JPH0458885A - アミラーゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規なアミラーゼとその製造法及びアミラーゼ
生産性微生物に関する。

［従来の技術］ アミラーゼは、でんぷんまたはその部分分解物に作用し
てα−１，４−グリコシド結合を分解する加水分解酵素
である。工業的には、でんぷん加工、食品加工、繊維加
工、醸造、医薬、臨床検査などに広く利用されており、
その起源も微生物、植物、動物と多岐にわたる。

アミラーゼの別の用途として、洗剤への配合の有用性が
示されている。具体的には、洗濯用洗剤、自動食器洗い
機用洗剤などへの配合があげられるが、使用時の条件を
考えると、アルカリに至適ｐ　Ｈを持ち、熱に対する安
定性が優れていることが望まれる。しかしながら、現在
工業的に使用されている酵素は、すべて中性アミラーゼ
であり、洗剤への配合という目的にかなった酵素はまだ
無い。したがって、すでに市販さ九ている洗剤配合酵素
もすべて中性アミラーゼであり、耐熱性という点では問
題無いが、十分に機能しているとは言い難い。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明は、至適ｐ　Ｈがアルカリ側にあり、高温、界面
活性剤存在下でも十分に活性を保持するアミラーゼを提
供しようとするものである。

［課題を解決するための手段］ 本発明者等は上記のような性質を有するアミラーゼを得
るべく、多数の微生物を分離・培養して検索した結果、
神奈川県下において採取した土壌より分離したバチルス
属に属するバクテリア、バチルスｓｐ、Ｓ　Ｄ　７７２
株が洗剤用酵素として優れた性質を有する新規アミラー
ゼを生産することを見いだし、本発明を完成するに至っ
た。

即ち、本発明は１）可溶性でんぷんを基質とした場合の
至適ｐＨが約１０、至適温度が約７０℃で、２）安定ｐ
ＨＭ城が５０℃、３０分処理したときｐＨ６−１，１で
あり、３）３０００ｐｐｍの直鎖アルキルベンゼンスル
ホン酸ナトリウム存在下（ｐ　Ｈ９，０）で３０℃、２
時間処理しても９５％以上の残存活性を有するなど、界
面活性剤に対しても極めて安定であり、４）分子量はＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定し
た場合４５，０００であり、そして５）等電点はポリア
クリルアミドゲル電気泳動法により測定した場合的４６
３である新規なアミラーゼ；バチルス属の上記アミラー
ゼ生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物から目
的のアミラーゼを採取することを特徴とする上記アミラ
ーゼの製造法；及び上記アミラーゼ生産能を有するバチ
ルス属の新規な菌株を提供せんとするものである。以下
に本発明のアミラーゼとその製造法およびこれに用いる
新規な菌株についてさらに詳しく説明する。

工２苗 本発明のアミラーゼの製造のために使用する微生物は、
前記の性質を有するアミラーゼを生産することが出来る
バチルス属に属するバクテリアであり次のような性質を
有する。

（ａ）形態 ■細胞の形及び大きさ　　桿菌、０．３〜０．６　Ｘ　
３〜５μｍ、培養条件により 多連鎖を生しる。

■運動性の有無　　　　　有り ■胞子　　　　　　　　　細胞の先端に円形、あるいは
楕円形で膨出し た胞子のうを形成する。

■ダラム染色　　　　　　陽性 （ｂ）各培地における生育状態 ■肉汁寒天平板培養　　　コロニーは淡黄色。円形、偏
平状で周縁は波 状。

■肉汁寒天斜面培養　　　淡黄色で、表面はザラついて
いる。拡布状で ■肉汁液体培養 ■ゼラチン液化 （ｃ）生理学的性質 ■硝酸塩の還元 ■脱窒反応 ■インドールの生成 ■硫化水素の生成 ■デンプンの加水分解 ■クエン６ｍの利用 ■無機窒素源の利用 ■色素の生成 ■ウレアーゼ ［相］オキシダーゼ ■カタラーゼ ＠生育の範囲（ｐＨ） 隆起はない。

