JPS58198291A - β−ガラクトシダ−ゼおよびその製造法 - Google Patents
β−ガラクトシダ−ゼおよびその製造法Info
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- JPS58198291A JPS58198291A JP8069682A JP8069682A JPS58198291A JP S58198291 A JPS58198291 A JP S58198291A JP 8069682 A JP8069682 A JP 8069682A JP 8069682 A JP8069682 A JP 8069682A JP S58198291 A JPS58198291 A JP S58198291A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規にして有用なβ−ガラクトシダーゼおよび
その製造法に関する。
その製造法に関する。
本発明で提供するβ−ガラクトシダーゼは乳糖に高い基
質特異性を有するβ−ガラクトシダーゼであり、ケトメ
ラ属に属するβ−ガラクトシダーゼ産生菌を培地に培養
し、得られる培養物から分離採取することにより得られ
る。
質特異性を有するβ−ガラクトシダーゼであり、ケトメ
ラ属に属するβ−ガラクトシダーゼ産生菌を培地に培養
し、得られる培養物から分離採取することにより得られ
る。
β−ガラクトシダーゼは乳糖などのもつβ−ガラクトシ
ド結合を分解してＤ−ガラクトースを遊離する酵素であ
り、従来より、乳糖不耐症の治療剤・各種乳製品の処理
剤などに応用すべく１種々の微生物を培養してβ−ガラ
クトシダーゼを得る研究が進められている。
ド結合を分解してＤ−ガラクトースを遊離する酵素であ
り、従来より、乳糖不耐症の治療剤・各種乳製品の処理
剤などに応用すべく１種々の微生物を培養してβ−ガラ
クトシダーゼを得る研究が進められている。
一般にβ−ガラクトシダーゼの活性度は測定が容易であ
るという理由から合成基質の０−ニトロフェニル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド（以下０ＮＰＧと略す）に対す
る分解力で表わされる場合が多いが・この値は生体内で
実際に基質となる乳糖に対する分解力とは通常一致しな
い。これまでに研究開発更に市販化されたβ−ガラクト
シダーゼは殆んど全てが乳糖よりも０ＮＰＧに高い基質
特異性を有しており・従って体内では表記された分解力
どおりの効力を期待できない。
るという理由から合成基質の０−ニトロフェニル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド（以下０ＮＰＧと略す）に対す
る分解力で表わされる場合が多いが・この値は生体内で
実際に基質となる乳糖に対する分解力とは通常一致しな
い。これまでに研究開発更に市販化されたβ−ガラクト
シダーゼは殆んど全てが乳糖よりも０ＮＰＧに高い基質
特異性を有しており・従って体内では表記された分解力
どおりの効力を期待できない。
本発明者らは、乳糖に対し０ＮＰＧ以上の基質特異性を
もつβ−ガラクトシダーゼを見い出すべく種々の微生物
を検索した結果、ケトメラ属に属する菌株がその目的に
合致するβ−ガラクトシダーゼを生産することを見い出
し１本発明を完成した。
もつβ−ガラクトシダーゼを見い出すべく種々の微生物
を検索した結果、ケトメラ属に属する菌株がその目的に
合致するβ−ガラクトシダーゼを生産することを見い出
し１本発明を完成した。
次に本発明β−ガラクトシダーゼの製造法を示す。本発
明β−ガラクトシダーゼの製造はケトメラ属に属するβ
−ガラクトシダーゼ産生菌を好気的条件下に栄養培地に
培養し、培養終了後当該β−ガラクトシダーゼを分離採
