JP2000060546A - 新規アルカリアミラ―ゼおよびその製造法 - Google Patents
新規アルカリアミラ―ゼおよびその製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 アルカリ環境下においても、強力な活
性を有する新規アルカリアミラーゼを提供すること。 【解決手段】 下記の理化学的性質を有するアルカ
リアミラーゼ。 (a) 作用および基質特異性：デンプン、アミロース、ア
ミロペクチン、およびそれらの部分分解物のα-1,4-グ
リコシド結合を特異的に加水分解し、主としてデキスト
リンおよびマルトオリゴ糖を生成する。 (b) 最適pH：最適pHは、10.0である。 (c) 安定pH：37℃、1時間の処理条件で、pH 7.5〜12.0
で安定である。 (d) 分子量：約77,500ダルトンである。
性を有する新規アルカリアミラーゼを提供すること。 【解決手段】 下記の理化学的性質を有するアルカ
リアミラーゼ。 (a) 作用および基質特異性：デンプン、アミロース、ア
ミロペクチン、およびそれらの部分分解物のα-1,4-グ
リコシド結合を特異的に加水分解し、主としてデキスト
リンおよびマルトオリゴ糖を生成する。 (b) 最適pH：最適pHは、10.0である。 (c) 安定pH：37℃、1時間の処理条件で、pH 7.5〜12.0
で安定である。 (d) 分子量：約77,500ダルトンである。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なアルカリア
ミラーゼ、その製造法および該アルカリアミラーゼ産生
能を有する好アルカリ性放線菌に関する。
ミラーゼ、その製造法および該アルカリアミラーゼ産生
能を有する好アルカリ性放線菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】アミラーゼはデンプン等に作用して、そ
のグリコシド結合を加水分解する酵素であり、近年台所
用洗剤等に配合され始めている。アミラーゼ自体は細
菌、酵母、糸状菌等の微生物により広く生産されること
が知られているが、その多くは最適pHが酸性〜中性付近
にある。アルカリアミラーゼについては、いわゆる好ア
リカリ性微生物と呼ばれる一群の細菌によって生産され
ることが知られている（堀越弘毅、秋葉晄彦編：好アル
カリ性微生物、p158〜159、学会出版センター）。しか
しながら、これらのアルカリアミラーゼ生産菌はいずれ
も好アルカリ性のバチルス属菌（枯草菌）であり、同じ
好アルカリ性放線菌については、最適pHを9.0付近に示
す好アルカリ性ストレプトマイセス属由来のアルカリア
ミラーゼ（特開昭61-209588）が唯一知られているのみ
である。一方、洗剤配合用のアミラーゼとして望ましい
アミラーゼは、洗浄条件下の洗剤溶液中においても充分
な活性を維持するものである。すなわち、現状の洗剤等
は配合組成の関係からそのpHが10以上のアルカリ領域に
あることから、これらに配合する酵素はその最適pHを10
以上に示すアルカリアミラーゼが最適である。
のグリコシド結合を加水分解する酵素であり、近年台所
用洗剤等に配合され始めている。アミラーゼ自体は細
菌、酵母、糸状菌等の微生物により広く生産されること
が知られているが、その多くは最適pHが酸性〜中性付近
にある。アルカリアミラーゼについては、いわゆる好ア
リカリ性微生物と呼ばれる一群の細菌によって生産され
ることが知られている（堀越弘毅、秋葉晄彦編：好アル
カリ性微生物、p158〜159、学会出版センター）。しか
しながら、これらのアルカリアミラーゼ生産菌はいずれ
も好アルカリ性のバチルス属菌（枯草菌）であり、同じ
好アルカリ性放線菌については、最適pHを9.0付近に示
す好アルカリ性ストレプトマイセス属由来のアルカリア
ミラーゼ（特開昭61-209588）が唯一知られているのみ
である。一方、洗剤配合用のアミラーゼとして望ましい
アミラーゼは、洗浄条件下の洗剤溶液中においても充分
な活性を維持するものである。すなわち、現状の洗剤等
は配合組成の関係からそのpHが10以上のアルカリ領域に
あることから、これらに配合する酵素はその最適pHを10
以上に示すアルカリアミラーゼが最適である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、10.0以上の
アルカリ領域に最適pHを有する、新規なアルカリアミラ
ーゼを提供することを目的とする。また本発明は、上記