培地は均一に濁る６ 色はない。

陽性。

着 還元する。

陰性 陰性 陰性 陽性 陰性 硝酸塩、アンモニウム 塩を利用する。

陰性 陰性 陽性 陽性 ニュートリエンド・ブ ロスを用いた検討で。

ｐＨ８，０，９，０で （温度） ｏｗ１素に対する態度 ■Ｏ−Ｆテスト は生育するが、ｐＨ ７、５，１０，０では 生育しない。

４０℃で生育するが ３５℃で生育しない。

６５℃で生育するが ７０℃で生育しない。

好気的 グルコースの場合は糖 を分解しない。麦芽糖。

ショ糖の場合は発酵。

［相］糖類の酸化とガスの生成 酸化 Ｌ−アラビノース Ｄ−キシロース Ｄ−グルコース Ｄ−マンノース Ｄ−フラクトース Ｄ−ガラクトース 麦芽糖 ± ガ　　ス （８）　シ　　ョ　　糖　　　　　　　　　±（９）乳
　　糖 （１０）トレハロース　　　　　＋ （１１）　Ｄ−ソルビット （１２）　Ｄ−マンニット （１３）イノジット （１４）グリセリン （１５）デンプン　　　　　　　＋ ［相］７％食塩存在下での生育　陽性 ■菌体内ＤＮＡノＧＣ含１ｋ　　　　４８％（モ／ｌ／
％）以上の菌学的性質から、型苗はバチルス属に属する
細菌と同定された。しかし、型苗は高温かつアルカリ側
のみ生育を示す菌であり、これらの特徴を示す菌種につ
いての記載はバーシーズ・マニュアル・オブ・システマ
チック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　　Ｍａ
ｎｕａｌ　　ｏｆ　　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　　Ｂａｃ
ｔ、ｅｒｉｏｌｏｇい、およびザ・ジーナス・バチルス
（Ｔｈｅ　ＧｅｎｕｓＢａｃｉｌｌｕｓ　　ＬＩＳＤＡ
　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　Ｎｏ、４２７）にはなく、新規な
菌株であることが認められた。そこで、バチルスｓｐ、
Ｓ　Ｄ　７７２と命名され、徴工研菌寄第１１４５６号
として寄託された。なお、成帯に記載のある類似菌（バ
チルス　ステアロサーモフィラス）と、型苗との主な性
状の相違を以下に示す。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　　　型苗 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｗ＋ｏｐｈｉｌｕｓｐＨ６，８で
の生育 ＋ ５％ＮａＣ１存在下での生育 ＋ 本発明のアミラーゼを製造するにあたって、上記の微生
物の培養のための培地は格別である必要はなく、栄養源
としては通常培養に用いられているものが広く利用でき
る。炭素源としては同化できる炭素化合物またはこれを
含有するものであれば良く、たとえばグルコース、マル
トース、でんぷんなどが用いられる。窒素源としても同
化可能な窒素化合物、またはこれを含有するものであれ
ば良く１例えばペプトン、大豆粉、Ｃ８Ｌなどが用いら
れる。また、無機塩類としては燐酸塩、マグネシウム塩
などの塩類が使用される。その他、菌の生育及び酵素生
産に必要な各種の有機物、無機物、またはこれらを含有
するもの、例えば酵母エキス、ビタミン類などを培地に
添加することが出来る。培養は、液体培養が好ましく、
培養条件は培地転成により異なる。生産の目的物である
アミラーゼの生産に最も有利な条件は、好気的な条件下
培養温度が約５５°Ｃであり、培養時間は１２時間から
３日程度であり、アミラーゼの生産量が最高に達したと
きに培養を終了すれば良い。培地のｐＨは８以上が良く
、９．５〜１０がアミラーゼ生産に好適である。本発明
のアミラーゼは主として培養液中に分泌され、蓄積され
る。

１１幕１１ 得られた培養液からのアミラーゼの採取は、酵素を取得
するための常法にしたがって分離、精製することができ
る。ろ過、遠心分離など適当な方法により、　培地中の
菌体など固形物を分離して上滑液を得ることが出来る。

この分離液を濃縮し、噴霧乾燥する方法、凍結乾燥する
方法、塩析法、親水性有機溶媒での沈澱法などによりア
ミラーゼを得ることが出来る。さらに、酵素を精製する
には、イオン交換樹脂、ゲルろ過払などの精製手段を単
独または複数組み合わせる方法がある。