取することにより行なう。
明β−ガラクトシダーゼの製造はケトメラ属に属するβ
−ガラクトシダーゼ産生菌を好気的条件下に栄養培地に
培養し、培養終了後当該β−ガラクトシダーゼを分離採
取することにより行なう。
本発明で使用するβ−ガラクトシダーゼ産生菌はケトメ
ラ属に属するカビの一種で具体的には例えば、ケトメラ
・ラフイゲーラＰ Ｆ ６６１ （Ｃｈａｅ −ｔｏ
ｍｅｌｌａ ｒａｐｈｉｇｅｒａ ＰＦ−１，ｇＪ’
）が挙げられる。該菌株は、粉胞子器（ｐｙｃｎｉｄ
ｉａ ）を形成してその上に形成されるトゲ（５ｅｔａ
ｅ ）には直状のもの（ｓｔｒａｉｇｈｔ ） 、曲
がったもの（ｂｅｎｔ ）ならびに鍵形のもの（ｈｏ
ｏｋ）が観られること。
ラ属に属するカビの一種で具体的には例えば、ケトメラ
・ラフイゲーラＰ Ｆ ６６１ （Ｃｈａｅ −ｔｏ
ｍｅｌｌａ ｒａｐｈｉｇｅｒａ ＰＦ−１，ｇＪ’
）が挙げられる。該菌株は、粉胞子器（ｐｙｃｎｉｄ
ｉａ ）を形成してその上に形成されるトゲ（５ｅｔａ
ｅ ）には直状のもの（ｓｔｒａｉｇｈｔ ） 、曲
がったもの（ｂｅｎｔ ）ならびに鍵形のもの（ｈｏ
ｏｋ）が観られること。
および、胞子が円筒形（ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａｌ ）
＋紡錘形（ｆｕｓｉｆｏｒｍ ）またハソーセーシ形
（ａｌａｎｔｏｉｄ）を呈し、大きさは４４ｊ〜４ Ｘ
／、 ７ Ｘ ２μであることなどの性状が下記文献
に記載されているケトメラ・ラフイゲーラの性状と一致
するところから同定されたものである。
＋紡錘形（ｆｕｓｉｆｏｒｍ ）またハソーセーシ形
（ａｌａｎｔｏｉｄ）を呈し、大きさは４４ｊ〜４ Ｘ
／、 ７ Ｘ ２μであることなどの性状が下記文献
に記載されているケトメラ・ラフイゲーラの性状と一致
するところから同定されたものである。
Ａ ｎｅｗ ５ｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ｃｈａｅｔｏｍｅ
ｌｌａ ｏｎ ｒｏｓｅ ： Ｍ、 Ｅ。
ｌｌａ ｏｎ ｒｏｓｅ ： Ｍ、 Ｅ。
シイｔ、 Ｍｙｃｏｌ ｏｇｉａ 、 ２２ 、 ／
１． ！；−１６１しかし９文献中には、記載のケート
メラ・ラフイゲ〜うがβ−ガラクトシダーゼを産生する
ことあるいはそれを示唆するような記述は全く見い出せ
ない。従ってケトメラ・ラフィゲーラを使用してβ〜ガ
ラクトシダーゼを得る本発明方法は、新規なβ−ガラク
トシダ〜ゼ製造法である。ケトメラ・ラフイゲ〜うＰＦ
−４Ｊ（ｆ′の標準菌株は微生物工業技術研究所に昭和
タフ年３月２７日より微工研菌寄第乙ｔ♂３号として寄
託しである。
１． ！；−１６１しかし９文献中には、記載のケート
メラ・ラフイゲ〜うがβ−ガラクトシダーゼを産生する
ことあるいはそれを示唆するような記述は全く見い出せ
ない。従ってケトメラ・ラフィゲーラを使用してβ〜ガ
ラクトシダーゼを得る本発明方法は、新規なβ−ガラク
トシダ〜ゼ製造法である。ケトメラ・ラフイゲ〜うＰＦ
−４Ｊ（ｆ′の標準菌株は微生物工業技術研究所に昭和
タフ年３月２７日より微工研菌寄第乙ｔ♂３号として寄
託しである。
本発明においては、上記のケトメラ・ラフィゲ〜うＰＦ
−６乙ｒ株ならびにその天然および人工変異株は勿論の
ことケトメラ属に属する当該β−ガラクトシダーゼ産生
菌は全て使用でき５本発明に包含する。
−６乙ｒ株ならびにその天然および人工変異株は勿論の
ことケトメラ属に属する当該β−ガラクトシダーゼ産生
菌は全て使用でき５本発明に包含する。
β−ガラクトシダーゼ産生菌の培地組成、培地条件など
は、酵素の製造に関して一般に用いられているものを用
いればよい。培地としては、皺。
は、酵素の製造に関して一般に用いられているものを用
いればよい。培地としては、皺。