アルカリアミラーゼを生産する微生物を利用した上記ア
ルカリアミラーゼの製造法を提供することを目的とす
る。
アルカリ領域に最適pHを有する、新規なアルカリアミラ
ーゼを提供することを目的とする。また本発明は、上記
アルカリアミラーゼを生産する微生物を利用した上記ア
ルカリアミラーゼの製造法を提供することを目的とす
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記のような観点から、
本発明者らはアルカリ環境下で強力なデンプン分解力を
有するアルカリアミラーゼを生産する微生物を、主に好
アルカリ性放線菌を中心として検索した結果、特願平10
-163441号に記載の新規アルカリプロテアーゼ生産菌で
あるTOTO-9805株（FERM BP-6359）が、好気的培養によ
り目的とする新規アルカリアミラーゼを効率良く生産す
ることを見い出し、本発明を完成するに至った。
本発明者らはアルカリ環境下で強力なデンプン分解力を
有するアルカリアミラーゼを生産する微生物を、主に好
アルカリ性放線菌を中心として検索した結果、特願平10
-163441号に記載の新規アルカリプロテアーゼ生産菌で
あるTOTO-9805株（FERM BP-6359）が、好気的培養によ
り目的とする新規アルカリアミラーゼを効率良く生産す
ることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】すなわち、本発明は、下記の理化学的性質
を有するアルカリアミラーゼを提供する。 (a) 作用および基質特異性：デンプン、アミロース、ア
ミロペクチン、およびそれらの部分分解物のα-1,4-グ
リコシド結合を特異的に加水分解し、主としてデキスト
リンおよびマルトオリゴ糖を生成する。 (b) 最適pH：作用最適pHは、10.0である。 (c) 安定pH：37℃、１時間の処理条件でpH7.0〜12.0で
安定である。 (d) 最適温度：作用最適温度は55℃である。 (e) 安定温度：pH10.0、10分間の処理条件で、カルシウ
ム無添加の場合は45℃、カルシウム添加の場合では50℃
まで安定である。 (f) 分子量：SDS電気泳動法で約77,500ダルトンであ
る。また、本発明による上記新規アルカリアミラーゼの
製造法は、好アルカリ性ストレプトマイセス属に属し、
上記アルカリアミラーゼの産生能を有する微生物を培養
する工程と、該工程で得られる培養物より該新規アルカ
リアミラーゼを分離する工程を含んでなる。
を有するアルカリアミラーゼを提供する。 (a) 作用および基質特異性：デンプン、アミロース、ア
ミロペクチン、およびそれらの部分分解物のα-1,4-グ
リコシド結合を特異的に加水分解し、主としてデキスト
リンおよびマルトオリゴ糖を生成する。 (b) 最適pH：作用最適pHは、10.0である。 (c) 安定pH：37℃、１時間の処理条件でpH7.0〜12.0で
安定である。 (d) 最適温度：作用最適温度は55℃である。 (e) 安定温度：pH10.0、10分間の処理条件で、カルシウ
ム無添加の場合は45℃、カルシウム添加の場合では50℃
まで安定である。 (f) 分子量：SDS電気泳動法で約77,500ダルトンであ
る。また、本発明による上記新規アルカリアミラーゼの
製造法は、好アルカリ性ストレプトマイセス属に属し、
上記アルカリアミラーゼの産生能を有する微生物を培養
する工程と、該工程で得られる培養物より該新規アルカ
リアミラーゼを分離する工程を含んでなる。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明によるアルカリアミラーゼ
は、pH10以上の強いアルカリ環境下においても、デンプ
ン等を強力に加水分解する。したがって、食器用洗剤お
よび衣料用洗剤に洗浄効果を高める目的で配合された
り、調理台などデンプンを含む汚れの発生しやすい場所
用の洗剤に添加されれば、極めて効果的である。さらに
本アルカリアミラーゼは、医薬、試薬等を含む広範囲の
工業分野で利用され得る。また、本発明による菌株は、
上記アルカリアミラーゼを効率良く菌体外に分泌するの
で、簡便な工程で高効率にその生産を行うことができる
点で有利である。上記洗浄剤組成物としては、上記アル
カリアミラーゼ単独、又は公知の洗浄剤成分、例えば、
各種界面活性剤、各種ビルダー（キレート剤、アルカリ
剤など）、再汚染防止剤、漂白剤、上記アルカリアミラ
ーゼ以外の酵素（他のアミラーゼ、プロテアーゼ、セル