１１勿且１ 本発明のアミラーゼについて、その詳細な性質を記載す
る。

１、酵素力価の測定方法。

可溶性でんぷんの１％水溶液を基質として用い測定する
。具体的には、緩衝液０．５ｍｌに基質０　、５ｍｌを
加え、所定温度で数分インキュベートした後酵素液を０
．０５ｍ１加え反応を開始する。１０分後、ＩＮ塩酸を
１．ｍｌ加えることで反応を停止する。反応を停止した
液から０．４＋１を分取し、５ｍｌの水で希釈する。

これに０．５％沃素−沃化カリウム溶液０．１２５ｍ１
を加え発色させた後、波長７００ｎｍで比色定量する。

酵素力価は、上記の条件で１分間に未反応状態のでんぷ
んと沃素の発色による吸光度の１０％相当を減少させる
酵素量を０．１単位とした。

２、酵素の性質 （１）作用 本酵素は、でんぷんあるいはその部分分解物に作用して
、α−１，４−グリコシド結合を加水分解し、主として
デキストリン、及びマルトオリゴ糖を生成する。また、
その分解は、エンド型である。

（２）至適ＰＨ ブリトン−ｏビンソン（ＢｒｊＬｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓ
ｏｎ）の広域緩衝液（ＰＨ６〜１２）を用い、可溶性で
んぷんを基質として３０℃で活性測定した場合、約１０
である。反応ｐ）（と活性との関係を第１図に示す。

（３）安定ＰＨ範囲 ブリトン・ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓ
ｏｎ）の広域緩衝液（ｐＨ３−１２）を用い、各ＰＨで
５０℃、３０分間放ＮＩ、ｆ：後、３０℃、ｐＨ１０で
の活性を測定した。安定ＰＨは６〜１１である。処理ｐ
Ｈと残存活性との関係を第２図に示す。

（４）至適温度 ５０ｍＭ　　ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ９）を用いて測定し
た場合、至適温度は約７０℃である。反応温度と活性と
の関係を第３図に示す。

（５）熱安定性 ５０ｍＭ　　ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ９）の下で、各温度
（３０℃〜８０℃）で１０分間熱処理し、水冷後３０℃
での残存活性を測定した。２ｍＭ　エチレンジアミンテ
トラ酢酸存在下では、６０℃まで安定でそれ以上の温度
では急激に失活したのに対し、２ｍＭＣａＣｌ２存在化
では８０’Ｃ処理後もまだ５０％以上の活性を残存して
いる。熱処理温度と残存活性の関係を第４図に示す。

（６）界面活性剤の影響。

直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム３０００ｐ
ｐｍ存在下（ｐＨ９）で３０℃、２時間処理してもほと
んど失活しない。処理時間と残存活性の関係を第５図に
示す。

（７）分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により得ら
れた分子量は、約４５，０００である。

（８）等電点 等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって測定
した結果、約４．３である。

本酵素は、バチルス属に属する菌株バチルスｓｐ、Ｓ　
Ｄ　７７２株によって生産され、アルカリ領域に最適ｐ
Ｈを有するものであり、特開平２−４９５８４に記載さ
れている耐熱アルカリアミラーゼと比較した場合は、本
酵素の分子量が４５，０００であるのに対し、上記アミ
ラーゼの分子量は７８．０００であること、並びに等電
点が４．３に対して５．３であることより明らかに別の
酵素である。

［発明の効果］ 本酵素は、高温、アルカリ領域で高い活性を示す酵素で
ある。現在、高温で作用するアミラーゼはすべて中性酵
素であるし、アルカリ酵素は熱に弱いといった欠点があ
り１両方を満足する酵素はまだ市販されていない２本酵
素を用いることにょリ、高温アルカリ領域でのでんぷん
分解を大幅に改善することが出来る。例えば、繊維工業
においては、精練漂白工程中アルカリ条件下での糊抜き
工程に使用することができ、従来とは違った風合いを出
すことが可能になる。また洗剤成分である陰イオン性界
面活性剤に対する安定性が高いため、洗剤用酵素として
使用でき、洗浄力の増強を図ることが出来る。更に、自
動食器洗い積用洗剤に配合することにより、飯粒などの
でんぷん性の汚れに対する洗浄効果を向上させることが
可能である。