油カス、米ヌカ、コーンステイープリカー、硝酸アンモ
ニウムなどを含有する液体培地または固体培地が利用で
き、その他必要に応じて、グルコース、デキストリン、
アラビノース、シヨ糖、グリセリンなどの炭素源、麦芽
エキス・大豆粉、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなど
の窒素源および無機リン酸塩、マグネシウム塩、カルシ
ウム塩などの無機塩を添加してもよい、またビタミンな
どを添加して菌の生育を促してもよい。培養は、ｌＯ〜
ｔｏ”ｃ、ｐ）Ｉ２．ｓ〜７．５′の好奇的条件下で好
ましくは２０〜３！；′Ｃ，ｐＨ３〜乙で行なう。培養
時間は、培養の規模、振盪の強さなどにより異なるが。
ニウムなどを含有する液体培地または固体培地が利用で
き、その他必要に応じて、グルコース、デキストリン、
アラビノース、シヨ糖、グリセリンなどの炭素源、麦芽
エキス・大豆粉、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなど
の窒素源および無機リン酸塩、マグネシウム塩、カルシ
ウム塩などの無機塩を添加してもよい、またビタミンな
どを添加して菌の生育を促してもよい。培養は、ｌＯ〜
ｔｏ”ｃ、ｐ）Ｉ２．ｓ〜７．５′の好奇的条件下で好
ましくは２０〜３！；′Ｃ，ｐＨ３〜乙で行なう。培養
時間は、培養の規模、振盪の強さなどにより異なるが。
通常／−Ｊ’日である。培養中に培地のｐＨが変動しう
る場合には、培地中に緩衝剤を加えてもよい。
る場合には、培地中に緩衝剤を加えてもよい。
培養終了後、培養物から当該β−ガラクトシダーゼを分
離採取するには９通常の酵素精製法を用いればよい。即
ち、遠心分離、ヌツチェ濾過、抽出などの方法により培
養物から菌体を除去して粗酵素液を得、これに塩酸、硫
酸、リン酸などのアルカリ金属塩またはアンモニウム塩
などのような水溶性塩を加えて塩析させたり、あるいは
、アセトン、アルコールなどにより沈澱させることによ
り粗酵素蛋白が得られる。これを更に、透析、遠心分離
、濾過、抽出、各種イオン交換樹脂や吸着剤による脱吸
着、クロマトグラフィーなどを適当に組み合わせて用い
て精製し、純粋な酵素標品を得ることができる。
離採取するには９通常の酵素精製法を用いればよい。即
ち、遠心分離、ヌツチェ濾過、抽出などの方法により培
養物から菌体を除去して粗酵素液を得、これに塩酸、硫
酸、リン酸などのアルカリ金属塩またはアンモニウム塩
などのような水溶性塩を加えて塩析させたり、あるいは
、アセトン、アルコールなどにより沈澱させることによ
り粗酵素蛋白が得られる。これを更に、透析、遠心分離
、濾過、抽出、各種イオン交換樹脂や吸着剤による脱吸
着、クロマトグラフィーなどを適当に組み合わせて用い
て精製し、純粋な酵素標品を得ることができる。
以上のようにして得られる本発明のβ−ガラクトシダー
ゼは下記の理化学的性質を有する。
ゼは下記の理化学的性質を有する。
（１）作用
β−Ｄ−ガラクトピラノシル誘導体に特異的に作用して
Ｄ−ガラクトースを遊離する。
Ｄ−ガラクトースを遊離する。
（２）基質特異性 ′ニ
一般にβ−ガラクトシダーゼは、天然基質である乳糖に
対する分解力が合成基質である０ＮＰＧに対する分解力
に比べてはるかに小さいが７本酵素は乳糖に対する分解
の方が強い。０ＮＰＣ分解力に△ 対する乳糖分解力の比率は／−２゜ （３）全適所および安定ｐｍ範囲 第１図および第２図に示す通りである。第１図はリン酸
・クエン酸緩衝液中で３７°ｃ、ｉｓ分間反応させたと
きのｐＩ（変化に伴なう酵素比活性（俤）の変化を示す
図である。図中１曲線■は乳糖を基質とした場合を５曲
線■は０ＮＰＧを基質とした場合をそれぞれ表わす。第
２図は、リン酸・クエン酸緩衝液中で３７°Ｏ，／時間