ラーゼなど）、香料、色素などの一種又は２種以上を併
用することができる。洗浄剤組成物などの形態は、液
状、スラリー状、粉状、粒状、錠剤状など任意の形態と
することができる。洗浄剤組成物としては、衣料用、食
器洗い用、台所用等種々の用途に用いられるが、食器洗
い乾燥機用洗剤及び台所用洗剤として用いるのが好まし
い。本発明による新規アルカリアミラーゼは、微生物を
用いて生産することができる。特に好ましくは、本発明
によるアルカリアミラーゼは、新規アルカリプロテアー
ゼの生産菌として特願平10-163441号に記載の、ストレ
プトマイセス エスピー（Streptomyces sp.）TOTO-98
05株（FERM BP-6359）により生産される。この菌株は、
TOTO- 9305株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６４０）の継代培養
により得られた変異株である。この菌株は好アルカリ性
放線菌であり、次の第１表及び第２表に示すように親株
であるTOTO- 9305株と全く同様の菌学的性質を有する。
なお、本菌株は好アルカリ微生物であり、通常の中性培
地では生育しないか、あるいは生育が極めて不良である
ため、第１表及び第２表の菌学的性質の検討に際しては
0.5%Na2CO3添加のアルカリ性培地を用いた。
は、pH10以上の強いアルカリ環境下においても、デンプ
ン等を強力に加水分解する。したがって、食器用洗剤お
よび衣料用洗剤に洗浄効果を高める目的で配合された
り、調理台などデンプンを含む汚れの発生しやすい場所
用の洗剤に添加されれば、極めて効果的である。さらに
本アルカリアミラーゼは、医薬、試薬等を含む広範囲の
工業分野で利用され得る。また、本発明による菌株は、
上記アルカリアミラーゼを効率良く菌体外に分泌するの
で、簡便な工程で高効率にその生産を行うことができる
点で有利である。上記洗浄剤組成物としては、上記アル
カリアミラーゼ単独、又は公知の洗浄剤成分、例えば、
各種界面活性剤、各種ビルダー（キレート剤、アルカリ
剤など）、再汚染防止剤、漂白剤、上記アルカリアミラ
ーゼ以外の酵素（他のアミラーゼ、プロテアーゼ、セル
ラーゼなど）、香料、色素などの一種又は２種以上を併
用することができる。洗浄剤組成物などの形態は、液
状、スラリー状、粉状、粒状、錠剤状など任意の形態と
することができる。洗浄剤組成物としては、衣料用、食
器洗い用、台所用等種々の用途に用いられるが、食器洗
い乾燥機用洗剤及び台所用洗剤として用いるのが好まし
い。本発明による新規アルカリアミラーゼは、微生物を
用いて生産することができる。特に好ましくは、本発明
によるアルカリアミラーゼは、新規アルカリプロテアー
ゼの生産菌として特願平10-163441号に記載の、ストレ
プトマイセス エスピー（Streptomyces sp.）TOTO-98
05株（FERM BP-6359）により生産される。この菌株は、
TOTO- 9305株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６４０）の継代培養
により得られた変異株である。この菌株は好アルカリ性
放線菌であり、次の第１表及び第２表に示すように親株
であるTOTO- 9305株と全く同様の菌学的性質を有する。
なお、本菌株は好アルカリ微生物であり、通常の中性培
地では生育しないか、あるいは生育が極めて不良である
ため、第１表及び第２表の菌学的性質の検討に際しては
0.5%Na2CO3添加のアルカリ性培地を用いた。
【０００７】本菌株TOTO-9805 株は第１表の結果より、
形態学的に放線菌、ストレプトマイセス属の特徴を有す
る。また、細胞壁にL-L-ジアミノピメリン酸を含有する
等のことから、本菌株はストレプトマイセス属に属する
一菌種と分類される。TOTO-9805 株は、各種寒天培地上
での気菌糸と胞子の色調から白色シリーズに属するこ
と、胞子表面は平滑であること、胞子の連鎖はおおむね
直状であること、メラニン色素は生成しないこと等の性
質を有する。
形態学的に放線菌、ストレプトマイセス属の特徴を有す
る。また、細胞壁にL-L-ジアミノピメリン酸を含有する
等のことから、本菌株はストレプトマイセス属に属する
一菌種と分類される。TOTO-9805 株は、各種寒天培地上
での気菌糸と胞子の色調から白色シリーズに属するこ
と、胞子表面は平滑であること、胞子の連鎖はおおむね
直状であること、メラニン色素は生成しないこと等の性