この他にも、アルカリ性領域ででんぷんを加工する工程
など極めて広範囲の分野に使用され得る。

次に、本発明について代表的な実施例を挙げて更に具体
的に説明する。

実１１例」− ペプトン２％、でんぷん（溶性）２％、酵母エキス０．
１％、リン酸水素二カリウム０．１％、硫酸マグネシウ
ム０．０２％、炭酸ナトリウム１％からなる液体培地を
常法により滅菌し、無菌的に試験管に分注した。これに
バチルスｓｐ、Ｓ　Ｄ　７７２株を接種し、５５℃で　
４８時間振盪培養した。培養液を遠心分離し、その上清
のアミラーゼ活性を測２したところ１．．１６Ｕ　／　
ｍ　１であった。

支五璽ユ ペプトン３．０％、でんぷん（溶性）１．０％、小麦ふ
すま　１．０％、ＤＥ−５０１，０％、酵母エキス０．
５％、リン酸水素二カリウム０．５％、硫酸マグネシウ
ム０．０５％、炭酸ナトリウム　１．０％からなる液体
培地を常法により滅菌し、５Ｌ培養槽に入れた。

これにあらかじめ培養しておいたバチルスｓｐ、５Ｄ７
７２株を接種し、５５°Ｃで３０時間通気攪拌培養を行
なった。この培養液を遠心分離し、上清を得た。この上
清のアミラーゼ活性は　２．４９Ｕ　／ｍ１であった。

この上清１．８Ｌを限外ろ過膜により濃縮し、１８．３
Ｕ　／　ｍ　ｌの試料液２７５　ｍ　ｌを得た。

実」１事［ａ 実施例２で得られた試料液から本発明のアミラーゼを精
製した。

まず、試料液からエタノール沈澱法により５０−７０％
画分の沈澱を得た。この沈澱を約２００ｍ１の水に溶解
し、硫酸アンモニウム沈澱法により４０−７０％画分の
沈澱を得た。さらに、この沈澱を　２０　ｍ　Ｍ　　酢
酸緩衝液（ｐＨ６）に溶かし、透析により股塩後、同じ
緩衝液で平衡化したＣＭ（カルボキシメチル）陽イオン
交換樹脂カラムにより不純物除去を行なった。同操作で
得られた活性画分を、２０ｍＭトリス−塩酸ｍ暫液に透
析し、緩衝液を置換した後、同緩衝液で平衡化したＤＥ
ＡＥ　（ジエチルアミノエチル）陰イオン交換樹脂カラ
ム（２０１１１Ｉφ、３０ｃｍ）に吸着させ、塩化ナト
リウムの濃度勾配（０−ＬＭ）で溶出させた。得られた
活性両分５０ｍ１を限外ろ過により２　ｍ　ｌに濃縮し
、セファデックスＧ　−７５（２５ｍｍφ、９０ｃ＋ｎ
）によるゲルろ過を行なった。活性は、２つのピークと
して検出され、後方のピークが電気泳動的にほぼ均一の
標品であることが確認された。この精製標品を用いて、
至適ｐＨ，ｐＨ安定性、至適温度、熱安定性、界面活性
剤に対する安定性を検討した結果は第１図〜第５図に示
した通りである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、反応ｐＨと活性との関係を示すグラフである
。 第２図は、処理ｐＨと残存活性を示すグラフである。 第３図は、反応温度と活性の関係を示すグラフである。 第４図は、熱処理温度と残存活性の関係を示すグラフで
ある。 第５図は、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム
３０００ｐｐｍの存在下での安定性を示すグラフである
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の性質を有するアミラーゼ； （１）至適ｐＨ、至適温度 可溶性でんぷんを基質とした場合の至適ｐＨが約１０、
   至適温度が約７０℃である。 （２）安定ｐＨ ５０℃で３０分処理したときｐＨ６〜１１まで安定であ
   る。 （３）界面活性剤の影響 ３０００ｐｐｍの直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナト
   リウム存在下（ｐＨ９．０）で３０℃、２時間処理して
   も９５％以上の残存活性を有する。 （４）分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定
   した分子量が約４５，０００である。 （５）等電点 等電点電気泳動によって測定した等電点が約４．３であ
   る。 ２、バチルス属に属し請求項１に記載のアミラーゼ生産
   能を有する微生物を培地に培養し、培養物から目的とす
   るアミラーゼを採取することを特徴とする請求項１に記
   載のアミラーゼの製造方法。