、各ｐＨに保ったのちの各ｐＨでの残存活性（係）を示
す図である。
対する分解力が合成基質である０ＮＰＧに対する分解力
に比べてはるかに小さいが７本酵素は乳糖に対する分解
の方が強い。０ＮＰＣ分解力に△ 対する乳糖分解力の比率は／−２゜ （３）全適所および安定ｐｍ範囲 第１図および第２図に示す通りである。第１図はリン酸
・クエン酸緩衝液中で３７°ｃ、ｉｓ分間反応させたと
きのｐＩ（変化に伴なう酵素比活性（俤）の変化を示す
図である。図中１曲線■は乳糖を基質とした場合を５曲
線■は０ＮＰＧを基質とした場合をそれぞれ表わす。第
２図は、リン酸・クエン酸緩衝液中で３７°Ｏ，／時間
、各ｐＨに保ったのちの各ｐＨでの残存活性（係）を示
す図である。
至適ｐＨ： ｌＡｓ （第７図参照）
安定声範囲：、２．．５〜７３（第２図参照）（４）力
価の測定法 （ａ）乳糖に対する加水分解力の測定 ／、 ５％乳糖を含有する０θｊＭ′リン酸・クエン酸
緩衝液（ｐＨＩＡ！；）０！−に本酵素０３ｔｘｌを加
え。
価の測定法 （ａ）乳糖に対する加水分解力の測定 ／、 ５％乳糖を含有する０θｊＭ′リン酸・クエン酸
緩衝液（ｐＨＩＡ！；）０！−に本酵素０３ｔｘｌを加
え。
３７°ｃ、ｉｓ分間反応きせたのち、１００°Ｃ，！；
分間熱湯につけて反応を停止させる。生成したグルコー
ス量をグルコース測定試薬を用いて測定り、・乳糖の分
解量を求める。１分間当たり、ｌμＭの乳糖を加水分解
する酵素量を／Ｉ、ａｃｔ単位とする。
分間熱湯につけて反応を停止させる。生成したグルコー
ス量をグルコース測定試薬を用いて測定り、・乳糖の分
解量を求める。１分間当たり、ｌμＭの乳糖を加水分解
する酵素量を／Ｉ、ａｃｔ単位とする。
（ｂｌ ０ＮＰＧの加水分解力の測定
００２Ｍ０ＮＰＧを含有する００．！；Ｍリン酸・クエ
ン酸緩衝液（ｐＨ４ｔ、、５）０３ ｍｌ ニ本酵素０
６ｔｔｔｌヲ加ニー３７°ｃ、ｉｓ分間反応させたのち
、／Ｍ炭酸ナトリウム液１ｙｘｌを加えて反応を停止さ
せる。生成した０−ニトロフェノール量を測定して、
０ＮＰＣの分解量を求める。１分間当たり、ｌμＭの０
ＮＰＣを加水分解する酵素量を／ ０ＮＰＣ単位とする
。
ン酸緩衝液（ｐＨ４ｔ、、５）０３ ｍｌ ニ本酵素０
６ｔｔｔｌヲ加ニー３７°ｃ、ｉｓ分間反応させたのち
、／Ｍ炭酸ナトリウム液１ｙｘｌを加えて反応を停止さ
せる。生成した０−ニトロフェノール量を測定して、
０ＮＰＣの分解量を求める。１分間当たり、ｌμＭの０
ＮＰＣを加水分解する酵素量を／ ０ＮＰＣ単位とする
。
（５）作用適温の範囲
第３図に示す通りである。第３図は、ｐＨｌＡ３゜各温
度でｉｓ分間反応させたときの温度変化に伴なう酵素比
活性（チ）の変化を示す図である。図中。
度でｉｓ分間反応させたときの温度変化に伴なう酵素比
活性（チ）の変化を示す図である。図中。
番号■および■は第１図と同意義である。
至適温度：乳糖を基質とする場合は約ｊｊ’ｃ。
０ＮＰＧを基質とする場合は約１．０°ｃ０（第３図参
照） （６）Ｉ）Ｔ（、温度などによる失活の条件筒を図に示
す通りである。第を図は、ｐＨ３およびｐＨ６のそれぞ
れのリン酸・クエン酸緩衝液中において、１３分間、各
温度に保ったのちの各温度での残存活性（チ）を示す図
である。
照） （６）Ｉ）Ｔ（、温度などによる失活の条件筒を図に示
す通りである。第を図は、ｐＨ３およびｐＨ６のそれぞ
れのリン酸・クエン酸緩衝液中において、１３分間、各
温度に保ったのちの各温度での残存活性（チ）を示す図
である。
安定温度範囲： ｐＨ３では＆ｊ’Ｃ以下。ｐＨ乙では
ｔｏ’ｃ以下。（第１図参照） （７）阻害、活性化および安定化 各種金属イオンおよび糖の本酵素におよぼす影響を、各
種金属イオンおよび糖存在下の残存活性（チ）により表
わしたのが次表である。