質を有する。
【０００８】
【表１】 第１表 TOTO-9805 株の菌学的諸性質
形態
生理的性質
各炭素源の同化性
【０００９】
【表２】 第２表 各培地における生育状況
＊１ メラニンなし
【００１０】本菌株は、親株であるTOTO- 9305株とは全
く異なるプロテアーゼを産生する点で異なっている。従
って、本菌株TOTO-9805 株は親株TOTO- 9305株の変異株
と判断し、ストレプトマイセス エスピー TOTO-9805
（Streptomyces sp. TOTO-9805）と命名した。なお、本
菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号
（FERM BP-6359)のもと寄託されている。 培養条件 上記菌株は好アルカリ性放線菌であるため、その培養は
アルカリ領域で行う必要がある。培地をアルカリ性にす
るための方法としては格別である必要はなく、通常の培
地中に例えば炭酸ナトリウムあるいは炭酸水素ナトリウ
ムを添加するだけで良い。炭素源としては各種デンプ
ン、デキストリン、セルロース等の多糖類をはじめとし
てグルコース、グリセリン、水飴等の単糖やオリゴ糖を
用いることができる。窒素源としては、硝酸塩、アンモ
ニウム塩などの無機物をはじめ、尿素、ペプトン、乾燥
酵母、酵母エキス、ダイズ粉、コーンスチープリカー、
カゼイン、肉エキス、アミノ酸などが用いられる。これ
らの炭素源や窒素源の他に各種無機塩、例えばマグネシ
ウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩などを必
要に応じて添加しても良い。培地に加えるアルカリ源と
しては、0.5〜2.0%程度の炭酸ナトリウム、炭酸水素ナ
トリウム等の炭酸塩あるいは水酸化ナトリウム、アンモ
ニアなどが使用でき、培地のpHは8.0〜11.0程度が望ま
しい。培養は、このような培地中で培養温度20〜40℃、
好ましくは25〜37℃で2日〜5日間好気的に撹袢または振
とうしながら行う。本発明による新規なアルカリアミラ
ーゼは、上記のような培養条件のもとで、主として培養
液中に分泌され、蓄積される。
く異なるプロテアーゼを産生する点で異なっている。従
って、本菌株TOTO-9805 株は親株TOTO- 9305株の変異株
と判断し、ストレプトマイセス エスピー TOTO-9805
（Streptomyces sp. TOTO-9805）と命名した。なお、本
菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号
（FERM BP-6359)のもと寄託されている。 培養条件 上記菌株は好アルカリ性放線菌であるため、その培養は
アルカリ領域で行う必要がある。培地をアルカリ性にす
るための方法としては格別である必要はなく、通常の培
地中に例えば炭酸ナトリウムあるいは炭酸水素ナトリウ
ムを添加するだけで良い。炭素源としては各種デンプ
ン、デキストリン、セルロース等の多糖類をはじめとし
てグルコース、グリセリン、水飴等の単糖やオリゴ糖を
用いることができる。窒素源としては、硝酸塩、アンモ
ニウム塩などの無機物をはじめ、尿素、ペプトン、乾燥
酵母、酵母エキス、ダイズ粉、コーンスチープリカー、
カゼイン、肉エキス、アミノ酸などが用いられる。これ
らの炭素源や窒素源の他に各種無機塩、例えばマグネシ
ウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩などを必
要に応じて添加しても良い。培地に加えるアルカリ源と
しては、0.5〜2.0%程度の炭酸ナトリウム、炭酸水素ナ
トリウム等の炭酸塩あるいは水酸化ナトリウム、アンモ
ニアなどが使用でき、培地のpHは8.0〜11.0程度が望ま
しい。培養は、このような培地中で培養温度20〜40℃、
好ましくは25〜37℃で2日〜5日間好気的に撹袢または振
とうしながら行う。本発明による新規なアルカリアミラ
ーゼは、上記のような培養条件のもとで、主として培養
液中に分泌され、蓄積される。
【００１１】酵素の採取
上記培養液から本発明による酵素を採取、精製するため
には、既知の精製法を単独もしくは併用して利用するこ
とができる。本酵素は主として菌体外（培養液中）に分
泌されるため、例えば濾過あるいは遠心分離で菌体を除
去することにより容易に粗酵素液を得ることができる。
この粗酵素は、さらに既知の精製法、例えば硫安などに
