Page,1996,Computer Applications in the Biosciences 12:357-358)。

5.　在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中表現

在pGAPZα C載體中進一步建構bgl-Cr -D2 cDNA(選殖於-T Easy Vector中)，以在畢赤酵母中(Invitrogen,USA)進行重組BGL-Cr -D2-Pp 之持續性表現。簡言之，以D2-bgl-f-EcoRI: CGC TTG AAT TC G ATG CCT GGT GAT GGT GAT TGG(SEQ ID NO: 17)及D2-bgl-r-NotI: TTC AAG CGG CCG C AT GTC CAC CTT TCC GAA TAC C(SEQ ID NO: 18)之引子組，進行Easy vector中bgl-Cr -D2 cDNA的PCR擴增。以Eco RI及Not I(NEB,USA)進行擴增子及載體之雙重酶切消化，再以T4 DNA接合酶進行接合，將此PCR產物連結至pGAPZα C載體中。將所建構之帶有bgl-Cr -D2 cDNA的pGAPZα C載體轉形進入大腸桿菌(DH5α菌株)中保存。在後續轉形進入畢赤酵母宿主之前，先以質體微量製備純化套組(GeneMark,Taiwan)純化具有D2-bgl cDNA之pGAPZα C載體，並以Bsp HI(NEB,USA)直線化。根據畢赤酵母表現套組(Invitrogen,USA)之操作流程，經由同源重組，將該直線質體DNA轉形進入巴斯德畢赤酵母(GS115及SMD1168菌株)中。在YPD_zeocin100 培養基及Invitrogen操作流程中所建議之條件下，培養該重構之巴斯德畢赤酵母細胞。在不同時點(0-14天)收集畢赤酵母細胞及其酶，以評估其生長及酶之活性/量。

6.　活性試驗

使用不同之受質(對硝基苯基β-D-葡萄糖苷，pNPG；纖維二糖；羧甲基纖維素，CMC；木聚糖；微晶纖維素；及，濾紙)，試驗取自天然D2菌株之粗製酶及取自巴斯德畢赤酵母之重組酶的纖維素水解活性。根據由2mM pNPG在55℃、於5分鐘內之pNP釋出率，測量該等酶之pNPG酶活性。pNP濃度係根據OD₄₀₅ 之分光光度吸收值而校正。纖維二糖活性係由纖維二糖還原率及/或葡萄糖生產率而評估，其中纖維二糖及葡萄糖之濃度係由HPLC(高效液相層析)分析而測定。此外，亦根據DNS(二硝基水楊酸)法所偵測之還原糖生產率，測量CMC酶(針對其內切葡聚糖酶活性)、木聚糖酶(針對其木糖水解活性)、微晶纖維素酶(針對其外切葡聚糖酶活性)、及FP酶(代表總纖維素酶活性)。

II.　結果

在本發明中，根據使用pNPG(對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷)及纖維二糖作為受質之評估，其首先發現臺灣原生種真菌刺孢殼葉斑菌D2菌種可分泌具有顯著β-葡萄糖苷酶活性之粗製酶。自基因組DNA及逆轉錄之cDNA中衍生編碼該目標β-葡萄糖苷酶(BGL-Cr -D2)之基因(bgl-Cr -D2)。其顯示，bgl-Cr -D2 cDNA具有2166 bps之大小(不包括信號序列及終止密碼子)，而bgl-Cr -D2基因組DNA則具有2851 bps之大小(圖1&2)。在比較bgl-Cr -D2基因組DNA及cDNA後，辨識出12個內含子。該bgl-Cr -D2基因可編碼722個胺基酸基礎以形成BGL-Cr -D2(圖2)。根據衍生自糖苷水解酶(GH)家族3之β-葡萄糖苷酶的胺基酸序列比較，該新發現之BGL-Cr -D2與柄籃狀菌(Talaromyces stipitatua )(65%相似性)及土曲黴(Aspergillus terreus )(64%相似性)之β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶同源(圖3)。根據種系發生分析，發現C. raphigena D2、柄籃狀菌、及柄籃狀菌形成一亞群，其可與其他真菌及細菌組群(如，青黴屬(Penicillium )、覆膜酵母屬(Saccharomycopsis )、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium )、及大腸桿菌(Escherichia coli ))區隔。

將該bgl-Cr -D2基因進一步選殖至pGAPZαC載體中(圖4)，並使用巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris )SMD1168菌株作為宿主細胞轉形至酵母菌表現系統。在比較帶有bgl-Cr -D2之巴斯德畢赤酵母SMD1168菌株的生長及pNPG酶活性時，僅在選殖bgl-Cr -D2之菌落中觀察到顯著之pNPG酶活性，而兩種菌落之生長曲線則為相似(圖5)。在30℃下培養4-6天後，其生長及活性到達穩定量。同時，該重組β-葡萄糖苷酶(BGL-Cr -D2-Pp )具有約95 kDa之分子量(圖6C)(因轉譯後糖基化作用而大於79 kDa之理論大小)；且根據糖基化率(表1)及非變性PAGE(聚丙烯醯胺凝膠電泳)(圖6A)/MUG(4-甲基傘形酮-β-D-吡喃葡糖苷)酶譜分析(圖6B)之觀察結果，其顯示具有高專一活性。