ｔｏ’ｃ以下。（第１図参照） （７）阻害、活性化および安定化 各種金属イオンおよび糖の本酵素におよぼす影響を、各
種金属イオンおよび糖存在下の残存活性（チ）により表
わしたのが次表である。
豪乳糖に対する分解力は、生成したグルコース量を定量
することによっているため測定不能。
することによっているため測定不能。
上表から明らかな様に５本酵素の酵素活性は。
硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅、塩化カルシウム、
ガラクトースおよびグルコースによす影響を受けない。
ガラクトースおよびグルコースによす影響を受けない。
（８）分子量
分子量は、セファデックスＧ−’、７θＯ（ファルマシ
ア・ファイン・ケミカルズ社製ゲル濾過剤）カラムクロ
マトグラフィ＝（φ／、３×７０ｃｍ）を使用しゲル濾
過法により測定。分子量既知の試料として、オバルブミ
ン（分子量’１３，０００）、牛血溝アルブ゛ミン（分
子量６’ｙ、ｏｏｏ ）、アルドラーゼ（分子量ｔ、５
ｙｏｏｏ ）およびカタラーゼ（分子量２４ｔ４θＯ
０）を使用した。分子量は約ｌ♂万。
ア・ファイン・ケミカルズ社製ゲル濾過剤）カラムクロ
マトグラフィ＝（φ／、３×７０ｃｍ）を使用しゲル濾
過法により測定。分子量既知の試料として、オバルブミ
ン（分子量’１３，０００）、牛血溝アルブ゛ミン（分
子量６’ｙ、ｏｏｏ ）、アルドラーゼ（分子量ｔ、５
ｙｏｏｏ ）およびカタラーゼ（分子量２４ｔ４θＯ
０）を使用した。分子量は約ｌ♂万。
（９）等電点
アンフオラインの電気泳動により本酵素の等電点を求め
た。等電点はｐＩ（Ｊ： ｏ”―よ３゜０１元素分析値 Ｃ：４ｔ／、７３チ、Ｈ：Ａ、／Ｊチ、Ｎ：１７０係係
上下本発明品°と従来のβ−ガラクトシダーゼとの比較
を示す。表中、 ［Ｌａ ｃ ｔ］は乳糖に対する分解
力を、 ［０ＮＰＧ］は０ＮＰＧに対する分解力をそ
れぞれ表わしており、即ち、 ［Ｌａｃｔ］ ／ ［
０ＮＰＧ］値が大きいほど乳糖に対して基質特異性が高
いこＡ：特開昭！；ｌｌ−１０！；２９０執記載のβ−
ガラクトシ一記 載：特開昭！；３−／１ｇｊ９１記載のβ−ガラクトシ
ダーゼ Ｃ：東京田辺製β−ガラクトシダーゼ市販品Ｄ：マイル
スボラトリーズ・インコーホレッド製市販品 表から明らかな様に本発明標品（表中本酵素と記載）は
、乳糖に対する基質特異性が非常に高い。
た。等電点はｐＩ（Ｊ： ｏ”―よ３゜０１元素分析値 Ｃ：４ｔ／、７３チ、Ｈ：Ａ、／Ｊチ、Ｎ：１７０係係
上下本発明品°と従来のβ−ガラクトシダーゼとの比較
を示す。表中、 ［Ｌａ ｃ ｔ］は乳糖に対する分解
力を、 ［０ＮＰＧ］は０ＮＰＧに対する分解力をそ
れぞれ表わしており、即ち、 ［Ｌａｃｔ］ ／ ［
０ＮＰＧ］値が大きいほど乳糖に対して基質特異性が高
いこＡ：特開昭！；ｌｌ−１０！；２９０執記載のβ−
ガラクトシ一記 載：特開昭！；３−／１ｇｊ９１記載のβ−ガラクトシ
ダーゼ Ｃ：東京田辺製β−ガラクトシダーゼ市販品Ｄ：マイル
スボラトリーズ・インコーホレッド製市販品 表から明らかな様に本発明標品（表中本酵素と記載）は
、乳糖に対する基質特異性が非常に高い。
即ち体内での作用が非常に強力なβ−ガラクトシダーゼ
であるといえる。酵素標品Ｂは従来品の中で０ＮＰＣよ
りも乳糖に高い基質特異性を有する唯一の例であるが、
非常に不安定なことが欠点となっている。本発明酵素は
非常に安定で収率がよく。
であるといえる。酵素標品Ｂは従来品の中で０ＮＰＣよ
りも乳糖に高い基質特異性を有する唯一の例であるが、
非常に不安定なことが欠点となっている。本発明酵素は
非常に安定で収率がよく。
また耐酸性を有する点においても、標品Ｂより応用範囲
の広い優れたβ−ガラクトシダーゼである。
の広い優れたβ−ガラクトシダーゼである。
上記の理化学的性質から明らかなように２本発明のβ−