よる塩析；メタノール、エタノール、アセトンなどの有
機溶媒による沈殿法；活性化デンプン等による吸着法；
限外濾過；ゲル濾過クロマトグラフィー；イオン交換ク
ロマトグラフィー；疎水クロマトグラフィー、アフィニ
テークロマトグラフィー、その他の各種クロマトグラフ
ィーを、単独もしくは併用して、精製することができ
る。好ましい精製法を示せば以下の通りである。まず、
培養濾液に80%飽和硫安を添加して塩析を行い、得られ
た沈殿を緩衝液に溶解する。次いでDEAE-Toyopearl650M
（東ソー社製）によるイオン交換クロマトグラフィー、
α-サイクロデキストリン・セファロースによるアフィ
ニテー・クロマトグラフィー、Superdex 75（FPLC、フ
ァルマシア製）によるゲル濾過を順次行うことにより、
SDS電気泳動的に均一な精製酵素を得ることができる。
には、既知の精製法を単独もしくは併用して利用するこ
とができる。本酵素は主として菌体外（培養液中）に分
泌されるため、例えば濾過あるいは遠心分離で菌体を除
去することにより容易に粗酵素液を得ることができる。
この粗酵素は、さらに既知の精製法、例えば硫安などに
よる塩析；メタノール、エタノール、アセトンなどの有
機溶媒による沈殿法；活性化デンプン等による吸着法；
限外濾過；ゲル濾過クロマトグラフィー；イオン交換ク
ロマトグラフィー；疎水クロマトグラフィー、アフィニ
テークロマトグラフィー、その他の各種クロマトグラフ
ィーを、単独もしくは併用して、精製することができ
る。好ましい精製法を示せば以下の通りである。まず、
培養濾液に80%飽和硫安を添加して塩析を行い、得られ
た沈殿を緩衝液に溶解する。次いでDEAE-Toyopearl650M
（東ソー社製）によるイオン交換クロマトグラフィー、
α-サイクロデキストリン・セファロースによるアフィ
ニテー・クロマトグラフィー、Superdex 75（FPLC、フ
ァルマシア製）によるゲル濾過を順次行うことにより、
SDS電気泳動的に均一な精製酵素を得ることができる。
【００１２】酵素の性質
本発明によるアルカリアミラーゼの性質は以下に示され
る通りである。なお、以下において活性測定法とは次の
方法をいうものとする。 （活性測定法)1%可溶性デンプン水溶液0.5 mlに0.2 Mグ
リシン・NaCl・NaOH緩衝液（pH 10.0）0.3 mlを加え、
適当に希釈した酵素液0.2 mlを添加して37℃で10分反応
させた。反応により生じた還元糖をSomogyi-Nelson法に
より測定した。すなわち、反応液0.2 mlを0.2 mlのSomo
gyi液に加えて反応を停止させ、100℃で10分加熱後、室
温まで冷却した。これにNelson液0.4 mlを加えて発色さ
せ、室温で15分間放置した。蒸留水3.2 mlを加えて全量
を4.0 mlとした後、500 nmの吸光度を測定した。酵素力
価：1 Uは1分間に1μmolのマルトースを遊離させる酵素
量と定義した。
る通りである。なお、以下において活性測定法とは次の
方法をいうものとする。 （活性測定法)1%可溶性デンプン水溶液0.5 mlに0.2 Mグ
リシン・NaCl・NaOH緩衝液（pH 10.0）0.3 mlを加え、
適当に希釈した酵素液0.2 mlを添加して37℃で10分反応
させた。反応により生じた還元糖をSomogyi-Nelson法に
より測定した。すなわち、反応液0.2 mlを0.2 mlのSomo
gyi液に加えて反応を停止させ、100℃で10分加熱後、室
温まで冷却した。これにNelson液0.4 mlを加えて発色さ
せ、室温で15分間放置した。蒸留水3.2 mlを加えて全量
を4.0 mlとした後、500 nmの吸光度を測定した。酵素力
価：1 Uは1分間に1μmolのマルトースを遊離させる酵素
量と定義した。
【００１３】(1) 作用および基質特異性
デンプン、アミロース、アミロペクチン、およびそれら
の部分分解物等のα-1,4-グリコシド結合を特異的に加
水分解し、主としてデキストリンおよびマルトオリゴ糖
を生成する。 (2) 最適pHおよび安定pH 上記の活性測定法にもとづき、本酵素に及ぼすpHの影響
を調べた。なお、緩衝液としてグリシン・塩酸緩衝液
（pH3.0〜3.5）、酢酸緩衝液（pH4.0〜5.5）、リン酸緩
衝液（pH6.0〜7.0）、トリス塩酸緩衝液（pH7.0〜8.
0）、ホウ酸緩衝液（pH8.0〜10.0）、グリシン・NaCl・
NaOH緩衝液（pH10.0〜12.0）、KCl・NaOH緩衝液（pH12.