在廣泛之pH範圍下(亦即，pH4-pH9)放置20小時後，重組BGL-Cr -D2-Pp 仍具有活性(圖7)。然而，此酶之pNPG酶活性在高於5.5之pH值下會顯著降低。此外，BGL-Cr -D2-Pp 在75℃之溫度下具有最高之pNPG酶活性；但在此高溫下，其活性在短期(亦即，2小時)之放置後會大量下降(圖8 & 9)。因此，在pH 5及55℃之溫度下，使重組BGL-Cr -D2-Pp 進行10分鐘之pNPG酶活性測量。

其他具體實例

所有揭示於此說明書中之特徵可以任何方式組合。各個揭示於此說明書中之特徵可以另一提供相同、相當、或類似目的之替代手段取代。因此，除非另有明示，各例示之特徵僅係一總括系列之相當或類似特徵中之一例。

茲已敘述諸多本發明之具體實例。然而，咸可明瞭，可在不偏離本發明精神及範圍之情形下進行各種不同之修飾。因此，其他具體實例亦涵括於下述之申請專利範圍中。

圖1係顯示刺孢殼葉斑菌(Chaetomella raphigera )中編碼BGL-Cr -D2酶之基因組DNA區域(2851 bps，SEQ ID NO: 3)的圖示，該區域含有12個內含子節段(在圖中以「白色」節段指明，並在序列中以「小寫/灰色/刪除線」節段指明)。編碼信號肽之區域在圖中以「黑色」指明，並在序列中以「底線」指明。

圖2係顯示bgl-Cr -D2 cDNA(2166 bps/SEQ ID NO: 2，排除以底線指明之信號序列/SEQ ID NO: 8)以及其對於臺灣原生種真菌刺孢殼葉斑菌之編碼胺基酸序列(722 a.a.殘基/SEQ ID NO: 1，排除信號肽/SEQ ID NO: 7)的圖示。

圖3係根據取自糖苷水解酶(GH)家族3之β-葡萄糖苷酶(BGL)之胺基酸序列之種系發生樹的圖示，其顯示由重構之巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris )(SMD1168菌株)所分泌之BGL-Cr -D2-Pp 與柄籃狀菌(T. stipitatua )、土曲黴(A. terreus )NIH2624 、及煙曲黴(A. fumigates )A1163 之β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶具有相關性(亦即，AA序列具有64-65%相似性)。

圖4係重構pGAPZαC載體圖譜之圖示，其顯示bgl-Cr -D2基因經選殖以進一步轉形至巴斯德畢赤酵母表現系統。(在該圖譜下方顯示之簡化核苷酸序列中，該等縮減區域之長度，亦即，GAP啟動子、α-因子信號序列、及bgl-Cr -D2，並不符合圖示之圖譜中依尺度繪製之實際大小。)

圖5A及5B係顯示下列菌落相對於時間之生長及pNPG酶活性的圖示：(A)巴斯德畢赤酵母SMD1168菌株及(B)帶有bgl-Cr -D2之巴斯德畢赤酵母SMD1168菌株；其顯示類似之生長曲線，但僅有選殖bgl-Cr -D2之菌落具有顯著之pNPG酶活性。

圖6A-C係顯示非變性PAGE(A)、MUG酶譜分析(B)、及SDS PAGE(C)之酶大小及活性的照片。(Pp ：巴斯德畢赤酵母；Cr -D2：刺孢殼葉斑菌真菌菌株D2；BGL：β-葡萄糖苷酶。)

圖7係顯示根據20小時之pH安定性評估(在進行標準之pNPG酶活性測量(亦即，pH 5及55℃，10分鐘)之前，將酶置於4℃、特定pH值下20小時)，重組酶BGL-Cr -D2-Pp 在廣泛之pH範圍下(4-9)皆為安定的圖示。BGL-Cr -D2-Pp 之pNPG酶活性的最適pH值為約5(在各個特定pH值測量該酶之pNPG酶活性)。

圖8係顯示根據4小時之熱安定性評估(在進行標準之pNPG酶活性測量之前，將酶置於各特定溫度下4小時)，重組酶BGL-Cr -D2-Pp 在4-55℃之溫度下皆為安定的圖示。BGL-Cr -D2-Pp 之pNPG酶活性的最適溫度為約70℃(在各個特定溫度測量該酶之pNPG酶活性)；但在此高溫下，該酶在較長之放置時間後(如，2小時，圖9)會失活。

圖9係顯示重組β-葡萄糖苷酶BGL-Cr -D2-Pp 在4至75℃之溫度下，於9天期間內之熱安定性的圖示。在50℃之溫度下，BGL-Cr -D2-Pp 於9天內皆維持安定(相對活性>80%)。