ガラクトシダーゼは乳糖に対する基質特異性が高いため
、胃腸管内で乳糖が分解されず乳糖に起因した消化不良
や下痢などを起こす乳糖不耐症の治療および防止には特
に有効であり、医薬品としであるいは牛乳その他の乳製
品に添加して用いられる。また本酵素は、胃内の卯でも
充分安定な耐酸性９通常の乳製品の加熱温度下で充分安
定な耐熱性を合わせ持ち 更には、金属イオンや糖と共
存しても安定であるな゛どの利点を有するので、使用に
際して取扱いが非常に容易であり、また体内で充分にそ
の効力を発揮することができる。
ガラクトシダーゼは乳糖に対する基質特異性が高いため
、胃腸管内で乳糖が分解されず乳糖に起因した消化不良
や下痢などを起こす乳糖不耐症の治療および防止には特
に有効であり、医薬品としであるいは牛乳その他の乳製
品に添加して用いられる。また本酵素は、胃内の卯でも
充分安定な耐酸性９通常の乳製品の加熱温度下で充分安
定な耐熱性を合わせ持ち 更には、金属イオンや糖と共
存しても安定であるな゛どの利点を有するので、使用に
際して取扱いが非常に容易であり、また体内で充分にそ
の効力を発揮することができる。
以下に実施例を示して本発明の様態を明らかにするが、
これらはいづれも本発明をなんら限定するものではない
。
これらはいづれも本発明をなんら限定するものではない
。
実施例１
皺３．０％、米ヌカ／、 ０１ 、コーンステイープリ
カー／、０％、硝酸アンモニウム０１％を含む液体培養
基（ｐＨ６，０）１００ｍｌを３００ Ｉ１１容三角フ
ラスコに分注し、ｉ２ｉ′ｃで３０分間蒸気滅菌する。
カー／、０％、硝酸アンモニウム０１％を含む液体培養
基（ｐＨ６，０）１００ｍｌを３００ Ｉ１１容三角フ
ラスコに分注し、ｉ２ｉ′ｃで３０分間蒸気滅菌する。
これに予め同様の培養基に２ｔ″Ｃで２日間培養してお
いたケトメラ・ラフィゲーラＰＦ−６ｔＦの種培養液’
Ａｌ１１ｌを接種し、２θｏｒ、ｐ、ｍ、の回転振盪機
で２ｒ°Ｃ，７日間培養する。培養液１０本分を合して
、ヌツチェ濾過により菌体を除去して培養炉液７θ０
ｇ／ （７７／ ０ＮＰＣ単位／ ｍｌ ）を得る。
いたケトメラ・ラフィゲーラＰＦ−６ｔＦの種培養液’
Ａｌ１１ｌを接種し、２θｏｒ、ｐ、ｍ、の回転振盪機
で２ｒ°Ｃ，７日間培養する。培養液１０本分を合して
、ヌツチェ濾過により菌体を除去して培養炉液７θ０
ｇ／ （７７／ ０ＮＰＣ単位／ ｍｌ ）を得る。
この培養Ｐ液を０１３飽和の硫安塩析し、生ずる沈澱を
水ｌθθｍｌに溶解し、不溶分除去して透析し、低温下
でアセトン１００ｍ１を添加し、生ずる沈澱を分離後、
凍結乾燥してβ−ガラクトシダーゼの粉末ｏｉざｇ（ム
ｌざθ０ＮＰＧ単位／１１゜５ｓざθＬａｃ を単位／
ｇ）を得る。収率：／７３％。
水ｌθθｍｌに溶解し、不溶分除去して透析し、低温下
でアセトン１００ｍ１を添加し、生ずる沈澱を分離後、
凍結乾燥してβ−ガラクトシダーゼの粉末ｏｉざｇ（ム
ｌざθ０ＮＰＧ単位／１１゜５ｓざθＬａｃ を単位／
ｇ）を得る。収率：／７３％。
実施例コ
米胚芽ｒ、ｏｉ、油カス（ナタネ）！０％を含む液体培
養基（ｐＨＪ、θ）１００ｍｌｆｅ！；００ｍ１容三角
フラスコに分注し、ｉ、；ｚｉ’ｃで３θ分間蒸気滅菌
後、予め実施例１記載と同様の培養基に２１′Ｃで２日
間培養しておいたケトメラ・ラフイゲーラＰＦ−６乙ざ
の種培養液１ｉｓｔを接種し、２０Ｏｒ、ｐ、ｍ。
養基（ｐＨＪ、θ）１００ｍｌｆｅ！；００ｍ１容三角
フラスコに分注し、ｉ、；ｚｉ’ｃで３θ分間蒸気滅菌
後、予め実施例１記載と同様の培養基に２１′Ｃで２日
間培養しておいたケトメラ・ラフイゲーラＰＦ−６乙ざ
の種培養液１ｉｓｔを接種し、２０Ｏｒ、ｐ、ｍ。
の回転振盪機で２ｆ°Ｃ，乙日間培養する。培養液乙Ｏ
本分を合して、Ｐ布式遠心分離機で菌体を除去し、培養