5〜13.0）を使用した。図１に活性の最大値を100とした
場合の各pHにおける相対活性を示した。図１により、本
酵素の最適pHは37℃において10.0であり、かつそれ以上
のpH域（〜12.0）においても78%以上の相対活性を示し
た。同様に本酵素のpH安定性について図２に示した。本
酵素を各pHの緩衝液中に37℃で1時間保持した後、その
残存活性を未処理（4℃で1時間放置）の酵素活性を100
とした残存活性として示した。図２から、本酵素は上記
処理条件下においてpH7.5〜12.0までの極めて広範囲のp
H域で安定であることが分かる。
の部分分解物等のα-1,4-グリコシド結合を特異的に加
水分解し、主としてデキストリンおよびマルトオリゴ糖
を生成する。 (2) 最適pHおよび安定pH 上記の活性測定法にもとづき、本酵素に及ぼすpHの影響
を調べた。なお、緩衝液としてグリシン・塩酸緩衝液
（pH3.0〜3.5）、酢酸緩衝液（pH4.0〜5.5）、リン酸緩
衝液（pH6.0〜7.0）、トリス塩酸緩衝液（pH7.0〜8.
0）、ホウ酸緩衝液（pH8.0〜10.0）、グリシン・NaCl・
NaOH緩衝液（pH10.0〜12.0）、KCl・NaOH緩衝液（pH12.
5〜13.0）を使用した。図１に活性の最大値を100とした
場合の各pHにおける相対活性を示した。図１により、本
酵素の最適pHは37℃において10.0であり、かつそれ以上
のpH域（〜12.0）においても78%以上の相対活性を示し
た。同様に本酵素のpH安定性について図２に示した。本
酵素を各pHの緩衝液中に37℃で1時間保持した後、その
残存活性を未処理（4℃で1時間放置）の酵素活性を100
とした残存活性として示した。図２から、本酵素は上記
処理条件下においてpH7.5〜12.0までの極めて広範囲のp
H域で安定であることが分かる。
【００１４】(3) 最適温度および安定温度
上記活性測定法に準じて、本酵素に及ぼす温度の影響を
調べた。図３に最大活性を100とした場合の各温度にお
ける相対活性を示した。図３から、本酵素の最適温度は
55℃であることが分かる。また、本酵素を100 mMトリス
塩酸緩衝液（pH7.0)に添加し、40〜65℃の範囲の各条件
下で10分間保持した後、その残存活性を測定した。その
結果を図４に示した。図４により、本酵素は上記条件下
でカルシウム無添加の場合は45℃まで、カルシウムを添
加した場合は50℃まで安定であることが分かる。 (4) 分子量 本酵素の分子量をSDS電気泳動法により測定したとこ
ろ、分子量は約77,500ダルトンであった。
調べた。図３に最大活性を100とした場合の各温度にお
ける相対活性を示した。図３から、本酵素の最適温度は
55℃であることが分かる。また、本酵素を100 mMトリス
塩酸緩衝液（pH7.0)に添加し、40〜65℃の範囲の各条件
下で10分間保持した後、その残存活性を測定した。その
結果を図４に示した。図４により、本酵素は上記条件下
でカルシウム無添加の場合は45℃まで、カルシウムを添
加した場合は50℃まで安定であることが分かる。 (4) 分子量 本酵素の分子量をSDS電気泳動法により測定したとこ
ろ、分子量は約77,500ダルトンであった。
【００１５】
【実施例】次に本発明を以下の実施例により更に詳細に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。 実施例１ 粗酵素粉末の調製 ストレプトマイセス エスピー TOTO-9805株の前培養
液100ml（37℃、4日間振とう培養）を、小麦デンプン1.
0%、酵母エキス0.8%、K2HPO4 0.1%、MgSO4・7H 2O 0.05
%、および別殺菌して添加したNa2CO3 1.0%を含有する培
地（pH9.0）4,500 mlを入れた小型ジャーファーメンタ
ーに植菌し、37℃で4日間、通気量1 v/v/min、回転数20
0rpmで培養を行った。培養終了後、培養液をハイフロス
ーパーセルで濾過して菌体を除去した。これにより、約
1.1 U/mlの粗酵素液約3,900 mlを得た。
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。 実施例１ 粗酵素粉末の調製 ストレプトマイセス エスピー TOTO-9805株の前培養
液100ml（37℃、4日間振とう培養）を、小麦デンプン1.
0%、酵母エキス0.8%、K2HPO4 0.1%、MgSO4・7H 2O 0.05
%、および別殺菌して添加したNa2CO3 1.0%を含有する培
地（pH9.0）4,500 mlを入れた小型ジャーファーメンタ
ーに植菌し、37℃で4日間、通気量1 v/v/min、回転数20
0rpmで培養を行った。培養終了後、培養液をハイフロス
ーパーセルで濾過して菌体を除去した。これにより、約
1.1 U/mlの粗酵素液約3,900 mlを得た。
【００１６】実施例２ 精製酵素の調製
実施例１と同様の培地7,500 mlを入れた小型ジャーファ
ーメンターに、ストレプトマイセス エスピー TOTO-9
805株の前培養液150 mlを植菌した。これを実施例１と
同様に培養した後、遠心分離により培養上清6,750 mlを
得た。この上清液のpH10.5におけるアミラーゼ活性は1.