<110>　中央研究院

<120>　新穎之β-葡萄糖苷酶及其用途

<160>　18

<170>　PatentIn version 3.3

<210>　1

<211>　722

<212>　PRT

<213>　刺孢殼葉斑菌(Chaetomella raphigera)

<400>　1

<210>　2

<211>　2166

<212>　DNA

<213>　刺孢殼葉斑菌(Chaetomella raphigera)

<400>　2

<210>　3

<211>　2851

<212>　DNA

<213>　刺孢殼葉斑菌(Chaetomella raphigera)

<400>　3

<210>　4

<211>　740

<212>　PRT

<213>　刺孢殼葉斑菌(Chaetomella raphigera)

<400>　4

<210>　5

<211>　2220

<212>　DNA

<213>　刺孢殼葉斑菌(Chaetomella raphigera)

<400>　5

<210>　6

<211>　2905

<212>　DNA

<213>　刺孢殼葉斑菌(Chaetomella raphigera)

<400>　6

<210>　7

<211>　18

<212>　PRT

<213>　刺孢殼葉斑菌(Chaetomella raphigera)

<400>　7

<210>　8

<211>　54

<212>　DNA

<213>　刺孢殼葉斑菌(Chaetomella raphigera)

<400>　8

<210>　9

<211>　7

<212>　PRT

<213>　刺孢殼葉斑菌(Chaetomella raphigera)

<400>　9

<210>　10

<211>　20

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　簡倂引子D2-bgl-NT

<400>　10

<210>　11

<211>　39

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　聚-T引子

<400>　11

<210>　12

<211>　21

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　聚-T錨引子

<400>　12

<210>　13

<211>　23

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　引子D2-bgl-f

<400>　13

<210>　14

<211>　26

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　引子D2-bgl-r

<400>　26

<210>　15

<211>　25

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　引子D2-bgl233f

<400>　15

<210>　16

<211>　23

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　引子D2-bgl232r

<400>　16

<210>　17

<211>　33

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　引子D2-bgl-f-EcoRI

<400>　17

<210>　18

<211>　34

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　引子D2-bgl-r-NotI

<400>　18

<400>　10

Claims (22)

1. 一種分離多肽，其包含與SEQ ID NO：1具有至少90%相同性之序列，其中該多肽具有β-葡萄糖苷酶活性。
2. 如申請專利範圍第1項之分離多肽，其中該序列與SEQ ID NO：1具有至少95%相同性。
3. 如申請專利範圍第2項之分離多肽，其中該序列與SEQ ID NO：1具有至少99%相同性。
4. 如申請專利範圍第3項之分離多肽，其中該多肽包括SEQ ID NO：1之序列。
5. 一種分離核酸，其編碼如申請專利範圍第1項之多肽。
6. 如申請專利範圍第5項之核酸，其中該核酸包含SEQ ID NO：2、3、5、或6之序列。
7. 一種表現載體，其包含如申請專利範圍第5項之核酸。
8. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第5項之核酸。
9. 一種製備多肽之方法，其包含在培養基中培養宿主細胞，該宿主細胞含有一核酸，編碼如申請專利範圍第1項之多肽，其培養條件為容許該核酸所編碼之多肽表現，以及由該經培養之細胞或該細胞之培養基中純化該多肽。
10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該多肽具有與SEQ ID NO：1具90%相同性之序列。
11. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該多肽具有與SEQ ID NO：1具95%相同性之序列。
12. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該多肽具有SEQ ID NO：1之序列。
13. 一種組合物，其包含如申請專利範圍第1項之多肽。
14. 如申請專利範圍第13項之組合物，其中該組合物尚包含外切葡聚糖酶及內切葡聚糖酶。
15. 一種由木質纖維素物質製備可醱酵糖之方法，其包含 提供如申請專利範圍第13項之組合物，以及使該組合物與木質纖維素物質接觸以製備可醱酵糖。
16. 如申請專利範圍第15項之方法，其中該可醱酵糖係選自由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、及纖維二糖所構成之群。
17. 如申請專利範圍第15項之方法，其中該多肽具有SEQ ID NO：1之序列。
18. 如申請專利範圍第15項之方法，其中該木質纖維素物質係選自由纖維素質動物糞便、城市固體廢棄物、廢紙、庭院廢棄物、農業廢棄物、及林業廢棄物所構成之群。
19. 如申請專利範圍第15項之方法，其進一步包含將該可醱酵糖轉化成為醱酵產物。
20. 如申請專利範圍第19項之方法，其中該轉化步驟係由微生物醱酵或酶處理而進行。
21. 一種由木質纖維素物質產生能量之方法，其包含提供如申請專利範圍第13項之組合物；使該組合物與木質纖維素物質接觸以製備可醱酵糖；轉化該可醱酵糖以產生可燃性之醱酵產物，及燃燒該可燃性醱酵產物以產生能量。
22. 一種生物反應器，其含有木質纖維素物質以及如申請專利範圍第13項之組合物。