炉液４！ Ｊ （／ １１．！０ＮＰＧ単位／！Ｉ／）
を得る。
本分を合して、Ｐ布式遠心分離機で菌体を除去し、培養
炉液４！ Ｊ （／ １１．！０ＮＰＧ単位／！Ｉ／）
を得る。
この培養Ｐ液を限外濾過により水分および塩分を除去し
ｔθθゴとする。さらに低温下でアセトン’ＡＯＯｍｌ
を添加し、生ずる沈澱を分離し、遠心分離で不溶分を除
去後、凍結乾燥してβ−ガラクトシダーゼの粉末３．Ｏ
ｆＣム９２θ０ＮＰＧ単位／ｆ。
ｔθθゴとする。さらに低温下でアセトン’ＡＯＯｍｌ
を添加し、生ずる沈澱を分離し、遠心分離で不溶分を除
去後、凍結乾燥してβ−ガラクトシダーゼの粉末３．Ｏ
ｆＣム９２θ０ＮＰＧ単位／ｆ。
６．３θ０Ｌａｃｔ単位／ｇ）を得る、収率：３０！％
。
。
実施例３
実施例１記載の培養基（ｐＨＡ、θ）♂θθゴを２１容
三角フラスコに分注し、１２１”Ｃで３０分間蒸気滅菌
する。これに予め同様の培養基に２ｇ°Ｃで２日間培養
しておいたケトメラ・ラフイケーラＰＦ−、ｇ乙♂の種
培養液ｑθｍｌを接種し、ｌざＱｒ、ｐ、ｍ、 の回
転振盪機で２１′Ｃ，１日間培養する。
三角フラスコに分注し、１２１”Ｃで３０分間蒸気滅菌
する。これに予め同様の培養基に２ｇ°Ｃで２日間培養
しておいたケトメラ・ラフイケーラＰＦ−、ｇ乙♂の種
培養液ｑθｍｌを接種し、ｌざＱｒ、ｐ、ｍ、 の回
転振盪機で２１′Ｃ，１日間培養する。
米胚芽ｇ、θ俤、市販フィツシュミールλ、θチを含む
液体培養基（ｐＨＡ、θ）２０！を３０１容ジャーファ
ーメンタ−に入れ、１２１′ｃで３θ分間蒸気滅菌する
。これに前記の種培養液ｆθＯｘｌを接種し・通気量２
０！／分、攪拌数Ｊｊ０ｒ、ｐ、ｍ、で２ざ°Ｃ，７日
間培養する。培養液を炉布式遠心分離機で濾過し、菌体
を除去して培養炉液ｌ乙ｌ（ｌよ７ ０ＮＰＧ単位／ｌ
ｘｌ＞を得る。
液体培養基（ｐＨＡ、θ）２０！を３０１容ジャーファ
ーメンタ−に入れ、１２１′ｃで３θ分間蒸気滅菌する
。これに前記の種培養液ｆθＯｘｌを接種し・通気量２
０！／分、攪拌数Ｊｊ０ｒ、ｐ、ｍ、で２ざ°Ｃ，７日
間培養する。培養液を炉布式遠心分離機で濾過し、菌体
を除去して培養炉液ｌ乙ｌ（ｌよ７ ０ＮＰＧ単位／ｌ
ｘｌ＞を得る。
この培養ろ液を限外濾過により水分および塩分を除去し
１．乙でとする。さらに低温下でアセトンｔ６ｊを添加
し、生ずる沈澱を分離し、遠心分離で不溶分を除去後、
凍結乾燥してβ−ガラクトシダーゼの粉末２０ｇ（ｌＡ
θθ０ＯＮＰＧ単位／ｆｌ。
１．乙でとする。さらに低温下でアセトンｔ６ｊを添加
し、生ずる沈澱を分離し、遠心分離で不溶分を除去後、
凍結乾燥してβ−ガラクトシダーゼの粉末２０ｇ（ｌＡ
θθ０ＯＮＰＧ単位／ｆｌ。
久３θＱＬａｃｔ単位／ｇ）を得る。収率：３１１ｇ係
。
。
第１図は本発明酵素の活性度に及ぼすｐＨの影響を示す
図である。 第２図は本発明酵素の安定性に及ぼすｐＨの影響を示す
図である。 第３図は本発明酵素の活性度に及ぼす温度の影響を示す
図である。 第４図は本発明酵素の安定性に及ぼす温度の影響を示す
図である。 尚、第１図および第３図において１曲線■は乳、糖を基
質とする場合５曲線■は０ＮＰＧを基質とする場合をそ
れぞれ表わす。 特許出願人 塩野義製薬株式会社 図面 第１図 ｐＨ 第コ 図 図面 第３図 第ｔ 図 温度 ＣＣ）
図である。 第２図は本発明酵素の安定性に及ぼすｐＨの影響を示す
図である。 第３図は本発明酵素の活性度に及ぼす温度の影響を示す
図である。 第４図は本発明酵素の安定性に及ぼす温度の影響を示す
図である。 尚、第１図および第３図において１曲線■は乳、糖を基
質とする場合５曲線■は０ＮＰＧを基質とする場合をそ
れぞれ表わす。 特許出願人 塩野義製薬株式会社 図面 第１図 ｐＨ 第コ 図 図面 第３図 第ｔ 図 温度 ＣＣ）
Claims (3)