0 U/mlであった。次いで、この上清液に硫安粉末を80%
飽和になるまで加え、１昼夜5℃で暗所に静置後8000 rp
mで遠心分離を行い、沈殿を回収した。この沈殿を少量
の蒸留水に溶解した後、フイルター（アドバンテックト
ーヨー、No.1）で濾過して粗酵素液とした。粗酵素液を
あらかじめ20 mMトリス・塩酸緩衝液（pH 8.0）で平衡
化しておいたPD10（ファルマシア製）により脱塩と緩衝
液交換を行った。この液を同緩衝液で平衡化したDEAE-T
oyopearl 650Mカラムに通じて酵素を吸着させ、0〜1.0
MのNaCl濃度勾配で溶出させた。活性画分を同緩衝液（p
H 8.0）により平衡化したPD10により脱塩を行った。次
いで、同緩衝液で平衡化したα-サイクロデキストリン
・セファロースカラムに通じて活性画分を吸着させ、1%
α-サイクロデキストリン溶液により活性画分を溶出し
た。さらに、PD10により残存するα-サイクロデキスト
リンを除去した後、同緩衝液で平衡化したSuperdex 75
カラム（FPLC）によりゲル濾過を行った。上記一連の精
製により、約64.9 U/mlの精製アルカリアミラーゼ15.6
mlを得た。本画分はSDS電気泳動的にもゲル濾過的に
も、それぞれ単一バンドおよび単一ピークを示し、酵素
タンパク質として均一であることが確認された。
ーメンターに、ストレプトマイセス エスピー TOTO-9
805株の前培養液150 mlを植菌した。これを実施例１と
同様に培養した後、遠心分離により培養上清6,750 mlを
得た。この上清液のpH10.5におけるアミラーゼ活性は1.
0 U/mlであった。次いで、この上清液に硫安粉末を80%
飽和になるまで加え、１昼夜5℃で暗所に静置後8000 rp
mで遠心分離を行い、沈殿を回収した。この沈殿を少量
の蒸留水に溶解した後、フイルター（アドバンテックト
ーヨー、No.1）で濾過して粗酵素液とした。粗酵素液を
あらかじめ20 mMトリス・塩酸緩衝液（pH 8.0）で平衡
化しておいたPD10（ファルマシア製）により脱塩と緩衝
液交換を行った。この液を同緩衝液で平衡化したDEAE-T
oyopearl 650Mカラムに通じて酵素を吸着させ、0〜1.0
MのNaCl濃度勾配で溶出させた。活性画分を同緩衝液（p
H 8.0）により平衡化したPD10により脱塩を行った。次
いで、同緩衝液で平衡化したα-サイクロデキストリン
・セファロースカラムに通じて活性画分を吸着させ、1%
α-サイクロデキストリン溶液により活性画分を溶出し
た。さらに、PD10により残存するα-サイクロデキスト
リンを除去した後、同緩衝液で平衡化したSuperdex 75
カラム（FPLC）によりゲル濾過を行った。上記一連の精
製により、約64.9 U/mlの精製アルカリアミラーゼ15.6
mlを得た。本画分はSDS電気泳動的にもゲル濾過的に
も、それぞれ単一バンドおよび単一ピークを示し、酵素
タンパク質として均一であることが確認された。
【００１７】配合例１：食器洗い乾燥機用洗剤
・本酵素の粗酵素粉末（1,000U/g）１〜５重量部
・炭酸ナトリウム１０〜３０重量部
・硫酸ナトリウム１０〜３０重量部
・過炭酸ナトリウム５〜１０重量部
・クエン酸ナトリウム１〜５重量部
・ポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＡＥ）１〜１
０重量部 ・効果−米飯のこびりつきを洗浄
０重量部 ・効果−米飯のこびりつきを洗浄
【００１８】配合例２：台所用洗剤
・粗酵素粉末（1,000U/g）１〜５重量部
・直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＬＡ
Ｓ）とアルキルエーテル硫酸エステルナトリウム（Ａ
ＥＳ）の混合系界面活性剤２０〜５０重量部、又はを
３０重量部まで又はを２０重量部まで ・エタノール１〜５重量部 ・カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０．１〜１．
０重量部 ・効果−米飯のこびりつきを洗浄
Ｓ）とアルキルエーテル硫酸エステルナトリウム（Ａ
ＥＳ）の混合系界面活性剤２０〜５０重量部、又はを
３０重量部まで又はを２０重量部まで ・エタノール１〜５重量部 ・カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０．１〜１．
０重量部 ・効果−米飯のこびりつきを洗浄
【図１】図１は、本発明によるアルカリアミラーゼの最
適pHを示すグラフである。
適pHを示すグラフである。
【図２】図２は、本発明によるアルカリアミラーゼの安
定pHを示すグラフである。
定pHを示すグラフである。
【図３】図３は、本発明によるアルカリアミラーゼの最
適温度を示すグラフである。
適温度を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明によるアルカリアミラーゼの安
定温度を示すグラフである。
定温度を示すグラフである。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
(Ｃ１２Ｎ 1/20
Ｃ１２Ｒ 1:465）
(72)発明者 森松 秀子
福岡県北九州市小倉北区中島２丁目１番１
号 東陶機器株式会社内
(72)発明者 清水 保広
滋賀県甲賀郡甲西町日枝町４番19号 大和
化成株式会社内
(72)発明者 杉山 敦史
滋賀県甲賀郡甲西町日枝町４番19号 大和
化成株式会社内
(72)発明者 上山 明代
滋賀県甲賀郡甲西町日枝町４番19号 大和
化成株式会社内
Claims (7)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するアルカリア
ミラーゼ。 (a) 作用および基質特異性：デンプン、アミロース、ア
ミロペクチン、およびそれらの部分分解物のα-1,4-グ
リコシド結合を特異的に加水分解し、主としてデキスト
リンおよびマルトオリゴ糖を生成する。 (b) 最適pH：作用最適pHは、10.0である。 (c) 安定pH：37℃、１時間の処理条件でpH7.0〜12.0で
安定である。 (d) 最適温度：作用最適温度は55℃である。 (e) 安定温度：pH10.0、10分間の処理条件で、カルシウ
ム無添加の場合は45℃、カルシウム添加の場合では50℃
まで安定である。 (f) 分子量：SDS電気泳動法で約77,500ダルトンであ
る。 - 【請求項２】 好アルカリ性放線菌ストレプトマイセス
（Streptomyces）属菌から得られる請求項1記載のアミ
ラーゼ。 - 【請求項３】 ストレプトマイセス エスピー（Strept
omyces sp.）TOTO-9805株から得られる請求項1記載の
アミラーゼ。 - 【請求項４】 好アルカリ性ストレプトマイセス属に属
し、請求項1〜3のいずれか1項記載のアルカリアミラー
ゼの産生能を有する微生物を培養する工程と、該工程で
得られた培養物より該アルカリアミラーゼを分離する工
程とを含んでなる、アルカリアミラーゼの製造法。 - 【請求項５】 前記微生物の培養がpH8.0〜13.0のアル
カリ性で行われる請求項4記載の製造法。 - 【請求項６】 前記微生物がストレプトマイセス エス
ピー TOTO-9805株である請求項4記載のアルカリアミラ
ーゼの製造法。 - 【請求項７】 請求項1〜3のいずれか1項記載のアルカ
リアミラーゼを含有する洗浄剤組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16553299A JP3791000B2 (ja) | 1998-06-11 | 1999-06-11 | 新規アルカリアミラーゼおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16344198 | 1998-06-11 | ||
| JP10-163441 | 1998-06-11 | ||
| JP16553299A JP3791000B2 (ja) | 1998-06-11 | 1999-06-11 | 新規アルカリアミラーゼおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000060546A true JP2000060546A (ja) | 2000-02-29 |
| JP3791000B2 JP3791000B2 (ja) | 2006-06-28 |
Family
ID=26488882
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16553299A Expired - Fee Related JP3791000B2 (ja) | 1998-06-11 | 1999-06-11 | 新規アルカリアミラーゼおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3791000B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7803604B2 (en) | 2000-07-28 | 2010-09-28 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Amylolytic enzyme extracted from Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) and washing and cleaning agents containing this novel amylolytic enzyme |
| KR101333853B1 (ko) * | 2005-03-28 | 2013-11-27 | 마젤란 시스템즈 인터내셔날, 엘엘시 | 금속 분말을 사용한 높은 고유 점도 폴리아렌아졸의 제조방법 |
-
1999
- 1999-06-11 JP JP16553299A patent/JP3791000B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7803604B2 (en) | 2000-07-28 | 2010-09-28 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Amylolytic enzyme extracted from Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) and washing and cleaning agents containing this novel amylolytic enzyme |
| KR101333853B1 (ko) * | 2005-03-28 | 2013-11-27 | 마젤란 시스템즈 인터내셔날, 엘엘시 | 금속 분말을 사용한 높은 고유 점도 폴리아렌아졸의 제조방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3791000B2 (ja) | 2006-06-28 |
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