- （１）ケトメラ属に属するβ−ガラクトシダーゼ産生菌
を培地に培養し、得られる培養物からβ−ガラクトシダ
ーゼを分離採取することを特徴とするβ−ガラクトシダ
ーゼの製造法。 - （２）ケトメラ属に属する菌株により産生されるβ−ガ
ラクトシダーゼ。 - （３）下記の理化学的性質を有する特許請求の範囲（２
）記載のβ−ガラクトシダーゼ。 （ａ）基質特異性 ０−ニトロフェニル−β−Ｄ−カラクトヒラノシド（以
下０ＮＰＧと略記）分解力に対する乳糖分解力の比率は
／−２゜ 山）至適ｐＨおよび安定声範囲 至適ｐＨ１４ｊ 安定ｐＨ範囲：２．Ｓ〜７ｊ （ｃ）作用適温の範囲 至適温度：乳糖を基質とする場合は約ＳＳ′Ｃｌ０ＮＰ
Ｇを基質とする場合は約ｔ Ｏ’Ｃ０（ｄ）ｐＨ，温度
などによる失活の条件安定温度範囲： ｐＨ３ではｇｊ
００以下。ｐＨ６では６０℃以下。 （ｅ）阻害、活性化および安定化。 硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅、塩化カルシウム、
ガラクトースおよびグルコースにより影響を受けない。 （ｆ）分子量 約ｉｔ万（セファデックスＧ−２００使用、ゲル濾過法
による。） ＜ｇ）等重点 ｐ）Ｉよ０−ｊ：３ （ｈ）元素分析値 Ｃ： Ｉｔ／、７８ 、 Ｈ： ｔ、１３％ 、 Ｎ
： １７０％
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8069682A JPS58198291A (ja) | 1982-05-12 | 1982-05-12 | β−ガラクトシダ−ゼおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8069682A JPS58198291A (ja) | 1982-05-12 | 1982-05-12 | β−ガラクトシダ−ゼおよびその製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58198291A true JPS58198291A (ja) | 1983-11-18 |
Family
ID=13725487
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8069682A Pending JPS58198291A (ja) | 1982-05-12 | 1982-05-12 | β−ガラクトシダ−ゼおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58198291A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2529013A2 (en) * | 2010-01-28 | 2012-12-05 | Academia Sinica | Novel -glucosidase and uses thereof |
-
1982
- 1982-05-12 JP JP8069682A patent/JPS58198291A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2529013A2 (en) * | 2010-01-28 | 2012-12-05 | Academia Sinica | Novel -glucosidase and uses thereof |
| EP2529013A4 (en) * | 2010-01-28 | 2013-12-11 | Academia Sinica | NOVEL BETA GLUCOSIDASE AND USES THEREOF |
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